CN114200132A - 一种检测甲状腺球蛋白抗体及其亚型的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测甲状腺球蛋白抗体及其亚型的试剂盒,属于生物医药技术领域。所述试剂盒包括:125I标记的人甲状腺球蛋白示踪剂,链霉亲和素琼脂糖凝胶试剂,生物素化抗人IgG亚型单克隆抗体,蛋白A琼脂糖和蛋白G琼脂糖。本发明在现有的放射配体检测法基础上,结合上下游的原理将核心步骤进行替换,首次引入链霉亲和素琼脂糖凝胶试剂和生物素化抗人IgG亚型单克隆抗体,为抗体亚型的分型重新打造了核心的技术平台,随后利用生物素化抗人IgG亚型单克隆抗体与TGAb IgG亚型结合,从而实现对TGAb IgG亚型的检测,成功实现技术平台的升级以及TGAb IgG亚型检测技术的突破。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种检测甲状腺球蛋白抗体及其亚型的试剂盒。
背景技术
桥本甲状腺炎(hashimoto thyroiditis,HT)是一种十分常见的自身免疫性疾病,起病隐匿,进展快慢不一,症状多不典型,临床表现复杂多样,且初诊时约20%表现为甲状腺功能减低,5%为轻度甲状腺功能亢进,大多数为甲状腺功能正常,但由于腺体萎缩、破坏,最终也将发展为甲状腺功能减退。HT发生甲状腺功能减退的概率随病程延长而逐渐增加,现有研究表明甲状腺功能减退发生率每年增加5%-7%。
甲状腺球蛋白(TG)是甲状腺滤泡上皮细胞分泌的由5496个氨基酸构成,分子量为660KD的同二聚体糖蛋白。TG在滤泡细胞内合成并被包装储存于囊泡中,以出胞的方式转运到滤泡腔成为胶状质的基本成分,其主要作用是储存和合成甲状腺激素。TG是一种潜在的自身抗原,当进入血液后可刺激机体产生甲状腺球蛋白抗体(TGAb),TGAb是甲状腺疾病中首先发现的自身抗体,具有高度种属特异性,可用于HT等甲状腺疾病的鉴别诊断。但大量研究发现血清TGAb浓度相同的不同患者甲状腺损伤程度及进展不同,仅检测TGAb水平很难评估病情严重程度。Li等学者发现TGAb IgG亚型在不同甲状腺功能状态的HT患者中分布不同,且高滴度IgG1亚型预示进展为甲减可能。然而,不同桥本甲状腺炎患者TGAb IgG亚型具体分布如何及这种亚型分布与桥本甲状腺炎的病理生理过程及甲状腺功能损伤的进展具有怎样的联系,目前国内外相关报道较少,因此其相关检测尚未纳入临床常规检测,相关的检测试剂盒也未上市。
目前对于TGAb IgG亚型的研究仍较少,检测方法主要为酶联免疫分析(ELISA),但ELISA法操作使用的介质有毒或会致癌,灵敏度、重复性和特异性较差,线性范围窄,且常常导致一些相互矛盾的结果。放射配体检测法是放射性核素标记的配体与相应的受体进行特异结合反应,从而对受体进行定性和定量检测的分析法。该方法具有灵敏度高、特异性强、精密度和准确度高以及应用广泛等特点,是疾病诊断和医学研究的重要方法,迄今已可用本技术测定体内各种微量生物活性物质,如激素、蛋白质、抗体、免疫球蛋白、微生素和药物。因此,有必要开发高性能的放射配体检测试剂盒或其它方法取代ELISA法检测TGAb IgG及各亚型。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测甲状腺球蛋白抗体及其亚型的试剂盒,可以实现快速检测血清TGAb及其亚型。
为了实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
一种检测甲状腺球蛋白抗体及其亚型的试剂盒,包括:125I标记的人甲状腺球蛋白示踪剂,链霉亲和素琼脂糖凝胶试剂,生物素化抗人IgG亚型单克隆抗体,蛋白A琼脂糖和蛋白G琼脂糖;
所述生物素化抗人IgG亚型单克隆抗体包括鼠抗人IgG1、鼠抗人IgG2、兔抗人IgG3和鼠抗人IgG4。
进一步地,上述试剂盒还包括:TBST缓冲液和牛血清白蛋白。
上述试剂盒在检测甲状腺球蛋白抗体和/或其亚型中的应用,所述应用为非疾病诊断目的。
采用上述试剂盒检测甲状腺球蛋白抗体及其亚型的方法,包括以下步骤:
步骤一,甲状腺球蛋白抗体的检测:
先将125I标记的人甲状腺球蛋白示踪剂与待测血清置于加样平板中孵育,再取抗原缓冲液加至PVDF微孔板中进行孵育,弃去PVDF微孔板的孵育液,向PVDF微孔板中加入蛋白A琼脂糖和蛋白G琼脂糖,然后加入加样平板中的混合液,形成抗原-抗体复合物的沉淀,去除PVDF微孔板的上清液,用TBST缓冲液洗涤沉淀,之后加入闪烁液置Counter计数仪上计数,得到TGAb总IgG指数;
步骤二,甲状腺球蛋白抗体亚型的检测:
先将125I标记的人甲状腺球蛋白示踪剂与待测血清置于加样平板中孵育,再取生物素化抗人IgG亚型单克隆抗体与链霉亲和素琼脂糖凝胶试剂进行孵育形成抗体-琼脂糖复合物;之后取抗原缓冲液加至PVDF微孔板中进行孵育,弃去PVDF微孔板的孵育液,向其中加入抗体-琼脂糖复合物,然后加入加样平板中的混合液,形成抗原-抗体复合物的沉淀,去除PVDF微孔板的上清液,用TBST缓冲液洗涤沉淀,之后加入闪烁液置Counter计数仪上计数。
上述过程中,抗原缓冲液是TBST缓冲液加牛血清白蛋白制成。
本发明在现有的放射配体检测法基础上,结合上下游的原理将核心步骤进行替换,首次引入链霉亲和素琼脂糖凝胶试剂和生物素化抗人IgG亚型单克隆抗体,为抗体亚型的分型重新打造了核心的技术平台,随后利用生物素化抗人IgG亚型单克隆抗体与TGAbIgG亚型结合,从而实现对TGAb IgG亚型的检测,成功实现技术平台的升级以及TGAb IgG亚型检测技术的突破。
附图说明
图1为放射配体检测法检测TGAb的线性范围。
图2为TGAb IgG亚型在桥本甲状腺炎患者中的分布结果。
具体实施方式
目前对于TGAb IgG亚型的研究仍较少,检测方法主要为酶联免疫分析(ELISA);放射配体检测法是放射性核素标记的配体与相应的受体进行特异结合反应,从而对受体进行定性和定量检测的分析法。发明人实验室现有的放射配体法检测糖尿病自身抗体技术处于国际先进水平,该专利在本实验室现有的放射配体检测法基础上,结合上下游的原理将核心步骤进行替换,首次引入链霉亲和素琼脂糖凝胶试剂和生物素化抗人IgG亚型单克隆抗体,为抗体亚型的分型重新打造了核心的技术平台,随后利用生物素化抗人IgG亚型单克隆抗体与TGAb IgG亚型结合,从而实现对TGAb IgG亚型的检测,成功实现技术平台的升级以及TGAb IgG亚型检测技术的突破。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
在本发明中,所采用的样本、试剂及仪器如下:
1、样本:收集2019年11月至2021年3月在南京医科大学附属第一医院确诊的84例桥本甲状腺炎患者血清。分析前标本均储存于-80℃。
2、质控血清标本:阳性质控为含高滴度TGAb(>4000IU/mL)的临床血清;阴性质控为来自于无自身免疫甲状腺炎家族史的健康志愿者,且电化学发光法所测TGAb阴性的血清。
3、试剂:125I标记的人甲状腺球蛋白示踪剂(125I-TG,北京北方生物技术研究所),链霉亲和素琼脂糖凝胶试剂(StSa 17-5113-01,GE Healthcare),生物素化抗人IgG亚型单克隆抗体(MoAb:鼠抗人IgG1,ab99775,Abcam;鼠抗人IgG2,05-3540,Invitrogen;兔抗人IgG3,ab86252,Abcam;鼠抗人IgG4,ab99818,Abcam),蛋白A/G琼脂糖(25%蛋白A-琼脂糖4mL和62.5%蛋白G-琼脂糖1mL振荡混匀,蛋白A和蛋白G琼脂糖均为GE Healthcare),96孔加样平板,96孔PVDF微孔过滤板(3504,Corning),闪烁液(Microscint-20,Perkin-Elmer),TBST缓冲液(Tris-Base 2.424g,NaCl 8.70g,Tween-20 1.5mL,加蒸馏水定容至1000mL,调pH至7.4),抗原缓冲液(TBST缓冲液加牛血清白蛋白0.25mg/250mL)。
4、主要仪器:βCounter液体闪烁计数仪(2450Microplate Counter,Perkin-Elmer)。
实施例1
一、甲状腺球蛋白抗体及其亚型的检测
1、血清TGAb总IgG测定:
(1)抗原稀释:取1个15mL离心管,用6mL pH 7.4的抗原缓冲液稀释125I-TG至20000CPM/60μL;
(2)标记抗原与血清孵育过夜:取一个96孔平板,每孔各加5μL待测血清,再向其中每孔加60μL稀释后的标记抗原,每孔CPM值要求≥20000,每个标本和质控血清均为双复孔,标记抗原与血清室温震荡混匀1小时,后4℃过夜;
(3)孵育96孔PVDF板:取一个96孔PVDF微孔过滤板,每孔加入150μL抗原缓冲液,4℃过夜;
(4)沉淀抗原-抗体复合物:弃去96孔PVDF板的孵育液,每孔中加25μL的蛋白A/G-琼脂糖,依次从96孔平板各孔中取出50μL混合液转移至96孔PVDF过滤板上沉淀抗原-抗体复合物,4℃冰箱中混匀1h;
(5)放射结合测定:真空泵抽吸去PVDF过滤板各孔中液体,留取沉淀物,每孔中加200μL TBST缓冲液洗涤沉淀物1次,再加150μL缓冲液重复洗涤6次,置于烘箱烘干后每孔加入60μL闪烁液,置96孔βCounter计数仪上计数,每孔计数1min。
TGAb总IgG的检测结果以TGAb总IgG指数表示,即TGAb总IgG指数=(待测血清CPM-阴性质控CPM)/(阳性质控CPM-阴性质控CPM),其阳性判定标准:采用134名正常人TGAb总IgG指数的99%百分位点作为阳性阈值。
2、血清TGAb各IgG亚型测定:
(1)抗原稀释:同上述血清TGAb总IgG测定;
(2)标记抗原与血清孵育过夜:同上述血清TGAb总IgG测定;
(3)每种MoAb分别与StSa孵育:配置StSa至20%(v/v),用量为50μL/孔,根据检测量配置成需要的体积;MoAb需要量为5μL/孔,根据检测量配置成需要的体积;将配好的StSa静置,吸取MoAb需要量的体积后,将MoAb加入;再在4℃冰箱,避光、旋转混匀过夜,得到MoAb-琼脂糖;
(4)孵育96孔PVDF板:同上述血清TGAb总IgG测定;
(5)沉淀抗原-抗体各IgG亚型复合物:洗涤MoAb-琼脂糖3次以去除未结合的MoAb,定容至20%(v/v);弃去96孔PVDF板孵育液,每孔中加50μL的各亚型MoAb-琼脂糖,依次从96孔平板各孔中取出50μL样本混合液转移至96孔PVDF过滤板上,4℃冰箱中混匀1h;
(5)放射结合测定:同上述血清TGAb总IgG测定。
TGAb各IgG亚型的结果均以总IgG的百分比表示,即TPOAb各IgG亚型百分比=每个TPOAb IgG亚型指数/TPOAb总IgG指数。
二、检测结果
1、精密度评价
(1)分析内精密度
在正常人和HT患者中选择TGAb浓度低、中、高(即分别为15IU/mL、500IU/mL、800IU/mL)3份血清,同一批次10孔平行测定,结果参见表1,得出批内变异系数5.72%-9.19%。
表1.TGAb检测结果的批内变异情况
(2)分析间精密度
在正常人和HT患者中选择TGAb浓度低、中、高(即分别为10IU/mL、400IU/mL、1100IU/mL)3份不同浓度的血清,每天1次,连续测定7天,结果参见表2,得出批间变异系数8.34%-11.15%。
表2.TGAb检测结果的批间变异情况
2、重复性评价
对40例TGAb阴性和15例TGAb阳性标本重复测量3次,间隔1个月。结果显示,3次检测的阴、阳性血清TPOAb指数呈显著正相关(r=0.876~0.912),且差异无显著性意义(P>0.05),所测标本的阴性和阳性结果判断完全一致。
3、线性范围评价
用抗原缓冲液将含高滴度TGAb(>4000IU/mL)的临床血清,按比例稀释至少5个浓度点,重复测定3次,计算TGAb指数平均值,将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合,并计算线性相关系数r应不低于0.9900。
表3.放射配体检测法检测TGAb的线性范围测试
由以上结果可知,本发明的方法在上述浓度范围内满足相关要求。
实施例2
与电化学发光法试剂盒比较一致性和相关性
与MODΜLAR ANALYTICS E170全自动电化学发光免疫检测系统及配套试剂盒(罗氏诊断,德国)对99份人血清样品同时进行检测。对99名门诊病人TGAb检测结果进行阴性、阳性结果分类,如表4所示。
表4两种方法测量TGAb的结果
本发明的试剂盒检测阳性符合率100%,阴性符合率79.2%,总符合率94.9%,Kappa值为0.852,提示本发明的试剂盒检测结果和ECLIA法具有高度的一致性,且差异无显著意义(配对卡方检验,P>0.05)。对80份检测极限范围内(10-4000IU/mL)的TGAb测量值进行Spearman相关性分析,提示本发明的试剂盒测定的TGAb和ECLIA法之间存在显著正相关,且相关性很强(r=0.814,P<0.01)。
实施例3
TGAb各IgG亚型测定
检测桥本甲状腺炎患者血清中TGAb各IgG亚型。根据初诊时甲状腺功能状态分为3组:甲减组、亚临床甲减组(亚甲减组)、甲状腺功能正常组(甲功正常组)。
图2为TGAb IgG亚型在桥本甲状腺炎(84例)患者血清中的分布图。图2结果显示,在桥本甲状腺炎患者中,TGAb各IgG亚型分布存在统计学差异,且以IgG1为主(IgG1%:IgG2%:IgG3%:IgG4%=42.42:17.76:18.44:16.92)。
Claims (3)
1.一种检测甲状腺球蛋白抗体及其亚型的试剂盒,其特征在于:包括:125I标记的人甲状腺球蛋白示踪剂,链霉亲和素琼脂糖凝胶试剂,生物素化抗人IgG亚型单克隆抗体,蛋白A琼脂糖和蛋白G琼脂糖;
所述生物素化抗人IgG亚型单克隆抗体包括鼠抗人IgG1、鼠抗人IgG2、兔抗人IgG3和鼠抗人IgG4。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:还包括:TBST缓冲液和牛血清白蛋白。
3.权利要求1或2所述的试剂盒在检测甲状腺球蛋白抗体和/或其亚型中的应用,所述应用为非疾病诊断目的。
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