CN113156130A - 一种检测cd47的酶联免疫试剂盒及其制备方法与应用 - Google Patents

一种检测cd47的酶联免疫试剂盒及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测CD47的酶联免疫试剂盒及其制备方法与应用。本发明的酶联免疫试剂盒，包括碱性磷酸酶标记的纳米金功能化修饰的抗CD47结合物的抗体、样品稀释液、酶标板、CD47标准品梯度溶液、酶标抗体稀释液、20×浓缩洗涤液、显色剂和终止液。本发明采用了碱性磷酸酶标记的纳米金功能化修饰的抗CD47结合物的抗体，以碱性磷酸酶标记替代传统辣根过氧化物酶标记，引入了纳米金和双抗(辅助抗体/抗体)，通过多次信号放大方法，显著提高了试剂盒的稳定性和检测灵敏度。另外，碱性磷酸酶标记的纳米金功能化修饰的抗CD47结合物的抗体引入了价格低廉易获得的辅助抗体aMab2，减少了Mab2的用量，极大地降低生产成本。

Description

一种检测CD47的酶联免疫试剂盒及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于医学检测试剂盒技术领域，具体涉及一种检测CD47的酶联免疫试剂盒及其制备方法与应用。
背景技术
CD47，又称为整合素相关蛋白(integrin-associated protein，IAP)，是免疫球蛋白超家族(immunoglobulins superfamily，IgSF)中的重要成员，是一种跨膜糖蛋白，具有氨基末端免疫球蛋白结构域和羧基末端多重跨膜区域。
CD47主要参与两个重要的生理功能：(1)CD47与信号调节蛋白(signal-regulatory proteinα，SIRPα)的相互作用，CD47通过与巨噬细胞上表达的SIRPα受体结合，导致酪氨酸磷酸酶活化并抑制吞噬突触位点肌球蛋白的积聚，对巨噬细胞发送一个“别吃我”信号，发挥抗吞噬的作用。CD47的高表达增强了这个信号，从而限制了巨噬细胞的吞噬清除能力，低表达或不表达CD47的细胞可更好的被巨噬细胞清除。CD47几乎在所有肿瘤细胞表面过度表达，使得肿瘤细胞逃避巨噬细胞的吞噬作用；(2)CD47作为TSP-1信号传导的受体，TSP-1是一种基质细胞蛋白，在细胞外基质中表达，并通过细胞外表面受体和细胞外基质的其他成分相接触来调节细胞的功能，血管组织中的内源性TSP-1水平在血浆中具有重要的病理生理功能；在与TSP-1结合后，CD47可转导信号，改变细胞中钙离子、环核苷酸、整合素和生长因子信号，并控制细胞的活力和应激性。CD47通过与胞外、胞内以及其他的跨膜蛋白的横向相互作用发挥不同的功能，介导了不同的信号转导通路，CD47的表达量在肿瘤、血管类疾病、自体免疫性疾病等多种疾病中发挥着重要作用。研究发现，乳腺癌、胃癌、肺癌等患者肿瘤细胞、骨髓及外周血CD47均过量表达，较正常人群发生了2-10倍上调。因此，检测人体内CD47的含量，可以作为临床辅助诊断癌症的依据，具有潜在的临床应用价值。有研究进一步表明，肿瘤细胞、骨髓或外周血中CD47的高表达，是一种不利的预后因素，可以通过检测CD47的表达量，预判患者的治疗效果。因此，开发一款可以准确检测CD47含量的试剂盒是非常有必要的。
目前，文献上很少有报道关于CD47检测的试剂盒，市场有售的CD47酶联免疫试剂盒多采用辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗，其稳定性较差，灵敏度较低，且成本较高。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种检测CD47的酶联免疫试剂盒及其制备方法与应用，本发明中的试剂盒是以碱性磷酸酶(ALP)标记的纳米金功能化修饰的抗CD47结合物的抗体(aMab2-GNP-Mab2)检测CD47的酶联免疫试剂盒，该试剂盒操作简便、结果稳定、灵敏度高，具有临床诊断的潜在应用价值。
术语说明：
ALP：碱性磷酸酶。
BSA：牛血清白蛋白
Mab1：CD47单克隆抗体1。
Mab2：CD47单克隆抗体2。
aMab2：碱性磷酸酶标记的β-Actin单克隆抗体。
GNP：金纳米粒子，通常是指直径为0.8-250nm金的固体微粒。
PNPP：对硝基苯磷酸二钠。
室温：具有本领域公知的含义，一般是指25±2℃。
本发明的技术方案如下：
一种检测CD47的酶联免疫试剂盒，包括：碱性磷酸酶标记的纳米金功能化修饰的抗CD47结合物的抗体和样品稀释液；
所述碱性磷酸酶标记的纳米金功能化修饰的抗CD47结合物的抗体是CD47单克隆抗体2(Mab2)和碱性磷酸酶标记的β-Actin单克隆抗体(aMab2)附着于GNP表面组成的组合物aMab2-GNP-Mab2，所述Mab2和aMab2的质量比为(0.5-2):(2-5)；
所述样品稀释液的配方是：以除菌的1000mL纯水计，含NaCl 8g、NaH2PO4·2H2O0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、表面活性剂S9 3g、酪蛋白钠盐5g、Proclin300 1mL。
根据本发明优选的，所述检测CD47的酶联免疫试剂盒还包括：酶标板、CD47标准品梯度溶液、酶标抗体稀释液、20×浓缩洗涤液、显色剂和终止液。
进一步优选的，所述酶标板为96或48孔酶标板，且其各孔包被有CD47单克隆抗体1(Mab1)。
进一步优选的，所述CD47标准品梯度溶液包括浓度梯度为400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、0ng/mL的6个CD47标准品溶液，所述CD47标准品梯度溶液由标准品缓冲液配制得到，所述标准品缓冲液为含5wt％牛血清白蛋白、0.85wt％氯化钠的pH7.0的1.0mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的缓冲液。
进一步优选的，所述酶标抗体稀释液的配方是：NaCl 8.0g/L，NaH2PO4·2H2O0.2g/L，Na2HPO4·12H2O 2.9g/L，新生牛血清200mL/L，蔗糖30g/L，BSA 10g/L，PEG200002g/L，酪蛋白钠盐1g/L，Proclin300 1mL/L，吐温20 2mL/L，pH为7.4，溶剂为纯化水。
进一步优选的，所述20×浓缩洗涤液的配方是：以除菌50mL双蒸水计，含NaCl8.0g、NaH2PO4·2H2O 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、吐温20 0.5mL。
进一步优选的，所述显色剂是50mg PNPP、1mg MgCl2·6H2O与10mL二乙醇胺的混合液，pH 9.8。
进一步优选的，所述终止液是浓度为2mol/L的硫酸溶液。
本发明中的检测CD47的酶联免疫试剂盒还包括盒体、封板膜、密封袋和说明书。
一种上述检测CD47的酶联免疫试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
1)酶标板的制备：
1.1)配制包被液：配制0.1mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，并调整pH值为9.0；称取α-环糊精1g加入到1L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液中，制得包被缓冲液；
1.2)配制洗涤液，洗涤液的配方是：
NaCl 8.0g
NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O 0.2g
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O 2.9g
吐温20 0.5mL
纯化水 定容至1000mL
配制完成后过滤除菌，4℃保存；
1.3)配制封闭液，封闭液的配方是：
NaCl 8.0g
NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O 0.2g
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O 2.9g
蔗糖 30g
BSA 10g
酪蛋白钠盐 10g
吐温20 0.5mL
纯化水 定容至1000mL
配制完成后过滤除菌，4℃保存；
1.4)用包被液将CD47单克隆抗体1(Mab1)稀释至工作浓度5μg/mL，混匀，并静置15分钟；
1.5)取酶标板，用8孔道排枪点板，使Mab1抗体液达到100μL/孔，盖上盖板膜，置于2℃-8℃冰箱，过夜包被20-24小时；
1.6)取出过夜包被的酶标板，室温平衡30min，甩掉Mab1抗体液，吸水纸拍干，每孔每次加300μL洗涤液，洗涤2次，吸水纸拍干；
1.7)每孔加入200μL封闭液，2℃-8℃过夜封闭16小时；
1.8)取出过夜封闭的酶标板，室温平衡30min，甩掉封闭液，吸水纸拍干；放在硅胶干燥器中干燥，在室温条件下，湿度30％以下保持5小时；
1.9)以铝箔袋真空包装，做好标记，2-8℃保存，备用；
2)碱性磷酸酶标记的纳米金功能化修饰的抗CD47结合物的抗体(aMab2-GNP-Mab2)的制备：
首先配置GNP悬浮液，将200mL 0.01％HAuCl4·4H2O溶液置于磁力搅拌器搅拌，煮沸3min，然后快速加入6mL 1％的柠檬酸钠溶液，继续搅拌、加热，颜色逐渐无色变为黑色，然后呈透亮酒红色，继续煮沸10min，停止加热，并继续搅拌，冷却至室温，用双蒸水定容至200mL，将GNP悬浮液储存在棕色的瓶子里，避光保存，储存于4℃备用；
然后，将50mg的Mab2和aMab2按照(0.5-2):(2-5)的质量比加入到制备好的100mLGNP悬浮液中，轻轻搅拌均匀，静置2h，使得Mab2和aMab2通过相互作用附着在GNP表面；再加入10mL BSA溶液(5wt％)，轻轻搅拌均匀，静置30min后，于4℃、12000r/min离心10min，弃上清，底部得到暗红色沉积物即是aMab2-GNP-Mab2，冷却后储存于4℃备用；
3)试剂盒溶液的配制：
3.1)酶标抗体稀释液的配制，酶标抗体稀释液的配方是：
NaCl 8.0g
NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O 0.2g
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O 2.9g
新生牛血清 200mL
蔗糖 30g
BSA 10g
PEG20000 2g
酪蛋白钠盐 1g
Proclin300 1mL
吐温20 2mL
纯化水 定容至1000mL
配制完成后调整pH为7.4，过滤除菌，4℃保存；
3.2)20×浓缩洗涤液的配制，20×浓缩洗涤液的配方是：
NaCl 8.0g
NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O 0.2g
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O 2.9g
吐温20 0.5mL
双蒸水 定容至50mL
配制完成后过滤除菌，4℃保存；
3.3)CD47标准品梯度溶液按如下方法制得：
配制含5wt％牛血清白蛋白、0.85wt％氯化钠的pH 7.0的1.0mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的缓冲液为标准品缓冲液；再以标准品缓冲液制备浓度梯度为400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、0ng/mL的6个CD47标准品梯度溶液；
3.4)样品稀释液的配制，样品稀释液的配方是：
NaCl 8.0g
NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O 0.2g
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O 2.9g
表面活性剂S9 3g
酪蛋白钠盐 5g
Proclin300 1mL
纯化水 定容至1000mL
配制完成后过滤除菌，4℃保存；
3.5)显色剂的配制是将50mg PNPP、1mg MgCl2·6H2O与10mL二乙醇胺制成的pH9.8的混合液；
3.6)终止液是浓度为2mol/L的硫酸溶液。
本发明按照棋盘法确定抗体、酶标抗体最佳工作浓度及抗体灵敏度，从而选择标准曲线各点，其中：
包被抗体Mab1：CD47单克隆抗体1(Mab1)的工作浓度为5μg/mL，稀释液为包被液；
酶标抗体aMab2-GNP-Mab2：碱性磷酸酶标记的纳米金功能化修饰的抗CD47结合物的抗体aMab2-GNP-Mab2最佳稀释度为1:100000，稀释液为酶标抗体稀释液；
标准曲线各点浓度分别是0ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL，稀释液为标准品缓冲液；
本发明试剂盒的精密度和准确性验证：通过平行测试中值CD47标准品，验证试剂盒的精密度；试剂盒的准确性从试剂盒的样本回收率方面进行验证；
本发明试剂盒灵敏度的测定：以CD47浓度梯度检测不同量CD47，确定试剂反应灵敏度。
上述酶联免疫试剂盒在检测CD47中的应用。
上述酶联免疫试剂盒检测CD47的方法，步骤如下：
(1)平衡：将待测样品及检测试剂盒内的试剂，于18～25℃平衡30±5分钟；
(2)加样：将酶标板设置标准品孔和样本孔，样本孔包括空白孔和待测样品孔；在各孔中先加样品稀释液50μL，在标准品孔按浓度梯度各加入CD47标准品梯度溶液50μL；在空白孔中加样品稀释液50μL；在待测样品孔中加待测样品50μL；加样时将样品加于板的孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，用封板膜封板后置于37℃震荡温育30分钟；
(3)配液：将20×浓缩洗涤液用蒸馏水稀释20倍得洗涤液备用；
(4)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
(5)加酶：将aMab2-GNP-Mab2按照稀释度1:100000稀释，稀释液为酶标抗体稀释液，酶标板每孔加入稀释后的aMab2-GNP-Mab2溶液100μL，用封板膜封板后置于37℃震荡温育15分钟；
(6)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
(7)显色：每孔加入显色剂100μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟；
(8)转板：将上述酶标板置于离心机中，1000r/min，离心3min，然后将上清液转移至新的酶标板；
(9)终止：每孔加终止液50μL，终止反应；
(10)测定：加终止液后15分钟以内，以空白孔调零，405nm波长依序测量各孔的吸光度即OD值；
(11)以标准品的各浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，待测样品根据测得的OD值由标准曲线查出相应的浓度；或用标准品的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将待测样品的OD值代入方程式，计算出样品的浓度。
有益效果：
1、现有技术中酶联免疫试剂盒多采用辣根过氧化物酶(HRP)标记，但其稳定性较差，灵敏度低。本发明较传统ELISA方法，采用碱性磷酸酶(ALP)标记的纳米金功能化修饰的抗CD47结合物的抗体aMab2-GNP-Mab2，以碱性磷酸酶(ALP)标记替代传统辣根过氧化物酶(HRP)标记，引入了纳米金和双抗(辅助抗体/抗体)，通过多次信号放大方法，显著提高了试剂盒的稳定性和检测灵敏度。另外，本发明中的酶标二抗碱性磷酸酶(ALP)标记的纳米金功能化修饰的抗CD47结合物的抗体aMab2-GNP-Mab2，引入了价格低廉易获得的辅助抗体aMab2，减少了Mab2的用量，且Mab2无需标记，极大地降低了生产成本。
2、本发明的检测CD47的酶联免疫检测试剂盒，在样品稀释液中加入阳离子表面活性剂S9，并限定其浓度为0.3wt％，利用其分散作用为CD47与包被抗体提供无障碍的接触机会，提高了回收率；同时利用其崩解作用，降低竞争物质的非特异性结合，提高了试剂盒的特异性，从而将灵敏度提高至5ng/mL，显著好于传统检测技术。
3、本发明提供的检测CD47的酶联免疫试剂盒，采用碱性磷酸酶(ALP)标记的纳米金功能化修饰的抗CD47结合物的抗体aMab2-GNP-Mab2代替常规酶标抗体，将反应时间缩短至原反应时间的一半，提高了检测效率。
4、本发明提供的检测CD47的酶联免疫试剂盒是基于酶联免疫吸附法制备而得的检测试剂盒，以碱性磷酸酶(ALP)替代常规辣根过氧化物酶(HRP)做标记物、以纳米金功能化修饰的酶标抗体代替常规酶标抗体的检测CD47的酶联免疫试剂盒，经试验验证，该试剂盒具有稳定性高、灵敏度高、检测速度快、费用低廉、仪器简单易携、易于操作等优点，可用于现场检验，且经过测试临床样本，表明本发明提供的检测CD47的酶联免疫试剂盒可以有效检测人体内CD47的含量，辅助临床诊断和治疗过程，具有潜在的临床应用价值。
附图说明
图1是检测CD47试剂盒线性分析曲线；
图2是传统ELISA检测技术检测CD47线性分析曲线；
图3是ELISA反应示意图，图中，(a)本发明反应示意图，(b)传统ELISA反应示意图。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
下述实施例中，所使用的实验方法，未做具体说明的，均为常规方法。实施例所用CD47单克隆抗体1(Mab1)、CD47单克隆抗体2(Mab2)和细菌碱性磷酸酶标记的β-Actin单克隆抗体(aMab2)均为市售产品，山东莱博生物科技有限公司有售。实施例所用试剂均为市售产品。
实施例1
一种检测CD47的酶联免疫试剂盒，包括：盒体，设在盒体内的酶标板、CD47标准品梯度溶液、样品稀释液、酶标抗体稀释液、碱性磷酸酶(ALP)标记的纳米金功能化修饰的抗CD47结合物的抗体aMab2-GNP-Mab2、20×浓缩洗涤液、显色剂、终止液及封板膜、密封袋和说明书；
其中，
所述酶标板为透明聚苯乙烯96或48孔酶标板，且其各孔包被有浓度为5μg/mL的CD47单克隆抗体1(Mab1)；
所述CD47标准品梯度溶液包括浓度梯度为400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、0ng/mL的6个CD47标准品溶液，所述CD47标准品梯度溶液由标准品缓冲液配制得到，所述标准品缓冲液为含5wt％牛血清白蛋白、0.85wt％氯化钠的pH 7.0的1.0mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的缓冲液；
所述样品稀释液的配方是：除菌的1000mL纯水中，含NaCl 8g、NaH2 PO4·2H2O0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、表面活性剂S9 3g、酪蛋白钠盐5g、Proclin300 1mL；
所述酶标抗体稀释液的配方是：NaCl 8.0g/L，NaH2PO4·2H2O 0.2g/L，Na2HPO4·12H2O 2.9g/L，新生牛血清200mL/L，蔗糖30g/L，BSA 10g/L，PEG20000 2g/L，酪蛋白钠盐1g/L，Proclin300 1mL/L，吐温20 2mL/L，pH为7.4，溶剂为纯化水；
所述碱性磷酸酶(ALP)标记的纳米金功能化修饰的抗CD47结合物的抗体aMab2-GNP-Mab2是碱性磷酸酶标记的CD47单克隆抗体2(Mab2)和碱性磷酸酶标记的β-Actin单克隆抗体(aMab2)附着于GNP表面组成的组合物，所述Mab2和aMab2的质量比为(0.5-2):(2-5)；
所述20×浓缩洗涤液的配方是：除菌的50mL双蒸水中，含NaCl 8.0g、NaH2PO4·2H2O 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、吐温20 0.5mL；
所述显色剂是50mg PNPP、1mg MgCl2·6H2O与10mL二乙醇胺制成的pH 9.8的混合液；
所述终止液是浓度为2mol/L的硫酸溶液。
上述试剂盒每盒中包括CD47单克隆抗体1包被酶标板1块、碱性磷酸酶(ALP)标记的纳米金功能化修饰的抗CD47结合物的抗体试剂、标准品6瓶、样品稀释液、酶标抗体稀释液、显色剂、终止液、洗涤液(20×浓缩)各一瓶，说明书一份，不干胶封片2张。
实施例2
实施例1中的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
1)酶标板的制备：
1.1)配制包被液：配制0.1mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，并调整pH值为9.0；称取α-环糊精1g加入到1L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液中，制得包被缓冲液；
1.2)配制洗涤液，洗涤液的配方是：
NaCl 8.0g
NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O 0.2g
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O 2.9g
吐温20 0.5mL
纯化水 定容至1000mL
配制完成后过滤除菌，4℃保存；
1.3)配制封闭液，封闭液的配方是：
NaCl 8.0g
NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O 0.2g
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O 2.9g
蔗糖 30g
BSA 10g
酪蛋白钠盐 10g
吐温20 0.5mL
纯化水 定容至1000mL
配制完成后过滤除菌，4℃保存；
1.4)用包被液将CD47单克隆抗体1(Mab1)稀释至工作浓度5μg/mL，混匀，并静置15分钟；
1.5)取酶标板，用8孔道排枪点板，使Mab1抗体液达到100μL/孔，盖上盖板膜，置于2℃-8℃冰箱，过夜包被20-24小时；
1.6)取出过夜包被的酶标板，室温平衡30min，甩掉Mab1抗体液，吸水纸拍干，每孔每次加300μL洗涤液，洗涤2次，吸水纸拍干；
1.7)每孔加入200μL封闭液，2℃-8℃过夜封闭16小时；
1.8)取出过夜封闭的酶标板，室温平衡30min，甩掉封闭液，吸水纸拍干；放在硅胶干燥器中干燥，在室温条件下，湿度30％以下保持5小时；
1.9)以铝箔袋真空包装，做好标记，2-8℃保存，备用；
2)碱性磷酸酶标记的纳米金功能化修饰的抗CD47结合物的抗体(aMab2-GNP-Mab2)的制备：
首先配置GNP悬浮液，将200mL 0.01％HAuCl4·4H2O溶液置于磁力搅拌器搅拌，煮沸3min，然后快速加入6mL 1％的柠檬酸钠溶液，继续搅拌、加热，颜色逐渐无色变为黑色，然后呈透亮酒红色，继续煮沸10min，停止加热，并继续搅拌，冷却至室温，用双蒸水定容至200mL，将GNP悬浮液储存在棕色的瓶子里，避光保存，储存于4℃备用；
然后，将50mg的Mab2和aMab2按照1:4的质量比加入到制备好的100mL GNP悬浮液中，轻轻搅拌均匀，静置2h，使得Mab2和aMab2通过相互作用附着在GNP表面；再加入10mL牛血清白蛋白溶液(5wt％)，轻轻搅拌均匀，静置30min后，于4℃、12000r/min离心10min，弃上清，底部得到暗红色沉积物即是aMab2-GNP-Mab2，冷却后储存于4℃备用；
3)试剂盒溶液的配制：
3.1)酶标抗体稀释液的配制，酶标抗体稀释液的配方是：
NaCl 8.0g
NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O 0.2g
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O 2.9g
新生牛血清 200mL
蔗糖 30g
BSA 10g
PEG20000 2g
酪蛋白钠盐 1g
Proclin300 1mL
吐温20 2mL
纯化水 定容至1000mL
配制完成后调整pH为7.4，过滤除菌，4℃保存；
3.2)20×浓缩洗涤液的配制，20×浓缩洗涤液的配方是：
NaCl 8.0g
NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O 0.2g
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O 2.9g
吐温20 0.5mL
双蒸水 定容至50mL
配制完成后过滤除菌，4℃保存；
3.3)CD47标准品梯度溶液按如下方法制得：
配制含5wt％牛血清白蛋白、0.85wt％氯化钠的pH 7.0的1.0mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的缓冲液为标准品缓冲液；再以标准品缓冲液制备浓度梯度为400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、0ng/mL的6个CD47标准品梯度溶液；
3.4)样品稀释液的配制，样品稀释液的配方是：
NaCl 8.0g
NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O 0.2g
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O 2.9g
表面活性剂S9 3g
酪蛋白钠盐 5g
Proclin300 1mL
纯化水 定容至1000mL
配制完成后过滤除菌，4℃保存；
3.5)显色剂的配制是将50mg PNPP、1mg MgCl2·6H2O与10mL二乙醇胺制成的pH9.8的混合液；
3.6)终止液是浓度为2mol/L的硫酸溶液。
按照棋盘法确定抗体及抗体灵敏度，从而选择标准曲线各点，其中：
包被抗体Mab1：CD47单克隆抗体1(Mab1)的工作浓度为5μg/mL，稀释液为包被液；
标准曲线各点浓度分别是0ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL，稀释液为标准品缓冲液。
实施例3
实施例1的试剂盒在检测CD47中的应用，检测方法如下：
(1)平衡：将待测样品及检测试剂盒内的试剂，于18～25℃平衡30±5分钟；
(2)加样：将酶标板设置标准品孔和样本孔，样本孔包括空白孔和待测样品孔；在各孔中先加样品稀释液50μL，在标准品孔按浓度梯度各加入CD47标准品梯度溶液50μL；在空白孔中加样品稀释液50μL；在待测样品孔中加待测样品50μL；加样时将样品加于板的孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，用封板膜封板后置于37℃震荡温育30分钟；
(3)配液：将20×浓缩洗涤液用蒸馏水稀释20倍得洗涤液备用；
(4)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
(5)加酶：将aMab2-GNP-Mab2按照稀释度1:100000稀释，稀释液为酶标抗体稀释液，酶标板每孔加入稀释后的aMab2-GNP-Mab2溶液100μL，用封板膜封板后置于37℃震荡温育15分钟；
(6)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
(7)显色：每孔加入显色剂100μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟；
(8)转板：将上述酶标板置于离心机中，1000r/min，离心3min，然后将上清液转移至新的酶标板；
(9)终止：每孔加终止液50μL，终止反应；
(10)测定：加终止液后15分钟以内，以空白孔调零，405nm波长依序测量各孔的吸光度即OD值；
(11)以标准品的各浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，待测样品根据测得的OD值由标准曲线查出相应的浓度；或用标准品的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将待测样品的OD值代入方程式，计算出样品的浓度。
按照棋盘法确定酶标抗体最佳工作浓度：
酶标抗体aMab2-GNP-Mab2：碱性磷酸酶标记的纳米金功能化修饰的抗CD47结合物的抗体aMab2-GNP-Mab2最佳稀释度为1:100000，稀释液为酶标抗体稀释液。
实施例4
实施例1试剂盒的线性、准确性、灵敏度、精密度的检测
1)试剂盒的线性
采用CD47标准品的6个浓度梯度，分别是：CD47标准品梯度浓度为400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、0ng/mL，用实施例3的检测方法进行标准品溶液的OD值读数(见表1)，计算线性。画出试剂盒的线性分析曲线，见图1。由图1可知，本试剂盒线性良好。
表1.试剂盒线性分析读数
标准品(ng/mL) 0 25 50 100 200 400
吸光度(OD值) 0.028 0.281 0.558 0.957 2.003 3.862
2)试剂盒的准确性，以样本回收率进行验证
分别在100ng/mL CD47标准品梯度溶液中添加CD47标准品，使得CD47标准品最终浓度分别为300ng/mL、150ng/mL、120ng/mL，每个样本平行测试3次，计算回收率统计结果见表2。
表2.CD47标准品的检测回收率
Figure BDA0002944468800000111
结果表明，不同浓度的CD47标准品样本，回收率在90.1％～95.5％之间，平均回收率在91.8％～93.5％之间，总体回收率92.8％。
3)试剂盒的精密性：
以100ng/mL CD47标准品平行测试10次，结果统计见表3。
表3：精密性试验结果
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
吸光度 0.941 0.966 1.101 0.966 0.95 0.957 0.955 0.978 0.958 0.956
精密性：CV％＝4.7％
4)试剂盒的灵敏度：
以CD47标准品低浓度梯度重复测定10次以上，计算每个低值样本检测信号的均值、标准差和变异系数(CV)，选择CV≤15％的最低值，即为CD47试剂盒灵敏度。结果统计见表4。
表4：灵敏度试验结果
CD47浓度(ng/mL) 40 20 10 5 2.5 1.25 0
吸光值(平均值) 0.435 0.246 0.142 0.091 0.069 0.057 0.045
标准差 0.018 0.020 0.015 0.013 0.014 0.014 0.013
变异系数CV 4.2％ 8.2％ 10.5％ 13.9％ 20.9％ 25.4％ 28.3％
试验结果表明，灵敏度为5ng/mL。
对比例1
应用传统酶联免疫试剂检测CD47，检测方法如下：
(1)平衡：将待测样品及检测试剂盒内的试剂，于18～25℃平衡30±5分钟；
(2)加样：将酶标板设置标准品孔和样本孔，样本孔包括空白孔和待测样品孔；在各孔中先加样品稀释液50μL，在标准品孔按浓度梯度各加入CD47标准品梯度溶液50μL；在空白孔中加样品稀释液50μL；在待测样品孔中加待测样品50μL；加样时将样品加于板的孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，用封板膜封板后置于37℃震荡温育60分钟；
(3)配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释20倍得洗涤液备用；
(4)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
(5)加酶：将碱性磷酸酶(ALP)标记CD47单克隆抗体2(Mab2)按照最佳比例稀释，酶标板每孔加入稀释后的抗体溶液100μL，用封板膜封板后置于37℃震荡温育30分钟；
(6)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
(7)显色：每孔加入显色剂100μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；
(8)终止：每孔加终止液50μL，终止反应；
(9)测定：加终止液后15分钟以内，以空白孔调零，405nm波长依序测量各孔的吸光度即OD值；
(10)以标准品的各浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，待测样品根据测得的OD值由标准曲线查出相应的浓度；或用标准品的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将待测样品的OD值代入方程式，计算出样品的浓度。
对比例2
传统酶联免疫检测技术线性分析、准确性、灵敏度、精密度的检测
1)传统酶联免疫检测技术线性分析
采用CD47标准品的6个浓度梯度，分别是：CD47标准品浓度梯度为400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、0ng/mL，用对比例1的检测方法进行标准溶液的OD值读数(见表5)，计算线性。画出传统酶联免疫检测线性分析曲线，见图2。对比图1、图2可知，本发明所述的试剂盒线性更好。
表5：试剂盒线性分析读数
标准品(ng/mL) 0 25 50 100 200 400
吸光度 0.008 0.239 0.369 0.530 0.882 1.591
2)传统酶联免疫检测技术准确性，以样本回收率进行验证
分别在100ng/mL CD47标准品梯度溶液中添加CD47标准品，使得CD47标准品最终浓度分别为300ng/mL、150ng/mL、120ng/mL，每个样本平行测试3次，计算回收率统计结果见表6。
表6：CD47标准品的检测回收率
Figure BDA0002944468800000131
结果表明，不同浓度的CD47标准品样本，回收率在73.1％～85.6％之间，平均回收率在79.1.0％～81.5％之间，总体回收率80.3％。对比可知，本发明所述的检测试剂盒准确性更好。
3)传统酶联免疫检测技术的精密性：
以100ng/mL CD47标准品梯度溶液平行测试10次，结果统计见表7。
表7：精密性试验结果
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
吸光度 0.535 0.459 0.405 0.489 0.579 0.413 0.536 0.553 0.594 0.615
精密性：CV％＝14.2％。对比可知，本发明所述的检测试剂盒精密性更好。
4)传统酶联免疫技术的灵敏度：
以CD47标准品低浓度梯度重复测定10次以上，计算每个低值样本检测信号的均值、标准差和变异系数(CV)，选择CV≤15％的最低值，即为CD47试剂盒灵敏度。结果统计见表8。
表8：灵敏度试验结果
CD47浓度(ng/mL) 40 20 10 5 2.5 1.25 0
吸光值(平均值) 0.256 0.187 0.163 0.137 0.137 0.130 0.122
标准差 0.037 0.029 0.030 0.027 0.035 0.040 0.051
变异系数CV 14.4％ 15.6％ 18.6％ 19.5％ 25.7％ 31.0％ 42.3％
试验结果表明，灵敏度为40ng/mL。对比可知，本发明所述的检测试剂盒灵敏度更好，检测限更低。
传统的酶联免疫反应和本发明中酶联免疫免疫反应的对比如图3所示，本发明较传统的酶联免疫反应方法，采用碱性磷酸酶(ALP)标记的纳米金功能化修饰的抗CD47结合物的抗体aMab2-GNP-Mab2，以碱性磷酸酶(ALP)标记替代传统辣根过氧化物酶(HRP)标记，引入了纳米金和双抗(辅助抗体/抗体)，通过多次信号放大方法，显著提高了试剂盒的稳定性和检测灵敏度。另外，本发明中的酶标二抗碱性磷酸酶(ALP)标记的纳米金功能化修饰的抗CD47结合物的抗体aMab2-GNP-Mab2，引入了价格低廉易获得的辅助抗体aMab2，减少了Mab2的用量，且Mab2无需标记，极大地降低了生产成本。
试验例
非小细胞肺癌患者和健康志愿者血液样本CD47表达水平的检测：
研究对象为非小细胞肺癌(NSCLC)患者10例，即为实验组，其中男性6例，女性4例，平均年龄(58.61±11.13)岁。选择10名健康志愿者作为健康对照组，其中男性5例，女性5例，平均年龄(55.98±9.85)岁。健康对照组均无糖尿病、高血压病、冠心病病史。两组年龄、性别比较无差异。
1.样本处理：收集非小细胞肺癌患者和健康志愿者血液各5mL，常温静置2h，3000r/min，4℃离心5min，将血清分装入EP管，于-80℃冰箱保存待检。
2.样本检测：使用实施例1的试剂盒，按照实施例3的检测方法对样本中CD47进行检测，结果统计见表9。
表9：CD47检测结果
编号 健康对照组(ng/mL) 实验组(ng/mL)
1 11.572 35.203
2 11.012 64.686
3 12.955 33.937
4 14.697 46.457
5 12.084 59.62
6 12.961 39.81
7 14.054 41.459
8 10.917 46.545
9 14.203 69.074
10 12.647 47.535
平均值 12.710 48.433
实验组和健康对照组的性别、年龄差异无统计学意义(P＞0.05)。10例非小细胞肺癌患者的CD47表达均高于对照组，非小细胞肺癌患者CD47表达量高于健康对照组的4倍左右。

Claims (10)

1.一种检测CD47的酶联免疫试剂盒，其特征在于，包括：碱性磷酸酶标记的纳米金功能化修饰的抗CD47结合物的抗体和样品稀释液；
所述碱性磷酸酶标记的纳米金功能化修饰的抗CD47结合物的抗体是CD47单克隆抗体2(Mab2)和碱性磷酸酶标记的β-Actin单克隆抗体(aMab2)附着于GNP表面组成的组合物aMab2-GNP-Mab2，所述Mab2和aMab2的质量比为(0.5-2):(2-5)；
所述样品稀释液的配方是：以除菌的1000mL纯水计，含NaCl 8g、NaH2PO4·2H2O 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、表面活性剂S9 3g、酪蛋白钠盐5g、Proclin300 1mL。
2.如权利要求1所述的检测CD47的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述检测CD47的酶联免疫试剂盒还包括：酶标板、CD47标准品梯度溶液、酶标抗体稀释液、20×浓缩洗涤液、显色剂和终止液。
3.如权利要求2所述的检测CD47的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述酶标板为96或48孔酶标板，且其各孔包被有CD47单克隆抗体1(Mab1)。
4.如权利要求2所述的检测CD47的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述CD47标准品梯度溶液包括浓度梯度为400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、0ng/mL的6个CD47标准品溶液，所述CD47标准品梯度溶液由标准品缓冲液配制得到，所述标准品缓冲液为含5wt％牛血清白蛋白、0.85wt％氯化钠的pH 7.0的1.0mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的缓冲液。
5.如权利要求2所述的检测CD47的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体稀释液的配方是：NaCl 8.0g/L，NaH2PO4·2H2O 0.2g/L，Na2HPO4·12H2O 2.9g/L，新生牛血清200mL/L，蔗糖30g/L，BSA 10g/L，PEG20000 2g/L，酪蛋白钠盐1g/L，Proclin300 1mL/L，吐温20 2mL/L，pH为7.4，溶剂为纯化水。
6.如权利要求2所述的检测CD47的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述20×浓缩洗涤液的配方是：以除菌50mL双蒸水计，含NaCl 8.0g、NaH2PO4·2H2O 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、吐温20 0.5mL。
7.如权利要求2所述的检测CD47的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述显色剂是50mgPNPP、1mg MgCl2·6H2O与10mL二乙醇胺的混合液，pH 9.8；
优选的，所述终止液是浓度为2mol/L的硫酸溶液。
8.一种权利要求1所述的检测CD47的酶联免疫试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)酶标板的制备：
1.1)配制包被液：配制0.1mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，并调整pH值为9.0；称取α-环糊精1g加入到1L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液中，制得包被缓冲液；
1.2)配制洗涤液，洗涤液的配方是：
NaCl 8.0g NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O 0.2g Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O 2.9g 吐温20 0.5mL 纯化水 定容至1000mL
配制完成后过滤除菌，4℃保存；
1.3)配制封闭液，封闭液的配方是：
NaCl 8.0g NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O 0.2g Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O 2.9g 蔗糖 30g BSA 10g 酪蛋白钠盐 10g 吐温20 0.5mL 纯化水 定容至1000mL
配制完成后过滤除菌，4℃保存；
1.4)用包被液将CD47单克隆抗体1(Mab1)稀释至工作浓度5μg/mL，混匀，并静置15分钟；
1.5)取酶标板，用8孔道排枪点板，使Mab1抗体液达到100μL/孔，盖上盖板膜，置于2℃-8℃冰箱，过夜包被20-24小时；
1.6)取出过夜包被的酶标板，室温平衡30min，甩掉Mab1抗体液，吸水纸拍干，每孔每次加300μL洗涤液，洗涤2次，吸水纸拍干；
1.7)每孔加入200μL封闭液，2℃-8℃过夜封闭16小时；
1.8)取出过夜封闭的酶标板，室温平衡30min，甩掉封闭液，吸水纸拍干；放在硅胶干燥器中干燥，在室温条件下，湿度30％以下保持5小时；
1.9)以铝箔袋真空包装，做好标记，2-8℃保存，备用；
2)碱性磷酸酶标记的纳米金功能化修饰的抗CD47结合物的抗体(aMab2-GNP-Mab2)的制备：
首先配置GNP悬浮液，将200mL 0.01％HAuCl4·4H2O溶液置于磁力搅拌器搅拌，煮沸3min，然后快速加入6mL 1％的柠檬酸钠溶液，继续搅拌、加热，颜色逐渐无色变为黑色，然后呈透亮酒红色，继续煮沸10min，停止加热，并继续搅拌，冷却至室温，用双蒸水定容至200mL，将GNP悬浮液储存在棕色的瓶子里，避光保存，储存于4℃备用；
然后，将50mg的Mab2和aMab2按照(0.5-2):(2-5)的质量比加入到制备好的100mL GNP悬浮液中，轻轻搅拌均匀，静置2h，使得Mab2和aMab2通过相互作用附着在GNP表面；再加入10mL BSA溶液(5wt％)，轻轻搅拌均匀，静置30min后，于4℃、12000r/min离心10min，弃上清，底部得到暗红色沉积物即是aMab2-GNP-Mab2，冷却后储存于4℃备用；
3)试剂盒溶液的配制：
3.1)酶标抗体稀释液的配制，酶标抗体稀释液的配方是：
NaCl 8.0g NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O 0.2g Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O 2.9g 新生牛血清 200mL 蔗糖 30g BSA 10g PEG20000 2g 酪蛋白钠盐 1g Proclin300 1mL 吐温20 2mL 纯化水 定容至1000mL
配制完成后调整pH为7.4，过滤除菌，4℃保存；
3.2)20×浓缩洗涤液的配制，20×浓缩洗涤液的配方是：
NaCl 8.0g NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O 0.2g Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O 2.9g 吐温20 0.5mL 双蒸水 定容至50mL
配制完成后过滤除菌，4℃保存；
3.3)CD47标准品梯度溶液按如下方法制得：
配制含5wt％牛血清白蛋白、0.85wt％氯化钠的pH 7.0的1.0mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的缓冲液为标准品缓冲液；再以标准品缓冲液制备浓度梯度为400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、0ng/mL的6个CD47标准品梯度溶液；
3.4)样品稀释液的配制，样品稀释液的配方是：
NaCl 8.0g NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O 0.2g Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O 2.9g 表面活性剂S9 3g 酪蛋白钠盐 5g Proclin300 1mL 纯化水 定容至1000mL
配制完成后过滤除菌，4℃保存；
3.5)显色剂的配制是将50mg PNPP、1mg MgCl2·6H2O与10mL二乙醇胺制成的pH 9.8的混合液；
3.6)终止液是浓度为2mol/L的硫酸溶液。
9.权利要求1所述的酶联免疫试剂盒在检测CD47中的应用。
10.权利要求1所述的酶联免疫试剂盒检测CD47的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)平衡：将待测样品及检测试剂盒内的试剂，于18～25℃平衡30±5分钟；
(2)加样：将酶标板设置标准品孔和样本孔，样本孔包括空白孔和待测样品孔；在各孔中先加样品稀释液50μL，在标准品孔按浓度梯度各加入CD47标准品梯度溶液50μL；在空白孔中加样品稀释液50μL；在待测样品孔中加待测样品50μL；加样时将样品加于板的孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，用封板膜封板后置于37℃震荡温育30分钟；
(3)配液：将20×浓缩洗涤液用蒸馏水稀释20倍得洗涤液备用；
(4)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
(5)加酶：将aMab2-GNP-Mab2按照稀释度1:100000稀释，稀释液为酶标抗体稀释液，酶标板每孔加入稀释后的aMab2-GNP-Mab2溶液100μL，用封板膜封板后置于37℃震荡温育15分钟；
(6)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
(7)显色：每孔加入显色剂100μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟；
(8)转板：将上述酶标板置于离心机中，1000r/min，离心3min，然后将上清液转移至新的酶标板；
(9)终止：每孔加终止液50μL，终止反应；
(10)测定：加终止液后15分钟以内，以空白孔调零，405nm波长依序测量各孔的吸光度即OD值；
(11)以标准品的各浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，待测样品根据测得的OD值由标准曲线查出相应的浓度；或用标准品的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将待测样品的OD值代入方程式，计算出样品的浓度。
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