CN110907649A - 一种检测短链脂肪酸的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测短链脂肪酸的试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板、短链脂肪酸标准品梯度溶液、样品稀释液、碱性磷酸酶标记的检测抗短链脂肪酸结合物的抗体、20×浓缩洗涤液、显色剂、终止液及封板膜、密封袋和说明书；其中，所述酶标板为透明聚苯乙烯96或48孔酶标板，且其各孔包被有浓度为5μg/mL的抗短链脂肪酸单克隆抗体Mab1；所述短链脂肪酸标准品梯度溶液有6个浓度的溶液，分别为20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0ng/mL。本发明的检测试剂盒提供了一种以碱性磷酸酶(ALP)标记的酶标二抗，显著提高了试剂盒的稳定性和灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测胃肠菌群代谢产物的试剂盒，尤其涉及一种检测短链脂肪酸(SCFAs)的以碱性磷酸酶(ALP)做标记物的酶联免疫检测试剂盒及其应用。
背景技术
短链脂肪酸(Short-chain fatty acids，SCFAs)是由益生菌，主要是肠道厌氧益生菌发酵膳食纤维和部分氨基酸和蛋白质的终产物，主要包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸和己酸等。短链脂肪酸不仅能为机体细胞提供能量，同时具有抑制致病菌、抑制肠道上皮细胞和骨髓细胞的炎症反应等作用，并可以调节机体代谢平衡，降低炎症性肠病、肥胖和II型糖尿病等疾病的发生率。
目前关于肠道菌群的重要作用已有明确证实，对于其详细机制的研究也在逐渐开展，也有证据显示SCFA是介导肠道菌群有益作用的重要效应分子。因此，针对短链脂肪酸实施进一步检测对于肠道健康具有重要意义。
现有技术中，气象色谱法是最常用的短链脂肪酸检测方法，但气象色谱法设备复杂、昂贵，使用成本高；操作复杂，人员需要专职培训，操作繁琐。因此其难以在常规工作和基层实验室中推广，应用受到极大的限制。除气相色谱法外，相关的酶联免疫试剂盒也开始获得关注，但检索国家食品药品监督管理总局网站，国产试剂和进口试剂均未搜索到短链脂肪酸检测试剂盒注册文号。文献报道的相关酶联免疫试剂盒均为辣根过氧化物酶(HRP)标记物，该标记物较不稳定，试剂盒灵敏度不高。有关以碱性磷酸酶(ALP)做标记物、既操作简单且标记物稳定、灵敏度高的检测短链脂肪酸试剂盒的酶联免疫检测试剂盒还未见报道。
发明内容
针对现有技术中气象色谱法检测设备复杂、昂贵，且操作繁琐，难以在常规实验室工作或在基层实验室中推广的不足，本发明的目的在于提供一种检测短链脂肪酸(SCFAs)的以碱性磷酸酶(ALP)做标记物的酶联免疫检测试剂盒及其应用，以克服现有酶联免疫试剂盒不稳定和灵敏度较低的缺陷。
本发明所述的检测短链脂肪酸的试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板、短链脂肪酸标准品梯度溶液、样品稀释液、碱性磷酸酶(ALP)标记的检测抗短链脂肪酸结合物的抗体、20×浓缩洗涤液、显色剂、终止液及封板膜、密封袋和说明书；
其特征在于：
所述酶标板为透明聚苯乙烯96或48孔酶标板，且其各孔包被有浓度为5μg/mL的抗短链脂肪酸单克隆抗体Mab1；
所述短链脂肪酸标准品梯度溶液有6个浓度的溶液，以如下方法制得：按乙酸:丙酸:丁酸:戊酸:己酸＝60mg/ml:25mg/ml:14mg/ml:0.5mg/ml:0.5mg/ml的比例，制备模拟血清中的短链脂肪酸标准品；再配制含5wt％牛血清白蛋白、0.85wt％氯化钠的pH＝7.0的1.0mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的缓冲液获得标准品缓冲液；再以标准品缓冲液制备标准品浓度梯度为20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0ng/mL的6个标准品溶液，其中0ng/mL为标准品缓冲液；
所述样品稀释液的配方是：除菌的1000mL纯水中，含NaCl 8g、NaH2PO4·2H2O0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、表面活性剂S9 3g、酪蛋白钠盐5g、Proclin300 1mL；
所述碱性磷酸酶(ALP)标记的检测抗短链脂肪酸结合物的抗体是细菌碱性磷脂酶标记的抗短链脂肪酸单克隆抗体Mab2；
所述20×浓缩洗涤液的配方是：除菌的50mL双蒸水中，含NaCl 8.0g、NaH2PO4·2H2O0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、吐温20 0.5mL；
所述显色剂是50mg PNPP、1mg MgCl2·6H2O与10mL二乙醇胺制成的pH＝9.8的混合液；
所述终止液是浓度为2mol/L的硫酸溶液。
其中：所述抗短链脂肪酸单克隆抗体Mab1或细菌碱性磷脂酶标记的抗短链脂肪酸单克隆抗体Mab2优选山东莱博生物科技有限公司产品。
本发明所述检测短链脂肪酸的试剂盒的制备方法，步骤是：
1)酶标板的制备：
1.1)配制包被液：配制0.1mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，并调整pH值为9.0；称取α-环糊精1g加入到1L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液中，制得包被缓冲液；
1.2)配制洗涤液，洗涤液的配方及制法是：
过滤除菌，4℃保存；
1.3)配制封闭液，封闭液的配方及制法是：
过滤除菌，4℃保存；
1.4)用包被液将抗短链脂肪酸单克隆抗体Mab1稀释至工作浓度5μg/mL，混匀，并静置15分钟；
1.5)取标记好的酶标板，用8孔道排枪点板，使抗体液达到100μL/孔，盖上盖板膜；
1.6)置于2℃-8℃冰箱，过夜包被20-24小时；
1.7)取出包被板，室温平衡30min，甩掉抗体液，吸水纸拍干，每孔每次加300μL洗涤液，洗涤2次，吸水纸拍干；
1.8)每孔加入200μL封闭液，2℃-8℃过夜封闭16小时；
1.9)取出包被板，室温平衡30min，甩掉封闭液，吸水纸拍干；放在硅胶干燥器中干燥，在室温条件下，湿度30％以下保持5小时；
1.10)以铝箔袋真空包装，做好标记，2-8℃保存，备用；
2)试剂盒溶液的配制：
2.1)基础溶液的配制
抗体稀释液配方是：
调整pH为7.4，过滤除菌，4℃保存；
20×浓缩洗涤液的配方是：除菌的50mL双蒸水中，含NaCl 8.0g、NaH2PO4·2H2O0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、吐温20 0.5mL；
短链脂肪酸标准品梯度溶液有6个浓度的溶液，以如下方法制得：按乙酸:丙酸:丁酸:戊酸:己酸＝60mg/ml:25mg/ml:14mg/ml:0.5mg/ml:0.5mg/ml的比例，制备模拟血清中的短链脂肪酸标准品；再配制含5wt％牛血清白蛋白、0.85wt％氯化钠的pH＝7.0的1.0mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的缓冲液获得标准品缓冲液；再以标准品缓冲液制备标准品浓度梯度为20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0ng/mL的6个标准品溶液，其中0ng/mL为标准品缓冲液；
样品稀释液的配方是：除菌的1000mL纯水中，含NaCl 8g、NaH2PO4·2H2O 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、表面活性剂S9 3g、酪蛋白钠盐5g、Proclin300 1mL；
显色剂是50mg PNPP、1mg MgCl2·6H2O与10mL二乙醇胺制成的pH＝9.8的混合液；
终止液是浓度为2mol/L的硫酸溶液；
2.2)按照棋盘法测定抗体效价、酶标二抗效价及抗体灵敏度，从而选择标准曲线各点，其中：
包被抗体：抗短链脂肪酸单克隆抗体Mab1工作浓度为0.5μg/mL，稀释液为包被液；
酶标二抗：细菌碱性磷脂酶标记的抗短链脂肪酸单克隆抗体Mab2工作效价为1:10000，稀释液为抗体稀释液；
标准曲线各点浓度分别是0ng/mL、1.25ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL，稀释液为标准品缓冲液；
3)试剂盒的精密度和准确性验证：通过平行测试中值短链脂肪酸标准品，验证试剂盒的精密度；试剂盒的准确性从试剂盒的样本回收率方面进行验证；
4)试剂盒灵敏度的测定：以短链脂肪酸浓度梯度检测不同量短链脂肪酸，确定试剂反应灵敏度。
本发明所述检测短链脂肪酸的试剂盒在检测短链脂肪酸中的应用。
其中，所述检测短链脂肪酸优选的方法是：
1)平衡：将待测样品及检测试剂盒内的试剂，于18～25℃平衡30±5分钟；
2)标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔按浓度梯度各加不同浓度的标准品50μL；
3)加样：将酶标包被板分别设空白孔、待测样品孔；在待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL，使样品最终稀释度为5倍；加样时将样品加于板的孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同；
4)加酶：每孔加入酶标试剂即细菌碱性磷脂酶标记的抗短链脂肪酸单克隆抗体Mab2100μL，空白孔除外；
5)温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟；
6)配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释20倍后备用；
7)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
8)显色：每孔加入显色剂50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；
9)终止：每孔加终止液50μL，终止反应；
10)测定：加终止液后15分钟以内，以空白孔调零，405nm波长依序测量各孔的吸光度即OD值；
11)以标准品的各浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，待测样品根据测得的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数，得到样品的实际浓度；或用标准品的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将待测样品的OD值代入方程式，计算出样品的浓度，再乘以稀释倍数，得到样品的实际浓度。
本发明公开的检测短链脂肪酸(SCFAs)的以碱性磷酸酶(ALP)做标记物的酶联免疫检测试剂盒，提供了一种除气相色谱外的更便捷的检测方法，该方法具有稳定性高、灵敏度高、选择性强，检测速度快、费用低廉、仪器简单易携、易于操作等优点，可用于现场检验。克服了现有技术中检测短链脂肪酸时，需由专业的操作人员在气相色谱仪上进行检测，常规工作和基层实验室中由于缺少气相色谱仪及专业操作人员，而无法开展气相色谱法检测的不足。
现有技术中酶联免疫试剂盒采用辣根过氧化物酶(HRP)标记的较多，但其稳定性较差，灵敏度低。本发明公开的检测短链脂肪酸(SCFAs)的酶联免疫检测试剂盒，提供了一种以碱性磷酸酶(ALP)标记的酶标二抗，显著提高了试剂盒的稳定性和灵敏度。
本发明的检测短链脂肪酸的酶联免疫检测试剂盒，在样品稀释液中加入阳离子表面活性剂S9，并限定其浓度为0.3wt％，利用其分散作用为短链脂肪酸与包被抗体提供无障碍的接触机会，提高了回收率；同时利用其崩解作用，降低竞争物质的非特异性结合，提高了试剂盒的特异性，从而将灵敏度提高至0.1ng/mL，显著高于现有相关产品。
附图说明
图1短链脂肪酸试剂盒线性分析曲线。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
下述实施例中，所使用的实验方法，未做具体说明的，均为常规方法，实施例所用抗短链脂肪酸单克隆抗体Mab1或细菌碱性磷脂酶标记的抗短链脂肪酸单克隆抗体Mab2产自山东莱博生物科技有限公司。实施例所用试剂均为市售产品。
实施例1
本发明所述检测短链脂肪酸的试剂盒，包括设在盒体内的酶标板、短链脂肪酸标准品梯度溶液、样品稀释液、碱性磷酸酶(ALP)标记的检测抗短链脂肪酸结合物的抗体、20×浓缩洗涤液、显色剂、终止液及封板膜、密封袋和说明书；
其中：
所述酶标板为透明聚苯乙烯96或48孔酶标板，且其各孔包被有浓度为5μg/mL的抗短链脂肪酸单克隆抗体Mab1；
所述短链脂肪酸标准品梯度溶液有6个浓度的溶液，以如下方法制得：按乙酸:丙酸:丁酸:戊酸:己酸＝60mg/ml:25mg/ml:14mg/ml:0.5mg/ml:0.5mg/ml的比例，制备模拟血清中的短链脂肪酸标准品；再配制含5wt％牛血清白蛋白、0.85wt％氯化钠的pH＝7.0的1.0mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的缓冲液获得标准品缓冲液；再以标准品缓冲液制备标准品浓度梯度为20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0ng/mL的6个标准品溶液，其中0ng/mL为标准品缓冲液；
所述样品稀释液的配方是：除菌的1000mL纯水中，含NaCl 8g、NaH2PO4·2H2O0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、表面活性剂S9 3g、酪蛋白钠盐5g、Proclin300 1mL；
所述碱性磷酸酶(ALP)标记的检测抗短链脂肪酸结合物的抗体是细菌碱性磷脂酶标记的抗短链脂肪酸单克隆抗体Mab2；
所述20×浓缩洗涤液的配方是：除菌的50mL双蒸水中，含NaCl 8.0g、NaH2PO4·2H2O0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、吐温20 0.5mL；
所述显色剂是50mg PNPP、1mg MgCl2·6H2O与10mL二乙醇胺制成的pH＝9.8的混合液；
所述终止液是浓度为2mol/L的硫酸溶液。
上述检测短链脂肪酸的试剂盒分为96人份或48人份。每盒中包括抗短链脂肪酸单克隆抗体包被酶标板1块、ALP标记的检测抗体结合试剂、标准品6瓶、短链脂肪酸样品稀释液、显色剂、终止液、洗涤液(20×浓缩)各1瓶，说明书一份，不干胶纸片2张。
实施例2
本发明所述检测短链脂肪酸的试剂盒的制备方法，步骤是：
1)酶标板的制备：
1.1)配制包被液：配制0.1mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，并调整pH值为9.0；称取α-环糊精1g加入到1L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液中，制得包被缓冲液；
1.2)配制洗涤液，洗涤液的配方及制法是：
过滤除菌，4℃保存；
1.3)配制封闭液，封闭液的配方及制法是：
过滤除菌，4℃保存；
1.4)用包被液将抗短链脂肪酸单克隆抗体Mab1稀释至工作浓度5μg/mL，混匀，并静置15分钟；
1.5)取标记好的酶标板，用8孔道排枪点板，使抗体液达到100μL/孔，盖上盖板膜；
1.6)置于2℃-8℃冰箱，过夜包被20-24小时；
1.7)取出包被板，室温平衡30min，甩掉抗体液，吸水纸拍干，每孔每次加300μL洗涤液，洗涤2次，吸水纸拍干；
1.8)每孔加入200μL封闭液，2℃-8℃过夜封闭16小时；
1.9)取出包被板，室温平衡30min，甩掉封闭液，吸水纸拍干；放在硅胶干燥器中干燥，在室温条件下，湿度30％以下保持5小时；
1.10)以铝箔袋真空包装，做好标记，2-8℃保存，备用；
2)试剂盒溶液的配制：
2.1)基础溶液的配制
抗体稀释液配方是：
调整pH为7.4，过滤除菌，4℃保存；
20×浓缩洗涤液的配方是：除菌的50mL双蒸水中，含NaCl 8.0g、NaH2PO4·2H2O0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、吐温20 0.5mL；
短链脂肪酸标准品梯度溶液有6个浓度的溶液，以如下方法制得：按乙酸:丙酸:丁酸:戊酸:己酸＝60mg/ml:25mg/ml:14mg/ml:0.5mg/ml:0.5mg/ml的比例，制备模拟血清中的短链脂肪酸标准品；再配制含5wt％牛血清白蛋白、0.85wt％氯化钠的pH＝7.0的1.0mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的缓冲液获得标准品缓冲液；再以标准品缓冲液制备标准品浓度梯度为20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0ng/mL的6个标准品溶液，其中0ng/mL为标准品缓冲液；
样品稀释液的配方是：除菌的1000mL纯水中，含NaCl 8g、NaH2PO4·2H2O 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、表面活性剂S9 3g、酪蛋白钠盐5g、Proclin300 1mL；
显色剂是50mg PNPP、1mg MgCl2·6H2O与10mL二乙醇胺制成的pH＝9.8的混合液；
终止液是浓度为2mol/L的硫酸溶液。
实施例3
本发明所述检测短链脂肪酸的试剂盒在检测短链脂肪酸中的应用。
具体的检测短链脂肪酸的步骤是：
1)平衡：将待测样品及检测试剂盒内的试剂，于18～25℃平衡30±5分钟；
2)标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔按浓度梯度各加不同浓度的标准品50μL；
3)加样：将酶标包被板分别设空白孔、待测样品孔；在待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL，使样品最终稀释度为5倍；加样时将样品加于板的孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同；
4)加酶：每孔加入酶标试剂即细菌碱性磷脂酶标记的抗短链脂肪酸单克隆抗体Mab2100μL，空白孔除外；
5)温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟；
6)配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释20倍后备用；
7)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
8)显色：每孔加入显色剂50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；
9)终止：每孔加终止液50μL，终止反应；
10)测定：加终止液后15分钟以内，以空白孔调零，405nm波长依序测量各孔的吸光度即OD值；
11)以标准品的各浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，待测样品根据测得的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数，得到样品的实际浓度；或用标准品的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将待测样品的OD值代入方程式，计算出样品的浓度，再乘以稀释倍数，得到样品的实际浓度。
实施例4
试剂盒的线性、准确性、灵敏度、精密度的检测
1)试剂盒的线性
分别采用所述标准品溶液为6个浓度梯度，分别是：20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0ng/mL，用本发明的标准操作步骤进行标准溶液的OD值读数(见表1)，计算线性。画出短链脂肪酸试剂盒线性分析曲线，见图1。由图1可知，本试剂盒线性良好。
表1：试剂盒线性分析读数
| 标准品(ng/mL) | 20 | 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0 |
| 吸光度 | 4.056 | 2.117 | 1.025 | 0.546 | 0.285 | 0.023 |
2)试剂盒的准确性以样本回收率进行验证。
分别在标准品缓冲液(5ng/mL)中添加短链脂肪酸，使得短链脂肪酸最终浓度为15ng/mL、8ng/mL、0.3ng/mL，每个样本平行测试3次，计算回收率统计结果见表2。
表2：回收率
结果表明，高、中、低浓度的短链脂肪酸样本，回收率在85.7％～92.6％之间，平均回收率在86.9％～91.2％之间，总体回收率88.8％。
3)精密性试验：
以5ng/mL标准品平行测试10次，结果统计见表3。
表3：精密性试验结果
| 板孔号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 吸光度 | 0.801 | 0.785 | 0.875 | 0.851 | 0.793 | 0.813 | 0.868 | 0.886 | 0.892 | 0.898 |
精密性：CV％＝5.2％
4)灵敏度试验：
以短链脂肪酸浓度梯度检测不同量短链脂肪酸时试剂反应灵敏度。结果统计见表4。
表4：灵敏度试验结果
| 标准品(ng/mL) | 1.6 | 0.8 | 0.4 | 0.2 | 0.1 | 0.05 | 0 |
| 吸光度 | 0.302 | 0.237 | 0.183 | 0.153 | 0.121 | 0.085 | 0.023 |
试验结果表明，灵敏度为0.1ng/mL。
Claims (5)
1.一种检测短链脂肪酸的试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板、短链脂肪酸标准品梯度溶液、样品稀释液、碱性磷酸酶标记的检测抗短链脂肪酸结合物的抗体、20×浓缩洗涤液、显色剂、终止液及封板膜、密封袋和说明书；
其特征在于：
所述酶标板为透明聚苯乙烯96或48孔酶标板，且其各孔包被有浓度为5μg/mL的抗短链脂肪酸单克隆抗体Mab1；
所述短链脂肪酸标准品梯度溶液有6个浓度的溶液，以如下方法制得：按乙酸:丙酸:丁酸:戊酸:己酸＝60mg/ml:25mg/ml:14mg/ml:0.5mg/ml:0.5mg/ml的比例，制备模拟血清中的短链脂肪酸标准品；再配制含5wt％牛血清白蛋白、0.85wt％氯化钠的pH＝7.0的1.0mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的缓冲液获得标准品缓冲液；再以标准品缓冲液制备标准品浓度梯度为20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0ng/mL的6个标准品溶液，其中0ng/mL为标准品缓冲液；
所述样品稀释液的配方是：除菌的1000mL纯水中，含NaCl 8g、NaH2PO4·2H2O 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、表面活性剂S9 3g、酪蛋白钠盐5g、Proclin300 1mL；
所述碱性磷酸酶标记的检测抗短链脂肪酸结合物的抗体是细菌碱性磷脂酶标记的抗短链脂肪酸单克隆抗体Mab2；
所述20×浓缩洗涤液的配方是：除菌的50mL双蒸水中，含NaCl 8.0g、NaH2PO4·2H2O0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、吐温20 0.5mL；
所述显色剂是50mg PNPP、1mg MgCl2·6H2O与10mL二乙醇胺制成的pH＝9.8的混合液；
所述终止液是浓度为2mol/L的硫酸溶液。
2.根据权利要求1所述检测短链脂肪酸的试剂盒，其特征在于：所述抗短链脂肪酸单克隆抗体Mab1或细菌碱性磷脂酶标记的抗短链脂肪酸单克隆抗体Mab2购自山东探克生物科技股份有限公司。
3.权利要求1所述检测短链脂肪酸的试剂盒的制备方法，步骤是：
1)酶标板的制备：
1.1)配制包被液：配制0.1mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，并调整pH值为9.0；称取α-环糊精1g加入到1L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液中，制得包被缓冲液；
1.2)配制洗涤液，洗涤液的配方及制法是：
过滤除菌，4℃保存；
1.3)配制封闭液，封闭液的配方及制法是：
过滤除菌，4℃保存；
1.4)用包被液将抗短链脂肪酸单克隆抗体Mab1稀释至工作浓度5μg/mL，混匀，并静置15分钟；
1.5)取标记好的酶标板，用8孔道排枪点板，使抗体液达到100μL/孔，盖上盖板膜；
1.6)置于2℃-8℃冰箱，过夜包被20-24小时；
1.7)取出包被板，室温平衡30min，甩掉抗体液，吸水纸拍干，每孔每次加300μL洗涤液，洗涤2次，吸水纸拍干；
1.8)每孔加入200μL封闭液，2℃-8℃过夜封闭16小时；
1.9)取出包被板，室温平衡30min，甩掉封闭液，吸水纸拍干；放在硅胶干燥器中干燥，在室温条件下，湿度30％以下保持5小时；
1.10)以铝箔袋真空包装，做好标记，2-8℃保存，备用；
2)试剂盒溶液的配制：
2.1)基础溶液的配制
抗体稀释液配方是：
调整pH为7.4，过滤除菌，4℃保存；
20×浓缩洗涤液的配方是：除菌的50mL双蒸水中，含NaCl 8.0g、NaH2PO4·2H2O 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、吐温20 0.5mL；
短链脂肪酸标准品梯度溶液有6个浓度的溶液，以如下方法制得：按乙酸:丙酸:丁酸:戊酸:己酸＝60mg/ml:25mg/ml:14mg/ml:0.5mg/ml:0.5mg/ml的比例，制备模拟血清中的短链脂肪酸标准品；再配制含5wt％牛血清白蛋白、0.85wt％氯化钠的pH＝7.0的1.0mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的缓冲液获得标准品缓冲液；再以标准品缓冲液制备标准品浓度梯度为20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0ng/mL的6个标准品溶液，其中0ng/mL为标准品缓冲液；
样品稀释液的配方是：除菌的1000mL纯水中，含NaCl 8g、NaH2PO4·2H2O 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、表面活性剂S9 3g、酪蛋白钠盐5g、Proclin300 1mL；
显色剂是50mg PNPP、1mg MgCl2·6H2O与10mL二乙醇胺制成的pH＝9.8的混合液；
终止液是浓度为2mol/L的硫酸溶液；
2.2)按照棋盘法测定抗体效价、酶标二抗效价及抗体灵敏度，从而选择标准曲线各点，其中：
包被抗体：抗短链脂肪酸单克隆抗体Mab1工作浓度为0.5μg/mL，稀释液为包被液；
酶标二抗：细菌碱性磷脂酶标记的抗短链脂肪酸单克隆抗体Mab2工作效价为1:10000，稀释液为抗体稀释液；
标准曲线各点浓度分别是0ng/mL、1.25ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL，稀释液为标准品缓冲液；
3)试剂盒的精密度和准确性验证：通过平行测试中值短链脂肪酸标准品，验证试剂盒的精密度；试剂盒的准确性从试剂盒的样本回收率方面进行验证；
4)试剂盒灵敏度的测定：以短链脂肪酸浓度梯度检测不同量短链脂肪酸，确定试剂反应灵敏度。
4.权利要求1所述检测短链脂肪酸的试剂盒在检测短链脂肪酸中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测短链脂肪酸的方法是：
1)平衡：将待测样品及检测试剂盒内的试剂，于18～25℃平衡30±5分钟；
2)标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔按浓度梯度各加不同浓度的标准品50μL；
3)加样：将酶标包被板分别设空白孔、待测样品孔；在待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL，使样品最终稀释度为5倍；加样时将样品加于板的孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同；
4)加酶：每孔加入酶标试剂即细菌碱性磷脂酶标记的抗短链脂肪酸单克隆抗体Mab2100μL，空白孔除外；
5)温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟；
6)配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释20倍后备用；
7)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
8)显色：每孔加入显色剂50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；
9)终止：每孔加终止液50μL，终止反应；
10)测定：加终止液后15分钟以内，以空白孔调零，405nm波长依序测量各孔的吸光度即OD值；
11)以标准品的各浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，待测样品根据测得的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数，得到样品的实际浓度；或用标准品的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将待测样品的OD值代入方程式，计算出样品的浓度，再乘以稀释倍数，得到样品的实际浓度。
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