JP3569074B2 - イムノアッセイ法 - Google Patents
イムノアッセイ法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3569074B2 JP3569074B2 JP13233896A JP13233896A JP3569074B2 JP 3569074 B2 JP3569074 B2 JP 3569074B2 JP 13233896 A JP13233896 A JP 13233896A JP 13233896 A JP13233896 A JP 13233896A JP 3569074 B2 JP3569074 B2 JP 3569074B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- monoclonal antibody
- antigen
- antibody
- latex
- insoluble carrier
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体被検試料中の抗原を、選択的に、かつ、高感度に検出できるイムノアッセイ法に関する。
【0002】
【従来の技術】
近年、病院、検査センター等においては、人手不足、コスト削減、多量検体処理の要請等の点から、臨床検査等の諸検査の自動化や測定時間の短縮化が図られている。
検査の自動化に適した方法として、不溶性担体粒子の凝集反応を利用して、抗原を定性又は定量する凝集法が注目されている。
【0003】
免疫化学分野においては、凝集法として、不溶性担体としてラテックスを利用するラテックス凝集イムノアッセイ法が主に用いられてきた。
特公昭58−11575号公報に開示されているように、ラテックス凝集イムノアッセイ法は、抗原又はこの抗原に特異的に結合する抗体をラテックスに担持させ、被検試料中の抗原と、抗体又はそのフラグメントとを反応、凝集させ、その凝集の程度を光学的に測定することにより、上記抗原を検出又は定量する方法である。
【0004】
凝集イムノアッセイ法において、多くの場合、抗体としてポリクローナル抗体が用いられてきた。
しかし、ポリクローナル抗体は、同じ品質のものを得ることが難しく、特異抗体に精製する段階でのポリクローナル抗体の損失が大きい等の欠点がある。
【0005】
一方、モノクローナル抗体を用いた場合、品質が一定した抗体を大量生産することが可能である。
しかしながら、モノクローナル抗体は、抗原分子上の特定のエピトープとのみ反応するので、抗原が多価抗原である場合でも、特定のエピトープに関しては多価であるとは限らない。従って、抗体としてモノクローナル抗体を用いた場合には、特定のモノクローナル抗体に対応するエピトープに関しては、一価抗原となる可能性が高くなる。
【0006】
測定の目的とする抗原が一価抗原である場合、ラテックスに担持された抗体と被検試料中の抗原とが反応又は結合しても、通常、凝集は起こらない。この場合、抗体を担持させたラテックスと、このラテックスを凝集させることができる凝集素としてのポリハプテンと、被検試料とを混合し、反応させて、被検試料中の抗原がラテックス凝集をどの程度阻害したかを測定することにより、抗原を検出又は定量する方法(凝集阻害法)が知られている。
【0007】
従って、多価抗原である蛋白抗原の場合、モノクローナル抗体を用いた凝集法においては、上述した理由で抗原エピトープに関して一価となる可能性があるので、このような蛋白抗原の測定においては、その抗原エピトープの部分を含むポリハプテンを用いた凝集阻害法に頼らざるを得ない。
従って、一価抗原をモノクローナル抗体を用いて測定する場合、凝集素としてのポリハプテンが新たに必要となるが、そのポリハプテンが被検試料中のネイティブな抗原と同一の反応性を示す保証はない。
【0008】
モノクローナル抗体を用いる場合、当然ながら、凝集素としてのポリハプテンと反応するモノクローナル抗体を用いることになるが、そのモノクローナル抗体がネイティブな抗原とは反応しない場合もある。これは、蛋白抗原の場合、抗体との反応性においては蛋白抗原の高次構造が重要な役割を果たしているのに対し、凝集素であるポリハプテンはペプチドのポリマー又はオリゴマーであり、上記蛋白抗原そのものとは立体構造が異なることによると考えられる。このような場合、ネイティブな抗原の反応性をポリハプテンの反応性に近づけるための何らかの処理が必要となる。
【0009】
特開平6−167495号公報には、被検試料中の抗原を不溶性担体粒子に吸着させ、上記抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体を反応させた後、上記モノクローナル抗体に選択的に結合する第二抗体を更に反応させて上記不溶性担体粒子を選択的に凝集させる凝集イムノアッセイ法が開示されている。この方法は、煩雑な前処理を行わずにモノクローナル抗体を用いることができるが、被検試料中の抗原を不溶性担体粒子に吸着させて固相化する必要があるので、抗原がng/ml以下の微量である場合には適用することができない等の欠点がある。
【0010】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記に鑑み、被検試料中の抗原を、選択的に、かつ、高感度に検出できるイムノアッセイ法を提供することを目的とする。
【0011】
【課題を解決するための手段】
本発明は、被検試料中の抗原に、上記抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体を反応させることにより、上記抗原を定性又は定量するイムノアッセイ法であって、上記モノクローナル抗体は、第一モノクローナル抗体及び第二モノクローナル抗体の2種類からなり、上記抗原に、上記第一モノクローナル抗体を吸着又は結合させた不溶性担体を反応させた後に、上記第二モノクローナル抗体及び上記第二モノクローナル抗体に結合性を有する第二抗体を更に反応させることにより上記不溶性担体を凝集させることを特徴とするイムノアッセイ法である。
以下に本発明を詳述する。
【0012】
本発明のイムノアッセイ法においては、被検試料中の抗原に、上記抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体を反応させて凝集させることにより、上記抗原を定性又は定量する。
【0013】
本発明のイムノアッセイ法で用いられるモノクローナル抗体は、細胞融合技術分野における公知の方法を適宜選択し又は組み合わせて、モノクローナル抗体産生融合細胞株を形成し、上記モノクローナル抗体産生融合細胞株より産生して得ることができる。上記モノクローナル抗体産生融合細胞株としては、例えば、完全抗原を用いて、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等の動物に、例えば、アジュバント等とともに皮下注射する等の方法を用いて投与して、上記動物を免疫した後、この免疫動物、例えば、免疫マウスの上記抗原に対する抗体産生細胞、例えば、脾細胞、胸腺細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等の抗体産生細胞を採取し、上記抗体産生細胞と、自己増殖性を有するが抗体産生能を実質的に有しない適当な株化細胞、例えば、マウス骨髄腫株化細胞(ミエローマ細胞)等とを、公知の方法により細胞融合処理する方法等により得ることができる。
【0014】
上記モノクローナル抗体を得るための上記株化細胞と上記モノクローナル抗体産生細胞との組み合わせは、各細胞が融合して増殖しつつ抗体を産生することが可能であれば、それぞれの細胞が由来する動物の種類としては限定されず、任意の組み合わせでよい。
【0015】
上記株化細胞としては特に限定されず、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒト等の動物の細胞体等が挙げられる。
上記株化細胞としては、薬剤抵抗性のものであり、かつ、未融合の株化細胞が選択培地で生存せず、一方融合細胞のみが生存するようなものが好ましい。上記株化細胞としては、例えば、8−アザグアニジン抵抗性の株化細胞等が挙げられる。上記8−アザグアニジン抵抗性の株化細胞は、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼを欠損し、ヒポキサンチン・アミンプテリン・チミジン(HAT)培地に生育できない性質を有している。上記株化細胞としては、特に、非分泌型のものであることが好ましく、例えば、マウスミエローマMOPC−21株由来のP3/X63−Ag8U1(P3U1)、P3/X63−Ag8・6・5・3、P3/NSI−1−Ag4−1、Sp2/O−Ag14、ラットミエローマ210・RCY3・Ag1・2・3等が挙げられる。
【0016】
上記細胞融合処理の方法としては、例えば、イーグル最小基本(MEM)培地、RPMI−1640培地等の培地中で上記免疫マウスの脾細胞1×108 〜5×108 個と、上記マウス骨髄腫株化細胞1×107 〜5×107 個とを混合する方法等が挙げられる。
【0017】
上記細胞融合処理には、融合促進剤を用いてもよい。上記融合促進剤としては、例えば、平均分子量1000〜6000のポリエチレングリコール(以下「PEG」という)、ポリビニルアルコール、ウイルス等が挙げられるが、なかでも、PEGが好ましい。上記PEGは、約30〜50%の濃度で用いることができる。
【0018】
本発明のイムノアッセイ法においては、上述のようにして得られた融合細胞含有系から、公知の方法により、選別処理、抗体活性スクリーニング処理及びクローニング処理を行い、免疫マウスと形成に用いた完全抗原とに対するモノクローナル抗体産生能を有し、かつ、自己増殖能を有するモノクローナル抗体産生融合細胞株を得ることができる。
【0019】
上記モノクローナル抗体産生融合細胞株の選別処理としては、例えば、20%ウシ胎児血清含有RPMI−1640培地等で細胞融合を終えた細胞を適当に希釈し、96穴マイクロプレートに105〜106個/ウェル程度に分注し、各ウェルに選択培地(例えば、HAT培地等)を加え、以後選択培地交換を行いながら、5%CO2 培養器(37℃)で培養を続けること等により行うことができる。上記株化細胞として8−アザグアニン抵抗性の株化細胞を用いた場合、未融合の株化細胞はHAT培地で死滅し、また、モノクローナル抗体産生細胞は正常細胞なのでin vitro培養では長期間生育できないので、培養後10〜14日ぐらいから生育してくる細胞はすべてモノクローナル抗体産生融合細胞株である。
【0020】
上記モノクローナル抗体産生融合細胞株の抗体活性スクリーニング処理及びクローニング処理は、常法により行うことができ、例えば、以下のようにして行うことができる。
上記モノクローナル抗体産生融合細胞株が生育したウェルの培養上清の一部を採取し、一定量の標識抗原とインキュベーションし、標識抗原との結合能を測定することにより目的とする抗体を分泌しているウェルを検索することができる。すなわち、125I、131I等のラジオアイソトープ又は酵素等で標識した抗原と培養上清を反応させた後、各反応液について抗原−抗体結合物を分離し、標識量を測定することにより、目的とする抗体の存在及び結合能を検索することができる。
目的とする抗体活性が認められる各ウェル中には2種以上の融合細胞が生育している可能性があるので、限界希釈法や軟寒天によるコロニー形成法によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産生融合細胞株を得ることができる。
【0021】
上記モノクローナル抗体産生細胞株を用いて、上記免疫動物の形成に用いた完全抗原に対するモノクローナル抗体を得る方法としては、例えば、上記モノクローナル抗体産生細胞株を適当な培地に培養し、培地からモノクローナル抗体を採取する方法、上記株化細胞由来動物と同系の動物に上記モノクローナル抗体産生細胞株を移植し腹水中のモノクローナル抗体を採取する方法等の公知の方法を用いることができる。
【0022】
前者の方法としては、例えば、モノクローナル抗体産生融合細胞株を10%ウシ胎児血清含有RPMI−1640培地等の培養液で培養し、その培養上清液を硫安分画、抗原を結合させたセファロース4B等のアフィニティークロマトグラフィー等によって精製する方法等が挙げられる。
【0023】
後者の方法としては、例えば、上記同系の動物にプリスタン(2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン)等の鉱物油を腹腔内投与した後、モノクローナル抗体産生融合細胞株を腹腔内投与することによりin vivoで融合細胞を大量に増殖させ、その結果、形成される腹水には高濃度のモノクローナル抗体が含まれるので、この腹水から硫安分画及び必要に応じて上述のアフィニティークロマトグラフィー等によって精製する方法等が挙げられる。
上記モノクローナル抗体は、市販品として入手することもできる。
【0024】
本発明のイムノアッセイ法において、上記モノクローナル抗体は、第一モノクローナル抗体及び第二モノクローナル抗体の2種類からなる。
上記第一モノクローナル抗体及び上記第二モノクローナル抗体は、同一の抗原に反応するものであり、かつ、お互いに異なるモノクローナル抗体である。
【0025】
本発明のイムノアッセイ法においては、抗原に、上記第一モノクローナル抗体を吸着又は結合させた不溶性担体を反応させた後に、上記第二モノクローナル抗体及び上記第二モノクローナル抗体に結合性を有する第二抗体を更に反応させることにより上記不溶性担体を凝集させる。
【0026】
上記不溶性担体としては、従来より免疫化学的凝集法又は凝集阻害法において一般的に用いられている微粒子の担体を用いることができる。
上記不溶性担体としては特に限定されないが、工業的に大量生産が可能な有機系微粒子が好ましく、例えば、スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーの単一重合体又は共重合体;スチレン−ブタジエン共重合体、メチルメタクリレート−ブタジエン共重合体等のブタジエン系共重合体等の微粒子等が挙げられる。
【0027】
上記有機系微粒子は、官能基を有する反応性有機系微粒子等であってもよい。上記官能基としては、例えば、カルボキシル基、第1級アミノ基、カルボアミノ基(−CONH2 )、水酸基、アルデヒド基等が挙げられる。
【0028】
上記不溶性担体としては、その他、動物の赤血球、細菌の細胞等の生物学的粒子;ベントナイト、コロジオン、コレステロール結晶、シリカ、カオリン、炭素末等非生物学的粒子等が挙げられる。
【0029】
本発明のイムノアッセイ法においては、上記不溶性担体が、水性液体媒体に実質的に不溶性である有機高分子物質の微粒子又は無機物質の微粒子であることが好ましい。
本発明のイムノアッセイ法においては、不溶性担体が、ラテックス粒子であることが好ましい。
【0030】
上記不溶性担体の表面に上記第一モノクローナル抗体を吸着又は結合させる方法としては、公知の方法を適宜用いることができ、例えば、不溶性担体表面にモノクローナル抗体を物理的に吸着させる方法、官能基を有する不溶性担体表面に、既知の方法である化学結合法又は共有結合法によりに感作する方法等が挙げられる。
【0031】
上記第二モノクローナル抗体に結合性を有する第二抗体としては、上記第二モノクローナル抗体に選択的に結合する能力を有するものであれば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでもよく、また、由来の動物種も問わない。上記第二モノクローナル抗体に結合性を有する第二抗体としては、例えば、第二モノクローナル抗体がマウス由来の場合には、他の動物由来の抗マウスイムノグロブリンG(IgG)血清等の抗イムノグロブリン血清等を用いることができる。また、その精製度も抗血清、イムノグロブリン分画、アフィニティ精製分画、F(ab′)2分画等いずれでもよい。
【0032】
本発明のイムノアッセイ法において、上記第二モノクローナル抗体と、上記第二モノクローナル抗体に結合性を有する第二抗体とは、あらかじめ結合させておくことが好ましく、例えば、両者を恒温(好ましくは25〜37℃)でインキュベートする等の方法で両者の複合体を得ることができる。上記複合体をそのまま用いてもよいし、第二抗体に第二モノクローナル抗体が2個導入された複合体のみ、ゲル濾過等の方法で分離精製して得られた画分を用いてもよい。上記第二モノクローナル抗体に結合性を有する第二抗体は、フリーの状態では、非特異凝集の原因となる可能性があるので、あらかじめ複合体の混合物から除いておくことが好ましい。
【0033】
本発明のイムノアッセイ法により検出される抗原としては、被検試料中に含まれる生理活性物質であり、かつ、上記抗原に対応するモノクローナル抗体の作成又は入手が可能であれば特に限定されないが、臨床検査上重要な項目であり、従来の凝集法では検出感度が不足であるとされていた項目について特に有用であり、例えば、癌検診のスクリーニングにおいて測定されるCEA、CA19−9等のng/mlまで検出感度が要求される項目等が好ましい。
【0034】
本発明のイムノアッセイ法において、上記不溶性担体に吸着又は結合させた第一モノクローナル抗体と、上記第二モノクローナル抗体及び上記第二モノクローナル抗体に結合性を有する第二抗体と、上記抗原との反応は、抗原抗体反応及びそれに伴う凝集反応である。
上記反応条件としては、上記凝集反応が起こりうる条件であれば特に限定されないが、上記反応は恒温で行うのが好ましく、より好ましくは25〜37℃である。
上記反応時間は、5秒〜15分が好ましい。
【0035】
上記反応液としては、抗原抗体反応が起こりうる生理的条件を満たす水溶液であれば特に限定されないが、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グッド緩衝液等が好ましい。上記反応液のpHは、5.5〜8.5が好ましい。より好ましくは6.5〜8.0である。
上記反応液には、種々の添加剤を適宜溶解させてもよい。上記添加剤としては、例えば、牛血清アルブミン、ショ糖等の安定剤;感度を高める効果が期待されるポリエチレングリコール、デキストラン等の水溶性多糖類;アジ化ナトリウム等の防腐剤;塩濃度調整のための塩化ナトリウム等が挙げられる。
【0036】
上記不溶性担体の凝集の程度を測定する方法としては特に限定されず、凝集を定性的又は半定量的に測定する場合には、例えば、既知の試料の濁度の程度と比較して、上記不溶性担体粒子の凝集の程度を目視によって判定すること等が可能である。上記凝集を定量的に測定する場合には、簡便性及び精度の点から、例えば、光学的に測定すること等が好ましい。
【0037】
上記凝集の光学的測定法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、いわゆる比濁法(凝集塊の形成を濁度の増加としてとらえる方法)、粒度分布による測定法(凝集塊の形成を粒度分布又は平均粒径の変化としてとらえる方法)、積分球濁度法(凝集塊の形成による前方散乱光の変化を積分球を用いて測定し、透過光強度との比を比較する方法)等が挙げられる。
【0038】
これらのそれぞれの測定法においては、速度試験(レートアッセイ;異なる時点で少なくとも2つの測定値を得て、これらの時点間における測定値の増加分(すなわち増加速度)に基づき凝集の程度を求める)、又は、終点試験(エンドポイントアッセイ;ある時点(通常は、反応の終点と考えられる時点)で1つの測定値を得て、この測定値に基づき凝集の程度を求める)を用いることができる。上記凝集の光学的測定法としては、なかでも、測定の簡便さ、迅速性の点から、比濁法を用いた速度試験が好ましい。
【0039】
本発明2は、被検試料中の抗原に、上記抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体を反応させることにより、上記抗原を定性又は定量するイムノアッセイ法であって、上記モノクローナル抗体は、第一モノクローナル抗体及び第二モノクローナル抗体の2種類からなり、上記抗原に、上記第一モノクローナル抗体を吸着又は結合させた不溶性担体を反応させた後に、上記第二モノクローナル抗体及び上記第二モノクローナル抗体に結合性を有する第二抗体を吸着又は結合させた不溶性担体を更に反応させることにより上記不溶性担体を凝集させることを特徴とするイムノアッセイ法である。
【0040】
本発明2のイムノアッセイ法において、上記第二モノクローナル抗体及び上記第二モノクローナル抗体に結合性を有する第二抗体を吸着又は結合させる不溶性担体としては、第一モノクローナル抗体を吸着又は結合させる不溶性担体と同様のものを用いることができる。
【0041】
本発明2のイムノアッセイ法において、上記第二モノクローナル抗体と、上記第二モノクローナル抗体に結合性を有する第二抗体とは、あらかじめ結合させておくことが好ましい。
【0042】
上記不溶性担体の表面に上記第二モノクローナル抗体及び上記第二モノクローナル抗体に結合性を有する第二抗体を吸着又は結合させる方法としては、上述の方法を用いることができる。
【0043】
本発明のイムノアッセイ法は、被検試料中の抗原に対する第一モノクローナル抗体を不溶性担体に吸着又は結合させたものと、上記抗原に対する第二モノクローナル抗体とを、第二抗体により結合させるか、又は、第二モノクローナル抗体を第二抗体に結合させたものを不溶性担体に吸着又は結合させたものと反応させることにより、1種類又は2種類の不溶性担体を選択的に凝集させることができる。
【0044】
本発明のイムノアッセイ法は、不溶性担体にモノクローナル抗体を直接結合させた場合に、抗体の認識部位が近接しすぎている等の立体障害により、凝集が不可能となるモノクローナル抗体の組み合わせにおいても、第二抗体を結合させて立体障害を解消することができるので、抗原との親和性の高いモノクローナル抗体を使用することができる。
【0045】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【0046】
実施例1
(1)材料及び試薬
ラテックス:平均粒径0.304μmのポリスチレンラテックス(固形分10重量/体積%、積水化学工業社製)を用いた。
ラテックス希釈用緩衝液:50mMNa2 HPO4 と50mMNaH2 PO4 とをpH7.50になるように混合し、ラテックス希釈用緩衝液として用いた。抗ヒトAFPモノクローナル抗体:精製ヒトα−フェトプロテインを免疫源として調製し、マウスから得られた2種類の異なるモノクローナル抗体(クローン名AFP4−F67を第一モノクローナル抗体とした。(実施例1及び2並びに比較例1において、これを「第1モノクロ」とした。)クローン名AFP4−F11を第二モノクローナル抗体とした。(実施例1及び2並びに比較例1において、これを「第二モノクロ」とした。)濃度はいずれも5mg/ml、クラスはIgG−1)を用いた。
【0047】
抗体希釈用緩衝液:ラテックス希釈用緩衝液を、抗体希釈用緩衝液として用いた。
ブロッキング用緩衝液:100mMNa2 HPO4 と100mMNaH2 PO4 とをpH7.40になるように混合し、ウシ血清アルブミン(Bovineserum albumin、FractionV、Reagent Grade、Miles Corp社製)を1重量/体積%になるように、また、NaN3 (試薬特級、ナカライテスク社製)を0.1重量/体積%になるように添加したものを、ブロッキング用緩衝液として用いた。
【0048】
第二抗体:抗マウスIgG−1抗体(ウサギ由来、アフィニティ精製分画、DAKO社製)をブロッキング用緩衝液で希釈して用いた。
AFP標準品:ヒトプール血清から精製されたAFP標準品(WHO標準品、90890I.U./ml、110.0μg/ml、DAKO社製)を用い、生理食塩水にて2000、500、100、20、5ng/mlにそれぞれ希釈して使用した。また、AFP標準品を含まない、生理食塩水のみのものを0ng/mlとした。
【0049】
(2)方法
(2)−1.ラテックス試薬の調製(第一モノクローナル抗体のラテックスへの固定化)
平均粒径0.304μmのポリスチレンラテックス(固形分10重量/体積%)1容に、ラテックス希釈用緩衝液で3容を添加希釈し、2.5%ラテックス液とした。抗AFP抗体(第1モノクロ)は、タンパク濃度が66.7μg/mlになるように抗体希釈用緩衝液で希釈し、感作抗体液とした。2.5重量/体積%ラテックス液200μlを25℃のインキュベーター中でマグネチックスターラーで攪拌しながら、抗体感作液800μlを素早く添加し、25℃にて1時間攪拌した。その後、ブロッキング用緩衝液を2.0ml添加し、25℃にて続けて2時間攪拌した。その後、15℃、15000rpmにて15分問遠心分離した。得られた沈殿にブロッキング用緩衝液4.0mlを添加し、同様に遠心分維することにより、沈殿を洗浄した。洗浄操作は3回行った。この沈殿にブロッキング用緩衝液を14.0ml添加し、よく攪拌した後、超音波破砕機にて分散処理を行い、固形分0.035重量/体積%のラテックス試薬を得た。このラテックス試薬は4℃にて保存した。
【0050】
(2)−2.第二モノクローナル抗体と第二抗体の調製
第二モノクロをブロッキング用緩衝液で1倍から256倍まで希釈し、これに第二抗体をブロッキング用緩衝液で10倍希釈したものを同容量加え、攪拌して室温に放置した。4時間後、第二モノクロを32倍希釈としたところで最も多量の免疫沈降物が得られたので、この希釈倍率で反応させた。市販のキットにより蛋白定量を行った。最終濃度が25μg/mlになるようにブロッキング用緩衝液で希釈・調製して第二モノクロ−第二抗体複合体を得た。
【0051】
(2)−3.ラテックス凝集反応
ラテックス試薬によるAFP量の測定は、生化学用自動分析装置7150形(日立製作所社製)を用いて行った。上記(2)−1.で得られたラテックス試薬をそのままR2液とした。
検体容量:20μl、第二モノクロ−第二抗体複合体:200μl、試薬(R2液):210μl、測定波長:570nm、測定温度:37℃の条件で測定を行った。
試薬(R2液)を添加してから約80秒後の吸光度と約320秒後の吸光度の差(ΔOD570)を測定し、この吸光度の差を10000倍したものを吸光度変化量とした。
【0052】
実施例2
(1)材料及び試薬
実施例1と同様のものを用いた。
(2)方法
(2)−1.ラテックス試薬の調製(第一モノクローナル抗体のラテックスへの固定化)
実施例1と同様に行い、ラテックス試薬を得た。
(2)−2.第二モノクローナル抗体と第二抗体の調製
実施例1と同様に行い、第二モノクローナル抗体−第二抗体複合体を得た。
(2)−3.第二モノクローナル抗体−第二抗体複合体のラテックス粒子への固定化
(2)−2.の方法で得られた第二モノクローナル抗体−第二抗体複合体をブロッキング用緩衝液で100μg/mlに希釈したものを感作液として、(2)−1.の方法と同様にして複合体固定化ラテックス試薬を調製した。得られたラテックスをブロッキング用緩衝液で固形分が0.035重量/体積%になるように調製し、複合体固定化ラテックス試薬を得た。
【0053】
(2)−4.ラテックス凝集反応
ラテックス試薬によるAFP量の測定は、生化学用自動分析装置7150形(日立製作所杜製)を用いて行った。上記(2)−3.で得られた固形分0.035重量/体積%の複合体固定化ラテックス試薬をそのままR2液とした。
検体容量:20μl、ラテックス試薬:200μl、複合体固定化ラテックス試薬(R2液):210μl、測定波長:570nm、測定温度:37℃の条件で測定を行った。
試薬(R2液)を添加してから約80秒後の吸光度と約320秒後の吸光度の差(ΔOD570)を測定し、この吸光度の差を10000倍したものを吸光度変化量とした。
【0054】
比較例1
(1)材料及び試薬
実施例1と同様のものを用いた。
(2)方法
(2)−1.ラテックス試薬の調製(第一モノクローナル抗体のラテックスへの固定化)
実施例1と同様に行い、第1モノクロ固定化ラテックス試薬を得た。
(2)−2.ラテックス試薬の調製(第二モノクローナル抗体のラテックスへの固定化)
抗体として第二モノクロを用いた以外は、実施例1の(2)−1.と同様に行い、第二モノクロ固定化ラテックス試薬を得た。
【0055】
(2)−3.ラテックス凝集反応
第1モノクロ固定化ラテックス試薬及び第二モノクロ固定化ラテックス試薬を等量混合し、ラテックス試薬(R2)を得た。ラテックス試薬によるAFP量の測定は、生化学用自動分析装置7150形(日立製作所杜製)を用いて行った。
検体容量:20μl、ブロッキング用緩衝液:200μl、ラテックス試薬(R2液):210μl、測定波長:570nm、測定温度:37℃の条件で測定を行った。
試薬(R2液)を添加してから約80秒後の吸光度と約320秒後の吸光度の差(ΔOD570)を測定し、この吸光度の差を10000倍したものを吸光度変化量とした。
【0056】
実施例3
(1)材料及び試薬
抗ヒトIgEモノクローナル抗体:精製ヒトIgEを免疫源として調製し、マウスから得られた2種類の異なるモノクローナル抗体(クローン名M−12.7Bを第一モノクローナル抗体とした。(実施例3及び4並びに比較例2において、これを「第1モノクロ」とした。)クローン名M−7H8を第二モノクローナル抗体とした。(実施例3及び4並びに比較例2において、これを「第二モノクロ」とした。)濃度はいずれも5mg/ml、クラスはIgG−1)を用いた。IgE陽性ヒト血清:ヒトプール血清から調製されたIgE陽性ヒト血清(WHO準拠、2000I.U./ml、協和メデックス社製)を用い、生理食塩水にて2000、1000、100、10、5I.U./mlにそれぞれ希釈して使用した。また、IgE陽性ヒト血清を含まない、生理食塩水のみのものを0I.U./mlとした。
抗ヒトAFPモノクローナル抗体の代わりに抗ヒトIgEモノクローナル抗体を用い、AFP標準品の代わりにIgE陽性ヒト血清を用いたこと以外は、実施例1と同様のものを用いた。
【0057】
(2)方法
(2)−1.ラテックス試薬の調製(第一モノクローナル抗体のラテックスへの固定化)
第1モノクロとしてM−12.7Bを用いたこと以外は実施例1と同様に行い、ラテックス試薬を得た。
(2)−2.第二モノクローナル抗体と第二抗体の調製
第二モノクロとしてM−7H8を用いたこと以外は実施例1と同様に行い、第二モノクロ−第二抗体複合体を得た。
【0058】
(2)−3.ラテックス凝集反応
ラテックス試薬によるIgE量の測定は、生化学用自動分析装置7150形(日立製作所社製)を用いて行った。上記(2)−1.で得られたラテックス試薬をそのままR2液とした。
検体容量:20μl、第二モノクロ−第二抗体複合体:200μl、試薬(R2液):210μl、測定波長:570nm、測定温度:37℃の条件で測定を行った。
試薬(R2液)を添加してから約80秒後の吸光度と約320秒後の吸光度の差(ΔOD570)を測定し、この吸光度の差を10000倍したものを吸光度変化量とした。
【0059】
実施例4
(1)材料及び試薬
実施例3と同様のものを用いた。
(2)方法
(2)−1.ラテックス試薬の調製(第一モノクローナル抗体のラテックスへの固定化)
実施例3と同様に行い、ラテックス試薬を得た。
【0060】
(2)−2.第二モノクローナル抗体と第二抗体の調製
実施例3と同様に行い、第二モノクロ−第二抗体複合体を得た。
(2)−3.第二モノクローナル抗体−第二抗体複合体のラテックス粒子への固定化
(2)−2.の方法で得られた第二モノクロ−第二抗体複合体をブロッキング用緩衝液で100μg/mlに希釈したものを感作液として、(2)−1.の方法と同様にして複合体固定化ラテックス試薬を調製した。得られたラテックスをブロッキング用緩衝液で固形分が0.035重量/体積%になるように調製し、複合体固定化ラテックス試薬を得た。
【0061】
(2)−4.ラテックス凝集反応
ラテックス試薬によるIgE量の測定は、生化学用自動分析装置7150形(日立製作所社製)を用いて行った。上記(2)−3.で得られた固形分0.035重量/体積%の複合体固定化ラテックス試薬をそのままR2液とした。
検体容量:20μl、ラテックス試薬:200μl、複合体固定化ラテックス試薬(R2液):210μl、測定波長:570nm、測定温度:37℃の条件で測定を行った。
試薬(R2液)を添加してから約80秒後の吸光度と約320秒後の吸光度の差(ΔOD570)を測定し、この吸光度の差を10000倍したものを吸光度変化量とした。
【0062】
比較例2
(1)材料及び試薬
実施例3と同様のものを用いた。
(2)方法
(2)−1.ラテックス試薬の調製(第一モノクローナル抗体のラテックスへの固定化)
実施例3と同様に行い、第1モノクロ固定化ラテックス試薬を得た。
(2)−2.ラテックス試薬の調製(第二モノクローナル抗体のラテックスへの固定化)
抗体として第二モノクロ(M−7H8)を用いたこと以外は、比較例1と同様に行い、第二モノクロ固定化ラテツクス試薬を得た。
【0063】
(2)−3.ラテックス凝集反応
第1モノクロ固定化ラテックス試薬及び第二モノクロ固定化ラテックス試薬を等量混合し、ラテックス試薬(R2)を得た。ラテックス試薬によるIgE量の測定は、生化学用自動分析装置7150形(日立製作所社製)を用いて行った。
検体容量:20μl、ブロッキング用緩衝液:200μl、ラテックス試薬(R2液):210μl、測定波長:570nm、測定温度:37℃の条件で測定を行った。
試薬(R2液)を添加してから約80秒後の吸光度と約320秒後の吸光度の差(ΔOD570)を測定し、この吸光度の差を10000倍したものを吸光度変化量とした。
実施例1〜3及び比較例1〜2における配合を、表1にまとめて示した。
【0064】
【表1】
【0065】
結果
実施例1及び2並びに比較例1の結果を表2及び図1に示した。これらはAFP標準品の希釈系列を本発明のイムノアッセイ法で定量した結果である。
図1中、縦軸は、反応液の濁度の増加量を表し、横軸は、被検試料中のAFP濃度(ng/ml)を表す。
表2及び図1から明らかなように、比較例1のように2種のモノクローナル抗体をいずれもラテックス粒子に固定化させて用いた系では、充分な検出感度が得られなかったが、実施例1及び2では、AFPが5ng/ml程度まで検出が可能であった。
【0066】
【表2】
【0067】
実施例3及び4並びに比較例2の結果を表3及び図2に示した。これらは総IgE陽性血清標準品の希釈系列を本発明のイムノアッセイ法で定量した結果である。
図2中、縦軸は、反応液の濁度の増加量を表し、横軸は、被検試料中の総IgE濃度(I.U./ml)を表す。
表3及び図2から明らかなように、比較例2のように2種のモノクローナル抗体をいずれもラテックス粒子に固定化させて用いた系では、充分な検出感度が得られなかったが、実施例3及び4では、IgEが5I.U./ml程度まで検出が可能であった。
【0068】
【表3】
【0069】
【発明の効果】
本発明のイムノアッセイ法は、上述のとおりであるので、被検試料中の抗原を、選択的に、かつ、高感度に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】実施例1及び2並びに比較例1におけるAFP標準品の希釈系列を定量した測定結果を示した図である。図1中、縦軸は、反応液の濁度の増加量を表し、横軸は、被検試料中のAFP濃度(ng/ml)を表す。白ぬりの○は、実施例1を表し、黒ぬりの○は、実施例2を表し、白ぬりの□は、比較例1を表す。
【図2】実施例3及び4並びに比較例2における総IgE陽性血清標準品の希釈系列を定量した測定結果を示した図である。図2中、縦軸は、反応液の濁度の増加量を表し、横軸は、被検試料中の総IgE濃度(I.U./ml)を表す。白ぬりの○は、実施例3を表し、黒ぬりの○は、実施例4を表し、黒ぬりの□は、比較例2を表す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体被検試料中の抗原を、選択的に、かつ、高感度に検出できるイムノアッセイ法に関する。
【0002】
【従来の技術】
近年、病院、検査センター等においては、人手不足、コスト削減、多量検体処理の要請等の点から、臨床検査等の諸検査の自動化や測定時間の短縮化が図られている。
検査の自動化に適した方法として、不溶性担体粒子の凝集反応を利用して、抗原を定性又は定量する凝集法が注目されている。
【0003】
免疫化学分野においては、凝集法として、不溶性担体としてラテックスを利用するラテックス凝集イムノアッセイ法が主に用いられてきた。
特公昭58−11575号公報に開示されているように、ラテックス凝集イムノアッセイ法は、抗原又はこの抗原に特異的に結合する抗体をラテックスに担持させ、被検試料中の抗原と、抗体又はそのフラグメントとを反応、凝集させ、その凝集の程度を光学的に測定することにより、上記抗原を検出又は定量する方法である。
【0004】
凝集イムノアッセイ法において、多くの場合、抗体としてポリクローナル抗体が用いられてきた。
しかし、ポリクローナル抗体は、同じ品質のものを得ることが難しく、特異抗体に精製する段階でのポリクローナル抗体の損失が大きい等の欠点がある。
【0005】
一方、モノクローナル抗体を用いた場合、品質が一定した抗体を大量生産することが可能である。
しかしながら、モノクローナル抗体は、抗原分子上の特定のエピトープとのみ反応するので、抗原が多価抗原である場合でも、特定のエピトープに関しては多価であるとは限らない。従って、抗体としてモノクローナル抗体を用いた場合には、特定のモノクローナル抗体に対応するエピトープに関しては、一価抗原となる可能性が高くなる。
【0006】
測定の目的とする抗原が一価抗原である場合、ラテックスに担持された抗体と被検試料中の抗原とが反応又は結合しても、通常、凝集は起こらない。この場合、抗体を担持させたラテックスと、このラテックスを凝集させることができる凝集素としてのポリハプテンと、被検試料とを混合し、反応させて、被検試料中の抗原がラテックス凝集をどの程度阻害したかを測定することにより、抗原を検出又は定量する方法(凝集阻害法)が知られている。
【0007】
従って、多価抗原である蛋白抗原の場合、モノクローナル抗体を用いた凝集法においては、上述した理由で抗原エピトープに関して一価となる可能性があるので、このような蛋白抗原の測定においては、その抗原エピトープの部分を含むポリハプテンを用いた凝集阻害法に頼らざるを得ない。
従って、一価抗原をモノクローナル抗体を用いて測定する場合、凝集素としてのポリハプテンが新たに必要となるが、そのポリハプテンが被検試料中のネイティブな抗原と同一の反応性を示す保証はない。
【0008】
モノクローナル抗体を用いる場合、当然ながら、凝集素としてのポリハプテンと反応するモノクローナル抗体を用いることになるが、そのモノクローナル抗体がネイティブな抗原とは反応しない場合もある。これは、蛋白抗原の場合、抗体との反応性においては蛋白抗原の高次構造が重要な役割を果たしているのに対し、凝集素であるポリハプテンはペプチドのポリマー又はオリゴマーであり、上記蛋白抗原そのものとは立体構造が異なることによると考えられる。このような場合、ネイティブな抗原の反応性をポリハプテンの反応性に近づけるための何らかの処理が必要となる。
【0009】
特開平6−167495号公報には、被検試料中の抗原を不溶性担体粒子に吸着させ、上記抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体を反応させた後、上記モノクローナル抗体に選択的に結合する第二抗体を更に反応させて上記不溶性担体粒子を選択的に凝集させる凝集イムノアッセイ法が開示されている。この方法は、煩雑な前処理を行わずにモノクローナル抗体を用いることができるが、被検試料中の抗原を不溶性担体粒子に吸着させて固相化する必要があるので、抗原がng/ml以下の微量である場合には適用することができない等の欠点がある。
【0010】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記に鑑み、被検試料中の抗原を、選択的に、かつ、高感度に検出できるイムノアッセイ法を提供することを目的とする。
【0011】
【課題を解決するための手段】
本発明は、被検試料中の抗原に、上記抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体を反応させることにより、上記抗原を定性又は定量するイムノアッセイ法であって、上記モノクローナル抗体は、第一モノクローナル抗体及び第二モノクローナル抗体の2種類からなり、上記抗原に、上記第一モノクローナル抗体を吸着又は結合させた不溶性担体を反応させた後に、上記第二モノクローナル抗体及び上記第二モノクローナル抗体に結合性を有する第二抗体を更に反応させることにより上記不溶性担体を凝集させることを特徴とするイムノアッセイ法である。
以下に本発明を詳述する。
【0012】
本発明のイムノアッセイ法においては、被検試料中の抗原に、上記抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体を反応させて凝集させることにより、上記抗原を定性又は定量する。
【0013】
本発明のイムノアッセイ法で用いられるモノクローナル抗体は、細胞融合技術分野における公知の方法を適宜選択し又は組み合わせて、モノクローナル抗体産生融合細胞株を形成し、上記モノクローナル抗体産生融合細胞株より産生して得ることができる。上記モノクローナル抗体産生融合細胞株としては、例えば、完全抗原を用いて、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等の動物に、例えば、アジュバント等とともに皮下注射する等の方法を用いて投与して、上記動物を免疫した後、この免疫動物、例えば、免疫マウスの上記抗原に対する抗体産生細胞、例えば、脾細胞、胸腺細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等の抗体産生細胞を採取し、上記抗体産生細胞と、自己増殖性を有するが抗体産生能を実質的に有しない適当な株化細胞、例えば、マウス骨髄腫株化細胞(ミエローマ細胞)等とを、公知の方法により細胞融合処理する方法等により得ることができる。
【0014】
上記モノクローナル抗体を得るための上記株化細胞と上記モノクローナル抗体産生細胞との組み合わせは、各細胞が融合して増殖しつつ抗体を産生することが可能であれば、それぞれの細胞が由来する動物の種類としては限定されず、任意の組み合わせでよい。
【0015】
上記株化細胞としては特に限定されず、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒト等の動物の細胞体等が挙げられる。
上記株化細胞としては、薬剤抵抗性のものであり、かつ、未融合の株化細胞が選択培地で生存せず、一方融合細胞のみが生存するようなものが好ましい。上記株化細胞としては、例えば、8−アザグアニジン抵抗性の株化細胞等が挙げられる。上記8−アザグアニジン抵抗性の株化細胞は、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼを欠損し、ヒポキサンチン・アミンプテリン・チミジン(HAT)培地に生育できない性質を有している。上記株化細胞としては、特に、非分泌型のものであることが好ましく、例えば、マウスミエローマMOPC−21株由来のP3/X63−Ag8U1(P3U1)、P3/X63−Ag8・6・5・3、P3/NSI−1−Ag4−1、Sp2/O−Ag14、ラットミエローマ210・RCY3・Ag1・2・3等が挙げられる。
【0016】
上記細胞融合処理の方法としては、例えば、イーグル最小基本(MEM)培地、RPMI−1640培地等の培地中で上記免疫マウスの脾細胞1×108 〜5×108 個と、上記マウス骨髄腫株化細胞1×107 〜5×107 個とを混合する方法等が挙げられる。
【0017】
上記細胞融合処理には、融合促進剤を用いてもよい。上記融合促進剤としては、例えば、平均分子量1000〜6000のポリエチレングリコール(以下「PEG」という)、ポリビニルアルコール、ウイルス等が挙げられるが、なかでも、PEGが好ましい。上記PEGは、約30〜50%の濃度で用いることができる。
【0018】
本発明のイムノアッセイ法においては、上述のようにして得られた融合細胞含有系から、公知の方法により、選別処理、抗体活性スクリーニング処理及びクローニング処理を行い、免疫マウスと形成に用いた完全抗原とに対するモノクローナル抗体産生能を有し、かつ、自己増殖能を有するモノクローナル抗体産生融合細胞株を得ることができる。
【0019】
上記モノクローナル抗体産生融合細胞株の選別処理としては、例えば、20%ウシ胎児血清含有RPMI−1640培地等で細胞融合を終えた細胞を適当に希釈し、96穴マイクロプレートに105〜106個/ウェル程度に分注し、各ウェルに選択培地(例えば、HAT培地等)を加え、以後選択培地交換を行いながら、5%CO2 培養器(37℃)で培養を続けること等により行うことができる。上記株化細胞として8−アザグアニン抵抗性の株化細胞を用いた場合、未融合の株化細胞はHAT培地で死滅し、また、モノクローナル抗体産生細胞は正常細胞なのでin vitro培養では長期間生育できないので、培養後10〜14日ぐらいから生育してくる細胞はすべてモノクローナル抗体産生融合細胞株である。
【0020】
上記モノクローナル抗体産生融合細胞株の抗体活性スクリーニング処理及びクローニング処理は、常法により行うことができ、例えば、以下のようにして行うことができる。
上記モノクローナル抗体産生融合細胞株が生育したウェルの培養上清の一部を採取し、一定量の標識抗原とインキュベーションし、標識抗原との結合能を測定することにより目的とする抗体を分泌しているウェルを検索することができる。すなわち、125I、131I等のラジオアイソトープ又は酵素等で標識した抗原と培養上清を反応させた後、各反応液について抗原−抗体結合物を分離し、標識量を測定することにより、目的とする抗体の存在及び結合能を検索することができる。
目的とする抗体活性が認められる各ウェル中には2種以上の融合細胞が生育している可能性があるので、限界希釈法や軟寒天によるコロニー形成法によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産生融合細胞株を得ることができる。
【0021】
上記モノクローナル抗体産生細胞株を用いて、上記免疫動物の形成に用いた完全抗原に対するモノクローナル抗体を得る方法としては、例えば、上記モノクローナル抗体産生細胞株を適当な培地に培養し、培地からモノクローナル抗体を採取する方法、上記株化細胞由来動物と同系の動物に上記モノクローナル抗体産生細胞株を移植し腹水中のモノクローナル抗体を採取する方法等の公知の方法を用いることができる。
【0022】
前者の方法としては、例えば、モノクローナル抗体産生融合細胞株を10%ウシ胎児血清含有RPMI−1640培地等の培養液で培養し、その培養上清液を硫安分画、抗原を結合させたセファロース4B等のアフィニティークロマトグラフィー等によって精製する方法等が挙げられる。
【0023】
後者の方法としては、例えば、上記同系の動物にプリスタン(2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン)等の鉱物油を腹腔内投与した後、モノクローナル抗体産生融合細胞株を腹腔内投与することによりin vivoで融合細胞を大量に増殖させ、その結果、形成される腹水には高濃度のモノクローナル抗体が含まれるので、この腹水から硫安分画及び必要に応じて上述のアフィニティークロマトグラフィー等によって精製する方法等が挙げられる。
上記モノクローナル抗体は、市販品として入手することもできる。
【0024】
本発明のイムノアッセイ法において、上記モノクローナル抗体は、第一モノクローナル抗体及び第二モノクローナル抗体の2種類からなる。
上記第一モノクローナル抗体及び上記第二モノクローナル抗体は、同一の抗原に反応するものであり、かつ、お互いに異なるモノクローナル抗体である。
【0025】
本発明のイムノアッセイ法においては、抗原に、上記第一モノクローナル抗体を吸着又は結合させた不溶性担体を反応させた後に、上記第二モノクローナル抗体及び上記第二モノクローナル抗体に結合性を有する第二抗体を更に反応させることにより上記不溶性担体を凝集させる。
【0026】
上記不溶性担体としては、従来より免疫化学的凝集法又は凝集阻害法において一般的に用いられている微粒子の担体を用いることができる。
上記不溶性担体としては特に限定されないが、工業的に大量生産が可能な有機系微粒子が好ましく、例えば、スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーの単一重合体又は共重合体;スチレン−ブタジエン共重合体、メチルメタクリレート−ブタジエン共重合体等のブタジエン系共重合体等の微粒子等が挙げられる。
【0027】
上記有機系微粒子は、官能基を有する反応性有機系微粒子等であってもよい。上記官能基としては、例えば、カルボキシル基、第1級アミノ基、カルボアミノ基(−CONH2 )、水酸基、アルデヒド基等が挙げられる。
【0028】
上記不溶性担体としては、その他、動物の赤血球、細菌の細胞等の生物学的粒子;ベントナイト、コロジオン、コレステロール結晶、シリカ、カオリン、炭素末等非生物学的粒子等が挙げられる。
【0029】
本発明のイムノアッセイ法においては、上記不溶性担体が、水性液体媒体に実質的に不溶性である有機高分子物質の微粒子又は無機物質の微粒子であることが好ましい。
本発明のイムノアッセイ法においては、不溶性担体が、ラテックス粒子であることが好ましい。
【0030】
上記不溶性担体の表面に上記第一モノクローナル抗体を吸着又は結合させる方法としては、公知の方法を適宜用いることができ、例えば、不溶性担体表面にモノクローナル抗体を物理的に吸着させる方法、官能基を有する不溶性担体表面に、既知の方法である化学結合法又は共有結合法によりに感作する方法等が挙げられる。
【0031】
上記第二モノクローナル抗体に結合性を有する第二抗体としては、上記第二モノクローナル抗体に選択的に結合する能力を有するものであれば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでもよく、また、由来の動物種も問わない。上記第二モノクローナル抗体に結合性を有する第二抗体としては、例えば、第二モノクローナル抗体がマウス由来の場合には、他の動物由来の抗マウスイムノグロブリンG(IgG)血清等の抗イムノグロブリン血清等を用いることができる。また、その精製度も抗血清、イムノグロブリン分画、アフィニティ精製分画、F(ab′)2分画等いずれでもよい。
【0032】
本発明のイムノアッセイ法において、上記第二モノクローナル抗体と、上記第二モノクローナル抗体に結合性を有する第二抗体とは、あらかじめ結合させておくことが好ましく、例えば、両者を恒温(好ましくは25〜37℃)でインキュベートする等の方法で両者の複合体を得ることができる。上記複合体をそのまま用いてもよいし、第二抗体に第二モノクローナル抗体が2個導入された複合体のみ、ゲル濾過等の方法で分離精製して得られた画分を用いてもよい。上記第二モノクローナル抗体に結合性を有する第二抗体は、フリーの状態では、非特異凝集の原因となる可能性があるので、あらかじめ複合体の混合物から除いておくことが好ましい。
【0033】
本発明のイムノアッセイ法により検出される抗原としては、被検試料中に含まれる生理活性物質であり、かつ、上記抗原に対応するモノクローナル抗体の作成又は入手が可能であれば特に限定されないが、臨床検査上重要な項目であり、従来の凝集法では検出感度が不足であるとされていた項目について特に有用であり、例えば、癌検診のスクリーニングにおいて測定されるCEA、CA19−9等のng/mlまで検出感度が要求される項目等が好ましい。
【0034】
本発明のイムノアッセイ法において、上記不溶性担体に吸着又は結合させた第一モノクローナル抗体と、上記第二モノクローナル抗体及び上記第二モノクローナル抗体に結合性を有する第二抗体と、上記抗原との反応は、抗原抗体反応及びそれに伴う凝集反応である。
上記反応条件としては、上記凝集反応が起こりうる条件であれば特に限定されないが、上記反応は恒温で行うのが好ましく、より好ましくは25〜37℃である。
上記反応時間は、5秒〜15分が好ましい。
【0035】
上記反応液としては、抗原抗体反応が起こりうる生理的条件を満たす水溶液であれば特に限定されないが、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グッド緩衝液等が好ましい。上記反応液のpHは、5.5〜8.5が好ましい。より好ましくは6.5〜8.0である。
上記反応液には、種々の添加剤を適宜溶解させてもよい。上記添加剤としては、例えば、牛血清アルブミン、ショ糖等の安定剤;感度を高める効果が期待されるポリエチレングリコール、デキストラン等の水溶性多糖類;アジ化ナトリウム等の防腐剤;塩濃度調整のための塩化ナトリウム等が挙げられる。
【0036】
上記不溶性担体の凝集の程度を測定する方法としては特に限定されず、凝集を定性的又は半定量的に測定する場合には、例えば、既知の試料の濁度の程度と比較して、上記不溶性担体粒子の凝集の程度を目視によって判定すること等が可能である。上記凝集を定量的に測定する場合には、簡便性及び精度の点から、例えば、光学的に測定すること等が好ましい。
【0037】
上記凝集の光学的測定法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、いわゆる比濁法(凝集塊の形成を濁度の増加としてとらえる方法)、粒度分布による測定法(凝集塊の形成を粒度分布又は平均粒径の変化としてとらえる方法)、積分球濁度法(凝集塊の形成による前方散乱光の変化を積分球を用いて測定し、透過光強度との比を比較する方法)等が挙げられる。
【0038】
これらのそれぞれの測定法においては、速度試験(レートアッセイ;異なる時点で少なくとも2つの測定値を得て、これらの時点間における測定値の増加分(すなわち増加速度)に基づき凝集の程度を求める)、又は、終点試験(エンドポイントアッセイ;ある時点(通常は、反応の終点と考えられる時点)で1つの測定値を得て、この測定値に基づき凝集の程度を求める)を用いることができる。上記凝集の光学的測定法としては、なかでも、測定の簡便さ、迅速性の点から、比濁法を用いた速度試験が好ましい。
【0039】
本発明2は、被検試料中の抗原に、上記抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体を反応させることにより、上記抗原を定性又は定量するイムノアッセイ法であって、上記モノクローナル抗体は、第一モノクローナル抗体及び第二モノクローナル抗体の2種類からなり、上記抗原に、上記第一モノクローナル抗体を吸着又は結合させた不溶性担体を反応させた後に、上記第二モノクローナル抗体及び上記第二モノクローナル抗体に結合性を有する第二抗体を吸着又は結合させた不溶性担体を更に反応させることにより上記不溶性担体を凝集させることを特徴とするイムノアッセイ法である。
【0040】
本発明2のイムノアッセイ法において、上記第二モノクローナル抗体及び上記第二モノクローナル抗体に結合性を有する第二抗体を吸着又は結合させる不溶性担体としては、第一モノクローナル抗体を吸着又は結合させる不溶性担体と同様のものを用いることができる。
【0041】
本発明2のイムノアッセイ法において、上記第二モノクローナル抗体と、上記第二モノクローナル抗体に結合性を有する第二抗体とは、あらかじめ結合させておくことが好ましい。
【0042】
上記不溶性担体の表面に上記第二モノクローナル抗体及び上記第二モノクローナル抗体に結合性を有する第二抗体を吸着又は結合させる方法としては、上述の方法を用いることができる。
【0043】
本発明のイムノアッセイ法は、被検試料中の抗原に対する第一モノクローナル抗体を不溶性担体に吸着又は結合させたものと、上記抗原に対する第二モノクローナル抗体とを、第二抗体により結合させるか、又は、第二モノクローナル抗体を第二抗体に結合させたものを不溶性担体に吸着又は結合させたものと反応させることにより、1種類又は2種類の不溶性担体を選択的に凝集させることができる。
【0044】
本発明のイムノアッセイ法は、不溶性担体にモノクローナル抗体を直接結合させた場合に、抗体の認識部位が近接しすぎている等の立体障害により、凝集が不可能となるモノクローナル抗体の組み合わせにおいても、第二抗体を結合させて立体障害を解消することができるので、抗原との親和性の高いモノクローナル抗体を使用することができる。
【0045】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【0046】
実施例1
(1)材料及び試薬
ラテックス:平均粒径0.304μmのポリスチレンラテックス(固形分10重量/体積%、積水化学工業社製)を用いた。
ラテックス希釈用緩衝液:50mMNa2 HPO4 と50mMNaH2 PO4 とをpH7.50になるように混合し、ラテックス希釈用緩衝液として用いた。抗ヒトAFPモノクローナル抗体:精製ヒトα−フェトプロテインを免疫源として調製し、マウスから得られた2種類の異なるモノクローナル抗体(クローン名AFP4−F67を第一モノクローナル抗体とした。(実施例1及び2並びに比較例1において、これを「第1モノクロ」とした。)クローン名AFP4−F11を第二モノクローナル抗体とした。(実施例1及び2並びに比較例1において、これを「第二モノクロ」とした。)濃度はいずれも5mg/ml、クラスはIgG−1)を用いた。
【0047】
抗体希釈用緩衝液:ラテックス希釈用緩衝液を、抗体希釈用緩衝液として用いた。
ブロッキング用緩衝液:100mMNa2 HPO4 と100mMNaH2 PO4 とをpH7.40になるように混合し、ウシ血清アルブミン(Bovineserum albumin、FractionV、Reagent Grade、Miles Corp社製)を1重量/体積%になるように、また、NaN3 (試薬特級、ナカライテスク社製)を0.1重量/体積%になるように添加したものを、ブロッキング用緩衝液として用いた。
【0048】
第二抗体:抗マウスIgG−1抗体(ウサギ由来、アフィニティ精製分画、DAKO社製)をブロッキング用緩衝液で希釈して用いた。
AFP標準品:ヒトプール血清から精製されたAFP標準品(WHO標準品、90890I.U./ml、110.0μg/ml、DAKO社製)を用い、生理食塩水にて2000、500、100、20、5ng/mlにそれぞれ希釈して使用した。また、AFP標準品を含まない、生理食塩水のみのものを0ng/mlとした。
【0049】
(2)方法
(2)−1.ラテックス試薬の調製(第一モノクローナル抗体のラテックスへの固定化)
平均粒径0.304μmのポリスチレンラテックス(固形分10重量/体積%)1容に、ラテックス希釈用緩衝液で3容を添加希釈し、2.5%ラテックス液とした。抗AFP抗体(第1モノクロ)は、タンパク濃度が66.7μg/mlになるように抗体希釈用緩衝液で希釈し、感作抗体液とした。2.5重量/体積%ラテックス液200μlを25℃のインキュベーター中でマグネチックスターラーで攪拌しながら、抗体感作液800μlを素早く添加し、25℃にて1時間攪拌した。その後、ブロッキング用緩衝液を2.0ml添加し、25℃にて続けて2時間攪拌した。その後、15℃、15000rpmにて15分問遠心分離した。得られた沈殿にブロッキング用緩衝液4.0mlを添加し、同様に遠心分維することにより、沈殿を洗浄した。洗浄操作は3回行った。この沈殿にブロッキング用緩衝液を14.0ml添加し、よく攪拌した後、超音波破砕機にて分散処理を行い、固形分0.035重量/体積%のラテックス試薬を得た。このラテックス試薬は4℃にて保存した。
【0050】
(2)−2.第二モノクローナル抗体と第二抗体の調製
第二モノクロをブロッキング用緩衝液で1倍から256倍まで希釈し、これに第二抗体をブロッキング用緩衝液で10倍希釈したものを同容量加え、攪拌して室温に放置した。4時間後、第二モノクロを32倍希釈としたところで最も多量の免疫沈降物が得られたので、この希釈倍率で反応させた。市販のキットにより蛋白定量を行った。最終濃度が25μg/mlになるようにブロッキング用緩衝液で希釈・調製して第二モノクロ−第二抗体複合体を得た。
【0051】
(2)−3.ラテックス凝集反応
ラテックス試薬によるAFP量の測定は、生化学用自動分析装置7150形(日立製作所社製)を用いて行った。上記(2)−1.で得られたラテックス試薬をそのままR2液とした。
検体容量:20μl、第二モノクロ−第二抗体複合体:200μl、試薬(R2液):210μl、測定波長:570nm、測定温度:37℃の条件で測定を行った。
試薬(R2液)を添加してから約80秒後の吸光度と約320秒後の吸光度の差(ΔOD570)を測定し、この吸光度の差を10000倍したものを吸光度変化量とした。
【0052】
実施例2
(1)材料及び試薬
実施例1と同様のものを用いた。
(2)方法
(2)−1.ラテックス試薬の調製(第一モノクローナル抗体のラテックスへの固定化)
実施例1と同様に行い、ラテックス試薬を得た。
(2)−2.第二モノクローナル抗体と第二抗体の調製
実施例1と同様に行い、第二モノクローナル抗体−第二抗体複合体を得た。
(2)−3.第二モノクローナル抗体−第二抗体複合体のラテックス粒子への固定化
(2)−2.の方法で得られた第二モノクローナル抗体−第二抗体複合体をブロッキング用緩衝液で100μg/mlに希釈したものを感作液として、(2)−1.の方法と同様にして複合体固定化ラテックス試薬を調製した。得られたラテックスをブロッキング用緩衝液で固形分が0.035重量/体積%になるように調製し、複合体固定化ラテックス試薬を得た。
【0053】
(2)−4.ラテックス凝集反応
ラテックス試薬によるAFP量の測定は、生化学用自動分析装置7150形(日立製作所杜製)を用いて行った。上記(2)−3.で得られた固形分0.035重量/体積%の複合体固定化ラテックス試薬をそのままR2液とした。
検体容量:20μl、ラテックス試薬:200μl、複合体固定化ラテックス試薬(R2液):210μl、測定波長:570nm、測定温度:37℃の条件で測定を行った。
試薬(R2液)を添加してから約80秒後の吸光度と約320秒後の吸光度の差(ΔOD570)を測定し、この吸光度の差を10000倍したものを吸光度変化量とした。
【0054】
比較例1
(1)材料及び試薬
実施例1と同様のものを用いた。
(2)方法
(2)−1.ラテックス試薬の調製(第一モノクローナル抗体のラテックスへの固定化)
実施例1と同様に行い、第1モノクロ固定化ラテックス試薬を得た。
(2)−2.ラテックス試薬の調製(第二モノクローナル抗体のラテックスへの固定化)
抗体として第二モノクロを用いた以外は、実施例1の(2)−1.と同様に行い、第二モノクロ固定化ラテックス試薬を得た。
【0055】
(2)−3.ラテックス凝集反応
第1モノクロ固定化ラテックス試薬及び第二モノクロ固定化ラテックス試薬を等量混合し、ラテックス試薬(R2)を得た。ラテックス試薬によるAFP量の測定は、生化学用自動分析装置7150形(日立製作所杜製)を用いて行った。
検体容量:20μl、ブロッキング用緩衝液:200μl、ラテックス試薬(R2液):210μl、測定波長:570nm、測定温度:37℃の条件で測定を行った。
試薬(R2液)を添加してから約80秒後の吸光度と約320秒後の吸光度の差(ΔOD570)を測定し、この吸光度の差を10000倍したものを吸光度変化量とした。
【0056】
実施例3
(1)材料及び試薬
抗ヒトIgEモノクローナル抗体:精製ヒトIgEを免疫源として調製し、マウスから得られた2種類の異なるモノクローナル抗体(クローン名M−12.7Bを第一モノクローナル抗体とした。(実施例3及び4並びに比較例2において、これを「第1モノクロ」とした。)クローン名M−7H8を第二モノクローナル抗体とした。(実施例3及び4並びに比較例2において、これを「第二モノクロ」とした。)濃度はいずれも5mg/ml、クラスはIgG−1)を用いた。IgE陽性ヒト血清:ヒトプール血清から調製されたIgE陽性ヒト血清(WHO準拠、2000I.U./ml、協和メデックス社製)を用い、生理食塩水にて2000、1000、100、10、5I.U./mlにそれぞれ希釈して使用した。また、IgE陽性ヒト血清を含まない、生理食塩水のみのものを0I.U./mlとした。
抗ヒトAFPモノクローナル抗体の代わりに抗ヒトIgEモノクローナル抗体を用い、AFP標準品の代わりにIgE陽性ヒト血清を用いたこと以外は、実施例1と同様のものを用いた。
【0057】
(2)方法
(2)−1.ラテックス試薬の調製(第一モノクローナル抗体のラテックスへの固定化)
第1モノクロとしてM−12.7Bを用いたこと以外は実施例1と同様に行い、ラテックス試薬を得た。
(2)−2.第二モノクローナル抗体と第二抗体の調製
第二モノクロとしてM−7H8を用いたこと以外は実施例1と同様に行い、第二モノクロ−第二抗体複合体を得た。
【0058】
(2)−3.ラテックス凝集反応
ラテックス試薬によるIgE量の測定は、生化学用自動分析装置7150形(日立製作所社製)を用いて行った。上記(2)−1.で得られたラテックス試薬をそのままR2液とした。
検体容量:20μl、第二モノクロ−第二抗体複合体:200μl、試薬(R2液):210μl、測定波長:570nm、測定温度:37℃の条件で測定を行った。
試薬(R2液)を添加してから約80秒後の吸光度と約320秒後の吸光度の差(ΔOD570)を測定し、この吸光度の差を10000倍したものを吸光度変化量とした。
【0059】
実施例4
(1)材料及び試薬
実施例3と同様のものを用いた。
(2)方法
(2)−1.ラテックス試薬の調製(第一モノクローナル抗体のラテックスへの固定化)
実施例3と同様に行い、ラテックス試薬を得た。
【0060】
(2)−2.第二モノクローナル抗体と第二抗体の調製
実施例3と同様に行い、第二モノクロ−第二抗体複合体を得た。
(2)−3.第二モノクローナル抗体−第二抗体複合体のラテックス粒子への固定化
(2)−2.の方法で得られた第二モノクロ−第二抗体複合体をブロッキング用緩衝液で100μg/mlに希釈したものを感作液として、(2)−1.の方法と同様にして複合体固定化ラテックス試薬を調製した。得られたラテックスをブロッキング用緩衝液で固形分が0.035重量/体積%になるように調製し、複合体固定化ラテックス試薬を得た。
【0061】
(2)−4.ラテックス凝集反応
ラテックス試薬によるIgE量の測定は、生化学用自動分析装置7150形(日立製作所社製)を用いて行った。上記(2)−3.で得られた固形分0.035重量/体積%の複合体固定化ラテックス試薬をそのままR2液とした。
検体容量:20μl、ラテックス試薬:200μl、複合体固定化ラテックス試薬(R2液):210μl、測定波長:570nm、測定温度:37℃の条件で測定を行った。
試薬(R2液)を添加してから約80秒後の吸光度と約320秒後の吸光度の差(ΔOD570)を測定し、この吸光度の差を10000倍したものを吸光度変化量とした。
【0062】
比較例2
(1)材料及び試薬
実施例3と同様のものを用いた。
(2)方法
(2)−1.ラテックス試薬の調製(第一モノクローナル抗体のラテックスへの固定化)
実施例3と同様に行い、第1モノクロ固定化ラテックス試薬を得た。
(2)−2.ラテックス試薬の調製(第二モノクローナル抗体のラテックスへの固定化)
抗体として第二モノクロ(M−7H8)を用いたこと以外は、比較例1と同様に行い、第二モノクロ固定化ラテツクス試薬を得た。
【0063】
(2)−3.ラテックス凝集反応
第1モノクロ固定化ラテックス試薬及び第二モノクロ固定化ラテックス試薬を等量混合し、ラテックス試薬(R2)を得た。ラテックス試薬によるIgE量の測定は、生化学用自動分析装置7150形(日立製作所社製)を用いて行った。
検体容量:20μl、ブロッキング用緩衝液:200μl、ラテックス試薬(R2液):210μl、測定波長:570nm、測定温度:37℃の条件で測定を行った。
試薬(R2液)を添加してから約80秒後の吸光度と約320秒後の吸光度の差(ΔOD570)を測定し、この吸光度の差を10000倍したものを吸光度変化量とした。
実施例1〜3及び比較例1〜2における配合を、表1にまとめて示した。
【0064】
【表1】
【0065】
結果
実施例1及び2並びに比較例1の結果を表2及び図1に示した。これらはAFP標準品の希釈系列を本発明のイムノアッセイ法で定量した結果である。
図1中、縦軸は、反応液の濁度の増加量を表し、横軸は、被検試料中のAFP濃度(ng/ml)を表す。
表2及び図1から明らかなように、比較例1のように2種のモノクローナル抗体をいずれもラテックス粒子に固定化させて用いた系では、充分な検出感度が得られなかったが、実施例1及び2では、AFPが5ng/ml程度まで検出が可能であった。
【0066】
【表2】
【0067】
実施例3及び4並びに比較例2の結果を表3及び図2に示した。これらは総IgE陽性血清標準品の希釈系列を本発明のイムノアッセイ法で定量した結果である。
図2中、縦軸は、反応液の濁度の増加量を表し、横軸は、被検試料中の総IgE濃度(I.U./ml)を表す。
表3及び図2から明らかなように、比較例2のように2種のモノクローナル抗体をいずれもラテックス粒子に固定化させて用いた系では、充分な検出感度が得られなかったが、実施例3及び4では、IgEが5I.U./ml程度まで検出が可能であった。
【0068】
【表3】
【0069】
【発明の効果】
本発明のイムノアッセイ法は、上述のとおりであるので、被検試料中の抗原を、選択的に、かつ、高感度に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】実施例1及び2並びに比較例1におけるAFP標準品の希釈系列を定量した測定結果を示した図である。図1中、縦軸は、反応液の濁度の増加量を表し、横軸は、被検試料中のAFP濃度(ng/ml)を表す。白ぬりの○は、実施例1を表し、黒ぬりの○は、実施例2を表し、白ぬりの□は、比較例1を表す。
【図2】実施例3及び4並びに比較例2における総IgE陽性血清標準品の希釈系列を定量した測定結果を示した図である。図2中、縦軸は、反応液の濁度の増加量を表し、横軸は、被検試料中の総IgE濃度(I.U./ml)を表す。白ぬりの○は、実施例3を表し、黒ぬりの○は、実施例4を表し、黒ぬりの□は、比較例2を表す。
Claims (4)
- 被検試料中の抗原に、前記抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体を反応させることにより、前記抗原を定性又は定量するイムノアッセイ法であって、
前記モノクローナル抗体は、第一モノクローナル抗体及び第二モノクローナル抗体の2種類からなり、
前記抗原に、前記第一モノクローナル抗体を吸着又は結合させた不溶性担体を反応させた後に、前記第二モノクローナル抗体及び前記第二モノクローナル抗体に結合性を有する第二抗体を更に反応させることにより前記不溶性担体を凝集させることを特徴とするイムノアッセイ法。 - 被検試料中の抗原に、前記抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体を反応させることにより、前記抗原を定性又は定量するイムノアッセイ法であって、
前記モノクローナル抗体は、第一モノクローナル抗体及び第二モノクローナル抗体の2種類からなり、
前記抗原に、前記第一モノクローナル抗体を吸着又は結合させた不溶性担体を反応させた後に、前記第二モノクローナル抗体及び前記第二モノクローナル抗体に結合性を有する第二抗体を吸着又は結合させた不溶性担体を更に反応させることにより前記不溶性担体を凝集させることを特徴とするイムノアッセイ法。 - 不溶性担体が、水性液体媒体に実質的に不溶性である有機高分子物質の微粒子又は無機物質の微粒子である請求項1又は2記載のイムノアッセイ法。
- 不溶性担体が、ラテックス粒子である請求項1、2又は3記載のイムノアッセイ法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP13233896A JP3569074B2 (ja) | 1996-05-27 | 1996-05-27 | イムノアッセイ法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP13233896A JP3569074B2 (ja) | 1996-05-27 | 1996-05-27 | イムノアッセイ法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH09318629A JPH09318629A (ja) | 1997-12-12 |
JP3569074B2 true JP3569074B2 (ja) | 2004-09-22 |
Family
ID=15079006
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP13233896A Expired - Fee Related JP3569074B2 (ja) | 1996-05-27 | 1996-05-27 | イムノアッセイ法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3569074B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA3031355C (en) | 2016-07-29 | 2023-05-23 | Diazyme Laboratories, Inc. | Methods and compositions for assaying vitamin d |
CN114008457A (zh) * | 2019-06-28 | 2022-02-01 | 美国西门子医学诊断股份有限公司 | 使用颗粒增强凝集检测的夹心免疫测定试剂及其生产和使用方法 |
WO2022202312A1 (ja) * | 2021-03-23 | 2022-09-29 | デンカ株式会社 | 不溶性粒子、標的抗原測定用又は標的抗体測定用キット、標的抗原又は標的抗体の測定方法及び不溶性粒子を製造する方法 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0690206B2 (ja) * | 1986-06-16 | 1994-11-14 | 日本赤十字社 | 抗原抗体複合物及びその使用方法 |
JPH01301165A (ja) * | 1988-05-30 | 1989-12-05 | Sekisui Chem Co Ltd | 免疫測定法 |
JPH0389166A (ja) * | 1989-08-31 | 1991-04-15 | Nitto Denko Corp | 抗体活性の測定方法 |
JP2677753B2 (ja) * | 1993-07-22 | 1997-11-17 | 株式会社エスアールエル | 凝集イムノアッセイ法 |
-
1996
- 1996-05-27 JP JP13233896A patent/JP3569074B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH09318629A (ja) | 1997-12-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4376110A (en) | Immunometric assays using monoclonal antibodies | |
US4536479A (en) | Use of anti-idiotype antibodies in immunoassays | |
US4062935A (en) | Immunoassay involving the binding of RF to the antigen-antibody complex | |
US4511662A (en) | Simultaneous assay for T and B lymphocyte populations and subpopulations | |
Yolken | Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): a practical tool for rapid diagnosis of viruses and other infectious agents. | |
US4469787A (en) | Immunoassay involving soluble complex of second antibody and labeled binding protein | |
US5561049A (en) | Method for detecting antibodies | |
US5122453A (en) | Method for discriminating surface stained lymphocytes | |
JPH0823560B2 (ja) | 免疫的に結合可能の物質の測定法及び診断剤 | |
JPS6343711B2 (ja) | ||
WO1985000663A1 (en) | Immunometric assay using polyclonal and monoclonal antibodies and a kit for use therein | |
EP0185722A1 (en) | Polyclonal antibodies, preparation and use | |
AU652637B2 (en) | Assay of specific antibody | |
JP3652029B2 (ja) | 高感度免疫測定法 | |
US20060073536A1 (en) | Immunoassays for determining vitamin B12, and reagents and kits therefor | |
CA1300498C (en) | Ice nucleation immunoassay | |
EP0968429B1 (en) | Method and kit for determining the phenotype of a haptoglobin and use thereof | |
JPH01262471A (ja) | Ckmb検定及びそれに使用するモノクローナル抗体 | |
JP3569074B2 (ja) | イムノアッセイ法 | |
CA1254134A (en) | Specific binding flow cytometry method | |
US5437981A (en) | Method for the immunological determination of ligands | |
JPH0421819B2 (ja) | ||
JPH06167495A (ja) | 凝集イムノアッセイ法 | |
EP0141620B1 (en) | Specific binding assay reagent | |
EP0248038A1 (en) | Idiotypic-antigenic conjunction binding assay |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20040514 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20040526 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20040617 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090625 Year of fee payment: 5 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |