JPH09318629A

JPH09318629A - イムノアッセイ法

Info

Publication number: JPH09318629A
Application number: JP8132338A
Authority: JP
Inventors: Yoshie Matsumoto; 美枝松本; Tatsuo Yamamoto; 達夫山本
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1996-05-27
Filing date: 1996-05-27
Publication date: 1997-12-12
Anticipated expiration: 2016-05-27
Also published as: JP3569074B2

Abstract

(57)【要約】【課題】被検試料中の抗原性物質を、選択的に、か
つ、高感度に検出できるイムノアッセイ法を提供する。【解決手段】被検試料中の抗原に、上記抗原に特異的
に反応するモノクローナル抗体を反応させることによ
り、上記抗原を定性又は定量するイムノアッセイ法であ
って、上記モノクローナル抗体は、第一モノクローナル
抗体及び第二モノクローナル抗体の２種類からなり、上
記抗原に、上記第一モノクローナル抗体を吸着又は結合
させた不溶性担体を反応させた後に、上記第二モノクロ
ーナル抗体及び上記第二モノクローナル抗体に結合性を
有する第二抗体を更に反応させることにより上記不溶性
担体を凝集させるイムノアッセイ法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、生体被検試料中の
抗原を、選択的に、かつ、高感度に検出できるイムノア
ッセイ法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、病院、検査センター等において
は、人手不足、コスト削減、多量検体処理の要請等の点
から、臨床検査等の諸検査の自動化や測定時間の短縮化
が図られている。検査の自動化に適した方法として、不
溶性担体粒子の凝集反応を利用して、抗原を定性又は定
量する凝集法が注目されている。

【０００３】免疫化学分野においては、凝集法として、
不溶性担体としてラテックスを利用するラテックス凝集
イムノアッセイ法が主に用いられてきた。特公昭５８−
１１５７５号公報に開示されているように、ラテックス
凝集イムノアッセイ法は、抗原又はこの抗原に特異的に
結合する抗体をラテックスに担持させ、被検試料中の抗
原と、抗体又はそのフラグメントとを反応、凝集させ、
その凝集の程度を光学的に測定することにより、上記抗
原を検出又は定量する方法である。

【０００４】凝集イムノアッセイ法において、多くの場
合、抗体としてポリクローナル抗体が用いられてきた。
しかし、ポリクローナル抗体は、同じ品質のものを得る
ことが難しく、特異抗体に精製する段階でのポリクロー
ナル抗体の損失が大きい等の欠点がある。

【０００５】一方、モノクローナル抗体を用いた場合、
品質が一定した抗体を大量生産することが可能である。
しかしながら、モノクローナル抗体は、抗原分子上の特
定のエピトープとのみ反応するので、抗原が多価抗原で
ある場合でも、特定のエピトープに関しては多価である
とは限らない。従って、抗体としてモノクローナル抗体
を用いた場合には、特定のモノクローナル抗体に対応す
るエピトープに関しては、一価抗原となる可能性が高く
なる。

【０００６】測定の目的とする抗原が一価抗原である場
合、ラテックスに担持された抗体と被検試料中の抗原と
が反応又は結合しても、通常、凝集は起こらない。この
場合、抗体を担持させたラテックスと、このラテックス
を凝集させることができる凝集素としてのポリハプテン
と、被検試料とを混合し、反応させて、被検試料中の抗
原がラテックス凝集をどの程度阻害したかを測定するこ
とにより、抗原を検出又は定量する方法（凝集阻害法）
が知られている。

【０００７】従って、多価抗原である蛋白抗原の場合、
モノクローナル抗体を用いた凝集法においては、上述し
た理由で抗原エピトープに関して一価となる可能性があ
るので、このような蛋白抗原の測定においては、その抗
原エピトープの部分を含むポリハプテンを用いた凝集阻
害法に頼らざるを得ない。従って、一価抗原をモノクロ
ーナル抗体を用いて測定する場合、凝集素としてのポリ
ハプテンが新たに必要となるが、そのポリハプテンが被
検試料中のネイティブな抗原と同一の反応性を示す保証
はない。

【０００８】モノクローナル抗体を用いる場合、当然な
がら、凝集素としてのポリハプテンと反応するモノクロ
ーナル抗体を用いることになるが、そのモノクローナル
抗体がネイティブな抗原とは反応しない場合もある。こ
れは、蛋白抗原の場合、抗体との反応性においては蛋白
抗原の高次構造が重要な役割を果たしているのに対し、
凝集素であるポリハプテンはペプチドのポリマー又はオ
リゴマーであり、上記蛋白抗原そのものとは立体構造が
異なることによると考えられる。このような場合、ネイ
ティブな抗原の反応性をポリハプテンの反応性に近づけ
るための何らかの処理が必要となる。

【０００９】特開平６−１６７４９５号公報には、被検
試料中の抗原を不溶性担体粒子に吸着させ、上記抗原に
特異的に反応するモノクローナル抗体を反応させた後、
上記モノクローナル抗体に選択的に結合する第二抗体を
更に反応させて上記不溶性担体粒子を選択的に凝集させ
る凝集イムノアッセイ法が開示されている。この方法
は、煩雑な前処理を行わずにモノクローナル抗体を用い
ることができるが、被検試料中の抗原を不溶性担体粒子
に吸着させて固相化する必要があるので、抗原がｎｇ／
ｍｌ以下の微量である場合には適用することができない
等の欠点がある。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記に鑑
み、被検試料中の抗原を、選択的に、かつ、高感度に検
出できるイムノアッセイ法を提供することを目的とす
る。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は、被検試料中の
抗原に、上記抗原に特異的に反応するモノクローナル抗
体を反応させることにより、上記抗原を定性又は定量す
るイムノアッセイ法であって、上記モノクローナル抗体
は、第一モノクローナル抗体及び第二モノクローナル抗
体の２種類からなり、上記抗原に、上記第一モノクロー
ナル抗体を吸着又は結合させた不溶性担体を反応させた
後に、上記第二モノクローナル抗体及び上記第二モノク
ローナル抗体に結合性を有する第二抗体を更に反応させ
ることにより上記不溶性担体を凝集させることを特徴と
するイムノアッセイ法である。以下に本発明を詳述す
る。

【００１２】本発明のイムノアッセイ法においては、被
検試料中の抗原に、上記抗原に特異的に反応するモノク
ローナル抗体を反応させて凝集させることにより、上記
抗原を定性又は定量する。

【００１３】本発明のイムノアッセイ法で用いられるモ
ノクローナル抗体は、細胞融合技術分野における公知の
方法を適宜選択し又は組み合わせて、モノクローナル抗
体産生融合細胞株を形成し、上記モノクローナル抗体産
生融合細胞株より産生して得ることができる。上記モノ
クローナル抗体産生融合細胞株としては、例えば、完全
抗原を用いて、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツ
ジ、ウマ、ウシ等の動物に、例えば、アジュバント等と
ともに皮下注射する等の方法を用いて投与して、上記動
物を免疫した後、この免疫動物、例えば、免疫マウスの
上記抗原に対する抗体産生細胞、例えば、脾細胞、胸腺
細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等の抗体産生細胞を採
取し、上記抗体産生細胞と、自己増殖性を有するが抗体
産生能を実質的に有しない適当な株化細胞、例えば、マ
ウス骨髄腫株化細胞（ミエローマ細胞）等とを、公知の
方法により細胞融合処理する方法等により得ることがで
きる。

【００１４】上記モノクローナル抗体を得るための上記
株化細胞と上記モノクローナル抗体産生細胞との組み合
わせは、各細胞が融合して増殖しつつ抗体を産生するこ
とが可能であれば、それぞれの細胞が由来する動物の種
類としては限定されず、任意の組み合わせでよい。

【００１５】上記株化細胞としては特に限定されず、例
えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒト等の動物の細胞体
等が挙げられる。上記株化細胞としては、薬剤抵抗性の
ものであり、かつ、未融合の株化細胞が選択培地で生存
せず、一方融合細胞のみが生存するようなものが好まし
い。上記株化細胞としては、例えば、８−アザグアニジ
ン抵抗性の株化細胞等が挙げられる。上記８−アザグア
ニジン抵抗性の株化細胞は、ヒポキサンチン・グアニン
・ホスホリボシルトランスフェラーゼを欠損し、ヒポキ
サンチン・アミンプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地に
生育できない性質を有している。上記株化細胞として
は、特に、非分泌型のものであることが好ましく、例え
ば、マウスミエローマＭＯＰＣ−２１株由来のＰ３／Ｘ
６３−Ａｇ８Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８
・６・５・３、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１、Ｓｐ２
／Ｏ−Ａｇ１４、ラットミエローマ２１０・ＲＣＹ３・
Ａｇ１・２・３等が挙げられる。

【００１６】上記細胞融合処理の方法としては、例え
ば、イーグル最小基本（ＭＥＭ）培地、ＲＰＭＩ−１６
４０培地等の培地中で上記免疫マウスの脾細胞１×１０
⁸〜５×１０⁸個と、上記マウス骨髄腫株化細胞１×１
０⁷〜５×１０⁷個とを混合する方法等が挙げられる。

【００１７】上記細胞融合処理には、融合促進剤を用い
てもよい。上記融合促進剤としては、例えば、平均分子
量１０００〜６０００のポリエチレングリコール（以下
「ＰＥＧ」という）、ポリビニルアルコール、ウイルス
等が挙げられるが、なかでも、ＰＥＧが好ましい。上記
ＰＥＧは、約３０〜５０％の濃度で用いることができ
る。

【００１８】本発明のイムノアッセイ法においては、上
述のようにして得られた融合細胞含有系から、公知の方
法により、選別処理、抗体活性スクリーニング処理及び
クローニング処理を行い、免疫マウスと形成に用いた完
全抗原とに対するモノクローナル抗体産生能を有し、か
つ、自己増殖能を有するモノクローナル抗体産生融合細
胞株を得ることができる。

【００１９】上記モノクローナル抗体産生融合細胞株の
選別処理としては、例えば、２０％ウシ胎児血清含有Ｒ
ＰＭＩ−１６４０培地等で細胞融合を終えた細胞を適当
に希釈し、９６穴マイクロプレートに１０５〜１０６個
／ウェル程度に分注し、各ウェルに選択培地（例えば、
ＨＡＴ培地等）を加え、以後選択培地交換を行いなが
ら、５％ＣＯ₂培養器（３７℃）で培養を続けること等
により行うことができる。上記株化細胞として８−アザ
グアニン抵抗性の株化細胞を用いた場合、未融合の株化
細胞はＨＡＴ培地で死滅し、また、モノクローナル抗体
産生細胞は正常細胞なのでｉｎｖｉｔｒｏ培養では長
期間生育できないので、培養後１０〜１４日ぐらいから
生育してくる細胞はすべてモノクローナル抗体産生融合
細胞株である。

【００２０】上記モノクローナル抗体産生融合細胞株の
抗体活性スクリーニング処理及びクローニング処理は、
常法により行うことができ、例えば、以下のようにして
行うことができる。上記モノクローナル抗体産生融合細
胞株が生育したウェルの培養上清の一部を採取し、一定
量の標識抗原とインキュベーションし、標識抗原との結
合能を測定することにより目的とする抗体を分泌してい
るウェルを検索することができる。すなわち、１２５
Ｉ、１３１Ｉ等のラジオアイソトープ又は酵素等で標識
した抗原と培養上清を反応させた後、各反応液について
抗原−抗体結合物を分離し、標識量を測定することによ
り、目的とする抗体の存在及び結合能を検索することが
できる。目的とする抗体活性が認められる各ウェル中に
は２種以上の融合細胞が生育している可能性があるの
で、限界希釈法や軟寒天によるコロニー形成法によりク
ローニングを行い、モノクローナル抗体産生融合細胞株
を得ることができる。

【００２１】上記モノクローナル抗体産生細胞株を用い
て、上記免疫動物の形成に用いた完全抗原に対するモノ
クローナル抗体を得る方法としては、例えば、上記モノ
クローナル抗体産生細胞株を適当な培地に培養し、培地
からモノクローナル抗体を採取する方法、上記株化細胞
由来動物と同系の動物に上記モノクローナル抗体産生細
胞株を移植し腹水中のモノクローナル抗体を採取する方
法等の公知の方法を用いることができる。

【００２２】前者の方法としては、例えば、モノクロー
ナル抗体産生融合細胞株を１０％ウシ胎児血清含有ＲＰ
ＭＩ−１６４０培地等の培養液で培養し、その培養上清
液を硫安分画、抗原を結合させたセファロース４Ｂ等の
アフィニティークロマトグラフィー等によって精製する
方法等が挙げられる。

【００２３】後者の方法としては、例えば、上記同系の
動物にプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチル
ペンタデカン）等の鉱物油を腹腔内投与した後、モノク
ローナル抗体産生融合細胞株を腹腔内投与することによ
りｉｎｖｉｖｏで融合細胞を大量に増殖させ、その結
果、形成される腹水には高濃度のモノクローナル抗体が
含まれるので、この腹水から硫安分画及び必要に応じて
上述のアフィニティークロマトグラフィー等によって精
製する方法等が挙げられる。上記モノクローナル抗体
は、市販品として入手することもできる。

【００２４】本発明のイムノアッセイ法において、上記
モノクローナル抗体は、第一モノクローナル抗体及び第
二モノクローナル抗体の２種類からなる。上記第一モノ
クローナル抗体及び上記第二モノクローナル抗体は、同
一の抗原に反応するものであり、かつ、お互いに異なる
モノクローナル抗体である。

【００２５】本発明のイムノアッセイ法においては、抗
原に、上記第一モノクローナル抗体を吸着又は結合させ
た不溶性担体を反応させた後に、上記第二モノクローナ
ル抗体及び上記第二モノクローナル抗体に結合性を有す
る第二抗体を更に反応させることにより上記不溶性担体
を凝集させる。

【００２６】上記不溶性担体としては、従来より免疫化
学的凝集法又は凝集阻害法において一般的に用いられて
いる微粒子の担体を用いることができる。上記不溶性担
体としては特に限定されないが、工業的に大量生産が可
能な有機系微粒子が好ましく、例えば、スチレン、塩化
ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エ
ステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーの
単一重合体又は共重合体；スチレン−ブタジエン共重合
体、メチルメタクリレート−ブタジエン共重合体等のブ
タジエン系共重合体等の微粒子等が挙げられる。

【００２７】上記有機系微粒子は、官能基を有する反応
性有機系微粒子等であってもよい。上記官能基として
は、例えば、カルボキシル基、第１級アミノ基、カルボ
アミノ基（−ＣＯＮＨ₂）、水酸基、アルデヒド基等が
挙げられる。

【００２８】上記不溶性担体としては、その他、動物の
赤血球、細菌の細胞等の生物学的粒子；ベントナイト、
コロジオン、コレステロール結晶、シリカ、カオリン、
炭素末等非生物学的粒子等が挙げられる。

【００２９】本発明のイムノアッセイ法においては、上
記不溶性担体が、水性液体媒体に実質的に不溶性である
有機高分子物質の微粒子又は無機物質の微粒子であるこ
とが好ましい。本発明のイムノアッセイ法においては、
不溶性担体が、ラテックス粒子であることが好ましい。

【００３０】上記不溶性担体の表面に上記第一モノクロ
ーナル抗体を吸着又は結合させる方法としては、公知の
方法を適宜用いることができ、例えば、不溶性担体表面
にモノクローナル抗体を物理的に吸着させる方法、官能
基を有する不溶性担体表面に、既知の方法である化学結
合法又は共有結合法によりに感作する方法等が挙げられ
る。

【００３１】上記第二モノクローナル抗体に結合性を有
する第二抗体としては、上記第二モノクローナル抗体に
選択的に結合する能力を有するものであれば、ポリクロ
ーナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでもよく、
また、由来の動物種も問わない。上記第二モノクローナ
ル抗体に結合性を有する第二抗体としては、例えば、第
二モノクローナル抗体がマウス由来の場合には、他の動
物由来の抗マウスイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）血清等
の抗イムノグロブリン血清等を用いることができる。ま
た、その精製度も抗血清、イムノグロブリン分画、アフ
ィニティ精製分画、Ｆ（ａｂ′）２分画等いずれでもよ
い。

【００３２】本発明のイムノアッセイ法において、上記
第二モノクローナル抗体と、上記第二モノクローナル抗
体に結合性を有する第二抗体とは、あらかじめ結合させ
ておくことが好ましく、例えば、両者を恒温（好ましく
は２５〜３７℃）でインキュベートする等の方法で両者
の複合体を得ることができる。上記複合体をそのまま用
いてもよいし、第二抗体に第二モノクローナル抗体が２
個導入された複合体のみ、ゲル濾過等の方法で分離精製
して得られた画分を用いてもよい。上記第二モノクロー
ナル抗体に結合性を有する第二抗体は、フリーの状態で
は、非特異凝集の原因となる可能性があるので、あらか
じめ複合体の混合物から除いておくことが好ましい。

【００３３】本発明のイムノアッセイ法により検出され
る抗原としては、被検試料中に含まれる生理活性物質で
あり、かつ、上記抗原に対応するモノクローナル抗体の
作成又は入手が可能であれば特に限定されないが、臨床
検査上重要な項目であり、従来の凝集法では検出感度が
不足であるとされていた項目について特に有用であり、
例えば、癌検診のスクリーニングにおいて測定されるＣ
ＥＡ、ＣＡ１９−９等のｎｇ／ｍｌまで検出感度が要求
される項目等が好ましい。

【００３４】本発明のイムノアッセイ法において、上記
不溶性担体に吸着又は結合させた第一モノクローナル抗
体と、上記第二モノクローナル抗体及び上記第二モノク
ローナル抗体に結合性を有する第二抗体と、上記抗原と
の反応は、抗原抗体反応及びそれに伴う凝集反応であ
る。上記反応条件としては、上記凝集反応が起こりうる
条件であれば特に限定されないが、上記反応は恒温で行
うのが好ましく、より好ましくは２５〜３７℃である。
上記反応時間は、５秒〜１５分が好ましい。

【００３５】上記反応液としては、抗原抗体反応が起こ
りうる生理的条件を満たす水溶液であれば特に限定され
ないが、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩酸緩
衝液、グッド緩衝液等が好ましい。上記反応液のｐＨ
は、５．５〜８．５が好ましい。より好ましくは６．５
〜８．０である。上記反応液には、種々の添加剤を適宜
溶解させてもよい。上記添加剤としては、例えば、牛血
清アルブミン、ショ糖等の安定剤；感度を高める効果が
期待されるポリエチレングリコール、デキストラン等の
水溶性多糖類；アジ化ナトリウム等の防腐剤；塩濃度調
整のための塩化ナトリウム等が挙げられる。

【００３６】上記不溶性担体の凝集の程度を測定する方
法としては特に限定されず、凝集を定性的又は半定量的
に測定する場合には、例えば、既知の試料の濁度の程度
と比較して、上記不溶性担体粒子の凝集の程度を目視に
よって判定すること等が可能である。上記凝集を定量的
に測定する場合には、簡便性及び精度の点から、例え
ば、光学的に測定すること等が好ましい。

【００３７】上記凝集の光学的測定法としては、公知の
方法を用いることができ、例えば、いわゆる比濁法（凝
集塊の形成を濁度の増加としてとらえる方法）、粒度分
布による測定法（凝集塊の形成を粒度分布又は平均粒径
の変化としてとらえる方法）、積分球濁度法（凝集塊の
形成による前方散乱光の変化を積分球を用いて測定し、
透過光強度との比を比較する方法）等が挙げられる。

【００３８】これらのそれぞれの測定法においては、速
度試験（レートアッセイ；異なる時点で少なくとも２つ
の測定値を得て、これらの時点間における測定値の増加
分（すなわち増加速度）に基づき凝集の程度を求め
る）、又は、終点試験（エンドポイントアッセイ；ある
時点（通常は、反応の終点と考えられる時点）で１つの
測定値を得て、この測定値に基づき凝集の程度を求め
る）を用いることができる。上記凝集の光学的測定法と
しては、なかでも、測定の簡便さ、迅速性の点から、比
濁法を用いた速度試験が好ましい。

【００３９】本発明２は、被検試料中の抗原に、上記抗
原に特異的に反応するモノクローナル抗体を反応させる
ことにより、上記抗原を定性又は定量するイムノアッセ
イ法であって、上記モノクローナル抗体は、第一モノク
ローナル抗体及び第二モノクローナル抗体の２種類から
なり、上記抗原に、上記第一モノクローナル抗体を吸着
又は結合させた不溶性担体を反応させた後に、上記第二
モノクローナル抗体及び上記第二モノクローナル抗体に
結合性を有する第二抗体を吸着又は結合させた不溶性担
体を更に反応させることにより上記不溶性担体を凝集さ
せることを特徴とするイムノアッセイ法である。

【００４０】本発明２のイムノアッセイ法において、上
記第二モノクローナル抗体及び上記第二モノクローナル
抗体に結合性を有する第二抗体を吸着又は結合させる不
溶性担体としては、第一モノクローナル抗体を吸着又は
結合させる不溶性担体と同様のものを用いることができ
る。

【００４１】本発明２のイムノアッセイ法において、上
記第二モノクローナル抗体と、上記第二モノクローナル
抗体に結合性を有する第二抗体とは、あらかじめ結合さ
せておくことが好ましい。

【００４２】上記不溶性担体の表面に上記第二モノクロ
ーナル抗体及び上記第二モノクローナル抗体に結合性を
有する第二抗体を吸着又は結合させる方法としては、上
述の方法を用いることができる。

【００４３】本発明のイムノアッセイ法は、被検試料中
の抗原に対する第一モノクローナル抗体を不溶性担体に
吸着又は結合させたものと、上記抗原に対する第二モノ
クローナル抗体とを、第二抗体により結合させるか、又
は、第二モノクローナル抗体を第二抗体に結合させたも
のを不溶性担体に吸着又は結合させたものと反応させる
ことにより、１種類又は２種類の不溶性担体を選択的に
凝集させることができる。

【００４４】本発明のイムノアッセイ法は、不溶性担体
にモノクローナル抗体を直接結合させた場合に、抗体の
認識部位が近接しすぎている等の立体障害により、凝集
が不可能となるモノクローナル抗体の組み合わせにおい
ても、第二抗体を結合させて立体障害を解消することが
できるので、抗原との親和性の高いモノクローナル抗体
を使用することができる。

【００４５】

【実施例】以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。

【００４６】実施例１（１）材料及び試薬ラテックス：平均粒径０．３０４μｍのポリスチレンラ
テックス（固形分１０重量／体積％、積水化学工業社
製）を用いた。ラテックス希釈用緩衝液：５０ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄と５
０ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄とをｐＨ７．５０になるように混
合し、ラテックス希釈用緩衝液として用いた。抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体：精製ヒトα−フェト
プロテインを免疫源として調製し、マウスから得られた
２種類の異なるモノクローナル抗体（クローン名ＡＦＰ
４−Ｆ６７を第一モノクローナル抗体とした。（実施例
１及び２並びに比較例１において、これを「第１モノク
ロ」とした。）クローン名ＡＦＰ４−Ｆ１１を第二モノ
クローナル抗体とした。（実施例１及び２並びに比較例
１において、これを「第二モノクロ」とした。）濃度は
いずれも５ｍｇ／ｍｌ、クラスはＩｇＧ−１）を用い
た。

【００４７】抗体希釈用緩衝液：ラテックス希釈用緩衝
液を、抗体希釈用緩衝液として用いた。ブロッキング用緩衝液：１００ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄と１
００ｍＭＮａＨ₂ＰＯ ₄とをｐＨ７．４０になるように
混合し、ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ
ａｌｂｕｍｉｎ、ＦｒａｃｔｉｏｎＶ、Ｒｅａｇｅｎ
ｔＧｒａｄｅ、ＭｉｌｅｓＣｏｒｐ社製）を１重量
／体積％になるように、また、ＮａＮ ₃（試薬特級、ナ
カライテスク社製）を０．１重量／体積％になるように
添加したものを、ブロッキング用緩衝液として用いた。

【００４８】第二抗体：抗マウスＩｇＧ−１抗体（ウサ
ギ由来、アフィニティ精製分画、ＤＡＫＯ社製）をブロ
ッキング用緩衝液で希釈して用いた。ＡＦＰ標準品：ヒトプール血清から精製されたＡＦＰ標
準品（ＷＨＯ標準品、９０８９０Ｉ．Ｕ．／ｍｌ、１１
０．０μｇ／ｍｌ、ＤＡＫＯ社製）を用い、生理食塩水
にて２０００、５００、１００、２０、５ｎｇ／ｍｌに
それぞれ希釈して使用した。また、ＡＦＰ標準品を含ま
ない、生理食塩水のみのものを０ｎｇ／ｍｌとした。

【００４９】（２）方法（２）−１．ラテックス試薬の調製（第一モノクローナ
ル抗体のラテックスへの固定化）平均粒径０．３０４μｍのポリスチレンラテックス（固
形分１０重量／体積％）１容に、ラテックス希釈用緩衝
液で３容を添加希釈し、２．５％ラテックス液とした。
抗ＡＦＰ抗体（第１モノクロ）は、タンパク濃度が６
６．７μｇ／ｍｌになるように抗体希釈用緩衝液で希釈
し、感作抗体液とした。２．５重量／体積％ラテックス
液２００μｌを２５℃のインキュベーター中でマグネチ
ックスターラーで攪拌しながら、抗体感作液８００μｌ
を素早く添加し、２５℃にて１時間攪拌した。その後、
ブロッキング用緩衝液を２．０ｍｌ添加し、２５℃にて
続けて２時間攪拌した。その後、１５℃、１５０００ｒ
ｐｍにて１５分問遠心分離した。得られた沈殿にブロッ
キング用緩衝液４．０ｍｌを添加し、同様に遠心分維す
ることにより、沈殿を洗浄した。洗浄操作は３回行っ
た。この沈殿にブロッキング用緩衝液を１４．０ｍｌ添
加し、よく攪拌した後、超音波破砕機にて分散処理を行
い、固形分０．０３５重量／体積％のラテックス試薬を
得た。このラテックス試薬は４℃にて保存した。

【００５０】（２）−２．第二モノクローナル抗体と第
二抗体の調製第二モノクロをブロッキング用緩衝液で１倍から２５６
倍まで希釈し、これに第二抗体をブロッキング用緩衝液
で１０倍希釈したものを同容量加え、攪拌して室温に放
置した。４時間後、第二モノクロを３２倍希釈としたと
ころで最も多量の免疫沈降物が得られたので、この希釈
倍率で反応させた。市販のキットにより蛋白定量を行っ
た。最終濃度が２５μｇ／ｍｌになるようにブロッキン
グ用緩衝液で希釈・調製して第二モノクロ−第二抗体複
合体を得た。

【００５１】（２）−３．ラテックス凝集反応ラテックス試薬によるＡＦＰ量の測定は、生化学用自動
分析装置７１５０形（日立製作所社製）を用いて行っ
た。上記（２）−１．で得られたラテックス試薬をその
ままＲ２液とした。検体容量：２０μｌ、第二モノクロ
−第二抗体複合体：２００μｌ、試薬（Ｒ２液）：２１
０μｌ、測定波長：５７０ｎｍ、測定温度：３７℃の条
件で測定を行った。試薬（Ｒ２液）を添加してから約８
０秒後の吸光度と約３２０秒後の吸光度の差（ΔＯＤ５
７０）を測定し、この吸光度の差を１００００倍したも
のを吸光度変化量とした。

【００５２】実施例２（１）材料及び試薬実施例１と同様のものを用いた。（２）方法（２）−１．ラテックス試薬の調製（第一モノクローナ
ル抗体のラテックスへの固定化）実施例１と同様に行い、ラテックス試薬を得た。（２）−２．第二モノクローナル抗体と第二抗体の調製実施例１と同様に行い、第二モノクローナル抗体−第二
抗体複合体を得た。（２）−３．第二モノクローナル抗体−第二抗体複合体
のラテックス粒子への固定化（２）−２．の方法で得られた第二モノクローナル抗体
−第二抗体複合体をブロッキング用緩衝液で１００μｇ
／ｍｌに希釈したものを感作液として、（２）−１．の
方法と同様にして複合体固定化ラテックス試薬を調製し
た。得られたラテックスをブロッキング用緩衝液で固形
分が０．０３５重量／体積％になるように調製し、複合
体固定化ラテックス試薬を得た。

【００５３】（２）−４．ラテックス凝集反応ラテックス試薬によるＡＦＰ量の測定は、生化学用自動
分析装置７１５０形（日立製作所杜製）を用いて行っ
た。上記（２）−３．で得られた固形分０．０３５重量
／体積％の複合体固定化ラテックス試薬をそのままＲ２
液とした。検体容量：２０μｌ、ラテックス試薬：２０
０μｌ、複合体固定化ラテックス試薬（Ｒ２液）：２１
０μｌ、測定波長：５７０ｎｍ、測定温度：３７℃の条
件で測定を行った。試薬（Ｒ２液）を添加してから約８
０秒後の吸光度と約３２０秒後の吸光度の差（ΔＯＤ５
７０）を測定し、この吸光度の差を１００００倍したも
のを吸光度変化量とした。

【００５４】比較例１（１）材料及び試薬実施例１と同様のものを用いた。（２）方法（２）−１．ラテックス試薬の調製（第一モノクローナ
ル抗体のラテックスへの固定化）実施例１と同様に行い、第１モノクロ固定化ラテックス
試薬を得た。（２）−２．ラテックス試薬の調製（第二モノクローナ
ル抗体のラテックスへの固定化）抗体として第二モノクロを用いた以外は、実施例１の
（２）−１．と同様に行い、第二モノクロ固定化ラテッ
クス試薬を得た。

【００５５】（２）−３．ラテックス凝集反応第１モノクロ固定化ラテックス試薬及び第二モノクロ固
定化ラテックス試薬を等量混合し、ラテックス試薬（Ｒ
２）を得た。ラテックス試薬によるＡＦＰ量の測定は、
生化学用自動分析装置７１５０形（日立製作所杜製）を
用いて行った。検体容量：２０μｌ、ブロッキング用緩
衝液：２００μｌ、ラテックス試薬（Ｒ２液）：２１０
μｌ、測定波長：５７０ｎｍ、測定温度：３７℃の条件
で測定を行った。試薬（Ｒ２液）を添加してから約８０
秒後の吸光度と約３２０秒後の吸光度の差（ΔＯＤ５７
０）を測定し、この吸光度の差を１００００倍したもの
を吸光度変化量とした。

【００５６】実施例３（１）材料及び試薬抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体：精製ヒトＩｇＥを免
疫源として調製し、マウスから得られた２種類の異なる
モノクローナル抗体（クローン名Ｍ−１２．７Ｂを第一
モノクローナル抗体とした。（実施例３及び４並びに比
較例２において、これを「第１モノクロ」とした。）ク
ローン名Ｍ−７Ｈ８を第二モノクローナル抗体とした。
（実施例３及び４並びに比較例２において、これを「第
二モノクロ」とした。）濃度はいずれも５ｍｇ／ｍｌ、
クラスはＩｇＧ−１）を用いた。ＩｇＥ陽性ヒト血清：
ヒトプール血清から調製されたＩｇＥ陽性ヒト血清（Ｗ
ＨＯ準拠、２０００Ｉ．Ｕ．／ｍｌ、協和メデックス社
製）を用い、生理食塩水にて２０００、１０００、１０
０、１０、５Ｉ．Ｕ．／ｍｌにそれぞれ希釈して使用し
た。また、ＩｇＥ陽性ヒト血清を含まない、生理食塩水
のみのものを０Ｉ．Ｕ．／ｍｌとした。抗ヒトＡＦＰモ
ノクローナル抗体の代わりに抗ヒトＩｇＥモノクローナ
ル抗体を用い、ＡＦＰ標準品の代わりにＩｇＥ陽性ヒト
血清を用いたこと以外は、実施例１と同様のものを用い
た。

【００５７】（２）方法（２）−１．ラテックス試薬の調製（第一モノクローナ
ル抗体のラテックスへの固定化）第１モノクロとしてＭ−１２．７Ｂを用いたこと以外は
実施例１と同様に行い、ラテックス試薬を得た。（２）−２．第二モノクローナル抗体と第二抗体の調製第二モノクロとしてＭ−７Ｈ８を用いたこと以外は実施
例１と同様に行い、第二モノクロ−第二抗体複合体を得
た。

【００５８】（２）−３．ラテックス凝集反応ラテックス試薬によるＩｇＥ量の測定は、生化学用自動
分析装置７１５０形（日立製作所社製）を用いて行っ
た。上記（２）−１．で得られたラテックス試薬をその
ままＲ２液とした。検体容量：２０μｌ、第二モノクロ
−第二抗体複合体：２００μｌ、試薬（Ｒ２液）：２１
０μｌ、測定波長：５７０ｎｍ、測定温度：３７℃の条
件で測定を行った。試薬（Ｒ２液）を添加してから約８
０秒後の吸光度と約３２０秒後の吸光度の差（ΔＯＤ５
７０）を測定し、この吸光度の差を１００００倍したも
のを吸光度変化量とした。

【００５９】実施例４（１）材料及び試薬実施例３と同様のものを用いた。（２）方法（２）−１．ラテックス試薬の調製（第一モノクローナ
ル抗体のラテックスへの固定化）実施例３と同様に行い、ラテックス試薬を得た。

【００６０】（２）−２．第二モノクローナル抗体と第
二抗体の調製実施例３と同様に行い、第二モノクロ−第二抗体複合体
を得た。（２）−３．第二モノクローナル抗体−第二抗体複合体
のラテックス粒子への固定化（２）−２．の方法で得られた第二モノクロ−第二抗体
複合体をブロッキング用緩衝液で１００μｇ／ｍｌに希
釈したものを感作液として、（２）−１．の方法と同様
にして複合体固定化ラテックス試薬を調製した。得られ
たラテックスをブロッキング用緩衝液で固形分が０．０
３５重量／体積％になるように調製し、複合体固定化ラ
テックス試薬を得た。

【００６１】（２）−４．ラテックス凝集反応ラテックス試薬によるＩｇＥ量の測定は、生化学用自動
分析装置７１５０形（日立製作所社製）を用いて行っ
た。上記（２）−３．で得られた固形分０．０３５重量
／体積％の複合体固定化ラテックス試薬をそのままＲ２
液とした。検体容量：２０μｌ、ラテックス試薬：２０
０μｌ、複合体固定化ラテックス試薬（Ｒ２液）：２１
０μｌ、測定波長：５７０ｎｍ、測定温度：３７℃の条
件で測定を行った。試薬（Ｒ２液）を添加してから約８
０秒後の吸光度と約３２０秒後の吸光度の差（ΔＯＤ５
７０）を測定し、この吸光度の差を１００００倍したも
のを吸光度変化量とした。

【００６２】比較例２（１）材料及び試薬実施例３と同様のものを用いた。（２）方法（２）−１．ラテックス試薬の調製（第一モノクローナ
ル抗体のラテックスへの固定化）実施例３と同様に行い、第１モノクロ固定化ラテックス
試薬を得た。（２）−２．ラテックス試薬の調製（第二モノクローナ
ル抗体のラテックスへの固定化）抗体として第二モノクロ（Ｍ−７Ｈ８）を用いたこと以
外は、比較例１と同様に行い、第二モノクロ固定化ラテ
ツクス試薬を得た。

【００６３】（２）−３．ラテックス凝集反応第１モノクロ固定化ラテックス試薬及び第二モノクロ固
定化ラテックス試薬を等量混合し、ラテックス試薬（Ｒ
２）を得た。ラテックス試薬によるＩｇＥ量の測定は、
生化学用自動分析装置７１５０形（日立製作所社製）を
用いて行った。検体容量：２０μｌ、ブロッキング用緩
衝液：２００μｌ、ラテックス試薬（Ｒ２液）：２１０
μｌ、測定波長：５７０ｎｍ、測定温度：３７℃の条件
で測定を行った。試薬（Ｒ２液）を添加してから約８０
秒後の吸光度と約３２０秒後の吸光度の差（ΔＯＤ５７
０）を測定し、この吸光度の差を１００００倍したもの
を吸光度変化量とした。実施例１〜３及び比較例１〜２
における配合を、表１にまとめて示した。

【００６４】

【表１】

【００６５】結果実施例１及び２並びに比較例１の結果を表２及び図１に
示した。これらはＡＦＰ標準品の希釈系列を本発明のイ
ムノアッセイ法で定量した結果である。図１中、縦軸
は、反応液の濁度の増加量を表し、横軸は、被検試料中
のＡＦＰ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を表す。表２及び図１から
明らかなように、比較例１のように２種のモノクローナ
ル抗体をいずれもラテックス粒子に固定化させて用いた
系では、充分な検出感度が得られなかったが、実施例１
及び２では、ＡＦＰが５ｎｇ／ｍｌ程度まで検出が可能
であった。

【００６６】

【表２】

【００６７】実施例３及び４並びに比較例２の結果を表
３及び図２に示した。これらは総ＩｇＥ陽性血清標準品
の希釈系列を本発明のイムノアッセイ法で定量した結果
である。図２中、縦軸は、反応液の濁度の増加量を表
し、横軸は、被検試料中の総ＩｇＥ濃度（Ｉ．Ｕ．／ｍ
ｌ）を表す。表３及び図２から明らかなように、比較例
２のように２種のモノクローナル抗体をいずれもラテッ
クス粒子に固定化させて用いた系では、充分な検出感度
が得られなかったが、実施例３及び４では、ＩｇＥが５
Ｉ．Ｕ．／ｍｌ程度まで検出が可能であった。

【００６８】

【表３】

【００６９】

【発明の効果】本発明のイムノアッセイ法は、上述のと
おりであるので、被検試料中の抗原を、選択的に、か
つ、高感度に検出することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１及び２並びに比較例１におけるＡＦＰ
標準品の希釈系列を定量した測定結果を示した図であ
る。図１中、縦軸は、反応液の濁度の増加量を表し、横
軸は、被検試料中のＡＦＰ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を表す。
白ぬりの○は、実施例１を表し、黒ぬりの○は、実施例
２を表し、白ぬりの□は、比較例１を表す。

【図２】実施例３及び４並びに比較例２における総Ｉｇ
Ｅ陽性血清標準品の希釈系列を定量した測定結果を示し
た図である。図２中、縦軸は、反応液の濁度の増加量を
表し、横軸は、被検試料中の総ＩｇＥ濃度（Ｉ．Ｕ．／
ｍｌ）を表す。白ぬりの○は、実施例３を表し、黒ぬり
の○は、実施例４を表し、黒ぬりの□は、比較例２を表
す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】被検試料中の抗原に、前記抗原に特異的
に反応するモノクローナル抗体を反応させることによ
り、前記抗原を定性又は定量するイムノアッセイ法であ
って、前記モノクローナル抗体は、第一モノクローナル
抗体及び第二モノクローナル抗体の２種類からなり、前
記抗原に、前記第一モノクローナル抗体を吸着又は結合
させた不溶性担体を反応させた後に、前記第二モノクロ
ーナル抗体及び前記第二モノクローナル抗体に結合性を
有する第二抗体を更に反応させることにより前記不溶性
担体を凝集させることを特徴とするイムノアッセイ法。
【請求項２】被検試料中の抗原に、前記抗原に特異的
に反応するモノクローナル抗体を反応させることによ
り、前記抗原を定性又は定量するイムノアッセイ法であ
って、前記モノクローナル抗体は、第一モノクローナル
抗体及び第二モノクローナル抗体の２種類からなり、前
記抗原に、前記第一モノクローナル抗体を吸着又は結合
させた不溶性担体を反応させた後に、前記第二モノクロ
ーナル抗体及び前記第二モノクローナル抗体に結合性を
有する第二抗体を吸着又は結合させた不溶性担体を更に
反応させることにより前記不溶性担体を凝集させること
を特徴とするイムノアッセイ法。
【請求項３】不溶性担体が、水性液体媒体に実質的に
不溶性である有機高分子物質の微粒子又は無機物質の微
粒子である請求項１又は２記載のイムノアッセイ法。
【請求項４】不溶性担体が、ラテックス粒子である請
求項１、２又は３記載のイムノアッセイ法。