ES2863624T3 - Ensayo en sándwich para moléculas pequeñas - Google Patents

Abstract

Un método para determinar la presencia y/o cantidad de una molécula pequeña que tiene un peso molecular de aproximadamente 500 a aproximadamente 2500, siendo dicha molécula pequeña un fármaco inmunosupresor que comprende un anillo de 15 a 50 miembros, en una muestra que se sospecha que contiene la molécula pequeña, en donde el fármaco inmunosupresor es sirolimus, comprendiendo el método: (a) proporcionar en combinación en un medio: (i) la muestra, (ii) un primer asociado de unión que se une a y es específico para una primera porción de la molécula pequeña, en donde el primer asociado de unión es un anticuerpo monoclonal que no exhibe sustancialmente ninguna afinidad de unión por tacrolimus, y (iii) un segundo asociado de unión que se une a la molécula pequeña en una segunda porción de la molécula pequeña distinta de la primera, en donde el segundo asociado de unión se prepara a partir de un inmunógeno que comprende un hapteno que no es la molécula pequeña o un derivado de la molécula pequeña en donde el hapteno comprende una unidad estructural que es estructuralmente similar a la de la segunda porción de la molécula pequeña, en donde tanto el primer asociado de unión como el segundo asociado de unión son anticuerpos monoclonales, y en donde el segundo anticuerpo monoclonal es un anticuerpo anti-tacrolimus y se prepara y selecciona para la unión tanto de tacrolimus como de sirolimus. (b) incubar el medio bajo condiciones para la unión del primer asociado de unión y el segundo asociado de unión a la molécula pequeña, y (c) examinar el medio para detectar la presencia de un inmunocomplejo que comprende la molécula pequeña, el primer asociado de unión y el segundo asociado de unión, la presencia y/o la cantidad del inmunocomplejo que indica la presencia y/o la cantidad de la molécula pequeña en la muestra.

Description

DESCRIPCIÓN

Ensayo en sándwich para moléculas pequeñas

Antecedentes

La invención se refiere a compuestos, métodos y kits para la determinación de moléculas pequeñas, en muestras, tales como muestras de pacientes, que se sabe o se sospecha que contienen una o más de dichas moléculas pequeñas. En algunos aspectos, la invención se refiere a ensayos en sándwich para moléculas pequeñas tales como, por ejemplo, fármacos inmunosupresores.

El cuerpo se basa en un complejo sistema de respuesta inmune para distinguir lo propio de lo ajeno. A veces, el sistema inmunológico del cuerpo debe controlarse para aumentar una respuesta deficiente o suprimir una respuesta excesiva. Por ejemplo, cuando se trasplantan órganos como riñón, corazón, corazón-pulmón, médula ósea e hígado en seres humanos, el cuerpo a menudo rechazará el tejido trasplantado mediante un proceso denominado rechazo de aloinjerto.

En el tratamiento del rechazo de aloinjertos, el sistema inmunológico se suprime frecuentemente de una manera controlada con terapia con fármacos. Los medicamentos inmunosupresores son medicamentos terapéuticos que se administran con cuidado a los receptores de trasplantes para ayudar a prevenir el rechazo del aloinjerto de tejido no propio. Los fármacos inmunosupresores pueden clasificarse como sigue: glucocorticoides, citostáticos, anticuerpos, fármacos que actúan sobre inmunofilinas y otros fármacos tales como interferones, opiáceos, proteínas de unión a INF, micofenolato, FTY720 y similares. Una clase particular de fármacos inmunosupresores comprende aquellos fármacos que actúan sobre las inmunofilinas. Las inmunofilinas son un ejemplo de proteínas de unión específicas de alta afinidad que tienen importancia fisiológica. Actualmente se conocen dos familias distintas de inmunofilinas: ciclofilinas y macrofilinas, la última de las cuales se une específicamente, por ejemplo, a tacrolimus o sirolimus.

Los dos fármacos inmunosupresores administrados más comúnmente para prevenir el rechazo de órganos en pacientes trasplantados son ciclosporina (CSA) y FK-506 (FK o tacrolimus). Otro fármaco que se utiliza como inmunosupresor en los Estados Unidos y otros países es el sirolimus, también conocido como rapamicina. Los derivados de sirolimus también son útiles como inmunosupresores. Dichos derivados incluyen, por ejemplo, everolimus y similares.

Los efectos secundarios asociados con algunos fármacos inmunosupresores pueden controlarse en parte controlando cuidadosamente el nivel del fármaco presente en un paciente. Se requiere la monitorización terapéutica de las concentraciones de fármacos inmunosupresores y fármacos relacionados en sangre para optimizar los regímenes de dosificación y asegurar una inmunosupresión máxima con una toxicidad mínima. Aunque los fármacos inmunosupresores son agentes inmunosupresores muy eficaces, su uso debe manejarse con cuidado porque el rango de dosis eficaz suele ser estrecho y una dosis excesiva puede provocar efectos secundarios graves. Por otro lado, una dosis muy pequeña de un inmunosupresor puede provocar el rechazo de los tejidos. Debido a que la distribución y el metabolismo de un fármaco inmunosupresor pueden variar mucho entre pacientes y debido a una amplia gama y gravedad de reacciones adversas, es esencial una monitorización precisa del nivel del fármaco. Los ensayos para controlar con precisión el nivel de fármaco en pacientes están sujetos a reactividad cruzada con análogos de fármacos, como metabolitos, que interfieren con la medición precisa del nivel de fármaco en un paciente. El documento US 2006/099654, se refiere a un método para determinar sirolimus en una muestra, que comprende: proporcionar una preparación de anticuerpos que comprende uno o más anticuerpos generados usando un fragmento de sirolimus; poner en contacto la preparación de anticuerpos con la muestra; y detectar la unión entre uno o más anticuerpos y sirolimus. Un ensayo ejemplar es un inmunoensayo de canalización de oxígeno luminiscente (LOCI), que se puede realizar en formatos de inmunoensayo de tipo sándwich y competitivo.

Por tanto, existe una necesidad continua de desarrollar métodos de diagnóstico rápidos y precisos para medir los niveles de moléculas pequeñas tales como, por ejemplo, fármacos inmunosupresores o derivados de los mismos en pacientes. Los métodos deben poder ser completamente automatizados y deben detectar selectivamente la molécula madre mientras se minimizan las inexactitudes resultantes de la reactividad cruzada de sus metabolitos o de los constituyentes en una muestra sospechosa de contener la molécula pequeña.

Resumen

Algunos ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento están dirigidos a métodos para determinar la presencia y/o cantidad de una molécula pequeña que tiene un peso molecular de aproximadamente 500 a aproximadamente 2,500 en una muestra que se sospecha que contiene la molécula pequeña, en los que la molécula pequeña es sirolimus. Una combinación que comprende la muestra, un primer asociado de unión que se une y es específico para una primera porción de la molécula pequeña, y un segundo asociado de unión, que se une a la molécula pequeña en una segunda porción de la molécula pequeña distinta de la primera porción, se forma en un medio. El primer asociado de unión es un anticuerpo monoclonal que no presenta sustancialmente ninguna afinidad de unión por tacrolimus. El segundo asociado de unión se prepara a partir de un inmunógeno que comprende un hapteno que no es la molécula pequeña ni un derivado de la molécula pequeña. El segundo anticuerpo monoclonal es un anticuerpo anti-tacrolimus y se prepara y selecciona para la unión de tacrolimus y sirolimus. El hapteno del inmunógeno comprende una unidad estructural que es estructuralmente similar al de la segunda porción de la molécula pequeña. El medio se incuba en condiciones para la unión de el primer asociado de unión y el segundo asociado de unión a la molécula pequeña. El medio se examina para detectar la presencia de un inmunocomplejo que comprende la molécula pequeña, el primer asociado de unión y el segundo asociado de unión, indicando la presencia y/o cantidad del inmunocomplejo la presencia y/o cantidad de la molécula pequeña en la muestra. La invención de acuerdo con los principios descritos en el presente documento está dirigida a métodos para determinar la presencia y/o cantidad de un fármaco inmunosupresor en una muestra que se sospecha que contiene el fármaco inmunosupresor. El método comprende proporcionar en combinación en un medio (i) la muestra, (ii) un primer anticuerpo que se une y es específico para una primera porción del fármaco inmunosupresor, y (iii) un segundo anticuerpo que se une al fármaco inmunosupresor en una segunda porción del fármaco inmunosupresor diferente de la primera porción, en donde el segundo asociado de unión se prepara a partir de un inmunógeno que comprende un hapteno que no es la molécula pequeña o un derivado de la molécula pequeña en donde el hapteno comprende una unidad estructural que es estructuralmente similar a la de la segunda porción de la molécula pequeña, en donde tanto el primer asociado de unión como el segundo asociado de unión son anticuerpos monoclonales, y en donde el segundo anticuerpo monoclonal es un anticuerpo anti-tacrolimus y se prepara y selecciona para la unión tanto de tacrolimus como de sirolimus.

El segundo anticuerpo se prepara a partir de un inmunógeno que comprende un hapteno que no es el fármaco inmunosupresor ni un derivado del mismo. El hapteno del inmunógeno comprende una unidad estructural que es estructuralmente similar a la de la segunda porción del fármaco inmunosupresor. El medio se incuba en condiciones para la unión del primer anticuerpo y el segundo anticuerpo al fármaco inmunosupresor. El medio se examina para detectar la presencia de un inmunocomplejo que comprende el fármaco inmunosupresor, el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo, indicando la presencia y/o la cantidad del inmunocomplejo la presencia y/o la cantidad del fármaco inmunosupresor en la muestra.

De acuerdo con los principios descritos en el presente documento, se describen métodos para determinar la presencia y/o la cantidad de un fármaco inmunosupresor, siendo dicho fármaco inmunosupresor sirolimus, en una muestra que se sospecha que contiene el fármaco inmunosupresor. Se forma una combinación en un medio en donde la combinación comprende la muestra, un primer anticuerpo monoclonal que se une y es específico para una primera porción del fármaco inmunosupresor, y un segundo anticuerpo monoclonal que se une al fármaco inmunosupresor en una segunda porción del fármaco inmunosupresor distinto de la primera porción, en donde el segundo anticuerpo monoclonal se prepara a partir de un inmunógeno que comprende tacrolimus o un derivado de tacrolimus. El medio se incuba en condiciones para la unión del primer anticuerpo monoclonal y el segundo anticuerpo monoclonal al fármaco inmunosupresor. El medio se examina para detectar la presencia de un inmunocomplejo que comprende el fármaco inmunosupresor, el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo, indicando la presencia y/o la cantidad del inmunocomplejo la presencia y/o la cantidad del fármaco inmunosupresor en la muestra.

Breve descripción de los dibujos

Los dibujos proporcionados en este documento no están a escala y se proporcionan con el propósito de facilitar la comprensión de ciertos ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento y se proporcionan a modo de ilustración y no como limitación del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

La Figura 1 es una fórmula química del sirolimus (I).

La figura 2 es una fórmula química para everolimus (II).

La Figura 3 es una fórmula química para tacrolimus (III).

La Figura 4 es la fórmula química de la Figura 1 con la numeración y representación de las porciones de la molécula contra las que se pueden preparar anticuerpos monoclonales de acuerdo con los principios descritos en este documento.

La Figura 5 es la fórmula química de la Figura 3 que representa una porción de la molécula de tacrolimus que es estructuralmente similar a la de una porción de sirolimus y everolimus.

La Figura 6 es un esquema de reacción para la preparación de derivados de oxima de sirolimus.

La Figura 7 es un esquema de reacción para la preparación de un inmunógeno a partir de un derivado de oxima de sirolimus de la Figura 6.

Descripción detallada de realizaciones específicas

Discusión General

Los presentes inventores han descubierto que se pueden diseñar asociados de unión, tales como anticuerpos, que se unan específicamente de forma simultánea a porciones separadas de moléculas pequeñas. Este descubrimiento es sorprendente porque las moléculas pequeñas son haptenos, que son moléculas relativamente pequeñas (peso molecular (daltons) menos de aproximadamente 2,500, o menos de aproximadamente 2,000, o menos de aproximadamente 1500, o menos de aproximadamente 1000) y no se considera que tengan más de un sitio al que puede unirse un anticuerpo. De acuerdo con los principios descritos en este documento, se pueden preparar al menos dos asociados de unión diferentes, que se unen a porciones separadas de una molécula pequeña al mismo tiempo. El primer asociado de unión se une y es específico para una primera porción de la molécula pequeña. El segundo asociado de unión se une a la molécula pequeña en una segunda porción de la molécula pequeña distinta de la primera, en donde el segundo asociado de unión se prepara a partir de un inmunógeno que comprende un hapteno que no es la molécula pequeña o un derivado de la molécula pequeña y donde el hapteno del inmunógeno comprende una unidad estructural que es estructuralmente similar al de la segunda porción de la molécula pequeña.

El término "molécula pequeña" se refiere a una molécula que tiene un peso molecular de aproximadamente 150 a aproximadamente 2,500, o aproximadamente 150 a aproximadamente 2,000, o aproximadamente 150 a aproximadamente 1.500, o aproximadamente 150 a aproximadamente 1.000, o aproximadamente 150 a aproximadamente 500, o aproximadamente 300 a aproximadamente 2,000, o aproximadamente 300 a aproximadamente 1,500, o aproximadamente 300 a aproximadamente 1,000, o aproximadamente 500 a aproximadamente 2,000, o aproximadamente 500 a aproximadamente 1,500, o aproximadamente 500 a aproximadamente 1,000, por ejemplo. En su mayor parte, las moléculas pequeñas no provocan una respuesta inmune por sí mismas.

La expresión "asociado de unión para una molécula pequeña" se refiere a una molécula que se une específicamente a la molécula pequeña y no se une en ningún grado significativo a otras sustancias que distorsionarían el análisis de la molécula pequeña. Además, el asociado de unión de la molécula pequeña se une específicamente a un cierto dominio de la molécula pequeña. La unión específica implica el reconocimiento específico de una de dos moléculas diferentes, o dos dominios diferentes de una molécula pequeña, por el otro en comparación con un reconocimiento sustancialmente menor de otras moléculas u otros dominios de una molécula pequeña. Por otro lado, la unión no específica implica la unión no covalente entre moléculas que es relativamente independiente de estructuras de superficie específicas. La unión no específica puede resultar de varios factores, incluidas las interacciones hidrófobas entre moléculas. Los asociados de unión pueden ser, pero no se limitan a, anticuerpos que incluyen anticuerpos monoclonales, receptores para moléculas con estructuras químicas similares, proteínas transportadoras de plasma tales como albúmina y lipoproteínas, por ejemplo.

La expresión "anticuerpo para una molécula pequeña" se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a la molécula pequeña y no se une en ningún grado significativo a otras sustancias que distorsionarían el análisis de la molécula pequeña. Además, el anticuerpo de la molécula pequeña se une específicamente a una determinada porción o dominio de la molécula pequeña.

Una molécula pequeña, a la que pueden aplicarse ejemplos de acuerdo con los principios descritos en el presente documento, tiene dominios de unión espacialmente separados para los anticuerpos. La molécula pequeña puede ser lineal o puede comprender uno o más anillos, por ejemplo, dos anillos o tres anillos o cuatro anillos o cinco anillos o más. Los dominios de unión en la molécula pequeña deben separarse de manera que dos asociados de unión diferentes puedan unirse simultáneamente a la molécula pequeña sin interferir con la unión entre sí para formar un complejo de tres miembros (o inmunocomplejo) en donde cada asociado de unión se una en cierta medida necesaria para que se forme un complejo suficientemente estable que comprenda los dos asociados de unión y la molécula pequeña. El complejo se considera suficientemente estable cuando el complejo permanece intacto durante un ensayo, de modo que el complejo puede detectarse y la cantidad del complejo refleja con precisión la cantidad de analito de molécula pequeña en una muestra. El complejo estable permite un ensayo preciso y sensible para el analito de molécula pequeña.

En algunos ejemplos, la molécula pequeña comprende al menos un anillo grande, que es un anillo de 15-50 miembros, o un anillo de 15-45 miembros, o un anillo de 15-40 miembros, o un anillo de 15-35 miembros, o un anillo de 15-30 miembros, o un anillo de 15-25 miembros, o un anillo de 15-20 miembros, o un anillo de 20-50 miembros, o un anillo de 20-45 miembros, o un anillo de 20-40 miembros, o un anillo de 20-35 miembros, o un anillo de 20-30 miembros, o un anillo de 20-25 miembros, o un anillo de 25-50 miembros, o un anillo de 25-45 miembros, o un anillo de 25-40 miembros, o un anillo de 25-35 anillo de miembros, o un anillo de 25-30 miembros, o un anillo de 30-50 miembros, o un anillo de 30-45 miembros, o un anillo de 30-40 miembros, por ejemplo. Los átomos que forman el anillo son principalmente carbono y también pueden incluir, pero no se limitan a, oxígeno, nitrógeno y azufre, por ejemplo. El anillo grande también puede comprender 1-5, o 1-4, o 1-3 o 1-2, o 2-5, o 2-4, o 2-3, anillos pequeños, que son anillos de 5-7 miembros o anillos de 5-6 miembros. Algunos de los átomos de los anillos pequeños pueden formar parte del anillo grande.

En algunos ejemplos, la molécula pequeña comprende una conformación tridimensional con uno o más grupos funcionales químicos únicos que permiten preparar diferentes asociados de unión donde al menos dos asociados de unión diferentes pueden acercarse y unirse a diferentes dominios de unión en la molécula pequeña sin interferir unos con otros. Los grupos funcionales químicos únicos incluyen, a modo de ilustración y no de limitación, dobles enlaces carbono-carbono, triples enlaces carbono-carbono, grupos carbonilo, grupos imina, grupos carboxilo, grupos hidroxilo, grupos amina, grupos amida, grupos éster y grupos éter, por ejemplo, y combinaciones de dos o más de los anteriores. Los grupos funcionales químicos pueden estar conjugados o no conjugados. El término "conjugado" se refiere a átomos contiguos que tienen orbitales p disponibles de manera que los electrones se pueden deslocalizar sobre los átomos contiguos. Los ejemplos de átomos conjugados incluyen, pero no se limitan a, uno, dos, tres, cuatro o cinco o más dobles enlaces carbono-carbono conjugados (grupos vinilo); uno, dos, tres, cuatro o cinco o más triples enlaces carbono-carbono conjugados; una combinación de uno, dos, tres, cuatro o cinco o más dobles enlaces carbonocarbono conjugados, triples enlaces carbono-carbono, grupos imina, grupos carbonilo y aniones, por ejemplo. En algunos ejemplos, los grupos funcionales químicos proporcionan una conformación espacial particular para la molécula pequeña.

En algunos ejemplos, la molécula pequeña es un macrólido. En algunos ejemplos, el macrólido es un fármaco inmunosupresor. El término "fármacos inmunosupresores" incluye aquellos que actúan sobre inmunofilina tales como, pero sin limitarse a, ciclosporina (incluyendo ciclosporina A, ciclosporina B, ciclosporina C, ciclosporina D, ciclosporina E, ciclosporina F, ciclosporina G, ciclosporina H, ciclosporina I), tacrolimus (FR-900506, FK506, PROGRAF®), sirolimus (rapamicina, RAPAMUNE®), y derivados de los anteriores tales como, pero sin limitarse a, Everolimus (RAD, CERTICAN®), por ejemplo.

Como se mencionó anteriormente, algunos ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento están dirigidos a métodos de diseño de anticuerpos para un ensayo en sándwich para una molécula pequeña que tiene un peso molecular de aproximadamente 500 a aproximadamente 2,500. El método comprende preparar un primer anticuerpo que se une a una porción o dominio de la molécula pequeña, y preparar un segundo anticuerpo que se une a la molécula pequeña en una porción o dominio de la molécula pequeña que no sea una porción o dominio al cual el primer anticuerpo se une. El segundo anticuerpo se prepara a partir de un inmunógeno que comprende un hapteno que no es la molécula pequeña o un derivado de la molécula pequeña, donde el hapteno comprende una unidad estructural que es estructuralmente similar al de la segunda porción de la molécula pequeña.

La expresión "estructuralmente similar" significa que una unidad estructural tiene las mismas o similares características estructurales o espaciales que otra unidad estructural, de modo que ambas unidades estructurales exhiben una afinidad de unión a un anticuerpo que es al menos 105 litros por mol, o 106 litros por mol, o al menos 107 litros por mol, o al menos 108 litros por mol, o al menos 109 litros por mol, por ejemplo. En algunos ejemplos, un anticuerpo exhibe sustancialmente la misma afinidad de unión por cada unidad estructural, lo que significa que la afinidad de unión de una unidad estructural por el anticuerpo no difiere de la afinidad de unión por la otra unidad estructural en más de 103, o en más de 102, o por más de 10, por ejemplo.

La expresión "hapteno que no es la molécula pequeña" se refiere a un compuesto que no es una molécula pequeña o que no es un derivado de la molécula pequeña. La expresión "derivado de la molécula pequeña" se refiere a una molécula pequeña que se modifica mediante la formación de un éster, una amida o un éter, por ejemplo, o se modifica mediante la hidrólisis de un éster, una amida o un éter, para ejemplo. El hapteno que no es la molécula pequeña comprende una unidad estructural que es estructuralmente similar al de la porción (segunda porción) de la molécula pequeña distinta de la porción de la molécula pequeña a la que se une el primer anticuerpo. La molécula pequeña es sirolimus y el hapteno del inmunógeno que no es la molécula pequeña es, a modo de ilustración y no de limitación, tacrolimus o un derivado de tacrolimus. El inmunógeno comprende el hapteno que no es la molécula pequeña unida a un portador inmunogénico y se puede usar para preparar anticuerpos de acuerdo con los principios descritos en este documento

La preparación de anticuerpos monoclonales que se unen simultáneamente a dos dominios diferentes en una molécula pequeña permite el uso de dichos anticuerpos en ensayos en sándwich en los que la molécula pequeña se une simultáneamente a los dos anticuerpos diferentes para formar un inmunocomplejo. La capacidad de realizar ensayos en sándwich en moléculas pequeñas mejora la sensibilidad de un ensayo para la molécula pequeña. Además, en el caso de ensayos en sándwich que involucran un anticuerpo monoclonal unido a un soporte, el ensayo puede realizarse en presencia de impurezas y sustancias que interfieren en una muestra porque el soporte puede separarse de la muestra y lavarse después de que se haya dejado que la molécula pequeña se uniera al anticuerpo monoclonal del soporte pero antes de la introducción del segundo anticuerpo monoclonal.

Los anticuerpos pueden incluir una inmunoglobulina completa o un fragmento de la misma, inmunoglobulinas que incluyen las diversas clases e isotipos, tales como IgA, IgD, IgE e IgM, por ejemplo. Sus fragmentos pueden incluir Fab, Fv y Fab')2, Fab', por ejemplo. Además, los agregados, polímeros y conjugados de inmunoglobulinas o sus fragmentos se pueden usar cuando sea apropiado siempre que se mantenga la afinidad de unión por una molécula particular.

Los anticuerpos de acuerdo con los principios descritos en el presente documento se pueden preparar mediante técnicas que incluyen, entre otras, la inmunización de un huésped y la recolección de sueros (policlonales), la preparación de líneas celulares híbridas continuas y la recolección de la proteína secretada (monoclonal) o la clonación y expresión de secuencias de nucleótidos o versiones mutagenizadas de las mismas que codifiquen al menos las secuencias de aminoácidos necesarias para la unión específica de anticuerpos naturales, por ejemplo.

Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar mediante técnicas que son bien conocidas en el arte tales como preparar líneas celulares híbridas continuas y recolectar la proteína secretada (técnicas de hibridación de células somáticas). Los anticuerpos monoclonales se pueden producir de acuerdo con las técnicas estándar de Kohler and Milstein, Nature 265: 495-497, 1975. Se encuentran reseñas de técnicas de anticuerpos monoclonales en Lymphocyte Hybridomas, ed. Melchers et al. Springer-Verlag (Nueva York 1978), Nature 266: 495 (1977), Science 208: 692 (1980) y Methods of Enzymology 73 (Parte B): 3-46 (1981).

En otra metodología para la preparación de anticuerpos, la secuencia que codifica los sitios de unión del anticuerpo puede escindirse del ADN del cromosoma e insertarse en un vector de clonación, que puede expresarse en bacterias para producir proteínas recombinantes que tienen los correspondientes sitios de unión al anticuerpo. Este enfoque implica clonar y expresar secuencias de nucleótidos o versiones mutagenizadas de las mismas que codifican al menos las secuencias de aminoácidos necesarias para la unión específica de anticuerpos naturales.

En una metodología para la producción de anticuerpos monoclonales, un primer paso incluye la inmunización de un animal productor de anticuerpos como un ratón, una rata, una cabra, una oveja o una vaca con un inmunógeno de acuerdo con los principios descritos aquí. La inmunización se puede realizar con o sin un adyuvante tal como adyuvante completo de Freund u otros adyuvantes tales como monofosforil lípido A y adyuvante dicorrinomicolato de trehalosa sintético. Un siguiente paso incluye aislar las células del bazo del animal productor de anticuerpos y fusionar las células del bazo que producen anticuerpos con un asociado de fusión apropiado, típicamente una célula de mieloma, tal como mediante el uso de polietilenglicol u otras técnicas. Normalmente, las células de mieloma utilizadas son aquellas que crecen normalmente en medio hipoxantina-timidina (HT) pero no pueden crecer en medio hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT), utilizado para la selección de las células fusionadas. Un siguiente paso incluye la selección de las células fusionadas, típicamente mediante selección en medio HAT. Un siguiente paso incluye el cribado de los híbridos clonados para la producción apropiada de anticuerpos utilizando inmunoensayos como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) u otros inmunoensayos apropiados para el cribado.

Se puede seleccionar un anticuerpo (preparado a partir de un inmunógeno de acuerdo con los principios descritos en este documento) con la especificidad requerida mediante metodologías de cribado, que incluyen, a modo de ilustración y no de limitación, ELISA, inmunoprecipitación puntual, análisis Western y Surface Resonancia Plasmon, por ejemplo. De esta manera se obtiene un anticuerpo que se une a un dominio de una molécula pequeña de interés y no se une en ningún grado detectable a otros dominios de la molécula pequeña o a otras moléculas que no son de interés en un ensayo particular. En algunos ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento, un anticuerpo que se une a un dominio de una molécula pequeña de interés tiene una afinidad de unión por el dominio de la molécula pequeña de interés de aproximadamente 10⁷ a aproximadamente 10¹⁴ litros/mol, o aproximadamente 10⁷ a aproximadamente 10¹¹ litros/mol, o aproximadamente 10⁷ a aproximadamente 10¹² litros/mol, o aproximadamente 10⁸ a aproximadamente 10¹⁴ litros/mol, o aproximadamente 10⁸ a aproximadamente 10¹¹ litros/mol, o aproximadamente 10⁸ a aproximadamente 10¹² litros/mol, por ejemplo. La expresión "cualquier grado detectable" significa que el anticuerpo que se une específicamente a un dominio de una molécula pequeña de interés tiene una afinidad de unión por otros dominios de la molécula pequeña de interés o por otras moléculas que no son de interés de menos de aproximadamente 10⁴ litros/mol, o menos de aproximadamente 10³ litros/mol, o menos de aproximadamente 10² litros/mol, o menos de aproximadamente 10 litros/mol, por ejemplo.

El término "hapteno" se refiere a compuestos que no provocan una respuesta inmunitaria a menos que estén ligados a una molécula grande o un portador inmunogénico que sí provoque una respuesta inmunitaria para generar anticuerpos. Los haptenos son compuestos capaces de unirse específicamente a los anticuerpos correspondientes, pero no actúan ellos mismos como inmunógenos (o antígenos) para la preparación de los anticuerpos. Los haptenos tienen un peso molecular de aproximadamente 150 a aproximadamente 2,500.

El término "portador inmunogénico" significa un grupo o unidad estructural que, cuando se conjuga con un hapteno y se inyecta en un mamífero o se emplea de otro modo como inmunógeno, induce una respuesta inmune y provoca la producción de anticuerpos que se unen al hapteno. Los portadores inmunogénicos también se denominan a veces portadores antigénicos. En algunos ejemplos de acuerdo con los principios descritos en el presente documento, se sintetizan inmunógenos que comprenden portadores inmunogénicos, incluidos los portadores inmunogénicos poli(aminoácidos) y no poli(aminoácidos), unidos a una molécula pequeña en una posición particular y se utilizan para preparar anticuerpos de acuerdo con los principios descritos en este documento.

El intervalo de peso molecular (en Dalton) para poli(aminoácidos) que son portadores inmunogénicos es de aproximadamente 5,000 a aproximadamente 10,000,000, o de aproximadamente 20,000 a aproximadamente 600,000, o de aproximadamente 25,000 a aproximadamente 250,000 de peso molecular, por ejemplo. Los portadores inmunogénicos de poli(aminoácidos) incluyen proteínas tales como, por ejemplo, albúminas, proteínas del suero, por ejemplo, globulinas, proteínas del cristalino ocular y lipoproteínas. Las proteínas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, albúmina de suero bovino (BSA), hemocianina de lapa californiana (KLH), ovoalbúmina de huevo y gammaglobulina bovina (BGG), tiroglobulina, ovoalbúmina o fibrinógeno, por ejemplo. En un ejemplo ilustrativo, la proteína es KLH; en otro ejemplo ilustrativo, la proteína es BSA. Los portadores inmunogénicos no poli(aminoácidos) incluyen polisacáridos, ácidos nucleicos y partículas (materiales biológicos y sintéticos). Una amplia variedad de portadores inmunogénicos se describe en Davalian, et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,089,390, columna 4, línea 57 a columna 5, línea 5.

Como se mencionó anteriormente, el portador inmunogénico puede ser un polisacárido, que es un polímero de monosacáridos de alto peso molecular que se puede preparar de forma natural o sintética y normalmente implica condensaciones repetidas de monosacáridos. Ejemplos de polisacáridos son almidones, glucógeno, celulosa, gomas de carbohidratos, tales como goma arábiga, agar, etc. El polisacárido también puede contener residuos de poli(aminoácidos) y/o residuos de lípidos.

Como se mencionó anteriormente, en algunos ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento, el portador inmunogénico puede unirse a un compuesto del inmunógeno que no es la molécula pequeña en una posición predeterminada del compuesto por medio de un grupo de enlace. En algunos ejemplos, el grupo de enlace puede comprender de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 átomos, o de 4 a aproximadamente 30 átomos, sin contar el hidrógeno y puede comprender una cadena de 2 a aproximadamente 30 átomos, o de 3 a aproximadamente 20 átomos, cada uno seleccionado independientemente del grupo consiste normalmente en carbono, oxígeno, azufre, nitrógeno y fósforo. Parte o todo el grupo de enlace puede ser una parte de la molécula que se enlaza al compuesto tal como, pero sin limitarse a, un residuo de aminoácido en un poli(aminoácido), por ejemplo. En algunos ejemplos, el grupo de enlace comprende una funcionalidad oxima.

El número de heteroátomos en el grupo de enlace puede estar en el intervalo de 0 a aproximadamente 20, o de 1 a aproximadamente 15, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 10. El grupo de enlace puede ser alifático o aromático. Cuando están presentes heteroátomos, el oxígeno está normalmente presente como oxo u oxi, unido a carbono, azufre, nitrógeno o fósforo; el nitrógeno está normalmente presente como nitro, nitroso o amino, normalmente unido a carbono, oxígeno, azufre o fósforo; el azufre es análogo al oxígeno; mientras que el fósforo está unido al carbono, azufre, oxígeno o nitrógeno, normalmente como fosfonato y fosfato mono o diéster. Las funcionalidades comunes en la formación de un enlace covalente entre el grupo de unión y la molécula que se va a conjugar son alquilamina, amidina, tioamida, éter, urea, tiourea, guanidina, azo, tioéter y carboxilato, sulfonato y ésteres de fosfato, amidas y tioésteres. Una realización específica de un grupo de enlace que comprende heteroátomos es una funcionalidad oxima como se mencionó anteriormente.

En su mayor parte, cuando un grupo de enlace tiene una funcionalidad de enlace (funcionalidad para la reacción con una unidad estructural) como, por ejemplo, un grupo no oxocarbonilo que incluye análogos de nitrógeno y azufre, un grupo fosfato, un grupo amino, alquilante agente como halo o tosilalquilo, oxi (hidroxilo o el análogo de azufre, mercapto) oxocarbonilo (por ejemplo, aldehído o cetona), u olefina activa tal como una vinilsulfona o éster a-, pinsaturado, estas funcionalidades están unidas a grupos amina, grupos carboxilo, olefinas activas, agentes alquilantes, por ejemplo, bromoacetilo. Cuando se unen una amina y un ácido carboxílico o su derivado de nitrógeno o ácido fosfórico, se forman amidas, amidinas y fosforamidas. Cuando se unen mercaptano y olefina activada, se forman tioéteres. Cuando se unen un mercaptano y un agente alquilante, se forman tioéteres. Cuando se unen aldehído y una amina en condiciones reductoras, se forma una alquilamina. Cuando se unen una cetona o un aldehído y una hidroxilamina (incluidos los derivados de los mismos donde un sustituyente está en lugar del hidrógeno del grupo hidroxilo), se forma una funcionalidad oxima (=N-O-). Cuando se unen un ácido carboxílico o ácido fosfato y un alcohol, se forman ésteres. Se conocen bien en la técnica varios grupos de enlace; véase, por ejemplo, Cuatrecasas, J. Biol. Chem. (1970) 245: 3059.

Sirolimus como ejemplo específico

La siguiente descripción específica es a modo de ilustración y no como limitación del alcance de la presente invención. La selección de fármacos inmunosupresores, y sirolimus en particular, también es a modo de ilustración y no de limitación, ya que la presente invención tiene una aplicación general para la detección de cualquier molécula pequeña que tenga regiones espacialmente separadas para las que se puedan producir anticuerpos contra un inmunógeno que no es la molécula pequeña y a la que dichos anticuerpos producidos se unirán específicamente durante un ensayo para la molécula pequeña.

Se pueden preparar anticuerpos monoclonales que se unan a porciones separadas de la molécula de sirolimus (Figura 1). Las porciones separadas a las que se unen los anticuerpos monoclonales pueden determinarse, por ejemplo, mediante estudios de reactividad cruzada usando, por ejemplo, metabolitos de sirolimus o sirolimus modificado.

Con referencia a la figura 4, a modo de ilustración y no de limitación, tres dominios de unión potenciales en la molécula de sirolimus se indican como D1, D2 y D3. El dominio de unión D1 se extiende aproximadamente desde el átomo del anillo 15 al átomo del anillo 21 e incluye una unidad estructural trieno desde el átomo del anillo 17 al átomo del anillo 22. El dominio de unión D2 se extiende aproximadamente desde el grupo metilo en el átomo 11 hasta el grupo metoxi en el átomo 39. El dominio de unión D3 se extiende desde el grupo metilo en el átomo 25 del anillo hasta el átomo 41. En un ejemplo de acuerdo con los principios descritos en este documento, se prepara un primer anticuerpo que se une a D1 de la molécula de sirolimus. Se prepara un segundo anticuerpo que se une a sirolimus en una porción de la molécula pequeña distinta de una porción a la que se une el primer anticuerpo, que en este ejemplo es el dominio D2 o el dominio D3 de la molécula de sirolimus. El segundo anticuerpo se prepara a partir de un inmunógeno que comprende un hapteno que no es la molécula pequeña ni un derivado de la molécula pequeña. El inmunógeno comprende un hapteno que comprende una unidad estructural que es estructuralmente similar al de la segunda porción de la molécula pequeña.

La discusión anterior también se aplica a la detección de everolimus, cuya estructura es sustancialmente similar a la del sirolimus.

Preparación de anticuerpos para el ensayo en sándwich para sirolimus

A modo de ilustración y no de limitación, en una metodología se prepara un anticuerpo anti-sirolimus a partir de un inmunógeno que comprende sirolimus. El anticuerpo anti-sirolimus se une a la región del dominio D1 de sirolimus, como puede determinarse, por ejemplo, mediante un ensayo de cribado como se describe a continuación.

En un ejemplo, a modo de ilustración y no de limitación, se prepara un primer anticuerpo monoclonal que se une a una porción de sirolimus representada por la región de dominio D1. Este primer anticuerpo monoclonal puede prepararse usando el compuesto Va (R5 es BSA), por ejemplo, como inmunógeno en los métodos de producción de anticuerpos descritos a continuación (véanse las Figuras 6 y 7).

Con referencia a la Figura 6, sirolimus (I) se hace reaccionar con ácido aminooxiacético para formar una mezcla de oximas de Fórmula IVa (que representa la formación de una oxima en C-26) y IVb (que representa la formación de una oxima en C-32). La reacción se lleva a cabo en un disolvente orgánico como, por ejemplo, un alcohol (por ejemplo, metanol o etanol), en condiciones para formar una oxima. En algunos ejemplos, la temperatura durante la reacción es de aproximadamente 10°C a aproximadamente 30°C, o de aproximadamente 15°C a aproximadamente 25°C. El período de tiempo de la reacción es de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 30 horas, o de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 24 horas. Los compuestos IVa y IVb pueden separarse o la mezcla de compuestos IVa y IVb puede emplearse en la siguiente etapa de la preparación de un inmunógeno. La separación de IVa y IVb se puede llevar a cabo mediante, pero sin limitarse a, cromatografía (TLC, HPLC, RPLC, HTLC) y cromatografía de gases, por ejemplo.

La Figura 7 representa, a modo de ilustración y no de limitación, la formación de un inmunógeno a partir del compuesto IVa. Se combina un portador inmunogénico de poli(aminoácido) (precursor de R5) con el compuesto de IVa para formar un compuesto de fórmula Va. La reacción se lleva a cabo en un medio regulado acuoso a un pH de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 7.0, o aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.5, o aproximadamente 6. Se incluye en el medio de reacción un agente de activación o acoplamiento para facilitar la reacción de la funcionalidad ácido carboxílico de Va con un grupo amina del precursor R5. Tales agentes de acoplamiento incluyen, pero no se limitan a, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDAC), N-hidroxisuccinimida (NHS), o N,N,N',N'-tetrametil-O-Tetrafluoroborato de (N-succinimidil)uronio, o combinaciones de dos o más de los anteriores. La reacción se lleva a cabo en condiciones para formar una amida. En algunos ejemplos, el medio de reacción es un medio acuoso, que puede ser únicamente agua o puede incluir de 0.1 a aproximadamente 40 por ciento en volumen de un codisolvente, que puede ser un disolvente orgánico polar como, por ejemplo, una amina (por ejemplo, dimetilformamida (DMF); un alcohol (por ejemplo, etanol); o un éter (por ejemplo, furano), por ejemplo. En algunos ejemplos, la temperatura durante la reacción es de aproximadamente 15°C a aproximadamente 25°C. El período de tiempo de la reacción es de aproximadamente 3 horas a aproximadamente 24 horas, o de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 20 horas, o de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 10 horas, por ejemplo. En algunos ejemplos, a modo de ilustración y no de limitación, el precursor de R5 es una proteína como BSA o KLH, por ejemplo. También se puede preparar un inmunógeno a partir del compuesto IVb de una manera similar a la descrita anteriormente para la preparación del inmunógeno Va. También se puede usar una mezcla de los compuestos IVa y IVb para preparar una mezcla de inmunógenos.

Se prepara y selecciona un anticuerpo anti-tacrolimus por su unión no solo con tacrolimus sino también por su reacción cruzada con sirolimus. El anticuerpo anti-tacrolimus se une a una porción de sirolimus distinta de aquella a la que se une el anticuerpo anti-sirolimus, ya que la región de dominio D1 de sirolimus no está presente en tacrolimus. La porción de sirolimus a la que se une el anticuerpo anti-tacrolimus es la región de dominio D2, que es estructuralmente similar a la región de dominio D2' de tacrolimus. El segundo anticuerpo monoclonal puede prepararse usando, por ejemplo, tacrolimus unido a un portador inmunogénico como inmunógeno para la preparación de anticuerpos en los métodos descritos anteriormente. El examen de la estructura de sirolimus mediante análisis tridimensional revela la conformación de las regiones D1 y D2.

En un ejemplo específico, a modo de ilustración y no de limitación, tacrolimus en la posición C22 de la molécula de tacrolimus está unido, ya sea directamente por un enlace o mediante la intermediación de un grupo de unión, a un portador inmunogénico. En un ejemplo particular, a modo de ilustración y no de limitación, el grupo ceto en la posición C22 se hace reaccionar con una amina para producir una oxima. La amina puede ser, pero no se limita a, carboximetoxilamina, por ejemplo.

En una metodología, la reacción de tacrolimus con carboximetoxilamina produce una carboximetiloxima. En este ejemplo particular, el tacrolimus se puede hacer reaccionar con carboximetoxilamina en un medio alcohólico como, por ejemplo, metanol, etanol o propanol, en presencia de una sal reguladora como, por ejemplo, acetato de sodio, para dar la carboximetiloxima. Esta oxima puede unirse a un portador inmunogénico tal como, por ejemplo, una proteína de alto peso molecular, que puede ser, pero no se limita a, albúmina de suero bovino, tiroglobulina, ovoalbúmina, fibrinógeno o hemocianina de lapa californiana, por ejemplo. En un ejemplo, la proteína es hemocianina de lapa californiana.

En un ejemplo, un método de preparación del conjugado de tacrolimus con una proteína de alto peso molecular es el siguiente: (1) preparación de la carboximetiloxima de tacrolimus como se describió anteriormente; (2) activar la carboximetiloxima para producir un éster de N-hidroxisuccinimida reactivo; y (3) hacer reaccionar el éster de N-hidroxisuccinimida con la proteína de alto peso molecular para producir el conjugado. La activación de la carboximetil oxima para producir el éster de N-hidroxisuccinimida se realiza, por ejemplo, usando un agente de acoplamiento como una carbodiimida soluble en agua como, por ejemplo, clorhidrato de 3-(3-dimetilaminopropil 1 -etil-3-dimetilaminopropilo)-carbodiimida (EDAC).

El anticuerpo monoclonal que se une a tacrolimus y sirolimus puede identificarse, por ejemplo, mediante un método de cribado, a modo de ilustración y no de limitación, de la siguiente manera: El ensayo es un ensayo competitivo que utiliza el anticuerpo conjugado con p-galactosidasa (conjugado anticuerpo-p-galactosidasa) y un análogo de sirolimus o tacrolimus recubierto sobre la superficie de una partícula magnética de CrO2. Los ensayos se pueden realizar en el sistema de química clínica Siemens DIMENSION® utilizando muestras que contienen tacrolimus o sirolimus. La muestra se agrega a un recipiente de reacción. El reactivo conjugado de anticuerpo-p-galactosidasa se agrega al recipiente de reacción y se mezcla con la muestra. Este paso permite la formación de un complejo que comprende tacrolimus o sirolimus con el conjugado anticuerpo-p-galactosidasa. A continuación, se añade a la mezcla de reacción el reactivo de partículas de CrO2 recubierto con tacrolimus o análogo de sirolimus. Para el sirolimus, el análogo utilizado para recubrir las partículas de CrO2 es una mezcla de derivados de sirolimus-C26 oxima y sirolimus-C32 oxima como se muestra en la Figura 6. Para la detección de tacrolimus, el análogo utilizado es FK506-C32-succinato (preparado como se describe en Patentes de los Estados Unidos. Nos. 5,532,137 y 5,164,495). Después de la incubación para permitir que las partículas de CrO2 recubiertas con tacrolimus o análogo de sirolimus eliminen el exceso de conjugado de anticuerpo-p-galactosidasa que no está unido a tacrolimus o sirolimus, las partículas de CrO2 se separan magnéticamente de la mezcla de reacción en el recipiente y una alícuota de sobrenadante que contienen tacrolimus (o sirolimus)::complejos conjugados de anticuerpo-p-galactosidasa se transfieren desde el recipiente de reacción a una cubeta fotométrica que contiene rojo de clorofenol-p-D-galactopiranósido (CPRG). La tasa de conversión de CPRG en rojo de clorofenol (CPR) se mide bicromáticamente a 577 y 700 nm. Esta tasa es proporcional a la concentración de tacrolimus o sirolimus en la muestra. El anticuerpo se selecciona para demostrar suficiente afinidad de unión tanto para tacrolimus como para sirolimus según la concentración de tacrolimus o sirolimus obtenida en el ensayo.

Como puede verse en la Figura 5, la región de dominio D2' de tacrolimus es estructuralmente similar a la región de dominio D2 de sirolimus. El tacrolimus se puede emplear como un compuesto unido a un portador inmunogénico para formar un inmunógeno donde el compuesto no es sirolimus o un derivado de sirolimus sino que comprende una unidad estructural (región de dominio D2' de tacrolimus) que es estructuralmente similar al de la región de dominio D2 de sirolimus.

En el ensayo de cribado para obtener un anticuerpo anti-tacrolimus que se une también a sirolimus, las preparaciones de anticuerpos que utilizan un inmunógeno que comprende tacrolimus se criban en un inmunoensayo para identificar uno o más anticuerpos que son altamente reactivos con sirolimus. Esta metodología es contraria a las metodologías para la selección de anticuerpos en los que se eligen anticuerpos que tienen poca o ninguna reactividad cruzada con moléculas distintas de la molécula utilizada en el inmunógeno.

Como se mencionó anteriormente, se utilizan sirolimus y tacrolimus a modo de ejemplo. La metodología anterior se puede aplicar a otras moléculas pequeñas con el fin de preparar un primer y un segundo anticuerpos para realizar un ensayo de sándwich para las moléculas pequeñas. Si un anticuerpo de ensayo en un formato de ensayo competitivo se une a un epítopo o dominio único de la molécula pequeña donde la molécula pequeña comparte un dominio común con, o comprende un dominio que es estructuralmente similar a un dominio en otro hapteno, dicho hapteno puede ser utilizado para generar un anticuerpo que reacciona de forma cruzada con el analito de molécula pequeña. De esta manera, se pueden preparar y usar dos anticuerpos que se unen a regiones de dominio separadas de la molécula pequeña en un ensayo en sándwich para la molécula pequeña.

Descripción general de los ensayos para una molécula pequeña.

Como se mencionó anteriormente, los ejemplos de acuerdo con los principios descritos en este documento permiten un ensayo en sándwich para la determinación de una molécula pequeña en una muestra que se sospecha que contiene la molécula pequeña. En la discusión a continuación, se usa un fármaco inmunosupresor como ejemplo, a modo de ilustración y no de limitación, de una molécula pequeña como se define aquí. En el ensayo en sándwich, se emplean dos anticuerpos monoclonales, cada uno de los cuales se une al mismo tiempo a regiones separadas de la molécula de fármaco inmunosupresor para formar un inmunocomplejo. La detección del inmunocomplejo permite la determinación del fármaco inmunosupresor en la muestra.

La muestra por analizar suele ser una muestra biológica. La expresión "muestra biológica" se refiere a cualquier material biológico como, por ejemplo, fluido corporal, tejido corporal, compuestos corporales y medios de cultivo. La muestra puede ser sólida, semisólida o fluida (un líquido o un gas) de cualquier fuente. En algunas realizaciones, la muestra puede ser una excreción corporal, un aspirante corporal, un seccionador corporal o un extractor corporal. El cuerpo suele ser el de un mamífero y, en algunas realizaciones, el cuerpo es un cuerpo humano. Las excreciones corporales son aquellas sustancias que se excretan de un cuerpo (aunque también pueden obtenerse por escisión o extracción) como, por ejemplo, orina, heces, deposiciones, mocos vaginales, semen, lágrimas, aliento, sudor, ampollas fluidas e inflamatorias. exudados. Los extractores corporales son aquellos materiales que se extraen de un cuerpo como, por ejemplo, muestras de piel, cabello y tejido, incluidas biopsias de órganos y otras partes del cuerpo. Los aspirantes corporales son aquellos materiales que se aspiran de un cuerpo como, por ejemplo, moco, saliva y esputo. Los extractantes corporales son aquellos materiales que se extraen de un cuerpo como, por ejemplo, sangre total, plasma, suero, fluido espinal, fluido cefalorraquídeo, fluido linfático, fluido sinovial y fluido peritoneal. En algunos ejemplos, la muestra es sangre total, plasma o suero.

Antes del ensayo, o en algunos casos durante el ensayo, la muestra puede someterse a uno o más pretratamientos para lisar células y/o liberar fármaco inmunosupresor de sustancias de unión endógenas. La lisis de células se puede lograr mediante el uso de un agente hemolítico, que es un compuesto o mezcla de compuestos que altera la integridad de las membranas de los glóbulos rojos liberando así el contenido intracelular de las células. Los agentes hemolíticos incluyen, pero no se limitan a, detergentes no iónicos, detergentes aniónicos, detergentes anfóteros, soluciones acuosas de baja fuerza iónica (soluciones hipotónicas), agentes bacterianos y anticuerpos que causan lisis dependiente del complemento, por ejemplo.

Los detergentes no iónicos que pueden emplearse como agente hemolítico incluyen tanto detergentes sintéticos como detergentes naturales. Ejemplos de detergentes sintéticos incluyen TRITON™ X-100, TRITON™ N-101, TRITON™ X-114, TRITON™ X-405, TRITON™ SP-135, TWEEN® 20 (polioxietileno (20) monolaurato de sorbitán), TWEEN® 80 (monooleato de polioxietileno (20) sorbitán), DOWFAX®, ZONYL®, palmitato de pentaeritritilo, ADOGEN® 464, tensioactivo ALKANOL® 6112, alcohol alílico 1,2-butoxilato-bloque-etoxilato HLB 6, BRIJ®, etilendiaminotetrakis (etoxilato-bloque-propoxilato) tetrol, IGEPAL®, MERPOL®, poli(etilenglicol), 2-[etil [(heptadecafluorooctil)-sulfonil]amino]etil éter, polietileno-bloque-poli (etilenglicol), polioxietilen sorbitán tetraoleato, polioxietilen sorbitol hexaoleato, TERGITOL® NP-9, GAFAC® (RHODAFAC®, un éster de alquil polioxietilenglicol fosfato tal como, por ejemplo, alfa-dodecil-omega-hidroxipoli (oxi-1,2-etanodiil) fosfato) y EP110® y similares. Los detergentes de origen natural que pueden emplearse como agente hemolítico incluyen, por ejemplo, saponinas, ácido graso neutralizado de sodio o potasio, fosfolípidos neutralizados, diacilglicerol, fosfatidil serina neutralizada, fosfatidato, fosfatidiletanoliamina neutralizada, fosfatidilcolina, fosfatidilinositilina sal, colesterol no esterificado, esfingosina neutralizada, ceramida y similares. También se pueden emplear combinaciones de uno o más detergentes sintéticos o uno o más detergentes de origen natural y combinaciones de detergentes sintéticos y detergentes de origen natural.

La naturaleza y la cantidad o concentración del agente hemolítico empleado depende de una o más de la naturaleza de la muestra, la naturaleza del fármaco inmunosupresor, la naturaleza de la unidad estructural de los componentes reactivos y las condiciones de reacción, por ejemplo. La cantidad de agente hemolítico es al menos suficiente para provocar la lisis de los glóbulos rojos para liberar el contenido de las células. En algunos ejemplos, la cantidad de agente hemolítico es aproximadamente 0.0001% a aproximadamente 0.5%, aproximadamente 0.001% a aproximadamente 0.4%, aproximadamente 0.01% a aproximadamente 0.3%, aproximadamente 0.01% a aproximadamente 0.2%, aproximadamente 0.1% a aproximadamente 0.3%, de aproximadamente 0.2% a aproximadamente 0.5%, o de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 0.2%, por ejemplo (el porcentaje es peso/volumen).

El agente de liberación es un compuesto o mezcla de compuestos que desplaza el fármaco inmunosupresor de las unidades estructurales de unión endógenas. El agente de liberación puede desplazar, y lo hace en muchos casos, los metabolitos del fármaco inmunosupresor de las unidades estructurales de unión endógenas. En muchos ejemplos, el agente de liberación tiene una alta afinidad de unión a las proteínas de unión endógenas de modo que desplaza fácilmente el fármaco inmunosupresor y sus metabolitos, cuando se desee, de las proteínas de unión endógenas. Además, el agente de liberación no se une en un grado significativo a un anticuerpo monoclonal para el fármaco que se usa en un ensayo. La expresión "no se une en un grado significativo" significa que el grado de unión debe ser lo suficientemente bajo para que pueda llevarse a cabo un ensayo preciso del fármaco. El agente de liberación, por lo tanto, puede ser cualquier unidad estructural, ya sea un solo compuesto o una mezcla de compuestos, que logre el resultado deseado de desplazamiento sin una unión significativa a un anticuerpo de ensayo.

En algunos ejemplos, el agente de liberación es un análogo, que incluye análogos estructurales, del fármaco inmunosupresor. Un análogo de fármaco inmunosupresor es un fármaco modificado que puede desplazar al fármaco inmunosupresor análogo de una proteína de unión, pero no compite en ningún grado sustancial por un anticuerpo monoclonal para el fármaco inmunosupresor. La modificación proporciona un medio para unir un análogo de fármaco inmunosupresor a otra molécula. En un ejemplo, el análogo de fármaco inmunosupresor puede ser, por ejemplo, el fármaco inmunosupresor conjugado con otra molécula a través de un grupo de enlace. Para los fármacos inmunosupresores que comprenden una funcionalidad de ácido hidroxi o carboxílico, el agente de liberación puede ser un éster del fármaco inmunosupresor, que tiene una alta afinidad de unión por las proteínas de unión endógenas en relación con el fármaco inmunosupresor que se va a detectar y que no tiene una afinidad de unión significativa por un anticuerpo para el fármaco inmunosupresor. Por ejemplo, en una determinación de tacrolimus, se puede emplear un éster de tacrolimus como agente de liberación siempre que cumpla con los requisitos anteriores. Un análogo estructural es una unidad estructural que tiene las mismas o similares características estructurales o espaciales que el fármaco inmunosupresor, de modo que el análogo estructural logra el mismo resultado o similar que el análogo del fármaco inmunosupresor. El análogo estructural puede ser, por ejemplo, otro compuesto relacionado con el fármaco inmunosupresor. Por ejemplo, en una determinación de tacrolimus, se puede emplear un éster de sirolimus como agente de liberación. El éster puede ser, por ejemplo, un carbamato, un carbonato, un éster de un ácido carboxílico C1 a C⁶ y similares. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 7,186,518. Otros ejemplos de agentes de liberación incluyen [Thr2, Leus, D-Hivs, Leu10]-ciclosporina A para ciclosporina A, FK506 para sirolimus, sirolimus para FK506 y similares. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 6,187,547.

La concentración del agente de liberación en el medio es suficiente para lograr el resultado deseado de desplazar el fármaco inmunosupresor, y en algunos casos los metabolitos del fármaco inmunosupresor, de las unidades estructurales de unión endógenos para hacer que el fármaco y los metabolitos sean accesibles para la unión. a un anticuerpo para el fármaco como se discutió anteriormente. La cantidad o concentración del agente de liberación empleado depende de una o más de la naturaleza de la muestra, la naturaleza del fármaco inmunosupresor, la naturaleza de los metabolitos del fármaco, la naturaleza de otros componentes reactivos y las condiciones de reacción, por ejemplo. En algunas realizaciones, la cantidad del agente de liberación es aproximadamente 0.000001% a aproximadamente 0.5%, aproximadamente 0.0001% a aproximadamente 0.4%, aproximadamente 0.001% a aproximadamente 0.3%, aproximadamente 0.01% a aproximadamente 0.2%, aproximadamente 0.1% a aproximadamente 0.3%, aproximadamente 0.2% a aproximadamente 0.5%, aproximadamente 0.1% a aproximadamente 0.2%, y así sucesivamente (el porcentaje es peso/volumen).

El ensayo es un inmunoensayo, que puede realizarse sin separación (homogénea) o con separación (heterogénea) de cualquiera de los componentes o productos del ensayo. Los ensayos homogéneos o heterogéneos se llevan a cabo en un medio regulado acuoso a un pH moderado, generalmente el que proporciona una sensibilidad de ensayo óptima. El medio acuoso puede ser únicamente agua o puede incluir de 0.1 a aproximadamente 40 por ciento en volumen de un codisolvente. El pH del medio estará normalmente en el intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 11, o en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, o en el intervalo de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 9.5. El pH normalmente será un compromiso entre la unión óptima de los anticuerpos monoclonales y el fármaco inmunosupresor, y el pH óptimo para otros reactivos del ensayo, como los miembros del sistema de producción de señales, por ejemplo.

Pueden usarse diversos reguladores para lograr el pH deseado y mantener el pH durante la determinación. Los reguladores ilustrativos incluyen borato, fosfato, carbonato, tris, barbital y similares. El regulador particular empleado no es crítico para esta invención, pero en un ensayo individual se puede preferir uno u otro regulador. Pueden emplearse varios materiales auxiliares en los métodos anteriores. Por ejemplo, además de los reguladores, el medio puede comprender estabilizadores para el medio y para los reactivos empleados. Con frecuencia, además de estos aditivos, se pueden incluir proteínas, como albúminas; disolventes orgánicos como formamida; sales de amonio cuaternario; polianiones tales como sulfato de dextrano; tensioactivos, particularmente tensioactivos no iónicos; potenciadores de la unión, por ejemplo, polialquilenglicoles; por ejemplo.

Se pueden aplicar uno o más períodos de incubación al medio a uno o más intervalos que incluyen cualquier intervalo entre adiciones de varios reactivos mencionados anteriormente. El medio normalmente se incuba a una temperatura y durante un tiempo suficientes para que se produzca la unión de varios componentes de los reactivos. Normalmente se emplean temperaturas moderadas para llevar a cabo el método y normalmente temperatura constante, preferiblemente temperatura ambiente, durante el período de medición. Las temperaturas de incubación varían de aproximadamente 5°C a aproximadamente 99°C, o de aproximadamente 15°C a aproximadamente 70°C, o de aproximadamente 20°C a aproximadamente 45°C. El período de tiempo de incubación es de aproximadamente 0.2 segundos a aproximadamente 6 horas, o de aproximadamente 2 segundos a aproximadamente 1 hora, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 minutos. El período de tiempo depende de la temperatura del medio y de la velocidad de unión de los diversos reactivos, que está determinada por la constante de velocidad de asociación, la concentración, la constante de unión y la constante de velocidad de disociación. Las temperaturas durante las mediciones oscilan entre aproximadamente 10°C y aproximadamente 50°C, o entre aproximadamente 15°C y aproximadamente 40°C.

La concentración de analito de fármaco inmunosupresor que puede ensayarse varía generalmente de aproximadamente 10-5 a aproximadamente 10-17 M, o de aproximadamente 10-6 a aproximadamente 10-14 M. Consideraciones, tales como si el ensayo es cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo (en relación con la cantidad de analito presente en la muestra), la técnica de detección particular y la concentración del analito determinan normalmente las concentraciones de los diversos reactivos.

Las concentraciones de los diversos reactivos en el medio de ensayo se determinarán generalmente por el intervalo de concentración de interés del analito de fármaco inmunosupresor. Sin embargo, la concentración final de cada uno de los reactivos normalmente se determina empíricamente para optimizar la sensibilidad del ensayo en el rango. Es decir, una variación en la concentración de analito que sea importante debería proporcionar una diferencia de señal medible con precisión. Consideraciones tales como la naturaleza de un sistema productor de señales y la naturaleza del analito inmunosupresor determinan normalmente las concentraciones de los diversos reactivos.

Si bien el orden de adición puede variar ampliamente, habrá ciertas preferencias dependiendo de la naturaleza del ensayo. El orden de adición más simple es agregar todos los materiales simultáneamente y determinar el efecto que el medio de ensayo tiene sobre la señal como en un ensayo homogéneo. Alternativamente, los reactivos se pueden combinar secuencialmente. Opcionalmente, una etapa de incubación puede estar involucrada después de cada adición como se discutió anteriormente.

En los ensayos discutidos anteriormente, se emplean uno o más marcadores en los que el marcador es normalmente parte de un sistema de producción de señales ("sps"). La naturaleza de la etiqueta depende del formato de ensayo particular. Un sps generalmente incluye uno o más componentes, siendo al menos un componente un marcador detectable, que genera una señal detectable que se relaciona con la cantidad de marcador unido y/o no unido, es decir, la cantidad de marcador unido o no unido al fármaco inmunosupresor que se detectado o a un agente que refleja la cantidad de fármaco inmunosupresor que se va a detectar. El marcador es cualquier molécula que produce o puede inducirse a producir una señal y puede ser, por ejemplo, un fluorescente, un radiomarcador, una enzima, un quimioluminiscente o un fotosensibilizador. Así, la señal se detecta y/o mide detectando actividad enzimática, luminiscencia, absorbancia de luz o radiactividad, según sea el caso.

Los marcadores adecuados incluyen, a modo de ilustración y no de limitación, enzimas tales como p-galactosidasa, fosfatasa alcalina, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa ("G6PDH") y peroxidasa de rábano picante; ribozima; un sustrato para una replicasa tal como QB replicasa; promotores; colorantes fluorescentes, tales como fluoresceína, isotiocianato, compuestos de rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina; complejos como los preparados a partir de CdSe y ZnS presentes en nanocristales semiconductores conocidos como puntos cuánticos; quimioluminiscentes tales como isoluminol; sensibilizadores; coenzimas; sustratos de enzimas; radiomarcadores tales como 125I, 131I, 14C, 3H, 57Co y 75Se; partículas tales como partículas de látex, partículas de carbono, partículas metálicas que incluyen partículas magnéticas, por ejemplo, partículas de cromo y similares; sol de metal; cristalita; liposomas; células, etc., que se pueden marcar además con un colorante, catalizador u otro grupo detectable. Enzimas y coenzimas adecuadas se describen en Litman, et al., Patente de los Estados Unidos No. 4,275,149, columnas 19 28, and Boguslaski, et al., Patente de los Estados Unidos No. 4,318,980, columnas 10-14; fluorescentes y quimioluminiscentes adecuados se describen en Litman, et al., Patente de los Estados Unidos No. 4,275,149, en las columnas 30 y 31.

La etiqueta puede producir directamente una señal y, por lo tanto, no se requieren componentes adicionales para producir una señal. Numerosas moléculas orgánicas, por ejemplo fluorescentes, son capaces de absorber luz ultravioleta y visible, donde la absorción de luz transfiere energía a estas moléculas y las eleva a un estado de energía excitada. Esta energía absorbida se disipa luego mediante la emisión de luz en una segunda longitud de onda. Otros marcadores que producen directamente una señal incluyen isótopos radiactivos y colorantes.

Alternativamente, la etiqueta puede necesitar otros componentes para producir una señal, y el sistema de producción de señal incluiría entonces todos los componentes necesarios para producir una señal medible. Dichos otros componentes pueden incluir sustratos, coenzimas, potenciadores, enzimas adicionales, sustancias que reaccionan con productos enzimáticos, catalizadores, activadores, cofactores, inhibidores, depuradores, iones metálicos y una sustancia de unión específica necesaria para la unión de sustancias generadoras de señales. Se puede encontrar una discusión detallada de los sistemas de producción de señales adecuados en Ullman, et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,185,243, columnas 11-13.

El marcador u otros miembros de sps o uno o más de los anticuerpos monoclonales pueden unirse a un soporte. Un anticuerpo monoclonal puede unirse a un soporte sólido de cualquier manera conocida en la técnica, siempre que la unión no interfiera sustancialmente con la capacidad de unirse con una región del fármaco inmunosupresor. En algunos ejemplos, la etiqueta u otro miembro sps o el anticuerpo monoclonal pueden estar recubiertos o unidos covalentemente directamente a la fase sólida o pueden tener capas de una o más moléculas portadoras como poli(aminoácidos) que incluyen proteínas como albúminas séricas o inmunoglobulinas. o polisacáridos (carbohidratos) como, por ejemplo, dextrano o derivados de dextrano. También se pueden usar grupos de enlace para acoplar covalentemente el soporte sólido y la unidad estructural que se va a acoplar. El grupo de enlace puede ser uno como se describió anteriormente para el enlace de inmunógeno a una molécula de fármaco inmunosupresor. También pueden emplearse otros métodos de unión a un soporte. Por ejemplo, un soporte sólido puede tener un recubrimiento de un aglutinante para una molécula pequeña como, por ejemplo, avidina o un anticuerpo, donde una molécula pequeña como, por ejemplo, biotina o un hapteno, puede unirse a la unidad estructural que se va a acoplar o viceversa. La unión de componentes a la superficie de un soporte puede ser directa o indirecta, covalente o no covalente y puede lograrse mediante técnicas bien conocidas, comúnmente disponibles en la literatura. Véase, por ejemplo, "Immobilized Enzymes", Ichiro Chibata, Halsted Press, Nueva York (1978) y Cautrecasas, J. Biol. Chem. 245: 3059 (1970).

El soporte puede estar compuesto por un material insoluble en agua, orgánico o inorgánico, sólido o fluido, que puede ser transparente o parcialmente transparente. El soporte puede tener cualquiera de varias formas, tales como partículas, incluyendo perlas, películas, membranas, tubos, pozos, tiras, varillas, superficies planas tales como, por ejemplo, placa y DENDRIMERS, por ejemplo. Dependiendo del tipo de ensayo, el soporte puede o no ser suspendido en el medio en donde se emplea. Ejemplos, a modo de ilustración y no de limitación, de soportes suspendibles son materiales poliméricos tales como látex, bicapas lipídicas o liposomas, gotitas de aceite, células e hidrogeles y partículas magnéticas, por ejemplo. Otras composiciones de soporte incluyen polímeros, tales como nitrocelulosa, acetato de celulosa, poli(cloruro de vinilo), poliacrilamida, poliacrilato, polietileno, polipropileno, poli(4-metilbuteno), poliestireno, polimetacrilato, poli(etilen tereftalato), nailon, poli(butirato de vinilo), por ejemplo; ya sea utilizados por sí mismos o junto con otros materiales.

El soporte puede ser una partícula. Las partículas deben tener un diámetro medio de al menos aproximadamente 0.02 micrómetros y no más de aproximadamente 100 micrómetros. En algunas realizaciones, las partículas tienen un diámetro medio de aproximadamente 0.05 micrómetros a aproximadamente 20 micrómetros, o de aproximadamente 0.3 micrómetros a aproximadamente 10 micrómetros. La partícula puede ser orgánica o inorgánica, hinchable o no hinchable, porosa o no porosa, preferiblemente de una densidad aproximada al agua, generalmente de aproximadamente 0.7 g/ml a aproximadamente 1.5 g/ml, y compuesta de material que puede ser transparente, parcialmente transparente u opaco. Las partículas pueden ser materiales biológicos tales como células y microorganismos, por ejemplo, eritrocitos, leucocitos, linfocitos, hibridomas, estreptococos, Staphylococcus aureus y E. coli, virus, por ejemplo. Las partículas también pueden ser partículas compuestas de polímeros orgánicos e inorgánicos, liposomas, partículas de látex, partículas magnéticas o no magnéticas, vesículas de fosfolípidos, quilomicrones, lipoproteínas y similares. En algunos ejemplos, las partículas son partículas de cromo o partículas de látex.

Las partículas de polímero se pueden formar a partir de polímeros de adición o de condensación. Las partículas serán fácilmente dispersables en un medio acuoso y pueden ser adsorbentes o funcionalizables para permitir la conjugación con un anticuerpo monoclonal para un fármaco inmunosupresor, ya sea directa o indirectamente a través de un grupo de enlace. El grupo de unión puede ser uno de los descritos anteriormente para la unión de inmunógenos a una molécula de fármaco inmunosupresor. Las partículas también pueden derivarse de materiales naturales, materiales naturales que se modifican sintéticamente y materiales sintéticos. Entre los polímeros orgánicos de particular interés se encuentran los polisacáridos, particularmente los polisacáridos reticulados, como la agarosa, que está disponible como Sepharose, dextrano, disponible como Sephadex y Sephacryl, celulosa, almidón y similares; polímeros de adición, tales como poliestireno, alcohol polivinílico, homopolímeros y copolímeros de derivados de acrilato y metacrilato, en particular ésteres y amidas que tienen funcionalidades hidroxilo libres, y similares.

El marcador y/u otro miembro de sps pueden estar unidos a uno o ambos de los dos anticuerpos monoclonales diferentes. La unión del marcador al miembro sbp puede lograrse mediante reacciones químicas que dan como resultado el reemplazo de un átomo de hidrógeno del marcador con un enlace al anticuerpo monoclonal o puede incluir un grupo de enlace entre el marcador y el anticuerpo monoclonal. El grupo de unión puede ser uno de los descritos anteriormente para la unión de inmunógenos a una molécula de fármaco inmunosupresor. Otros miembros de sps también pueden unirse covalentemente a los anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, dos miembros sps tales como un fluorescente y un extintor pueden unirse cada uno, respectivamente, a los anticuerpos monoclonales donde el fluorescente está unido a uno de los anticuerpos monoclonales y un extintor está unido al otro de los anticuerpos monoclonales. Cuando los dos anticuerpos monoclonales diferentes se unen al fármaco inmunosupresor, la formación de un complejo sándwich acerca al fluorescente y al desactivador, lo que permite que el desactivador interactúe con el fluorescente para producir una señal. Los métodos de conjugación son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Rubenstein et al., Patente de los Estados Unidos No. 3,817,837.

Las enzimas de particular interés como proteínas marcadoras son enzimas rédox, particularmente deshidrogenasas como glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, lactato deshidrogenasa, etc., y enzimas que implican la producción de peróxido de hidrógeno y el uso de peróxido de hidrógeno para oxidar un colorante precursor de un colorante. Las combinaciones particulares incluyen, pero no se limitan a, sacárido oxidasas, por ejemplo, glucosa y galactosa oxidasa, o heterocíclicas oxidasas, tales como uricasa y xantina oxidasa, junto con una enzima que emplea el peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de colorante, es decir, un peroxidasa como peroxidasa de rábano picante, lactoperoxidasa o microperoxidasa. Se conocen en la técnica combinaciones adicionales de enzimas. Cuando se usa una sola enzima como marcador, otras enzimas pueden encontrar uso tales como hidrolasas, transferasas y oxidorreductasas, preferiblemente hidrolasas tales como fosfatasa alcalina y beta-galactosidasa. Alternativamente, se pueden usar luciferasas tales como luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana.

Las coenzimas ilustrativas que encuentran uso incluyen NAD[H], NADP[H], fosfato de piridoxal, FAD[H], FMN[H], etc., normalmente coenzimas que implican reacciones cíclicas. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No.

4,318,980.

La activación de un sistema de producción de señales depende de la naturaleza de los miembros del sistema de producción de señales. Para aquellos miembros de un sistema de producción de señales que se activan con luz, el miembro se irradia con luz. Para miembros de sistemas productores de señales que están en la superficie de una partícula, la adición de una base puede resultar en activación. A los expertos en la técnica se les propondrán otros métodos de activación en vista de las descripciones de este documento. Para algunos sistemas productores de señales, no es necesario ningún agente de activación, como los sistemas que involucran un marcador que es un marcador radiactivo, una enzima, etc. Para los sistemas enzimáticos, puede ser necesaria la adición de un sustrato y/o un cofactor.

El examen de la presencia y cantidad de la señal también incluye la detección de la señal, que generalmente es simplemente un paso en donde se lee la señal. La señal normalmente se lee utilizando un instrumento, cuya naturaleza depende de la naturaleza de la señal. El instrumento puede ser un espectrofotómetro, fluorómetro, espectrómetro de absorción, luminómetro, quimioluminómetro, actinómetro, instrumento fotográfico y similares. La presencia y la cantidad de señal detectada está relacionada con la presencia y la cantidad del compuesto de sirolimus presente en una muestra. Las temperaturas durante las mediciones pueden oscilar entre aproximadamente 10° y aproximadamente 70°C, o entre aproximadamente 20° y aproximadamente 45°C, o entre aproximadamente 20° y aproximadamente 25°C. En una metodología, se forman curvas estándar usando concentraciones conocidas de los analitos que se van a cribar. Como se discutió anteriormente, también se pueden usar calibradores y otros controles.

La expresión "medir la cantidad de un fármaco inmunosupresor" se refiere a la determinación cuantitativa, semicuantitativa y cualitativa del fármaco inmunosupresor. Los métodos cuantitativos, semicuantitativos y cualitativos, así como todos los demás métodos para determinar el fármaco inmunosupresor, se consideran métodos para medir la cantidad del fármaco inmunosupresor. Por ejemplo, un método, que simplemente detecta la presencia o ausencia del fármaco inmunosupresor en una muestra que se sospecha que contiene el fármaco inmunosupresor, se considera incluido dentro del alcance de la presente divulgación. Los términos "detectar" y "determinar", así como otros sinónimos comunes para medir, se contemplan dentro del alcance de la presente divulgación.

En un ejemplo de acuerdo con los principios aquí descritos, uno de los anticuerpos monoclonales específicos para una región de un fármaco inmunosupresor se une a un soporte y el otro de los anticuerpos monoclonales que es específico para una región del fármaco inmunosupresor que se separa espacialmente de la región del fármaco inmunosupresor al que se unen los otros anticuerpos monoclonales y se une a un miembro sps tal como, por ejemplo, un marcador. La muestra sospechosa de contener el fármaco inmunosupresor se combina en un medio adecuado con los dos anticuerpos monoclonales conjugados y el medio se incuba. Luego, el medio se examina para determinar la presencia y la cantidad de un inmunocomplejo formado por los dos anticuerpos monoclonales diferentes y el fármaco inmunosupresor de la muestra. El soporte puede o no separarse del medio antes del examen. La presencia y/o cantidad del inmunocomplejo se determina determinando la presencia y/o cantidad del marcador en el medio o sobre el soporte.

En un ejemplo particular, se emplea un ensayo de captura. En este formato de ensayo, un anticuerpo monoclonal se une covalentemente a una partícula magnética tal como, por ejemplo, una partícula de cromo (dióxido de cromo). La muestra se incuba con estas partículas para permitir que el fármaco inmunosupresor de la muestra se una al anticuerpo monoclonal de la partícula magnética. Posteriormente, se incuba con las partículas magnéticas un segundo anticuerpo monoclonal conjugado con una enzima tal como, por ejemplo, p-galactosidasa. Después de la aplicación de un imán y el lavado de las partículas magnéticas, se mide la cantidad de enzima que se une a las partículas magnéticas y se relaciona directamente con la presencia y/o cantidad del fármaco inmunosupresor en la muestra. En este enfoque, se añade el sustrato de la enzima indicadora al recipiente de reacción final, y la actividad de la enzima se mide espectrofotométricamente como un cambio en la absorbancia a lo largo del tiempo.

En una metodología alternativa, el reactivo de partículas magnéticas se agrega en una cantidad en exceso, es decir, una cantidad mayor que la requerida para unir todo el fármaco inmunosupresor que podría estar presente en la muestra. Luego, se aplica un imán para separar las partículas magnéticas del medio y las partículas magnéticas se lavan y se resuspenden en el medio de ensayo. Se añade la enzima conjugada con el segundo anticuerpo monoclonal y se incuba el medio seguido de la determinación de la señal como se describe anteriormente.

En otro ejemplo, a modo de ilustración y no de limitación, se emplean partículas quimioluminiscentes, que comprenden el compuesto quimioluminiscente asociado con las mismas tal como por incorporación o unión a las mismas. Uno de los anticuerpos monoclonales para el fármaco inmunosupresor se une a las partículas, por ejemplo, mediante la intermediación de un polisacárido que recubre las partículas. El otro anticuerpo monoclonal que se une al fármaco inmunosupresor es parte de un conjugado de biotina. La estreptavidina se conjuga con un segundo conjunto de partículas que tienen asociado un fotosensibilizador. Las partículas quimioluminiscentes se mezclan con una muestra sospechosa de contener el fármaco inmunosupresor y las partículas fotosensibilizadoras. El medio de reacción se incuba para permitir que las partículas se unan al fármaco inmunosupresor en virtud de la unión de los anticuerpos monoclonales al fármaco inmunosupresor. Luego, el medio se irradia con luz para excitar el fotosensibilizador, que es capaz en su estado excitado de activar el oxígeno a un estado singlete. Debido a que el compuesto quimioluminiscente de uno de los conjuntos de partículas se encuentra ahora muy próximo al fotosensibilizador en virtud de la presencia del fármaco inmunosupresor, se activa mediante oxígeno singlete y emite luminiscencia. A continuación, se examina el medio para determinar la presencia y/o la cantidad de luminiscencia o luz emitida, estando relacionada su presencia con la presencia y/o la cantidad del fármaco inmunosupresor en una muestra.

Kits para realizar ensayos

Los reactivos para realizar un ensayo particular pueden estar presentes en un kit útil para realizar convenientemente un ensayo para la determinación de una molécula pequeña tal como, por ejemplo, un analito de fármaco inmunosupresor. En un ejemplo, un kit comprende una combinación de reactivos empaquetados para analizar el analito, cuya naturaleza depende del formato de ensayo particular. Los reactivos pueden incluir, por ejemplo, uno o más anticuerpos monoclonales de acuerdo con los principios descritos en este documento, que pueden conjugarse con un marcador o un soporte. Cada uno de los reactivos puede estar en recipientes separados o se pueden combinar varios reactivos en uno o más recipientes dependiendo de la reactividad cruzada y la estabilidad de los reactivos. El kit puede incluir además otros reactivos empaquetados por separado para realizar un ensayo, tales como miembros de unión adicionales y reactivos auxiliares.

Las cantidades relativas de los diversos reactivos en los kits se pueden variar ampliamente para proporcionar concentraciones de los reactivos que optimicen sustancialmente las reacciones que deben producirse durante el presente método y optimicen además sustancialmente la sensibilidad del ensayo. En circunstancias apropiadas, uno o más de los reactivos en el kit se pueden proporcionar como un polvo seco, normalmente liofilizado, incluyendo excipientes, que al disolverse proporcionarán una solución de reactivo que tenga las concentraciones apropiadas para realizar un método o ensayo. El kit puede incluir además una descripción escrita de un método de acuerdo con las presentes realizaciones como se describió anteriormente.

La expresión "al menos" como se usa en este documento significa que el número de elementos especificados puede ser igual o mayor que el número mencionado. La expresión "aproximadamente" como se usa aquí significa que el número citado puede diferir en más o menos un 10%; por ejemplo, "aproximadamente 5" significa un rango de 4.5 a 5.5. La designación "primero" y "segundo" es completamente arbitraria y no pretende sugerir ningún orden o clasificación entre los miembros de un grupo al que pertenece el lenguaje anterior, como, por ejemplo, "primer y segundo anticuerpos monoclonales" o "primer anticuerpo monoclonal "y" segundo anticuerpo monoclonal".

Los siguientes ejemplos describen adicionalmente las realizaciones específicas de la invención a modo de ilustración y no de limitación y están destinados a describir y no limitar el alcance de la invención o las reivindicaciones adjuntas. Las partes y porcentajes descritos en este documento son en volumen a menos que se indique lo contrario.

Ejemplos

Todos los productos químicos se adquirieron de Sigma-Aldrich Company (St. Louis MO) a menos que se indique lo contrario.

La prueba se llevó a cabo usando el analizador DIMENSION® RxL, disponible de Siemens AG, Newark DE. El instrumento se empleó mediante un sistema de detección enzimática con formato de inmunoensayo en sándwich. En la realización del método sándwich utilizado en este documento y que se analiza con más detalle a continuación, la unión entre un anticuerpo (Ab) marcado conjugado a una enzima (conjugado) y el fármaco sirolimus (SIRO) en muestras de pacientes y la posterior unión del inmunocomplejo resultante con un anticuerpo capturado sobre las partículas de cromo determinó la cantidad de sirolimus en las muestras de los pacientes. El conjugado de enzima anticuerpo etiqueta no unido se eliminó automáticamente mediante 3-4 ciclos de mezcla/lavado y separación magnética. Se midió la actividad enzimática del conjugado que queda en las partículas de cromo y fue directamente proporcional a la cantidad de sirolimus en la muestra del paciente.

Definiciones:

mg = miligramo

g = gramo(s)

ng = nanogramo(s)

mL = mililitro(s)

jL = microlitro(s)

mmol(s) = milimol(es)

|jmol = micromolar

°C = grados centígrados

min = minuto(s)

sec = segundo(s)

hr = hora(s)

w/v = peso a volumen

v/v = volumen a volumen

TLC = cromatografía en capa fina

HPLC = cromatografía líquida de alta resolución

UV = ultravioleta

EtOAc = acetato de etilo

MeOH = metanol

DMF = dimetilformamida

DI = desionizado

THF = tetrahidrofurano

NHS = N-hidroxisuccinimida

DCC = N,N-diciclohexil carbodiimida

BSA = albúmina de suero bovino

BGG = gammaglobulina bovina

MS = espectrometría de masas

SIRO = sirolimus

rotovap = evaporador rotatorio

Ejemplo 1

Preparación de anticuerpo monoclonal contra sirolimus

Preparación de C-32-Sirolimus y C-26-Sirolimus Oximas (IVa y IVb) (Figura 6). A una solución de Sirolimus (I) (653.6 mg, 0.715 mmol) y hemihidrocloruro de carboximetoxiamina (234.4 mg, 2.14 mmol) en MeOH (20 ml) se añade acetato de sodio (181.8 mg, 3.1 mmol). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente (23°C) durante la noche (18 h) bajo una atmósfera de nitrógeno. El análisis de TLC indicó que la reacción se completó. (TLC, placa de gel de sílice, CH2Cl2/MeOH = 9/1). Se añaden CH2O 2 (80 ml) y agua desionizada (20 ml) a la mezcla, que se agita durante 10 min. La capa de CH2Cl2 se separa. La capa acuosa se extrae con CH2O 2 (3 x 30 ml). Las soluciones de CH2O 2 combinadas se lavan con agua DI (2 x 40 ml), se secan sobre Na²SO⁴, se filtran y se concentran en un evaporador rotatorio para dar una mezcla de C-32-Sirolimus y C-26-Sirolimus oximas (IVa y IVb, 622 mg).

Aislamiento de C-26-Sirolimus oxima (IVa) (Figura 6). Una condición óptima de TLC (gel de sílice, EtOAc/Hexanos/MeOH = 5/2/1, Rf C-32-oxima = 0.59, Rr C-26-oxima = 0.51) para la separación de C-32-Sirolimus y C-26-Sirolimus oximas se desarrolla y aplica con éxito en un sistema de cromatografía instantánea BIOTAGE® ISOLERA™ (John Morris Scientific, Chatswood, NSW). Se disuelve una mezcla de oximas de C-32-Sirolimus y C-26-Sirolimus (IVa y IVb, 622 mg) en CH2O 2 (5 ml). La solución de CH2Cl2 se eluye a un cartucho (sílice, 50 g SNAP Ultra) asociado con el sistema de cromatografía instantánea BIOTAGE® ISOLERA™. El sistema se hace funcionar con una mezcla de disolvente a un caudal de 25 ml/min. Todas las fracciones recogidas del cartucho se controlan mediante TLC (EtOAc/Hexanos/MeOH = 5/2/1). Con base en el análisis de TLC, las fracciones puras más polares (Rf C-26-oxima = 0.51) se combinan y concentran para dar C-26-Sirolimus oximas (IVa) (197 mg). El análisis HPLC-UV de este compuesto indica una pureza del 95%.

Preparación de conjugado de C-26-sirolimus oxima-BSA (Va) (R⁵ = BSA en la Figura 7). A una solución de IVa (167.97 mg, 0.17 mmol) en THF/DMF (8 ml de THF, 0.4 ml de DMF), se añade NHS (41.8 mg, 0.35 mmol) y DCC (70.9 mg, 0.34 mmol). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente bajo una atmósfera de nitrógeno y el éster de NHS producto es ligeramente menos polar que el compuesto IVa en el análisis por TLC. Se filtra un sólido blanco formado durante la reacción y luego se lava con EtOAc. Después de eliminar el disolvente, la mezcla de reacción se disuelve en EtOAc y se filtra; la evaporación del disolvente proporcionó un sólido ligeramente amarillo, que se mantuvo a alto vacío durante 1 hora.

El éster NHS de hapteno activado (sólido amarillo claro) se disuelve en DMF (1 ml) y la solución se añade gota a gota a un BSA (120 mg) en regulador salino regulado con fosfato (PBS) (NaH²PO⁴0.1 M/Na²HPO⁴, pH 8) (14 ml) en un baño de hielo. Después de agitar durante 1 hora a temperatura ambiente, el pH de la solución se ajusta a pH 8 con NaOH (1N) y la mezcla se agita en una habitación fría (4°C) durante la noche. El conjugado de BSA se purifica a través de una columna SEPHADEX® G-25 equilibrada (C26 x 70) con regulador PBS (NaH²PO⁴0.1 M/Na²PO⁴, pH 7) y se eluye con el mismo regulador PBS. Se utiliza un detector de UV a 280 nm para controlar las fracciones eluidas de la columna. Se observa una separación limpia entre el conjugado BSA y el hapteno IVa no conjugado. Las fracciones que contienen conjugado de BSA (Va) se combinan hasta un total de 57 ml, y se determina que la concentración de Va es de 2.52 mg/ml mediante el ensayo de concentración de proteína BCA (Pierce Biotechnology, Rockford IL).

Preparación de anticuerpo monoclonal que se une al dominio D1 de sirolimus. Los anticuerpos monoclonales que se unen al dominio D1 de la molécula de sirolimus se preparan como sigue. El inmunógeno es el conjugado Va de BSA preparado como se describió anteriormente. Este inmunógeno se usa para inmunizar ratones Balb/c. La primera inmunización es de 25 |jg en un volumen de 200 |jl con monofosforil lípido A y adyuvante dicorrinomicolato de trehalosa sintético (RIBI MPL+TDM Emulsion, RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton MT) por vía intraperitoneal. Cinco semanas después, se administra una inmunización de refuerzo con 25 jg del inmunógeno en 200 j l de monofosforil lípido A y adyuvante de dicorrinomicolato de trehalosa sintético por vía intraperitoneal. Posteriormente, después de otras 8 semanas, se administra un refuerzo de perfusión de 25 |jg del inmunógeno en 200 |jl de solución salina equilibrada de Hanks por vía intravenosa e intraperitoneal.

Tres días después, se realiza la fusión mediante métodos estándar usando un mieloma murino no secretor designado P3x63-AG8.653. La clonación se lleva a cabo mediante métodos estándar.

Los clones se criban mediante el siguiente procedimiento de inmunoensayo ELISA inverso de acuerdo con el siguiente protocolo. Las placas se recubren con IgG policlonal de cabra anti-ratón (IgG+IgA+IgM) (Zymed Laboratories, South San Francisco CA) a 5 jg/m l en solución salina regulada con fosfato a 100 j l por pozo. El revestimiento de la placa se realiza durante 2 horas o más a temperatura ambiente o durante la noche a aproximadamente 4°C. Después, las placas se secan y se bloquean con 300 j l por pozo de diluyente de regulador de bloqueo (albúmina de suero bovino al 0.5%, TWEEN® 20 al 0.05% en PBS). El bloqueo de la placa se realiza mediante incubación durante 15 minutos o más a temperatura ambiente con agitación de la placa. A continuación, se secan las placas. El anticuerpo monoclonal que se va a cribar se añade luego a cada pozo como sigue: se añadieron 50 j l por pozo de diluyente de regulador de bloqueo junto con 50 j l por pozo de sobrenadante de cultivo transferido desde el pozo correspondiente en la placa de crecimiento de fusión. La incubación es de aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente con agitación. La placa se lava con un lavador de placas TITERTECK PLUS® con apilador S20, siendo el regulador de lavado PBS con TWEEN® 20 al 0.05%. Un conjugado enzimático de sirolimus acoplado covalentemente a glucosa-6-fosfato deshidrogenasa diluido en diluyente de regulador de bloqueo a 1:4000 se añade a 100 j l por pozo. La incubación se realiza durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Luego se lava la placa y se agrega una solución cromogénica a un volumen de 100 j l por pozo. La solución cromogénica contiene violeta de pyodonitrotetrazolio 0.593 mM, NAD 0.02 M, glucosa-6-fosfato 0.033 M, Tris 0.055 M, azida sódica al 0.02% y una dilución 1:4000 de diaforasa (lipoil deshidrogenasa). BSA está presente al 1% (vol/vol) de una solución de BSA al 5% p/vol. BSA se utiliza para ayudar a prevenir la precipitación rápida de violeta de p-iodonitrotetrazolio reducido.

A partir del cribado, se selecciona un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal adecuado que se une al dominio D1 de sirolimus.

Preparación de solución de pretratamiento hemolítico. Esta solución de pretratamiento contiene 5 jg/m l de FK506, 6.8 mg/ml de sal sódica PIPES™ 1.5, 0.3 mg/ml de EDTA disódico, 1.0 mg/ml de saponina, 0.2% de PROCLIN® 300, 0.024 mg/ml de sulfato de neomicina y 0.99 mg/ml de NaN3, pH 6.5. La concentración de FK506 en la mezcla de reacción final es, 1 jg/ml.

Preparación de anticuerpo monoclonal que se une a tacrolimus y sirolimus

Preparación de conjugados de tacrolimus-hemocianina de lapa californiana. A una solución de tacrolimus monooxima (32.3 mg, 36.8 jmol) en 1.05 ml de dimetilformamida anhidra se añade clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDAC) (11 mg, 57.4 jM , 1.5 equiv.) y N-hidroxisuccinimida (7.3 mg, 63.4 jM , 1.7 equiv.). El enlace se encuentra en la posición C22 de la molécula de tacrolimus. La reacción se agita a temperatura ambiente durante 1 hora bajo argón. A continuación, la mezcla se añade gota a gota mediante una jeringa a una solución de hemocianina de lapa californiana (74 mg, 54% de pureza) en 5.0 ml de solución salina regulada con fosfato (0.1 M, pH 8.0) y 0.25 ml de dimetilformamida. Después de agitar a temperatura ambiente durante 2 horas, la suspensión resultante se dializa (1 x 4 l, 4°C, 2 horas) frente a PBS (solución salina regulada con fosfato) (10 mM, pH 7.0).

La mezcla resultante se extrae luego 3 veces con cloruro de metileno para eliminar cualquier traza de monooximas de tacrolimus sin reaccionar. El análisis cuantitativo de la mezcla se realiza usando una solución de ensayo de proteína de ácido bicinconínico (BCA) para dar 50 mg de inmunógeno en 8 ml de PBS (10 mM, pH 7.0).

La determinación del número de haptenos usando el método TNBS (A.F.S.A. Habeeb, Anal. Biochem. 14: 328 (1966)) da un número de haptenos de 1300. El inmunógeno se congela inmediatamente usando un baño de hielo seco-acetona y se mantiene a -20°C para almacenamiento.

Se prepara una mezcla de inmunógenos que contiene tres isómeros posicionales de tacrolimus (KLH enlazado en la posición C32, KLH enlazado en la posición C24 y KLH enlazado en las posiciones C32 y C24) como sigue: Se seca el tacrolimus (301.3 mg) en un matraz de fondo redondo al vacío durante 1.5 horas. Al matraz se añade una barra agitadora, anhídrido succínico (568.2 mg), 4-(dimetilamino)piridina (46.3 mg), diclorometano (2 ml, anhidro) y piridina (2.093 ml). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente (24°C) bajo atmósfera de nitrógeno durante 24.5 horas. Tres isómeros posicionales son los productos de esta reacción: tacrolimus-32-succinato, tacrolimus-24-succinato y tacrolimus-24, 32-di-succinato. Una vez que se detiene la reacción, el disolvente se elimina mediante evaporación rotatoria y el producto se seca más mediante una bomba de vacío durante dos horas.

A un vial se añade la mezcla de succinato de tacrolimus anterior (2.5 mg, 2.8 |jmol), N-hidroxisuccinimida (1.0 mg, 8.7 |jmol) y acetonitrilo anhidro (250 jl). La mezcla se tapa y se agita a temperatura ambiente. A la mezcla en agitación se añade N,N-diciclohexilcarbodiimida (3.0 mg, 15 jmol). Se tapa el vial y se agita la mezcla a temperatura ambiente.

Después de 2 horas, la mezcla se evapora a sequedad. El material resultante se disuelve en N,N-dimetilformamida anhidra (250 jl). Esta es la solución de trabajo de succinato de FK506 activado.

En un vial de 20 ml se añade una solución de KLH (8 mg) en 8 ml de regulador fosfato 10 mM pH 8 y DMF (1.5 ml). La mezcla se enfría a aproximadamente 4°C y se añaden gota a gota con agitación 200 jL de la solución de trabajo anterior a la solución enfriada. La mezcla se agita durante 16-24 horas a 4°C y luego se diluye a 30 ml con agua, se desala con dos filtros CENTRICON® 30 y se reconstituye con agua fresca 3 veces más. El material final se diluye a 10 ml con agua. La concentración de proteína se determina mediante el método de ensayo de proteína BCA.

Preparación de anticuerpo monoclonal para tacrolimus y sirolimus. El anticuerpo monoclonal que se une a tacrolimus y sirolimus se prepara de la siguiente manera. El inmunógeno es un conjugado de tacrolimus-hemocianina de lapa californiana preparado como se describió anteriormente. Este inmunógeno se usa para inmunizar ratones Balb/c. La primera inmunización es de 25 jg en un volumen de 200 j l con monofosforil lípido A y adyuvante dicorrinomicolato de trehalosa sintético (RIBI MPL+TDM Emulsion, RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton MT) por vía intraperitoneal. Cinco semanas después, se administra una inmunización de refuerzo con 25 jg del inmunógeno en 200 j l de monofosforil lípido A y adyuvante de dicorrinomicolato de trehalosa sintético por vía intraperitoneal. Posteriormente, después de otras 8 semanas, se administra un refuerzo de prefusión de 25 jg del inmunógeno en 200 j l de solución salina equilibrada de Hanks por vía intravenosa e intraperitoneal.

Tres días después, la fusión se realiza mediante métodos estándar usando un mieloma murino no secretor designado P3x63-AG8.653. La clonación se lleva a cabo mediante métodos estándar.

Los clones se cribaron mediante el siguiente procedimiento de inmunoensayo ELISA inverso de acuerdo con el siguiente protocolo. Las placas se recubren con IgG policlonal de cabra anti-ratón (IgG+IgA+IgM) (Zymed Laboratories, South San Francisco CA) a 5 jg/m l en solución salina regulada con fosfato a 100 j l por pozo. El revestimiento de la placa se realiza durante 2 horas o más a temperatura ambiente o durante la noche a aproximadamente 4°C; las placas se pueden almacenar envueltas en una película a aproximadamente 4°C durante varios días. Después, las placas se secan y bloquean con 300 j l por pozo de diluyente de regulador de bloqueo (albúmina de suero bovino al 0.5%, Tween® 20 al 0.05% en PBS). El bloqueo de la placa se realiza mediante incubación durante 15 minutos o más a temperatura ambiente con agitación de la placa. A continuación, se secan las placas. A continuación, se añade a cada pozo el anticuerpo monoclonal que se va a seleccionar como sigue: se añaden 50 j l por pozo de diluyente de regulador de bloqueo junto con 50 j l de sobrenadante de cultivo por pozo transferido desde el pozo correspondiente en la placa de crecimiento de fusión. La incubación es de aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente con agitación. La placa se lava con un lavador de placas TITERTECK PLUS® con apilador S20, siendo el regulador de lavado PBS con TWEEN® 20 al 0.05%. Un conjugado enzimático de tacrolimus acoplado covalentemente a glucosa-6-fosfato deshidrogenasa diluida en diluyente de regulador de bloqueo a 1:4000 se añade a 100 j l por pozo. La incubación se realiza durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Luego se lava la placa y se agrega una solución cromogénica a un volumen de 100 j l por pozo. La solución cromogénica contiene violeta de pyodonitrotetrazolio 0.593 mM, NAD 0.02 M, glucosa-6-fosfato 0.033 M, Tris 0.055 M, azida sódica al 0.02% y una dilución 1:4000 de diaforasa (lipoil deshidrogenasa). BSA está presente al 1% (vol/vol) de una solución de BSA al 5% p/vol. BSA se utiliza para ayudar a prevenir la precipitación rápida de violeta de p-iodonitrotetrazolio reducido.

A partir del cribado, se selecciona un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal adecuado. Este monoclonal se denomina anticuerpo marcador porque el anticuerpo se une tanto al sirolimus como al tacrolimus.

Ejemplo 2

Determinación de sirolimus mediante el ensayo en sándwich de partículas de cromo automatizado

Preparación de conjugado anti-sirolimus F(ab')2-p-galactosidasa usando un anticuerpo monoclonal que se une al dominio D1 de sirolimus. El anticuerpo monoclonal anti-sirolimus que se une al dominio D1 de sirolimus (preparado como se describió anteriormente en el Ejemplo 1) se fragmenta en F(ab')2 usando digestión con lisil-endopeptidasa (Wako, Richmond, VA) y luego se conjuga con p-galactosidasa usando un conector SMCC heterobifuncional estándar (succinimidil trans-4-(N-maleimidilmetil)ciclohexano-1-carboxilato) de acuerdo con técnicas conocidas. La solución de conjugado de anticuerpos contiene aproximadamente 2.0 jg/m l de conjugado de anticuerpo anti-sirolimus-pgalactosidasa, 30 mg/ml de albúmina sérica bovina sin proteasa, 0.126 mg/ml de MgCh, 0.03 ml/ml de etilenglicol, 24.5 mg/ml de HEPES, 38.5 mg/ml de Na HEPES, 50 mg/ml de NaCl y muteína beta-gal (beta-galactosidasa inactivada), pH 7.8.

Preparación de partículas magnéticas de cromo. Las partículas de cromo (inmunoensayo en fase sólida) se preparan conjugando un anticuerpo monoclonal que se une al dominio D1 de sirolimus (preparado como se describió anteriormente en el Ejemplo 1 usando como inmunógeno C-26-Sirolimus Oxima-BSA Conjugado (Va) (R⁵ = BSA en la Figura 6)) a partículas de dióxido de cromo recubiertas con glutaraldehído. El reactivo de cromo contiene partículas de cromo y 60.4 mg/ml de trehalosa dihidrato y 7.2 mg/ml de polietilenglicol (PEG) 8000. En el estudio se utilizan tres concentraciones de partículas de cromo, a saber, 5, 2.5 y 1.67 mg/ml.

Ensayo de sirolimus tipo sándwich. El principio y el funcionamiento del ensayo en sándwich para sirolimus es el siguiente: Se combina una muestra de sangre completa (50 |jL) que contiene sirolimus con un reactivo de pretratamiento hemolítico preparado como se describe anteriormente en un recipiente de reacción en el analizador DIMENSION® RxL. La sangre completa se extrae de una taza estándar mezclando primero la sangre con la sonda de muestra ultrasónica. La mezcla de la muestra de sangre completa con la solución de pretratamiento asegura la hemólisis de la sangre completa y el desplazamiento de las moléculas de sirolimus unidas a proteínas de sus dominios de unión.

Se añade a los recipientes de reacción conjugado anti-sirolimus F(ab')2-p-galactosidasa preparado utilizando el anticuerpo monoclonal que se une al dominio D1 del sirolimus (50 j l) y la mezcla se mantiene durante un período de tiempo (35 segundos) y a una temperatura de 43°C para permitir que sirolimus, si está presente, reaccione con el conjugado de enzima anticuerpo. Se añaden (50 j l) a los recipientes de reacción partículas de cromo con anticuerpo monoclonal inmovilizado que se une tanto a tacrolimus como a sirolimus y se permite que se unan al complejo antisirolimus F(ab')2-p-galactosidasa para formar un sándwich. Esta mezcla de reacción se incuba durante 14 min a una temperatura de 43°C antes de que comiencen los ciclos automatizados de separación magnética, mezcla y lavado en el instrumento DIMENSION®. Se emplean un total de 4 ciclos de separación/lavado para eliminar el conjugado antisirolimus F(ab')2-p-galactosidasa no unido y los residuos de la muestra. Los lavados de cromo automatizados se realizan sobre la placa utilizando una solución de lavado químico a pH 8.0 en regulador HEPES, ambos proporcionados para el módulo de inmunoensayo heterogéneo DIMENSION®. Las partículas de cromo lavadas se resuspenden luego en la solución de lavado químico mediante mezcla por ultrasonidos y una porción (54 j l) de las partículas de cromo suspendidas se transfieren a una cubeta fotométrica para mezclar con una solución de sustrato de p-galactosidasa (rojo clorofenol-p-D-galactopiranósido o CPRG). El sirolimus unido al conjugado anti-sirolimus F(ab')2-p-galactosidasa en la superficie de la partícula de cromo se detecta midiendo la tasa enzimática del conjugado en presencia de CPRG. La velocidad para cada recipiente de reacción se mide bicromáticamente a 577 y 700 nm. Los resultados indican una detección exitosa de sirolimus.

Ejemplo 3

Determinación de sirolimus mediante ensayo en sándwich ELISA automatizado

Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) tipo sándwich para sirolimus. Se emplean los siguientes pasos: Paso 1:50 j l de anticuerpo monoclonal purificado que se une al dominio D1 de sirolimus (preparado como se describió anteriormente en el Ejemplo 1 usando como inmunógeno C-26-Sirolimus Oxime-BSA Conjugate (Va) (R⁵ = BSA en la Figura 6)) (10 jg/m l en PBS) se recubren sobre placas de ELISA durante la noche a 4°C. Las placas se lavan con agua MILLI-Q® (Millipore Corporation, Billerica MA) que contiene 0.05% de TWEEN® 20. Paso 2: 200 j l de solución de PCT Blocker (0.5% de caseína (proteína de leche) en regulador fosfato que contiene 0.05% de TWEEN® 20) se añade a cada pozo y los medios se incuban a temperatura ambiente durante 30 min. Las placas se lavan usando agua MILLI-Q® que contiene 0.05% de TWEEN® 20. Paso 3: Se añaden 50 j l de la concentración deseada de sirolimus diluido en PBS a los respectivos pozos y se incuban los medios a temperatura ambiente durante 30 min. Las placas se lavan usando agua MILLI-Q® que contiene 0.05% TWEEN® 20. Las concentraciones de fármaco sirolimus ensayadas son 0, 0.01, 0.02, 0.04, 0.08, 0.16, 0.31, 0.63, 1.25, 2.50, 5.0 y 10.0 ng/ml, respectivamente. Paso 4: El conjugado anti-sirolimus F(ab')2-p-galactosidasa preparado usando el anticuerpo monoclonal que se une tanto al tacrolimus como al sirolimus (preparado de una manera similar a la descrita anteriormente) (1:300 diluido en PCT Blocker solución) y los medios se incuban a temperatura ambiente durante 30 min. Las placas se lavan utilizando agua MILLI-Q® que contiene TWEEN® 20 al 0.05%. Paso 5: Se añade la solución de sustrato de p-gatactosidasa CPRG a cada pozo (100 jl/pozo). Paso 6: Los pozos se leen en un lector de placas a 577 nm cada minuto durante 20 min. Los resultados indican una detección exitosa de sirolimus.

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar la presencia y/o cantidad de una molécula pequeña que tiene un peso molecular de aproximadamente 500 a aproximadamente 2500, siendo dicha molécula pequeña un fármaco inmunosupresor que comprende un anillo de 15 a 50 miembros, en una muestra que se sospecha que contiene la molécula pequeña, en donde el fármaco inmunosupresor es sirolimus, comprendiendo el método:

(a) proporcionar en combinación en un medio:

(i) la muestra,

(ii) un primer asociado de unión que se une a y es específico para una primera porción de la molécula pequeña, en donde el primer asociado de unión es un anticuerpo monoclonal que no exhibe sustancialmente ninguna afinidad de unión por tacrolimus, y

(iii) un segundo asociado de unión que se une a la molécula pequeña en una segunda porción de la molécula pequeña distinta de la primera, en donde el segundo asociado de unión se prepara a partir de un inmunógeno que comprende un hapteno que no es la molécula pequeña o un derivado de la molécula pequeña en donde el hapteno comprende una unidad estructural que es estructuralmente similar a la de la segunda porción de la molécula pequeña, en donde tanto el primer asociado de unión como el segundo asociado de unión son anticuerpos monoclonales, y en donde el segundo anticuerpo monoclonal es un anticuerpo anti-tacrolimus y se prepara y selecciona para la unión tanto de tacrolimus como de sirolimus.

(b) incubar el medio bajo condiciones para la unión del primer asociado de unión y el segundo asociado de unión a la molécula pequeña, y

(c) examinar el medio para detectar la presencia de un inmunocomplejo que comprende la molécula pequeña, el primer asociado de unión y el segundo asociado de unión, la presencia y/o la cantidad del inmunocomplejo que indica la presencia y/o la cantidad de la molécula pequeña en la muestra.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el fármaco inmunosupresor es sirolimus y el hapteno del inmunógeno es tacrolimus o un derivado del mismo.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde uno del primer asociado de unión y el segundo asociado de unión comprende un miembro de un sistema de producción de señales.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde uno de el primer asociado de unión y el segundo asociado de unión está unido a un soporte.5

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la primera porción consiste esencialmente en una porción trieno del fármaco inmunosupresor que es sirolimus.