CN106501504A - 层粘连蛋白测试试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种层粘连蛋白测试试剂盒,包括:磁分离试剂,标记LN单克隆抗体的纳米磁性微球,浓度为167μg/ml;试剂R1,含有碱性磷酸酶标记的LN抗体,所述碱性磷酸酶标记的LN抗体浓度为1μg/ml;试剂R2,含有牛γ球蛋白质组分的缓冲液;标准品、质控品和校准品,含有LN抗原的牛血清白蛋白组分五(BSA V)溶液;清洗浓缩液,含有Tween‑20和Proclin‑300的缓冲液;稀释液,含有牛血清白蛋白组分五(BSA V)的溶液;发光底物,金刚烷的衍生物IUMIPHOS530。本发明提供的层粘连蛋白(LN)测试试剂盒,特异性强,灵敏度高,获得检测结果的时间短,操作方式简便,检测结果准确可靠。
Description
技术领域
本发明涉及免疫分析医学领域,尤其是涉及一种层粘连蛋白测试试剂盒及其制备方法。
背景技术
层粘连蛋白(laminin,LN)主要存在于基膜(basal lamina)结构中,是基膜所特有的非胶原糖蛋白,相对分子质量为820kDa,含13-15%的糖,有三个亚单位,即重链(α链,400kDa)和β1(215kDa)、β2(205kDa)两条轻链。结构上呈现不对称的十字形,由一条长臂和三条相似的短臂构成。这四个臂均有棒状节段和球状的末端域。β1和β2短臂上有两个球形结构域,α链上的短臂有三个球形结构域,其中有一个结构域同Ⅳ型胶原结合,第二个结构域同肝素结合,还有同细胞表面受体结合的结构域。正是这些独立的结合位点使LN作为一个桥梁分子,介导细胞同基膜结合。所以LN的主要功能就是作为基膜的主要结构成分对基膜的组装起关键作用,在细胞表面形成网络结构并将细胞固定在基膜上。
LN还有许多其他的作用,如在细胞发育过程中刺激细胞粘着、细胞运动。LN还能够刺激胚胎中神经轴的生长,并促进成年动物的神经损伤后重生长和再生。如同纤粘连蛋白,细胞外的LN能够影响细胞的生长、迁移和分化。LN在原生殖细胞的迁移中起关键作用。肝纤维化时人层粘连蛋白与Ⅳ型胶原结合形成内皮基膜,导致纤维化。血清人层粘连蛋白测定是观察慢性肝炎患者肝组织纤维化程度的一项重要指标之一
发明内容
本发明提供了一种层粘连蛋白(LN)测试试剂盒及其制备方法,特异性强,灵敏度高,获得检测结果的时间短,操作方式简便,检测结果准确可靠。
为了解决上述问题,本发明实施例公开了一种层粘连蛋白测试试剂盒,包括:
磁分离试剂,标记LN单克隆抗体的纳米磁性微球,浓度为132~167μg/ml;试剂R1,含有碱性磷酸酶标记的LN抗体,所述碱性磷酸酶标记的LN抗体浓度为0.6~1μg/ml;
试剂R2,含有牛γ球蛋白质组分的缓冲液;
含有LN抗原的牛血清白蛋白组分五(BSA V)溶液的标准品、质控品和校准品;
清洗浓缩液,含有Tween-20和Proclin-300的缓冲液
稀释液,含有牛血清白蛋白组分五(BSA V)的溶液;
发光底物,金刚烷的衍生物IUMIPHOS530,所述金刚烷的衍生物IUMIPHOS530的浓度为10μg/ml。
优选地,各试剂体积比为:磁分离试剂4-6,试剂R1 4-6,试剂R2 4-6,标准品4-6,质控品1-3,校准品1-3,清洗浓缩液20-30,稀释液10-20,发光底物25-40。
一种层粘连蛋白测试试剂盒的制备方法,包括如下步骤:
(1)磁分离试剂的制备
配制磁珠缓冲液:分别称取Tris、NaCl于容器中,配制Tween-20溶液,倒入所述容器中;量取Proclin-300,溶解于水中后倒入所述容器中,在所述容器中加入水,并充分搅拌,使加入的试剂完全溶解;调节PH值在7.95-8.05范围内;称取BSA V(牛血清白蛋白组分五)倒入所述容器中;定容,配制溶液中Tris浓度为4.58g/L,NaCl浓度为6.81g/L,Tween-20浓度为0.96g/L,浓度0.02%的Proclin-300,BSA V浓度为3g/L,PH值在7.95-8.05范围内,配制好的溶液用0.2μm滤器过滤,过滤后在于2-8℃下保存;
配制磁分离试剂:将DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺)溶于DMSO中,配制成浓度为20mg/mL的溶液;取抗体溶于PH 9.5的0.1mol/L PB缓冲液中,浓度为2mg/mL;将DSS溶液加入到抗体溶液中,室温放置90分钟;离心处理;另取浓度为100mg/ml的磁珠,按与抗体溶液的体积比为1:2量取,加入反应杯中,经磁铁吸附2分钟后吸取上清;用PH9.5、0.1mol/L的PB清洗磁珠;将离心处理后的浓缩抗体溶液加入到清洗后的磁珠中混匀,室温放置4小时,保持混匀状态;磁珠-抗体混合液中加入1mol/L的Tris溶液,37℃下放置15分钟,所述Tris的加样量为1mg抗体加0.15mlTris;用PH 7.2、0.1mol/L的PB清洗已经标记好抗体的磁珠;用磁珠保存液稀释并制得浓度为0.05%的LN磁分离试剂;再将制得的LN磁分离试剂与制得的磁珠缓冲液按照1:1的比例混匀得磁分离试剂;
(2)试剂R1的制备
试剂R1稀释液的配制:量取Tris、NaCl、Zncl2、Proclin-300、MgCl2于容器中,加入水,充分搅拌,使加入的试剂完全溶解;调节PH在7.35-7.45范围内;加入BSA V;定容,配制溶液中Tris浓度为6.06g/L,NaCl浓度为13g/L,Zncl2的浓度为0.05g/L,Proclin-300的浓度0.02%,MgCl2的浓度为0.05g/L,BSA V浓度为3g/L,PH在7.35-7.45范围内,配制好的溶液用0.2μm滤器过滤,过滤后在于2-8℃下保存;
配制试剂R1,称取碱性磷酸酶(ALP)溶于生理盐水中,离心浓缩处理;与离心浓缩后的ALP浓缩液中按体积比5:1加入浓度为0.1M的NaIO4溶液,室温下避光搅拌20分钟;将搅拌后ALP溶液透析处理;透析处理后的ALP溶液中加入浓度为0.2M、PH9.5的碳酸盐缓冲液,使醛化ALP的PH升高到9.0~9.5,立即加入IgG抗体,加入抗体的量按与ALP的重量比为1:10加入,在浓度为0.01M的碳酸盐缓冲液中,室温避光轻轻搅拌2小时;加入浓度为4mg/ml的NaBH4溶液混匀,置于4℃下2小时;透析处理;之后在搅拌下逐滴加入等体积的饱和硫酸铵,置于4℃下1小时;离心处理弃上清,沉淀物用半饱和硫酸铵清洗,将沉淀物溶于浓度为0.15M、PH7.4的PBS溶液中;透析处理,去除铵离子;离心处理去除沉淀,上清液为酶结合物,与制得的酶反应物稀释液以1:600的体积比混合均匀,即的试剂R1;
(3)试剂R2的制备
称取Tris、NaCl于容器中,量取Proclin-300,用水溶解后加入到所述容器中;在所述容器中加水,搅拌,使得加入到所述容器中的试剂完全溶解,调节PH在7.35-7.45的范围内;称取牛γ球蛋白(IgG),加入到所述容器中;定容,配制溶液中,Tris浓度为1.56g/L,NaCl浓度为4.23g/L,Proclin-300的浓度0.02%,牛γ球蛋白(IgG)的浓度为0.9g/L,PH在7.35-7.45的范围内,配制好的溶液用0.2μm滤器过滤,过滤后在于2-8℃下保存;
(4)标准品、质控品及校准品的配制
LN标准品配制浓度为30,90,180,450,900ng/ml;质控品配制浓度点为60,450ng/ml;校准品配制浓度为90,450ng/ml;
(5)清洗浓缩液的配制
称取Tris和NaCl于容器中,称取Tween-20于水中溶解后将溶液加入到所述容器中;量取Proclin-300于水中溶解后将溶液加入到所述容器中;向所述容器中加入水,充分搅拌,使所加入的试剂完全溶解;调节PH在7.35-7.45范围内;定容,配制溶液中Tris浓度为12.54g/L,NaCl浓度为325.6g/L,Tween-20浓度为5g/L,Proclin-300的浓度0.02%,PH在7.35-7.45的范围内,配制好的溶液用0.2μm滤器过滤,过滤后在于2-8℃下保存;
(6)稀释液的配制
称取NaCl和BSA V于容器中;量取Proclin-300于水中溶解后将溶液加入到所述容器中;定容,配制溶液中NaCl浓度为9g/L和BSA V浓度为60g/L,Proclin-300的浓度0.05%,配制好的溶液用0.2μm滤器过滤,过滤后在于2-8℃下保存;
(7)发光底物的配制
称取Tris、NaCl、Na2SO3和Proclin-300于容器中,加入水,充分搅拌,使加入的试剂完全溶解;调节PH在7.95-8.05的范围内;定容,配制溶液中Tris浓度为2.35g/L,NaCl浓度为6.41g/L,Na2SO3浓度为0.002g/L,Proclin-300的浓度为0.02%,PH在7.95-8.05范围内,配制好的溶液用0.2μm滤器过滤,过滤后,配制溶液与IUMIPHOS530按4:1的体积比加入IUMIPHOS530,混匀后于2-8℃下保存。
优选地,所述步骤(1)中,DSS的投入量计算公式为:投入量=抗体质量/16000×10×368/CDSS。
优选地,所述步骤(1)中,所述离心处理为将加入DSS的抗体溶液于高速冷冻离心机中在3000g的离心力下浓缩30分钟,至浓缩体积为小于0.5ml。
优选地,所述步骤(1)中,所述磁珠直径为0.9-1.5μm,加入浓度为100mg/ml的磁珠。
一种层粘连蛋白(LN)测试试剂盒的测试方法,包括如下步骤:
(1)加LN标准品、质控品、待测标本至对应试管底部;
(2)加试剂R1至每一试管中;
(3)加试剂R2至每一试管中;
(4)加磁分离试剂至每一试管中;
(5)各试管内试剂混匀后,置37℃水浴30分钟;
(6)将各试管放至磁分离器上,确保每支试管都与分离器表面接触,沉淀2分钟;缓慢倒出上清液,除去各试管内的液滴;
(7)清洗浓缩液用水稀释7倍后,加稀释后的清洗液至每一试管中,混匀;
(8)重复操作步骤(5)、(6)、(5)一遍;
(9)加底物溶液至试管中混匀3秒,迅速用准备好的发光检测仪进行检测。
优选地,所述步骤(1)之前使用校准品进行曲线校正,并用质控品进行质量控制。
本发明具有如下有益效果:
(1)本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合,提供了一种接近均相的反应体系,与现有技术相比,在出结果时间上较传统酶联免疫法少10-20分钟,同时抗体的用量降低了20%以上,在提高产品性能的同时,大大降低了产品成本。
(2)本发明公开了一种新的专用试剂R2,通过使用能使AP稳定的体系和添加IgG消除干扰使得反应过程更加稳定可靠,具有更高的检测灵敏度和特异性,并达到了较佳的性能参数。(3)试剂盒中的磁分离试剂,试剂R1,试剂R2,标准品,质控品,校准品,清洗浓缩液、稀释液以及发光底物的配比优化合理,在此反应体系下检测结果精准可靠,并且该配比体系为本发明试剂盒的使用有效期及检测性能提供了有力保障。
(4)本发明试剂盒的精确度、灵敏度以及稳定性均优于现有技术中的同类产品,并且成本低廉,操作简单,应用前景广阔。
具体实施方式
下文中将结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是,在不冲突的情况下,本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1
本实施例提供了一种层粘连蛋白(LN)测试试剂盒,所述试剂盒包括:
磁分离试剂,标记有小鼠抗人LN的单克隆抗体的纳米磁性微球,所述标记有小鼠抗人LN的单克隆抗体的纳米磁性微球的浓度为167μg/ml;
试剂R1,含有碱性磷酸酶标记的LN抗体,所述碱性磷酸酶标记的LN抗体浓度为1μg/ml;
试剂R2,含有牛γ球蛋白质组分的缓冲液;
标准品,含有LN抗原的牛血清白蛋白组分五(BSA V)溶液,浓度为0(S0)ng/ml、30(S1)ng/ml、90(S2)ng/ml、180(S3)ng/ml、450(S4)ng/ml、900(S5)ng/ml;
质控品,含有LN抗原的牛血清白蛋白组分五(BSA V)溶液,浓度为60ng/ml,450ng/ml;
校准品,含有LN抗原的牛血清白蛋白组分五(BSA V)溶液,浓度为90ng/ml,450ng/ml;
清洗浓缩液,含有Tween-20和Proclin-300的缓冲液
稀释液,含有牛血清白蛋白组分五(BSA V)的溶液;
发光底物,金刚烷的衍生物IUMIPHOS530,所述金刚烷的衍生物IUMIPHOS530的浓度为10μg/ml。
其中,本实施例试剂盒中各试剂按下述体积比配制:磁分离试剂4,试剂R1 4,试剂R2 4,标准品4,质控品1,校准品1,清洗浓缩液20,稀释液10,发光底物25。
本实施例层粘连蛋白(LN)测试试剂盒的制备方法,包括如下步骤:
第一步:磁分离试剂的制备过程
一、磁珠缓冲液配制操作规程:配方见表1,以配制1L为例:
(1)称取Tris 4.58g和NaCl6.81g于1L容器中,称取0.96g Tween-20于20ml容器中加适量水使其完全溶解后,倒入上述容器中;
(2)用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入上述1L容器中;然后在1L容器中加入800ml纯化水,充分搅拌,使试剂完全溶解;
(3)调节PH计测量其PH值;用4M HCl或4M NaOH调PH,测量其PH在7.95-8.05之间即符合要求;
(4)称取BSA V(牛血清白蛋白)3g倒入上述1L容器中;
(5)最后定容至1000ml,测PH值,范围在7.95-8.05之间即符合要求,
用0.2um滤器过滤即得;过滤完后贴好标签于2-8℃冷库贮存;
表1 磁珠缓冲液的配制
二、磁分离试剂的配制
(1)将1.0mg DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺)溶于50ul DMSO中,即浓度为20mg/mL;取2mg LN抗体溶于PH 9.5的0.1mol/L PB缓冲液中至总体积为1ml;
(2)计算DSS的投入量,按照以下公式计算:(抗体质量/16000)×10×368/CDSS),其中CDSS指代DSS的物质的量浓度mol/L;
(3)用移液枪吸取相应体积的DSS加入到步骤1的抗体溶液中,置室温90min;
(4)将步骤3抗体溶液加入到Centricon-10浓缩管中,然后放入到sigma2-16k高速冷冻离心机中在3000g的离心力下浓缩约30min至体积为0.5ml;
(5)取0.5ml磁珠,所述的磁珠直径在0.01-5.0μm之间,加入5ml反应杯中,放入专用试管架,经磁铁吸附2分钟后吸取上清;
(6)每次加入1.5ml PH9.5 0.1mol/L PB,混匀30秒,上架,去上清,重复操作3次;将步骤4获得的抗体溶液加入到磁珠中,混匀后室温反应4小时,保持混匀状态;
(7)加入0.3ml 1mol/L的Tris溶液37℃15分钟,其中Tris的加样量为1mg抗体加0.15mlTris;
(8)每次加入1.5ml PH 7.2 0.1mol/L PB清洗已经标记的磁珠,混匀30秒,上架,去上清,重复操作3次;
(9)用100ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶,即为0.05%的LN磁分离试剂;
(10)将步骤9获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1:1的比例混匀,即得本发明试剂盒中分离试剂。
第二步:试剂R1的制备过程
一、试剂R1稀释液配制操作规程:配方见表2,以配制1L为例:
(1)取Tris 6.06g、NaCl 13.0g、Zncl2 0.05g、Proclin-300 0.2ml和MgCl2 0.05g于烧瓶中;然后在烧瓶中加入800ml纯化水,充分搅拌,使试剂完全溶解;
(2)用4M HCl或4M NaOH调PH,测量使PH在7.35-7.45范围内;
(3)称取BSA V 3g倒入上述烧瓶中;
(4)最后定容至1000ml,测PH值,范围在7.35-7.45之间即符合要求,用0.2um滤器过滤;过滤完后,贴好标签于2-8℃冷库贮存;
表2 试剂R1稀释液的配制
二、试剂R1的配制(碱性磷酸酶(ALP)标记的小鼠抗人LN单克隆抗体)
(1)取10mgALP加入5ml生理盐水中,加入到Centricon-10浓缩管中,3000rpm离心大约20分钟,浓缩至1毫升。
(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液,室温下避光搅拌20分钟。
(3)将上述溶液装入透析袋中,用1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析,4℃过夜。
(4)加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液,使以上醛化ALP的PH升高到9.0~9.5,然后立即加入2.5mg IgG抗体,在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中,室温避光轻轻搅拌2小时。
(5)加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液,混匀,再置4℃2小时。
(6)将上述液装入透析袋中,对0.15M PH7.4PBS透析,4℃过夜。
(7)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置4℃1小时。
(8)3000rpm离心半小时,弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。
(9)将上述溶液装入透析袋中,对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析约5个小时,去除铵离子后,10000rpm离心30分钟去除沉淀,上清液即为酶结合物,加入体积1/100的1MMgcl2溶液4℃保存。收集到的碱性磷酸酶(ALP)与LN单克隆抗体的偶联物用上述酶反应物稀释液以1:600的体积比混合均匀,即得本发明试剂盒中试剂R1。
第三步:试剂R2的制备
试剂R2配制操作规程:配方见表3,以配制1L为例:
(1)称取Tris(三羟甲基氨基甲烷,分子式:(HOCH2)3CNH2)1.56g和NaCl 4.23g于1L烧杯中;用移液器将Proclin-300量取0.2ml于少量纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入上述1L容器中;
(2)用量筒量取800ml纯化水于烧杯中,充分搅拌,直至完全溶解;用4M HCL或4MNaOH调PH,测量其范围在7.35-7.45之间;
(3)称取牛γ球蛋白IgG 0.9g于800ml纯化水的烧杯中;
(4)最后定容1000ml,完全溶解后,测PH值,范围在7.35-7.45之间即符合要求,用0.2μm滤器过滤;过滤完后,贴好标签于2-8℃冷库贮存;
表3 试剂R2的配制
第四步:标准品和质控品的配制:
(1)最高点:最高浓度点为X,目标点浓度为A,B,C,D,E,F,配制V体积的溶液时,需加入原料的体积如表4所示
表4 配制V体积溶液时需加入原料的体积
浓度 | 加入标准品稀释液体积 | 加入X体积 |
A | V-A*V/X | A*V/X |
B | V-B*V/X | B*V/X |
C | V-C*V/X | C*V/X |
D | V-D*V/X | D*V/X |
E | V-E*V/X | E*V/X |
F | V-F*V/X | F*V/X |
(2)层粘连蛋白(LN)定量测定试剂盒LN标准品原料配制成浓度点为0,0.1,1,5,50,100ng/ml;质控品配制的浓度点为0.6,50ng/ml。校准品配制的浓度点为1,50ng/ml
(3)完全溶解后,贴好标签于2-8℃冷库贮存;
第五步:清洗浓缩液配制操作规程:配方见表5,以配制1L为例:
(1)称取Tris 12.54g和NaCl 325.6g于1L容器中;
(2)称取5g Tween-20于100ml容器中加20ml水使其完全溶解后,倒入上述容器中;
(3)用移液器将Proclin-300量取0.2ml于盛有10ml纯化水的烧杯中完全溶解后,倒入上述1L容器中;
(4)用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中,充分搅拌,直至完全溶解;
(5)用4M HCL或4M NaOH调PH,测量其范围在7.35-7.45之间;
(6)最后定容1000ml,测PH值,范围在7.35-7.45之间即符合要求,完全溶解后用0.2μm滤器过滤即得;过滤完后,贴好标签于2-8℃冷库贮存;
表5 清洗浓缩液的配制
第六步:稀释液配方见表6,以配制1L为例:
(1)称取NaCl9.0g和BSA V 60g于1L的容器中;
(2)用移液器将Proclin-300量取0.5ml加10ml纯化水溶解,倒入上述1L的容器中;
(3)最后定容1000ml,完全溶解后,用0.2um滤器过滤,贴好标签于2-8℃冷库贮存;
表6 稀释液的配制
第七步:发光底物配制操作规程:配方见表7,以配制1L为例:
(1)称取Tris 2.35g、NaCl 6.41g、Na2SO3 0.002g和Proclin-300 0.2ml于1L烧杯中;
(2)用量筒量取800ml纯化水于烧杯中,充分搅拌,直至完全溶解;用4M HCl或4MNaOH调PH,测量其范围在7.95-8.05之间;
(3)最后定容至1000ml,测PH值,范围在7.95-8.05之间即符合要求,用0.2um滤器过滤;过滤完后,加入250ml IUMIPHOS530,混匀后,贴好标签于2-8℃冷库贮存;
表7 发光底物的配制
本实施例层粘连蛋白(LN)测试试剂盒的测试方法,包括如下步骤:
(1)使用前,需使用试剂盒内校准品(采用全自动仪器)进行曲线校正,并用质控品进行质量控制;测试结果在质控范围内方可进行样本的检测。
(2)加4份LN标准品、质控品、待测标本至对应试管底部;
(3)加4份试剂R1至每一试管中;
(4)加4份试剂R2至每一试管中;
(5)加4份磁分离试剂至每一试管中;
(6)用塑料薄膜覆盖试管,多管混匀器轻轻振荡试管架30s后,置37℃水浴30分钟;
(7)试管连架放至磁分离器上,确保每支试管都与分离器表面接触,沉淀2分钟。缓慢的倒转分离器倒出上清液,把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上,用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴;
(8)清洗浓缩液用纯化水稀释7倍后,加26.7份稀释后的清洗液至每一试管中,置多管混匀器上轻轻振荡混匀30s。加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出。混匀要彻底;
(9)重复步骤(6)、(7)、(6)一遍;
(10)加25份底物溶液至试管中混匀3秒,迅速用准备好的发光检测仪进行检测;
(11)如遇到高值HOOK样本,建议临床医师根据其余测试指标选择合适的稀释倍数用稀释液对样品进行稀释。
实施例2
本实施例提供了一种层粘连蛋白(LN)测试试剂盒,所述试剂盒包括:
磁分离试剂,标记有小鼠抗人LN的单克隆抗体的纳米磁性微球,所述标记有小鼠抗人LN的单克隆抗体的纳米磁性微球的浓度为132μg/ml;
试剂R1,含有碱性磷酸酶标记的LN抗体,所述碱性磷酸酶标记的LN抗体浓度为0.6μg/ml;
试剂R2,含有牛γ球蛋白质组分的缓冲液;
标准品,含有LN抗原的牛血清白蛋白组分五(BSA V)溶液,浓度为0(S0)ng/ml、30(S1)ng/ml、90(S2)ng/ml、180(S3)ng/ml、450(S4)ng/ml、900(S5)ng/ml;
质控品,含有LN抗原的牛血清白蛋白组分五(BSA V)溶液,浓度为60ng/ml,450ng/ml;
校准品,含有LN抗原的牛血清白蛋白组分五(BSA V)溶液,浓度为90ng/ml,450ng/ml;
清洗浓缩液,含有Tween-20和Proclin-300的缓冲液
稀释液,含有牛血清白蛋白组分五(BSA V)的溶液;
发光底物,金刚烷的衍生物IUMIPHOS530,所述金刚烷的衍生物IUMIPHOS530的浓度为10μg/ml。
其中,本实施例试剂盒中各试剂按下述体积比配制:磁分离试剂5.1,试剂R1 5.1,试剂R2 4,标准品5.1,质控品1.7,校准品1.7,清洗浓缩液25,稀释液17,发光底物34。
本实施例层粘连蛋白(LN)测试试剂盒的制备方法与实施例1相同。
本实施例层粘连蛋白(LN)测试试剂盒的测试方法,包括如下步骤:
(1)使用前,需使用试剂盒内校准品(采用全自动仪器)进行曲线校正,并用质控品进行质量控制;测试结果在质控范围内方可进行样本的检测。
(2)加5.1份LN标准品、质控品、待测标本至对应试管底部;
(3)加5.1份试剂R1至每一试管中;
(4)加5.1份试剂R2至每一试管中;
(5)加5.1份磁分离试剂至每一试管中;
(6)用塑料薄膜覆盖试管,多管混匀器轻轻振荡试管架30s后,置37℃水浴30分钟;
(7)试管连架放至磁分离器上,确保每支试管都与分离器表面接触,沉淀2分钟。缓慢的倒转分离器倒出上清液,把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上,用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴;
(8)清洗浓缩液用纯化水稀释7倍后,加26.7份稀释后的清洗液至每一试管中,置多管混匀器上轻轻振荡混匀30s。加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出。混匀要彻底;
(9)重复步骤(6)、(7)、(6)一遍;
(10)加34份底物溶液至试管中混匀3秒,迅速用准备好的发光检测仪进行检测;
(11)如遇到高值HOOK样本,建议临床医师根据其余测试指标选择合适的稀释倍数用稀释液对样品进行稀释。
实施例3
本实施例提供了一种层粘连蛋白(LN)测试试剂盒,所述试剂盒包括:
磁分离试剂,标记有小鼠抗人LN的单克隆抗体的纳米磁性微球,所述标记有小鼠抗人LN的单克隆抗体的纳米磁性微球的浓度为167μg/ml;
试剂R1,含有碱性磷酸酶标记的LN抗体,所述碱性磷酸酶标记的LN抗体浓度为1μg/ml;
试剂R2,含有牛γ球蛋白质组分的缓冲液;
标准品,含有LN抗原的牛血清白蛋白组分五(BSA V)溶液,浓度为0(S0)ng/ml、30(S1)ng/ml、90(S2)ng/ml、180(S3)ng/ml、450(S4)ng/ml、900(S5)ng/ml;
质控品,含有LN抗原的牛血清白蛋白组分五(BSA V)溶液,浓度为60ng/ml,450ng/ml;
校准品,含有LN抗原的牛血清白蛋白组分五(BSA V)溶液,浓度为1ng/ml,50ng/ml;
清洗浓缩液,含有Tween-20和Proclin-300的缓冲液
稀释液,含有牛血清白蛋白组分五(BSA V)的溶液;
发光底物,金刚烷的衍生物IUMIPHOS530,所述金刚烷的衍生物IUMIPHOS530的浓度为10μg/ml。
其中,本实施例试剂盒中各试剂按下述体积比配制:磁分离试剂6,试剂R1 6,试剂R2 6,标准品6,质控品3,校准品3,清洗浓缩液30,稀释液20,发光底物40。
本实施例层粘连蛋白(LN)测试试剂盒的制备方法与实施例1相同。
本实施例层粘连蛋白(LN)测试试剂盒的测试方法,包括如下步骤:
(1)使用前,需使用试剂盒内校准品(采用全自动仪器)进行曲线校正,并用质控品进行质量控制;测试结果在质控范围内方可进行样本的检测。
(2)加6份LN标准品、质控品、待测标本至对应试管底部;
(3)加6份试剂R1至每一试管中;
(4)加6份试剂R2至每一试管中;
(5)加6份磁分离试剂至每一试管中;
(6)用塑料薄膜覆盖试管,多管混匀器轻轻振荡试管架30s后,置37℃水浴30分钟;
(7)试管连架放至磁分离器上,确保每支试管都与分离器表面接触,沉淀2分钟。缓慢的倒转分离器倒出上清液,把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上,用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴;
(8)清洗浓缩液用纯化水稀释7倍后,加26.7份稀释后的清洗液至每一试管中,置多管混匀器上轻轻振荡混匀30s。加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出。混匀要彻底;
(9)重复步骤(6)、(7)、(6)一遍;
(10)加40份底物溶液至试管中混匀3秒,迅速用准备好的发光检测仪进行检测;
(11)如遇到高值HOOK样本,建议临床医师根据其余测试指标选择合适的稀释倍数用稀释液对样品进行稀释。
本发明层粘连蛋白(LN)测试试剂盒的临床试验:
1、检测数据
标本采自1000例正常体检、供血者。样本体检结果均无肝、脑、肾、消化道疾病,半年内无输血和大手术史,妇女不在妊娠期和哺乳期。将测值进行统计学分析,得出正常血清参考范围:5~130ng/ml。
本数据在不同地区、不同个体以及采用不同方法进行检测时,所测得的LN水平也会有所不同,各实验室应建立自己的正常值范围。不可仅凭本方法得出的LN值作出诊断,仅作为中间数据参考作用,应结合临床其他资料分析结果,包括病人的具体情况和治疗状况。通过其他方法得到的样品中的LN浓度值与本试剂盒测定结果不具有直接的可比性。超出试剂盒测定范围的样本,系统将无法给出确切的数值。如欲测定其确切的结果,建议稀释后再进行测定。本试剂盒的检测结果仅供临床参考,不能单独作为确诊或排除病例的依据,为达到诊断目的,此检测结果要与临床检查、病史和其它的检查结合使用。本品可用于血清样本的测定,用于其他体液样本中LN浓度测定的可靠性未得到充分确认。
2、本发明试剂盒性能指标
分析灵敏度定义为:对20次零标准品的测定,取其2倍的平均偏差,其在标准曲线上所对应的浓度即为分析灵敏度;分析灵敏度:0.03ng/ml;精密性:批内变异CV%≦10.0%;批间变异CV%≦15.0%;线性系数:r≥0.9900;线性范围:0.03-100ng/ml:受3种主要类似交叉反应物的干扰情况如表8所示。
表8 与主要类似物的交叉反应情况:
最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (8)
1.一种层粘连蛋白测试试剂盒,其特征在于,包括:
磁分离试剂,标记LN单克隆抗体的纳米磁性微球,浓度为132~167μg/ml;试剂R1,含有碱性磷酸酶标记的LN抗体,所述碱性磷酸酶标记的LN抗体浓度为0.6~1μg/ml;
试剂R2,含有牛γ球蛋白质组分的缓冲液;
含有LN抗原的牛血清白蛋白组分五(BSA V)溶液的标准品、质控品和校准品;
清洗浓缩液,含有Tween-20和Proclin-300的缓冲液
稀释液,含有牛血清白蛋白组分五(BSA V)的溶液;
发光底物,金刚烷的衍生物IUMIPHOS530,所述金刚烷的衍生物IUMIPHOS530的浓度为10μg/ml。
2.根据权利要求1所述的层粘连蛋白测试试剂盒,其特征在于,各试剂体积比为:磁分离试剂4-6,试剂R1 4-6,试剂R2 4-6,标准品4-6,质控品1-3,校准品1-3,清洗浓缩液20-30,稀释液10-20,发光底物25-40。
3.如权利要求1或2所述的层粘连蛋白测试试剂盒的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)磁分离试剂的制备
配制磁珠缓冲液:分别称取Tris、NaCl于容器中,配制Tween-20溶液,倒入所述容器中;量取Proclin-300,溶解于水中后倒入所述容器中,在所述容器中加入水,并充分搅拌,使加入的试剂完全溶解;调节PH值在7.95-8.05范围内;称取BSA V(牛血清白蛋白组分五)倒入所述容器中;定容,配制溶液中Tris浓度为4.58g/L,NaCl浓度为6.81g/L,Tween-20浓度为0.96g/L,浓度0.02%的Proclin-300,BSA V浓度为3g/L,PH值在7.95-8.05范围内,配制好的溶液用0.2μm滤器过滤,过滤后在于2-8℃下保存;
配制磁分离试剂:将DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺)溶于DMSO中,配制成浓度为20mg/mL的溶液;取抗体溶于PH 9.5的0.1mol/L PB缓冲液中,浓度为2mg/mL;将DSS溶液加入到抗体溶液中,室温放置90分钟;离心处理;另取浓度为100mg/ml的磁珠,按与抗体溶液的体积比为1:2量取,加入反应杯中,经磁铁吸附2分钟后吸取上清;用PH9.5、0.1mol/L的PB清洗磁珠;将离心处理后的浓缩抗体溶液加入到清洗后的磁珠中混匀,室温放置4小时,保持混匀状态;磁珠-抗体混合液中加入1mol/L的Tris溶液,37℃下放置15分钟,所述Tris的加样量为1mg抗体加0.15mlTris;用PH 7.2、0.1mol/L的PB清洗已经标记好抗体的磁珠;用磁珠保存液稀释并制得浓度为0.05%的LN磁分离试剂;再将制得的LN磁分离试剂与制得的磁珠缓冲液按照1:1的比例混匀得磁分离试剂;
(2)试剂R1的制备
试剂R1稀释液的配制:量取Tris、NaCl、Zncl2、Proclin-300、MgCl2于容器中,加入水,充分搅拌,使加入的试剂完全溶解;调节PH在7.35-7.45范围内;加入BSA V;定容,配制溶液中Tris浓度为6.06g/L,NaCl浓度为13g/L,Zncl2的浓度为0.05g/L,Proclin-300的浓度0.02%,MgCl2的浓度为0.05g/L,BSA V浓度为3g/L,PH在7.35-7.45范围内,配制好的溶液用0.2μm滤器过滤,过滤后在于2-8℃下保存;
配制试剂R1,称取碱性磷酸酶(ALP)溶于生理盐水中,离心浓缩处理;与离心浓缩后的ALP浓缩液中按体积比5:1加入浓度为0.1M的NaIO4溶液,室温下避光搅拌20分钟;将搅拌后ALP溶液透析处理;透析处理后的ALP溶液中加入浓度为0.2M、PH9.5的碳酸盐缓冲液,使醛化ALP的PH升高到9.0~9.5,立即加入IgG抗体,加入抗体的量按与ALP的重量比为1:10加入,在浓度为0.01M的碳酸盐缓冲液中,室温避光轻轻搅拌2小时;加入浓度为4mg/ml的NaBH4溶液混匀,置于4℃下2小时;透析处理;之后在搅拌下逐滴加入等体积的饱和硫酸铵,置于4℃下1小时;离心处理弃上清,沉淀物用半饱和硫酸铵清洗,将沉淀物溶于浓度为0.15M、PH7.4的PBS溶液中;透析处理,去除铵离子;离心处理去除沉淀,上清液为酶结合物,与制得的酶反应物稀释液以1:600的体积比混合均匀,即的试剂R1;
(3)试剂R2的制备
称取Tris、NaCl于容器中,量取Proclin-300,用水溶解后加入到所述容器中;在所述容器中加水,搅拌,使得加入到所述容器中的试剂完全溶解,调节PH在7.35-7.45的范围内;称取牛γ球蛋白(IgG),加入到所述容器中;定容,配制溶液中,Tris浓度为1.56g/L,NaCl浓度为4.23g/L,Proclin-300的浓度0.02%,牛γ球蛋白(IgG)的浓度为0.9g/L,PH在7.35-7.45的范围内,配制好的溶液用0.2μm滤器过滤,过滤后在于2-8℃下保存;
(4)标准品、质控品及校准品的配制
LN标准品配制浓度为30,90,180,450,900ng/ml;质控品配制浓度点为60,450ng/ml;校准品配制浓度为90,450ng/ml;
(5)清洗浓缩液的配制
称取Tris和NaCl于容器中,称取Tween-20于水中溶解后将溶液加入到所述容器中;量取Proclin-300于水中溶解后将溶液加入到所述容器中;向所述容器中加入水,充分搅拌,使所加入的试剂完全溶解;调节PH在7.35-7.45范围内;定容,配制溶液中Tris浓度为12.54g/L,NaCl浓度为325.6g/L,Tween-20浓度为5g/L,Proclin-300的浓度0.02%,PH在7.35-7.45的范围内,配制好的溶液用0.2μm滤器过滤,过滤后在于2-8℃下保存;
(6)稀释液的配制
称取NaCl和BSA V于容器中;量取Proclin-300于水中溶解后将溶液加入到所述容器中;定容,配制溶液中NaCl浓度为9g/L和BSA V浓度为60g/L,Proclin-300的浓度0.05%,配制好的溶液用0.2μm滤器过滤,过滤后在于2-8℃下保存;
(7)发光底物的配制
称取Tris、NaCl、Na2SO3和Proclin-300于容器中,加入水,充分搅拌,使加入的试剂完全溶解;调节PH在7.95-8.05的范围内;定容,配制溶液中Tris浓度为2.35g/L,NaCl浓度为6.41g/L,Na2SO3浓度为0.002g/L,Proclin-300的浓度为0.02%,PH在7.95-8.05范围内,配制好的溶液用0.2μm滤器过滤,过滤后,配制溶液与IUMIPHOS530按4:1的体积比加入IUMIPHOS530,混匀后于2-8℃下保存。
4.根据权利要求3所述的层粘连蛋白测试试剂盒的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中,DSS的投入量计算公式为:投入量=抗体质量/16000×10×368/CDSS。
5.根据权利要求3所述的层粘连蛋白测试试剂盒的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中,所述离心处理为将加入DSS的抗体溶液于高速冷冻离心机中在3000g的离心力下浓缩30分钟,至浓缩体积为小于0.5ml。
6.根据权利要求3所述的层粘连蛋白测试试剂盒的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中,所述磁珠直径为0.9-1.5μm,加入浓度为100mg/ml的磁珠。
7.如权利要求1或2所述的层粘连蛋白(LN)测试试剂盒的测试方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)加LN标准品、质控品、待测标本至对应试管底部;
(2)加试剂R1至每一试管中;
(3)加试剂R2至每一试管中;
(4)加磁分离试剂至每一试管中;
(5)各试管内试剂混匀后,置37℃水浴30分钟;
(6)将各试管放至磁分离器上,确保每支试管都与分离器表面接触,沉淀2分钟;缓慢倒出上清液,除去各试管内的液滴;
(7)清洗浓缩液用水稀释7倍后,加稀释后的清洗液至每一试管中,混匀;
(8)重复操作步骤(5)、(6)、(5)一遍;
(9)加底物溶液至试管中混匀3秒,迅速用准备好的发光检测仪进行检测。
8.根据权利要求7所述的层粘连蛋白(LN)测试试剂盒的测试方法,其特征在于,所述步骤(1)之前使用校准品进行曲线校正,并用质控品进行质量控制。
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