JPH0735752A - 凝集イムノアッセイ法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 被検試料中の抗原性物質を不溶性担体粒子に
吸着させ、該抗原性物質に特異的に反応する抗体もしく
は抗体複合体を反応させて、上記不溶性担体粒子を選択
的に凝集させる。 【効果】 煩雑な前処理を行うことなく、簡便かつ迅速
に被検試料中の抗原性物質もしくは抗体の測定が可能と
なり、同時に多数検体を並列的に処理することも極めて
容易となる。更に、上記の測定法を生化学自動分析機に
適用することにより、測定の自動化による検体の大量処
理が可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、生体試料などの流体中
における抗原性物質を、凝集反応を利用して免疫学的に
測定する方法（凝集イムノアッセイ法）に関する。

【０００２】

【従来の技術】近時、病院、検査センター等において
は、人手不足、コスト削減、あるいは多量検体処理の要
請等の点から、臨床検査等の諸検査の自動化、および／
又は測定時間の短縮化が図られてきた。このような自動
化に適した方法として、不溶性担体粒子の凝集反応を利
用して抗原性物質を定性ないし定量する凝集法が注目さ
れるに至っている。

【０００３】免疫化学分野においては、凝集法としてラ
テックス凝集イムノアッセイ法が主として行われてき
た。当分野において公知のラテックス凝集法とは、例え
ば特公昭５８−１１５７５号公報に記載されているよう
に、生体試料などの流体（被検試料）中における抗原性
物質を測定する場合、該被検試料と、該抗原性物質に特
異的に結合する抗体もしくはそのフラグメントを担持さ
せたラテックスとを混合して、ラテックスの凝集の程度
を測定することにより、前記抗原性物質を検出又は定量
するものである。

【０００４】この場合、上記抗体としては、通常ポリク
ローナル抗体が用いられる。モノクローナル抗体は、抗
原分子上の特定のエピトープのみと反応するため、該抗
原性物質が多価抗原である場合でも、特定のエピトープ
に関しては多価であるとは限らない。従って、上記抗体
としてモノクローナル抗体を用いた場合は、その抗原
は、特定のモノクローナル抗体に対応するエピトープに
関しては、一価抗原となる可能性が高くなる。

【０００５】測定の目的とする抗原物質が一価抗原であ
る場合、ラテックスに担持された抗体と試料中の該抗原
性物質とが反応もしくは結合しても、通常、凝集は起こ
らない。この場合、抗体を担持させたラテックスと、こ
のラテックスを凝集させることの出来る凝集素（例えば
ポリハプテン）と、被検試料とを混合し、反応させて、
被検試料中の抗原性物質がラテックス凝集をどの程度阻
害したかを測定することにより、該抗原性物質を検出又
は定量する方法（凝集阻害法）が、当分野において公知
である。

【０００６】従って、多価抗原である蛋白抗原の場合、
モノクローナル抗体を用いた凝集法においては、上記し
た理由で抗原エピトープに関して一価となる可能性があ
るため、このような蛋白抗原の測定に際しては、その抗
原エピトープの部分を含むポリハプテンを用いた凝集阻
害法による測定に頼らざるを得ないこととなる。

【０００７】したがって一価抗原をモノクローナル抗体
を用いて測定する場合、凝集素としてのポリハプテンが
新たに必要となるが、そのポリハプテンが生体試料中の
ネイティブな抗原性物質と同一の反応性を示す保証はな
い。

【０００８】ポリクローナル抗体を用いた通常のラテッ
クス凝集法と、モノクローナル抗体を用いたラテックス
凝集阻害法とを比較してみれば、ポリクローナル抗体は
同じ品質のものを常に得ることは難しく、特異抗体に精
製する段階での該抗体の損失も大きいのに対し、モノク
ローナル抗体はその点、品質の一定した抗体の大量生産
に向いている。このような品質の安定性の点からはモノ
クローナル抗体の方が有利であるが、モノクローナル抗
体を用いた場合、上述したようにラテックス凝集阻害法
を用いざるを得ないという難点がある。このような点を
考慮して、ポリクローナル抗体を用いた通常のラテック
ス凝集法が用いられているのが現状である。

【０００９】モノクローナル抗体を用いる場合、当然の
ことであるが、凝集素としてのポリハプテンと反応する
モノクローナル抗体を用いることになるが、そのモノク
ローナル抗体がネイティブな抗原性物質とは反応しない
場合もある。このような場合、ネイティブな抗原性物質
の反応性をポリハプテンの反応性に近づけるための何ら
かの処理が必要となると考えられる。

【００１０】上述したような諸欠点から、当分野におけ
る公知のラテックス凝集法（ないしラテックス凝集阻害
法）の限界は明らかである。

【００１１】より具体的には、従来のラテックス凝集法
においては、分子内に同じエピトープを複数含む糖鎖抗
原などの場合を除いては、特定のエピトープしか認識し
ないモノクローナル抗体は一般的には使用できない。こ
の場合、ラテックス凝集阻害法の応用の可能性が残され
ているが、凝集素であるポリハプテンとモノクローナル
抗体は反応しても、モノクローナル抗体とネイティブな
該抗原性物質とは反応せず、何らかの処理が必要になる
可能性が高い。これは、蛋白抗原の場合、抗体との反応
性においては該蛋白抗原の高次構造が重要な役割を果た
しているのに対し、凝集素であるポリハプテンはペプチ
ドのポリマー（ないしオリゴマー）であり、上記蛋白抗
原そのものとは立体構造が異なることによると考えられ
る。

【００１２】従って、本発明の目的の一つは、抗原性物
質に対する新たな凝集イムノアッセイ法を提供すること
にある。

【００１３】より具体的には、本発明の目的は、モノク
ローナル抗体を用いつつ、より単純で、凝集素を必要と
しない凝集イムノアッセイ法を提供することにある。

【００１４】本発明の他の目的は、より安定で単純な凝
集試薬を用いる凝集イムノアッセイ法を提供することに
ある。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明者は鋭意研究の結
果、被検試料中の抗原性物質の測定に際して該抗原性物
質に特異的な抗体を担持させた不溶性担体粒子を用いる
のではなく、測定試料たる該抗原性物質自体を不溶性担
体粒子に吸着させ、該抗原物質に特異的な抗体もしくは
抗体複合体を反応させることにより、上記不溶性担体粒
子が選択的に凝集することを見出した。

【００１６】本発明のラテックス凝集イムノアッセイ法
は上記知見に基くものであり、より詳しくは、被検試料
中の抗原性物質を不溶性担体粒子に吸着もしくは結合さ
せ、該抗原性物質に特異的に反応する抗体もしくは抗体
複合体を反応させて、不溶性担体粒子を選択的に凝集さ
せることを特徴とするものである。

【００１７】本発明においては、定量性の確保を容易と
する点からは、生体試料の濃度及び不溶性担体粒子懸濁
液の緩衝液濃度などは、生体試料中の抗原性物質がその
存在量に比例して不溶性担体粒子に吸着されるよう、測
定項目の特性により条件を選ぶことが好ましい。

【００１８】本発明においては、不溶性担体粒子に吸着
させるべき抗原性物質が多価抗原であるか一価抗原であ
るかは問題ではない。ただし、微量な生体成分や不溶性
担体粒子への吸着が困難な抗原性物質の測定には、本発
明の適用は必ずしも容易ではない。

【００１９】被検試料中の抗原性物質を不溶性担体粒子
に吸着させて、該抗原性物質に特異的に反応するモノク
ローナル抗体を反応させる場合、固相化されずに液相中
に残った抗原性物質（即ち未吸着の抗原性物質）の存在
が測定値に影響を与える場合がある。

【００２０】より具体的には、上記モノクローナル抗体
が、不溶性担体粒子に吸着された抗原性物質のみなら
ず、未吸着の抗原性物質とも反応すると、不溶性担体粒
子の凝集が阻害されることになり、不都合が生じる。不
溶性担体粒子に抗原性物質を吸着させた後に、該不溶性
担体を洗浄して未吸着の抗原性物質を除去することでこ
の不都合は解決可能であるが、このような洗浄工程の付
加は、本発明の凝集イムノアッセイの実用性ないし迅速
性を低下させる可能性がある。

【００２１】このような場合は、不溶性担体粒子に吸着
される抗原性物質の比率を高くすることで、未吸着の抗
原性物質の量を実質的に問題とならない量として取り扱
うことが可能である。たとえば、ＩｇＧ（イムノグロブ
リンＧ）をラテックスに吸着させる場合、ある条件下に
おいては、液相中に残存するＩｇＧの量を１万分の１に
しても、ラテックスに固相化されるＩｇＧの量は５分の
１にしか減少しないことが知られている（文献名：第１
６章 医用ラテックス、２３０〜２４４頁 （久下倫
生）を参照）。

【００２２】本発明者はこのような点を考慮しつつ更に
研究を進めた結果、上記本発明においては、上記モノク
ローナル抗体を液相中の抗原性物質と実質的に反応させ
ることなく、不溶性担体に吸着・固相化された抗原性物
質と選択的に反応させることが可能であることを見いだ
した。従って、本発明の好ましい態様によれば、上記凝
集イムノアッセイ法において、被検試料中の抗原性物質
を不溶性担体に吸着させた後、該被検試料を洗浄により
除去することなく、前記抗原性物質に対するモノクロー
ナル抗体を反応させることが可能となる。

【００２３】すなわち、本発明のより好ましい具体例に
おいては、使用するモノクローナル抗体として、不溶性
担体粒子に吸着された抗原とは反応するが、液相中の未
吸着の抗原性物質とは実質的に反応しないものを選ぶこ
とにより、未吸着成分による凝集阻害作用を完全に除外
することが可能となる。

【００２４】（抗原性物質）本発明の凝集イムノアッセ
イ法により測定されるべき抗原性物質は、不溶性担体へ
の吸着（ないし結合）が可能で、且つ該抗原性物質に対
応するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の
少なくとも一方の作成ないし入手が可能である限り特に
制限されないが、不溶性担体への吸着の容易性の点から
は、生体試料中に１００μｇ／ｍＬ以上（更には１ｍｇ
／ｍＬ以上）もしくは（総タンパク重量の）１％以上含
まれる物質であることが好ましい。また、上記ポリクロ
ーナル抗体ないしモノクローナル抗体作成の容易性の点
からは、上記抗原性物質は分子量１０，０００以上の物
質（蛋白質等）であることが好ましい。

【００２５】本発明の凝集イムノアッセイ法により測定
されるべき「抗原性物質」は、これに対応するポリクロ
ーナル抗体またはモノクローナル抗体の少なくとも一方
の作成ないし入手が可能なものであればよい。

【００２６】（抗原性物質に特異的な抗体）本発明にお
いて、「抗原性物質に特異的に反応する抗体」として
は、ポリクローナル抗体および／又はモノクローナル抗
体のいずれを用いることも可能である。

【００２７】このようなモノクローナル抗体は、Ｋｏｅ
ｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ、２５
６、４９５〜４９７、１９７５）らの報告した細胞融合
法により得ることが出来る。この方法自体は常法であ
り、あらためて述べる必要はないが、この方法において
は、目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマ細胞を効率よく選別する必要がある。大量検体処
理が容易であることから、９６穴プレートに所定の抗原
を固相化させ、それにハイブリドーマ細胞の培養上清を
反応させ、更に酵素標識抗マウスイムノグロブリンを反
応させる、いわゆるＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定法）に
よる選別が行われることが多い。この際、抗原は固相化
されているため、抗原が固相化されている状態で抗体を
反応させるアッセイ系を組む場合には、この選別法でよ
いが、ＥＬＩＳＡ法で選別して得たハイブリドーマ細胞
の産生するモノクローナル抗体の中に、ラジオイムノア
ッセイ（ＲＩＡ）のように、抗原と抗体とを液相中で反
応させるアッセイ系では反応しないという抗体が存在す
る場合が、見受けられることがある。

【００２８】このような現象自体は当分野においては公
知ないし周知のことであるが、本発明の凝集イムノアッ
セイ法においてこのようなモノクローナル抗体を用いる
ことにより、液相中の抗原性物質の阻害を受けずに、不
溶性担体粒子に固相化された抗原性物質と特異的に反応
させることが可能となる。

【００２９】ところで、分子量が通常の抗体分子である
ＩｇＧよりも小さい、例えば分子量７万程度の抗原性物
質を測定する場合を考えてみる。従来技術によれば、該
抗原性物質に対する抗体をラテックス表面に吸着させ
る。このとき、抗体分子はＦｃ部分でラテックスに吸着
し、Ｆａｂ部分を外に向けて存在しており、かなり整然
とした方向性をもっていることが知られている（例え
ば、文献名：第１６章 医用ラテックス、２３０〜２４
４頁（久下倫生）参照）。したがって、本発明者の検討
によれば、従来技術においては、ラテックス表面からＩ
ｇＧ分子が腕をのばしており、ラテックス同士の中間で
抗原分子がそれぞれのＩｇＧ分子と結合するという形に
なり、ラテックス間の距離は分子量１５万のＩｇＧ分子
２つ分と分子量７万の抗原分子１つ分ということにな
る。

【００３０】これに対して、本発明による方法において
は、該抗原性物質を不溶性担体（例えばラテックス）に
吸着させ、該ラテックスに吸着された抗原分子に特異的
に反応する抗体が、Ｆａｂ部分を広げて結合するという
形をとると考えられる。したがって、ラテックス間の距
離は分子量１５万のＩｇＧ分子１つ分と、分子量７万の
抗原分子２つ分ということになり、従来技術と比較して
本発明では、このような測定の場合に、ラテックスを凝
集させるために該ラテックス粒子同士をより接近させる
ことが重要になると考えられる。

【００３１】ラテックス粒子同士は通常、負の表面電荷
により反発しあっているため、比較的分子量の小さい分
子を測定する場合に、従来法よりもラテックス同士をよ
り接近させることが重要である本発明では、それだけ強
い凝集力を発生させることが好ましいと考えられる。し
たがって、本発明においては、より凝集力の強い抗体を
用いることが好ましいということになる。

【００３２】しかし、本発明において測定すべき抗原性
物質がＩｇＧ分子（分子量約１５万）よりも巨大である
場合は、逆のこと（より凝集力の弱い抗体で足りる）も
成り立つ可能性がある。

【００３３】本発明による凝集イムノアッセイ法におい
ては、上述したような理由から、抗原性物質をラテック
ス等の不溶性担体に吸着させた後、モノクローナル抗体
を反応させてもラテックスが凝集しない可能性が考えら
れるが、そのような場合でも、次のような手段で凝集を
起こさせることが可能である。

【００３４】表面の負電荷によるラテックス粒子同士の
反発力は、ラテックス同士の距離が大きくなれば小さく
なる。したがって、モノクローナル抗体の立体構造を大
きくすれば、同じ抗体でも凝集を起こすことができる。
より具体的には、該モノクローナル抗体と、これに選択
的に反応する第二抗体とを反応させてモノクローナル抗
体複合体を形成させ、該抗体複合体を、抗原を吸着させ
たラテックスと反応させれば、ラテックス粒子同士が少
し離れた距離で（すなわち、より小さな力で）結合して
凝集を起こすことができるようになると考えられる。

【００３５】他に、抗体複合体を形成する方法として
は、モノクローナル抗体をビオチン標識し、アビジンを
加えて複合体とする方法、更に、化学結合による方法
（例えば、抗体を酵素標識する際に用いられる方法）等
を挙げることが出来る。

【００３６】本発明において用いられる抗体複合体は、
ＩｇＧ型抗体分子（分子量約１５万）を２分子以上含む
ことが好ましく、また、その分子量はＩｇＧ型抗体分子
の分子量の３倍以上であることが好ましい。

【００３７】本発明の凝集イムノアッセイ法において
は、上述した理由から、抗原性物質に特異的に反応する
抗体として、五量体の抗体であるＩｇＭ型のモノクロー
ナル抗体を用いることが、該ＩｇＭ型抗体の強い凝集力
の点から好ましい。

【００３８】ラテックス凝集反応で、リウマチ因子（変
性ＩｇＧのＦｃ部分に対する自己抗体）を検出する場
合、凝集を起こすのはＩｇＭ型のリウマチ因子であるこ
とは、当分野では公知のことである（例えば、文献名：
臨床免疫、２１（Ｓｕｐｐｌ．１４）８０−８４，１９
８９参照）。すなわち、当分野では、抗原が感作された
ラテックスにＩｇＭ型のリウマチ因子を反応させると凝
集するが、ＩｇＧ型のリウマチ因子を反応させても凝集
しないとされている。

【００３９】以上、主にモノクローナル抗体について述
べてきたが、ポリクローナル抗体を用いて、本発明の凝
集イムノアッセイ法を行うことも可能である。ただし、
ポリクローナル抗体の場合には、単一のエピトープのみ
を認識するモノクローナル抗体の場合と異なり、固相化
された抗原とは反応するが液相中の抗原とは反応しない
抗体を選択することは容易ではないと考えられる。した
がってポリクローナル抗体を用いる場合には、被検試料
中の抗原性物質を不溶性担体に吸着（ないし結合）させ
る段階において、前述したような、未吸着の抗原性物質
が実質的に無視できる程度になるように吸着の効率のよ
い条件を選択することが好ましい。

【００４０】また、ポリクローナル抗体と反応する抗原
上の反応サイトは複数あるため、ポリクローナル抗体は
通常、モノクローナル抗体と比べて凝集力が強いと考え
られる。すなわち、本発明において被検試料中の抗原性
物質をラテックス等の不溶性担体に吸着させる際に、抗
原性物質が液相中にも残ると、加えたポリクローナル抗
体は固相、液相両方の抗原と反応できるため、ポリクロ
ーナル抗体が液相中の抗原とも反応して不溶性担体粒子
同士を架橋することで凝集力が大きくなると考えられ
る。

【００４１】上述したように本発明によれば、不溶性担
体粒子に吸着ないし結合させた抗原性物質に、該抗原性
物質に特異的な抗体もしくは抗体複合体を反応させるこ
とにより、不溶性担体の選択的な凝集を起こすことが出
来る。

【００４２】上述したように本発明によれば、試薬の製
造が単純、容易であるため、保存安定性の高い試薬を用
いた方法を提供することが出来る。

【００４３】より具体的には、当分野においては、不溶
性担体として一般にラテックスが用いられているが、こ
のラテックス試薬（抗原、抗体等が担持されたラテック
ス）について、常に同等の品質のものを作り、非特異凝
集や沈殿が生ずることを防止しつつ、安定な状態で保存
することは容易なことではない。

【００４４】これに対し、本発明によれば、不溶性担体
（ラテックス等）に抗原や抗体は実質的に感作されてい
ないため、該不溶性担体として市販の未感作ラテックス
をそのまま使用することが可能となる。更に抗体につい
ても必ずしも精製品である必要はなく、また試薬が単純
なため保存安定性を高く保つことが可能となり、製造業
者にとっても有利な方法といえる。

【００４５】以下、必要に応じて図面を参照しつつ本発
明を詳細に説明する。

【００４６】（不溶性担体粒子）本発明の凝集イムノア
ッセイ法の開発過程において、本発明者は、抗原性物質
を不溶性担体に固相化する時間は極めて短いことを観察
した。そこで、本発明者は、抗原性物質を含む水溶液の
被検試料をそのまま不溶性担体に固相化することを試
み、本発明を完成するに至った。

【００４７】本発明に用いる不溶性担体としては、例え
ば、従来技術（特公昭５８−１１５７５号公報等）にい
うところの有機高分子物質の微粒子や、無機酸化物の微
粒子、あるいは核となるこれらの物質の表面を有機物等
で表面処理した微粒子が好ましく用いられるが、これら
に制限されるものではない。本発明においては、上記不
溶性担体として、ポリスチレンラテックス等のラテック
スが特に好ましく用いられる。本来ラテックスとは、ゴ
ムの木を傷付けたときに浸出する乳液のことであるが、
本発明でいうラテックスとは、水性液中において不連続
な微粒子が懸濁している懸濁液ないし乳濁液をいう。

【００４８】定性反応で用いる場合を除き、定量的にイ
ムノアッセイを行う場合、通常は、粒子の大きさの均一
性、表面状態の制御、内部構造の選択などが高度の次元
で要求されるが、このような試薬向けの良好なラテック
ス粒子は、市販品の中から選択して用いることが可能で
ある。

【００４９】例えば、ラテックス粒子としては、平均粒
径０．０４〜０．８ミクロン（更には０．０８〜０．２
ミクロン）程度のものが好ましく用いられる。

【００５０】ラテックスの材質は特に制限されないが、
ポリスチレンラテックス等のスチレン系ラテックス、ア
クリル酸系ラテックス等が好ましく用いられる。表面の
疎水性が強いラテックス（例えばポリスチレンラテック
ス）を用いることは、タンパク質ないしペプチドの吸着
をスムーズにする上で好ましい。更には、種々の変性ラ
テックス（例えば、カルボン酸変性ラテックス）、磁性
ラテックス（磁性粒子を内包させたラテックス）等を必
要に応じて用いてもよい。

【００５１】ラテックス粒子としては、乳化剤を用いな
い乳化重合によって得られるポリスチレン粒子が特に好
ましく用いられる。このようなラテックスは、表面の負
電荷同士の反発に基づき、乳化剤なしでも安定に存在で
きる。

【００５２】被検試料中の抗原性物質をラテックス粒子
に吸着させるためには、ラテックス粒子を懸濁させる緩
衝液については、ＥＬＩＳＡ等でプレートに抗原を固相
化させる場合と基本的に同じ技術が使用可能である。ラ
テックス粒子によっては、自然凝集を起こしやすいもの
もあるが、このような場合には、弱アルカリ性のグリシ
ン緩衝液もしくはホウ酸緩衝液に懸濁させておくことが
安定性の点から好ましい。ラテックス濃度に関しては、
０．０５〜１重量パーセントの懸濁液として用いること
が好ましい。

【００５３】（抗原−抗体反応）本発明においては、被
検試料中の抗原性物質を固相化した後、該抗原性物質に
対して特異的に反応する抗体もしくは抗体複合体を反応
させ、ラテックス等からなる不溶性担体を凝集させる。
この際に用いる水性溶液は、該抗体もしくは抗体複合体
がラテックス等からなる不溶性担体に吸着するのを防ぐ
ために、Ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤を０．１〜０．
３％程度含んでいることが好ましい。

【００５４】（凝集反応）本発明の凝集反応を行う容器
は特に限定されないが、通常のチューブ（試験管；例え
ばポリスチレン製）状の容器を用いることが可能であ
る。多数検体の同時処理が容易な点を考慮すれば、複数
のウエル（穴）を有するＥＬＩＳＡ用プレート（例え
ば、９６−ウエルＥＬＩＳＡ用プレート（ＮＵＮＣ−Ｉ
ＭＭＵＮＯ ＰＬＡＴＥ等）を用いることが可能であ
る。後述するように、光学的手法によるラテックス凝集
の測定を容易とする点からは、実質的に透明な容器を用
いて反応を行うことが好ましい。なお、後述するような
自動分析機を利用する場合には、通常は、該分析機中の
反応槽中で凝集反応を行わせることとなる。

【００５５】（凝集の測定）不溶性担体粒子の凝集の程
度を測定する方法は、特に制限されない。例えば、凝集
を定性的ないし半定量的に測定する場合には、既知の試
料の濁度の程度との比較から、上記不溶性担体粒子の凝
集の程度を目視によって判定する（凝集の少ないものは
透明感がある）ことも可能である。該凝集を定量的に測
定する場合、簡便性の点からは、例えば光学的に測定す
ることが好ましい。

【００５６】ラテックス等からなる不溶性担体粒子の凝
集の光学的測定法としては、公知の方法が利用可能であ
る。より具体的には例えば、いわゆる比濁法（凝集塊の
形成を濁度の増加としてとらえる）、粒度分布による測
定法（凝集塊の形成を粒度分布ないし平均粒径の変化と
してとらえる）、積分球濁度法（凝集塊の形成による前
方散乱光の変化を積分球を用いて測定し、透過光強度と
の比を測定する）等の種々の方式が利用可能である。こ
れらのそれぞれの測定法について、速度試験（レートア
ッセイ；異なる時点で少なくとも２つの測定値を得て、
これらの時点間における該測定値の増加分（すなわち増
加速度）に基づき凝集の程度を求める）と、終点試験
（エンドポイントアッセイ；ある時点（通常は、反応の
終点と考えられる時点）で１つの測定値を得て、この測
定値に基づき凝集の程度を求める）が利用可能である。
測定の簡便さ、迅速性の点からは、比濁法を用いた速度
試験を行うことが好ましい。

【００５７】不溶性担体粒子の凝集の光学的測定におい
ては、ラテックス等からなる不溶性担体粒子の平均粒径
が０．０４〜０．８ミクロン程度の範囲では、５００〜
１４００ｎｍ程度の波長の光を用いて測定することが好
ましい。

【００５８】（ヘモグロビンＡ1c測定例）本発明の凝集
イムノアッセイ法の特徴をよく示す一つの実施態様とし
て、以下にヘモグロビンＡ1c（ＨｂＡ1c）の測定例につ
いて述べるが、本発明の凝集イムノアッセイ法はヘモグ
ロビンＡ1cの測定に限定されるものではない。

【００５９】ここに上記「ヘモグロビンＡ1c」は、ヘモ
グロビン（Ｈｂ）のβ鎖Ｎ末端のアミノ酸残基であるバ
リンのαーアミノ基にグルコースが非酵素的に結合し、
グリコシル化ヘモグロビンとなったものであり、このヘ
モグロビンＡ1cの血中量は糖尿病の比較的長期の血糖コ
ントロール状態を反映する。したがって、このＨｂＡ1c
を測定することは、血糖コントロール状態を知る上で臨
床的に極めて有意義である（例えば、日本臨床、４８、
増刊号、３１５ー３２２（１９９０）参照）。

【００６０】ヘモグロビンはα鎖２本、β鎖２本からな
るヘテロテトラマーであるが、ヘモグロビンＡ1cは２本
のβ鎖のうち１本のＮ末端のαアミノ基がグリコシル化
していることが特徴であり、従って、ヘモグロビンＡ1c
に特徴的な反応部位は１カ所である。換言すれば、ヘモ
グロビンＡ1cに特異的なモノクローナル抗体との反応性
の面からは、ヘモグロビンＡ1cは一価抗原として機能す
る。

【００６１】ヘモグロビンＡ1cを測定するに際しては、
従来技術を用いてラテックス凝集阻害法により測定を行
うことが考えられるが、特開平１ー１５０８５７号公報
によれば、ラテックスに担持させたモノクローナル抗体
は凝集素であるポリハプテンとは反応して凝集を起こす
が、生体試料中のネイティブなヘモグロビンＡ1cはモノ
クローナル抗体とは反応せず、そのために被検試料に例
えば塩酸グアニジンを加えて５６℃、１５分間加熱する
等の前処理が必要とされている。

【００６２】ヘモグロビンＡ1cの測定に関しては、更に
特有な問題があった。すなわち、ヘモグロビンＡ1cは従
来より高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によっ
て測定され、全ヘモグロビン中のヘモグロビンＡ1cの分
画％が求められてきた。従って、上記特開平１ー１５０
８５７号公報によれば、ラテックス凝集阻害法を行って
ヘモグロビンＡ1cの分画％を求めるためには、別途ヘモ
グロビンの定量を行うことが必須であった。

【００６３】本発明の凝集イムノアッセイ法によれば、
ヘモグロビンＡ1cの測定に関しては、例えば、被検試料
（例えば、全血に精製水を加えて溶血したもの）をラテ
ックス（不溶性担体）に吸着させ、抗ヘモグロビンＡ1c
モノクローナル抗体複合体を反応させることにより、ラ
テックスの選択的凝集を起こさせることができ、この選
択的凝集の程度を測定することにより、ヘモグロビンＡ
1cを定量することができる。ＨＰＬＣで測定したヘモグ
ロビンＡ1c％値が既知の標準試料を、本発明の凝集イム
ノアッセイ法により同時に定量して検量線を作成するこ
とにより、この検量線に基づき未知の試料のヘモグロビ
ンＡ1cの分画％値を求めることができる。

【００６４】（抗ＨｂＡ1cモノクローナル抗体）抗Ｈｂ
Ａ1cモノクローナル抗体としては、吸着ないし固相化さ
れたＨｂＡ1cに対して実質的に反応し、固相化されたＨ
ｂＡ0 と実質的に反応しない（好ましくは、更に液相中
のＨｂＡ1c及びＨｂＡ0 と実質的に反応しない）抗Ｈｂ
Ａ1cモノクローナル抗体であれば、特に制限なく用いる
ことができる。本発明者の検討によれば、一般に、糖化
ペプチドを免疫原としてモノクローナル抗体を作製する
と、このようなモノクローナル抗体を得ることができ
る。ここでＨｂＡ1cおよびＨｂＡ0 に対する反応性は、
例えば以下のようにして測定可能である。

【００６５】例えば、固相化されたＨｂＡ1cと反応し、
ＨｂＡ0 とは反応しないことは次のようにして測定する
ことが可能である。

【００６６】９６穴（ウェル）ＥＬＩＳＡ用プレート
（例えばＮＵＮＣ社；ＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯ ＰＬＡ
ＴＥ，ＭＡＸＩＳＯＲＰ Ｆ９６（４−４２４０４））
にＨｂＡ1c（例えば、ＥＸＯＣＥＬＬ社製；精製ＨｂＡ
1c）を、その濃度が５μｇ／ｍＬになるように０．０５
Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．６）で希釈した後、各ウェ
ルに５０μＬづつ分注する。このプレートを４℃で一晩
放置してＨｂＡ1cをＥＬＩＳＡプレートに固相化する。

【００６７】このプレートをＰＢＳ−Ｔ（０．０１Ｍリ
ン酸緩衝液ｐＨ６．８／０．１５ＭＮａＣｌ／０．１％
Tween ２０）で４回洗浄した後、抗ＨｂＡ1cモノクロ
ーナル抗体を含む試料（例えば、ハイブリドーマ培養上
清）５０μＬを加え、室温（約２５℃）で２時間放置し
て反応させる。ＰＢＳ−Ｔで４回プレートを洗浄した
後、ＰＯＤ（ペルオキシダーゼ）標識抗マウスＩｇＧ
（例えばＣＡＰＰＥＬ社製、３７１１−００８１）をＰ
ＢＳ−Ｔで５０００倍希釈し、５０μＬ加え、室温で１
時間反応させる。

【００６８】ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄後、基質溶液（０．
１％ ｏ−フェニレンジアミン（シグマ社製）／リン酸
−クエン酸緩衝液（クエン酸１水和物７．３ｇ／リン酸
２ナトリウム１２水和物２３．９ｇ／精製水１Ｌ）／
０．００３％Ｈ2 Ｏ2 ）１００μＬを加え、室温で３０
分間反応させた後、２Ｎ−硫酸を５０μＬ加え、酵素反
応を停止させる。次いで、イムノプレートリーダー（ダ
イナテック社製、ＭＲ５０００）を用いて上記酵素反応
後の溶液の４９０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を求め
る。

【００６９】上記で用いたＨｂＡ1cに代えてＨｂＡ0
（例えばＥＸＯＣＥＬＬ社製；精製ＨｂＡ0 ）を用いる
以外は上記と同様に実施することにより、モノクローナ
ル抗体とＨｂＡ0 との反応性を同様にＯＤ値で求めるこ
とができる。

【００７０】本発明においては、抗ＨｂＡ1cモノクロー
ナル抗体は、ＨｂＡ1cと上記イムノプレートリーダーの
スケールで１．０以上（更には２．０以上）の反応性を
示すことが好ましく、また、ＨｂＡ0 とは０．１以下
（更には０．０５以下）の反応性を示すことが好まし
い。

【００７１】一方、上記したモノクローナル抗体が、固
相化したＨｂＡ1cとは反応するが、液相中のＨｂＡ1cや
ＨｂＡ0 とは反応しないことは、次のようにして測定可
能である。

【００７２】ＨｂＡ1c １００μＬに対して０．２Ｍグ
リシン緩衝液（ｐＨ２．５）を１００μＬ加え、室温に
５分間放置する。そこにＰＢＳ−Ｔを８００μＬ加え、
攪拌したのち、その１００μＬに抗ヘモグロビンＡ1cモ
ノクローナル抗体（ハイブリドーマ培養上清、５０倍希
釈）を１００μＬ加え、室温に３０分間放置する。そし
て、そのうちの１００μＬを、あらかじめＨｂＡ1cを固
相化（５μｇ／ｍＬ、１００μＬを９６穴プレートに加
え、４℃一晩放置することにより固相化し、ＰＢＳ−Ｔ
で４回洗浄したもの）した９６穴プレートに加え、室温
で２時間反応させる。

【００７３】ＰＢＳ−Ｔで洗浄４回行なった後ＰＯＤ標
識抗マウスＩｇＧ抗体（５０００倍希釈）を１００μＬ
加え、室温で１時間反応させる。ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄
後基質反応を室温３０分間行ない、停止液を加えて４９
０ｎｍのＯＤ値を測定する。上記で用いたＨｂＡ1cに代
えて、ＨｂＡ0 を用いる以外は上記と同様に実施し、モ
ノクローナル抗体とＨｂＡ0 との液相中での反応性を求
めることができる。

【００７４】以上はヘモグロビンを変性させた場合であ
り、対照として、ＨｂＡ1c、ＨｂＡ0 を未変性のまま反
応させるため、グリシン緩衝液１００μＬを加えるとこ
ろを純水１００μＬに変更した以外は上記と同様に実施
し、液相中でのモノクローナル抗体との反応性を求める
ことができる。

【００７５】本発明においては、抗ＨｂＡ1cモノクロー
ナル抗体は、未変性のＨｂＡ1cやＨｂＡ0 、さらには変
性したＨｂＡ0 などとは、液相中では１０μｇ／ｍＬ
（更には２０μｇ／ｍＬ）でも反応性を示さず、一方、
変性ＨｂＡ1cとは液相中で１μｇ／ｍＬ（更には０．５
μｇ／ｍＬ）以下でも反応性を示すことが好ましい。

【００７６】本測定においては、ＨｂＡ1cおよびＨｂＡ
0 は精製して用いることが好ましい。この精製ＨｂＡ1c
およびＨｂＡ0 としては市販品を用いることが可能であ
るが、適当な市販品が無ければ、ＨＰＬＣで精製して用
いてもよい。この精製においては、たとえば、ヒト全血
５０μＬをＰＢＳ ２ｍＬで遠心洗浄し、上清を捨て、
赤血球であるペレットに純水２ｍＬを加えて溶血させ
る。これをＨＰＬＣで分画し、ＨｂＡ1cとＨｂＡ0 のピ
ークを分取する。

【００７７】ＨＰＬＣの分離条件は、たとえば以下の条
件が好ましく用いられる。

【００７８】分析機器：島津ＨＰＬＣシステム カラム：ヘモグロビン分離用高分解能カラム MICROPEA
RL（積水化学工業株） 溶離液Ａ：Low Phosphate 、（Ａuto Ａ1c ,Ｐ type
（京都第一化学）） 溶離液Ｂ：High Phosphate、（リン酸１カリ８．５ｇ、
リン酸２カリ１２．５ｇ、塩化カリウム３．５ｇ、精製
水１Ｌ） 移動相：Ａ＋Ｂ ０〜３．５ｍｉｎ Ｂ濃度 ０％ ３．５〜４．０ｍｉｎ Ｂ濃度 ０％から８０％へのグ
ラジェント ４．０〜１７．０ｍｉｎ Ｂ濃度 ８０％ 流 速：１ｍＬ／ｍｉｎ モニター：吸光度 ４１５ｎｍ サンプル量：２０μＬ （抗ＨｂＡ1cモノクローナル抗体と結合する抗体） 上記した抗ＨｂＡ1cモノクローナル抗体（以下、モノク
ローナル抗体を「ＭＡｂ」とも記載する）と選択的に結
合する抗体（以下、「第２抗体」という）としては、該
ＭＡｂが由来する動物種の精製イムノグロブリンと、オ
クタロニー法において実質的に反応性を示す抗体であれ
ば、特に制限なく用いることができる。

【００７９】本発明において、精製イムノグロブリンと
第２抗体との反応性は、例えば、以下の方法によって評
価することができる。

【００８０】アガロースを１％になるように生理食塩水
に加え、加熱して溶解させ、厚さ１．５ｍｍのアガロー
ス平板を作製し、このアガロース平板に、径３ｍｍ、間
隔２ｍｍの穴（７穴）をパンチャーで開ける。

【００８１】精製マウスＩｇＧ（たとえば、ＺＹＭＥＤ
Laboratories Inc ．品番０２ー６５０２）を０．５
ｍｇ／ｍＬ，０．１２５ｍｇ／ｍＬに０．１５Ｍ塩化ナ
トリウムで調製したもの１０μＬを間隔２ｍｍの７穴の
中央の穴に、第二抗体（例えば、抗マウスＩｇＧヤギ血
清）は０．１５Ｍ塩化ナトリウムで４倍、８倍、１６
倍、３２倍、６２倍、１２８倍、に希釈したもの各１０
μＬを周辺の穴に加え、湿潤中に放置することによりア
ガロース中を拡散させ、沈降線を形成させる。室温で４
ー５時間後に、精製マウスＩｇＧに対して抗血清の何倍
希釈まで沈降線が形成可能かを肉眼で観察する。

【００８２】本発明に用いる第二抗体は、少くとも８倍
希釈まで精製マウスＩｇＧと沈降線を形成することが好
ましく、少なくとも３２倍希釈（更には６４倍希釈）ま
で沈降線を形成することが更に好ましい。

【００８３】次に、本発明においてＨｂＡ1cを測定する
場合の好ましい一実施態様について述べる。

【００８４】本発明においては、各チューブに、通常、
被検試料として溶血液１〜２０μＬ（更には２〜５μ
Ｌ）程度を採取する。実際に用いる溶血液としては、被
検試料（例えば、全血５０μＬに純水１ｍＬを加えたも
の）を５〜１０倍程度にグリシン緩衝液等で希釈して用
いることもできる。

【００８５】次いで、各チューブに、ラテックス懸濁液
（例えば０．１２μｍラテックス、０．２％濃度）を１
００〜３００μＬ（更には１５０〜２００μＬ）程度加
えて、３７ Ｃで１〜３０分（更には３〜１０分）程度
放置して、ラテックスに試料中のＨｂＡ1cを吸着させ
る。この際用いるラテックス懸濁液は、ラテックス原液
をグリシン緩衝液等で希釈して用いることが好ましい。

【００８６】次いでラテックスに吸着させたＨｂＡ1c
に、抗ＨｂＡ1cモノクローナル抗体（例えばマウス腹水
由来のモノクローナル抗体）と第二抗体との複合体を含
む溶液を１００〜３００μＬ（更には１５０〜２００μ
Ｌ）程度加え、３７℃で２〜３０分（更には３〜１０
分）程度放置（インキュベーション）して、ＨｂＡ1cと
モノクローナル抗体とを反応させる。この際に用いるモ
ノクローナル抗体複合体溶液の濃度は、たとえば抗Ｈｂ
Ａ1cモノクローナル抗体と抗マウスＩｇＧ抗体を用いる
場合、それぞれの抗体の希釈系列を作り、最適濃度を求
めることが好ましい。希釈に用いる緩衝液は、たとえ
ば、０．０５ー０．１Ｍグリシン緩衝液（ＧＢＳ；glyc
ine buffered saline；ｐＨ８．２ー８．５，０．１
５Ｍ ＮａＣｌを含む）などをあげることができる。こ
の際用いる緩衝液には界面活性剤（Tween ２０等）を
０．１〜０．５％（更には０．２〜０．３％）程度加え
ておくことが、モノクローナル抗体のラテックス表面へ
の物理吸着を防ぐ点から好ましい。

【００８７】なお、実際の測定において、生化学自動分
析機（例えば日立製作所製、７１５０型自動分析機）を
用いて測定する場合、例えば試料量３〜１５μＬ程度、
試薬量１〜３５０μＬ程度が好適に用いられる場合に
は、一例として、以下のような量比及び反応時間が好ま
しく用いられる。

【００８８】 被検試料： ４μＬ ラテックス懸濁液： ２００μＬ（反応時間５分） モノクローナル抗体複合体： ２００μＬ（反応時間５
分）

【００８９】

【実施例】以下、製造例、実施例により本発明の凝集イ
ムノアッセイ法を更に具体的に説明する。

【００９０】製造例１ （ヘモグロビンＡ1cβ鎖Ｎ末端のグリコペプチドエピト
ープに対するモノクロ−ナル抗体の作製）ヘモグロビン
β鎖のＮ末端アミノ酸配列に相当するペプチドを合成
し、Ｎ末端アミノ酸残基であるＶａｌのα−アミノ基に
グルコースを非酵素的に結合させて、グリコペプチドを
合成し、更にスペーサーを介してキャリアー蛋白に結合
させ、それを免疫原としてモノクローナル抗体を得た。

【００９１】具体的には、以下のようにして行った。

【００９２】Ｆmoc −Ｌ−Valine，Ｎα−Ｆmoc −Ｎim
−Trityl−Ｌ−Histidine ，Ｆmoc−Ｌ−Leucine ，Ｆm
oc −Ｏ−ｔ−Butyl −Ｌ−Threonine 、Ｆmoc −Ｌ−P
roline ，及びＦmoc −ｓ−trityl−Ｌ−Cysteine（い
ずれもペプチド研究所製）を用いて、Val −His −Leu
−Thr −Pro −Cys およびVal −His −Leu −Cys のペ
プチドを合成した（なお、Ｃｙｓ（システイン）は、ス
ペーサーの一部である）。合成は市販のペプチド合成機
（Applied Biosystems，Model ４３０Ａ）を用いて行っ
た。ペプチド合成後、固相である樹脂からペプチドを脱
離させて粗ペプチドを得た。

【００９３】粗ペプチドを１ｍｇ／ｍＬになるように精
製水に溶かし、４℃に冷却した。モル比１．５倍量の
２，２´−ジチオジピリジンを撹拌しながら滴下し、１
０分間反応させて、システインのＳＨ基を保護した。凍
結乾燥後、１％酢酸に溶かし、不溶物を遠心除去した
後、Sephadex Ｇ２５（１５×９００ｍｍカラム）でゲ
ルろ過して得たペプチド分画を凍結乾燥した。このペプ
チドを酢酸に溶かし、ピリジン存在下でモル比２倍量の
グルコースを添加し、室温で約１０日間撹拌した。ペプ
チドが糖化されるとＨＰＬＣでのリテンションタイム
（保持時間）が短くなることから、反応の進行状況はＨ
ＰＬＣでチェックした。

【００９４】ＨＰＬＣによる分析条件は以下の通りであ
る。

【００９５】カラム：ＴＳＫｇｅｌ、ＯＤＳ−１２０Ａ
（４．６×２５０ｍｍ、東ソー社製） 機器：島津ＨＰＬＣシステム 移動相：１０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ
酢酸から６０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ
酢酸への直線勾配 流 速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ 時間：２５ｍｉｎ モニター：吸光度 ２８０ｎｍ この糖化ペプチドを最終的にＨＰＬＣで精製し、凍結乾
燥した。

【００９６】分離条件は以下のとおりである。

【００９７】カラム：ＴＳＫｇｅｌ、ＯＤＳ−１２０Ａ
（２１．５×３００ｍｍ、東ソー社製） 移動相：１０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ
酢酸から６０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ
酢酸への直線勾配 流 速：５ｍＬ／ｍｉｎ モニター：吸光度 ２８０ｎｍ 凍結乾燥した上記ペプチドを０．１Ｍリン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ８．５）に溶かし、システイン保護基を脱離
するため、３倍量のＤＴＴ(Dithiotreitol) を加え、窒
素ガスを満たして２４時間反応させた。そして塩酸でｐ
Ｈを５に下げた後、上記と同様にＨＰＬＣで精製し、凍
結乾燥し、最終的に糖化ペプチドを得た。ただし、２８
０ｍｍの吸光度に代えて２１５ｎｍの吸光度を測定し
た。

【００９８】この糖化ペプチドに、スペーサーとしてＥ
ＭＣＳ（Ｎ−succinimidyl ６−maleimidocaproate)を
用い、常法によりキャリアー蛋白（水溶性蛋白としてTh
yroglobulin ，不溶性蛋白としてEdestin （ともにＦｌ
ｕｋａ社製）に結合させ、免疫原とした。

【００９９】上記免疫原１００μｇを完全フロインドア
ジュバント（Complete Freund's Adjuvant) でｗ／ｏ(w
ater in oil)型ミセルとし、Balb／ｃ、マウス（８週
令）の腹腔中に注射した。追加免疫は免疫原を不完全フ
ロインドアジュバント（Incomplete Freund's Adjuvan
t）でｗ／ｏミセルとし、１ケ月の間隔で２回行なっ
た。細胞融合の３日前に生食（生理的食塩水）中の免疫
原を皮下注射し、これをブースターとした。

【０１００】細胞融合は常法により行なった。すなわ
ち、脾臓から脾細胞をとり、これをマウス・ミエローマ
株細胞（ＰＡＩ、東京理大、新井研究室提供；癌研究リ
サーチソースバンク（ＪＣＲＢ）にて入手可能）と１
０：１の割合で混合し、ポリエチレングリコール４００
０で細胞を融合させた。ＨＡＴ培地に細胞を浮遊させ、
９６穴プレートにまき、融合細胞がクローン増殖してく
るのを待った。スクリーニングは、あらかじめ精製Ｈｂ
Ａ1cもしくはＨｂＡ0 を固相化した９６穴ＥＬＩＳＡプ
レートに培養上清を反応させることにより行なった。Ｐ
ＢＳ−Ｔで洗浄後ＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧを反応さ
せ、洗浄後、ｏ−フェニレンジアミンで発色させた。

【０１０１】より具体的には、スクリーニングは以下の
ようにして行なった。

【０１０２】９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート（ＮＵＮ
Ｃ社製；ＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯＰＬＡＴＥ，ＭＡＸＩ
ＳＯＲＰ Ｆ９６（４−４２４０４））にＨｂＡ1c（Ｂ
ioＲex７０による精製品）を、その濃度が５μｇ／ｍＬ
になるように０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．６）
で希釈した後、各ウェルに５０μＬづつ分注した。この
プレートを４℃で一晩放置してＨｂＡ1cをＥＬＩＳＡプ
レートに固相化した。

【０１０３】このプレートをＰＢＳ−Ｔ（０．０１Ｍリ
ン酸緩衝液、ｐＨ６．８／０．１５Ｍ ＮａＣｌ／０．
１％ Tween ２０）で４回洗浄した後、培養上清５０μ
Ｌを加え、室温（約２５℃）で２時間放置して反応させ
た。ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した後、ＰＯＤ（ペルオキシ
ダーゼ）標識抗マウスＩｇＧ（ＣＡＰＰＥＬ社製；３７
１１−００８１）をＰＢＳ−Ｔで２５００倍希釈し、５
０μＬ加え、室温で１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔで４
回洗浄後、基質溶液（０．１％ｏ−フェニレンジアミン
／リン酸−クエン酸緩衝液（クエン酸１水和物７．３
ｇ、リン酸２ナトリウム１２水和物２３．９ｇ、精製水
１Ｌ／０．００３％Ｈ2 Ｏ2 ）１００μＬ加え、室温で
３０分間反応させた後、２Ｎ−硫酸を５０μＬ加え、酵
素反応を停止させた。

【０１０４】次いで、イムノプレートリーダー（ダイナ
テック社製、ＭＲ５０００）を用いて上記酵素反応後の
溶液の４９０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を求めた。

【０１０５】上記で用いたＨｂＡ1cに代えてＨｂＡ0
（ＢioＲex７０による精製品）を用いた以外は上記と同
様に実施することにより、培養上清とＨｂＡ0 との反応
性を同様にＯＤ値で求めることができた。

【０１０６】ＨｂＡ1cと反応し、ＨｂＡ0 と反応しない
ウェルに、ＨｂＡ1cと特異的に反応するモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマが存在することになる。

【０１０７】ＨｂＡ1cと反応し、ＨｂＡ0 と反応しない
ウエルのハイブリドーマを限界希釈法でクローン化し
た。クローンを大量培養後、あらかじめ１週間前にプリ
スタン（シグマ社製、Ｐ１４０３）１ｍＬを腹腔注射し
たBalb／ｃマウス（９〜１０週令）にハイブリドーマ１
×１０7 cellsを生食（生理食塩水）とともに腹腔注射
し、腹水が腹腔中に充満したところで、モノクローナル
抗体を腹水として採取した。

【０１０８】上記のＥＬＩＳＡで用いた精製ＨｂＡ1c、
ＨｂＡo は以下のようにして得た。

【０１０９】すなわち、ＨｂＡ1cが高値（１０％以上）
を示す検体（ヒト血液）を２５００ｒｐｍ ２０分間遠
心して血漿蛋白を除去した後、赤血球ペレットの５倍量
の生理食塩水を加え、遠心洗浄を２回行った。遠心後の
赤血球ペレットに等量の純水を加え、溶血させた。１
５，０００ｒｐｍ ４５分間高速遠心し、沈澱物を除去
した後、上清をBio Rex 70（Ｂｉｏ Ｒａｄ社製、２０
０〜４００メッシュ、カラムサイズ２８×２５５ｍｍ）
を用いてＨｂＡ1cとＨｂＡ0 を分画した（Trivelli, L.
A., 他、New Engl. J. Med. ２８４，３５３〜３５７、
（１９７１）参照）。各分画の純度をＨＰＬＣでチェッ
クしたところ、ＨｂＡ1cは８０〜９０％、ＨｂＡ0 は９
９％以上であった。蛋白濃度の測定は、蛋白定量試薬
（Ｐｉｅｒｃｅ社製、ＢＣＡ Protein Assay Reagent
）を用い、添付のマニュアル通りに行った。

【０１１０】製造例２ （抗マウスＩｇＧの作製）第二抗体たる抗マウスＩｇＧ
は、外部業者に委託して作製した。すなわち、精製マウ
スＩｇＧ（ＺＹＭＥＤ Laboratories Inc. 品番０２
ー６５０２）を完全フロインドアジュバントと共に、ヤ
ギ皮下に免疫した。抗体価が６４倍以上になるのを基準
にして全採した。

【０１１１】実施例１ ヒトから採取した全血５０μＬに精製水２ｍＬを加えて
溶血させ、被検試料とした。

【０１１２】ポリスチレンチューブ中に、上記被検試料
４μＬを取り、これに粒径０．１２μｍラテックス（積
水化学工業社製、「試薬用ラテックス 品番Ｎ−１０
０」）を１２．５ｍＭグリシン緩衝液 ｐＨ８．２（１
８．８ｍＭ塩化ナトリウムを含む）で希釈して０．２％
濃度としたラテックス懸濁液を２００μＬ加え、３７℃
で２０分間放置して、上記ラテックスに被検試料中のＨ
ｂＡ1cを吸着させた。

【０１１３】次いで、上記ラテックス懸濁液に、製造例
１で得たマウス腹水由来の抗ＨｂＡ1cモノクローナル抗
体と製造例２で得た抗マウスＩｇＧヤギ血清とをＧＢＳ
−Ｔ（ＧＢＳにＴｗｅｅｎ２０を０．３％溶かしたも
の）で希釈し、混合して複合体としたものを２００μＬ
加え、３７℃で２０分間放置して、ラテックスの選択的
凝集反応を行った。

【０１１４】ＨｂＡ1c値が既知の検体をスタンダードと
して同様に凝集反応を行い、分光光度計（ベックマン、
ＤＵー６４０）を用いて６６０ｎｍの吸光度を測定し、
標準曲線を求めた。このようにして求めたＨｂＡ1cの標
準曲線を図１のグラフに示す。この標準曲線から、未知
検体中のＡ1cのパーセント値を求めた。ラテックス法の
対照法として、自動測定装置、Ｈｉ−Ａｕｔｏ Ａ1c
ＨＡ−８１２１型（京都第一科学製）によるＨＰＬＣ法
でＨｂＡ1cを測定して、ラテックス法とＨＰＬＣ法双方
の測定値の相関を求めた。結果を図２のグラフに示す。
図２においては、ＨＰＬＣ測定データはlabile ＨｂＡ
1cを含むＡ1c％を示した。図２に示すようにラテックス
法とＨＰＬＣ法との間には、良好な相関関係が見られ
た。

【０１１５】実施例２ 製造例１で得た抗ＨｂＡ1cモノクローナル抗体の倍々希
釈系列を×１より×２５６倍希釈まで作り、これに製造
例２で得た抗マウスＩｇＧ血清（第二抗体）の×１０希
釈液を同容量加え、撹拌して室温に静置することによ
り、モノクローナル抗体複合体を形成させた。４時間後
の観察から、モノクローナル抗体×３２希釈、×６４希
釈、としたところで最も多量の免疫沈降物がみられたこ
とから、これらの希釈倍数でモノクローナル抗体と第二
抗体の量が、格子状の免疫沈降物を形成するのに適した
量比（すなわち最適比）になっていたことが判明した。

【０１１６】ＨｂＡ1c ０％、８％、１６％の溶血液４
μＬを、実施例１と同様にラテックス２００μＬに吸着
させ、上記の各モノクローナル抗体複合体をＧＢＳ−Ｔ
でさらに×１６倍希釈した溶液を２００μＬ加えて３７
℃で２０分間反応させ、ラテックスを凝集させた。結果
を図３のグラフに示す。本発明による凝集イムノアッセ
イに適したモノクローナル抗体複合体は、最適比よりも
モノクローナル抗体が約８倍過剰に存在する複合体であ
った。

【０１１７】実施例３ 製造例１で得た抗ＨｂＡ1cモノクローナル抗体の濃度を
×８倍希釈の一定とし、第二抗体の濃度を×２倍希釈よ
り×５１２倍希釈まで倍々希釈系列を作り、同容量づつ
加え、撹拌して室温に静置することにより、モノクロー
ナル抗体複合体を形成させた。最も多量の免疫沈降物が
みられた最適比は、第二抗体×２倍希釈、×４倍希釈の
ところであった。

【０１１８】上記各モノクローナル抗体複合体をＧＢＳ
−Ｔでさらに×８倍希釈した溶液を用いた以外は、実施
例２と同様にしてラテックスを凝集させた。結果を図４
のグラフに示す。本発明による凝集イムノアッセイ法に
適したモノクローナル抗体複合体は、最適比よりも、モ
ノクローナル抗体が約８倍過剰に存在する複合体であっ
た。

【０１１９】実施例４ 製造例１で得た抗ＨｂＡ1cモノクローナル抗体の複合体
を、該モノクローナル抗体と抗マウスＩｇＧ抗体（第二
抗体）の複合体という形とした場合と、ビオチン標識該
モノクローナル抗体とアビジンＤの複合体という形とし
た場合との相関を求めた。

【０１２０】ビオチン化試薬として、ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂ
ｉｏｔｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社製、Ｎｏ．２１３３５）を
用い、該試薬に添付のマニュアル通りに抗ＨｂＡ1cモノ
クローナル抗体のビオチン化を行った。未反応のビオチ
ンは、透析を繰り返すことにより除去した。アビジンＤ
としては、ＶＥＣＴＯＲ社製のＡ−２０００を用い、上
記ビオチン標識モノクローナル抗体に加えることにより
複合体化した。

【０１２１】実施例１と同様にラテックスに被検試料中
のＨｂＡ1cを吸着させた後、抗ＨｂＡ1cモノクローナル
抗体と抗マウスＩｇＧヤギ血清（第二抗体）との複合体
２００μＬを加え、さらに３７℃で２０分間反応させ、
ラテックスの選択的凝集反応を行った。

【０１２２】対照として、抗ＨｂＡ1cモノクローナル抗
体と抗マウスＩｇＧヤギ血清との複合体に代えて、上記
で得たビオチン標識ＨｂＡ1cモノクローナル抗体とアビ
ジンＤとの複合体を加えた以外は、上記と同様にラテッ
クスの選択的凝集反応を行った。

【０１２３】結果を図５のグラフに示す。抗ＨｂＡ1cモ
ノクローナル抗体の複合体化の方法として抗マウスＩｇ
Ｇ抗体を用いた場合と、ビオチンーアビジン系の方法を
用いた場合とで、得られたＡ1c％値の間には良好な相関
関係が認められた。

【０１２４】実施例５ 一晩４℃に放置した正常全血サンプルの上清である血漿
を静かにピペットで分離することにより、下層の赤血球
層を得た。この赤血球層を赤血球過多の全血検体とみな
し、先に分離した血漿で倍々希釈系列（×１、×２、×
４、×８、×１６）を作った。これらをヘモグロビン濃
度の異なる全血検体とみなし、それぞれ２５μＬに対し
て、０．５ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬの精製水を加えて溶血
させた。このように溶血させた検体のそれぞれ４μＬを
被検試料とした以外は、実施例１と同様にラテックスの
選択的凝集反応を行い、６６０ｎｍのＯＤ値を測定し
た。

【０１２５】得られた結果を図６のグラフに示す。被検
試料４μＬの場合、全血に２０倍の精製水を加えて溶血
したものは、ヘモグロビン濃度が低下するにしたがい６
６０ｎｍＯＤ値が上昇しているのに対して、４０倍の精
製水を加えて溶血した場合には、ほぼ一定の６６０ｎｍ
ＯＤ値を示しており、ヘモグロビン濃度の違いが測定値
にあまり影響しないことが判明した。

【０１２６】また、干渉物質の影響（干渉チェックＡ、
国際試薬社製、品番７９２９０）を調べたところでは、
乳ビ、ビリルビン共に、ほとんど本発明による凝集イム
ノアッセイ法には影響しなかった。

【０１２７】実施例６ 第一反応、すなわち被検試料と、ラテックス懸濁液との
反応時間を２〜３０分間とした以外は実施例１と同様に
してラテックスの選択的凝集反応を行い、６６０ｎｍの
ＯＤ値を測定した。結果を図７のグラフに示す。ヘモグ
ロビンＡ1cのラテックスへの吸着は、短時間に行なわれ
ることが判明した。

【０１２８】第二反応、すなわち抗ヘモグロビンＡ1cモ
ノクローナル抗体と抗マウスＩｇＧ抗体（第二抗体）と
の複合体を反応させる時間を２〜３０分間とした以外
は、実施例１と同様にしてラテックスの選択的凝集反応
を行い、６６０ｎｍのＯＤ値を測定した。得られた結果
を図８のグラフに示す。モノクローナル抗体複合体を用
いることにより、ラテックスは短時間のうちに凝集する
ことが判明した。

【０１２９】実施例７ ＨｂＡ1cおよびＨｂＡ0 をそれぞれ生食（生理食塩水）
で倍々に希釈して、希釈系列を作製した。

【０１３０】これらの希釈系列それぞれ１００μＬに対
して、０．２Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ２．５）を１００
μＬ加え、室温に５分間放置した。

【０１３１】そこにＰＢＳ−Ｔ（０．０１Ｍリン酸緩衝
液ｐＨ６．８／０．１５Ｍ ＮａＣｌ／０．１％ Ｔｗ
ｅｅｎ ２０）を８００μＬ加え攪拌したのち、その１
００μＬに抗ヘモグロビンＡ1cモノクローナル抗体（培
養上清、５０倍希釈）を１００μＬ加え、室温に３０分
間放置した。次いで、そのうちの１００μＬを、あらか
じめＨｂＡ1cを固相化した９６ウェルプレート（５μｇ
／ｍＬ、１００μＬを９６ウェルプレートに加え、４℃
一晩放置することにより固相化し、ＰＢＳ−Ｔで４回洗
浄したもの）に加え、室温で２時間反応させた。

【０１３２】ＰＢＳ−Ｔで洗浄４回行なった後、ＰＯＤ
（ペルオキシダーゼ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＣＡＰ
ＰＥＬ社製、３７１１−００８１）（５０００倍希釈）
を１００μＬ加え、室温で１時間反応させた。

【０１３３】以降の操作は、モノクローナル抗体作製時
のスクリーニングのときと同様に行なった。すなわち、
基質反応を室温３０分間行ない、停止液を加えて４９０
ｎｍのＯ．Ｄ値を測定した。以上の操作は、ＨｂＡ1cも
しくはＨｂＡ0 を変性させて、それらが、抗ＨｂＡ1cモ
ノクローナル抗体が固相化されたＨｂＡ1cと反応するの
を阻害するか否かを判定するためのものであった。

【０１３４】対照として、ＨｂＡ1c、ＨｂＡ0 を未変性
のまま反応させるため、グリシン緩衝液１００μＬを加
えるところを純水１００μＬに変更した以外は、上記と
同様の操作を繰り返して４９０ｎｍのＯ．Ｄ値を測定し
た。

【０１３５】結果を図９のグラフに示す。図９に示すよ
うに、ＨｂＡ1cを変性させると、抗ＨｂＡ1cモノクロー
ナル抗体と液相中で反応し、固相化されたＨｂＡ1cとの
反応が阻害された。一方、変性させないＨｂＡ1cにはこ
のような阻害は認められず、抗ＨｂＡ1cモノクローナル
抗体とは液相中で反応しないことが判明した。また、Ｈ
ｂＡ0 は、変性の有無にかかわらず抗ＨｂＡ1cモノクロ
ーナル抗体とは反応しなかった。

【０１３６】

【発明の効果】上述したように本発明によれば、被検試
料中の抗原性物質を不溶性担体粒子に吸着させ、該抗原
性物質に特異的に反応する抗体もしくは抗体複合体を反
応させて不溶性担体粒子を選択的に凝集させることを特
徴とする凝集イムノアッセイ法が提供される。

【０１３７】本発明の凝集イムノアッセイ法によれば、
煩雑な前処理を行うことなく、簡便且つ迅速に被検試料
中の抗原性物質の測定が可能となるため、同時に多数検
体を並列的に処理することも極めて容易となる。加え
て、このようなアッセイ法は、生化学自動分析機に好適
に適用可能であるため、測定の自動化、大量処理が可能
となる。

【０１３８】更に、本発明によればアッセイ法自体のみ
ならず、試薬の製造という点についても有利な点があ
る。すなわち、一般に、ラテックス試薬（ラテックスに
抗原、抗体等が結合されている）の製造は、同じ品質の
ものを作ることは必ずしも容易ではない。また、保存中
に凝集や沈殿が生じるのを防ぐためのノウハウも必要で
ある。一般に、ラテックス診断薬の価格のうちで素材ラ
テックスのコストは低く、試薬の価格の過半を占めるの
は、生物材料と、それをラテックス粒子に被覆するため
の工程に要するコストである。

【０１３９】これに対し、本発明によれば、ラテックス
等の不溶性担体に抗原や抗体は実質的に感作されておら
ず、市販の試薬用の不溶性担体（ラテックス等）をその
まま使用することも可能なため、新たな「ラテックス試
薬」を製造することは必須でなくなる。加えて、本発明
においては、抗体についても、必ずしも精製品である必
要はなく、また、酵素標識などの操作も必要ないため、
測定試薬の製造が容易となり、保存安定性の面でも極め
て有利である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の凝集イムノアッセイ法によるＨｂＡ1c
の標準曲線を示すグラフである。

【図２】ＨｂＡ1cに関して、ＨＰＬＣ法と本発明の凝集
イムノアッセイ法とによる測定値の相関を示すグラフで
ある。

【図３】モノクローナル抗体の量を可変とし、第二抗体
の量を一定とした際の、モノクローナル抗体複合体の反
応性を示すグラフである。図中の矢印は最適比領域を示
す。

【図４】モノクローナル抗体の量を一定とし、第二抗体
の量を可変とした際の、モノクローナル抗体複合体の反
応性を示すグラフである。図中の矢印は最適比領域を示
す。

【図５】本発明による凝集イムノアッセイ法のうち、抗
マウスＩｇＧ（第二抗体）で抗ＨｂＡ1cモノクローナル
抗体を複合体とした場合と、アビジンＤでビオチン標識
抗ＨｂＡ1cモノクローナル抗体を複合体とした場合の測
定値との相関を示すグラフである。

【図６】検体中の赤血球の量（すなわちヘモグロビン
量）、および検体を溶血させるときの精製水の量が、本
発明の凝集イムノアッセイ法による測定値に与える影響
を説明するためのグラフである。

【図７】ＨｂＡ1cをラテックスに吸着させる時間が、本
発明の凝集イムノアッセイ法による測定値に与える影響
を説明するためのグラフである。

【図８】抗ＨｂＡ1cモノクローナル抗体複合体を反応さ
せる時間が、本発明の凝集イムノアッセイ法による測定
値に与える影響を説明するためのグラフである。

【図９】抗ＨｂＡ1cモノクローナル抗体がＥＬＩＳＡプ
レートに固相化されたＨｂＡ1cと反応するが、液相中の
ＨｂＡ1cとは反応せず、液相中の変性させたＨｂＡ1cと
は反応することを示すグラフである。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 被検試料中の抗原性物質を不溶性担体粒
   子に吸着もしくは結合させ、該抗原性物質に特異的に反
   応する抗体もしくは抗体複合体を反応させて、不溶性担
   体粒子を選択的に凝集させることを特徴とする凝集イム
   ノアッセイ法。
2. 【請求項２】 被検試料中の抗原性物質を不溶性担体粒
   子に吸着もしくは結合させた後、該被検試料を洗浄によ
   り除去することなく、抗原性物質に特異的に反応する抗
   体もしくは抗体複合体を反応させる請求項１記載の凝集
   イムノアッセイ法。
3. 【請求項３】 前記抗体もしくは抗体複合体が、ネイテ
   ィブな状態で液相中に存在する抗原性物質には実質的に
   反応せず、不溶性担体に固相化された抗原性物質には特
   異的に反応する抗体もしくは抗体複合体である請求項１
   又は２記載の凝集イムノアッセイ法。
4. 【請求項４】 前記抗体がモノクロナール抗体である請
   求項１又は２記載の凝集イムノアッセイ法。
5. 【請求項５】 前記抗体がポリクローナル抗体である請
   求項１又は２記載の凝集イムノアッセイ法。
6. 【請求項６】 前記抗体複合体が、抗原性物質に特異的
   に反応する抗体と、これに選択的に反応する第二抗体と
   からなる請求項１又は２記載の凝集イムノアッセイ法。
7. 【請求項７】 前記抗体複合体が、抗原性物質に特異的
   に反応する抗体のビオチン標識体と、アビジンとからな
   る請求項１又は２記載の凝集イムノアッセイ法。
8. 【請求項８】 前記不溶性担体粒子が、水性液体媒体に
   実質的に不溶性である有機高分子物質の微粒子および／
   又は無機物質の微粒子からなる請求項１又は２記載の凝
   集イムノアッセイ法。
9. 【請求項９】 前記不溶性担体粒子が、表面処理した微
   粒子からなる請求項１又は２記載の凝集イムノアッセイ
   法。
10. 【請求項１０】 不溶性担体粒子が、平均粒径０．０４
    〜０．８ミクロンの範囲のラテックス粒子である請求項
    １又は２記載の凝集イムノアッセイ法。