CN106370860A - 血清免疫球蛋白e胶体金层析定量检测试剂盒及试纸条 - Google Patents

血清免疫球蛋白e胶体金层析定量检测试剂盒及试纸条 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种血清免疫球蛋白E胶体金层析定量检测试剂盒及试纸条，所述试剂盒包括：胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体、兔抗人IgE多克隆抗体、羊抗鼠IgG抗体。本发明采用胶体金免疫层析技术，需要与免疫层析结果判读仪联合使用。本发明所述的试剂盒以及试纸条具有操作简单，无需培训，可迅速掌握，无需大型设备，适合基层实验室或社区实验室应用。

Description

血清免疫球蛋白E胶体金层析定量检测试剂盒及试纸条
技术领域
本发明属于临床医学检验领域，尤其是涉及一种血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试剂盒,采用胶体金免疫层析技术，与免疫层析结果判读仪联合使用。
背景技术
“过敏性疾病”是指机体对某些抗原初次应答后，再次接受相同抗原刺激时发生的一种病理性免疫应答。过敏性疾病主要由免疫球蛋白E(IgE)介导，导致过敏性疾病的抗原称为“过敏原(allergen)”。过敏原进入机体后可刺激B淋巴细胞产生特异性IgE(sIgE)抗体，sIgE与肥大细胞或嗜碱性粒细胞结合使机体处于致敏状态。当相同过敏原再次进入已致敏状态机体时，过敏原与特异性IgE抗体结合而触发致敏细胞的活化，释放活性介质产生过敏反应并导致临床症状。近年来，随着社会经济的发展，生活环境的改善和生活方式的变化，过敏性疾病正在迅速增加。研究发现，正常人血清tIgE水平很低，但在发生过敏反应时会显著升高。临床上，血清tIgE测定常作为过敏反应性疾病的初筛试验或鉴别诊断指标。
早期血清tIgE检测方法是上世纪60年代所建立的免疫放射分析方法。此方法以放射性核素(125I)作为标记物，采用双抗体夹心分析模式。基本原理如下：于固相材料包被抗人-IgE多克隆抗体(捕获抗体)，用125I标记抗人-IgE单克隆抗体(标记抗体)；待检血清中IgE与塑料试管表面的捕获抗体结合，同时结合标记抗体形成捕获抗体-待检IgE-标记抗体复合物，经洗涤分离游离标记抗体，通过γ计数器测定放射信号，信号强度与血清IgE含量呈正比例函数关系。免疫放射分析具有较高的分析敏感性和分析特异性，但因放射性污染问题，如今已被淘汰。
目前，被临床实验室广泛使用的血清IgE定量方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、发光免疫分析(FIA)和免疫比浊分析(含散射和透射)。ELISA方法采用96-T板式方式适合批量检测，技术成熟、检测成本低；但影响酶的因素较多，分析精密度差，不适合单一标本独立检测。发光免疫分析(FIA)具有较高分析特异性和分析精密度，但国内技术尚未成熟，分析仪器及其试剂主要依靠进口，检测成本较高不适合基层医疗单位应用。免疫比浊技术(IA)需采用乳球增强比浊分析技术(PETIA)，用抗人-IgE抗体包被包被聚苯乙烯微粒作为主要试剂。当血清中IgE与聚苯乙烯微粒表面的抗IgE结合导致聚苯乙烯微粒靠近和聚集，此种聚集导致穿过溶液的光束发生散射。检测某种角度散射光，散射光的强度与样本IgE浓度呈正比例函数关系。此种方法是目前国内广泛应用血清IgE定量方法，采使用西门子(SIEMENS)公司BN ProSpec特种蛋白分析仪，配套使用相应进口试剂。正常血清IgE含量很低，而过敏患者血清IgE水平较高，因此，需要较宽检测范围，为保证任何水平IgE均获得准确结构，需使用高质量抗人IgE抗体和具有监测“钩状效应”软件和硬件系统，故对分析仪器性能要求很高。
如前文所述，过敏性疾病是一种常见病和多发病，且中国人口众多，地域广阔，一些基层医疗单位因不能开展血清IgE定量检测，不能对过敏性疾病进行鉴别诊断，从而加重三级甲等医院的门诊负担。同时，正常人血清IgE水平低于100IU/ml，而过敏性疾病患者含量差异很大，从每毫升几百单位到几千单位。针对异常标本，精确定量到“十”位对临床诊断，特别是鉴别诊断没有实际意义。因此，针对基层医院的“初诊”患者，急需一种简单、快速、成本低POCT产品，能够快速检测外周血IgE含量的体外诊断试剂。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种血清免疫球蛋白E胶体金层析定量检测试剂盒以及试纸条，以实现血清IgE含量的快速定量的检测。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试剂盒，包括：胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体、兔抗人IgE多克隆抗体、羊抗鼠IgG抗体。
优选的，所述胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体的浓度为2～20微克/毫升，优选的，5微克/毫升；所述兔抗人IgE多克隆抗体、羊抗鼠IgG抗体均为0.5-1.0毫克/毫升，优选0.8毫克/毫升。
优选的，所述胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体通过如下方法制备而成，调节胶体金溶液pH至8.0-8.4；于胶体金溶液中加入抗体，搅拌5-10分钟；再加入牛血清白蛋白，至牛血清白蛋白的终浓度为2.5-25mg/mL，优选5mg/mL，搅拌混匀；再加入PEG 20000，至PEG20000终浓度为1-10mg/mL，优选2mg/mL，再持续搅拌混匀；2～8℃静置过夜；离心10000～13000rpm15～45分钟，小心弃上清；得到的沉淀即为胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体。
优选的，所述胶体金溶液中胶体金颗粒粒径为16-71.5nm，优选41nm的胶体金颗粒；所述抗体的加入量为0.4-0.8mg，优选0.6mg；用0.1M K2CO3或0.1M HCl调节胶体金溶液的pH。
优选的，将最后制备的沉淀用含有0.5毫克/毫升PEG 20000缓冲液悬浮，测定吸光度值A，调整浓度至A＝1.5(1cm/525nm)，加0.5毫克/毫升叠氮钠防腐；4℃保存，应用时将胶体金标记的鼠抗人IgE单克隆抗体稀释至5微克/毫升。
本发明还提供了一种血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试纸条，组装试剂包括如上所述的试剂盒中的试剂；所述试剂条包括胶体金抗体垫、硝酸纤维膜、PVC垫板、加样垫以及吸水纸；
其中胶体金抗体垫内置胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体；
硝酸纤维膜的检测区(T区)，包被有兔抗人IgE多克隆抗体；质控区(C区)预包被有羊抗鼠IgG抗体；
所述PVC垫板上依次组装有加样垫、胶体金抗体垫、硝酸纤维膜以及吸水纸；所述硝酸纤维膜的检测区靠近胶体金抗体垫，质控区靠近吸水纸。
本发明同时提供了一种利用如上所述的血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试纸条进行检测的方法，包括以下步骤，
1)将试纸条水平放置与实验台上；待试纸条平衡至室温后，再撕开试纸条外侧的铝板袋将试纸条取出；
2)新鲜血清、血浆或全血样本无需预处理，冰冻或2～8℃存储样本，应先平衡至室温再进行检测；
3)取出样本稀释液，混匀备用；优选的，样本稀释液为0.01M PH7.4PBS缓冲溶液；
4)加样及判读：用移液枪吸取10μL血清/血浆样本，或15μL全血样本，慢慢加到胶体金抗体垫上，立即在加样垫上加100μL样本稀释液，开始计时，10～20分钟内用免疫层析结果判读定量判定结果；超过20分钟判定，结果无效；
本发明采用双抗体夹心模式，将待检血清滴加样本孔，样本在层析果过程中首先溶解胶体金抗体并与之形成待检IgE-鼠抗人IgE-胶体金复合物，继续泳动至T区，与捕获抗体(兔抗人IgE多克隆抗体)结合形成双抗体夹心复合物，形成紫色条带，颜色强度与待检IgE含量呈正比例函数关系。游离(过剩)的胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体泳动至C区，与羊抗鼠IgG抗体结合形成免疫复合物，显色。将测试板放入免疫层析结果判读仪内，读取胶体金颜色密度，并通过内置剂量-反应函数计算待检标本IgE含量打印实验结果。
优选的，还包括校准步骤：读取试剂前确认所用免疫层析结果判读记录仪处于正常运行状态，并经过日常光度校准，仪器使用前按照标准曲线下载方式下载该批号试剂所使用标准曲线，并导入IC卡中作为试剂判读依据，不同批号试剂不可混用标准曲线。
本发明也提供了一种根据如上所述的血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试剂盒在分析血清IgE水平中的应用。
本发明还提供了一种根据如上所述的试纸条在分析血清IgE水平中的应用。
相对于现有技术，本发明所述的血清免疫球蛋白E胶体金层析定量检测试剂盒及试纸条，具有以下优势：
(1)本发明所述的试剂盒以及试纸条，其测定IgE时，操作简单，无需培训，可迅速掌握，无需大型设备，适合基层实验室或社区实验室应用。
(2)本发明采血后立即检测的POCT模式，可防止标本搞错，以及标本存放引起待测物降解所带来误差。
(3)本发明与现有检测方法相比，具有检测成本低的优点，同时具有临床鉴别诊断可介绍的分析准确度，非常适合疑似患者初诊时的广泛筛查。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明实施例所述的试纸条的结构示意图；
图2为本发明实施例所述的检测过程的示意图，加入样本时；
图3为本发明实施例所述的检测过程的示意图，加入样本稀释液时；
附图标记说明：
1、PVC垫板；2、加样垫；3胶体金抗体垫；4、硝酸纤维膜T(检测区)，包被有兔抗人IgE多克隆抗体；C(质控区)预包被有羊抗鼠IgG抗体；5、吸水纸；6、待检IgE；7、金标记鼠抗人IgE单克隆抗体；8、兔抗人IgE多克隆抗体；9、羊抗鼠IgG抗体。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
实施例一
1、胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体的制备
原料：鼠抗人IgE单克隆抗体，商品化试剂，英国ABCAM公司产品。胶体金颗粒，商品化试剂，中新科炬生物技术公司产品。
方法：
用0.1M K2CO3或0.1M HCl调节胶体金溶液pH至8.0-8.4左右；于20毫升胶体金溶液(胶体金颗粒的粒径41nm)中加入抗体(抗体加入量为0.6mg)，搅拌5-10分钟；再加入100mg/mL牛血清白蛋白(BSA)，至BSA终浓度为5mg/mL，搅拌混匀15min；再加入200mg/mL PEG20000(聚乙二醇，分子量为20,000)至PEG 20000终浓度为2mg/mL，再持续搅拌混匀15min；4℃静置过夜；离心14000rpm 30分钟，小心弃上清；沉淀用含有0.5毫克/毫升PEG 20000缓冲液悬浮，测定吸光度值A，调整浓度至A＝1.5左右(1cm/525nm)，加0.5毫克/毫升叠氮钠防腐；4℃保存，应用时将胶体金标记的鼠抗人IgE单克隆抗体稀释至5微克/毫升。
2、预包被抗体硝酸纤维膜的制备
原料：硝酸纤维膜商品化材料；兔抗人IgE多克隆抗体商品化试剂，英国ABCAM公司产品；羊抗鼠IgG抗体商品化试剂，美国Sigma公司产品
制备方法：
采用点样机进行点样。检测区(T)和质控区(C)同时点样，T区包被兔抗人IgE多克隆抗体，C区包被羊抗鼠IgG抗体，两种抗体浓度为0.8毫克/毫升。点样后迅速风干，裁剪备用。
3、试剂条的组装
如图1所示，所述试剂条包括胶体金抗体垫、硝酸纤维膜、PVC垫板、加样垫以及吸水纸；
其中胶体金抗体垫内置胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体；
硝酸纤维膜的检测区(T区)，包被有兔抗人IgE多克隆抗体；质控区(C区)预包被有羊抗鼠IgG抗体；
所述PVC垫板上依次组装有加样垫、胶体金抗体垫、硝酸纤维膜以及吸水纸；所述硝酸纤维膜的检测区靠近胶体金抗体垫，质控区靠近吸水纸。
组装时，胶体金抗体垫进行胶体金标记抗体点样后需要在湿度≤30％RH的环境下进行干燥，干燥后的胶体金抗体垫内置干燥剂后密封包装，4～30℃保存备用。
4、试剂条的使用方法
1)、样本要求
血清(血浆)样本按常规方法由静脉采集，采血后立刻分离出血清或血浆用于分析，可使用EDTA(1.5g/L全血)或肝素(20～30U/mL全血)作抗凝剂，2天内测定的样本可放置4℃保存。样本放置在-20℃至少可保存3个月。样本尽可能避免溶血或反复冻溶。混浊或有沉淀的样本应离心或过滤澄清后再进行检测。
2)检测方法
如图2、图3所示，包括以下步骤：
a)打开包装盒，将检测试剂从密封铝箔袋中取出，水平放置于实验台上(如从冰箱中取出的检测试剂，需在铝箔包装密封完好情况下平衡至室温，再撕开铝箔袋取出检测试剂，否则将影响实验结果)。
b)新鲜血清、血浆或全血样本无需预处理，冰冻或2～8℃存储样本，应先平衡至室温再进行检测。
c)取出0.01M PH7.4PBS缓冲溶液，混匀备用。
d)加样及判读：用移液枪吸取10μL血清/血浆样本，或15μL全血样本，慢慢加入S孔(对应胶体金抗体垫)中，立即在B孔(对应加样垫)中加入100μL样本稀释液，开始计时，10～20分钟内用免疫层析结果判读记录仪(具体操作详见免疫层析结果判读记录仪说明书)定量判定结果。超过20分钟判定，结果无效。
e)校准程序：读取试剂前确认所用免疫层析结果判读记录仪处于正常运行状态，并经过日常光度校准，仪器使用前按照标准曲线下载方式下载该批号试剂所使用标准曲线，并导入IC卡中作为试剂判读依据，不同批号试剂不可混用标准曲线。
3)参考值(参考范围)
本试剂盒参考区间引用自：中华人民共和国卫生部医政司：全国临床检验操作规程(第3版)，及对本产品的验证结果，本产品检测正常成人血清、血浆和全血时，范围如下：
参考值：≤100ng/mL。
5、产品性能指标
1)分析灵敏度：测定浓度为10ng/mL灵敏度企业内控品，测定值与标定值偏差应不高于±20％。
2)特异性：分别测定浓度为50g/L的白蛋白(Alb)、16g/L免疫球蛋白G(IgG)、200g/L血红蛋白(Hb)，检测结果小于10ng/mL。
3)准确度：测定浓度为200ng/mL和1000ng/mL准确度企业内控品，各质控点测定值与标定值偏差不高于±15％。
4)剂量-反应曲线的线性：在10-2000ng/mL检测范围内，相关系数r应不低于0.975，10ng/mL和50ng/mL两个低值质控点绝对偏差不大于±0.5，100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL和2000ng/mL五个质控点相对偏差不大于±15％。
5)批内不精密度：平行测定企业精密度内控品，重复10次，变异系数(CV)应不高于15％。
6)批间不精密度：用3个批号的产品平行测定企业精密度内控品，每个批号各重复10次，3个批号间的变异系数(CV)应不高于20％。
对比试剂：苏州浩欧博生物医药有限公司的总IgE抗体检测试剂盒(酶联免疫法)
对比试剂操作步骤：
1.将所有试剂平衡至室温(20-25℃)
2.在酶标板中分别加入100μL标准品系列、质控品系列、校准品系列、待测血清样本，混匀10秒，37℃温育45分钟
3.洗板：倒尽板内液体，每空加入250μL清洗液洗涤酶标板，然后倒尽液体，反复洗涤5次，最后将酶标板翻扣在厚叠吸水纸上拍干
4.在所有反应孔中加入100μL HRP酶联二抗，37℃温育45分钟。
5.洗板：重复步骤3操作。
6.在所有反应孔中加入100μL TMB底物显色液，置室温避光反应25-30分钟。
7.在所有反应孔中加入100μL终止液。
8.使用酶标仪在450nm波长下，测每空的OD值，根据公式计算相应浓度值。
对比实验：分别用对比试剂与本发明试剂检测IgE企业内控品系列，计算本发明试剂的灵敏度、特异性、准确度、剂量-反应曲线的线性及批内不精密度的检测结果，并以对比试剂的检测结果为标准，计算本试剂检测结果与对比试剂的相对偏差。
结果：
1.灵敏度：检测结果显示测定值与标定值偏差为8.4％，小于±20％，符合要求。
表1灵敏度检测结果
2.特异性：检测结果显示分别检测50g/L的白蛋白(Alb)、16g/L免疫球蛋白G(IgG)、200g/L血红蛋白(Hb)，检测结果均小于10ng/mL，符合要求。
表2特异性检测结果
3.准确度：测定浓度为200ng/mL和1000ng/mL准确度企业内控品，各质控点测定值与标定值偏差分别为9.74％和7.37％，小于±15％，符合要求。
表3准确度检测结果
4.剂量-反应曲线的线性：分别检测10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL和2000ng/mL7个质控点，每个浓度测3次取平均值，记录各质控点检测数值并取平均值记为Mi。以检测浓度为横坐标，检测结果为纵坐标，进行线性回归，求得线性回归方程，相关系数r值为0.994，将各质控点代入回归方程求得各质控点的回归值记为Ni，按以下公式计算前两个质控点的绝对偏差为-0.39、-0.40，后五个质控点的相对偏差为-4.19％～11.28％，(公式：绝对偏差＝Mi-Ni；相对偏差＝(Mi—Ni)/Mi)符合绝对偏差≤0.5，相对偏差不大于±15％的要求。
表4剂量-反应曲线的线性检测结果
5.批内不精密度：测定浓度为200ng/mL不精密度企业内控品，检测结果的CV值为9.74％，小于±15％，符合要求。
6.对比实验：以对比试剂的检测结果为标准，计算本试剂检测结果与对比试剂的相对偏差在-5.85～5.64％，检测结果基本一致。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (10)

1.血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试剂盒，其特征在于，包括：胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体、兔抗人IgE多克隆抗体、羊抗鼠IgG抗体。
2.根据权利要求1所述的血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试剂盒，其特征在于，所述胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体的浓度为2～20微克/毫升，优选的，5微克/毫升；所述兔抗人IgE多克隆抗体、羊抗鼠IgG抗体均为0.5-1.0毫克/毫升，优选0.8毫克/毫升。
3.根据权利要求1所述的血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试剂盒，其特征在于：所述胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体通过如下方法制备而成，调节胶体金溶液pH至8.0-8.4；于胶体金溶液中加入抗体，搅拌5-10分钟；再加入牛血清白蛋白，至牛血清白蛋白的终浓度为2.5-25mg/mL，优选5mg/mL，搅拌混匀；再加入PEG 20000，至PEG 20000终浓度为1-10mg/mL，优选2mg/mL，再持续搅拌混匀；2～8℃静置过夜；离心10000～13000rpm 15～45分钟，小心弃上清；得到的沉淀即为胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试剂盒，其特征在于：所述胶体金溶液中胶体金颗粒粒径为16-71.5nm，优选41nm的胶体金颗粒；所述抗体的加入量为0.4-0.8mg，优选0.6mg；用0.1M K2CO3或0.1M HCl调节胶体金溶液的pH。
5.根据权利要求3所述的血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试剂盒，其特征在于：将最后制备的沉淀用含有0.5毫克/毫升PEG 20000缓冲液悬浮，测定吸光度值A，调整浓度至A＝1.5(1cm/525nm)，加0.5毫克/毫升叠氮钠防腐；4℃保存，应用时将胶体金标记的鼠抗人IgE单克隆抗体稀释至5微克/毫升。
6.一种血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试纸条，其特征在于：组装试剂包括如权利要求1～5任一项所述的试剂盒中的试剂；所述试剂条包括胶体金抗体垫、硝酸纤维膜、PVC垫板、加样垫以及吸水纸；
其中胶体金抗体垫内置胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体；
硝酸纤维膜的检测区，包被有兔抗人IgE多克隆抗体；质控区，预包被有羊抗鼠IgG抗体；
所述PVC垫板上依次组装有加样垫、胶体金抗体垫、硝酸纤维膜以及吸水纸；所述硝酸纤维膜的检测区靠近胶体金抗体垫，质控区靠近吸水纸。
7.一种利用如权利要求6所述的血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试纸条进行检测的方法，其特征在于：包括以下步骤，
1)将试纸条水平放置与实验台上；待试纸条平衡至室温后，再撕开试纸条外侧的铝板袋将试纸条取出；
2)新鲜血清、血浆或全血样本无需预处理，冰冻或2～8℃存储样本，应先平衡至室温再进行检测；
3)取出样本稀释液，混匀备用；优选的，样本稀释液为0.01M PH7.4PBS缓冲溶液
4)加样及判读：用移液枪吸取10μL血清/血浆样本，或15μL全血样本，慢慢加到胶体金抗体垫上，立即在加样垫上加100μL样本稀释液，开始计时，10～20分钟内用免疫层析结果判读定量判定结果；超过20分钟判定，结果无效。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：还包括校准步骤：读取试剂前确认所用免疫层析结果判读记录仪处于正常运行状态，并经过日常光度校准，仪器使用前按照标准曲线下载方式下载该批号试剂所使用标准曲线，并导入IC卡中作为试剂判读依据，不同批号试剂不可混用标准曲线。
9.根据权利要求1～5任一项所述的血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试剂盒在分析血清IgE水平中的应用。
10.根据权利要求6所述的试纸条在分析血清IgE水平中的应用。
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