CN105973878A - 一种层粘连蛋白（ln）测试试剂盒及其测试方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种层粘连蛋白(LN)的测试试剂盒，该试剂盒由磁分离试剂，试剂R1，试剂R2，标准品、质控品，校准品，清洗浓缩液、稀释液及发光底物组成，本发明还公开了该试剂盒的制备方法。本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，与现有酶联免疫的技术相比，本发明具有更高的特异性，灵敏度，获得检测结果的时间短，操作方式简便，检测结果准确可靠，大大降低了产品成本。

Description

一种层粘连蛋白(LN)测试试剂盒及其测试方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及测定血清中层粘连蛋白含量的试剂盒及其测试方法。
背景技术
层粘连蛋白(laminin,LN)主要存在于基膜(basal lamina)结构中，是基膜所特有的非胶原糖蛋白,相对分子质量为820kDa,含13-15％的糖，有三个亚单位,即重链(α链,400kDa)和β1(215kDa)、β2(205kDa)两条轻链。结构上呈现不对称的十字形,由一条长臂和三条相似的短臂构成。这四个臂均有棒状节段和球状的末端域。β1和β2短臂上有两个球形结构域,α链上的短臂有三个球形结构域，其中有一个结构域同Ⅳ型胶原结合，第二个结构域同肝素结合，还有同细胞表面受体结合的结构域。正是这些独立的结合位点使LN作为一个桥梁分子，介导细胞同基膜结合。所以LN的主要功能就是作为基膜的主要结构成分对基膜的组装起关键作用,在细胞表面形成网络结构并将细胞固定在基膜上。
LN还有许多其他的作用,如在细胞发育过程中刺激细胞粘着、细胞运动。LN还能够刺激胚胎中神经轴的生长,并促进成年动物的神经损伤后重生长和再生。如同纤粘连蛋白,细胞外的LN能够影响细胞的生长、迁移和分化。LN在原生殖细胞的迁移中起关键作用。肝纤维化时人层粘连蛋白与Ⅳ型胶原结合形成内皮基膜，导致纤维化。血清人层粘连蛋白测定是观察慢性肝炎患者肝组织纤维化程度的一项重要指标之一
中国专利CN200710073309公开了一种层粘连蛋白测试试剂盒及其测试方法，试剂盒包含的试剂有：分离试剂、发光标记物、荧光素标记物以及采用纳米免疫磁性微珠作为分离试剂、采用抗LN单克隆抗体标记异鲁米诺衍生物作为发光标记物的测试方法，该LN试剂盒及其测试方法具有较高的灵敏度和特异性，但其出检测结果的时间较长，且采用的试剂量较多，无形中增加了试剂盒的试剂成本。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种特异性强，灵敏度高，获得检测结果的时间短，操作方式简便，检测结果准备可靠的层粘连蛋白(LN)的测试试剂盒及其测试方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种组合物，其中包括：牛γ球蛋白IgG、TRIS、NaCl和防腐剂。
本提供的组合物中各组分的浓度为：牛γ球蛋白IgG0.5～1μg/mL；TRIS1～2g/L；NaCl 4～5g/L；防腐剂0.1～0.5mL/L。
一些实施例中，本提供的组合物中各组分的浓度为：牛γ球蛋白IgG 0.9μg/mL；TRIS 1.56g/L；NaCl 4.23g/L；防腐剂0.2mL/L。
一些实施例中，防腐剂为Proclin300。
一些实施例中，pH值为7.4±0.05。
本发明提供的组合物在制备层黏连蛋白检测产品中的应用。
本发明提供的组合物，用于LN的磁微粒化学发光法，能够使得反应过程更加稳定可靠，具有更高的检测灵敏度和特异性，并达到了较佳的性能参数。试验表明，以本发明提供的组合物对LN进行检测，最低检测限可达0.03ng/mL，灵敏度高。批内变异CV％≦10.0％；批间变异CV％≦15.0％；精密性良好。标准曲线，线性系数：r≥0.9900；线性范围：0.03-100ng/ml。
本发明还提供了一种层粘连蛋白检测试剂盒，包括：磁分离试剂、试剂R1、试剂R2、清洗浓缩液和发光底物，其中：
所述磁分离试剂中含有标记有小鼠抗人LN的单克隆抗体的纳米磁性微球；
所述试剂R1中含有碱性磷酸酶标记的LN抗体；
所述试剂R2中含有牛γ球蛋白IgG；
所述清洗浓缩液中含有Tween-20；
所述稀释液中含有BSA；
所述发光底物中含有IUMIPHOS530。
在实施例中，标记有小鼠抗人IV-COL的单克隆抗体的纳米磁性微球的浓度为132～167μg/mL。
在一些实施例中，标记有小鼠抗人IV-COL的单克隆抗体的纳米磁性微球的浓度为132μg/mL。
在此实施例中，磁分离试剂中包括：标记有小鼠抗人IV-COL的单克隆抗体的纳米磁性微球132μg/mL；BSA V 3g/L；TRIS 4.58g/L；NaCl 6.81g/L；Tween20 0.96g/L；Proclin300 0.2mL/L。
在另一实施例中，标记有小鼠抗人IV-COL的单克隆抗体的纳米磁性微球的浓度为167μg/mL。
在此实施例中，磁分离试剂中包括：标记有小鼠抗人IV-COL的单克隆抗体的纳米磁性微球167μg/mL；BSA V 3g/L；TRIS 4.58g/L；NaCl 6.81g/L；Tween20 0.96g/L；Proclin300 0.2mL/L。
磁分离试剂的pH值为8.0±0.05。
磁分离试剂中标记有小鼠抗人LN的单克隆抗体的纳米磁性微球的制备方法为：
(1)将DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺)溶于DMSO中至浓度为20mg/mL，记为溶液1；将LN抗体溶于pH值为9.5的0.1mol/L PB缓冲液中至浓度为2mg/ml，记为溶液2；
(2)溶液1与溶液2混合，置室温90min，记为溶液3；
(3)将溶液3加入到Centricon-10浓缩管中,3000g离心30min至体积为0.5ml，记为抗体溶液；
(4)取0.5mL磁珠经磁铁吸附2分钟后吸取上清；以pH值为9.5的0.1mol/L PB缓冲液清洗3次；
(5)抗体溶液与磁珠混合，室温反应4小时，保持混匀状态；
(6)加入1mol/L的Tris溶液37℃孵育15分钟，获得标记的磁珠；其中Tris的加样量为1mg抗体加0.15mlTris；
(7)以pH 7.2 0.1mol/L PB清洗标记的磁珠3次，获得标记有小鼠抗人LN的单克隆抗体的纳米磁性微球。
本发明采用的LN抗体为LN的单克隆抗体，本发明对其来源不做限定，其可为自制也可于市场购得，其实施皆在本发明的保护范围之内。本发明采用的LN单克隆抗体来自北京菲斯特生物科技有限公司。
本发明采用的磁珠为四氧化三铁微球，其直径为0.01～5.0μm。
在本发明中，试剂R1中碱性磷酸酶标记的IV-COL抗体的浓度为0.5～2μg/mL。
在实施例中，碱性磷酸酶标记的IV-COL抗体的浓度为0.6～1μg/mL。
在一些实施例中，碱性磷酸酶标记的IV-COL抗体的浓度为0.6μg/mL。
在此实施例中，试剂R1中包括：碱性磷酸酶标记的IV-COL抗体0.6μg/mL；BSA V3g/L；TRIS 6.06g/L；NaCl 13.0g/L；Proclin300 0.2mL/L；MgCl2 0.05g/L；Zncl2 0.05g/L。
在另一实施例中，碱性磷酸酶标记的IV-COL抗体的浓度为1μg/mL。
在此实施例中，试剂R1中包括：碱性磷酸酶标记的IV-COL抗体1μg/mL；BSA V 3g/L；TRIS 6.06g/L；NaCl 13.0g/L；Proclin300 0.2mL/L；MgCl2 0.05g/L；Zncl2 0.05g/L。
试剂R1的pH值为7.4±0.05。
碱性磷酸酶标记的LN抗体的制备方法为：
(1)将ALP溶解于生理盐水，至浓度为2mg/mL，加入到Centricon-10浓缩管中，3000rpm离心大约20分钟，获得ALP溶液；
(2)每毫升ALP溶液加入0.2ml的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟后，装入透析袋中，用1mM pH值为4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜，获得醛化ALP；
(3)每毫升加20μl 0.2MpH值为9.5的碳酸盐缓冲液，使pH值为9.0～9.5，加入LN的IgG抗体至抗体浓度为2.5mg/mL，在0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时；
(4)每毫升加0.1ml 4mg/ml NaBH4溶液，4℃放置2小时；然后以0.15MpH7.4PBS透析，4℃过夜；
(5)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，4℃放置1小时后，3000rpm离心半小时，弃上清；沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于0.15MpH值为7.4的PBS中，以0.15MPH7.4的PB缓冲盐水透析约5个小时；
(6)10000rpm离心30分钟去除沉淀，制得碱性磷酸酶标记的LN抗体。
在本发明中，试剂R2中包括：牛γ球蛋白IgG 0.5～1μg/mL；TRIS 1～2g/L；NaCl 4～5g/L；防腐剂0.1～0.5mL/L。
一些实施例中，牛γ球蛋白IgG 0.9μg/mL；TRIS 1.56g/L；NaCl 4.23g/L；防腐剂0.2mL/L。
一些实施例中，防腐剂为Proclin300。
一些实施例中，试剂R2的pH值为7.4±0.05。
在本发明中，所述清洗浓缩液中包括：TRIS 12.54g/L；NaCl 325.6g/L；Tween205g/L；Proclin300 0.2mL/L。
清洗浓缩液的pH值为7.4±0.05。
在本发明中，所述稀释液中包括：BSA V 60g/L；NaCl 9g/L；Proclin-3000.5mL/L。
在本发明中，发光底物中包括：LUMIPHOS530 250mL/L；TRIS 2.35g/L；NaCl6.41g/L；Na2SO3 0.002g/L；Proclin-300 0.2mL/L。
发光底物的pH值为8.0±0.05。
在本发明中，本发明提供的试剂盒中还包括标准品、质控品和/或标准品；
所述标准品、质控品和标准品中含有LN抗原和BSA V。
所述标准品为不同浓度的LN抗原溶液，其中含有BSA V。
标准品中，LN抗原的浓度分别为0ng/mL、30ng/mL、90ng/mL、180ng/mL、450ng/mL、900ng/mL。
各标准品中，BSA的浓度为6％。
所述质控品为不同浓度的LN抗原溶液，其中含有BSA V。
质控品中，LN抗原的浓度分别为60ng/mL、450ng/mL。
各质控品中，BSA的浓度为6％。
所述校准品为不同浓度的LN抗原溶液，其中含有BSA V。
校准品中，LN抗原的浓度分别为90ng/mL、450ng/mL。
各校准品中，BSA的浓度为6％。
本发明提供的试剂盒适用于全自动仪器检测或半自动仪器检测，采用全自动检测的实际和中，包括校准品。
本发明提供的试剂盒中还包括ID卡。
本发明提供试剂和中各试剂的比例以体积份数计为：磁分离试剂4～6份，试剂R14～6份，试剂R2 4～6份，校准品4～6份，质控品1～3份，校准品1～3份，清洗浓缩液20～30份，稀释液10～20份，发光底物25～40份。
本发明提供的试剂盒采用本发明提供的组合物，其适用于LN的化学发光法检测，其检测灵敏度高，精密性，线性范围较广。其能够检测的物质为LN的标准品、质控品或校准品，血清或全血。其可用于疾病的诊断或治疗，也可仅用于科研目的的检测。
本发明提供的试剂盒用于非疾病诊断或治疗目的LN的磁微粒化学发光法检测。
本发明提供的试剂盒的使用方法，包括：
步骤1:将待测样品与试剂R1、试剂R2、磁分离试剂混合，37℃孵育30min；
步骤2:磁分离沉淀1min后，弃上清液、以经稀释的清洗浓缩液清洗后，与发光底物混合，测定发光值，根据发光值，以标准曲线法确定LN浓度。
标准曲线采用标准品绘制，以标准品浓度为横坐标，以发光值为纵坐标，拟合曲线，获得公式。
步骤1中试剂R1、试剂R2、磁分离试剂的体积比为1:1:1。
步骤2中稀释采用纯化水，稀释的比例为7倍。
遇到高值HOOK样本，以稀释液对待测样品稀释后进行检测。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明公开了一种新的组合物，用于LN的磁微粒化学发光法，使得反应过程更加稳定可靠，具有更高的检测灵敏度和特异性，并达到了较佳的性能参数。
(2)本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，与现有技术相比，在出结果时间上较传统酶联免疫法少10-20分钟，同时抗体的用量降低了20％以上，在提高产品性能的同时，大大降低了产品成本。
(3)试剂盒中各组分的配比均是反应体系下的最优配方，给该试剂盒的使用有效期及检测性能提供了有力保障。
(4)本发明试剂盒的精确度、灵敏度以及稳定性均优于市场同类产品，并且成本低廉，操作简单，应用前景广阔。
试验表明，以本发明提供的组合物对LN进行检测，最低检测限可达0.03ng/mL，灵敏度高。批内变异CV％≦10.0％；批间变异CV％≦15.0％；精密性良好。标准曲线，线性系数：r≥0.9900；线性范围：0.03-100ng/ml。
具体实施方式
本发明公开了一种层粘连蛋白(LN)测试试剂盒及其测试方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品、方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
以配制1L为例：
(1)称取Tris(三羟甲基氨基甲烷，分子式:(HOCH2)3CNH2)1.56g和NaCl 4.23g于1L烧杯中；用移液器将Proclin-300量取0.2ml于少量纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；
(2)用量筒量取800ml纯化水于烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解；用4M HCL或4MNaOH调PH，测量其范围在7.35-7.45之间；
(3)称取牛γ球蛋白IgG 0.9g于800ml纯化水的烧杯中；
(4)最后定容1000ml，完全溶解后，测PH值，范围在7.35-7.45之间即符合要求，用0.2um滤器过滤；过滤完后，贴好标签于2-8℃冷库贮存；
试剂R2的配制(表1)
实施例2：
本发明的一种层粘连蛋白(LN)测试试剂盒，该试剂盒由磁分离试剂，试剂R1，试剂R2，标准品，质控品，校准品，清洗浓缩液，稀释液及发光底物组成，其中：磁分离试剂：标记有小鼠抗人LN的单克隆抗体的纳米磁性微球，所述标记有小鼠抗人LN的单克隆抗体的纳米磁性微球的浓度为167μg/ml；试剂R1：含有碱性磷酸酶标记的LN抗体，所述碱性磷酸酶标记的LN抗体浓度为1μg/ml；试剂R2：含有牛γ球蛋白质组分的缓冲液；标准品，质控品和校准品：含有一定量LN抗原的牛血清白蛋白组分五(BSA V)溶液，所述标准品的浓度为0(S0)、30(S1)、90(S2)、180(S3)、450(S4)、900(S5)ng/ml，所述质控品的浓度为60,450ng/ml，所述校准品的浓度为90,450ng/ml；清洗浓缩液：含有Tween-20和Proclin-300的缓冲液；稀释液：含有牛血清白蛋白组分五(BSA V)的溶液；发光底物：金刚烷的衍生物IUMIPHOS530，所述金刚烷的衍生物IUMIPHOS530的浓度为10μg/ml；
本实施例的一种层粘连蛋白(LN)测试试剂盒，由下述体积比组成的：磁分离试剂4％，试剂R1 4，试剂R2 4，校准品4，质控品1，校准品1，清洗浓缩液20，稀释液10，发光底物25；
本发明上述层粘连蛋白(LN)测定试剂盒的制备方法，其具体步骤如下：
第一步：磁分离试剂的制备过程
一、磁珠缓冲液配制操作规程：配方见表2，以配制1L为例：
(1)称取Tris 4.58g和NaCl6.81g于1L容器中，称取0.96g Tween-20于20ml容器中加适量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；
(2)用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；然后在1L容器中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；
(3)调节PH计测量其PH值；用4M HCl或4M NaOH调PH，测量其PH在7.95－8.05之间即符合要求；
(4)称取BSA V(牛血清白蛋白)3g倒入上述1L容器中；
(5)最后定容至1000ml，测PH值，范围在7.95－8.05之间即符合要求，用0.2um滤器过滤即得；过滤完后贴好标签于2-8℃冷库贮存；
磁珠缓冲液(表2)
二、磁分离试剂的配制
(1)将1.0mg DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺)溶于50ul DMSO中，即浓度为20mg/mL；取2mgLN抗体溶于PH 9.5的0.1mol/L PB缓冲液中至总体积为1ml；
(2)计算DSS的投入量，按照以下公式计算：(抗体质量/16000)×10×368/CDSS)，其中CDSS指代DSS的物质的量浓度mol/L；
(3)用移液枪吸取相应体积的DSS加入到步骤1的抗体溶液中，置室温90min；
(4)将步骤3抗体溶液加入到Centricon-10浓缩管中,然后放入到sigma2-16k高速冷冻离心机中在3000g的离心力下浓缩约30min至体积为0.5ml；
(5)取0.5ml磁珠，所述的磁珠直径在0.01-5.0μm之间，加入5ml反应杯中，放入专用试管架，经磁铁吸附2分钟后吸取上清；
(6)每次加入1.5ml PH9.5 0.1mol/L PB，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；将步骤4获得的抗体溶液加入到磁珠中，混匀后室温反应4小时，保持混匀状态；
(7)加入0.3ml 1mol/L的Tris溶液37℃15分钟，其中Tris的加样量为1mg抗体加0.15mlTris；
(8)每次加入1.5ml PH 7.2 0.1mol/L PB清洗已经标记的磁珠，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；
(9)用100ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶，即为0.05％的LN磁分离试剂；
(10)将步骤9获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1：1的比例混匀，即得本发明试剂盒中分离试剂。
第二步：试剂R1的制备过程
一、试剂R1稀释液配制操作规程：配方见表3，以配制1L为例：
(1)取Tris 6.06g、NaCl 13.0g、Zncl2 0.05g、Proclin-300 0.2ml和MgCl2 0.05g于烧瓶中；然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；
(2)用4M HCl或4M NaOH调PH，测量使PH在7.35-7.45范围内；
(3)称取BSA V 3g倒入上述烧瓶中；
(4)最后定容至1000ml，测PH值，范围在7.35-7.45之间即符合要求，用0.2um滤器过滤；过滤完后，贴好标签于2-8℃冷库贮存；
试剂R1稀释液表3
二、试剂R1的配制(碱性磷酸酶(ALP)标记的小鼠抗人LN单克隆抗体)
(1)取10mgALP加入5ml生理盐水中，加入到Centricon-10浓缩管中，3000rpm离心大约20分钟，浓缩至1毫升。
(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟。
(3)将上述溶液装入透析袋中，用1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。
(4)加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化ALP的PH升高到9.0～9.5，然后立即加入2.5mg IgG抗体，在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。
(5)加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混匀，再置4℃2小时。
(6)将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4PBS透析，4℃过夜。
(7)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。
(8)3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。
(9)将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析约5个小时，去除铵离子后，10000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，加入体积1/100的1MMgcl2溶液4℃保存。收集到的碱性磷酸酶(ALP)与LN单克隆抗体的偶联物用上述酶反应物稀释液以1：600的体积比混合均匀，即得本发明试剂盒中试剂R1。
第三步：试剂R2的制备
试剂R2配制操作规程：配方见(表4)，以配制1L为例：
(1)称取Tris(三羟甲基氨基甲烷，分子式:(HOCH2)3CNH2)1.56g和NaCl 4.23g于1L烧杯中；用移液器将Proclin-300量取0.2ml于少量纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；
(2)用量筒量取800ml纯化水于烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解；用4M HCL或4MNaOH调PH，测量其范围在7.35-7.45之间；
(3)称取牛γ球蛋白IgG 0.9g于800ml纯化水的烧杯中；
(4)最后定容1000ml，完全溶解后，测PH值，范围在7.35-7.45之间即符合要求，用0.2um滤器过滤；过滤完后，贴好标签于2-8℃冷库贮存；
试剂R2的配制(表4)
第四步：标准品和质控品的配制：
(1)最高点：最高浓度点为X，目标点浓度为A,B,C,D,E,F，配制V体积的溶液时，需加入原料的体积为分别为：表5
(2)层粘连蛋白(LN)定量测定试剂盒LN标准品原料配制成浓度点为0，0.1，1，5，50，100ng/ml；质控品配制的浓度点为0.6，50ng/ml。校准品配制的浓度点为1，50ng/ml
(3)完全溶解后，贴好标签于2-8℃冷库贮存；
第五步：清洗浓缩液配制操作规程：配方见(表6)，以配制1L为例：
(1)称取Tris 12.54g和NaCl 325.6g于1L容器中；
(2)称取5g Tween-20于100ml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述容器中；
(3)用移液器将Proclin-300量取0.2ml于盛有10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；
(4)用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解；
(5)用4M HCL或4M NaOH调PH，测量其范围在7.35－7.45之间；
(6)最后定容1000ml，测PH值，范围在7.35-7.45之间即符合要求，完全溶解后用0.2um滤器过滤即得；过滤完后，贴好标签于2-8℃冷库贮存；
清洗浓缩液的配制(表6)
第六步：稀释液配方见(表7)，以配制1L为例：
(1)称取NaCl9.0g和BSA V 60g于1L的容器中；
(2)用移液器将Proclin-300量取0.5ml加10ml纯化水溶解，倒入上述1L的容器中；
(3)最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um滤器过滤，贴好标签于2-8℃冷库贮存；
稀释液的配制(表7)
第七步：发光底物配制操作规程：配方见(表8)，以配制1L为例：
(1)称取Tris2.35g、NaCl 6.41g、Na2SO3 0.002g和Proclin-300 0.2ml于1L烧杯中；
(2)用量筒量取800ml纯化水于烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解；用4M HCl或4MNaOH调PH，测量其范围在7.95-8.05之间；
(3)最后定容至1000ml，测PH值，范围在7.95-8.05之间即符合要求，用0.2um滤器过滤；过滤完后，加入250ml IUMIPHOS530，混匀后，贴好标签于2-8℃冷库贮存；
发光底物的配制(表8)
本发明一种层粘连蛋白(LN)的测试方法，包括下列步骤：
(1)使用前，需使用试剂盒内校准品(选)进行曲线校正，并用质控品进行质量控制。测试结果在质控范围内方可进行样本的检测。
(2)加4份LN标准品、质控品、待测标本至对应试管底部；
(3)加4份试剂R1至每一试管中；
(4)加4份试剂R2至每一试管中；
(5)加4份磁分离试剂至每一试管中；
(6)用塑料薄膜覆盖试管，多管混匀器轻轻振荡试管架30s后，置37℃水浴30分钟；
(7)试管连架放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀2分钟。缓慢的倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上，用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；
(8)清洗浓缩液用纯化水稀释7倍后，加26.7份稀释后的清洗液至每一试管中，置多管混匀器上轻轻振荡混匀30s。加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出。混匀要彻底；
(9)重复步骤6、7、6一遍；
(10)加25份底物溶液至试管中混匀3秒，迅速用准备好的发光检测仪进行检测。
(11)如遇到高值HOOK样本，建议临床医师根据其余测试指标选择合适的稀释倍数用稀释液对样品进行稀释。
实施例3：
本发明的一种层粘连蛋白(LN)测试试剂盒，该试剂盒由磁分离试剂，试剂R1，试剂R2，标准品，质控品，校准品，清洗浓缩液，稀释液及发光底物组成，其中：磁分离试剂：标记有小鼠抗人LN的单克隆抗体的纳米磁性微球，所述标记有小鼠抗人LN的单克隆抗体的纳米磁性微球的浓度为132μg/ml；试剂R1：含有碱性磷酸酶标记的LN抗体，所述碱性磷酸酶标记的LN抗体浓度为0.6μg/ml；试剂R2：含有牛γ球蛋白质组分的缓冲液；标准品，质控品和校准品：含有一定量LN抗原的牛血清白蛋白组分五(BSA V)溶液，所述标准品的浓度为0(S0)、30(S1)、90(S2)、180(S3)、450(S4)、900(S5)ng/ml，所述质控品的浓度为60,450ng/ml，所述校准品的浓度为90,450ng/ml；清洗浓缩液：含有Tween-20和Proclin-300的缓冲液；稀释液：含有牛血清白蛋白组分五(BSA V)的溶液；发光底物：金刚烷的衍生物IUMIPHOS530，所述金刚烷的衍生物IUMIPHOS530的浓度为10μg/ml；
本实施例一种层粘连蛋白(LN)测试试剂盒，由下述体积比组成的：磁分离试剂5.1，试剂R1 5.1，试剂R2 5.1，校准品5.1，质控品1.7，校准品1.7，清洗浓缩液25，稀释液17，发光底物34；
本实施例的测试方法，包括下列步骤：
(1)使用前，需使用试剂盒内校准品(选)进行曲线校正，并用质控品进行质量控制。测试结果在质控范围内方可进行样本的检测。
(2)加5.1份LN标准品、质控品、待测标本至对应试管底部；
(3)加5.1份试剂R1至每一试管中；
(4)加5.1份试剂R2至每一试管中；
(5)加5.1份磁分离试剂至每一试管中；
(6)用塑料薄膜覆盖试管，多管混匀器轻轻振荡试管架30s后，置37℃水浴30分钟；
(7)试管连架放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀2分钟。缓慢的倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上，用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；
(8)清洗浓缩液用纯化水稀释7倍后，加26.7份稀释后的清洗液至每一试管中，置多管混匀器上轻轻振荡混匀30s。加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出。混匀要彻底；
(9)重复步骤6、7、6一遍；
(10)加34份底物溶液至试管中混匀3秒，迅速用准备好的发光检测仪进行检测。
(11)如遇到高值HOOK样本，建议临床医师根据其余测试指标选择合适的稀释倍数用稀释液对样品进行稀释。
本实施例采用所述的试剂盒各组分的配制方法与实施例2相同。
实施例4：
本发明的一种层粘连蛋白(LN)测试试剂盒，该试剂盒由磁分离试剂，试剂R1，试剂R2，标准品，质控品，校准品，清洗浓缩液，稀释液及发光底物组成，其中：磁分离试剂：标记有小鼠抗人LN的单克隆抗体的纳米磁性微球，所述标记有小鼠抗人LN的单克隆抗体的纳米磁性微球的浓度为167μg/ml；试剂R1：含有碱性磷酸酶标记的LN抗体，所述碱性磷酸酶标记的LN抗体浓度为1μg/ml；试剂R2：含有牛γ球蛋白质组分的缓冲液；标准品，质控品和校准品：含有一定量LN抗原的牛血清白蛋白组分五(BSA V)溶液，所述标准品的浓度为0(S0)、30(S1)、90(S2)、180(S3)、450(S4)、900(S5)ng/ml，所述质控品的浓度为60,450ng/ml，所述校准品的浓度为1,50ng/ml；清洗浓缩液：含有Tween-20和Proclin-300的缓冲液；稀释液：含有牛血清白蛋白组分五(BSA V)的溶液；发光底物：金刚烷的衍生物IUMIPHOS530，所述金刚烷的衍生物IUMIPHOS530的浓度为10μg/ml；
本实施例一种层粘连蛋白(LN)测试试剂盒，由下述体积比组成的：磁分离试剂6，试剂R1 6，试剂R2 6，校准品6，质控品3，校准品3，清洗浓缩液30，稀释液20，发光底物40；
本实施例的测试方法，包括下列步骤：
(1)使用前，需使用试剂盒内校准品(选)进行曲线校正，并用质控品进行质量控制。测试结果在质控范围内方可进行样本的检测。
(2)加6份LN标准品、质控品、待测标本至对应试管底部；
(3)加6份试剂R1至每一试管中；
(4)加6份试剂R2至每一试管中；
(5)加6份磁分离试剂至每一试管中；
(6)用塑料薄膜覆盖试管，多管混匀器轻轻振荡试管架30s后，置37℃水浴30分钟；
(7)试管连架放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀2分钟。缓慢的倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上，用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；
(8)清洗浓缩液用纯化水稀释7倍后，加26.7份稀释后的清洗液至每一试管中，置多管混匀器上轻轻振荡混匀30s。加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出。混匀要彻底；
(9)重复步骤6、7、6一遍；
(10)加40份底物溶液至试管中混匀3秒，迅速用准备好的发光检测仪进行检测。
(11)如遇到高值HOOK样本，建议临床医师根据其余测试指标选择合适的稀释倍数用稀释液对样品进行稀释。
本实施例采用所述的试剂盒各组分的配制方法与实施例2相同。
实施例5：临床试验：
1、检测数据
标本采自1000例正常体检、供血者。样本体检结果均无肝、脑、肾、消化道疾病，半年内无输血和大手术史，妇女不在妊娠期和哺乳期。分离血清进行检测，将测值进行统计学分析，得出正常血清参考范围：5～130ng/ml。本数据仅供参考，不同地区、不同个体以及采用不同方法进行检测，所测得的LN水平也会有所不同，建议各实验室建立自己的正常值范围。不可仅凭本方法得出的LN值作出诊断，仅作为中间数据参考作用，应结合临床其他资料分析结果，包括病人的具体情况和治疗状况。通过其他方法得到的样品中的LN浓度值与本试剂盒测定结果不具有直接的可比性。超出试剂盒测定范围的样本，系统将无法给出确切的数值。如欲测定其确切的结果，建议稀释后再进行测定。本试剂盒的检测结果仅供临床参考，不能单独作为确诊或排除病例的依据，为达到诊断目的，此检测结果要与临床检查、病史和其它的检查结合使用。本品可用于血清样本的测定，用于其他体液样本中LN浓度测定的可靠性未得到充分确认。
2、本发明试剂盒性能指标
分析灵敏度定义为：对20次零标准品的测定，取其2倍的平均偏差，其在标准曲线上所对应的浓度即为分析灵敏度；分析灵敏度：最低检测限为0.03ng/ml；精密性：批内变异CV％≦10.0％；批间变异CV％≦15.0％；线性系数：r≥0.9900；线性范围：0.03-100ng/ml：
与主要类似物的交叉反应情况(表9)：
结果显示，本发明试剂盒具有良好的灵敏性、精密型、线性范围广，且具有良好的抗干扰能力。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (12)

1.一种组合物，其中包括：牛γ球蛋白IgG、TRIS、NaCl和防腐剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，各组分的浓度为：
牛γ球蛋白IgG 0.5～1μg/mL；TRIS 1～2g/L；NaCl 4～5g/L；防腐剂0.1～0.5mL/L。
3.权利要求1或2所述的组合物在制备层黏连蛋白检测产品中的应用。
4.一种层粘连蛋白检测试剂盒，包括：权利要求1或2所述的组合物、磁分离试剂、试剂R1、清洗浓缩液、稀释液和发光底物，其中：
所述磁分离试剂中含有标记有小鼠抗人LN的单克隆抗体的纳米磁性微球；
所述试剂R1中含有碱性磷酸酶标记的LN抗体；
所述清洗浓缩液中含有Tween-20；
所述稀释液中含有BSA；
所述发光底物中含有IUMIPHOS530。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁分离试剂中标记有小鼠抗人LN的单克隆抗体的纳米磁性微球的浓度为100～200μg/mL。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中碱性磷酸酶标记的LN抗体的浓度为0.5～2μg/mL。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述清洗浓缩液中包括：TRIS 12.54g/L；NaCl 325.6g/L；Tween20 5g/L；Proclin300 0.2mL/L。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释液中包括：BSA V 60g/L；NaCl9g/L；Proclin-300 0.5mL/L。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述发光底物中包括：IUMIPHOS530250mL/L；TRIS 2.35g/L；NaCl 6.41g/L；Na2SO3 0.002g/L；Proclin-300 0.2mL/L。
10.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其中还包括标准品、质控品和/或标准品；
所述标准品、质控品和标准品中含有LN抗原和BSA V。
11.权利要求4～10任一项所述的试剂盒用于非疾病诊断或治疗目的LN的磁微粒化学发光法检测。
12.权利要求4～10任一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括：
步骤1:将待测样品与试剂R1、试剂R2、磁分离试剂混合，37℃孵育30mi n；
步骤2:磁分离沉淀1min后，弃上清液、以经稀释的清洗浓缩液清洗后，与发光底物混合，测定发光值，根据发光值，以标准曲线法确定LN浓度。
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