JPS5856696A - カラムを用いる酵素免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗原または抗体を速かにかつ精度良く測定する
方法に関するものである。更に詳しくは酵素免疫測定法
によって抗原または抗体を測定するに際して抗原−酵素
標識抗体結合物または抗体−酵素標識抗原結合物（以上
の免疫反応生成物を結合型又はＢと呼ぶ）と遊離の酵素
標識抗体または酵素標識抗原（以上を遊離型またはＦと
呼ぶ）の混合物を、または定量すべき抗原と酵素標識抗
体ないしは定量すべき抗体と酵素標識抗原を順次抗体不
溶化担体、第二抗体不溶化担体、プロティンＡ不溶化担
体等のカラムに流し、結合型のみをカラムに結合させ、
遊離型はカラムより洗い流すかまたは抗原と酵素標識抗
原の混合液を抗体不溶化担体のカラムに流し遊離型をカ
ラムより洗い流し、ついでカラム内に酵素の基質溶液を
流しカラム内にて酵素活性を測定し、これによって結合
型の量を求め抗原または抗体を定量するこ゛とを特徴と
するカラムを用いる酵素免疫測定法に関するものである
。

本発明において定量される抗原としては種々の生体成分
あるいは薬剤があるが、特に臨床的には生体体液中に含
まれる種々のホルモン類、蛋白質が重要である。具体的
にはペプチドホルモン類、ステロイドホルモン類、サイ
ロキシン類の甲状腺ホルモンあるいはイムノグロブリン
−α−フェトプロティン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（Ｃ
ｇＡ）等が含まれる。また抗体としては種々の感染症に
よって生体内に生成される抗体、自己免疫疾患によって
生成される抗体あるいは種々の薬物に対して生成される
抗体などが含まれる。

一般に免疫測定法は測定感度および特異性において優れ
ており特に血液、尿等の生体体液中の微量物質の定量に
広く用いられる方法であって、この方法には標識物質の
種類によりラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、螢光免疫
測定法（ＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）等に分類
される。

このうち、ラジオイムノアッセイは自動測定機器が開発
され広く普及しているが、特殊な施設と技術者あるいは
管理者を必要とし、また標識物質として放射性同位元素
を用いるため測定廃棄物の処理に厳重な注意を要する。

また、放射性同位元素は比較的不安定であるため標識抗
原（標識抗体）を長時間保存することが難しい。

これらの問題を解決する目的で、標識化合物として螢光
物質や酵素を用いる免疫測定法、即ち螢光免疫測定法、
酵素免疫測定法が研究、開発されてきた。この２つの免
疫測定法において、螢光免疫測定法では標識に用いる螢
光物質を直接定量するのに対して、酵素免疫測定法は標
識酵素をその酵素の基質に作用させ、酵素反応によって
生成した生成物を定量することにより間接的に標識酵素
の量を求める。ここで、酵素反応の時間をある程度長く
すれば、１分子の酵素は何分子もの生成物を生成するの
で、酵素免疫測定法は適切な条件を設定することにより
螢光免疫測定法より測定感度が良くなる。例えば、Ｅ、
Ｉｓｈｉｋａｗａとに、　ＫａｔＯは標識酵素としてβ
−Ｄ−ガラクトシダーゼ酵素基質として４−メチルウン
ベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドを用いてＩ　Ｘ　
１０−”モル以下のオルニチンδ−７ミノトランスフエ
ラーゼ（Ｏｒｎｉｔｈｉｎｅδ−ａｍｉ　ｎｏ　ｔ　ｒ
ａｍｓ　ｆ　ｅ　ｒａｚ　ｅ　）を測定している（Ｓｃ
ａｎｄ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕ−ｎｏｌ、　１３巻、４３ペ
ージ、　１９７８年）。

酵素免疫測定法においては、上記のように高感度の測定
が可能であり、更に標識物質が生物由来の酵素であるた
め放射性同位元素のように特殊な施設や管理者を必要と
しない。又、適当な酵素を選択することにより酵素標識
抗原または酵素標識抗体を長期間保存し使用することが
できる（Ｍ、Ｊ。

α５ｕｌｌｉｖａｎら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

１００巻、１００ページ、１９７９年）。

酵素免疫測定法では、不溶性担体に抗体、第二抗体、プ
ロティンＡ等を結合させたものを用いる固相法が一般的
であり、不溶性担体としてはポリスチレン試験管（Ｅ、
Ｅｎｇｖａｌｌら、　　Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ、２５１巻、４２７ページ、
１９７１年）、ポリスチレン球（Ｊ、　Ｈｉｓｔｃｈｅ
ｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ２２巻、１０８４ペニジ、１９
７４年）、シリコン樹脂片（Ｅ、　Ｉｓｈｉｋａｗａら
、　　ＳｃａｍｊＪ、Ｉｍｍｕｎａｌ８巻、４３ページ
、１９７８年）が用いられる。

これらの不溶性担体は入手し易く、また抗体等の不溶化
も簡単であるが、抗体等を不溶化し得る部分、即ち不溶
性担体の表面積が小さく、従って１つの不溶性担体に結
合させ得る抗体等の量は極めて少ない。このため、神々
の問題、例えば酵素標識抗原と第二抗体不溶化担体（ま
たはプロティン不溶化担体）を用いる測定系では、血清
中の抗体を測定しようとした場合血清中には目的とする
抗体以外のイムノグロブリンがはるかに多く含まれるの
で、検体として多量の血清を用いることができず、当然
検出限界濃度が高くなるという欠点がある。また、これ
らの不溶′性担体を用いると生体体液中の干渉物質の影
響を受は易く、生体体液を試料とした場合、測定感度、
精度が低下するという問題がある。また、特にポリスチ
レン球、シリコン樹脂片を用いる場合には、測定中にこ
れらの担体を洗浄し、新しい試験管に入れるなど煩雑な
操作が必要である。

一方、不溶性担体として繊維状の多糖（セルロースパウ
ダー等）あるいは微粒状の多糖ゲル（デキストランゲル
、アガロースゲル等）が用いられることもある。例えば
Ｂ、　Ｋ、Ｖａｎ　Ｗｅｅｍｅｎらはセルロースに抗体
を不溶化したものを用いた酵素免疫測定法を行なってい
る（　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔ　ｔｅ　ｒｓ　１５巻２３２ペ
ージ、１９７１年）。このような不溶性担体を用いた場
合、不溶性担体に結合し得る抗体等の量も多いため、前
述の第二抗体不溶化担体を用いる抗体の測定系において
も、低濃度の抗体の検出が可能となる。しかし、測定中
に不溶性担体を洗浄するには遠心分離あるいは濾過とい
う煩雑な操作が必要である上、不溶性担体が繊維状ある
いは微粒状であるため洗浄中に一部を損失したり、試験
管壁等に付着したりし易いので測定誤差が出易いという
欠点がある。もっともカラムを用いて結合型と遊離型を
分離する方法は既に開発されている。Ｅ、Ｉｓｈｉｋａ
ｗａ　　らはａ−Ｄ−グルコシダーゼ標識インス、リン
とα−Ｄ−グルコシダーゼ標識インスリン−インスリン
抗体結合物をセファデックスＧ−１５０（ファルマシア
社製）のカラムで分離している（Ｓｃａｍｄ、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎａｌ、　６巻、４３ページ、１９７８年）。

同じく、ｍ、　Ｔｅｒｏｕａｎｎｅらはエストラジオー
ルを不溶化したゲル濾過担体のカラムを利用して遊離型
のΔ５．３−ケトステロイドイソメラーゼ標識抗原と結
合型の△５．３−ケトステロイドイソメラーゼ標識抗原
をアフィニティクロマトグラフイの技術を用い、遊離型
と結合型の分子量の差をゲル濾過の技術を利用して分別
し、カラムより溶出されてくる結合型を測定しティる（
Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ３５巻、２７１
７ページ、１９８０年）。これらのカラム法は操作が簡
単であるという利点はあるものの、酵素あるいは抗原の
種類によってカラムに充てんする担体の種類を検討する
必要があり、すべての抗原又は抗体を同じ酵素あるいは
担体を用いて一定することはできないという欠点を有す
る。

さらにカラムを使う方法について特開昭５２−１３９７
１７にも記載があるが、この方法は競争結合俣の改良法
であり、抗体に対して酵素標識抗原と定量すべき抗原と
を競争的に結合させる方法にしか応用できず、広く多種
の抗原あるいは抗体を測定することはできない。

本発明者等は、以上の如き酵素免疫測定法の現状を考慮
し、従来の方法の欠点を改良すべく鋭意検討した結果、
測定操作が簡単であり、生体体液中の干渉物質等の正確
な測定を妨害する物質の影響を受けず、測定感度および
測定精度が良好であり、しかも抗原の両側結合法および
競争結合法による定量更に抗体の定量においてすべ・て
同じ方式で定量が可能であるところのカラムを用いる酵
素免疫測定法を確立したのである。

即ち、本発明は ■　定量すべき抗原と酵素標識抗体を反応させた反応液
。

■　定量すべき抗原、酵素標識抗原および抗体を反応さ
せた反応液。

■　定量すべさ抗体と酵素標識抗原を反応させた反応液
。

■　定量すべき抗原と酵素標識抗原の混合液。

を抗体不溶化担体、第二抗体不溶化担体、プロティンＡ
不溶化担体のいずれかを充てんしたカラムに流すか、 ■　定量丁べき抗原を抗体不溶化担体のカラムに流した
後、酵素標識抗体をカラムに流すか、 ■　定量すべき抗体を第二抗体不溶化担体のカラムに流
した後、酵素標識抗原をカラムに流し、 カラムを洗浄後、カラム内に保持された標識酵素の活性
をカラム内に酵素の基質溶液を流すことによって測定す
ることを特徴とする抗原または抗体の定量法に関するも
のである。このカラム内にて酵素反応を行なう方法は本
発明者等が独自番こ開久した方法であって、測定操作が
簡便化されると同時に余分な操作の省略により測定操作
に由来する測定誤差を鰻少眼に押えることが可能となる
。また本発明法においては多量の抗体、第二抗体、プロ
ティンＡを不溶性担体に不溶化することにより生体体液
中の測定を妨害する物質の影響を除去し、更を二本発明
者等が開発した「免疫測定法における非特異的阻害作用
の除去法」（特開昭５５−１５２４５８）即ち疎水性蛋
白質と塩類を反応液に共存させて干渉物質の影響を除去
する方法を応用して測定精度を向上させることを可能と
したのである。本発明法は高感度であるため、測定試料
にあわせて測定範囲を自由に設定することもできる。

本発明に使用される標識用酵素としてはβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼ、アルカリホスファターゼ。

バーオ午シダーゼ、グルコースオ午シダーゼ、リンゴ酸
脱水素酵素等通常用いられる酵素であればいずれでもよ
い。

酵素標識抗体、酵素標識抗原の調製番こ際して用いられ
る酵素と抗体または抗原との結合法は、酵素抗体、抗原
の各々の活性（触媒活性、抗原結合能、抗体結合能）が
失なわれないような方法であればどのような方法でもよ
い。具体的にはグルタルアルデヒド、カルボジイミド、
Ｎ、Ｎ−ｏ−フェニレンジマレイミド、ｍ−マレイミド
ベンゾイル−Ｎ−ハイドロキシサクシニミドエステル（
ｍ−Ｍａｌｅ　１ｍ１ｄｏｂａｎｚｏｙｌ−Ｎ　−Ｈｙ
ｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅＩｉ；５ｔｅｒ）等
の既知の二官能性試薬が使用できる。

不溶性担体としてはアガロース、デキストラン、セルロ
ースなどの多糖類、ポリスチレン等の合成樹脂、あるい
はガラス、ポリアクリルアミド等が用いられ、形態とし
てはビーズ状、繊維状であることが好ましい。本発明法
では多量の抗体、第二抗体、プロティンＡを不溶性担体
に不溶化させる必要があり、このため、不溶性担体はカ
ラムの流速を低下させない程度であればできるだけ微粒
状または細粒状であることが望ましい。

抗体、第二抗体、プロティンＡと不溶性担体との結合は
通常蛋白質あるいは酵素等を不溶化するのに用いられる
方法が用いられる。例えば不溶性多糖を用いる場合であ
れば不溶性多糖を臭化シアン、過沃素酸ナトリウム、エ
ピクロルヒドリン、１．１′−カルポニルジイミタソー
ル、Ｐ−）ルエンスルフォニルクロリド等で活性化して
結合反応を行なわせる。また、不溶性担体に適当なスペ
ーサーを導入した後、スペーサーを介して抗体、第二抗
体、プロティンＡを結合させてもよい。更に抗体、第二
抗体、プロティンＡと不溶性担体の結合を可逆的な結合
、例えばＳ−８結合にした場合には、測定後年溶性担体
に結合した免疫反応物を不溶性担体より切断・除去しく
例えばＳ−８結合の場合還元剤により切断される）、不
溶性担体をくり返し使用することもできる。不溶性担体
に不溶化する抗体、第二抗体、プロティンＡの量は不溶
性担体１ｄ当１１）０．１〜２０■が適当であるが、可
能ならば更に多量の抗体等を不溶化してもよい。

多量の抗体等を不溶化することによって測定感度測定精
度を向上させることが可能である。

ここで使用される抗体、第二抗体、プロティンＡは、そ
のままでもよいが、抗原またはイムノグロブリン結合部
位のみを分離したものでもよい。

例えば抗体、第二抗体の場合には、パパイン、ペプシン
などのプロテアーゼで処理して得られるＦａｂ′部分、
Ｆ　（ａｂ’　）２部分などを使用することもできる。

Ｆａｂ’部分の調製法についてはＥ、　Ｉｓｈｉｋａｗ
ａらの報告がある（　５ｃａｎｄ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ１
８巻、４３ページ、１９７８年）。

使用するカラムの形態はいかなるものでも良いが、通常
免疫測定法の試料の液量が少量であることと、操作の簡
便化、測定時間の短縮とを考えると容量が１１Ｉｇ以下
であることが望ましい。例えば第１図のような上部にリ
ザーバーのついたカラムが使い易い。

生体体液成分による干渉作用を抑制あるいは除去するた
めに用いる疎水性蛋白質としてはゼラチンなど、塩類と
しては食塩などが用いられる。

本発明法によればこのように、測定する抗原あるいは抗
体の種類に関係なく同じ方式で、しかも生体体液成分に
よる影響も受けず、高感度で精度の高い測定が可能とな
り、更に本発明法は自動測定系への応用も容易である。

次に本発明の実施例を示す。

実施例１．　インスリンの定量 （１）　　モルモット（抗ブタインスリン）ＩｇＧの調
製（ＩｇＧ−イムノグロブリンＧ） 加藤らの方法（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉ　５ｔｒｙ８１巻、１５５７ページ、１９７７年）に
従いモルモットの抗ブタインスリン血清より硫安分子ｉ
、ＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィによって調製
した。

（２）　　抗ブタインスリンＦ（ａｂ’）２　フラクシ
ョンの調製 （１）で得られた（抗ブタインスリン）ＩｇＧヲヘフシ
ンで限定分解後、セファデックスＧ−１５０（ファルマ
シア、ファインケミカル社’ＪｌりのカラムでＦ（ａｂ
’）ｚフラクションを分離した（加藤らの方法：　Ｊｏ
ｕｒｎａｌ　ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　　１１６巻、
１５５４ページ。

１９７６年）。

（３）　　Ｆａｂ’−β−Ｄ−ガラクトシダーゼの調製
（２）で得られたＦ（ａｂ’）２フラクシヨンを２−メ
ルカプトエチルアミンで還元し、ＳＨ基ヲ持ツＦａｂ′
フラクションとした。このＦａｂ’フラクションと天然
にＳＨ基を持つ４１、ｃｏｌｉのβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ（ぺ一リンガー社製）をＮ、Ｎ’−ｏ−フェニレン
ジマレイミドにて結合させＦａｂ’−β−Ｄ−ガラクト
シダーゼを得た（加藤らの方法：化学と生物　１４巻、
７３７ページ）。

（４）ｌｔインスリン）ＩｇＧ不溶化セファ０−スの調
製 （１）で調製した（抗インスリン）ＩｇＧ５０ｑとＣＮ
Ｂｒ活性化セファロース（ファルマシア、ファインケミ
カル社製）　１０＋ｗｊを０．５Ｍ食塩を含む０．１Ｍ
炭酸ソーダ緩衝液中（ｐＨ８，３）で−晩反応させた。

調製した（抗インスリン）ＩｇＧ不溶化セファロースは
０．５Ｍ食塩を含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）中
で保存した。

（５）測定 標準インスリン溶液を緩衝液Ｇ（０，３ＭＮａＣ１，１
ｍＭＭｇＣ１’、０．５％ゼラチン、ｏ、ｉ％牛血清ア
ルブミン、０．１％ＮａＮ５を含むｐＨ７の１０ｍＭ＋
）ン酸緩衝液）にて希釈した各検体０．１　ｓｕ　（イ
ンスリン０〜３２０μν賃）とＦａｂ’−β−Ｄ−ガラ
クトシダーゼを含む緩衝液Ｇｌｄを混合し、３７°Ｃで
２時間反応させた。この反応液を緩衝液Ｇで平衡化した
（抗インスリン）ＩｇＧ不溶化セフ１０−スのカラム（
０，１ｍ）に流し、緩衝液Ｑ２．ｚでカラムを洗浄後、
０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（ｏ−ＮＰ
Ｃ）の溶液（１ｏＩｖ／＊）０．１ｄをカラムに流しカ
ラム内をｏ−ＮＰＣ溶液で満たし３７°Ｃで２時装置い
た。

酵素反応の結果、カラム内に生成した０−ニトロフェノ
ールを０．ＩＭＭａ２ＣＯａ溶液２１１−洗浄し、洗浄
液の　Ａ４２０ｎｍの吸光度を測定したところ第２図に
示す検量線を得た。

実施例２、　トリョードチロニン（Ｔ３）の定量Ｔ３−
β−Ｄ−ガラクトシダーゼはＴ、のアミノ基とβ−Ｄ−
ガラクトシダーゼのＳＨ基を４−（マレイミドメチル）
シクロへ午サンー１−カルボキシリックアルドサクシニ
ミドエステル（４−（Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ
）　ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ　−１−Ｃａｒｂｏｘｙｌ
ｉｃ　ａｃｉｄ、ｃｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ　ｅｓｔｅｒ
；ＭＣＡＥ）で架橋することによって調製した。

ウサギ（抗Ｔ　ｚ　）　工ｇＧ、ヤギ（抗ウサギＩｇＧ
）ＩｇＧは実施例１（１）に準じて調製した。（抗ウサ
ギＩｇＧ）ＩｇＧ不溶化セファロースは、ヤギ（抗ウサ
ギＩｇＧ）ＩｇＧをメルカプトエチルアミンで還元し、
Ｓ−８，ＳＨ基交換反応を利用しテ活性化チオールセフ
１０−ス（ファルマシア、ファインケミカル社製）に結
合させることによって調製した（ヤギ（抗ウサギＩｇＧ
）ＩｇＧ１ＯＮｇ／セファロース１ｄ）　ヒト正常血清
を活性炭で処理してＴ３を除いた血清にＴ３を加え（０
〜８ｎｇ／ｄ）、コノ標準血清’１００　ａＬに０．３
Ｎ　ＮａＯＨ５０ｍ１を加えて３７℃で２０９間処理し
た。０．３　ＮＨＣ１５０＃ｌを加えて中和した後、緩
衝液Ｇで希釈した（抗Ｔａ）ＩｇＧｌｄと同じく緩衝液
Ｇで希釈したＴ８−７β−Ｄ−ガラクトシダーゼ０．１
ｄを加え３７°Ｃで１時間反応させた。反応液を（抗ウ
サギＩｇＧ）ＩｇＧ不溶化セファロースのカラム（０，
１−７）に流し、実施例１と同様にカラムを洗浄後、ｏ
−ＮＰＣ溶液を流し、１時間の酵素反応を行なったとこ
ろ第３図に示す検量線が得られた。

実施例８．インスリン抗体の定量 インスリン−β−Ｄ−ガラクトシダーゼは加藤らの方法
（化学と生０Ｊ１４巻、７３７ページ。

１９７６年）に従って、Ｓ−アセチルメルカプト無水コ
ハク酸にてＳＲ基を導入したブタインスリンとβ−Ｄ−
ガラクトシダーゼをＮ、Ｎ’−０−フェニレンジマレイ
ミドによって結合させて調製した。ウサギ（抗モルモッ
トＩｇＧ）ＩｇＧおよび（抗モルモットＩｇＧ）ＩｇＧ
不溶化セファロースは実施例１に準じて調製した。

モルモット（抗インスリン）血清をモルモット正常血清
で希釈したもの３μｌと緩衝液Ｇで希釈したインスリン
−β−Ｄ−ガラクトシダーゼｌ１１ｊを混合し３７°Ｃ
で１時間反応させた。この反応液を（抗モルモッ）Ｉｇ
Ｇ）ＩｇＧ　不溶化セフ１０−スのカラム（０，ＩＪ）
に流し、洗浄後実施例１に準じて１時間の酵素反応を行
なったところ第４図に示す検量線を得た。一方、加藤ら
の方法（化学と生物１４巻、７３７ページ）に従りて調
製した（抗モルモットＩｇＧ）ＩｇＧ不溶化シリコン片
を同じ（抗インスリン）血清３１１１を緩衝液ＧＯ，５
ｄに加えたものに加え、３７℃で２時間反応後、シリコ
ン片を洗浄した。次にこのシリコン片をインスリン−β
−Ｄ−ガラクトシダーゼを含む緩衝液ＧＯ，５＠Ｊに入
れ、３７℃で２時間反応させた。反応後シリコン片を洗
浄し、０−ＮＰＣ溶液に入れ、３７°Ｃで４時間反応さ
せたが、（抗インスリン）血清の希釈率を下げても酵素
活性は上昇せず検量線は描けなかった。即ちシリコン片
では不溶化し得る（抗モルモッ）ＩｇＧ）ＩｇＧが極め
て少量であるため、試料中に大量に存在するモルモット
のＩｇＧにより測定が妨害されることが分かる。

実施例４．サイロキシン（Ｔ４）の定量スタフィロコッ
カス−アウレウス （Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　）の
菌体より抽出精製したプロティンＡをＣＮＢｒ活性花セ
ファロースと反応させ、プロティンＡ不溶化セファロー
スを調製した（プロティンＡ５■／セフアロース１−）
。一方、実施例２の方法に準じてＴ４−β−Ｄ−ガラク
トシダーゼ、ウサギ（抗Ｔｓ）ＩｇＧを調製した。

Ｔ４溶液（Ｔ４０〜３２μｇ／ｄｉ）ｓｏμｍに緩衝液
Ｇにて希釈した（抗Ｔ３）　ＩｇＧとＴ４−β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼを加え、３７℃で１時間反応させた後、
反応液をプロティンＡ不溶化セファロースのカラム（０
，１７）に流し、カラムを洗浄後、カラム内にて１時間
の酵素反応を行ない第５図の検量線を得た。

実施例５．インスリン抗体の定量 実施例３と同じ方法で（抗モルモッ）ＩｇＧ）ＩｇＧ不
溶化セファロースの代りにプロティンＡ不溶化セファロ
ースを用いてインスリン抗体を測定したところ第３図と
ほぼ同じ検量線を得た。

実施例６６　　不溶性担体の再生 実施例２と同じ方法でＴ３を測定した後使用した（抗ウ
サギＩｇＧ）ＩｇＧ不溶化セファロースのカラムに３０
ｍＭジチオスレイトールを流し、免疫反応生成物を溶出
し、セファロースに結合しているグルタチオンのＳＨ基
を還元状態とし、更に２．２′−ジチオジピリジン溶液
を流してセフ１０−ス−（グルタチオン−２−ピリジル
ジスルフィド）即ち活性化チオールセファロースのもと
の状態とした。この再生した活性化チオールセファロー
スに再びヤギ（抗ウサギＩｇＧ）ＩｇＧを不溶化し、Ｔ
３を測定したところ第３図と同じ検量線が得られた。こ
の操作を数回くり返して行なったが検量線に変化はなか
った。

実施例７．血清中の干渉物質の影響の抑制実施例１に準
じてヤギ（抗ヒトＩｇＥ）血清よりＩｇＧクラクション
を調製した（ＩｇＥ−イムノグロブリンＥ）。この（抗
ヒトＩｇＥ）ＩｇＧより実施例１に準じて（抗ヒトＩｇ
Ｅ）Ｆａｂ’−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、（抗ヒトＩ
ｇＥ）ＩｇＧ不溶化セファロースを調製した。

標準ＩｇＥ溶液を緩衝液Ｇにて希釈したＩｇＥ標準液（
ＩｇＥ　Ｏ〜１００　ｕ／ｘｉ　）　０．１ｍと（抗ヒ
トＩｇＥ　）　Ｆａｂ’−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを
含む緩衝液ＧＱ、４．ｖを混合し、３７ｃＣで１時間置
いた後、反応液を（抗ヒ）ＩｇＥ）ＩｇＥ不溶化セファ
ロースのカラム（０，１ｄ）に流し、カラムを洗浄後、
酵素活性を測定した。同時にヒト血清と各々の血清に１
０υ／ｄのＩｇＧを加えたものについて測定し、標準曲
線より血清に添加したＩｇＥの回収率を求めた（測定系
−Ｇ）。

次に緩衝液Ｇの代りに緩衝液ＡＣ０，１ＭＮａＣ１１ｍ
　Ｍ　Ｍｇ　Ｃｌ　ｚ、０．１％牛血清アルブミン　０
．１％ＮａＮ１を含むＩ）ｌＨ７のｌＱｍＭリン酸緩衝
波緩衝液いて添加回収率を調べた（測定系−人）。

以上の結果を表−１に示す。即ちＮａＣ１濃度を上げ、
ゼラチンを緩衝液に添加するこ、之により干渉物質の影
響が除かれ、添加回収率は１００％に近（なった。

実施例８゜　α−フェトプロティン（ＡＦＰ）の定量 ヤギ（抗ヒ）ＡＦＰ）血清より実施例１に準じて（抗ヒ
トＡＦＰ）ＩｇＧ、（抗ヒトＡＦＰ　）Ｆａｂ’−β−
Ｄ−ガラクトシダーゼを調製した。

一方、トヨバールＨＷ−５５（東洋曹達工業社製）をエ
ピクロルヒドリンで活性化し６−アミノカプロン酸を不
溶化し、カルボキシペンチル−トヨパールを調製し、水
溶性カルボジイミドを用いて（抗ヒトＡＦＰ）ＩｇＧを
結合させた（（抗ヒトＡＦＰ）ＩｇＧ不溶化トヨパール
、（抗ヒトＡＦＰ　）　ＩｇＧ　ｔ、５　ｍｙ／　）ヨ
パールＩＭｔ）。

５０ｇ１（７）ヒトＡＦＰ標準液（０〜８００ｎｇ／ｄ
）または検体血清と緩衝液Ｇで希釈した（抗ヒトＡＦＰ
）Ｆａｂ’−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ１ｄを混合し、
３７°Ｃで１時間反応させた。　この反応液を（抗ヒ）
ＡＦＰ）ＩｇＧ不溶化トヨパールのカラム（０，１−２
）に゛流し、カラムを洗浄後、カラムに０−ＮＰＧ溶液
を流し、８７’Ｃで２時間反応させ、カラムをＮａ　２
　Ｃｏ、溶液で洗浄しＡ４２０ｎｍを測定した。

一方、ラジオイムノアッセイ法によって同じ検体血清の
ＡＦＰ濃度を測定したところ、本発明法による測定値は
ラジオイムノアッセイ法による測定値とＶ−１，１５ｘ
＋１８．９　（単位ｎｇ／ｄ、検体数５検体数量０．相
関係数６）の関係式で示され、良好な相関性を示した。

実施例９．サイロキシン抗体の測定 実施例４で用いたプロティンＡにＳ−７セチルメルカブ
ト無水コハク酸にてＳＨ基を導入し活性化チオールセフ
ァロースに不溶化した（プロティンＡ５＋＋ｖ／セフア
ロース１−）ウサギ（抗Ｔ４）血清をウサギ正常血清に
て希釈し、その３μｌと緩衝液Ｇにて希釈したＴ４−β
−Ｄ−ガラクトシダーゼ０．５ｄを混合し３７℃で２時
間反応後、プロティンＡ不溶化セファロースのカラム（
０，１−７）に流し、カラムを洗浄後酵素活性を測定（
３０分反応）し、第６図に示す検量線を得た。同時に（
抗Ｔａ）血清をカラムに流し、カラムを洗浄後、Ｔ４−
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ溶液をカラムに流し、カラム
を洗浄後酵素活性を測定したところ第６図とほぼ同じ検
量線が得られた。

使用したカラムを実施例６に準じて再生し、再びＳＨ基
を導入したプロティンＡを不溶化し抗サイロキシン抗体
を定量したところ、第６図と同じ検量線が得られた。

実施例１Ｏ，トリョードチロニンの定量実施例２と同じ
方法で標準血清および検体卑情についてＴａを測定した
。一方、同じ検体血清についてラジオイムノアッセイ法
でＴａを測定した。両者の相関式は’！−０，９５８ｘ
＋０．５９１（単位ｎｇ／ｄ、検体数７７、相関係数０
．９２１）となり、本発明法による測定値はラジオイム
ノアッセイ法の測定値と良好な相関性を示した。

一方、直径６籠、厚さ０．４ｍのペーパーディスクを１
．１′−カルボニルジイミダゾールで活性化し、（抗ウ
サギＩｇＧ）Ｉ’ｇＧを不溶化した（（抗ウサギＩｇＧ
）ＩｇＧ　　１０ａｇ／ペーパーディスク）。このペー
パーディスクを実施例２と同じ方法で反応させた反応液
に１枚づつ入れ、３７℃で２時間振盪しながら反応させ
た。反応後ペーパーディスクを緩衝液Ｇで洗浄し、次に
０−ＮＰＧ溶液にペーニ（−ディスクを入れ、３７℃で
８時間酵素反応を行ない、反応液のＡ４２０ｎｍを測定
した。本発明法でＴａを定量した７７検体について、こ
の方法でＴａを定量したところラジオイムノアッセイ法
との相関式はｙ−０，５００ｘ＋１．１６、相関係数は
０．４９１となった。

即ち、ペーパーディスクを用いた場合、血清中の干渉物
質の影響を除去するためにゼラチンと食塩を反応液に加
えても、干渉作用を除去できずラジオイムノアッセイ法
との相関性も本発明法に比べて極端に悪くなる。

実施例ＬＬ、　　サイロキシンの定量 Ｔ４を緩衝液Ｇに溶解した標準液５０μｌとＴ４−β−
Ｄガラクトシダーゼ溶液０．５ｊ、ウサギ（抗Ｔ４）血
清５００倍希釈液０．５ｄを混合し、３７℃で１時間反
応後、実施例１とに準じて同じ方法で反応させた反応液
に１枚づつ入れ、３７℃で２時間振盪しながら反応させ
た。反応後ペーパーディスクを緩衝液Ｇで洗浄し、次に
０−ＮＰＣ溶液にペーパーディスクを入れ、３７℃で８
時間酵素反応を行ない、反応液のＡ４２０ｎｍを測定し
た。本発明法でＴａを定量した７７検体について、この
方法でＴａを定量したところラジオイムノアッセイ法と
の相関式はｙ−０，５００ｘ＋１．１６、相関係数は０
．４９１となった。

即ち、ペーパーディスクを用いた場合、血清中の干渉物
質の影響を除去するためにゼラチンと食塩を反応液に加
えても、干渉作用を除去できずラジオイムノアッセイ法
との相関性も本発明法に比べて極端に悪くなる。

実施例１１．サイロキシンの定量 Ｔ４を緩衝液Ｇに溶解した標準液５０μｌとＴ４−β−
Ｄガラクトシダーゼ溶液０．５ａ＃、ウサギ（抗Ｔａ）
血清５００倍希釈液０．５ｄを混合し、８７ｃＣで１時
間反応後　実施例１とに準じて反応液をプロティンＡ不
溶化セフ１０−スのカラムに流し、カラムを洗浄後酵素
活性を測定したところ第７図Ａの検量線を得た。

次にＴ４−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ溶液を２倍に希釈
し、ウサギ（抗Ｔ４）血清の希釈率５０００倍にして同
じく測定したところ第７図Ｂの検量線を得た。酵素反応
時間はＡが１時間Ｂは２時間とした。Ａの検量線ではｌ
　ｎｇから１００　ｎｇのＴ４が測定されるのに対し、
Ｂの検量線では０．１　ｎｇから１０　ｎｇのＴ４が測
定される。即ち、同じ方法でも試薬の量を調節すること
により定量可能な範囲を自由に選択できることが分かる
。

実施例１２．　　ト、　ＩＪヨードチロニンの測定実施
例２に準じてヒト血清８検体のＴ、濃度を各々の検体に
ついて２０回測定し１平均値と変動係数（ｃｖ）を計算
した。

同じ標準液と検体につい°て、同じ方法で反応させた反
応液をカラムに流さずに０．１ｄの（抗ウサギＩｇＧ）
ＩｇＧ不溶化セファロースを加えファロースを分離し、
更にセファロースに緩衝液Ｇ１．７を加えて懸濁後、遠
心分離した。洗浄を更に１回行なった後セファロースを
０−ＮＰＧ溶液ｌ―に懸濁し、８７℃で１時間反応後、
０−２　Ｍ　ＮａｚＣＯａ溶液１ｄを加え、遠心分離に
より上澄を分離し、上澄のＡ４２０ｎｍ　　を測定した
。この方法によりヒト血清３検体について平均値と変動
係数を計算した。

以上の結果を表−２に示す。

表−２ 表−２の結果より明らかなように、同じ（抗ワサギＩｇ
Ｇ）ＩｇＧ不溶化セファロースを用いても、遠心分離に
よる方法は特に低濃度領域において本発明法より変動係
数が大きく、測定誤差ばらつきが多いことが分かる。

実施例１３．サイロキシンの定量 Ｔ４を緩衝液Ｇにｉ解した標準液５０μｌとＴ４−β−
Ｄ−ガラクトシダーゼ溶液溶液１セｌ合し、実施例１に
準じて調製した（抗Ｔ４）ＩｇＧ不溶化セファロース（
（抗Ｔ４）ＩｇＧｏ、５■／セフアロースｄ）のカラム
（０，１−７）４こ流し、カラムを洗浄後、０−ＮＰＣ
溶液を流し３７°Ｃで１時間反応させた後、カラムを０
．１　Ｍ　Ｎａ、Ｃｏ３で洗浄しＡ４２０ｎｍを測定し
た。　得られた検量線を第８図に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明において用いるカラムの１例を示すもの
であり、第２図、第３図、第４図、第５図および第６図
は本発明におけるインスリン、Ｔ３、モルモット（抗イ
ンスリン）抗体、Ｔ４およびウサギ（抗Ｔ４）抗体゛の
標準曲線を示すものであり、第７図は測定試薬の量によ
るＴ４標準曲線の変化を示す図であり、第８図は実施例
１３におけるＴ４の標準曲線を示すものである。 第１図 インスリン　（μＵΔｄ） Ｔｓ　（”ν／ｄ） モルモット（抗インスリン）血清希釈率Ｔ４（μｆ／ｄ
ｌ　） ウサギ（抗Ｔ、）ｆｌｉｔ清希釈率 ０　　　　　　１０　　　　　　２０　　　　　　１１
０　　　　　　４０７４（μｆ／ｄｌ） 手続補正書（自発） 昭和５７年１０月６日 特許庁長官　若　杉　和　夫　　　殿 １、事件の表示 特　願　昭５６−１５６，８１２号 ２、発明の名称 カラムを用いる酵素免疫測定法 ３１．補正をする者 事件との関係　特許出願人 天野製薬株式会社 ４、代理人 東京都港区虎ノ門１−１−１２．虎ノ門ビル５０５号（
６２１７）久　　高　　将　　信（外−名）５、補正の
対象 明細書の発明の詳細な説明及び図面の簡単な説明の各構
盤うイＣ逍＝＼、 ６、補正の内容 特願昭５６−１５６，８１２号１手続補正書（１）　　
明細書第３２頁矛１１行と第１２行との間に次の文を挿
入します。 「実施例１４．　　カラムを用いる分泌型イムノグロブ
リンＡ（以下Ｓ−ＩｇＡと略す）の定・　　　　　　　
−・量 実施例１に準じて調製したβ−ガラクトシダ・−ゼ標識
ＳＣ抗体希釈液０．１　ｍｌとＳ−４ｇＡ溶液（緩衝液
Ｇに溶解）１ｍｌを混合し、３７Ｃで１時間反応させた
後９反応液を（抗ヒ）　ＩｇＡ　）　ＩｇＧ−不溶化セ
ファロースのカラム（０，１ｍｌ　）に流した。（抗ヒ
トＩｇＡ　）　ＩｇＧは、ウサギ（抗ヒトＩｇＡ　）血
清よシ実施例１（１）の方法に準じてｒｇＧフラクショ
ンを調製し、これとＣ！ＮＢｒ活性化セファロース（フ
ァルマシア社）と混合し、−晩攪拌して調製した。 （（抗ヒトＩｇＡ）ＩｇＧ５ｎｆ　／セファロース１１
１Ｌｌ）。 反応液を流したカラムを緩衝液Ｇで洗浄後、０−ニトロ
フェニル−β−β−Ｄ−ガラクトシド溶液（１０ｗｒｙ
／ｍｌ　、緩衝液Ａ）０．１　　−ｍｌをカラムに流し
、３７Ｃで２時間反応後、カラムを０．０８　ＭＮａ２
ＧＯ，ｌ　ｍｌで洗浄液−のＡ　４２０　ｎｍを測定し
たところ牙９図に示す検量線を得た。 実施例１５．　　ブタカルシトニンの定量（１）　　ブ
タカルシトニン ブタカルシトニンはブタ甲状腺よｐ　、　Ｈ，Ｂｒｙａ
ｎＢｒｅｗｅｒらの方法（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ
ｆ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　２４３
巻、２１号、５７３９頁、１９６８年）に従って、脱脂
した甲状腺から抽出してセファデックスＣ）−５０，セ
ファデックスＧ−２５゜カルボキシメチルセルロース、
を用いて精製した。 （２）酵素標識カルシトニンの調製 酵素標識カルシトニンの調製は、（１）で調製じたブタ
カルシトニンのアミノ基とＬ　ｃｏｌｉのβ−ガラクト
シダーゼのチオール基を４−（マレイミドメチル）シク
ロヘキサン−１−カルボン酸のＮ−ヒドロキシサクシニ
ミドエステルを用いて結合させて調製した。 （３）　　カルシトニン抗体の調製 抗カルシトニン血清は（１）で調製したカルシトニン０
．５ｒＩｖＩをＦｒｅｕｎｄｓ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａ
ｊｕｖａｎｔと混合して、ウサギに１週問おきに１０回
免疫して採血した血清を用いた。抗体は加藤らの方法（
Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　
８１巻、１５５７頁、１９７−７年）Ｋ従ってＩｆＧフ
ラクションを集めカルシトニン抗体を調製した。 （４）　　矛２抗体不溶化担体の調製 抗つサギＩｆＧ血清（ヤギ）は医学生物研究所（名古屋
）よシ購入したものを用いた。矛２抗体は（３）と同様
の方法で調製した。 矛２抗体（抗ウサギＩｆｆ）抗体）４００曙を０．５Ｍ
　Ｎａ（’１を含む０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８，３）
１５０１ｄＫ溶かし、　　０ＮＢｒ活性化セフアロース
１０２を加えて、４Ｃ１晩反応させて矛２抗体不溶化担
体を調製した。 （５）測定法 ブタカルシトニン標準液（カルシトニン０〜１５０ＭＲ
Ｏミリ単位／ｍｌ　）　０．１　ｍｌにカルシトニン抗
体希釈液を１　ｍｌ加え、この液にβ−ガラクトシダー
ゼ標識カルシトニンＱ、　ｌ　ｍｌを加えて、３７Ｃで
１時間反応させた。次に矛２抗体不溶化担体をＱ、　ｌ
　Ｒｅ詰めたカラムに上記反応液１　ｍｌを流した。次
にカラムを緩衝液Ｃ）　（０，５％ゼラチン、　　０．
３　ＭＮａＯｌ　。 １　ｍＭ　Ｍｔ０１２０．１　％　ＮａＮ３．０．１　
％牛血清アルブミンを含むｐＨ７の１０ｍＭリン酸カリ
ウム緩衝液）１　ｍｌテ２　回洗った後、０−ニトロフ
ェニル−β−Ｄガラクトピラノシド溶液（１０ｍｙ／ｒ
ｎｌ緩衝液Ｇ）０、１　ｍｌをカラムに流し、３７Ｃで
１時間反応波カラムに０．０８　Ｍ炭酸ナトリウム０．
５屑ｌを２回流゛して洗浄し、洗浄液の４２０　ｎｍの
吸光度を測定した。その結果才１０図に示す検量線を得
た。 ブタカルシトニンのｌ　ＭＲＯ単位はＤｉｖｉｓｉＱｎ
　ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　５ｔａｎｄａｒｄ、Ｎａ
ｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉ、ｔｕｔｅ　ｆｏｒＭｅｄｉ
ｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌｏｎｄｏｎから供給され
る０ａｌ−ｃｉｔｏｎｉｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５ｔａ
ｎｄａｒｄ　Ａ　４０　ｍｌに相当するカルシトニン量
である。 実施例１６．８−１００タンパクの定量実施例１に準じ
て調製した（抗生Ｓ−１００タンパク）ＩｆＧｌｏｒｎ
ＩｊをｘｏｍｉのＣＮＢｒ活性化セファロースと反応さ
せ、（抗生Ｓ−１００タンパ・り）工ｆＧ不溶化セファ
ロース？調製し、これ゛をＯｌｌ・ｍｌ容の小カラムに
充填した。 Ｓ−１００タンパクをＧ液に溶解し標準液（０〜１Ｏｒ
Ｌ枕／ｌ１ｌ）を調製し、この標準液５０μｌにＧ液１
　ｒｚｌを加えて、上記のカラムに流した後、カラムを
２ｍｌのＧ液で洗浄した。 次に実施例１に準じて調製した抗体Ｆａｂ’−β−Ｇａ
／　ｌ　ｍｌ　（５ｍ　ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）をカラムに
流し、更にＧ液２　ｍｌでカラムを洗浄した。 次ニカラムにＯ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシ
ド溶液（１０ｍｆＪ／ｍｌ　）　Ｏ８２ｍｌを流し、室
温で１時間置いた後、　　０．０８　Ｍ　Ｎａ、Ｃ！０
３．　２　ｍｌでカラー１００タンパクを加えて上と同
様に測定し、添加したＳ−１００タンパクの回収率を調
べたところ１表−３の結果となった。即ちいずれの試料
にても添加量に比例してＳ−１００タンパクが回収され
ていることがわかる。 表　　−３ 測定値 Ｓ−１００タンパク添加量 試料番号　Ｏｎｇ／ｍＡ！　　０．５　ｎ、ｇ／ｍ／　
　１．０　ｎｇ／ｍ／１　　　　０．２１　　　０．６
９　　　　１．３０２　　　　０．４０　　　０，８５
　　　　１．３３３　　　　０．３７　　　０．９０　
　　　１．４２（２）　　明細書１３３頁第１行の全文
を抹消し、かわシに次の文を挿入します。 ｒ１３におけるＴ、の標準曲線を示すものであり。 矛９図は実施例１４＆ＣおけるＳ−ＩｇＡの標準曲線を
示すものであり、１１０図は実施例１５におけ暮ブタカ
ルシトニンの標準曲線を示すものであシ。 矛１１図は実施例１６における５−ｉｏｏタンイメクの
標準曲線を示すものである。　」 （３）　　図面に別紙の矛９図、牙１０図及び矛１１′
図を補充します。 一以上一 青９　口 Ｓ−ＩｇＡ　（ｎｇ／ｙａｊ） 介１０１ｉｉｎ ５０　　　１００　　　１５０ ブタかルシトニン（ｍｕ／ｄす 舟１１　図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、定量すべき抗原と酵素で標識された該抗原に対する
   抗体（酵素標識抗体）を反応させた後、反応液を該抗原
   に対する抗体を結合せしめた不溶性担体（抗体不溶化担
   体）のカラムに流し該反応液中の抗原−酵素標識抗体結
   合物を該カラムに結合せしめるかまたは定置すべき抗原
   を抗体不溶化担体のカラムに流した後酵素標識抗体をカ
   ラムに流して酵素標識抗体−抗原−抗体不溶化担体結合
   物を形成せしめた後、該カラム内にて酵素活性を測定し
   抗原を定量することを特徴とするカラムを用いる酵素免
   疫測定法。 ２、定量すべき抗原と酵素で標識された抗原（酵素標識
   抗原）を該抗原に対する抗体に競争的に結合させた後、
   反応液を該抗体に対する抗体（第二抗体）を結合せしめ
   た不溶性担体（第二抗体不溶化担体）のカラムを二流し
   、該反応液中の抗体−酵素標識抗原結合物を該カラムに
   結合せしめ、該カラム内にて酵素活性を測定し抗原を定
   量することを特徴とするカラムを用いる酵素免疫測定法
   。 ８、定量すべき抗体と酵素標識抗原とを反応させた後、
   反応液を第二抗体不溶化担体のカラムに流し、該反応液
   中の抗体−酵素標識抗原結合物をカラムに結合せしめる
   か、又は定量すべき抗体を第二抗体不溶化担体のカラム
   Ｇこ流した後、酵素標識抗原をカラムに流して、酵素標
   識抗原−抗体−第二抗体不溶化担体結合物を形成せしめ
   た後、該カラム内にて酵素活性を測定し抗体を定量する
   ことを特徴とするカラムを用いる酵素免疫測定法。 ４、第二抗体不溶化担体の代りにプロティンＡ不溶化担
   体を用いることを特徴とする特許請求の範囲第２項又は
   第３項記載のカラムを用いる酵素免疫測定法。 ５　定量すべき抗原と酵素標識抗原とを混合し、該混合
   液を抗体不溶化担体のカラムに流し、該カラムに結合し
   た酵素標識抗原の酵素活性を該カラム内にて測定し抗原
   を定量することを特徴とするカラムを用いる酵素免疫測
   定法。 ６、抗体、第二抗体またはプロティンＡと不溶性担体と
   の結合が可逆的な結合であり、測定終了後該結合を切断
   し免疫反応物を除き、再び抗体、第二抗体またはプロテ
   ィンＡを不溶性担体に結合せしめ、不溶性担体を繰り返
   し測定に使用することを特徴とする特許請求の範囲第１
   項から第５項記載のカラムを用いる酵素免疫測定法。 ７、　測定系に疎水性蛋白質と塩類を共存させて、生体
   体液中に含まれる干渉物質の影響を抑制することを特徴
   とする特許請求の範囲第１項から第６項記載のカラムを
   用いる酵素免疫測定法。