CN112285360B - I-309在制备原发性干燥综合征诊断试剂或试剂盒中的应用 - Google Patents
I-309在制备原发性干燥综合征诊断试剂或试剂盒中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及医学生物检测领域,具体是I‑309在制备原发性干燥综合征诊断试剂或试剂盒中的应用。本发明还提供I‑309在制备原发性干燥综合征分期诊断试剂或试剂盒中的应用。本发明采用U‑PLEX多因子电化学发光检测技术平台检测I‑309在原发性干燥综合征患者和健康对照血清中的表达量,能够较敏感、特异地诊断原发性干燥综合征,并能对原发性干燥综合征的病情活动情况进行初步评估,同时基于血清I‑309水平与原发性干燥综合征的密切关系,以该分子作为生物标志物对其进行血清电化学发光法检测可用于指导原发性干燥综合征的准确诊断和病情判断,检测方法简便,可靠,周期短,特异性高,易于临床推广。
Description
技术领域
本发明涉及医学生物检测技术领域,具体地说,是I-309作为诊断标志物在制备原发性干燥综合征诊断试剂或试剂盒中的应用。
背景技术
原发性干燥综合征(primary syndrome,简称pSS)是一种常见的系统性自身免疫性疾病,虽然该疾病常以外分泌腺损伤造成眼干、口干为主要特征,但如果诊断和治疗不及时,会引起包括肾脏、肺、神经系统、血液系统等在内的系统性损伤,严重影响患者的生活质量,甚至引起死亡。目前,pSS的诊断和病情判断都缺乏有效的实验室指标,血清SSA抗体虽然对pSS具有辅助诊断价值,但其敏感性只有67%左右,而且特异性更差。pSS的诊断主要依据联合病理、血清SSA抗体、泪液和唾液分泌情况的积分系统,非常复杂,造成大量的误诊和漏诊。pSS的病情判断主要依据欧洲风湿病联盟推荐的pSS活动度积分ESSDAI,该积分系统非常复杂,包括12项指标,在临床实际工作中很难执行。
因此,本领域迫切需要寻找能对pSS进行早期诊断和病情判断的操作简单便捷的无创性指标。这方面研究对于pSS早发现、早治疗,预防系统性损伤的发生,减少患者死亡具有重要意义。
I-309也称为CC趋化因子配体1(CC ligand 1,CCL1)是一种趋化因子,其编码基因位于人类第17号染色体。多种细胞都可以分泌I-309,包括活化的单核/巨噬细胞、Th2细胞、调节性T细胞、2类固有淋巴样细胞、表皮血管细胞等。I-309通过与其受体CCR8作用,能够趋化Th2细胞、调节性T细胞等免疫细胞,主要参与过敏性疾病的发生,如过敏性哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎等,而且在肿瘤的发生和转移中也具有重要作用。
迄今为止,国内外尚无文献报道I-309与pSS的关系,更缺乏应用相关检测技术检测血清I-309水平对pSS的诊断和病情判断价值,该指标也尚未在临床上得到应用。
发明内容
本发明的目的在于提供I-309的新用途,即作为原发性干燥综合征的新的诊断标志物在制备原发性干燥综合征诊断试剂或试剂盒中的应用。
发明人经过广泛而深入的研究,首次发现,检测患者血清中的提供I-309表达量,能够比较准确地对原发性干燥综合征进行诊断和病情评估。基于提供I-309在血清中的表达量与原发性干燥综合征的这种相关性,以该分子作为生物标志物对其表达量进行检测可用于指导原发性干燥综合征的早期诊断和病情判断。
本发明的第一方面,提供I-309在制备原发性干燥综合征(pSS)诊断标志物中的应用。所述的原发性干燥综合征是指一种以外分泌腺损伤为主要特征的系统性自身免疫性结缔组织病。
本发明的第二方面,提供I-309在制备原发性干燥综合征诊断试剂或试剂盒中的应用。
本发明的第三方面,提供检测I-309表达量的试剂在制备原发性干燥综合征诊断试剂盒中的应用。
本发明的第四方面,提供I-309在制备原发性干燥综合征分期诊断试剂或试剂盒中的应用。
进一步的,所述的试剂为定量检测生物样品中I-309表达量的试剂。
进一步的,所述的试剂盒包含了定量检测生物样品中I-309表达量的试剂。
进一步的,所述的定量检测生物样品中I-309表达量的试剂,选自:对I-309具有检测特异性的抗体,该抗体可以是单克隆抗体,也可以是多克隆抗体。
进一步的,所述的生物样品为取自检测对象的血清。
进一步的,所述的试剂为采用如下检测方法对生物样品中的I-309表达量进行定量检测的试剂:U-PLEX电化学发光检测法,酶联免疫吸附试验(ELISA)(见文献Ai etal.Neuropsychiatr Dis Treat.2019;15:303-310.)和以免疫印迹为基础的ProteomeProfiler人类细胞因子检测试剂(见文献Kim et al.Ann Dermatol.2014;26(3):308-313.)。
进一步的,所述试剂或试剂盒为利用特异性I-309的抗体,制备的U-PLEX电化学发光检测试剂或试剂盒。
更进一步的,当采用U-PLEX电化学发光法检测I-309浓度高于10.5pg/mL时,提示患者可能发生了原发性干燥综合征。
进一步的,当采用U-PLEX电化学发光法检测I-309浓度高于16.3pg/mL时,其水平越高,提示患者越可能处于原发性干燥综合征活动期,随着病程的进展,I-309水平逐渐升高,与pSS进程呈正相关。
本发明的第五方面,提供了一种原发性干燥综合征的诊断试剂盒,其包含了定量检测生物样品中I-309表达量的试剂,对原发性干燥综合征进行诊断或病情活动情况确定。
进一步的,所述的诊断试剂盒为U-PLEX试剂盒,包括U-PLEX微孔板、含生物素结合域及微孔板结合域的连接体,生物素标记的I-309捕获抗体、SULFO-TAGTM标记I-309的检测抗体、I-309标准品、样本稀释液、抗体稀释液、终止液、读板液和清洗缓冲液。
此外,本发明还可以利用市售的I-309电化学发光检测试剂盒(如美国Meso scalediscovery公司),体外检测I-309在原发性干燥综合征患者血清中的表达量。
本发明的第六方面,提供了一种利用如上所述的诊断试剂盒进行原发性干燥综合征检测或分期诊断的方法,包括以下步骤:
(1)通过静脉穿刺采血,按照采血管制造商的程序文件分离血清。标本在检测之前可置于2℃~8℃贮存3天,若长期保存标本可将其置于-80℃超低温冰箱。测试前,将冷冻标本置于室温后,在分析前应轻轻翻转试管多次,使其充分混匀。
(2)使用前将所有试剂平衡至室温(20℃-25℃)。
(3)采用连接体和生物素标记的I-309捕获抗体复合物包被U-PLEX微孔板,准备校准品、检测抗体和读板液。
(4)每孔先加入25μL样本稀释液,然后每孔对应加入25μL的样本、标准品,并用封膜封上板,放置于摇床上,室温孵育1小时。为了避免携带污染,不要使精密移液器的吸头触及液体的表面。
(5)温育后将孔内液体吸干,每孔加入150μL清洗缓冲液,清洗微孔板3次。
(6)每孔加入50μL的检测抗体,并用封膜封上板,放置于摇床上,室温孵育1小时。
(7)温育后将孔内液体吸干,每孔加入150μL清洗缓冲液,清洗微孔板3次。
(8)每孔加入2×读板液,放入MSD SQ120检测仪读板。
(9)采用拟合曲线法绘制标准曲线。每个患者标本未知的I-309浓度可根据其信号值从标准曲线上读出。
采用上述方法,分别对pSS患者和健康对照组的血清标本中I-309的表达水平进行检测,结果显示,PSS患者血清I-309的水平明显高于健康对照,差异具有显著的统计学意义(p<0.001)。
同时,应用ROC曲线分析血清水平对pSS的诊断价值时,曲线下面积达到0.883,说明具有非常好的诊断价值。利用约登指数最大的原则,判断出I-309的最佳临界值为10.5pg/mL,对应的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为77.6%、90.0%、93.8%、54.0%和81.8%。
综上,提示I-309在原发性干燥综合征细胞中的特异性和灵敏性高,可应用于原发性干燥综合征诊断。
此外,利用SPSS软件通过Spearman相关性分析的方法对pSS患者不同活动度血清I-309的水平进行分析,显示血清I-309水平与pSS疾病活动度呈明显正相关,(r=0.378,P=0.003);而且,应用ROC曲线分析血清I-309水平对活动期pSS(ESSDAI>5)的诊断价值时,曲线下面积达到0.800±0.052(P<0.001),说明具有较好的诊断价值。利用约登指数最大的原则,判断出I-309的最佳临界值为16.3pg/mL,对应的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为57.6%、90.9%、79.2%、78.1%和78.4%,提示I-309可用于pSS的分期诊断。
本发明有益效果在于:
1、申请人从上海长征医院取得了大量的原发性干燥综合征病人的血清标本,为本发明的研究提供了有力的保障。本发明利用U-PLEX电化学发光检测技术测定患者血清中I-309分子的表达水平,具有操作简便、检测灵敏、特异性好、重复性高等特点,现今已越来越多地被应用于临床检验技术中。
2、本发明结合大量临床信息,确定I-309的血清水平对于pSS具有明显的诊断意义,I-309分子能用于制备判断pSS的蛋白质分子标记,能够较特异地诊断pSS,并能对pSS的病情活动情况进行初步评估。基于血清I-309水平与pSS的密切关系,以该分子作为生物标志物对其进行血清电化学发光法检测可用于指导pSS的准确诊断和病情判断,对于pSS患者病情判断和序贯治疗具有重要的指导意义。
3本发明的I-309分子与pSS相关性的发现为早期诊断pSS提供一条全新的途径,对于早期诊断和治疗pSS,评估pSS病情具有重要作用。当U-PLEX电化学发光法检测I-309浓度高于10.5pg/ml时,提示患者可能发生了pSS,而且随着pSS的病情发展逐渐升高。
4、本发明采用U-PLEX多因子电化学发光检测技术平台检测I-309在原发性干燥综合征患者和健康对照血清中的表达量,能够较敏感、特异地诊断原发性干燥综合征,并能对原发性干燥综合征的病情活动情况进行初步评估,同时基于血清I-309水平与原发性干燥综合征的密切关系,以该分子作为生物标志物对其进行血清电化学发光法检测可用于指导原发性干燥综合征的准确诊断和病情判断,检测方法简便,可靠,周期短,特异性高,易于临床推广。
附图说明
图1为pSS组和健康对照组血清I-309的水平对比结果;
图2是本发明中pSS患者不同活动度血清的水平结果;
图3是本发明中血清I-309水平对pSS的诊断价值的ROC曲线图;
图4是本发明中血清I-309水平对活动期pSS(ESSDAI>5)的诊断价值的ROC曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
在以下实施例中,研究对象的血清标本均来自上海长征医院。
实施例1:原发性干燥综合征与健康对照中I-309的表达水平检测
随机选取58例pSS患者和30例健康对照的血清(标本的获取均来自上海长征医院,并通过该单位伦理审批),采用U-PLEX电化学发光法检测I-309分子在各组血清中的表达水平。所用的I-309测定试剂盒(购自美国Meso Scale Discovery公司),具体步骤为:
(1)通过静脉穿刺采血,按照采血管制造商的程序文件分离血清。标本在检测之前可置于2℃~8℃贮存3天,若长期保存标本可将其置于-80℃超低温冰箱。测试前将冷冻标本置于室温后,在分析前应轻轻翻转试管多次,使其充分混匀。
(2)使用前将所有试剂平衡至室温(20℃-25℃)。
(3)按照说明书要求,采用连接体和生物素标记的I-309捕获抗体复合物包被U-PLEX微孔板,准备校准品、检测抗体和读板液。
(4)每孔先加入25μL样本稀释液,然后每孔对应加入25μL的样本、标准品,并用封膜封上板,放置于摇床上,室温孵育1小时。为了避免携带污染,不要使精密移液器的吸头触及液体的表面。
(5)温育后将孔内液体吸干,每孔加入150μL清洗缓冲液,清洗微孔板3次。
(6)每孔加入50μL的检测抗体,并用封膜封上板,放置于摇床上,室温孵育1小时。
(7)温育后将孔内液体吸干,每孔加入150μL清洗缓冲液,清洗微孔板3次。
(8)每孔加入2X读板液,放入MSD SQ120检测仪读板。
(9)采用拟合曲线法绘制标准曲线。每个患者标本未知的I-309浓度可根据其信号值从标准曲线上读出。
(10)如图1和表1所示,pSS患者血清I-309的水平明显高于健康对照,差异具有显著的统计学意义(p<0.001)。
表1 pSS组和健康对照组血清I-309水平
实施例2:血清I-309水平与pSS患者活动度分期的相关性
应用Spearman相关性分析血清I-309水平与pSS患者肝组织学分期的相关性。在58例pSS患者中,利用SPSS软件通过Spearman相关性分析的方法显示。如图2所示的pSS患者不同活动度血清I-309的水平,可见血清I-309水平与pSS活动度呈明显正相关,随着pSS病情活动进展,血清水平逐渐升高(r=0.378,P=0.003)。
实施例3:应用ROC曲线分析血清I-309水平对pSS的诊断价值
在88例检测对象中,以pSS患者为靶对象,利用SPSS软件做出ROC曲线,并分析相关的各种参数。
如图3所示,曲线下面积达到0.883±0.036(P<0.001),说明具有非常好的诊断价值。利用约登指数最大的原则,判断出I-309的最佳临界值为10.5pg/mL,对应的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为77.6%、90.0%、93.8%、54.0%和81.8%,见表2所示。
实施例4:应用ROC曲线分析血清I-309水平对活动期pSS(ESSDAI>5)的诊断价值
在88例检测对象中,活动期pSS患者为靶对象,利用SPSS软件做出ROC曲线,并分析相关的各种参数。
如图4所示,曲线下面积达到0.800±0.052(P<0.001),说明具有较好的诊断价值。利用约登指数最大的原则,判断出I-309的最佳临界值为16.3pg/mL,对应的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为57.6%、90.9%、79.2%、78.1%和78.4%,见表2所示。
表2对pSS的诊断价值
实施例5:临床验证(一)
样本:某出现眼干、口干症状的患者血清,采用以上的U-PLEX方法检测I-309分子在该患者血清中的表达水平,经计算,I-309浓度为18.3pg/mL,高于临界值10.5pg/ml,提示该患者患有pSS,采用国际最新诊断标准,患者确为pSS。
实施例6:临床验证(二)
样本:某pSS患者血清,采用以上的U-PLEX方法检测分子在该患者血清中的表达水平,经计算,I-309浓度为40.9pg/mL,属于较高水平,经计算ESSDAI活动度积分为9,证实患者处于活动期。
由以上试验结果可知,通过采用U-PLEX方法检测I-309分子在出现眼干,口干症状的患者血清中的表达量能有效诊断出pSS,并对pSS病情作出判断。显然,I-309分子与pSS有明显相关性,因此,以I-309分子作为生物标志物对其血清表达量进行检测能够较好地对pSS作出诊断和病情评估。相应的,其U-PLEX检测技术能用于制备pSS诊断的试剂或试剂盒,这对于本领域技术人员来说是显而易见的。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明,但本发明创造并不限于所述实施例,熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换,这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (9)
1.血清I-309作为诊断标志物在制备原发性干燥综合征诊断试剂或试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的血清I-309作为诊断标志物在制备原发性干燥综合征诊断试剂或试剂盒中的应用,其特征在于,所述的试剂为定量检测血清中I-309表达量的试剂。
3.根据权利要求1所述的血清I-309作为诊断标志物在制备原发性干燥综合征诊断试剂或试剂盒中的应用,其特征在于,所述的试剂盒包含了定量检测血清中I-309表达量的试剂。
4.根据权利要求2所述的血清I-309作为诊断标志物在制备原发性干燥综合征诊断试剂或试剂盒中的应用,其特征在于,所述的定量检测血清中I-309表达量的试剂,选自:对I-309具有检测特异性的抗体。
5.根据权利要求1所述的血清I-309作为诊断标志物在制备原发性干燥综合征诊断试剂或试剂盒中的应用,其特征在于,所述的试剂为采用如下检测方法对血清中的I-309表达量进行定量检测的试剂:U-PLEX电化学发光检测法,或酶联免疫吸附试验。
6.根据权利要求5所述的血清I-309作为诊断标志物在制备原发性干燥综合征诊断试剂或试剂盒中的应用,其特征在于,当采用U-PLEX电化学发光法检测I-309浓度高于10.5pg/mL时,提示患者可能发生了原发性干燥综合征。
7.检测血清I-309表达量的试剂在制备原发性干燥综合征诊断试剂盒中的应用。
8.血清I-309作为诊断标志物在制备原发性干燥综合征分期诊断试剂或试剂盒中的应用。
9.根据权利要求8所述的血清I-309作为诊断标志物在制备原发性干燥综合征分期诊断试剂或试剂盒中的应用,其特征在于,当采用U-PLEX电化学发光法检测I-309浓度高于16.3pg/mL时,提示患者可能处于原发性干燥综合征活动期。
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