CN114008457A - 使用颗粒增强凝集检测的夹心免疫测定试剂及其生产和使用方法 - Google Patents

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Abstract

公开了用于半抗原的夹心免疫测定中的试剂以及含有所述试剂的试剂盒。还公开了在颗粒增强的凝集检测测定中利用这些免疫测定试剂以检测样品中的半抗原/药物的诊断免疫测定方法。

Description

使用颗粒增强凝集检测的夹心免疫测定试剂及其生产和使用 方法
相关申请的交叉引用/通过引用并入声明
本申请根据35 USC § 119(e)要求2019年6月28日提交的美国临时申请号62/868,309的权益。上述专利申请的全部内容在此通过引用明确并入本文。
关于联邦资助的研究或开发的声明
不适用。
背景
身体依靠复杂的免疫应答系统来区分自身与非自身。有时，必须控制身体的免疫系统，以增强不足的应答或抑制过度的应答。例如，当将器官诸如肾脏、心脏、心-肺、骨髓和肝脏移植于人体中时，身体经常会通过称为同种异体移植排斥的过程排斥移植的组织。
在治疗同种异体移植排斥中，经常用药物疗法以受控方式抑制免疫系统。免疫抑制剂药物是一种治疗性药物，其被小心地施用于移植受体，以帮助防止非自身组织的同种异体移植排斥。免疫抑制性药物包括(但不限于)：糖皮质激素、细胞抑制剂、抗体、作用于免疫亲和素的药物以及其他药物、诸如(但不限于)干扰素、阿片类INF结合蛋白、霉酚酸酯、FTY720等。一类特定的免疫抑制剂药物包括作用于免疫亲和素的那些药物。免疫亲和素是具有生理意义的高亲和力、特异性结合蛋白的一个实例。目前已知两种不同的免疫亲和素家族：亲环蛋白和亲巨蛋白(macrophilins)，其后者特异性结合例如(但不限于)他克莫司、西罗莫司或依维莫司。
在移植患者中预防器官排斥的两种最常施用的免疫抑制性药物是环孢菌素(CSA)和他克莫司(FK506)。另一种在美国和其他国家用作免疫抑制剂的药物是西罗莫司，也称为雷帕霉素。西罗莫司的衍生物也可用作免疫抑制剂；此类衍生物包括，例如(但不限于)依维莫司等。
他克莫司，也称为FK506，是一种环状的、聚-N-甲基化的十一肽，其具有免疫抑制性活性，且从细菌筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis) No.9993的发酵产物中分离出来。FK506的结构显示于下式I中。
Figure 267254DEST_PATH_IMAGE001
他克莫司经常与其他免疫抑制剂药物一起使用，通常用于通过抑制免疫系统来减少同种异体器官移植物中的移植排斥。他克莫司具有窄治疗窗口，且因此监测血药浓度对于最佳效力是至关重要的。对于他克莫司药物监测，采用单一抗体的竞争性免疫测定是商业可得的，并且已经描述了一种夹心免疫测定，其应当提供比竞争形式更高的分析灵敏度和特异性以及更宽的动态范围(Wei等人，Clinical Chemistry (2014) 60(4):621-630；和美国专利号8,586,322)。
西罗莫司，也称为雷帕霉素，是一种由吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)产生的大环内酯类抗生素，并且已发现其在各种应用中药学上有用，特别是作为免疫抑制剂，例如用于治疗和预防器官移植排斥和自身免疫性疾病。西罗莫司(雷帕霉素)的结构显示于下式II中。
Figure 184394DEST_PATH_IMAGE002
然而，西罗莫司在较高剂量下确实表现出副作用，并且其具有稍可变的生物利用度。因此，非常期望监测正在用雷帕霉素治疗的患者中雷帕霉素的血液水平，以便能够调节剂量以维持对于药理学活性足够的最低水平并避免任何过度的副作用风险。雷帕霉素测定近来已经描述于美国专利号6,635,745；8,039,599；和8,039,600。
依维莫司[40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素]，也称为SDZ-RAD、RAD和CERTICAN®(Novartis)，是由Novartis (Nashan, B., Transplantation Proceedings (2001) 33:3215-3230)开发以努力在西罗莫司之上进行改进的新型大环内酯类免疫抑制剂。与西罗莫司相比，依维莫司在有机溶剂中具有更大的稳定性和增强的溶解度，以及更有利的药代动力学与更少的副作用。依维莫司的结构显示于下式III中。
Figure 432973DEST_PATH_IMAGE003
然而，对于依维莫司存在与他克莫司和西罗莫司类似的治疗药物监测(TDM)的需求。依维莫司的免疫测定公开于例如美国专利号7,223,553中。
如上文所述，与这些免疫抑制剂药物相关的副作用可以通过仔细控制患者中存在的药物水平来部分控制。需要对生物样品中的免疫抑制剂药物和相关药物的浓度进行治疗监测，以优化给药方案，以确保最大的免疫抑制和最小的毒性。尽管免疫抑制剂药物是高效的免疫抑制剂，但其使用必须谨慎管理，因为有效剂量范围经常窄，并且过大的剂量可导致严重的副作用。另一方面，过少剂量的免疫抑制剂可导致组织排斥。由于免疫抑制剂药物的分布和代谢在患者之间可存在很大差异，并且由于不良反应的宽范围和严重程度，准确监测药物水平至关重要。
小的半抗原药物/激素测定(诸如但不限于他克莫司测定)经常通过使用单一抗体的竞争性免疫测定法来测量。这种类型的测定法经常采用颗粒增强的凝集用于信号检测。然而，这些测定法具有缺点。首先，这些竞争性测定法通常具有低灵敏度，并且通常不如夹心测定法精确。其次，低特异性、与结构类似物的交叉反应性高于需要识别更多表位的夹心测定法。第三，在半抗原类似物存在的情况下，更难以除去反应混合物中的样品基质；出于该原因，在此类测定法中除去样品基质经常需要使用手动提取程序。
此外，已经报道了对小的半抗原的夹心测定法，其利用对半抗原特异性的两种抗体(参见美国专利号8,586,322)。然而，先前没有报道使用颗粒增强的凝集来制定半抗原的夹心测定。
因此，本领域需要克服现有技术的缺点和缺陷的针对分析物(诸如但不限于半抗原)的新的和改进的免疫测定法。本公开正是涉及此类免疫测定法以及其中使用的试剂和试剂盒。
详细描述
在通过示例性语言和结果的方式详细解释本公开的至少一个实施方案之前，应理解，本公开的应用不限于下面的描述中阐述的组分的构造和排列的细节。本公开能够具有其他实施方案，或者能够以各种方式实践或实施。因此，本文使用的语言意欲被给予最广泛的可能范围和含义；并且实施方案意味着是示例性的——而非穷举性的。而且，应该理解，本文采用的措辞和术语是为了描述的目的，并且不应被认为是限制性的。
除非本文另有定义，否则结合本公开使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。进一步，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。前述技术和程序通常根据本领域众所周知的常规方法、并且如在本说明书通篇引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述而实施。与本文所述的分析化学、合成有机化学以及药用和药物化学结合利用的命名及其实验室程序和技术是本领域中众所周知和常用的那些。标准技术用于化学合成和化学分析。
本说明书中提及的所有专利、公开的专利申请和非专利出版物指示本公开所属领域的技术人员的技术水平。在本申请的任何部分中引用的所有专利、公开的专利申请和非专利出版物在本文中明确地通过引用以其整体并入，其程度如同每个单独的专利或出版物被具体和个别地指出通过引用并入一样。
鉴于本公开，无需过度实验即可制备和执行本文公开的所有组合物、试剂盒和/或方法。尽管已经从具体实施方案的角度描述了所述组合物、试剂盒和/或方法，但对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本公开的构思、精神和范围的情况下，可对所述组合物、试剂盒和/或方法、以及在本文描述的方法的步骤或步骤顺序中应用变化。认为对于本领域技术人员显而易见的所有此类类似的取代和修改在如所附权利要求书限定的本公开的精神、范围和构思内。
如根据本公开所利用，除非另有指示，否则以下术语应理解为具有以下含义：
与权利要求和/或说明书中的术语“包括”结合使用时，术语“一个/种(a)”或“一个/种(an)”的使用可意味着“一个/种(one)”，但它也与“一个/种或多个/种”、“至少一个/种”和“一个/种或多于一个/种”的含义一致。因此，术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该/所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另有明确指示。因此，例如，对“一种化合物”的提及可指一种或多种化合物、2种或更多种化合物、3种或更多种化合物、4种或更多种化合物或更大数目的化合物。术语“多个/种”是指“两个/种或更多个/种”。
术语“至少一个/种”的使用将被理解为包括一个/种以及多于一个/种的任何数量，包括但不限于2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、100个/种等。术语“至少一个/种”可延伸多至100或1000或更多个/种，这取决于它所附接的术语；此外，100/1000的数量不视为限制性的，因为更高的限值也可产生令人满意的结果。此外，术语“X、Y和Z中的至少一种”的使用将被理解为包括单独的X，单独的Y和单独的Z，以及X、Y和Z的任何组合。序数术语(即，“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等)的使用仅用于区分两个或更多个事项的目的，并且不意味着暗示例如一个事项相对于另一事项的任何顺序或次序或重要性、或任何添加次序。
在权利要求中使用术语“或”用于意指包括性的“和/或”，除非明确指出仅指代替代方案或者除非替代方案是互相排斥的。例如，以下任一种都满足条件“A或B”：A为真(或存在)且B为假(或不存在)，A为假(或不存在)且B为真(或存在)，并且A和B两者均为真(或存在)。
如本文所用，对“一个实施方案(one embodiment)”、“一个实施方案(anembodiment)”、“一些实施方案”、“一个实例(one example)”、“例如”或“一个实例(anexample)”的任何引用意指结合该实施方案描述的具体要素、特征、结构或特征包括在至少一个实施方案中。例如，说明书中各个地方出现的短语“在一些实施方案中”或“一个实例”不一定全部是指同一实施方案。此外，对一个或多个实施方案或实例的所有引用都应被解释为对权利要求非限定性的。
在整个申请中，术语“约”用于指示值包括用于测定该值的组合物/仪器/装置、方法的误差的固有变化，或研究受试者间存在的变化。例如，但不限于，当利用术语“约”时，指定值可以与列举值相差正负20%，或15%，或12%，或11%，或10%，或9%，或8%，或7%，或6%，或5%，或4%，或3%，或2%，或1%，因为此类变化适用于执行公开的方法并由本领域普通技术人员所理解。
如在本说明书和一个或多个权利要求中所用，术语“包含(comprising)”(和任何形式的包含，例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(和任何形式的具有，例如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(和任何形式的包括，例如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(和任何形式的含有，例如“含有(contains)”和“含有(contain)”)都是包括性的或开放式的，并且不排除另外的未列举的要素或方法步骤。
如本文所用的术语“或其组合”是指所述术语之前列出的事项的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”意欲包括以下中的至少一个：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，并且如果次序在特定上下文中是重要的，则也包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续该实例，明确包括的是含有一个或多个事项或术语的重复的组合，例如BB、AAA、AAB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等等。本领域技术人员将理解，除非从上下文可见，否则通常对任何组合中的事项或术语的数量没有限制。
如本文所用，术语“实质上(substantially)”意味着随后描述的事件或情况完全发生或者随后描述的事件或情况在大范围或程度上发生。例如，当与具体事件或环境相关时，术语“实质上”意味着随后描述的事件或情况发生在至少80％的时间、或至少85％的时间、或至少90％的时间、或至少95％的时间。术语“实质上相邻”可以意指两个事项与彼此100%相邻，或者两个事项与彼此密切接近，但与彼此不是100%相邻，或者两个事项之一的一部分与另一事项不是100%相邻，而是与另一事项密切接近。
术语“类似物”和“衍生物”在本文中可互换使用，并且是指在其结构中包含与给定化合物相同的基本碳骨架和碳官能团、但也可含有对其的一个或多个取代的物质。如本文所用的术语“取代”将被理解为是指用残基R替换化合物上的至少一个取代基。在某些非限制性实施方案中，R可以包括H、羟基、硫醇、选自氟化物、氯化物、溴化物或碘化物的卤化物、选自以下之一的C1-C4化合物：直链、支链或环状烷基，任选取代的和线性支链或环状烯基，其中任选的取代基选自一个或多个烯基烷基、炔基烷基、环烷基、环烯基烷基、芳基烷基、杂芳基烷基、杂环烷基、任选取代的杂环烯基烷基、芳基环烷基和芳基杂环烷基，其中每一个任选地被取代，其中任选的取代基选自以下中的一种或多种：烯基烷基、炔基烷基、环烷基、环烯基烷基、芳基烷基、烷基芳基、杂芳基烷基、杂环烷基、任选地取代的杂环烯基烷基、芳基环烷基和芳基杂环烷基、苯基、氰基、羟基、烷基、芳基、环烷基、氰基、烷氧基、烷基硫基、氨基、-NH(烷基)、-NH(环烷基)2、羧基和-C(O))-烷基。
如本文所用的术语“特异性结合配偶体”应理解为是指能够与亲巨蛋白-结合药物特异性缔合以用于其检测目的的任何分子。例如但非限定地，所述特异性结合配偶体可以是抗体、受体、配体、适体、分子印迹聚合物(即，无机基质)或其任何组合和/或衍生物，以及能够特异性结合亲巨蛋白-结合药物的任何其他分子。
术语“抗体”在本文中以最广义使用，并且是指例如完整单克隆抗体和多克隆抗体，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其表现出结合分析物的期望生物活性的抗体片段及缀合物(诸如但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、双抗体、单链抗体和其他抗体片段及其缀合物，其保留完整抗体的可变区的至少一部分)，抗体替代蛋白或肽(即，工程改造的结合蛋白/肽)及其组合或衍生物。所述抗体可以是任何类型或类别(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或子类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
如本文所用的术语“样品”将理解为包括可根据本公开利用的任何类型的生物样品。在某些实施方案中，所述样品可以是任何流体样品和/或能够是流体的样品(例如，与流体基质混合的生物样品)。可使用的生物样品的实例包括但不限于：全血或其任何部分(即，血浆或血清)、唾液、痰、脑脊液(CSF)、手术排液、皮肤、肠液、腹膜内液、囊液(cysticfluid)、汗液、间质液、细胞外液、泪液、粘液、膀胱洗液(bladder wash)、尿液、拭子、精液、粪便、胸膜液、鼻咽液、其组合等。应当注意，尽管本公开针对生物样品，但本领域技术人员应理解，本文公开的概念可以应用于其中可以测定分析物(诸如但不限于半抗原)的浓度的任何样品，且因此，本公开的范围不限于生物样品。
现在转向当前公开和/或请求保护的发明构思，公开了在使用颗粒增强凝集检测的分析物(诸如但不限于半抗原)的夹心免疫测定中利用的试剂，以及含有其的试剂盒及其生产和使用方法，其克服了现有技术的缺点和缺陷。当前公开和/或请求保护的发明构思将颗粒上独特的抗体包被设计与夹心测定形式组合，以使测定信号最大化，同时将所需的试剂数量减少至仅两种试剂。例如，典型的夹心免疫测定需要制造五种不同的试剂：预处理(或提取)试剂、标记的抗体(即，FITC抗体)、固相(即，用抗FITC抗体包被的磁性颗粒)、辅助试剂(即，荧光素标记的二抗)以及洗涤和信号生成溶液。相比之下，本文所述的免疫测定仅需要制造两种试剂。在一个非限制性实施方案中，两种试剂包括预处理试剂和用两种不同抗体包被的单一颗粒。在另一个非限制性实施方案中，两种试剂包括预处理试剂和包含两种颗粒的混合物的试剂，每种颗粒用两种抗体之一包被。在又另一个非限制性实施方案中，两种试剂包括预处理试剂和包含与之附接的抗体的颗粒和处于其“游离”形式(即，未附接至颗粒)的二抗的试剂。
本公开的免疫测定形式将给出比竞争性免疫测定形式更高的测定灵敏度以及更低的与药物类似物的交叉反应性。此外，本文所述的免疫测定可以完全自动化并且不需要任何手动提取步骤。本文公开的免疫测定形式仅需要两种试剂，预处理试剂和颗粒-双重抗体试剂。因此，当前公开和/或请求保护的发明构思包括利用颗粒增强凝集用于信号检测的半抗原的第一夹心测定形式。此外，当前公开和/或请求保护的发明构思包括用两种抗体的混合物包被乳胶颗粒以形成用于凝集的颗粒间夹心的第一测定。此外，当前公开和/或请求保护的发明构思包括其中颗粒凝集通过半抗原桥接的第一测定。
与其他技术(诸如利用酶或化学发光标签的那些)相比，颗粒增强凝集测定的主要优点之一是试剂制备的简化。例如，该测定仅需要一种颗粒试剂；如果两种抗分析物抗体(诸如但不限于抗半抗原抗体)与相同的乳胶颗粒缀合，则当分析物/半抗原桥接颗粒时发生凝集。另一个实例是，如果一种抗体与乳胶颗粒缀合，则另一种抗体可直接用于测定中以经由颗粒结合的分析物/半抗原触发凝集，而无需将第二抗体与颗粒缀合。当前公开的免疫测定设计的另一个主要优点是测定过程的简化。本文利用的颗粒增强信号检测允许一种免疫试剂(如在其中两种抗体均附接至相同颗粒的情况下)或抗体包被颗粒和游离抗体的混合物作为一种试剂。由于不同试剂对试剂储存和反应环境的独特要求，使用酶或化学发光标签的测定形式经常需要多种试剂以及多个添加步骤。
本公开的某些非限制性实施方案涉及用于分析物(诸如但不限于半抗原)的颗粒增强凝集免疫测定中的诊断免疫测定试剂。所述诊断免疫测定试剂包含具有与之附接的两种抗体或其片段的颗粒。第一抗体或其片段特异性结合分析物/半抗原的部分(即，表位)，其不同于第二抗体或其片段特异性结合的分析物/半抗原的部分(即，表位)；即，第一和第二抗体或其片段结合分析物/半抗原的不同(并且基本上不重叠)的表位。此外，两种诊断免疫测定试剂与分析物/半抗原的结合导致用于信号检测的颗粒增强的凝集。
可通过夹心免疫测定法检测的任何分析物(诸如但不限于半抗原/药物分子)可通过本文公开的试剂和方法检测。例如(但不限于)，所述半抗原可以是以下中的至少一种：依维莫司(例如但不限于RAD、Certican、ZORTRESS® (Novartis AG Corp., 瑞士巴塞尔))；西罗莫司(例如但不限于雷帕霉素、RAPAMUNE® (Wyeth, LLC, Madison, NJ))；他克莫司(例如但不限于FK506、FR-900506、PROGRAF® (Astellas Pharma Inc., 日本东京))；和环孢菌素(例如但不限于，环孢菌素A、环孢菌素B、环孢菌素C、环孢菌素D、环孢菌素E、环孢菌素F、环孢菌素G、环孢菌素H、环孢菌素I和环孢菌素L)。然而，应当理解，本公开不限于仅与半抗原一起使用，并且更大的分析物(诸如但不限于蛋白分析物)也可以通过本文公开的免疫测定法检测。
可以根据本公开利用本领域已知的用于自动化诊断免疫测定中的任何类型的颗粒。在某些非限制性实施方案中，所述颗粒应具有至少约0.02微米且不超过约100微米的平均直径。在一些实施方案中，所述颗粒具有约0.05微米至约20微米，或约0.3微米至约10微米的平均直径。所述颗粒可以是有机的或无机的、可溶胀的或不可溶胀的、和多孔的或无孔的。在一个具体(但非限制性)实施方案中，所述颗粒具有接近水的密度，通常为约0.7g/mL至约1.5g/mL，并且由可以是透明、部分透明或不透明的材料构成。所述颗粒可以由有机和无机聚合物、乳胶颗粒、磁性或非磁性颗粒等构成。在一些非限制性实例中，所述颗粒是铬颗粒或乳胶颗粒。
所述聚合物颗粒可以由加成或缩合聚合物形成。所述颗粒还可以源自天然存在的材料、合成改性的天然存在的材料和合成材料。尤其感兴趣的有机聚合物是多糖，特别是交联多糖，诸如(但不限于)琼脂糖，其可作为Sepharose获得；葡聚糖，其可用作Sephadex和Sephacryl获得；纤维素；淀粉；等；加成聚合物，诸如聚苯乙烯、聚乙烯醇、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的衍生物(特别是(但不限于)具有游离羟基官能团的酯和酰胺等)的均聚物和共聚物。
所述颗粒将易于分散于水性介质中并且可以是吸附性的或可官能化的，从而允许直接或通过连接基团间接缀合至免疫抑制剂药物的两种单克隆抗体。当利用连接基团时，在一些非限制性实施方案中，所述连接基团可以包含约2至约50个原子，或4至约30个原子，不计氢且可以包含2至约30个原子或3至约20个原子的链，所述原子各自独立地选自通常由碳、氧、硫、氮和磷组成的组。部分或全部连接基团可以是与免疫抑制剂化合物连接的分子的一部分，诸如但不限于例如聚(氨基酸)上的氨基酸残基。在一些实例中，所述连接基团包含肟官能团。
所述连接基团中杂原子的数目可以在0至约20或1至约15或约2至约10的范围内。所述连接基团可以是脂族或芳族的。当存在杂原子时，氧通常作为与碳、硫、氮或磷键合的氧代(oxo)或氧基(oxy)存在，氮通常作为通常与碳、氧、硫或磷键合的硝基、亚硝基或氨基存在；硫类似于氧；而磷与碳、硫、氧或氮键合，通常作为膦酸和磷酸单酯或二酯。在连接基团和待缀合分子之间形成共价键中的常见官能团是烷基胺、脒、硫代酰胺、醚、尿素、硫脲、胍、偶氮、硫醚和羧酸酯、磺酸酯和磷酸酯、酰胺和硫酯。包含杂原子的连接基团的一个具体实施方案是如上所提及的肟官能团。
对于大部分，当连接基团具有连接官能团(与部分反应的官能团)诸如例如包括氮和硫类似物的非氧代羰基、磷酸酯基团、氨基、烷基化剂诸如卤代或甲苯磺酰基烷基、氧基(羟基或硫类似物、巯基)、氧代羰基(例如醛或酮)或活性烯烃(诸如乙烯基砜或α-、β-不饱和酯，这些官能团连接至胺基、羧基、活性烯烃、烷基化剂，例如溴乙酰基。在连接胺和羧酸或其氮衍生物或磷酸的情况下，形成酰胺、脒和磷酰胺。在连接硫醇和活化烯烃的情况下，形成硫醚。在连接硫醇和烷基化剂的情况下，形成硫醚。在还原条件下连接醛和胺的情况下，形成烷基胺。在连接酮或醛和羟胺(包括其衍生物，其中取代基替代羟基的氢)的情况下，形成肟官能团(=N-O-)。在连接羧酸或磷酸和醇的情况下，形成酯。各种连接基团是本领域众所周知的；参见，例如，Cautrecasas (J. Biol. Chem. (1970) 245:3059)。
在诊断免疫测定试剂的一个具体(但非限制性)实施方案中，所述颗粒是乳胶颗粒。在诊断免疫测定试剂的另一个具体(但非限制性)实施方案中，第一和第二抗体或其片段各自经由连接基团附接至颗粒。
本领域已知或本领域普通技术人员另外可考虑的针对待通过免疫测定方法检测的分析物/半抗原/药物的任何抗体或其片段都落入本公开的范围内。在一个具体(但非限制性)实例中，诊断免疫测定试剂中利用的每种抗体或其片段是针对他克莫司的单克隆抗体，诸如(但不限于)先前在美国专利号8,586,322中公开的14H04或1E2单克隆抗体克隆；或针对与14H04相同的免疫原产生的1H06克隆。'322专利为这两种抗体克隆提供了以下定义：(a)单克隆抗体，其特异性结合他克莫司的基本上由包括甲氧基和羟基取代基的C29-C34环和包括甲氧基取代基的C15组成的部分(即，表位)(克隆14H04)；(b)单克隆抗体，其特异性结合他克莫司的基本上由C10-C14环的甲氧基和包括C22酮氧的C1-C26环的C19-C27组成的部分(即，表位)(克隆1E2)；(c)针对免疫原产生的单克隆抗体，所述免疫原包含与他克莫司在C22处连接的免疫原性载体(克隆14H04和1H06)；(d)针对免疫原产生的单克隆抗体，所述免疫原包含与他克莫司在C24处连接的免疫原性载体(克隆1E2)；(e)针对免疫原产生的单克隆抗体，所述免疫原包含与他克莫司在C32处连接的免疫原性载体(克隆1E2)；和(f)针对免疫原产生的单克隆抗体，所述免疫原包含与他克莫司在C24和C32处连接的免疫原性载体(克隆1E2)。
1H06克隆是针对含有经由22位的肟偶联的FK的免疫原产生的，并且需要C-22偶联的类似物。该单克隆抗体具有良好的交叉反应性模式，并且在LOCI测定中具有KD < 3*10-9的确定亲和力。
在另一个具体(但非限制性)实施方案中，该测定中利用的抗体是针对西罗莫司的单克隆抗体。其非限制性实例包括IgG2aK克隆，其免疫原在位置C-32；和克隆3H9 (IgG1λ)和165 (IgG2aK)，其为针对包含C26 & C32混合物的免疫原产生的。因此，可根据本公开利用的单克隆抗体的其他非限制性实例包括(g)针对免疫原产生的单克隆抗体，所述免疫原包含与西罗莫司在C32处连接的免疫原性载体；和(h)针对包含与西罗莫司在C26处连接的免疫原性载体的免疫原和包含与西罗莫司在C32处连接的免疫原性载体的免疫原的混合物产生的单克隆抗体。
本公开的某些非限制性实施方案还涉及经由分析物/半抗原分子通过颗粒间桥接形成的颗粒的聚集体。这些颗粒聚集体包括：(A)分析物/半抗原；(B)与颗粒附接的第一抗体或其片段，其中所述第一抗体或其片段与所述分析物/半抗原的部分(即，表位)特异性结合；和(C)第二抗体或其片段，其中所述第二抗体或其片段特异性结合所述分析物/半抗原的部分(即，表位)，其不同于所述第一抗体或其片段结合的分析物/半抗原的部分/表位。此外，(B)和(C)与(A)的结合导致颗粒增强的凝集。
分析物/半抗原和颗粒的聚集体的颗粒可以分别是本文描述或以其他方式考虑的任何分析物/半抗原和颗粒。此外，第一和第二抗体或其片段各自可以是本文描述或以其他方式考虑的任何抗体或其片段。
(C)的第二抗体或其片段可以以其“游离”形式存在(即，其中抗体/片段不直接附接至颗粒)，且因此，可能需要两种诊断免疫测定试剂来形成颗粒的聚集体。或者，第二抗体或其片段可以在与(A)和(B)组合之前附接至颗粒；在该实施方案中，如下所述，可能需要一种或两种诊断免疫测定试剂来形成颗粒的聚集体。当第二抗体/片段附接至颗粒时，(C)的颗粒可以是与(B)类型相同的颗粒，或(C)的颗粒可以与(B)的颗粒不同。此外，聚集体的试剂(B)和/或(C)中利用的颗粒可以提供有与之附接的第一和第二抗体或其片段。例如，试剂(B)和(C)可以相同，且因此，仅需要一种类型的诊断免疫测定试剂来形成颗粒的聚集体(其中两个拷贝的相同诊断免疫测定试剂附接至分析物/半抗原的不同部分/表位)。或者，试剂(B)和/或(C)中利用的颗粒可能仅含有(B)或(C)中列出的抗体/其片段，且因此，需要两种不同的诊断免疫测定试剂来形成颗粒的聚集体。
本公开的某些非限制性实施方案还涉及用于检测样品中分析物(诸如但不限于半抗原)的存在的试剂盒。所述试剂盒包含一种或多种如本文所公开或以其他方式考虑的任何诊断免疫测定试剂。例如(但不通过限制的方式)，所述试剂盒包含至少一种诊断免疫测定试剂，其包括：(1)颗粒；(2)附接至(1)的颗粒的第一抗体或其片段；和(3)第二抗体或其片段；其中第一和第二抗体或其片段特异性结合所述样品中存在的分析物/半抗原的不同表位，由此导致颗粒增强的凝集。当(3)附接至(1)时，所述试剂盒将仅包括单一诊断免疫测定试剂，其中(2)和(3)均附接至(1)。当(3)不附接至(1)时，则所述试剂盒将包括两种诊断免疫测定试剂(一种含有(1)和(2)，且另一种含有(3))；在该实施方案中，(3)可以以其游离形式(即，不直接附接至颗粒)存在于所述第二诊断免疫测定试剂中，或者其可以附接至不同的颗粒。
在某些非限制性实施方案中，本公开的试剂盒进一步包含预处理试剂。所述预处理试剂可以包含至少一种置换剂/结合竞争剂或表面活性剂，其发挥功能以从其内源性结合蛋白释放分析物/半抗原，如下文详细描述。
免疫亲和素(immunophilin)-结合药物的治疗药物监测(TDM)特别困难，因为生物样品中内源性存在的免疫亲和素的结合将干扰测定。一种用于试图克服这种干扰的方法是添加一种物质，其通过将药物从其内源性结合蛋白置换出来而充当“置换剂”。置换剂的非限制性实例可以在美国专利号6,187,547(其公开了使用这些具有相似化学结构的免疫抑制药物(ISD)来置换另一种ISD(即，使用西罗莫司来置换他克莫司，且反之亦然))；和美国专利号7,186,518(其公开了使用多种FK506(他克莫司)衍生物来将FK506从其内源性结合蛋白置换出来)中找到。
此外，近来提交的美国申请号62/754,913 (2018年11月2日提交)公开了结合竞争剂，其用于将半抗原/药物从其内源性结合蛋白/免疫亲和素复合物置换出来并且不显著结合免疫测定中利用的第一和第二抗体或其片段。因此，本公开的预处理试剂可以具体包括'913申请中公开的任何结合竞争剂。
例如(但不限于)，当待检测的半抗原是他克莫司时，所述预处理试剂可以包括西罗莫司或依维莫司。或者，当待检测的半抗原是西罗莫司或依维莫司时，所述预处理试剂可以包含至少一种选自由下式IV、V、VI和VII代表的化合物的结合竞争剂。
Figure 93762DEST_PATH_IMAGE004
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所述组合物/试剂盒/方法的测定组分/试剂可以以允许它们根据本公开发挥功能的任何形式提供。例如，但不限于，每种试剂可以以液体形式提供并且以散装和/或单等分试样的形式布置在试剂盒内。或者，在一个具体(但非限制性)实施方案中，一种或多种试剂可以以单等分试样冻干试剂的形式布置在试剂盒中。微流体装置中干燥试剂的使用详细描述于美国专利号9,244,085(Samproni)中，其全部内容在此通过引用明确并入本文。
除了上文详述的测定组分/试剂，所述试剂盒可以进一步含有用于进行本文描述或以其他方式考虑的任何特定测定的其他试剂。这些额外的试剂的性质将取决于特定的测定形式，并且其鉴定完全在本领域普通技术人员的技能范围内；因此，对其进行进一步描述被认为是不必要的。此外，试剂盒中存在的组分/试剂可以各自在分开的容器/隔室中，或者各种组分/试剂可以组合在一个或多个容器/隔室中，这取决于组分/试剂的交叉反应性和稳定性。此外，所述试剂盒可以包括其中布置组分/试剂的微流体装置。
所述试剂盒中的各种组分/试剂的相对量可以广泛变化，以提供组分/试剂的浓度，其实质上优化测定方法期间需要发生的反应，并且进一步实质上优化测定的灵敏度。在适当的情况下，所述试剂盒中的一种或多种组分/试剂可以作为干燥粉末、诸如冻干粉末提供，并且所述试剂盒可以进一步包括用于溶解干燥试剂的赋形剂；以此方式，可以从这些组分获得用于进行根据本公开的方法或测定的具有适当浓度的试剂溶液。试剂盒中也可包含阳性和/或阴性对照。另外，所述试剂盒可以进一步包括一组解释如何使用试剂盒的书面说明书。这种性质的试剂盒可以在本文所述或以其他方式考虑的任何方法中使用。
本公开的某些非限制性实施方案进一步涉及检测样品中分析物(诸如但不限于半抗原)的存在的方法。所述方法包括以下步骤：(i)将所述样品暴露于本文公开或以其他方式考虑的任何预处理试剂以从内源性结合蛋白释放分析物/半抗原并提供预处理的样品；(ii)将(i)中形成的预处理样品与本文公开或以其他方式考虑的一种或多种诊断免疫测定试剂中的任一种混合以形成混合物；(iii)在所述诊断免疫测定试剂与所述样品中存在的分析物/半抗原结合的条件下孵育(ii)中形成的混合物，由此导致颗粒增强的凝集；和(iv)检测孵育混合物中存在的颗粒增强的凝集的水平，并将颗粒增强的凝集的水平与所述样品中存在的分析物/半抗原的水平关联。
在一个具体(但非限制性)实施方案中，在步骤(ii)中仅提供单一类型的诊断免疫测定试剂，并且该试剂含有附接至单一颗粒的第一和第二抗体/片段，如上文所述。在该方法中，两个拷贝的相同诊断免疫测定试剂附接至分析物/半抗原的不同部分/表位以形成引起凝集的颗粒的聚集体。
或者，在步骤(ii)中提供两种类型的诊断免疫测定试剂：第一试剂包括附接至颗粒的第一抗体/片段，且第二试剂包括其游离形式(即，不直接附接至颗粒)或附接至颗粒的第二抗体/片段。在该实施方案中，两种不同的诊断免疫测定试剂必须结合单一分析物/半抗原以形成颗粒的聚集体。所述方法的该实施方案包括以下步骤：(i)将所述样品暴露于预处理试剂(如本文所述或以其他方式考虑)以从内源性结合蛋白释放分析物/半抗原并提供预处理的样品；(ii)将(i)中形成的预处理样品与两种诊断免疫测定试剂混合以形成混合物，其中第一诊断免疫测定试剂包含具有与之附接的第一抗体或其片段的第一颗粒，且第二诊断免疫测定试剂包含第二抗体或其片段(以其游离形式或附接至颗粒)，其中所述第一抗体或其片段特异性结合所述分析物/半抗原的部分/表位，其不同于所述第二抗体或其片段特异性结合的分析物/半抗原的部分/表位(且其中第一和第二抗体/片段和颗粒分别是本文描述或以其他方式考虑的任何抗体/片段或颗粒)；(iii)在两种诊断免疫测定试剂与所述样品中存在的分析物/半抗原结合的条件下孵育(ii)中形成的混合物，由此导致颗粒增强的凝集；和(iv)检测孵育混合物中存在的颗粒增强的凝集的水平，并将颗粒增强的凝集的水平与所述样品中存在的分析物/半抗原的水平关联。
本领域已知或本领域普通技术人员另外可考虑的任何检测凝集的方法都落入本公开的范围并且可以与本文公开或以其他方式考虑的任何方法一起使用。在某些非限制性实施方案中，凝集可以通过本领域众所周知的方法通过比浊法或金属计量法检测。
在具体(但非限制性)实施方案中，颗粒增强凝集免疫测定涉及散射光强度的测量和吸光度的测量。在颗粒增强凝集免疫测定中进行的分析步骤的非限制性实例描述于例如美国专利申请公开号2019/0154674中。具体而言，'674公开教导了这些步骤可以包括：将含有分析物的样品与携带分析物的结合配偶体的不溶性载体颗粒混合以制备混合溶液；基于第一和第二时间点之间散射光强度的差异确定从混合溶液散射的光强度的变化(i)；基于第三和第四时间点之间吸光度的差异确定混合溶液的吸光度的变化(ii)；和使用基于散射光强度的变化绘制的校准曲线和基于吸光度的变化绘制的校准曲线，将确定的散射光强度的变化(i)和确定的吸光度的变化(ii)与所述样品中存在的分析物的量关联。
然而，本公开不限于上文提供的任何实例；本领域已知或本领域普通技术人员另外可考虑的可用于在自动化环境中进行颗粒增强凝集免疫测定的任何其他分析步骤组也落入本公开的范围内。
实施例
下文提供了实施例。然而，应理解本公开的应用不限于本文公开的具体实验、结果和实验室程序。反而，所述实施例仅作为各个实施方案之一提供，并且仅意在是示例性的，而非穷举性的。
诊断免疫测定试剂的制备
存在使用两种抗半抗原抗体(仅用于举例说明的目的，在本实施例中使用两种抗FK506抗体)用抗体包被乳胶颗粒的三种可能方式。首先，制备两种乳胶颗粒制剂：一种是用1E2包被的乳胶颗粒，且另一种是用14H04包被的乳胶颗粒。其次，乳胶颗粒用1E2或14H04包被，且第二抗体保持其游离形式。第三，乳胶颗粒用1E2和14H04的混合物包被。两种制备方法都可以以类似的方式用于测定中，但在下面的测定中仅使用用14H04和1E2混合物包被的乳胶颗粒。
使用颗粒增强的凝集的免疫测定形式
测定序列包括以下步骤：(a)将全血样品与预处理试剂混合；(b)将如上产生的乳胶颗粒添加至混合物中并孵育；和(c)检测药物信号。
步骤(a)中使用的预处理试剂含有置换剂/表面活性剂，目的是从内源性结合蛋白释放FK506药物。在步骤(b)中添加乳胶颗粒后，在该过程中让反应混合物孵育，且然后在步骤(c)中读取读数以检测颗粒凝集。
因此，根据本公开，已经提供了完全满足上文所述的目的和优点的组合物、试剂盒和装置以及其产生和使用方法。尽管已经结合上文阐述的具体附图、实验、结果和语言描述了本公开，但显然，许多替代、修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，意欲涵盖落入本公开的精神和广泛范围内的所有此类替代、修改和变化。

Claims (28)

1.诊断免疫测定试剂，其包含：
颗粒；
附接至所述颗粒的第一抗体或其片段；和
附接至所述颗粒的第二抗体或其片段；
其中所述第一抗体或其片段特异性结合分析物的部分，其不同于所述第二抗体或其片段特异性结合的分析物的部分，由此半抗原与所述诊断免疫测定试剂的结合导致用于信号检测的颗粒增强的凝集。
2.权利要求1的诊断免疫测定试剂，其中所述分析物是半抗原。
3.权利要求2的诊断免疫测定试剂，其中所述半抗原选自他克莫司、依维莫司、西罗莫司和环孢菌素。
4.权利要求1的诊断免疫测定试剂，其中所述颗粒是乳胶颗粒。
5.权利要求1的诊断免疫测定试剂，其中所述第一和第二抗体或其片段各自选自：
(a) 单克隆抗体或其片段，其特异性结合他克莫司的基本上由包括甲氧基和羟基取代基的C29-C34环和包括甲氧基取代基的C15组成的部分；
(b) 单克隆抗体或其片段，其特异性结合他克莫司的基本上由C10-C14环的甲氧基和包括C22酮氧的C1-C26环的C19-C27组成的部分；
(c) 针对免疫原产生的单克隆抗体或其片段，所述免疫原包含与他克莫司在C22处连接的免疫原性载体；
(d) 针对免疫原产生的单克隆抗体或其片段，所述免疫原包含与他克莫司在C24处连接的免疫原性载体；
(e) 针对免疫原产生的单克隆抗体或其片段，所述免疫原包含与他克莫司在C32处连接的免疫原性载体；
(f) 针对免疫原产生的单克隆抗体或其片段，所述免疫原包含与他克莫司在C24和C32处连接的免疫原性载体；
(g) 针对免疫原产生的单克隆抗体或其片段，所述免疫原包含与西罗莫司在C32处连接的免疫原性载体；和
(h) 针对包含与西罗莫司在C26处连接的免疫原性载体的免疫原和包含与西罗莫司在C32处连接的免疫原性载体的免疫原的混合物产生的单克隆抗体或其片段。
6.颗粒聚集体，其包含：
(A) 半抗原；
(B) 与颗粒附接的第一抗体或其片段，其中所述第一抗体或其片段与所述半抗原的部分特异性结合；和
(C) 第二抗体或其片段，其中所述第二抗体或其片段特异性结合所述半抗原的部分，其不同于所述第一抗体或其片段结合的半抗原的部分；且
其中(B)和(C)与(A)的结合导致颗粒增强的凝集。
7.权利要求6的颗粒聚集体，其中所述第二抗体或其片段不直接附接至颗粒。
8.权利要求6的颗粒聚集体，其中所述第二抗体或其片段附接至颗粒。
9.权利要求8的颗粒聚集体，其中所述第二抗体或其片段附接至(B)的颗粒。
10.权利要求6的颗粒聚集体，其中所述半抗原选自他克莫司、依维莫司、西罗莫司和环孢菌素。
11.权利要求6的颗粒聚集体，其中所述颗粒是乳胶颗粒。
12.权利要求6的颗粒聚集体，其中所述第一和第二抗体或其片段各自选自：
(a) 单克隆抗体或其片段，其特异性结合他克莫司的基本上由包括甲氧基和羟基取代基的C29-C34环和包括甲氧基取代基的C15组成的部分；
(b) 单克隆抗体或其片段，其特异性结合他克莫司的基本上由C10-C14环的甲氧基和包括C22酮氧的C1-C26环的C19-C27组成的部分；
(c) 针对免疫原产生的单克隆抗体或其片段，所述免疫原包含与他克莫司在C22处连接的免疫原性载体；
(d) 针对免疫原产生的单克隆抗体或其片段，所述免疫原包含与他克莫司在C24处连接的免疫原性载体；
(e) 针对免疫原产生的单克隆抗体或其片段，所述免疫原包含与他克莫司在C32处连接的免疫原性载体；
(f) 针对免疫原产生的单克隆抗体或其片段，所述免疫原包含与他克莫司在C24和C32处连接的免疫原性载体；
(g) 针对免疫原产生的单克隆抗体或其片段，所述免疫原包含与西罗莫司在C32处连接的免疫原性载体；和
(h) 针对包含与西罗莫司在C26处连接的免疫原性载体的免疫原和包含与西罗莫司在C32处连接的免疫原性载体的免疫原的混合物产生的单克隆抗体或其片段。
13.用于诊断免疫测定的试剂盒，所述试剂盒包含：
至少一种诊断免疫测定试剂，其包含：
(1) 颗粒；
(2) 附接至(1)的颗粒的第一抗体或其片段；和
(3) 第二抗体或其片段；且
其中第一和第二抗体或其片段特异性结合存在于样品中的半抗原的不同表位，由此导致颗粒增强的凝集；和
预处理试剂，其包含置换剂，用于从内源性结合蛋白释放所述半抗原。
14.权利要求13的试剂盒，其中(3)不直接附接至颗粒。
15.权利要求13的试剂盒，其中(3)附接至(1)。
16.权利要求13的试剂盒，其中所述半抗原选自他克莫司、依维莫司、西罗莫司和环孢菌素。
17.权利要求13的试剂盒，其中所述诊断免疫测定试剂的颗粒是乳胶颗粒。
18.权利要求13的试剂盒，其中所述第一和第二抗体或其片段各自选自：
(a) 单克隆抗体或其片段，其特异性结合他克莫司的基本上由包括甲氧基和羟基取代基的C29-C34环和包括甲氧基取代基的C15组成的部分；
(b) 单克隆抗体或其片段，其特异性结合他克莫司的基本上由C10-C14环的甲氧基和包括C22酮氧的C1-C26环的C19-C27组成的部分；
(c) 针对免疫原产生的单克隆抗体或其片段，所述免疫原包含与他克莫司在C22处连接的免疫原性载体；
(d) 针对免疫原产生的单克隆抗体或其片段，所述免疫原包含与他克莫司在C24处连接的免疫原性载体；
(e) 针对免疫原产生的单克隆抗体或其片段，所述免疫原包含与他克莫司在C32处连接的免疫原性载体；
(f) 针对免疫原产生的单克隆抗体或其片段，所述免疫原包含与他克莫司在C24和C32处连接的免疫原性载体；
(g) 针对免疫原产生的单克隆抗体或其片段，所述免疫原包含与西罗莫司在C32处连接的免疫原性载体；和
(h) 针对包含与西罗莫司在C26处连接的免疫原性载体的免疫原和包含与西罗莫司在C32处连接的免疫原性载体的免疫原的混合物产生的单克隆抗体或其片段。
19.权利要求13的试剂盒，其中所述预处理试剂包含至少一种结合竞争剂，其将半抗原从其内源性结合蛋白置换出来，其中所述结合竞争剂是以下中的至少一种：
(a) 西罗莫司；
(b) 依维莫司；
(c) 由式IV代表的化合物：
Figure 15286DEST_PATH_IMAGE001
(d) 由式V代表的化合物：
Figure 949744DEST_PATH_IMAGE002
(e) 由式VI代表的化合物：
Figure 208687DEST_PATH_IMAGE003
或
(f) 由式VII代表的化合物：
Figure 103962DEST_PATH_IMAGE004
。
20.检测样品中半抗原的存在的方法，所述方法包括以下步骤：
(i) 将所述样品暴露于预处理试剂以从内源性结合蛋白释放所述半抗原并提供预处理的样品；
(ii) 将(i)中形成的预处理样品与至少一种诊断免疫测定试剂混合以形成混合物，其中所述至少一种诊断免疫测定试剂包含颗粒、附接至所述颗粒的第一抗体或其片段和第二抗体或其片段，其中所述第一抗体或其片段特异性结合半抗原的部分，其不同于所述第二抗体或其片段特异性结合的半抗原的部分；
(iii) 在至少一种诊断免疫测定试剂与所述样品中存在的半抗原结合的条件下孵育(ii)中形成的混合物，由此导致颗粒增强的凝集；和
(iv) 检测孵育混合物中存在的颗粒增强的凝集的水平，并将颗粒增强的凝集的水平与所述样品中存在的半抗原的水平关联。
21.权利要求20的方法，其中所述至少一种诊断免疫测定试剂中存在的第二抗体或其片段不直接附接至颗粒。
22.权利要求20的方法，其中所述至少一种诊断免疫测定试剂中存在的第二抗体或其片段附接至颗粒。
23.权利要求20的方法，其中所述至少一种诊断免疫测定试剂中存在的第一和第二抗体或其片段附接至相同颗粒。
24.权利要求20的方法，其中所述半抗原选自他克莫司、依维莫司、西罗莫司和环孢菌素。
25.权利要求20的方法，其中所述至少一种诊断免疫测定试剂的颗粒是乳胶颗粒。
26.权利要求20的方法，其中所述至少一种诊断免疫测定试剂的第一和第二抗体或其片段各自选自：
(a) 单克隆抗体或其片段，其特异性结合他克莫司的基本上由包括甲氧基和羟基取代基的C29-C34环和包括甲氧基取代基的C15组成的部分；
(b) 单克隆抗体或其片段，其特异性结合他克莫司的基本上由C10-C14环的甲氧基和包括C22酮氧的C1-C26环的C19-C27组成的部分；
(c) 针对免疫原产生的单克隆抗体或其片段，所述免疫原包含与他克莫司在C22处连接的免疫原性载体；
(d) 针对免疫原产生的单克隆抗体或其片段，所述免疫原包含与他克莫司在C24处连接的免疫原性载体；
(e) 针对免疫原产生的单克隆抗体或其片段，所述免疫原包含与他克莫司在C32处连接的免疫原性载体；
(f) 针对免疫原产生的单克隆抗体或其片段，所述免疫原包含与他克莫司在C24和C32处连接的免疫原性载体；
(g) 针对免疫原产生的单克隆抗体或其片段，所述免疫原包含与西罗莫司在C32处连接的免疫原性载体；和
(h) 针对包含与西罗莫司在C26处连接的免疫原性载体的免疫原和包含与西罗莫司在C32处连接的免疫原性载体的免疫原的混合物产生的单克隆抗体或其片段。
27.权利要求20的方法，其中所述预处理试剂包含结合竞争剂，其将半抗原从其内源性结合蛋白置换出来，其中所述结合竞争剂是以下中的至少一种：
(a) 西罗莫司；
(b) 依维莫司；
(c) 由式IV代表的化合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
(d) 由式V代表的化合物：
Figure 372132DEST_PATH_IMAGE006
(e) 由式VI代表的化合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE007
或
(f) 由式VII代表的化合物：
Figure 551310DEST_PATH_IMAGE008
。
28.检测样品中分析物的存在的方法，所述方法包括以下步骤：
(i) 将所述样品暴露于预处理试剂以从内源性结合蛋白释放所述分析物并提供预处理的样品；
(ii) 将(i)中形成的预处理样品与至少一种诊断免疫测定试剂混合以形成混合物，其中所述至少一种诊断免疫测定试剂包含颗粒、附接至所述颗粒的第一抗体或其片段和第二抗体或其片段，其中所述第一抗体或其片段特异性结合分析物的部分，其不同于所述第二抗体或其片段特异性结合的分析物的部分，且其中：
(a) 所述至少一种诊断免疫测定试剂中存在的第二抗体或其片段不直接附接至颗粒；或
(b) 所述至少一种诊断免疫测定试剂中存在的第一和第二抗体或其片段附接至相同颗粒；
(iii) 在至少一种诊断免疫测定试剂与所述样品中存在的半抗原结合的条件下孵育(ii)中形成的混合物，由此导致颗粒增强的凝集；和
(iv) 检测孵育混合物中存在的颗粒增强的凝集的水平，并将颗粒增强的凝集的水平与所述样品中存在的半抗原的水平关联。
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