DK173095B1 - Immunokemisk metode til bestemmelse af stabilt glycosyleret hæmoglobin og diagnostisk system til brug ved denne metode, sam - Google Patents

Description

i DK 173095 B1

Den foreliggende opfindelse angår en imrounokeraisk metode til bestemmelse af stabilt glycosyleret hæmoglobin og et diagnostisk system til brug ved denne metode, samt en fremgangsmåde til omdannelse af stabilt glycosyleret hæmoglo-5 bin til glucitollysinhæmoglobin.

Glycosylerede hæmoglobiner (glycohæmoglobiner) er hæmoglobiner, som er bundet kovalent til en sukkerrest.

Dvs. glycohæmoglobiner er additionsprodukter (addukter) fra reaktionen mellem hæmoglobin og en sukkerart. Gluco-10 hæmoglobiner er en underklasse af glycohæmoglobin, som omfatter hæmoglobin bundet til glucose. Glycosylering er en uspecifik reaktion, om hvilken det er rapporteret, at den resulterer i addition af forskellige sukkerarter eller sukkerphosphater til humane hæmoglobiner AQ, A2, C, D, E, 15 F og S.

Glucohæmoglobin Alc (HbA^c) er det glycohæmoglobin, som der er mest af, og som er mest vidtgående undersøgt.

HbAlc betyder HbAQ, som har D-glucose bundet til amino-gruppen af det N-terminale valin ved den ene eller begge 20 β-globinkæderne. Imidlertid er additionen af glucose til hæmoglobin ikke begrænset til N-terminussen af Ø-kæden og kan også forekomme ved £-aminogruppen af lysiner i både a- Og Ø-globinkæderne.

Reaktionsmekanismen og -kinetikken af glueoseaddition 25 til hæmoglobin er vist skematisk i fig. 1. D-Glucose i dets aldehydform reagerer hurtigt og reversibelt med en aminogruppe (tilvejebragt af en N-terminal valingruppe eller af £-aminogruppen af en intrakæde-lysinrest) til dannelse af et labilt aldimin (Schiff-base) -mellemprodukt. Dette 30 labile mellemprodukt (labilt glucohæmoglobin) kan dissociere tilbage til D-glucose og hæmoglobin, eller det kan undergå en irreversibel, men langsom Amadori-omlejring til dannelse af en stabil ketoamin (stabilt glucohæmoglobin).

Ketoaminen eksisterer igen i ligevægt med en hemiketal eller ringform (specifikt deoxyfructosyl-lysin).

Dannelsen af stabilt glucohæmoglobin er en ikke- 0 2 DK 173095 B1 enzymatisk proces, som forløber langsomt og kontinuerligt under erythrocytens levetid. Hastigheden af glucohæmo-globin-dannelse er direkte afhængig af et individs evne til at regulere blodsukker (glucose) -niveauer. Derfor 5 har information med hensyn til koncentrationen af totalt stabilt glucohæmoglobin af HbAlc opnået accept som til-vejebringende en objektiv, tidsgennemsnitlig overvågning af glukæmi hos diabetes mellitus-patienter.

De forskellige metoder til bestemmelse af mængden 10 af totalt glycohæmoglobin eller en bestemt glucohæmoglo-binart, såsom HbA^c, og de metodiske problemer knyttet til sådanne procedurer er beskrevet i Goldstein et al.,

Clin. Chem., 31:1060-1067 (1985), og Jovanovic et al.,

Am. J. Med., 70:331-338 (1981). For eksempel lider radio-15 immunobestemmelsen (RIA) for HbA^c beskrevet af Javid et al., Br. J. Haematology, 38:329-337 (1978), under anvendelsen af antistoffer, som har lav affinitet og krydsreaktivitet med ikke-glucosyleret hæmoglobin.

I nyere tid har Curtiss et al., J. Clin. Invest., 20 72:1427-1438 (1983) beskrevet anvendelsen af monoklonale antistoffer, som immunoreagerer med glucitollysinrest-holdige epitoper, til bestemmelse af nærværelsen af gluco-sylerede plasmaproteiner, som har relativt korte halveringstider. Disse forfattere beskriver også inhibering af 25 binding af nogle af deres monoklonale antistoffer til glucitollysin-plasmaproteiner med glucitollysin-hæmoglobin.

En glucitollysinrest dannes ved reduktion af det ovennævnte Amadori-omlejringsprodukt, når ketoaminformen af den glucosylerede £-aminogruppe af lysin (Amadori-30 produkt) reduceres med et vand-foreneligt borhydrid-re- duktionsmiddel, såsom natriumborhydrid eller natriumcyano-borhydrid. Således har Curtiss et al. vist, at gluco-plasmaproteinet i en prøve kan reduceres og omdannes til glucitollysin-holdigt plasmaprotein og derefter bestemmes 35 under anvendelse af glucitollysin-specifikke monoklonale antistoffer, hvorved problemet med kryds-reaktivitet iagttaget med ikke-glucosylerede plasmaproteiner undgås.

3 DK 173095 B1

Som det kan ses af figur 1, giver in-vitro-reduk-tionsprocessen imidlertid glucityllysinrester i både de labile og stabile former af glucohæmoglobin. Metoden ifølge Curtiss et al., ovenfor, anvendt på hæmoglobin i stedet for 5 et plasmaprotein, kan således ikke uden videre skelne mellem mængden af labile og stabile former af glucohæmoglobin til stede i en prøve.

Ifølge både Goldstein et al., ovenfor, og Jovanovic et al., ovenfor, skal bestemmelsesmetoden, for at en 10 glucohæmoglobin-bestemmelse giver et pålideligt index af langvarig glukæmisk kontrol, skelne mellem de labile og stabile former af glucohæmoglobin. Der er to grunde hertil.

For det første er den totale mængde glucohæmoglobin 15 til stede i en erythrocyt, på et hvilket som helt givet tidspunkt, summen af både de labile og stabile fraktioner.

For det andet fluktuerer mængden af labilt glucohæmoglobin til stede i erythrocyter hurtigt som respons på kortvarige glucose-niveauer. Dvs. dannelsen af den labile fraktion 20 er tilstrækkelig hurtig, sammenlignet med den langsomme irreversible dannelse af den stabile ketoamin, til, at akutte ændringer i blodglucose vil resultere i en forøgelse af det totale glucohæmoglobin, i alt væsentligt som et resultat af en forøgelse af den labile fraktion. Der-25 for kan indbefatning af den labile fraktion i enhver måling af glucohæmoglobin afspejle et akut eller kortvarigt respons på blodglucose-niveauer og behøver ikke at afspejle graden af langvarig glukæmisk kontrol.

De i øjeblikket tilgængelige chromatografiske, 30 elektroforetiske og immunologiske metoder til bestemmelse af glycohæmoglobin kan ikke skelne mellem de labile og stabile former af glucohæmoglobin, når begge er til stede i prøven. Følgelig har der været en betydelig forskning for at udvikle bestemmelsesmetoder, som omfatter 35 en procedure til fjernelse af den labile glucohæmoglobin-fraktion fra prøven før bestemmelsestrinnet.

Rapporterede metoder til fjernelse af labilt gluco- 4

O

DK 173095 B1 hæmoglobin fra en prøve er typisk afhængige af, at prøven underkastes betingelser, som fremmer dissocieringen af den labile form til en glycose, såsom glucose (en aldose) og hæmoglobin. Disse metoder omfatter inkubering af ery-5 throcyterne i normal saltopløsning i 24 timer før hæmolyse (Goldstein et al., Diabetes 29:623-628 (1980)), dialyse af hæmolysatet i 48 timer mod glucose-fri phosphatpuffer (Widness et al., J. Lab. Clin. Med. 95:386-394 (1980) og fortynding og efterfølgende koncentrering ved ultrafil-10 trering af hæmolysatet (Innanen et al., Clin. Chem.

27:1478-1479 (1981)).

Af særlig interesse med hensyn til den foreliggende opfindelse er de metoder, som anvender et surt inkubationstrin til fjernelse af labilt glycohæmoglobin. Nathan et 15 al., Diabetes, 30:700-701 (1981), beskriver en bestemmelsesmetode, ved hvilken erythrocyterne inkuberes i en opløsning indeholdende semicarbazid og analin ved en pH-værdi på 5 i 30 minutter ved 38°C til fjernelse af den labile fraktion. Den stabile glycohæmoglobinfraktion, f.eks.

20 glucohæmoglobin, bestemmes derpå under anvendelse af enten højtryksvæskechromatografi (HPLC) eller citratagar-gel-elektroforeseseparationsmetoder.

Metoden beskrevet af Bisse et al., Diabetes, 31:630-633 (1982), fjerner den labile fraktion fra prøven, som 25 skal bestemmes, ved lysering af erythrocyterne i 50 volumener af en opløsning indeholdende 0,05 M kaliumbi-phthalat ved en pH-værdi på 5 i 15 minutter ved 37°C.

Mængden af stabilt glycohæmoglobin, som bliver tilbage i prøven, fra hvilken labilt glycohæmoglobin er fjernet, 30 bestemmes derpå ved HPLC.

Der har imidlertid ikke været nogen rapporter til dato vedrørende anvendelse af et surt trin til fjernelse af labilt glycose, f.eks. glucose, under anvendelse af biphthalsyre eller på anden måde i kombination med reduk-35 tionstrin under anvendelse af et vand-foreneligt borhydrid-reduktionsmiddel til dannelse af glucitallysinhæmoglobin, som er immunologisk bestemmeligt.

0 5 DK 173095 B1

Den foreliggende opfindelse omhandler en metode til bestemmelse af mængden af stabilt glycohæmoglobin, såsom glucohæmoglobin, i en glycohæmoglobinprøve. Det labile glucohæmoglobin til stede i prøven fjernes først ved 5 blanding af den glucohæmoglobin-holdige prøve med phthal-eller biphthalsyre i et forhold på mindst ca. 1,5 mmol syre pr. mg hæmoglobin i et vandigt medium ved en pH-værdi på ca. 3 til ca. 6 til dannelse af en sur reaktionsblanding. Blandingen holdes i et i forvejen bestemt tidsrum 10 under i forvejen bestemte betingelser, sådan at det labile glucohæmoglobin, som er til stede, dissocierer til glucose og hæmoglobin, medens det stabile glucohæmoglobin til stede i den oprindelige prøve bevares.

Den sure reaktionsblanding blandes derpå med et 15 vandforeneligt borhydrid, fortrinsvis natrium- eller kaliumborhydrid i et forhold på mindst ca. 0,15 mmol borhydrid pr. mg hæmoglobin til dannelse af en vandig reduktionsreaktionsblanding . Reduktionsreaktionsblandingen holdes i et i forvejen bestemt tidsrum og under sådanne 20 betingelser, at de glucosylerede lysiner, som er til stede, omdannes til glucitollysinrester, og der dannes glucitol-lysin-hæmoglobin.

Efter fraskillelse af eventuelt uomsat borhydrid fra glucitollysin-hæmoglobinet til stede i den reducerede 25 prøve bestemmes den mængde glucitollysin-hæmoglobin, som er til stede, ved velkendte immunologiske bestemmelsesmetoder, som anvender glucitollysin-specifikke receptormolekyler. Det skal forstås, at denne metode, indtil den immunologiske bestemmelse af glucitollysin-hæmoglobin, 30 også kan anvendes til fremstilling af glucitollysin-hæmoglobin udefra stabilt glucohæmoglobin i en grucohæmoglofrin-prøve, som indeholder både labilt glucohæmoglobin og stabilt hæmoglobin.

Opfindelsen omhandler også et diagnostisk system, 35 som typisk er i form af et sæt, og som indeholder et stort antal særskilte pakninger. En første pakning indeholder en fastfase-matriks, såsom en mikrotiterplade, på hvis 0 6 DK 173095 B1 brøndoverflader bestemmelsen kan udføres. En anden pakning indeholder en i forvejen bestemt mængde af det vandforenelige borhydrid-reduktionsmiddel i fast form. En tredje pakning indeholder passende glucitollysin-specifikke 5 receptormolekyler i tør eller flydende form. En fjerde pakning indeholder phthal- eller biphthalsyrer. Systemet kan desuden omfatte én eller flere yderligere pakninger, som indeholder ét eller flere yderligere anvendelige reagenser .

10 Den foreliggende opfindelse frembyder forskellige fordele.

En fordel er, at koncentrationen af stabilt hæmoglobin i en glucohæmoglobinprøve indeholdende både labile og stabile glucohæmoglobiner kan bestemmes relativt hur-15 tigt, nemt og akkurat.

En anden fordel ved den foreliggende opfindelse er, at glucitollysin-hæmoglobin kan fremstilles ud fra den stabile glucohæmoglobindel af en glucohæmoglobinprøve med udelukkelse af glucitollysin-hæmoglobin fremstillet 20 ud fra den labile glucohæmoglobindel af prøven.

En anden fordel ved opfindelsen er, at det fremstillede glucitollysin-hæmoglobin er mere antigent end det, der fremstilles ved andre metoder.

Yderligere fordele ved den foreliggende opfindelse 25 vil blive åbenbare for fagfolk ud fra den følgende beskrivelse .

I figurerne, som danner en del af beskrivelsen, illustreres følgende:

Fig. 1 er en skematisk afbildning, som illustrerer 30 reaktionssekvensen for den ikke-enzymatiske glucosylering af de α-frie (amlnoterminalt valin) og β-frie (lysin) aminer af hæmoglobin, betegnet "protein" i figuren, til dannelse af labile og stabile glucohæmoglobiner, og den efterfølgende reduktion af mellemprodukter til dannelse 35 af de glucitol-substituerede slutprodukter.

Fig. 2 omfatter tre grafer, som illustrerer resultaterne af kompetitive inhiberingsforsøg gennemført ved

O

7 DK 173095 B1 blanding af peberrod-peroxidase-mærkede G6C9-receptorer (HRPO-G6C9) med forskellige koncentrationer af potentielle konkurrenter Cm G6C9-antistof-kombineringsstedet. Abscissen i hver graf viser koncentrationen i mikrogram pr.

5 milliliter (pg/ml) af de anvendte inhibitor-opløsninger. Ordinaten i hver graf viser ""brøkdelen af maksimal""binding, dvs. mængden af binding opnået med HRPO-G6C9 i fraværelse af kompetitiv inhibitor, som bliver tilbage eller opnås efter omsætning med de forskellige potentielle 10 inhibitorer.

Figur 2A illustrerer resultaterne opnået under anvendelse af glucitollysin (A), reduceret poly-L-lysin (□), reduceret a-T-Boc-lysin (·), reduceret ikke-gluco-syleret hæmoglobin (Δ) og reduceret poly-L-valin () 15 som potentielle konkurrenter . Disse resultater viser, at af denne gruppe inhiberer kun den positive kontrol, glucitollysin, bindingen af HRPO-G6C9-receptorer, og derfor giver reduktion alene i fraværelse af glucose ikke epi-topen genkendt af HRPO-G6C9.

20 Figur 2B illustrerer resultaterne opnået under anvendelse af glucitollysin (A), glucosyleret poly-L--lysin (O), glucosyleret a-T-Boc-lysin (· ), glucosyleret hæmoglobin (Δ) og glucosyleret poly-L-valin () som potentielle konkurrenter. Disse resultater viser, at kun 25 den positive kontrol, glucitollysin, inhiberer binding.

Således giver glucosylering alene ikke epitopen genkendt af HRPO-G6C9.

Figur 2C illustrerer resultaterne opnået efter glucosylering og derpå reduktion af poly-L-lysin (□ ), 30 a-T-Boc-lysin (·), hæmoglobin (Δ) og poly-L-valin () .

Disse resultater viser, at når poly-L-lysin og hæmoglobin glucosyleres og reduceres, kan de begge konkurrere om HRPO-G6C9-antistof-kombinerende steder på lignende måde som den positive kontrol, glucitollysin. Kun glucosyle-35 ret og reduceret poly-L-valin kunne ikke konkurrere væsentligt, hvilket således viser, at HRPO-G6C9-receptorer ikke immunoreagerer med det N-terminale glucosylerede

O

8 DK 173095 B1 valin af hæmoglobin.

Figur 3 omfatter to grafer, som illustrerer de uventede resultater, der opnås, når glucitollysin-dannelse i en hæmoglobinprøve gennemføres ved reduktion i nærværel-5 se af phthalsyre.

I figur 3A er glucohæmoglobin-holdige hæmoglobinprøver tilvejebragt som 10 mikroliter (pi) af en pakket RBC-pellet opnået fra blodet af enten et diabetisk individ (trekant) eller et normalt individ (firkant). Prøverne 10 reduceres under anvendelse af enten NaBH^ (^ ,□) eller KBH^ (A ,U) som vandforeneligt borhydrid-reduktionsmiddel og underkastes derpå bestemmelse for glucitollysin-hæmoglobin-danneIse. Hæmoglobin-koncentrationen i hver af reduktionsreaktionsblandingerne er 2,4 mg pr. ml. Koncen-15 trationen af borhydridet i hver af blandingerne er vist på abscissen.

Figur 3B illustrerer resultaterne opnået for de samme to hæmoglobinprøver og de samme to reduktionsmidler, når reduktionen gennemføres efter omsætning af prøverne 20 med phthalsyre. En sammenligning af resultaterne i figur 3A med resultaterne i figur 3B viser, at omsætning med phthalsyre før reduktion med borhydrid resulterer i en væsentlig forøgelse af bestemmeligt glucitollysin-hæmoglo-bin, som bestemt ved immunologisk binding af HRPO-G6C9-25 -receptorerne. Glucitollysin-hæmoglobinet fremstillet som beskrevet under anvendelse af phthalsyre og et bor-hydrid-reduktionsmiddel udviser således forøget antigeni-tet. Denne konstaterede forøgede mængde af bestemmeligt glucitollysin-hæmoglobin (antigenitet) er uventet.

30 Figur 4 illustrerer virkningen af at variere holdetidsperioden for reduktionsreaktionsblandingen. Sure reaktionsblandinger fremstillet under anvendelse af forskellige fortyndinger af helblod fra enten en diabetisk eller normal kvinde blandes med det samme volumen 0,10 M 35 phthalsyre. Koncentrationen af hæmoglobin (Hb) i de sure reaktionsblandinger, i mg Hb/ml, er som følger: 27,0, 10,8, 5,4, 2,7, 1,08, 0,675, 0,54, 0,415, 0,337 og 0,270. Mængden 0 9 DK 173095 B1 af mmol syre pr. mg hæmoglobin i hver af de ovennævnte blandinger er hhv. 1,85, 4,63, 9,26, 18,5, 46,3, 74,07, 92,6, 120,5, 148,5 og 185,2.

Efter hæmolysat-danneIse fremstilles reduktions-5 reaktionsblandinger ved blanding af hvert hæmolysat med det samme volumen 400 mM NaBH^. De reciprokke værdier af de færdige fortyndinger af hæmoglobinprøverne er vist på abscissen. Fra venstre til højre og med stigende hæmoglobinfortynding er mængden af mmol NaBH4 pr. mg hæmoglo-10 bin i hver af reduktionsreaktionsblandingerne 0,0148, 0,037, 0,074, 0,148, 0,37, 0,593, 0,74, 0,964, 1,187 og 1,481.

Resultaterne vist i figur 4 viser, at bibeholdelse af reduktionsblandingerne i 30 minutter for både de dia-15 betiske (□) og normale (fl) prøver giver mere bestemme-ligt glucitollysin-hæmoglobin end en 15 minutters bibeholdelse af disse blandinger for både de diabetiske (Δ) og normale (A) prøver.

Figur 5 er et diagram, som illustrerer virkningen 2o af forskellige sure reaktionsblandinger på dannelsen af bestemmeligt glucitollysin-hæmoglobin som en funktion af syren i reaktionsblandingerne. Blandingerne fremstilles ved blanding af 10 pi af en pakket RBC-pellet opnået fra enten en diabetisk () eller normal (□) blodprøve og 25 615 pi af én af de følgende 0,05 M opløsninger (pH-værdi

4-5): phthalsyre (A) , citrat (E), eddikesyre (F), phosphat (G), D(+)-glucosamin (H), α-ketoglutarsyre (I), oxaleddi-kesyre (J), oxal-di-kaliumsyre (K), ravsyre (L) og pyro-druesyre (M) efterfulgt af reduktion med NaBH4 og bestem-30 melse af glucitollysin-hanoglobin-indholdet ved ELISA

beskrevet herefter. Kontroller omfatter destilleret vand (B), inkubering natten over (ca. 18 timer) af RBC'er i isotonisk saltopløsning og derefter destilleret vand (C) eller phthalsyre (D). Kontrollerne bestemmes som ovenfor 35 beskrevet. Mængden af bestemmeligt dannet glucitollysin- hæmoglobin udtrykkes som en optisk tæthedsværdi (O.D.) ved 490 nm.

Resultaterne vist i figur 5 viser, at den klassiske metode til fjernelse af labilt glucohæmoglobin fra en prøve, o 10 DK 173095 B1 dvs. inkubering natten over af RBC-pelleten i saltopløsning (C), ikke potenserer dannelsen af glucitollysin på samme måde som phthalsyre. Disse resultater illustrerer også potentieringen af bestemmeligt glucitollysin under 5 anvendelse af en kombination af phthalsyre og et vandforeneligt borhydrid-reduktionsmiddel.

Figur 6 er en graf, som illustrerer de resultater, der opnås, når bestemmelsesmetoden ifølge den foreliggende opfindelse gennemføres med sure reaktionsblandinger, som 10 har koncentrationer på enten ca. 0,05 M (O) eller ca.

0,025 Μ (A) phthalsyre. Der er også vist de resultater, der opnås, når hæmolysaterne dannet under anvendelse af en sur reaktionsblanding, som har en koncentration på 0,05 M phthalsyre, ikke underkastes reduktion (). Andre 15 kontroller omfatter de resultater, der opnås, når der ikke anvendes nogen phthalsyre-behandling før NaBH^-reduk-tionen (0) og inkubering af RBC-pelleten natten over i isotonisk saltopløsning før reduktion, men uden phthalsyre-behandling (Δ) .

20 Koncentrationerne af hæmoglobin i de sure reaktions blandinger i mg/ml er 75, 50, 37,5, 30, 25 og 21,4. Koncentrationerne af hæmoglobin i hver af de respektive reduktionsreaktionsblandinger i mg/ml er 37,5, 25, 18,75, 15, 12,5 og 10,7. Koncentrationen af NaBH^ i reduktionsreaktions-25 blandingerne er 200 mM.

Figur 7 er et diagram, soiT illustrerer O .Ί57-4 9 0-værdierne opnået under anvendelse af vandige phthalsyre-opløsninger, som har pH-værdier på 3,5, 4,5 og 6,5, til fremstilling af sure reaktionsopløsninger. Diabetiske hæmoglobinprøver 30 nummer 1 () og nummer 2 O) og normale prøver nummer 1 (i 1) og numrvsr 2 (O) har totale glycosylerede hæmoglobinniveauer på hhv. 14,7%, 10,7%, 7,5% og 8,0%, som bestemt under anvendelse af Gly-Affin-systemet (Isolab, Akron, OH), ifølge fabrikantens anvisninger.

35 Figur 8 er et diagram, som illustrerer virkningen af

at variere den sure reaktionsblandings holdetidsperioder. Blandingerne dannes under anvendelse af 0,05 M

o 11 DK 173095 B1 phthaisyre, som har en ikke-indstillet pH-værdi på ca.

4,3. De anvendte prøver er de samme som dem, der er beskrevet i figur 7, dvs. diabetiske prøver nr. 1 () og nr. 2 O), normale prøver nr. 1 (□) og nr. 2 (E2) .

5 Figur 9 illustrerer virkningen af at holde reduktionsreak tionsblandingerne ved enten stuetemperatur eller ved 37°C under anvendelse af hæmoglobin i koncentrationer på 27,0-0,27 mg/ml i de sure reaktionsblandinger og 13,5-0,135 mg/ml i reduktionsblandingerne. De sure reaktioner gennem-10 føres ved en phthalsyre-koncentration på ca. 0,05 M og ved en ikke-indstillet phthalsyre-pH-værdi (ca. 4,3). Reduktionsreaktionerne gennemføres ved en NaBH4-koncentration på ca. 200 mM.

Hæmoglobinprøver tilvejebragt som helblocfTfra 15 enten en diabetisk (åbent symbol) eller normal (udfyldt symbol) kvinde holdes i reduktionsreaktionen ved enten stuetemperatur (CJhhv.A) eller 37°C Ohhv.B;.

Figur 10 viser resultaterne af tilsætnings-“og gehvin-dingsforsøget, hvori hæraoglobinprøver, Indeholdende de forskel-20 lige viste forhold af en normal og en diabetisk blodprøve, undersøges. Det procentvise totale glycosylerede hæmoglobin i den ikke-blandede diabetiske og normale prøve bestemmes under anvendelse af Gly-Affin-systemet (Isolab) og viser sig at være 18,56% hhv. 5,45%. Yderligere detaljer 25 ved dette forsøg er anført i eksempel 8.

Udtrykket "antistof" henviser til et molekyle, som er et medlem af en familie af glycosylerede proteiner betegnet immunoglobuliner, som kan kombineres specifikt med et antigen. Sådan et antistof kombineres med dets 30 antigen ved en specifik immunologisk bindingsvekselvirkning mellem den antigene determinant .af antigenet og antistoffets antistof-kombinerende sted.

Et "antistof-kombinerende sted" er den strukturelle del af et antistofmolekyle bestående af tung og let 35 kæde-variable' og -hypervariaHl'é regioner, som specifikt binder antigen. Under anvendelse af nomenklaturen ifølge Jerne, (1974) Ann. Immunol. (Inst. Pasteur), 125C:373-389,

O

12 DK 173095 B1 omtales et antistof-kombinerende sted også som en "paratop".

Polypeptiddele af antistoffer indeholdende et antistof-kombinerende sted (paratop) er de dele af antistofmolekyler, som indeholder paratopen og binder til et anti-5 gen, og omfatter f.eks. antistoffernes Fab-, Fab1-, F(ab')2“ F(v)-dele. Fab- og F(ab')2-dele af antistoffer fremstilles ved proteolytisk reaktion af papain hhv. pepsin på i alt væsentligt intakte antistoffer ved velkendte metoder. Se for eksempel US patentskrift nr. 4.342.566.

10 Fab'-Antistofdele er også velkendte og produceres ud fra F(ab')2~dele efterfulgt af reduktion af disulfid-bindingerne, som forbinder de to tunge kædedele, f.eks. med mercapto-ethanol, og efterfulgt af alkylering af den fremkomne pro-teinmercaptan med et reagens, såsom iodoacetamid. Intakte 15 antistoffer foretrækkes og anvendes som eksempler på de monoklonale ligandmolekyler ifølge den foreliggende opfindelse .

Ordet "antigen" er blevet anvendt historisk til at betegne en enhed, som bindes af et antistof, og~også 20 til at betegne den enhed, som bevirker produktion af antistoffet. Mere gængs sprogbrug begrænser betydningen af antigen til den enhed, som bindes af et antistof, medens ordet "immunogen" anvendes for den enhed, som bevirker antistof-produktion. Når en enhed omtalt i den foreliggende 25 beskrivelse er både immunogen og antigen, vil den sædvanligvis blive omtalt som et antigen.

Udtrykket "antigen determinant" henviser til den egentlige strukturelle del af antigenet, som immunologisk bindes af' et antistof-kombinerende sted. Jerne-Nomen-30 klaturen omdefinerer en antigen determinant som en "epi-top" .

Udtrykket "biologisk aktiv" henviser i det mindste til et proteinholdigt molekyles evne til specifikt at binde antigen eller et specifikt antistof-kombinerende sted, selv 35 om anden generel eller effektor-evne også kan være til stede i dette molekyle. Biologisk aktivitet af et receptormolekyle indeholdende et antistof-kombinerende sted påvises o 13 DK 173095 B1 ved immunologisk reaktion af paratopen (antistof-kombinerende sted) med dens epitop (antigen determinant) ved blanding deraf i et vandigt medium til dannelse af en immunoreaktant, i det mindste ved fysiologiske pH-værdier og ionstyrker.

5 Fortrinsvis forekommer biologisk aktivitet under biologiske bestemmelsesbetingelser, som defineres i det følgende.

"ELISA" henviser til en enzym-bundet iramunosorbens-bestemmelse, som anvender et antistof eller antigen bundet til en fast fase og et enzym-antigen- eller enzym-antistof-io konjugat til påvisning og kvantificering af mængden af antigen eller antistof til stede i en prøve. En beskrivelse af ELISA-teknikken findes i kapitel 22 af 4. udgave af Basic and Clinical Immunology af D.P. Sites et al., udgivet af Lange Medical Publications, Los Altos, CA, 1982, og i 15 US patentskrifterne nr. 3.654.090, 3.850.752 og 4.016.043.

"Enzym" henviser til et protein, som ved katalytisk indvirkning kan accelerere eller producere en vis ændring i et substrat, for hvilket det ofte er specifikt.

Udtrykket "immunoreagere" i dets forskellige former 20 betyder binding mellem et receptormolekyle og en epitop.

"Immunoreaktant", som anvendt i den foreliggende beskrivelse, henviser til produktet fra en immunologisk reaktion, dvs. den enhed, der produceres, når et receptormolekyle immunologisk bindes til en epitop.

25 Udtrykkene "mærkemidler", ”indikatorgruppe" eller "mærkestof" anvendes ensbetydende iden foreliggende beskrivelse og omfatter enkelte atomer og molekyler, som enten er direkte eller indirekte involveret i produktionen af et påviseligt signal til påvisning af nærværelsen af en immuno-30 reaktant. Ethvert mærkemiddel kan knyttes til eller inkorporeres i en receptor eller anvendes særskilt, og disse atomer eller molekyler kan anvendes alene eller i forening med yderligere reagenser. Sådanne indikatorgrupper eller mærkestoffer er selv velkendte inden for immunokemien og 35 udgør kun en del af den foreliggende opfindelse, for så vidt som de anvendes med ellers nye metoder og/eller systemer.

Udtrykket "receptor" anvendes i den foreliggende be- o 14 DK 173095 B1 skrivelse for at betegne et biologisk aktivt molekyle bestående af et antistof-kombinerende sted, som binder immunologisk til (eller med) et antigen. Sådan binding sker typisk med en affinitet på ca. 10^ til ca. 1010 liter pr.

5 mol og er en specifik vekselvirkning mellem antigenets epitop og receptorens antistof-kombinerende sted.

Ordene "udskille" og "producere" anvendes ofte ensbetydende inden for teknikken til at betegne celler, ud fra hvilke der fås antistofmolekyler. Celler, der producerer 10 antistoffer, behøver imidlertid ikke at udskille disse molekyler i deres miljø. Hybridomacellerne af interesse i den foreliggende beskrivelse udskiller monoklonale antistoffer i deres miljø. Ikke desto mindre omtales sådanne celler undertiden i den foreliggende beskrivelse som "antistof-produce-15 rende" celler, og deren antistoffer omtales undertiden som værende "produceret" svarende til udtrykkets anvendelse inden for teknikken. Dele af de ovennævnte antistoffer (receptorer) indeholdende antistof-kombinerende sted omtales ligeledes i den foreliggende opfindelse som værende "pro-20 duceret" eller "udskilt", selv om det skal forstås, at sådanne molekyler fremstilles ud fra antistoffer, som selv "produceres" eller "udskilles".

Udtrykket "ovenstående væske" anvendes i den foreliggende beskrivelse for at henvise til in vitro-væskeme-25 diet, i hvilket cellerne dyrkes. Monoklonale antistoffer produceret af hybridoma-kulturerne af interesse i den foreliggende beskrivelse udskilles i deres dyrkningsmedium. Derfor er den ovenstående dyrkningsmedievæske for disse celler en foretrukken kilde til de monoklonale receptor-30 molekyler og kan let fås fri for hybridomaceller ved velkendte metoder. Eksempler på sådanne metoder er centrifugering ved lav hastighed til sedimentering af celler fra væskemediet. Monoklonale receptormolekyler kan alternativt fås ud fra ascitestumorvæske (ascitesvæske) fra laboratorie-35 dyr, i hvilke der er indført hybridomavæv. Begge metoder er velkendte inden for teknikken. Monospecifikke receptormolekyler, som også er omtalt i den foreliggende beskrivelse,

O

15 DK 173095 B1 udskilles i blodet hos værtsdyrene, i hvilke de produceres. Metoder til opnåelse af sådanne antistoffer er også velkendte inden for teknikken.

B. Glucitollysin-hæmoglobin 5 Produktionsmetoder_

Den foreliggende opfindelse omhandler en metode til produktion af glycitollysin-hæmoglobin ud fra glycohæmo-globin, idet der f.eks. anvendes glucitollysin-hæmoglobin og glucohæmoglobin. Glucitollysin-hæmoglobinet produceret 10 ved denne metode har en uventet forøget antigenitet i forhold til glucitollysin-hæmoglobin produceret ved metoder kendte inden for teknikken. Grunden til den iagttagede forøgede antigenitet er ukendt.

Der tilvejebringes en prøve af glucohæmoglobin, som 15 har en kendt mængde hæmoglobin. Det således tilvejebragte glucohæmoglobin kan være til stede som indeholdt i erythro-cyter (røde blodlegemer) eller som frie molekyler,

Metoder til opnåelse af glucohæmoglobin samt til bestemmelse af nærværelsen af glucohæmoglobin et velkendte 20 inden for teknikken. Endvidere er metoder til glucosylering af proteiner og polypeptider i almindelighed og hæmoglobin i særdeleshed velkendte inden for teknikken. Se for eksempel US patentskrift nr. 4.478.744 og Curtiss et al., J. Clin. Invest., 72:1427-1438 (1983).

25 Typisk tilvejebringes en glucohæmoglobinprøve som en kendt mængde helblod og mere foretrukket som et kendt volumen pakkede røde blodlegemer (RBC). Metoder til tilvejebringelse af blodprøver og pakkede røde blodlegemer samt metoder til lysering af RBC'erne indeholdt deri er velkendte 30 inden for teknikken.

(a) Glucohæmoglobin-prøven blandes i et vandigt medium med en kendt mængde phthalsyre eller biphthalsyre til dannelse af en sur reaktionsblanding. Mængden af syre er tilstrækkelig til at tilvejebringe et forhold på mindst 35 ca. 1,5 mmol phthalsyre pr. mg hæmoglobin, fortrinsvis et forhold på mindst ca. 15,0 mmol syre pr. mg hæmoglobin og mere foretrukket mindst ca. 45,0 mmol syre pr. mg hæmoglobin.

0 16 DK 173095 B1

Syren tilvejebringes typisk som en vandig opløsning med en pH-værdi fra ca. 3 til ca. 6, fortrinsvis fra ca. 4 til ca. 5, og mere foretrukket fra ca. 4,1 til ca. 4,5.

Det vandige medium tilvejebragt af syreopløsningen kan så-5 ledes tilvejebringe det vandige medium af den sure reaktionsblanding.

Metoder til bestemmelse af den molære mængde hæmoglobin i en prøve er velkendte inden for teknikken.

(b) Den'dannede sure reaktionsblanding holdes JTet 10 i forvejen bestemt tidsrum fra sekunder til timer. Et tidsrum på ca. 10 minutter til ca. 15 minutter er sædvanligvis tilstrækkeligt til i alt væsentligt at dissociere og fjerne labilt glucohæmoglobin, som kan være til stede, medens det stabile glucohæmoglobin oprindeligt til stede 15 i prøven bevares. Hvis det ønskes, kan blandingen imidlertid bevares i et tidsrum fra ca. 16 til ca. 20 timer uden nogen skadelige konsekvenser.

Når glucohæmoglobinprøven tilvejebringes som Tvele RBC'er virker syreopløsningen som en RBC-lyseringsopløs-20 ning (middel), således at RBC'erne under opretholdelsen af den sure reaktionsblanding lyseres, hvorved hæmoglobinet indeholdt deri frigøres til dannelse af et hæmolysat. Fra det således dannede hæmolysat fjernes labilt glucohæmoglobin, og hæmolysatet indeholder det stabile hæmoglobin til 25 stede i den oprindelige RBC-prøvedel.

(c) Den sure reaktionsblanding blandes dernæst med et vandforeneligt borhydrid-reduktionsmiddel til dannelse af en vandig reduktionsblanding. Den vandige del af reduktionsblandingen kan tilføres af vandet af den sure reak- 30 tionsblanding, af en vandig opløsning af borhydrid-reduk-tionsmidlet eller særskilt. Fortrinsvis tilvejebringer den sure reaktionsblanding mindst en del af den vandige del af reduktionsblandingen.

Vandforenelige borhydrid-reduktionsmidler er vel-35 kendte inden for teknikken og omfatter natriumborhydrid (NaBH^), kaliumborhydrid (KBH^) og natriumcyanoborhydrid (NaCNBH^). Den mængde bcrhydrid, som iblandes, er den o 17 DK 173095 B1 mængde, der er tilstrækkelig til at tilvejebringe et forhold på mindst ca. 0,015 mmol borhydrid (BH^j pr. mg hæmoglobin, fortrinsvis en mængde, der er tilstrækkelig til at tilvejebringe et forhold på mindst ca. 0,15 mmol bor-5 hydrid pr. mg hæmoglobin og mere foretrukket en mængde, der er tilstrækkelig til at tilvejebringe et forhold på mindst ca. 0,35 mmol borhydrid pr. mg hæmoglobin.

(d) Den dannede reduktionsreaktionsblanding holdes ved en temperatur på over ca. 0 til ca. 37°C, fortrinsvis 10 ca. 20 til ca. 37°C, i et i forvejen bestemt tidsrum fra sekunder til timer. Et tidsrum fra ca. 10 minutter til ca.

16-20 timer, fortrinsvis fra ca. 15 minutter til ca. 30 minutter, er sædvanligvis tilstrækkeligt til at reducere ketogruppe(n/erne) indeholdt i det stabile glucohamoglobin Ί5 til hydroxylgruppe(n/erne) af glucitollysinrest(en/erne) og danne glucitollysin-hsmoglobin.

(e) Det dannede glucitollysin-hæmoglobin fraskilles derpå fra det tilbageværende uomsatte borhydrid til dannelse af isoleret glucitollysin-hæmoglobin. Cellemateria- 20 let fra RBC-lyse fjernes også fortrinsvis i dette fraskil le Ises trin.

Metoder til fraskillelse af glucitollysin-hæmoglobinet fra det uomsatte borhydrid og resten af reduktionsreaktionsblandingen er også velkendte inden for teknikken. Sådanne 25 fraskillelsesmetoder omfatter geludelukkelseschromatografi, elektroforese, affinitetschromatografi og lignende. Når der anvendes en fastfase-bestemmelsesmetode, foretrækkes det at binde hæmoglobinderivatet til fastfase-matriksen til dannelse af en fast bærer og derefter simpelthen dekan-30 tere den flydende reduktionsreaktionsblanding fra den faste fase til gennemførelse af fraskillelsen. Den faste bærer indeholdende det bundne glucitollysin kan også vaskes efter dekanteringstrinnet.

Den ovenfor beskrevne metode kan anvendes til pro-35 duktion af glucitollysin-hæmoglobin, som er anvendeligt ved diagnostiske bestemmelsesmetoder og sæt, som anvendes til måling af glucohæmoglobin. Denne metode kan anvendes

O

18 DK 173095 B1 til fremstilling af andre ønskede glycitollysin-hæmoglobin-arter afhængigt af det bestemte lysin-sukker-addukt, som er til stede.

C. Bestemmelsesmetoder 5 Den foreliggende opfindelse angår også en metode til bestemmelse af mængden af stabilt glycohæmoglobin i en hæmoglobinprøve, igen under anvendelse af glucohæmoglo-bin som eksempel.

Den tidligere beskrevne metode til fremstilling af 10 glucitollysin-hæmoglobin anvendes til fremstilling af isoleret glucitollysin-hæmoglobin i trin (e), ovenfor, ud fra en prøve indeholdende en kendt mængde haanoglobin.

Dernæst gennemføres de følgende trin.

(f) Det isolerede glucitollysin-hæmoglobin blandes 15 med receptorer, som immunoreagerer med glucitollysin-holdige epitoper, og som i alt væsentligt er frie for krydsreaktivitet med glucitollysin-frit hæmoglobin, til dannelse af en immunoreaktionsblanding. De anvendelige receptorer blandes typisk i støkiometrisk overskud over 20 den mængde glucitollysin, som forventes at være til stede.

Receptormolekyler, som udviser de ovenfor beskrevne immunoreaktiviteter, omtales i den foreliggende beskrivelse som "glucitollysin-specikke" receptormolekyler eller receptorer. Det skal forstås, at sådanne receptormolekyler 25 kan krydsreagere med andre dele, såsom reducerede Amadori-produkter af andre sukker-hæmoglobin-addukter, eller manni-tollysin-rester. For nemheds skyld omtales alle de reducerede stabile hæmoglobin (Amadori) -produkter som glucitol-lysinrester, og således omtales receptormolekyler, som 30 immunoreagerer med disse reducerede produkter, som "gluci-tollysin-specifikke”. De anvendelige receptormolekyler kan også krydsreagere med andre dele, såsom sorbitol, mannitol, reducerede Amadori-produkter af plasma og andre proteiner samt frie aminosyrer, såsom lysin eller argin.

35 Imidlertid er disse andre dele ikke til stede i immunoreak-tionsblandingen, som er anvendelige ved den foreliggende opfindelse, så nogen yderligere krydsreaktiviteter af de o 19 DK 173095 B1 anvendelige receptormolekyler er ikke relevante for den foreliggende opfindelse.

Metoder til fremstilling af anvendelige receptorer, som immunoreagerer med glucitollysin-hæmoglobin og udviser 5 ringe eller ingen immunologisk krydsreaktivitet med hæmoglobin, som ikke indeholder glucitollysin-rester, dvs. glucitollysin-specifikke receptormolekyler, er velkendte inden for teknikken. Typisk kræver disse metoder i begyndelsen fremstilling af et immunogen indeholdende glucitol-10 lysin-rester.

Som tidligere beskrevet, er metoder til glycosylering af proteiner og syntetiske polypeptider i almindelighed og glucosylering af disse dele i særdeleshed velkendte inden for teknikken. Endvidere er metoder til omdannelse 15 af lysinrester, som har glucose bundet kovalent til deres £ -aminogrupper, til glucitollysin-rester, som ved reduktion med et vandforeneligt borhydrid-reduktionsmiddel, også velkendte inden for teknikken. Se Curtiss et al., J. Clin. Invest, 72:1427-1438 (1983). Endvidere er metoder til 20 fremstilling af receptorer under anvendelse af protein- og polypeptidimmunogener også velkendte inden for teknikken.

For eksempel beskriver Curtiss et al., ovenfor, en metode til fremstilling af hybridomaer, som producerer glucitollysin-specifikke monoklonale antistoffer (recep-25 torer) under anvendelse af immunogener indeholdende glucitollysin-rester. To hybridomaer, fremstillet ved denne metode, som udskiller monoklonale antistoffer, som immunoreagerer med glucitollysin-hæmoglobin, men ikke glucohæmo-globin eller hæmoglobin, er deponeret hos American Type 30 Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, ifølge Budapest Traktaten, den 20. september 1983 under de følgende ATCC-deponerlngsnumre:

Hybrldoma Subklon ATCC-deponerlngsnr.

35 G6C9 IC87G11 HB 8356 G8H9 2A1.5G8 HB 8358

O

20 DK 173095 B1

Monospecifikke antisera, som immunoreagerer med glucitollysin-hæmoglobin, men udviser ringe krydsreaktivitet med hæmoglobin, som ikke indeholder glucitollysin, kan også fremstilles under anvendelse af velkendte immunoab-5 sorptionsmetoder. For eksempel kan glucitollysin-hæmoglobin anvendes i stedet for HbA^c som immunogen ved metoden beskrevet i US patentskrift nr. 4.247.533. Antistoffer, som er immunospecifikke over for glucitollysin-hæmoglobin, kan derpå isoleres, dvs. der kan fremstilles et monospecifikt 10 antiserum,ved anvendelse af ikke-reduceret hæmoglobin og/-eller glucohæmoglobin som et immunoabsorptionsmiddel til absorption af krydsreaktive antistoffer. Forsøgsprocedurerne til overvågning af produktionsprocessen anvender glucitollysin-hæmoglobin som mål-antigen.

15 (g) immunoreaktionsblandingen holdes under biologis ke bestemmelsesbetingelser i et i forvejen bestemt tidsrum, såsom fra ca. 10 minutter til ca. 16-20 timer, fortrinsvis fra ca. 15 minutter til ca. 30 minutter, som er tilstrækkeligt for receptorerne til immunologisk at binde til 20 glucitollysin-hæmoglobinet, som er til stede, og danne en Immunoreaktant.

Biologiske bestemmelsesbetingelser er de betingelser, der bevarer aktiviteten af receptorerne og glucitollysin-hæmoglobinet, som ønskes bestemt. Disse betingelser omfat-25 ter et temperaturområde fra ca. 4 til ca. 45°C, en pH-værdi på ca. 5 til ca. 9 og en ionstyrke varierende fra ionstyrken af destilleret vand til ionstyrken af ca. 1 M natri-umchlorid. Metoder til optimering af sådanne betingelser er velkendte inden for teknikken.

30 (h) Mængden af immunoreaktant, som dannes i immuno reaktionsblandingen, bestemmes derpå og derved mængden af stabilt glucohæmoglobin til stede i prøven.

Bestemmelse af mængden af dannet immunoreaktant, enten direkte eller indirekte, kan gennemføres ved bestem-35 melsesmetoder, som er velkendte inden for teknikken. For eksempel kan der anvendes et homogent bestemmelsessystem som dem, der er beskrevet i US patentskrifterne nr. 4.536.479, o 21 DK 173095 B1 4.233.401, 4.233.402 og 3.996.345.

Ved foretrukne udførelsesformer indeholder receptorerne i trin (g), ovenfor, en indikatorgruppe eller et mærkestof, som kan signalere tilstedeværelsen af den mær-5 kede receptor i en immunoreaktant. Metoder til bestemmelse af nærværelsen og mængden af mærkede receptorer afhænger af det anvendte mærkestof; sådanne mærkestoffer og bestemmelsesmetoder er velkendte inden for teknikken.

Mærkningen af proteiriisTce specifikke bindende midler, 10 såsom receptorer, er velkendt inden for teknikken. For eksempel kan receptorer produceret af hybridomaer mærkes ved metabolisk inkorporering af radioisotop-holdige aminosyrer tilvejebragt som en bestanddel i vævsdyrkningsmediet.

Se for eksempel Galfre et al., Meth. Enzymol. 73, 3-46 15 (1981). Metoderne til proteinkonjugation eller -kobling via aktiverede funktionelle grupper er særligt anvendelige. Se for eksempel Aurameas et al., Scand. J. Immunol. Vol. 8, Suppl. 7, 7-23 (1978) og US patentskrift nr. 4.493.795. Desuden kan der foretages en sted-rettet 20 koblingsreaktion, således at mærkestoffet ikke interfererer væsentligt med immunoreaktionen af den anden receptor med dens mål-antigen. Se for eksempel Rodwell et al., Biotech.

3, 889-894 (1985).

Mærkemidlet kan være et fluorescerende mærkemiddel, 25 som binder kemisk til antistoffer eller antigener uden at denaturere dem til dannelse af et fluorchrom (farvestof), som er et anvendeligt immunofluorescerende sporstof. Egnede fluorescerende mærkemidler er fluorochromer, såsom fluor-esceinisocyanat (FIC), fluorescein!sothiocyanat (FITC), 30 5-dimethylamin-l-naphthalensulfonylchlorid (DANSC), tetra-methylrhodaminisothiocyanat (TRITC), lissamin, rhodamin 8200-sulfonylchlorid (RB 200 SC) og lignende. En beskrivelse af immunofluorescens-analysemetoder findes i DeLuca, "Immunofluorescence Analysis", i Antibody As A Tool, Marchalo-35 nis et al., eds,, John Wiley ft Sons, Ltd. pp. 189231 (1982).

Ved foretrukne udførelsesformer er indikatorgruppen et enzym, såsom peberrodperoxidase (HRPO), glucoseoxidase o 22 DK 173095 B1

eller lignende. I sådanne tilfælde hvor den væsentlige indikatorgruppe er et enzym, såsom HRPO eller glucoseoxi-dase, er yderligere reagenser nødvendige til visualisering af, at der er dannet et receptor-antigen-kompleks 5 (immunoreaktant). Sådanne yderligere reagenser for HRPO

omfatter hydrogenperoxid (^C^) og et oxidationsfarvestofforstadie, såsom diaminobenzidin eller o-phenylendiamin (OPD). Et yderligere reagens, som er anvendeligt med glucoseoxidase er 2,21-azino-di-(3-ethyl-benzthiazolin-10 -G-sulfonsyre) (ABTS).

Radioaktive elementer er også anvendelige mærkemidler og anvendes illustrativt i den foreliggende beskrivelse. Et eksempel på et radiomærkemiddel er et radioaktivt element, som producerer γ-stråle-emissioner. Ele- 2 4 125 15 menter, som selv udsender γ-stråler, såsom 4I, 3I, 128j, 131j^ 132j ^cr, udgør én klasse af indikatorg-rupper af radioaktive elementer, som producerer y-stråleemissioner.

125 Særligt foretrukket er I. En anden gruppe af anvendelige mærkemidler er sådanne elementer, såsom 11C, ^®F, ^0 og ^N, som selv 20 udsender positroner. De således udsendte positroner producerer γ-stråler ved sammenstød med elektroner, som er til stede i bestemmelsesblandingen. Også anvendelig er en 3--emitter, såsom ^^In eller .

Indikatormidlet kan bindes direkte til et receptor-25 molekyle, som er anvendeligt ved den foreliggende opfindelse, eller kan omfatte et særskilt molekyle. Indikatormidlet kan være et særskilt molekyle, såsom antistoffer, der binder til anvendelige receptormolekyler, såsom gede-· eller kanin-ånti-muse-antistoffer. Staphylococcus aureus pro-30 tein A kan også anvendes som en særskilt molekyleindikator eller mærkemiddel, hvor der anvendes hele eller i alt væsentligt hele receptormolekyler ifølge den foreliggende opfindelse, dvs. hvor der anvendes molekyler indeholdende den del af Fc-regionerne af receptormolekyler, som bin-' 35 defe af protein A. Ved sådanne anvendelser indeholder protein A selv et mærkestof, såsom et radioaktivt element eller et fluorchrom-farvestof.

0 23 DK 173095 B1

Ved en særligt foretrukken udøvelse gennemføres den ovenfor beskrevne bestemmelse som en heterogen fastfase-bestemmelse, ved hvilken det glucitollysin-holdige antigen bindes eller knyttes til en fastfase-matriks til dan-5 nelse af en fastfase-bærer. Antigenet kan bindes eller knyttes til den faste matriks ved en hvilken som helst velkendt kemisk eller fysisk metode. Selv om binding, f.eks. ved adsorption eller immunoreaktion, kun er et middel til sammenknytning, anvendes ordene "binde" og "knytte" 10 og deres forskellige grammatiske varianter i flæng i den foreliggende beskrivelse.

Fysisk binding ved adsorption af antigenet til væggene af mikrotiterpladebrønde anvendt som fastfase-ma-trikser illustreres i det følgende. Kemiske bindingsmetoder 15 omfatter binding med et første antistof, som binder til en hæmoglobin-epitop, som, når den er bundet, i alt væsentligt ikke interfererer med immunologisk binding af glucitol-lysin-epitoper med receptormolekylerne. Denne bestemmelsesteknik omtales sædvanligvis som en "sandwich"-bestemmelse.

20 En anden kemisk blndlhgsmetbde anvender et vandopløseligt carbodiimidreagens, såsom l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)--carbodiimid-hydrochlorid, til dannelse af et amid eller en ester mellem en carboxylsyre af matriksen og en amino-hhv. hydroxylgruppe af receptoren eller omvendt. Yder-25 ligere kemiske bindingsmetoder anvender polyfunktionelle~ reagenser, såsom glutaraldehyd eller cyanurchlorid, som også er velkendte.

Eksempler på faste matrikser, som er anvendelige ved de ovennævnte metoder, er velkendte inden for teknikken 30 og omfatter en fast matriks, såsom en 96-brønds mikrotiter-plade, forhandlet under betegnelsen Falcon Microtest III Flexible Assay Plates (Falcon Plastics, Oxnard, CA), eller en mikrotiterstrimmel indeholdende tolv brønde i en række, såsom de strimler, der forhandles under betegnelsen Immu-35 Ion I og II (Dynateet, Alexandria, VA). Mikrotiterstrimmelen eller -pladen er fremstillet af et klart plastmateriale, fortrinsvis polyvinylchlorid eller polystyren. Alter- 0 24 DK 173095 B1 native faste matrikser til anvendelse ved en tidligere beskreven metode ifølge opfindelsen omfatter polystyrenperler, ca. 1 til ca. 5 jam i diameter, som kan fås fra Abbot Laboratories, North Chicago, IL, polystyrenrør, 5 -stave eller -pinde med en hvilken som helst passende størrelse og polystyren-latex, hvis polystyrenpartikler har en størrelse på ca. 1 p og kan fremstilles ved centrifugering fra resten af latexen.

Den faste matriks kan også være fremstillet af mange 10 forskellige materialer, såsom tværbundet dextran, f.eks. "Sephadex G 25", "-50", "-100", ,,-200" og lignende, som kan fås fra Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ, agarose og tværbundet agarose, f.eks. "Sepharose 6B", "CL6B", "4B", "CL46" og lignende, som også fås fra Phar-15 macia Fine Chemicals.

Den ovenfor beskrevne bestemmelsesmetode kan anvendes til bestemmelse af mængden af enhver bestemt glycitol-lysin-hæmoglobinart, som er til stede i en hæmoglobinprøve, som ønsket, ved anvendelse af receptorer, som er immuno-20 specifikke for de ønskede glycitollysinarter.

D. Diagnostiske systemer

Et andet aspekt af den foreliggende opfindelse er et diagnostisk system, som typisk er i form af et sæt, og som er anvendeligt til gennemførelse af en tidligere 25 beskrevet bestemmelsesmetode. Systemet indeholder et stort antal pakninger.

En første pakning indeholder en fastfase-matriks som tidligere beskrevet. Denne matriks er fortrinsvis en plastmikrotiterplade eller -strimmel indeholdende et stort 30 antal brønde, f.eks. 96 eller 12, på hvis brøndoverflader der udføres en tidligere beskrevet bestemmelsesmetode.

En anden pakning indeholder en i forvejen bestemt mængde af det vandforenelige borhydrid-reduktionsmiddel.

Dette reagens leveres typisk som et tørt pulver.

35 En tredje pakning indeholder en kendt mængde passende gly.citollysin-specifikke receptormolekyler, fortrinsvis glucitollysin-specifikke receptorer, f.eks. dem, der ud- 0 25 DK 173095 B1 skilles af hybridomaerne med ATCC-deponeringsnumrene HB 8356 og HB 8358. Disse receptormolekyler er typisk til stede som et vandigt præparat eller som et frysetørret pulver.

Ved foretrukne udførelsesformer leveres receptorerne bun-5 det til en indikatorgruppe eller et mærkestof som tidligere omtalt.

En fjerde pakning indeholder en i forvejen bestemt mængde phthalsyre eller biphthalsyre. Syren kan også leveres opløst i et vandigt medium eller som et tørt fast stof.

10 Foretrukne udførelsesformer omfatter også en yder ligere pakning, som indeholder en glycitollysin-hæmoglobin-art, som immunoreagerer med de tilvejebragte receptorer.

Eller fortrinsvis indeholder pakningen glucitollysin-hæmo-globin, som har en kendt procentdel glucitollysin, der 15 anvendes som en standard eller kontrol. Yderligere pakninger, som også kan være med i systemet, omfatter sådanne, der indeholder puffersalte eller opløsninger, såsom PBS, et særskilt pakket indikatormiddel, såsom mærket protein A, eller mærkede anti-receptorantistoffer, særskilt pakkede 20 visualiseringsreagenser til en enzym-indikatormiddel, såsom hydrogenperoxid og et oxidationsfarvesto'fforstadium, yderligere kontroller og lignende.

Det skal forstås, at hver pakning indbefattet i systemet indeholder en sådan mængde af dens indhold, som 25 er tilstrækkelig til at gennemføre en bestemmelse, herunder passende kontroller. Fortrinsvis er der indeholdt en mængde, som er tilstrækkelig til at gennemføre flere bestemmelser, i hver pakning.

Den bedste metode til udøvelse af opfindelsen 30 De følgende eksempler illustrerer, men begrænser ikke den foreliggende opfindelse.

Eksempel 1: Hæmoglobinprøver Hæmoglobinprøver fås fra 118 diabetes-patienter, både mænd og kvinder, i alderen mellem 18 og 88 år. Prøver fås 35 også fra 35 normale voksne (normoglukæmiske), både mænd og kvinder, i alderen mellem 24 og 52 år. Prøverne fås fra Endocrinology and Diabetes Clinics of Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, California, og fra Kaiser Permanente, San Diego, California.

0 26 DK 173095 B1

Blodprøver opsamles i reagensglas Indeholdende ethylen-diamintetraeddikesyre (EDTA) som et antikoagulerlngsmiddel og underkastes centrifugering ved ca. 12.000-13.000 g i 3 minutter i en Beckman-mikrofuge 12 til dannelse af en 5 pakket pellet af røde blodceller (RBC) og en plasmafraktion. Plasmafraktionen kastes bort, og hæmoglobinprøven, som skal analyseres, tilvejebringes typisk som enten 10 eller 15 pliter af pelleten (pakkede RBC'er).

Til bestemmelse af antallet af mg hæmoglobin pr.

10 pi af en pakket RBC-pellet, som dannet ovenfor, blandes 1 volumen af en pellet med enten 1 volumen eller 3 volumener "Isoton III" (Coulter Electronic, Inc., Hialeah, FL) til dannelse af 1:2- hhv. 1:4-pelletfortyndinger. Hver pelletfortynding analyseres derpå for hæmoglobin-koncen-15 tration under anvendelse af en model S-Plus VI-Coulter-tæller (Coulter Electronics) ifølge fabrikantens instruktioner. Kortfattet omdannes hæmoglobinet til stede i fortyndingerne til cyanmethæmoglobin under anvendelse af Drab-kin's-reagens, og mængden, som er til stede, bestemmes spek-20 trofotometrisk ved absorbansen ved 540 ran.

Det gennemsnitlige antal mg hæmoglobin (Hb) pr. pi pakket RBC-pellet viser sig at være 0,294 mg Hb/pl . Denne værdi afrundes imidlertid, for nemheds skyld ved beregningerne, til 0,3 mg Hb/pl for adle~mængdébestemmelser, 25 beregnet på hæmoglobinprøver tilvejebragt som et kendt volumen af en pakket RBC-pellet.

Når hæmoglobinprøver tilvejebringes som et kendt volumen helblod, bestemmes mængden af tilstedeværende hæmoglobin under anvendelse af en gennemsnitlig værdi på 155 30 mg Hb/ml helblod for prøver opnået fra mænd og 135 mg Hb/ml for blodprøver opnået fra kvinder.

Eksempel 2: Produktion, rensning og mærkning af receptorer.

Hybridomaet, som har ATCC-deponeringsnummeret HB 8356, 35 producerer det monoklonale antistof G6C9 som beskrevet i Curtiss et al., J. Clin. Invest. 72:1427-1438 (1983). Ascites tumorvæsker indeholdende G6C9-receptormolekyler fås

O

27 DK 173095 B1 fra 10 uger gamle Balb/c-mus, som hver er forbehandlet med 0y3 ml mineralolie og injiceret intraperitonealt med 3-50 X 10^ HB-8356-celler. Den gennemsnitlige tid for udvikling af ascites er 12 dage. Efter klaring ved centri-5 fugering ved 15.000 g i 1 time ved 4°C sammenhældes ascitestumorvæskerne og oplagres i frosset tilstand ved -20°C.

G6C9-Receptorer renses ved at underkaste ascites-tumorvæskerne hurtig protéinvæskechroma tograf i (FPLC) ~ på en "Pharmacia Mono Q Hr 5/5"-anionbyttersøjle i et 10 Pharmacia PFLC-system under anvendelse af en 0-0,5 NaCl--gradient i 10 mM Tris, pH-værdi 8,0, og ved at følge anvisningerne leveret med søjlen.

De rensede G6C9-receptormolekyler kobles til peber-rodperoxidase under anvendelse af metoden beskrevet i 15 Nakane et al., J. Histochem. Cytochem., 22:1084-1089 (1974). Disse receptorer omtales i det følgende som HRPO-G6C9-receptorer.

Eksempel 3: Fremstilling af glucosylerede addukter

De følgende proteiner og forstadier underkastes 20 glucosylering og/eller reduktion: poly-L-lysin, poly-L- -valin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), a-T-Boc-lysin (Bachem, Torrance, CA), renset human-hæmoglobin (Sigma) og glucitollysin fremstillet ved proceduren beskrevet af Schwartz et al., Arch. Biochem. Biophys., 181:542-549 25 (1977).

Glucosylerede og reducerede addukter omtales som glc-RED-addukter. glc-RED-Addukterne fremstilles ved blanding af 2 ml af en 15 mg/ml opløsning af de forskellige ovenfor beskrevne proteiner og forstadier med 2 ml 240 ao mM glucose (Sigma) i phosphat-pufret saltopløsning (PBS) og 2 ml 37,5 mg/ml NaCNBH^ (J.T. Baker Chemical Co., Phillipsburg, NJ) i PBS, pH-v*rdi 7,4. De fremkomne blandinger holdes i forseglede glasrør (16 x 100 mm) i 120 timer ved 37°C. Addukterne overføres dernæst til dialyse-35 poser (Spectraphor, molekyludelukkelse 3.500)^6^ dialyseres indgående mod PBS i 72 timer ved 4°C, indstilles til en endelig koncentration på ca. 5 mg/ml og oplagres ved 4°C.

DK 173095 B1 o 28

Glucosylerede, men ikke-reducerede adduktkontroller (glc-NR) fremstilles ved at erstatte NaCNBH^ med 2 ml PBS ved den ovennævnte procedure.

Ikke-glucosylerede reducerede kontroller (RED-addukt-5 er) fremstilles ved at erstatte 240 mM glucose med 2 ml PBS ved den ovennævnte procedure.

Eksempel 4: Bestemmelse af antistof-specificitet ved kompetitiv inhibering glc-RED-, glc-NR- og RED-Addukterne fremstillet i 10 eksempel 3 fortyndes til koncentrationer fra 200 pg/ml til 0,39 pg/ml i PBS indeholdende 10% normalt gedeserum (NGS). 500 pi af de forskellige fortyndinger blandes derpå i glas med 500 pi af HRPO-G6C9-receptorerne fremstillet i eksempel 2 (fortyndet 1:150 i PBS indeholdende 10% NGS) 15 til dannelse af kompetitive immunoreaktionsblandinger. Blandingerne holdes i 1 time ved 37°C for at gøre det muligt for receptorerne immunologisk at binde alle glu-citollysinrest-holdige eller ikke-glucitollysinholdige, men krydsreaktive epitoper og danne en væskefase-immuno-20 reaktant.

De holdte kompetitive immunoreaktionsblandinger analyseres dernæst for mængden af ikke-bundne HRPO-G6C9--receptorer. Dette sker under anvendelse af fastfase-bundet glucitollysin-hæmoglobin som et mål- eller ind-25 fangningsantigen ved en ELISA.

Fastfase-bundet glucitollysin-hæmoglobin fremstilles ved først at blande 0,240 ml af en pakket RBC-pellet, fremstillet ifølge proceduren i eksempel 1 under anvendelse af blod fra en diabetisk patient, med 15 ml 30 destilleret vand indeholdende 0,05 mM phthalsyre (en 1:62,5-fortynding efter volumen). Den fremkomne sure ' reaktionsblanding holdes i 15 minutter ved 37°C til dannelse af et hæmolysat.

Dernæst blandes 50 pi af hæmolysatet med 50 pi 400 35 mM NaBH^ i en mikrotiterplades brønde (fast matriks).

Den fremkomne reduktionsreaktionsblanding holdes i 15 minutter ved 37°C for at muliggøre dannelse af glucitollysin-

O

29 DK 173095 B1 hæmoglobin, som ved slutningen af denne holdetid bindes til fastfasematriksen til dannelse af fastfase-bundet glu-citollysin-hæmoglobin (fast bærer) og en væskefase indeholdende ikke-omsat borhydrid og resten af reduktionsreak-5 tionsblandingen. Den fremkomne blandings faste og flydende faser adskilles. De faste bærere dannet af det adsorberede glucitollysin-hæmoglobin bundet til brøndvæggene af den faste matriks vaskes derpå 4 gange med 350 pi PBS indeholdende 0,05% "Tween 20" (polyoxyethylen-(20)-sorbitan-10 -monolaurat) til dannelse af isoleret fastfase-bundet glucitollysin-hæmoglobin.

Et volumen på 100 pi af hver af de holdte kompe-titive HRPO-G6C9/addukt-immunoreaktionsblandinger blandes derpå med fastfase-bundet glucitollysin-hæmoglobin. Den 15 således dannede anden væske/fastfase-immunoreaktionsblan-ding holdes i 15 minutter ved 37°C for at gøre det muligt for ethvert antistof molekyle, som ikke har immunor'eageret med en addukt-inhibitor eller -kontrol, immunologisk at binde fastfase-glucitollysin-hæmoglobinet og danne en fast-20 fase-bundet immunoreaktant.

De faste og flydende faser adskilles igen, og enhver fastfase-bundet immunoreaktant, som dannes, adskilles yderligere fra væskefaserne ved dekantering og vaskning af hver af brøndene 4 gange med vaskeopløsning (PBS indeholden-25 de 0,05% "Tween 20"). Den mængde fastfase-bundet immuno-reaktant, som dannes, bestemmes derpå ved blanding af 100 pi frisk fremstillet HRPO-substratoplØsning (0,0125% ^2^2 og 0,67 mg/ml o-phenylendiamin (OPD) i destilleret vand) i hver brønd. Farve får lov til at udvikles ved stuetem-30 peratur (ca. 20 til ca. 25°C) i 5 minutter. Substratomdannelses (farveproduktions) -reaktionen stoppes derpå ved blanding af 50 pi 4N I^SO^ i hver brønd. Den optiske tæthed (O.D.) af opløsningerne bestemmes ved en bølgelængde på 490 nm under anvendelse af et "Dynatech MR 600" (Dynatech, 35 Alexandria, VA) -mikrotiterpladelæseapparat.

Resultaterne af dette forsøg er illustreret i figur 2A, B og C. Disse resultater viser, at de reducerede, men DK 173095 B1 o 30 ikke-glucosylerede addukter (figur 2A) og de glucosylerede, men ikke-reducerede addukter (figur 2B) ikke inhiberer bindingen af HRPO-G6C9 til det fastfase-bundne glucitollysin--hæmoglobin. Som det imidlertid er illustreret i figur 2C, 5 er de glucosylerede og reducerede proteiner og Torstadier indeholdende lysin, dvs. glucitollysin, meget effektive inhibitorer af immunoreaktionen mellem HRPO-G6C9 og det fastfase-bundne glucitollysin-hæmoglobin, men ikke det glucosylerede og reducerede poly-L-Valin. Fordi det struk-10 tureile træk, som er fælles for de addukter, som inhiberer dannelsen af fastfase-immunoreaktanter, er tilstedeværelsen af en glucitollysinrest, påviser resultaterne af dette forsøg, at G6C9-receptorer immunoreagerer med en glucitol-lysin-holdig epitop, når denne epitop foreligger som 15 fastfase-bundet glucitollysin-hæmoglobin.

Eksempel 5: Réduktionsoptlmerlng a. Vandforenelige reduktionsmidler

Som tidligere beskrevet er glucitollysin den reducerede hexosealkoholform af glucose bundet kovalent til 20 6-aminogruppen af lysin. De følgende forsøg gennemføres for at undersøge forskellige vandforenelige borhydrid-reduktionsmidler for deres evne til at producere glucitol-lysinrester på hæmoglobin under forskellige betingelser. Hæmoglobinprøver tilvejebringes som 10 μΐ af en 25 pakket RBC-pellet fremstillet som beskrevet i eksempel 1 (ca. 3 mg hæmoglobin) under anvendelse af blod fra et normalt individ og et diabetisk individ. Procentdelen af glycosyleret hæmoglobin i hver prøve bestemmes under anvendelse af det kommercielt tilgængelige "GLY-AFFIN GHb"-30 bestemmelsessystem (Isolab, Akron, OH) og viser sig at være 6,3% i den normale prøve og 8,9% i den diabetiske prøve.

Der er således 1,4 gange mere glucosyleret hæmoglobin i den diabetiske prøve sammenlignet med den normale prøve.

Prøverne blandes hver med 615 μΐ af enten destilleret vand 35 eller 0,05 M phthalsyre. Dette giver blandinger indeholdende hæmoglobin i en koncentration på ca. 4,8 mg/ml, og, hvor der anvendes syre, et forhold på mindst ca. 10 μποΙ syre

O

31 DK 173095 B1 pr. mg hæmoglobin.

De fremkomne blandinger holdes i 15 minutter ved 37°C.

I løbet af dette tidsrum lyseres i alt væsentligt alle RBC'erne til stede i hver blanding, hvorved hæmoglobinet 5 indeholdt deri frigøres i opløsningen, og der dannes et hæmolysat.

Dernæst blandes 50 pi af hvert hæmolysat (ca. 0,24 mg hæmoglobin) i en mikrotiterpladebrønd med 50 pi af forskellige koncentrationer NaBH^ eller KBH^ til dannelse io af reduktionsreaktionsblandinger. Disse blandinger holdes 1 15 minutter ved 37°C. I løbet af dette tidsrum reduceres hæmoglobinlysin-resterne, som har glucose bundet kovalent til deres E-aminogrupper, til dannelse af glucitollysin-rester. Desuden bindes glucitollysin-hæmoglobinet, som 15 dannes, ved adsorption til væggene af mikrotiterpladebrønden, dvs. der dannes fastfase-bundet glucitollysin-hæmoglobin.

De faste og flydende faser adskilles ved dekantering.

Hver brønd vaskes derpå "4 gange med vaskeopløsning for yderligere at adskille det ikke-omsatte borhydrid fra 20 det fastfase-bundne (mikrotiterpladebrønd-bundne) glucitollysin-hæmoglobin.

I hver brønd iblandes derpå 100 pi peberrodperoxidase-mærkede G6C9 (HRPO-G6C9) -receptorer fremstillet i eksempel 2 til dannelse af en immunoreaktionsblanding. Denne blan-25 ding holdes i 15 minutter ved 37°C, hvorved de mærkede receptorer kan binde immunologisk til det fastfase-bundne (mikrotiterpladebrønd-bundne) glucitollysin-hæmoglobin, som er til stede, og danne en fastfase-bundet (mikrotiter-pladebrønd-bundet) immunoreaktant. Ikke-immunoomsat (ikke- 30 bundet) HRPO-G6C9 fjernes fra brøndene ved dekantering efterfulgt af vaskning 5 gange med vaskeopløsning. Den mængde fastfase-bundet immunoreaktant, som dannes, bestemmes derpå som beskrevet i eksempel 4.

Resultaterne af dette forsøg er illustreret i figur 35 3A. og B og påviser forskellige fænomener af interesse. For det første er der, som det kan ses i både figur 3A og 3B, ingen væsentlig forskel mellem resultaterne opnået under DK 173095 B1 o 32 anvendelse af enten natrium- eller kaliumborhydrid som det vandforenelige borhydrid-reduktionsmiddel.

For det andet påviser figur 3A, at reduktion (gluci-tollysindannelse) i fraværelse af syre, som forventet, 5 giver et større antal receptor-bundne glucitollysinrest-holdige epitoper i prøven indeholdende den større mængde glucohæmoglobin, dvs. den diabetiske prøve. Når disse resultater sammenlignes med de resultater, der opnås, når reduktionerne gennemføres i nærværelse af syre (figur 3B) 10 ses det imidlertid, at der produceres et større antal receptor-bundne glucitollysinrester i begge hæmoglobinprøverne i forhold til antallet produceret i fraværelse af phthal-syre. Desuden er der en større forskel i antallet af receptor-bundne glucitollysinrester mellem de normale og 15 diabetiske prøver, når reduktionen gennemføres i nærværelse af phthalsyre (figur 3B) sammenlignet med, når den gennemføres i fraværelse af denne syre (figur 3A). Disse to resultater viser, at tilstedeværelsen af phthalsyre overraskende potenserer et vandforeneligt borhydrid-reduk-20 tionsmiddels evne til at producere glucitollysinrest-holdige epitoper samt lyserer de røde blodceller og fjerner labilt glucohæmoglobin.

Når resultaterne i figur 3A sammenlignes med resultaterne vist i figur 3B, ses det endelig, at når hæmoglo-25 binprøven blandes med phthalsyre i et forhold på mindst ca. 10 jjmol syre pr. mg haemoglobin, potenseres reduktionsreaktionen, selv når hæmoglobinet blandes med borhydrid i et forhold så lavt som mindst ca. 2,6 pnol borhydrid pr. mg hæmoglobin.

30 De ovenfor omtalte resultater står i modsætning til det, der er anført inden for teknikken, og er" derfor uventede. Som beskrevet ovenfor, angiver den kendte teknik, at den totale mængde glucohæmoglobin i en haEmoglobinprøve tilvejebragt fra RBC'er er summen af de labile og stabile 35 glucohæmoglobinfraktioner. Ifølge Bisse et al., Diabetes 31: 630-633 (1982) , fjernes den labile fraktion fra en hæmoglobinprøve ved behandling med biphthalsyre, dvs. mængden 33 DK 173095 B1 0 af bestemme ligt glucohaanoglobin nedsættes- i en prøve behandlet med biphthalsyre. Derfor angiver den kendte teknik, at ved en bestemmelse, som måler mængden af glucohæmoglobin i en prøve, bør signalet produceret af en prøve, fra hvil-5 ken den labile fraktion er fjernet, være mindre end det signal, der produceres af en sammenlignelig prøve, fra hvilken den ikke er fjernet.

b. Reduktionsreaktionsblanding Holdepériode 10 Sure reaktionsblandinger fremstilles under anvendelse af hæmoglobin tilvejebragt som helblod-prøver fra en diabetisk og en normal kvinde. Phthalsyre-koncentrationen i hver blanding er konstant 0,05 M. Imidlertid varierer hæmoglobin-koncentrationen fra 27,0 mg/ml til 0,270 ^ig/ml, 15 hvilket giver forhold mmol syre/mg Hb fra~l,85 til 185,2. De sure reaktionsblandinger holdes alle i 15 minutter ved 37°C til dannelse af hæmolysater.

Dernæst fremstilles reduktionsreaktionsblandinger i to sæt ved blanding af 50 jil af hvert hæmolysat og 20 50 pi 400 mM NaBH^, hvilket giver forhold mmol borhydrid/mg Hb fra 0,0148 til 1,481. Det ene sæt af reduktionsreaktionsblandingerne holdes i 15 minutter og det andet i 30 minutter, hvert ved 37°C. Prøverne adskilles derefter fra det uomsatte borhydrid og resten af reduktions-25 reaktionsblandingerne, vaskes og analyseres for glucitol-lysin-hæmoglobin som beskrevet i eksempel 4.

Som det ses i figur 4, viser resultaterne af dette forsøg, at en reduktionsreaktionsperiode på enten 15 eller 30 minutter giver målelige mængder af glucitolly-30 sin-hæmoglobin i både diabetiske og normale prøver ved alle de undersøgte hæmoglobin-koncentrationer. Det bør også bemærkes, at de optimale forhold for produktion af bestem-meligt glucitollysin viser sig at være 46,3 mmol syre/mg Hb for de sure reaktionsblandinger og 0,37 mmol borhydrid/-35 mg Hb for reduktionsreaktionsblandingerne, når hæmoglobin er til stede i koncentrationer på 1,08 mg/ml og 0,54 mg/-ml i de respektive reaktioner.

DK 173095 B1 o 34

Eksempel 6: Fjernelse af labilt glucohæmoglobin a. Sure reaktionsblandinqer

Det er blevet rapporteret, at dissociationen af labilt glucohæmoglobin til glucose og hæmoglobin syre-5 katalyseres i opløsninger, som har en pH-værdi på ca.

5. Bisse et al., Diabetes, 31:630-633 (1982). Til bestemmelse af, om den rapporterede pH-afhængige stabilitet af labilt glucohæmoglobin påvirkes af typen af anvendt syre fremstilles opløsninger indeholdende enten phthalsyre, 10 citrat, eddikesyre, phosphat, D(+)-glucosamin, a-keto-glutarsyre, oxaleddikesyre, oxal-di-kaliumsyre, ravsyre eller pyrodruesyre i en koncentration på 0,05 M og en pH--værdi på 4-5. Hæmoglobinprøver tilvejebragt som 10 pi af en pakket RBC-pellet fremstilles som beskrevet i eksem-15 pel 1 ud fra blod fra et diabetisk og et normalt individ.

En diabetisk og en normal hæmoglobinprøve blandes hver med 615 pi af hver af de ovennævnte sure opløsninger til dannelse af sure reaktionsblandinger eller med 615 pi destilleret vand som en kontrol.

20 Desuden fremstilles pakkede RBC-pellets ud fra RBC'er, fra både diabetiske og normale individer, som er inkuberet natten over (ca. 18 timer) i isotonisk saltopløsning. 10 pi Af hver af disse pellets blandes med 615 pi af enten 0,05 M phthalsyre eller destilleret vand som 25 en kontrol.

De således dannede sure reaktionsblandinger og kontrolopløsninger holdes ved 37°C i 15 minutter til dannelse af hæmolysater. Glucitollysin-haanoglobin dannes dernæst og undersøges under anvendelse af 50 pl-portioner af hvert af 30 hæmolysåterne, NaBH^ og HRPO-G6C9-receptorer som beskrevet i eksempel 4.

Resultaterne af dette forsøg illustreres i figur 5. Disse resultater viser, at omsætning af glucohæmoglobin med phthalsyre før reduktion med borhydrid væsentligt 35 potenserer dannelsen af glucitollysin-rester i sammenligning med de andre undersøgte prøver.

o 35 DK 173095 B1 b. Syrekoncentration

Til undersøgelse af virkningen af phthalsyrekoncen-tration, inden for en pH-værdi på 4-5, på glucitollysin--hæmoglobin-produktion og bestemmelse frem-5 stilles sure reaktionsblandinger med phthalsyrekoncentra-tioner på enten 0,05 M eller 0,025 M med hæmoglobinkoncentrationer på 75, 50, 37,5, 30, 25 eller 21,4 mg hæmoglobin pr. ml. Således er der i blandingerne indeholdende 0,05 M phthalsyre et forhold mellem mmol phthalsyre pr.

10 mg hæmoglobin på 0,66 til ca. 2,34. Tilsvarende er forholdet i 0,025 M-phthalsyreblandingerne på 0,33 til 1,17. Hæmoglobin tilvejebringes som et i forvejen bestemt volumen af en pakket RBC-pellet fremstillet af blod fra et diabetisk individ som beskrevet i eksempel 1.

15 De fremkomne sure reaktionsblandinger holdes i 15 minutter ved 37°C til dannelse af hæmolysater. Glucitol-lysin-hæmoglobin dannes dernæst og undersøges under anvendelse af 50 pi af hvert af hæmolysaterne, NaBH4 og HRPO-G6C9-receptorer som beskrevet i eksempel 4.

20 Figur 6 illustrerer resultaterne af dette forsøg.

Disse resultater viser, at både 0,05 M- og 0,025 M-phthal-syrereaktionsblandingerne potenserer dannelsen af gluci-tollysinrest-holdige epitoper bundet med mærkede receptorer, når forholdet mellem mmol syre pr. mg hæmoglobin er 25 mellem ca. 1,00 og ca. 2,34.

Desuden påviser resultaterne vist i figur 6, at omsætning med phthalsyre alene ikke producerer bestemme-ligt glucitollysin.

c. ' Syre-pH-vardi 30 Der fremstilles stamopløsninger indeholdende 0,05 M phthalsyre med pH-værdier på 3,5, 4,5, 5,5 og 6,5. Derpå fremstilles fire sure reaktionsblandinger under anvendelse af hver stamopløsning. Hæmoglobinprøver tilvejebragt som 10 μΐ pakkede RBC-pellets dannet som i eksempel 1 under 35 anvendelse af to diabetiske og to normale blodprøver blandes med 615 pi af hver stainopløsning. De fremkomne sure reaktionsblandinger holdes i 15 minutter ved 37°C til o 36 DK 173095 B1 dannelse af hæmolysater. Glucitollysin-hæmoglobin dannes dernæst og bestemmes' under anvendelse af 50 pi af hvert af hæmolysaterne, NaBH4 og HRPO-G6C9-receptorer som beskrevet i eksempel 4.

5 Figur 7 illustrerer resultaterne af dette forsøg og viser, at det største antal immunologisk bindelige glucitollysinrester produceres ved bestemmelser gennemført på hæmolysater dannet under anvendelse af phthalsyre med en pH-værdi på ca. 3,5. Dog er den pH-værdi, der pro-το ducerer den største forskel i signal (optisk tæthed) mellem de normale og diabetiske prøver på 4,5. Desuden giver anvendelsen af phthalsyreopløsninger med pH-værdier på 5,5 og 6,5 også målelige mængder glucitollysinrester.

Til undersøgelse af variabiliteten i pH-værdien af 15 0,05 M vandig phthalsyre fremstilles fire 0,05 M-opløs- ninger, og deres ikke-regulerede pH-værdier bestemmes under anvendelse af en Altex model 3500-digital-pH-meter (Beckman Instruments, Berkeley, CA) i kombination med en Calomel MicroProbe-elektrode (Fisher Scientific, 20 Pittsburgh, PA) . De fundne pH-værdier for de fire ikke-regulerede opløsninger varierer fra 4,13 til 4,5 og har et gennemsnit på ca. 4,3.

d. "Holdeti3~'"for"den sure realctionsblanding Et formål med det sure reaktionstrin ved bestemmel-25 sesmetoden ifølge den foreliggende opfindelse er at fjerne den labile glucohæmoglobinfraktion (dissociere det labile glucohæmoglobin til hæmoglobin og glucose), medens den stabile fraktion bevares. Virkningen af at variere holdetiden af den sure reaktionsblanding undersøges der-30 for.

Der undersøges fire sæt sure reaktionsblandinger.

Hvert sæt indeholder fire blandinger fremstillet ved blanding af en hæmoglobinprøve fra hver af de to diabetiske og to normale blodprøver fra kvinder med 0,05 M phthalsyre 35 som beskrevet i eksempel 6c. Et af de sure reaktionsblandingssæt blandes derpå straks med NaBH^ og behandles yderligere og undersøges som beskrevet i eksempel 4. De reste- 37 DK 173095 B1 0 rende 3 sæt holdes i et tidsrum på 5, 10 eller 15 minutter, før de blandes med NaBH^ som i eksempel 4.

Som det ses i figur 8, viser resultaterne af dette forsøg, at en forøgelse af holdeperioden af den sure 5 reaktionsblanding resulterer i dannelse af mindre bestemme ligt glucitollysin i den diabetiske prøve nr. 1, hvilket viser, at prøven i begyndelsen indeholdt en væsentlig mængde labilt glucohæmoglobin. Holdeperioden på 15 minutter giver også mindre bestemmeligt glucitollysin i io den diabetiske prøve nr. 2 og den normale prøve nr. 1 i sammenligning med holdeperioden på mindre end 1 minut.

Disse resultater viser, at en holdeperiode af en sur reaktionsblanding på kun ca. 5 minutter kan resultere i fjernelse af den labile glucohæmoglobinfraktion i en 15 hæmoglobinprøve.

Eksempel 7: BestemmeIsestemperatur Hæmolysater, som har hæmoglobinkoncentrationer på 27 pg/ml til 1,35 jig/ml, fremstilles ifølge eksempel 5b under anvendelse af helblod fra diabetiske og normale 20 kvinder. Hæmolysaterne reduceres derpå og undersøges ved enten stuetemperatur (ca. 20-25°C) eller 37°C som beskrevet i eksempel 4 under anvendelse af 30 minutters holdeperioder for reduktions- og antistof-reaktionerne.

Figur 9 illustrerer, at mens mængden af påvist glu-25 citollysin-hæmoglobin er lidt større, når reduktions- og immunoreaktionsblandingerne holdes ved 37°C, er der ingen væsentlig forskel mellem .resultaterne opnået ved 37°C og dem, der opnås ved stuetemperatur.

Eksempel 8: ELISA-evaluerlng 30 Selv om metoden til optimering af fremstillingen af bestemmelige glucitollysinrester på glucohæmoglobin under anvendelse af phthalsyre og borhydrid som beskrevet i den foreliggende beskrivelse er anvendelig på et hvilket som helst immunobestemmelsesformat, "vurderes funktionen 35 af et ELISA-format under anvendelse af denne metode detaljeret til bestemmelse af den kliniske anvendelighed som beskrevet i det følgende. Det særlige vurderede DK 173095 B1 o 38 ELlSA-format gennemføres, som følger; 10 pi Af en pakket RBC-pellet fremstillet som beskrevet i eksempel 1 under anvendelse af blod fra forskellige normale og diabetiske individer blandes med 615 5 pi 0,05 M kaliumbiphthaiat. Den således dannede sure reaktionsblanding holdes i 15 minutter ved 37°C til dannelse af et hæmolysat. Dernæst pipetteres 50 pi af hæmo-lysatet over i hver af 2 "NUNC Immuno I"-mikrotiterplade-brønde (fladbundspolystyrenplader, (Gibco Laboratory, 10 Lawrence, MA). Et volumen på 50 pi 400 mM NaBH^ blandes derpå i hver hæmolysatprøve til dannelse af reduktionsreaktionsblandinger. De dannede reduktionsreaktionsblandinger holdes i 15 minutter ved 37°C til dannelse af glu-citollysin-hæmoglobin bundet til mikrotiterpladebrøndene.

15 Glucitollysin-hæmoglobinet bundet til mikrotiterplade brøndene skilles fra det overskydende borhydrid ved dekantering og vaskning af brøndene 4 gange med 0,35 ml PBS indeholdende 0,05% "Tween 20".

Mængden af glucitollysin-hæmoglobin bundet til 20 brøndene bestemmes derpå ved iblanding i hver brønd af 0,100 ml af HRPO-G6C9-receptorerne i eksempel 2 fortyndet 1:300 i PBS indeholdende 10% normalt gedeserum til dannelse af en væske/fastfase-immunoreaktionsblanding. Immunoreaktionsblandingen holdes i 15 minutter ved 37°c.

25 De faste og flydende faser "adskilles, og brøndene vaskes derpå 5 gange med 0,35 ml PBS (pH-værdi 7,4) indeholdende 0,05% "Tween 20" til fraskiIleIse af ikke-bundne receptorer fra de fastfase-bundne immunoreaktanter. HRPO-G6C9-Receptorer, som er til stede som fastfase-bundne 30 immunoreaktanter, påvises under anvendelse af OPD-substrat-opløsningen som beskrevet i eksempel 4.

Glc-RED-Hb-adduktet fremstillet i eksempel 3 anvendes som en indre standard (kalibrator) for ELISA-formatet.

Der fremstilles standardopløsninger med en koncentration 35 fra 380 pg/ml til 8 pg/ml Glc-RED-hæmoglobin Hb fortyndet i 0,1 M natriumhydrogencarbonatpuffer, pH-værdi 9,0, indeholdende 10% normalt gedeserum. Til frembringelse af en 0 39 DK 173095 B1 standardkurve gennemføres den ovenfor beskrevne ELISA-metode under anvendelse af 50 ^il af hver standardopløsning i stedet for hæmolysatet.

a. Genvinding 5 Genvindingsforsøg gennemføres til bestemmelse af, om ELISA-metoden nøjagtigt kan måle forskellige mængder glucohæmoglobin fra et diabetisk erythrocyt-hæmolysat sat til et hæmolysat fra et normalt individ. Dette sker ved fremstilling af et hæmolysat fra et normalt individ, io som indeholder forskellige stigende procentiske tilsætninger af et hæmolysat fra et diabetisk individ.

Genvindingen af mængden af diabetisk glucohæmoglobin sat til hæmolysatet fra det normale individ bestemmes derpå under anvendelse af den ovenfor beskrevne ELISA-15 metode. Som vist i figur 10, viser de opnåede resultater et lineært forløb over det. undersøgte område af procentiske tilsætninger, hvilket viser en additiv sammenhæng mellem mængden af glucohæmoglobin til stede i en prøve og mængden af glucitollysln-hæmoglobin bestemt ved 20 ELISA-metoden.

b. Keproducerbarhed af ELISA-resultater

Reproducerbarheden af ELISA-metoden bestemmes ved intra-bestemmelses- og inter-bestemmelses-forsøg.

Til intra-bestemmeIser undersøges hæmoglobinprøver fra 25 tre forskellige individer 60 gange hver. Variationskoefficienten blandt .de opnåede værdier for hvert individ er på 1,6-6,4%.

Til inter-bestemmelser undersøges hæmoglobinprøver fra 3 forskellige individer på 12 forskellige tidspunkter.

30 Reproducerbarheden af inter-bestemmelsen bestemmes til at være på 8,3-10,4%.

Den foreliggende opfindelse er blevet beskrevet med hensyn til foretrukne udførelsesformer. Det vil være klart for fagfolk, at der kan foretages modifikationer og/-35 eller variationer af det omhandlede, uden at der afviges fra opfindelsens omfang, som beskrevet i den foreliggende beskrivelse.

Claims (15)

1. Metode til bestemmelse af mængden af stabilt glu-cohæmoglobin i en glucohæmoglobin-holdig prøve, kendetegnet ved, at den omfatter trinene: 5 (a) blanding af den nævnte prøve i et vandigt medium med phthal- eller biphthalsyre, som har en pH-værdi på ca. 3 til ca. 6, i et forhold på mindst ca. 1,5 mmol syre pr. mg hæmoglobin til dannelse af en sur reaktionsblanding, (b) bibeholdelse af den sure réaktionsblanding i et i io forvejen bestemt tidsrum ved en temperatur over ca. 0°C til ca. 37°C, som er tilstrækkeligt til fjernelse af det labile glucohæmoglobin, som er til stede, medens det stabile glucohæmoglobin til stede i den oprindelige prøve bevares, (c) blanding af reaktionsblandingen med et vand- 15 foreneligt borhydrid-reduktionsmiddel i et forhold på mindst ca. 0,015 mol borhydrid pr. mg hæmoglobin til dannelse af en reduktionsreaktionsblanding, (d) bibeholdelse af reduktionsreaktionsbiåndingen i et i forvejen bestemt tidsrum ved en temperatur over ca. 0°C 20 til ca. 37°C, som er tilstrækkeligt til dannelse af gluci-tollysin-hæmoglobin, (e) adskillelse af glucitollysin-hæmoglobinet fra evt. uomsat borhydrid til dannelse af isoleret glucitol-lysin-hæmoglobin, 25 (f) blanding af det isolerede glucitollysin-hæmoglo- bin med glucitollysin-specifikke receptormolekyler til dannelse af en immunoreaktionsblanding, (g) bibeholdelse af lmmunoreaktionsblandingen under biologiske bestemmelsesbetingelser i et tilstrækkeligt tidsrum 30 til, at receptormolekylerne immunologisk binder til glucitollysin-hæmoglobinet til dannelse af en immunoreaktant, og (h) bestemmelse af mængden af immunoreaktant dannet i den holdte immunoreaktionsblanding.

2. Metode ifølge krav 1, kendetegnet ved, at blandetrinnet (a) gennemføres ved ét forhold på mindst ca. 15,0 mmol syre pr. mg hæmoglobin. DK 173095 B1 o

3. Metode ifølge krav 1,kendetegnet ved, at syreopløsningen i trin (a) har en pH-værdi på ca. 4 til ca. 5.

4. Metode ifølge krav 1, kendetegnet ved, 5 at blandetrinnet (c) gennemføres ved et forhold på mindst ca. 0,15 mmol borhydrid pr. mg hæmoglobin.

5. Metode ifølge krav 1, kendetegnet ved, at receptorerne i trin (f) er i form af et monoklonalt antistof.

6. Metode ifølge krav 5, kendetegnet ved, at det monoklonale antistof udskilles af hybridomaerne, som har ATCC-deponeringsnumrene HB 8356 eller HB 8358.

7. Metode til bestemmelse af mængden af stabilt glucohæmoglobin i en glucohæmoglobin-holdig prøve, k e n - 15 detegnet ved, at den omfatter trinene: (a) tilvejebringelse af et i forvejen bestemt volumen af en pakket RBC-pellet, (b) blanding af det i forvejen bestemte pellet-volumen med vandig 0,05 M phthalsyre ved en pH-værdi på ca. 4 til 20 ca. 5 i ét forhold på ca. 1 volumen pellet til ca. 62,5 volumener vandig syre til dannelse af en sur reaktionsblanding, (c) bibeholdelse af den sure reåktionsbTanding i et tidsrum på ca. 15 minutter til ca. 30 minutter ved en tem- 25 peratur på ca. 20°C til ca. 37°C til dannelse af et hæmo-lysat, (d) blanding i en mikrotiterpladebrønd af et i forvejen bestemt volumen af hæmolysatet med en lige så stort volumen af en vandig opløsning, som har en natriumborhydrid- 30 eller kaliumborhydrid-koncentration på ca. 400 mM, til dannelse af en reduktionsreaktionsblanding indeholdende et forhold på mindst ca. 0,15 mmol borhydrid pr. mg hæmoglobin, (e) bibeholdelse af reduktionsreaktionsbiandingen i et tidsrum på ca. 15 minutter til ca. 30 minutter ved en tem- 35 peratur på ca. 20°C til ca. 37°C til dannelse af glucitol-lysin-hæmoglobin bundet til mikrotiterpladebrøndene, (f) ~fraskillelse af det brønd-Bundne glucitollysin- o DK 173095 B1 hæmoglobin fra borhydridet til dannelse af isoleret brøndbundet glucitollysin-hæmoglobin, (g) blanding af det isolerede brønd-bundne glucitollysin-hæmoglobin med en i forvejen bestemt mængde af 5 enzym-mærkede receptorer udskilt af hybridomaerne, som har ATCC-deponeringsnumrene HB 8356 eller HB 8358, til dannelse af en immunoreaktionsblanding, (h) bibeholdelse af immunoreaktionsblandingen i et tidsrum på ca. 15 minutter til ca. 30 minutter ved en tempe- 10 ratur på ca. 20°C til ca. 37°C, idet tidsrummet er tilstrækkeligt til, at receptorerne immunologisk binder glucitollysin-hæmoglobinet og danner en mikrotiterplade-brønd-bundet immunoreaktant og (i) bestemmelse af mængden af mikrotiterpladebrønd-15 bundet immunoreaktant dannet i trin (h).

8. Metode til omdannelse af stabilt glucohæmoglobin til glucitollysin-hæmoglobin ud fra en glucohæmoglobinprøve indeholdende både labile og stabile glucohæmoglobiner, kendetegnet ved, at den omfatter trinene: 20 (a) blanding af prøven i et vandigt medium med phthal- eller biphthalsyre, som har en pH-værdi på ca. 3 til ca. 6, i et forhold på mindst ca. 1,5 mmol syre pr. mg hæmoglobin til dannelse af en sur reaktionsblanding, (b) bibeholdelse af den sure reaktionsblandxny x er i 25 forvejen bestemt tidsrum ved en temperatur på over ca. 0°C til ca. 37°C, som er tilstrækkeligt til fjernelse af det labile glucohæmoglobin til stede, medens det stabile glucohæmoglobin til stede i den oprindelige prøve bevares, (c) blanding af reaktionsblandingen med et vand-30 foreneligt borhydrid-reduktionsmiddel i et forhold på mindst ca. 0,015 mmol borhydrid pr. mg hæmoglobin til dannelse af en reduktionsreaktionsblanding, (d) bibeholdelse af reduktionsreaktionsblandingen i et i forvejen bestemt tidsrum ved en temperatur over ca. 35 o°C til ca. 37°C, som er tilstrækkeligt til dannelse af glucitollysin-hæmoglobin, og (e) adskillelse af glucitollysin-hæmoglobinet fra o 43 DK 173095 B1 evt. uomsat borhydrid til dannelse af isoleret glucitol-lysin-hæmoglobin.

9. Metode ifølge krav 8,kendetegnet ved, at blandetrinnet (a) gennemføres~ved et forhold på mindst 5 ca. 15 mmol syre pr. mg hæmoglobin.

10. Metode ifølge krav 8f kendetegnet ved, at syreopløsningen i trin (a) har en pH-værdi på ca. 4 til ca. 5.

11. Metode ifølge krav 8, kendetegnet to ved, at blandetrinnet (c) gennemføres ved et forhold på mindst ca. 0,15 mmol borhydrid pr. mg hæmoglobin.

12. Metode ifølge krav 8, kendetegne t ved, at prøven er i form af røde blodlegemer.

13. Diagnostisk system, der er anvendeligt til gen-15 nemførelse af en fastfasebestemmelse af mængden af stabilt glucohæmoglobin til stede i en glucohæmoglobinprøve, kendetegnet ved, at det omfatter (a) en første pakning indeholdende en fastfase-matriks, på hvis overflade bestemmelsen udføres, 20 (b) en anden pakning'indeholdende en i forvejen bestemt mængde af en vandforeneligt borhydrid-reduktionsmiddel, (c) en tredje pakning indeholdende en kendt mængde glucitollysin-specifikke receptormolekyler og (d) en fjerde pakning indeholdende en i forvejen 25 bestemt mængde phthalsyre eller biphthalsyre, idet indholdet af pakningerne er til stede i respektive mængder, sonTer tilstrækkelige jtil gennemførelse af bestemmelsen.

14. Diagnostisk system ifølge krav 13, k e n d e -tegnet ved, at de glucitollysin-specifikke receptor- 30 molekyler udskilles af hybridomaerne, som har ATCC-depone-ringsnumrene HB 8356 eller HB 8358.

15. Diagnostisk system ifølge krav 14, kendetegnet ved, at receptormolekylerne er bundet til et mærkestof. 33 DK 173095 B1 glucose Schiff-base ketoamin hemiketal Hs ,0 H. C* C=N-protein HzC-NH-protein HCOH HCOH Mori C=0 ^ „ °H HOCH + HiN—protein^—— HOCH r— HOCH \ HCOH hurtig HCOH 1^n9soin HCOH „ACHi i I I OH y HCOH HCOH HCOH NH-protein ! I I CHjOH CHzOH CHjOH NaCNBHi v / eller glc(NR|- protein NABH« j glucitollysin I mannositollysin HjC-NH- protein NaBH4! • I HiC—NH—protein HCOH--------------J---1 I HOCH HOCH I i HOCH HCOH I , HCOH HCOH HCOH CHiOH CHzOH v ·ν· x glc(RED)-protein FIG. I