CN107643283A - 干扰素诱导T细胞α趋化因子在制备原发性胆汁性胆管炎诊断试剂或试剂盒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域,具体是干扰素诱导T细胞α趋化因子(I‑TAC)新的用途,特别是I‑TAC在制备原发性胆汁性胆管炎(PBC)诊断试剂或试剂盒中的应用。本发明采用U‑PLEX电化学发光检测技术平台检测I‑TAC在PBC患者、健康对照及疾病对照血清中的表达量,能够较敏感、特异地诊断PBC,并能对PBC的发展阶段进行初步评估。基于血清I‑TAC水平与PBC的密切关系,以该分子作为生物标志物对其进行血清电化学发光法检测可用于指导PBC的准确诊断和病情判断。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种干扰素诱导T细胞α趋化因子的新的用途,具体地说,涉及干扰素诱导T细胞α趋化因子在制备原发性胆汁性胆管炎诊断试剂或试剂盒中的应用。
背景技术
原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis,简称PBC)是一种比较常见的慢性胆汁淤积性自身免疫性肝病,如不及时诊断和治疗会逐渐发展为肝硬化,甚至肝衰竭和肝癌而威胁生命。目前,血清中的抗线粒体抗体及其M2亚型是PBC最重要的辅助诊断指标,但该指标存在一定比例的漏诊和误诊,而且无法判断PBC的病情。特别是对于AMA及其M2亚型阴性的PBC患者,其诊断主要依赖于肝组织学检测,但这种损伤性检查患者不愿接受。
综上所述,本领域迫切需要寻找能对PBC进行早期诊断和病情判断的操作简单快捷的无创性指标。这方面研究对于PBC早发现、早治疗,预防肝硬化、肝衰竭和肝癌的发生,减少患者死亡具有重要意义。
干扰素诱导T细胞α趋化因子(I-TAC),也称趋化因子CXCL11,属于CXC趋化因子家族,是一种主要由干扰素诱导产生的趋化因子,其编码基因位于4号染色体,GENBANK号为NC_000004.12。多种组织细胞,如内皮细胞、上皮细胞、树突状细胞等在干扰素诱导下都可以分泌I-TAC。诱导I-TAC分泌的干扰素主要是γ-干扰素和β-干扰素。I-TAC主要结合T细胞表面表达的趋化因子受体CXCR3,从而趋化并诱导T细胞向Th1细胞分化。
经检索国内外文献发现,仅有一项研究检测了PBC患者血清I-TAC水平,该研究在健康对照和PBC患者的血清中检测CXCL9、CXCL10和CXCL11(I-TAC),研究结果认为虽然PBC患者的血清中I-TAC水平略有升高,但与健康对照比较差异无统计学意义,不能作为PBC的诊断标志物,而CXCL9、CXCL10水平与健康对照比较有显著差异,可以作为PBC的诊断标志物。(参见文献:Manousou P,et al.CXCR3 axis in patients with primary biliarycirrhosis:a possible novel mechanism of the effect of ursodeoxycholicacid.Clin Exp Immunol.2013;172(1):9-15.)
综上所述,迄今为止,国内外尚无文献报道应用U-PLEX电化学发光检测技术检测血清I-TAC水平对PBC的诊断和病情判断价值,该指标亦尚未在临床上得到应用。
发明内容
本发明的目的在于提供干扰素诱导T细胞α趋化因子(I-TAC)的新的用途,特别是干扰素诱导T细胞α趋化因子(I-TAC)在制备原发性胆汁性胆管炎(PBC)诊断试剂或试剂盒中的应用。
本发明人经过广泛而深入的研究,首次发现,采用U-PLEX电化学发光检测技术检测患者血清中的干扰素诱导T细胞α趋化因子(I-TAC)表达量,能够比较准确地对原发性胆汁性胆管炎(PBC)进行诊断和病情评估。基于干扰素诱导T细胞α趋化因子(I-TAC)在血清中的表达量与原发性胆汁性胆管炎(PBC)的这种相关性,以该分子作为生物标志物对其表达量进行检测可用于指导原发性胆汁性胆管炎(PBC)的早期诊断和病情判断。即干扰素诱导T细胞α趋化因子(I-TAC)可用于制备原发性胆汁性胆管炎(PBC)的诊断试剂或试剂盒。
本发明的第一方面,提供干扰素诱导T细胞α趋化因子(I-TAC)在制备原发性胆汁性胆管炎(PBC)诊断标志物中的应用。所述的原发性胆汁性胆管炎(PBC)是指一种以肝内中小胆管炎症损伤为主要特征的慢性胆汁淤积性自身免疫性肝病。
本发明的第二方面,提供干扰素诱导T细胞α趋化因子(I-TAC)在制备原发性胆汁性胆管炎(PBC)诊断试剂或试剂盒中的应用。
优选的,所述的诊断试剂或试剂盒是干扰素诱导T细胞α趋化因子(I-TAC)U-PLEX电化学发光法定量诊断试剂或试剂盒。
优选的,所述的诊断试剂或试剂盒检测血清中干扰素诱导T细胞α趋化因子(I-TAC)的表达量。
优选的,所述的诊断试剂或试剂盒是以干扰素诱导T细胞α趋化因子(I-TAC)作为生物标志物,利用U-PLEX检测试剂盒,检测血清中干扰素诱导T细胞α趋化因子(I-TAC)的表达量的诊断试剂或试剂盒。
更优选的,当U-PLEX电化学发光法检测干扰素诱导T细胞α趋化因子(I-TAC)浓度高于49.0pg/mL时,提示患者可能发生了原发性胆汁性胆管炎(PBC)。
优选的,所述的诊断试剂或试剂盒是利用特异性抗T细胞α趋化因子(I-TAC)的抗体,制备的U-PLEX电化学发光检测试剂或试剂盒。所述的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
优选的,所述的诊断试剂或试剂盒包括U-PLEX微孔板、含生物素结合域及微孔板结合域的连接体,生物素标记的干扰素诱导T细胞α趋化因子(I-TAC)捕获抗体、SULFO-TAGTM标记干扰素诱导T细胞α趋化因子(I-TAC)的检测抗体、干扰素诱导T细胞α趋化因子(I-TAC)标准品、样本稀释液、抗体稀释液、终止液、读板液和清洗缓冲液。
更优选的,本发明还可以利用市售的干扰素诱导T细胞α趋化因子(I-TAC)电化学发光检测试剂盒(如美国Meso scale discovery公司),体外检测干扰素诱导T细胞α趋化因子(I-TAC)在原发性胆汁性胆管炎(PBC)患者血清中的表达量的方法,该方法包括以下步骤(可根据试剂盒说明书):
(1)通过静脉穿刺采血,按照采血管制造商的程序文件分离血清。标本在检测之前可置于2℃~8℃贮存3天。长期保存标本可将其置于-80℃超低温冰箱。将冷冻标本置于室温后,在分析前应轻轻翻转试管多次,使其充分混匀。
(2)使用前将所有试剂平衡至室温(20℃-25℃)。
(3)按照说明书要求,采用连接体和生物素标记的干扰素诱导T细胞α趋化因子捕获抗体复合物包被U-Plex微孔板,准备校准品、检测抗体和读板液。
(4)每孔先加入25μL样本稀释液,然后每孔对应加入25μL的样本、标准品,并用封膜封上板,放置于摇床上,室温孵育1小时。为了避免携带污染,不要使精密移液器的吸头触及液体的表面。
(5)温育后将孔内液体吸干,每孔加入150μL清洗缓冲液,清洗微孔板3次。
(6)每孔加入50μL的检测抗体,并用封膜封上板,放置于摇床上,室温孵育1小时。
(7)温育后将孔内液体吸干,每孔加入150μL清洗缓冲液,清洗微孔板3次。
(8)每孔加入2X读板液,放入MSD SQ120检测仪读板。
(9)采用拟合曲线法绘制标准曲线。每个患者标本未知的I-TAC浓度可根据其信号值从标准曲线上读出。
本发明的第三方面,提供干扰素诱导T细胞α趋化因子(I-TAC)在制备原发性胆汁性胆管炎(PBC)分期试剂或试剂盒中的应用。
优选的,所述的诊断试剂或试剂盒是干扰素诱导T细胞α趋化因子(I-TAC)U-PLEX电化学发光法定量诊断试剂或试剂盒。
优选的,所述的诊断试剂或试剂盒检测血清中干扰素诱导T细胞α趋化因子(I-TAC)的表达量。
更优选的,当U-PLEX电化学发光法检测血清干扰素诱导T细胞α趋化因子(I-TAC)水平高于94.6pg/mL时,提示患者可能处于原发性胆汁性胆管炎(PBC)1-2期;若高于131.9pg/mL时,提示患者可能处于原发性胆汁性胆管炎(PBC)1期。
本发明优点在于:
本发明的I-TAC分子与PBC相关性的发现为早期诊断PBC提供一条全新的途径,对于早期诊断和治疗PBC,评估PBC病情具有重要作用。当U-PLEX电化学发光法检测I-TAC浓度高于49.0pg/mL时,提示患者可能发生了PBC,而且有趣的是,早期PBC患者血清I-TAC水平最高,随着PBC的发展又逐渐降低,若I-TAC水平高于94.6pg/mL时,提示患者可能处于1-2期,若高于131.9pg/mL时,提示患者可能处于1期。
本发明利用U-PLEX电化学发光检测技术测定患者血清中I-TAC分子的表达水平,并结合大量临床信息,确定I-TAC的血清水平对于PBC具有明显的诊断意义,I-TAC分子能用于制备判断PBC的蛋白质分子标记,能够较敏感、特异地诊断PBC,并能对PBC的发展阶段进行初步评估。基于血清I-TAC水平与PBC的密切关系,以该分子作为生物标志物对其进行血清电化学发光法检测可用于指导PBC的准确诊断和病情判断,对于PBC患者病情判断和序贯治疗具有重要的指导意义。
附图说明
图1为PBC组、乙肝肝硬化组和健康对照组血清I-TAC水平。可见PBC患者血清I-TAC水平明显高于乙肝肝硬化组和健康对照组,差异具有显著的统计学意义(p<0.001)。
图2为PBC患者肝组织学不同分期(1-2、3-4期)血清I-TAC水平。可见血清I-TAC水平在PBC早期最高,随着PBC的发展,血清I-TAC水平逐渐降低,1-2期与3-4期比较差异有统计学意义(p<0.001)。
图3为血清I-TAC水平对PBC的诊断价值的ROC曲线图;可见曲线下面积为0.904±0.026(P<0.001),提示具有很高的诊断价值。I-TAC浓度最佳临界值为49.0pg/mL,对应的敏感性、特异性和准确性分别为83.3%、80.6%和82.0%。
图4为血清I-TAC水平对PBC患者肝组织学1-2期的预测价值的ROC曲线图;可见曲线下面积为0.777±0.061(P<0.001),提示诊断价值较高。I-TAC浓度最佳临界值为94.6pg/mL,对应的敏感性、特异性和准确性分别为81.3%、67.9%和75.0%。
图5为血清I-TAC水平对PBC患者肝组织学1期的预测价值的ROC曲线图;可见曲线下面积为0.820±0.055(P=0.002),提示诊断价值较高。I-TAC浓度最佳临界值为131.9pg/mL,对应的敏感性、特异性和准确性分别为90.0%、70.0%和73.3%。
具体实施方式
下面结合本发明的附图和实施例对本发明的实施作详细说明,以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
在以下实施例中,研究对象的血清标本均来自第二军医大学第二附属医院(上海长征医院)。
实施例1:
随机选取60例PBC患者、30例健康对照和32例乙肝肝硬化患者(疾病对照)的血清(标本的获取均通过第二军医大学伦理审批),本发明采用U-PLEX电化学发光法检测I-TAC分子在各组血清中的表达水平,所用的I-TAC测定试剂盒(购自美国Meso Scale Discovery公司),具体步骤为:
(1)通过静脉穿刺采血,按照采血管制造商的程序文件分离血清。标本在检测之前可置于2℃~8℃贮存3天。长期保存标本可将其置于-80℃超低温冰箱。将冷冻标本置于室温后,在分析前应轻轻翻转试管多次,使其充分混匀。
(2)使用前将所有试剂平衡至室温(20℃-25℃)。
(3)按照说明书要求,采用连接体和生物素标记的干扰素诱导T细胞α趋化因子捕获抗体复合物包被U-Plex微孔板,准备校准品、检测抗体和读板液。
(4)每孔先加入25μL样本稀释液,然后每孔对应加入25μL的样本、标准品,并用封膜封上板,放置于摇床上,室温孵育1小时。为了避免携带污染,不要使精密移液器的吸头触及液体的表面。
(5)温育后将孔内液体吸干,每孔加入150μL清洗缓冲液,清洗微孔板3次。
(6)每孔加入50μL的检测抗体,并用封膜封上板,放置于摇床上,室温孵育1小时。
(7)温育后将孔内液体吸干,每孔加入150μL清洗缓冲液,清洗微孔板3次。
(8)每孔加入2X读板液,放入MSD SQ120检测仪读板。
(9)采用拟合曲线法绘制标准曲线。每个患者标本未知的I-TAC浓度可根据其信号值从标准曲线上读出。
(10)如图1和表1所示,PBC患者血清I-TAC的水平明显高于健康对照和乙肝肝硬化患者,差异具有显著的统计学意义(p<0.001)。
表1 不同组别血清I-TAC水平
实施例2:
应用ROC曲线分析血清I-TAC水平对PBC的诊断价值。在122例检测对象中,以PBC患者为靶对象,利用SPSS软件做出ROC曲线,并分析相关的各种参数。如图3所示,曲线下面积达到0.904,说明具有非常好的诊断价值。利用约登指数最大的原则,判断出I-TAC的最佳临界值为49.0pg/mL,对应的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为83.3%、80.6%、80.6%、83.3%和82%,见表2所示。
实施例3:
如图2所示,图2为PBC患者肝组织学不同分期(1-2、3-4期)血清I-TAC水平。可见血清I-TAC水平在PBC早期最高,随着PBC的发展,血清I-TAC水平逐渐降低,1-2期与3-4期比较差异有统计学意义(p<0.001)。因此检测I-TAC水平,可用于原发性胆汁性胆管炎分期。
应用ROC曲线分析血清I-TAC水平对PBC患者肝组织学分期的预测价值。在60例PBC患者中,以1-2期患者为靶对象,利用SPSS软件做出ROC曲线,并分析相关的各种参数。如图4所示,曲线下面积达到0.777,说明具有较好的预测价值。利用约登指数最大的原则,判断出I-TAC的最佳临界值为94.6pg/mL,对应的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为81.3%、67.9%、73.5%、76.9%和75.0%,见表2所示。以1期患者为靶对象,如图5所示,ROC曲线下面积达到0.820,说明对于1期PBC患者具有较好的预测价值。利用约登指数最大的原则,判断出I-TAC的最佳临界值为131.9pg/mL,对应的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为90.0%、70.0%、64.3%、97.2%和73.3%,见表2所示。
表2 I-TAC对PBC的诊断价值及对早期PBC的预测价值
实施例4:
样本:某疑似肝病患者血清,采用以上的U-PLEX电化学发光法检测I-TAC分子在该患者血清中的表达水平,经计算,I-TAC浓度为103pg/mL,高于临界值49.0pg/mL,提示该患者患有PBC,经查患者虽抗线粒体抗体阴性,但碱性磷酸酶368U/L,经肝组织学证实,患者确诊为PBC。
实施例5:
样本:某PBC患者血清,采用以上的U-PLEX电化学发光法检测I-TAC蛋白在该患者血清中的表达水平,经计算,I-TAC浓度为192.0pg/mL,高于临界值131.9pg/mL,提示该患者处于1期,经肝组织学证实患者确处于肝组织学1期。
由以上试验结果可知,通过采用U-PLEX电化学发光法检测I-TAC蛋白在疑似肝病患者血清中的表达量能有效诊断出PBC,并对PBC病情作出判断。显然,I-TAC蛋白与PBC有明显相关性,因此,以I-TAC蛋白作为生物标志物对其血清表达量进行检测能够较好地对PBC作出诊断和病情评估。相应的,其U-PLEX检测技术能用于制备PBC诊断的试剂或试剂盒。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明,但本发明创造并不限于所述实施例,熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换,这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (10)
1.干扰素诱导T细胞α趋化因子在制备原发性胆汁性胆管炎诊断试剂或试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的干扰素诱导T细胞α趋化因子在制备原发性胆汁性胆管炎诊断试剂或试剂盒中的应用,其特征在于,所述的诊断试剂或试剂盒是干扰素诱导T细胞α趋化因子U-PLEX电化学发光法定量诊断试剂或试剂盒。
3.根据权利要求2所述的干扰素诱导T细胞α趋化因子在制备原发性胆汁性胆管炎诊断试剂或试剂盒中的应用,其特征在于,所述的诊断试剂或试剂盒检测血清中干扰素诱导T细胞α趋化因子的表达量。
4.根据权利要求3所述的干扰素诱导T细胞α趋化因子在制备原发性胆汁性胆管炎诊断试剂或试剂盒中的应用,其特征在于,当U-PLEX电化学发光法检测血清干扰素诱导T细胞α趋化因子浓度高于49.0pg/mL时,提示患者可能发生了原发性胆汁性胆管炎。
5.根据权利要求3所述的干扰素诱导T细胞α趋化因子在制备原发性胆汁性胆管炎诊断试剂或试剂盒中的应用,其特征在于,所述的诊断试剂或试剂盒是利用特异性抗T细胞α趋化因子的抗体,制备的U-PLEX电化学发光检测试剂或试剂盒。
6.根据权利要求5所述的干扰素诱导T细胞α趋化因子在制备原发性胆汁性胆管炎诊断试剂或试剂盒中的应用,其特征在于,所述的诊断试剂或试剂盒包括U-PLEX微孔板、含生物素结合域及微孔板结合域的连接体,生物素标记的干扰素诱导T细胞α趋化因子捕获抗体、SULFO-TAGTM标记干扰素诱导T细胞α趋化因子的检测抗体、干扰素诱导T细胞α趋化因子标准品、样本稀释液、抗体稀释液、终止液、读板液和清洗缓冲液。
7.干扰素诱导T细胞α趋化因子在制备原发性胆汁性胆管炎分期试剂或试剂盒中的应用。
8.根据权利要求7所述的干扰素诱导T细胞α趋化因子在制备原发性胆汁性胆管炎分期试剂或试剂盒中的应用,其特征在于,所述的诊断试剂或试剂盒是干扰素诱导T细胞α趋化因子U-PLEX电化学发光法定量诊断试剂或试剂盒。
9.根据权利要求8所述的干扰素诱导T细胞α趋化因子在制备原发性胆汁性胆管炎分期试剂或试剂盒中的应用,其特征在于,所述的诊断试剂或试剂盒检测血清中干扰素诱导T细胞α趋化因子的表达量。
10.根据权利要求9所述的干扰素诱导T细胞α趋化因子在制备原发性胆汁性胆管炎分期试剂或试剂盒中的应用,其特征在于,当U-PLEX电化学发光法检测血清干扰素诱导T细胞α趋化因子水平高于94.6pg/mL时,提示患者可能处于原发性胆汁性胆管炎1-2期;高于131.9pg/mL时,提示患者可能处于原发性胆汁性胆管炎1期。
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