SE447028B - Bestemning av endstaende sackaridgrupper i glykoprotein - Google Patents

Description

'Jï 10 b! 'Jl 40 _ tidsödande och fordrar specíalutrustning lämpar den sig 447 Û28 den totala transferrinhalten. Den huvudsakliga transferrinkompo- nßnten har ett pl-värde av 5,4. En förhöjd mängd av transferrín- komponenten med ett pl-värde av 5,7 utgör-följaktligen en indika- tion på en långvarig, hög alkoholkonsumtion. l För närvarande fastställes en sådan transferrinabnormalitet med en metod inbegripande isoelektrísk fokusering följt av immu- nofirering och kvantitativ densitometri. Eftersom denna metod är inte för klinisk användning i stor skala.

Syftet med uppfinningen är följaktligen utveckling av en enkel och känslig metod för kvalitativ och/eller kvantitativ be- stämning av ändstående sackaridgrupper i glykoproteiner, vilken metod lämpar sig för rutinmässig användning i stor skala.

Enligt uppfinningen uppnås detta syfte med ett sätt, som kännetecknas av följande steg: 1) antikroppar med specificitet mot glykoproteinet som skall bestämmas fästs vid en fast fas, varvid en immunoadsorbent bildas; 2) glykoproteinet från prover av kroppsvätska eller frà1olika standardlösningar, vilka standardlösníngar var och en innehåller tglykoprotein medeflidefhüerad komposition av ändstående sackarid- grupper, binds till immunoadsorbenten, varvid-ett immunoadsorbent- 'glykoprotein-komplex bildas: ~ rr 3) märkt lektin eller lektin, som kan märkas sättes till immuno- adsorbent-glykoprotein-komplexet från steg 2, i vilket komplex en eller flera ändstående sackaridgrupper i glykoproteinet eventu- ellt har modifierats, vilket lektin binds till ändstående sackarid- grupper i komplexet, varefter mängden lektin, som binds av kom- plexet från steg 2, eller mängden lektin, som inte binds av detta komplex, betäms på i sig känt sätt.

Sättet enligt uppfinningen kan benämnas med det rationella namnet radio-lectin immunoassay (RLIA).

De i det första steget av detta sätt använda antikropparna, dvs immunoglobuliner, som uppvisar specificitet mot ett humant glykoprotein, som skall analyseras, framställes med metoder ba- serade på tídígare beskriven teknik. Sådana metoder inbegriper exempelvis att det glykoprotein, som skall analyseras; sprutas in i ett djur,-där det ger upphov till antikroppar, dvs immuno- globulincr, med önskad specificitet, som separeras och renas på i sig känt sätt, Många sådana antikroppberedningar är kommersi- ellt tillgängliga. .__ g Wíàí-f-...w-vfi-w-vuv- POOR i QUALITY 447 028 I det första steget enligt uppfinningen fästes sådana immuno- globuliner på en fast fas med vilken som helst lämplig känd tek- nik. Uppfinningen är därvid inte begränsad till någon speciell, nu känd teknik. Dessutom kan också sådana metoder, som kan tänkas år! utvecklas i framtiden, troligen utnyttjas. I detta sammanhang av~ ses med fast fas en fas som lätt kan separeras från en vätskefas, vilket möjliggör att vätskefasen kan bytas och förnyas. Produkten 'som erhålles när immunoglobulinerna fästes på fast fas kallas immunoadsorbent. 10 Immunoadsorbentbildningen innebär att antikropparna olöslig- gjorts med bibehållen reaktivitet. Olösliggörandet kan ske på olika sätt, t.ex. genom kovalent bindning av antikro par till en fast matris, såsom partiklar av Sepharoség, Sephadek eller cellulosa. Vid kovalent bindning till Sepharoség-gel aktiveras 1,länplígen gelen med bromcyaníd under alkaliska betingelser före tillsetsen av antikroppar. Även korskonjugering, inkorperering i polyakrylamidgeler eller fysikalisk adsorption till aktivt kol, glas- eller plastytor kan utnyttjas för olösliggörandet.

Det andra steget enligt uppfinningen innefattande bindning 20av glykoprotein till immunoadsorbenten kan lämpligen genomföras sålunda att immunoadsorbenten inkuberas med glykoproteinet eller kroppsvätskan, som skall undersökas, i ett sådant mängdförhàllan- de nat glykoproteinet föreligger i överskott gentemot antalet .lyï g oproteinbindande platser i adsorbenten.(0m överskott inte zgföreligger måste sättet enligt uppfinningen kompletteras med radívimmunoassay (RlA)).Denna ínkubering innebär att immunoadsor- benten har mättats med antigen, dvs glykoproteinet. Inkuberingen kan genomföras vid en temperatur av -100 till +500C, lämpligen l0~40OC och företrädesvis 25-40OC och vid ett pH-värde av 3-9, 33 lämpligen då 6-S. Dessa betingelser är ej speciellt kritiska och lämpliga betingelser kan lätt fastställas av fackmannen. Tiden för inkuberingen kan variera från nägra minuter, exempelvis S minuter, till ett par timmar eller längre tid. Vanligen är en tid av högst 2 timmar tillräcklig. 35 Efter det att immunoadsorbenten har mättats med glykoprote- inet som skall undersökas,_tvättas glykoproteinöverskottet bort från den fasta fasen. .~ I erhållet komplex kan ändstående sackaridgrupper i glyko- proteinet modifieras, vad beträffar transferrin t.ex. genom inku- 40 boring med galaktosídas till N-acetyl-glykosamid, GlNac, och där- *Ü f) f År fi, Fiffi “F *_¥ É. 3: *f en 15 441 028 4 efter med N-acetylglykosaminidas-till mannos.

Det tredje steget enligt uppfinningen innefattande bindning av lektin till immunoadsorbent-antigen-komplexet från steg 2 ge- nomföres på i sig känt sätt. Lämplígen inkuberas den tvättade ge- len från steg Z vid en temperatur av cirka 37°C under cirka 10 minuter varefter obundet lektin avlägsnas. Inkuberingsbetingelser- na är ej speciellt kritiska utan ungefär samma intervall för tem- peratur, pH och tid, som angivits ovan för steg 2, kan användas.

Mängden lektin, som bundits, eller alternativt som icke bundits, till ändstående sackaridgrupper mäts därefter på lämpligt sätt.

Vid isotopmärkning kan vätskescintíllationsräknare eller /"-räk- nare användas.

En fördel med sättet enligt uppfinningen är att mycket små glykoproteinmängder är tillräckliga för tillämpning av uppfinning- en, eftersom mängder understigande 1 nmol ändstâende sackaridgrup- per kan bestämmas både kvantitativt och kvalitativ. En upplösnings- förmåga av 30 pmol sackarid har dessutom uppnåtts, vilket värde troligen kan förbättras om försöksbetingelserna optimeras.

Glykoproteinerna, som kan användas enligt uppfinningen, är sådana som a) ger upphov till antikroppsbildning när de sprutas in i något djur, varvid bildad antikroppsfraktion kan separeras och renas, samt b) uppvisar mikroheterogenitet i sackaridgruppen eller -grupperna. Med mikroheterogenitet avses därvid att glyko- proteiner, som binds till samma antikroppsberedning, kan uppvisa olika ändstående sackaridgrupper i sackariddelen. De ändstâende sackaridgrupperna kan exempelvis utgöras av sialinsyra, galaktos Vidare eller mannos. bör dessa glykoproteiners ändstående sac- -karídgrupper ej utgöra antigendeterminanter, dvs bildade anti- kroppar med specificítet mot glykoproteinet bör inte reagera med ändstâende sackaridgrupper i glykoproteinet.

Ett väsentligt kännetecken för uppfinningen är användningen av lektiner för kvantitativ och/eller kvalitativ bestämning av olika ändstående sackaridrester i glvkonroteín. ' Lektiner är proteiner, eventuellt glykoproteiner, som kan 'erhållas från djur- eller växtríket, och som binds till olika sackaridgrupper. Exempel på sådana lektiner är galaktosbíndande lektin från Crotalaria juncea (se Ersson, B., Afpberg, K. och Porath, J., Biochim. Biophys. Acta, vol. 310 (1973) pp 446-452 och Ersson, B,. Biochim. Biophys. Acta, vol. 494 (1977), pp M-60), PÖëš-*ëäfiunßzwrv 50 55 447 028 vn kaljväxt, och ett sialinsyrabindande lektín fran kungskrabban, Limulus polyphemus. _ Enligt uppfinningen används märkt lektin för att de ändstå- ende sackaridgrupperna i glykoproteinet skall kunna bestämmas kvalitativt och/eller kvantitativt. Därvid kan med fördel isotop- 1311, användas. Också andra märkning, t.ex. med jod, 125I eller märkningsmetoder, som är kända och som utnyttjas konventionellt vid immunologiska och likartade metoder kan användas. Såsom exem- pel kan nämnas märkning med fluorescerande färgämnen, såsom fluorescein eller rodamin, eller diazoterade färgämnen, såsom Évunsblått.

Med hjälp av märkt per i glykoproteín bestämmas med konventionell analysteknik. Hal- lektin kan halten ändscående snckaridgrup- ändstàende sackaridgrupper kan korreleras till den procentu- Sàdan analysteknik ten ella mängden av en viss glykoproteinkomponent. innefattar att mängden lektin, som bundits till sackaridgrupper i glykoproteinet mätes. Alternativt kan mängden obundet lektin, som kvarstår i övervätskan och i eventuella tvättlösningar mätas.

Vid isotopmärkning av lektínet används lämpligen en vätskescin- Iillationsräknnrv eller /-räknare för bestämning av mängden bun- det eller fritt lektín. kan exempelvis mikrospektrofluorometri utnyttjas för kvantitativ Vid märkning med fluorescerande färgämnen bestämning. Genom användning av olika lektintvper, som binds till olika ändstående sackaridgrupper kan man också bestämma vilka ändstâende sackaridgrupper som ingår i ett glykoprotein och even- tuellt också i vilket förhållande dessa ingår.

Vad beträffar de betingelser, som används vid genomförandet olika stegen enligt uppfinningen, dígare, dessa ej speciellt kritiska. Betingelser, som konventio- nellt används inom immunologiska förfaranden kan användas. Lämp- nv de är, såsom framhållits ti- llgå betingelser för steg Z och 3 har diskuterats ovan. Det första dvs bindning av antikroppar till fast fas, kan lämpligen genomföras under ca 2 h, ett pH-värde av 7-8 och vid rumstempera- dvs cirka ZOÜC, men temperaturer av från -100 till +S0°C, 3-9 och en tid från nägra minuter till flera timmar, steget, tur, pH-värden av kan användas. _ Såsom framhällits ovan kan sättet enligt uppfinningen med fördel tillämpas vid bestämning av en viss transferrínkomponent som finekmmmr i finhöjdnfingd isenmxfrài personer med en långvarig, PUUii Quialifrï 447 028 hög alkoholkonsumtion.

I följande exempel beskrives därför uppfinningen narmare med hänvisning till en sådan transferrinkomponentbestämning. Re- sultaten från dessa exempel finns sammanställda i diagram på de 5 bifogade ritningarna, varvid fig. 1 visar ett diagram över ana- lysresultat, som erhållits med användning av märkt Crotalaría- -lektin och fifl. ZA och B visar diagram över analysresultat, somi gerhållits_med användning av märkt Limulus-lektin.

Exempel 1 10 A) 25 ml av med destillerat vatten tvättad Sepharoséâ 4 B uppslammas i 25 ml omdestillerat vatten, kyls till ZOOC och överföres till en bägare under magnetisk omröring. 5 g bromcya- nid tillsättes och pH-värdet justeras till och upprätthålles vid 11 genom tillsats av iskall natriumhydroxidlösning (2 mol/1). 15 Temperaturen hålles vid ZOOC med krossad is och efter nästan fullbordad titrering (efter ca 15 min) tvättas gelen i en iskyld Büchner-tratt med iskyld natriumfosfatbuffert (0,07 mol/1 fosfat, pH 8,0). Denna gel sättes till en lika stor mängd antitransferrín (10 mg/ml) av rumstemperatur och det hela får stå vid rumstempe- 20 ratur under magnetisk omröring under 2 h. Etanolamin-HCl FJ CJ | (1 mol/1, pH 8,0) tillsättes därefter (5 ml/ml gel) och blandning- en inkuberas under omröring under ytterligare 2 h. Genom tvätt- ning och centrifugering byts bufferten till 0,05 mol/1 natrium- fosfatbuffert, pH 7,5 innehållande 1 mol/1 natriumklorid. Gelen lagras vid 4°C i en lika stor volym av denna buffert.

B] Standardlösningar innehållande olika procentuella mängder av asialotransferrin och transferrin framställes genom att 0,069 U agaros-bunden neuraminidas från Dactylium dendroides med en aktivitet av 44 U/g agaros (1 U frigör 1 pmol/min av sialin- 50 gsyra från AcNeu-laktos vid pH 5,0 och 37°C) överföres till nat- l/'l t!! riumfosfatbuffert (0,01 mol/1, pH 6,3). I denna buffert löses 1 mg human-transferrin, som sättes till agarosen till en total volym av 1 ml och inkuberas under omskakning under 30 min vid 57°C. Agarosen pellettiseras vid botten av röret och asialotrans- ferrin överföres till ett annat rör. 1 mg av obehandlad trans- ferrin löses i samma buffert och_standardlösningar framställes genom blandning av asialotransferrinlösningen och transferrin- lösningen i olika proportioner. , 10 pl antitransferrin-gel från A) i en total volym av 20 p 40 fosfatbuffert (0,05 mol/1, pH 7,5) innehållande natriumkloríd 1.11 10 i 30 447 028 1 1 mol/1) införes i iskylda plastprovrör. Denna gel inkuheras därefter under skakning vid 37°C under 10 minuter med 1) olika standardlösningnr av 50 pg transferrin-asialotransferrin av olika komposition i 50 pl fosfatbuffert (0,01 mol/l, pH 6,3) och 2) med prover om 100 pl serum från olika personer efter föregåen- de tillsats av 100 pl natriumfosfat (0,05 mol/l)- citrat(0,02 mol/1), pH 7,2. Gelen befrias därefter genom tvättning från lös- sligt transferrin. 12 C) Gelen ínkuberas däT6fUfl'mGd5Ûr100 mg av SI-märkt Crotfi- laría-lektín under 10 minuter i en termostaterad skakanordning vid 37°C. Obundet lektin avlägsnas från den"pellettíseradeigelen, varefter den senare uppslammas i 0,5 ml buffert, överföres till en scintillationsbehållare och räknas i närvaro av Aquasol.

Crotalaria-lektin hade märkts på följande sätt: Crotalaria- -lektin solubiliserades i natríumfosfatbuffert (0,07 mol/l, pH 8,0) till en koncentration av 10 g/l och lösningen kyldes med is. 0,09 nmol Bolton-Hunter-reagens (2200 Ci/mmol) indunstades i kväve från en lösning i 20 Pl vattenfri bensen i ett glasprov- rör. Ungefär halva bensenvolymen avdunstades vid rumstemperatur under 10 minuter och återstoden under 20 minuter efter det att iöret hade placerats i ett isbad. Därefter tillsattes 50 pg av Crotularia-lektinlösningen från en iskyld mikropipett och det hela fick stå under 1 timme vid OOC och därefter under 3 timmar vid 4°C. Därefter tillsattes 1 mg av Crotalaria-lektinlösningen och det makromolekylära materialet eluerades från en Sephadexšy 0-25 kolonn (PD-10, Pharmacia, Uppsala) med simultant buffert- byte till natriumfosfat (0,05 mol/1, pH 7,5) innehållande natrium- klorid (1 mol/1). Frnktíoner om 1 ml tillvaratogs.' Lektinet förblev aktivt under minst 4 månader efter lagring vid 4°C i den sistnämnda bufferten. ' §§gmpel_2. Förfarandet i exempel 1 upprepades förutom att i C) användes 1251-märkt sialinsyrabindande lektin från Límulus polyphemus i stället för Crotalaria-lektin. Först tillsattes 0,1 ml Na-EDTA (0,1 mol/1, pH 7,4) till gelen varefter buffert- utbyte till Tris-HCl (0,05 mol/l, pH 7,2) innehållande NaCl (0,15 mol/l) och CaClz (0,1 mol/1) genomfördes genom tvättning.

Därefter tillsattes ca 20-25 pg märkt Limulus-lektin löst i 0,1 av sistnämnda buffert följt av tre tvättningar.

Limulus-lektinet hade märkts såsom i exempel 1 förutom att m 1 ' POÜIi QfäÄLïTí 447 028 färkningen genomfördes vid en lägre koncentration (1 g/1) och med ett förhållande av protein till Bolton-Hunter-reagens av en tiondel av det som använts i exempel 1. Efter märkning späddes Limulus-lektinet med en lika stor volym av Na-EDTA (0,1 mol/l, pH 7,4) och överfördes till en buffert av Tris-HCl (0,05 mol/1, pH 7,2 , NaCl (0,15 mol/1) och CaCl2 (0,1 mol/1). _ Resultaten från exempel 1 finns sammanställda i diagrammet i fig. 1. Ett molförhållande av transferrín till galaktosbindande lektin av ungefär 1:1 har använts eftersom förmodligen maximalt endast en lektinmolekyl kan bindas till en av de i asialotrans- ferrin exponerade galaktosgrupperna.Nfitnnnærnalmr gengmförts i det för undersökning av personers alkoholvanor kliniskt"intres- santa området av 0-15 % asialotransferrín, baserat på total trans- ferrinmängd.a I fig. 1 visas två kurvor erhållna med RLIA av ändstående galaktosgrupper-i 1) standardlösningar innehållande 50¿ug trans- ferrín med indíkerat förhållande av asialotransferrin (fyllda cirklar) eller i Z) 100 pl serum innehållande indikerat förhål- lande av transferrinkomponenten med pl 5,7(Qfyllda cirklar).

-Standardkurvan O och tre koordinater.B i serumtransferrinkur- van är autentiska under det att övriga koordinater i serumtrans- fendnkurvan 0 representerar värden som erhållits från en annan -beredning av antitransferrin-gel, varvid en för varje koordinat likvärdig korrigering införts för det högre bakgründsvärdet för lektinbindning till den senare gelen. Bakgrundsbildningen för serumínkuberíngarna var 8-9000 cpm vid den första inkuberingen, _ och 12500 cpm vid den andra inkuberíngen. Det vid det senare in- kuberingstíllfället bundna lektinet svarar mot 10-15 % av till- satt lektin eller 8-12 pg. Ungefärligen samma procentandel märkt lektin binds till partiellt hydrolyserad Sepharos innehållande överskott av terminala galaktosrester, när spädníngsförhàllandet mellan märkt och omärkt lektin är detsamma.

PÛÖR QÜÉåE-lfïiïifffïeigš' i* i ' 9 447 028 Tabell till Pig. 1 (inkubering nr. 2) Procentandel serum desíalotransferrín Bundet Crotalaría lektin med använ- med pl 5.7, bestämd genom isoelektrísk dande av patentsökt metod (Radio- fokusering lectin immunoassay) Ccpnü 2 13300 3 200 4 ' 13950 i 890 6 15660 8 15340 É 890 8 15980 i 1310 12 15730 13 16260 1 1840 14, 17310 16 18690 3 160 Av fig. 1 framgår att standardkurvan i intervallet 0-15 % asüflotransferrin har ungefär samma lutning som kurvan erhållen med serumprover i området Z-16 % av transferrinkomponenten med pl 5,7. Dessutom har sådana värden, som ligger i den nedre_vänst- ra delen av serumkurvan, dvs med normal halt av transferrinkompo- nenten med pl 5,7, erhållits med serum från personer med låg el- ler-normal alkoholförbrukning, då däremot värden erhållna med -serum från personer med hög alkoholförbrukning ligger i den-övre högra delen av serumkurvan, dvs motsvarande en klart förhöjd mängd av transferrinkomponenten med pl 5,7. 'än Resultaten från exempel 2 finns sammanställda i fig. 2A och ZB. Dessa diagram visar resultaten från RLIA av ändstáende sia- linsyra i transferrin med märkt Limulus-lektin, varvid 10 Pl anti- transferrin-Sepharose -gel har inkuberats med 50 pg transferrin innehållande obehandlat transferrin och fullständigt desialylerat asíalotransferrin i indikerade proportioner, vilken gel sedan ínkuberats med 25 pg märkt Limulus-lektin.

Av dessa diagram framgår att transferrin binder en signifi- kant större mängd Límulus-lektin än vad asialotransferrin gör: Däremot binder asialotransferrin-antítransferrín-komplexet signi- fikanta mängder Limulus-lektin. Detta beror troligen på att sialylgrupper ingår i antikropparna och bidrager till Limulus- -lektinbindning. ' pmm, QUALITY "

Claims (7)

10 447io2s Patentkrav

1. Sätt att i kroppsvätska aj kvalitativt och/eller kvanti- tativt bestämma ändstående sackaridgrupper i glykoproteinkompo- nenter, vilket glykoprotein uppvisar“mikroheterogenitet i sacka- tidgruppen eller -grupperna, och/eller b) bestämma halten av en glykoproteinkomponent, k ä n n e t e c k n a t därav, att 1) antikroppar med specificitet mot glykoproteinet, som skall analyseras, fästs vid en fast fas, varvid en immunoadsorbent bil- das; att 2) glykoproteinet från prover av kroppsvätska eller från olika standardlösningar, vilka standardlösningar var och en innehåller glykoprotein med en definierad komposition av ändstående sackarid- grupper, binds till immunoadsorbenten, varvid ett immunoadsorbent- ~glykoprotein-komplex bildas; och att 3) märkt lektin eller lektin, som kan märkas, sättes till immunoadsorbent-glykoprotein-komplexet från steg 2, i vilket kom- plex en eller flera ändstående sackaridgrupper i glykoproteinet eventuellt har modifíerats, vilket lektin binds till ändstående sackaridgrupper i komplexet, varefter mängden lektin, som binds av komplexet från steg Z, och/eller mängden lektin, som inte binds av detta komplex, bestäms på i sig känt sätt.

2. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att glykoproteinet utgöres av humant transferrin och att antikropparna i steg 1 utgöres av antitransferrin.

3. Sätt enligt krav 1 eller Z, k ä n n e t e c k n a t därav, att lektinet utgöres av galaktosbíndande lektin eller av ett sia- linsyrabindande lektin. '

4. Sätt enligt något av föregående krav, k ä n n e t e c k- n a t därav, att den fasta fasen utgöres av en gel.

5. Sätt enligt något av kraven 1-4, k ä n n e t e c k n a t därav, att lektinet är isotopmärkt.

6. Sätt enligt krav 5, k ä n n e t e c k n a t därav, att lektiner är märkt med jod 1251.

7. Sätt enligt krav 5 eller 6, k ä n n e t e o k n a t därav, att mängden märkt lektin mätes med vätskescintillationsräknare eller 1"-räknare. f i ”šeealfoeaiifrr