CN114636826A - Cd177+中性粒细胞在制备新生儿坏死性小肠结肠炎检测产品中的应用 - Google Patents

Cd177+中性粒细胞在制备新生儿坏死性小肠结肠炎检测产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了CD177+中性粒细胞在制备新生儿坏死性小肠结肠炎检测产品中的应用，涉及生物医药技术领域。本发明提出CD177+中性粒细胞作为标志物在制备新生儿坏死性小肠结肠炎检测产品中的应用，基于确诊NEC患儿(NEC II期患儿和NEC III期患儿)外周血中的CD177+中性粒细胞降低，且确诊NEC患儿外周血中的CD177+中性粒细胞与Bell分期呈负相关，CD177+中性粒细胞可以作为NEC的标志物，CD177+中性粒细胞作为标志物相关的新生儿坏死性小肠结肠炎检测产品能够用于辅助诊断或辅助区分NEC I期患儿和确诊NEC患儿。

Description

CD177+中性粒细胞在制备新生儿坏死性小肠结肠炎检测产品 中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及CD177+中性粒细胞在制备新生儿坏死性小肠结肠炎检测产品中的应用。
背景技术
坏死性小肠结肠炎(Necritizing Enterocolitis,NEC)是新生儿重症监护室常见的消化道疾病之一。在极低出生体重儿中，该病的发病率约为10％-12％，但根据不同的研究中心数据显示，其发病率在2％至22％之间。目前使用Bell分期修正版对NEC进行诊断，将NEC分为NEC I期(疑似NEC)、NEC II期(确诊NEC)和NEC III期(确诊NEC)，确诊NEC病例相关死亡率在20％-30％。NEC I期和II期一般采取保守治疗，NEC III期患儿宜尽早外科手术治疗。
因此，为了采取正确的治疗措施，提高NEC患儿的预后，提供一种能够准确诊断NEC和识别NEC的分期的方法显得非常重要。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出CD177+中性粒细胞在制备新生儿坏死性小肠结肠炎检测产品中的应用，确诊NEC患儿(包括NEC II期患儿和NEC III期患儿)外周血中的CD177+中性粒细胞显著降低，且确诊NEC患儿外周血中的CD177+中性粒细胞与Bell分期呈负相关，CD177+中性粒细胞可以作为NEC的标志物。
本发明还提供了一种新生儿坏死性小肠结肠炎检测产品。
本发明的第一个方面，提供CD177+中性粒细胞在制备新生儿坏死性小肠结肠炎检测产品中的应用，所述CD177+中性粒细胞为阳性表达中性粒细胞表面抗原CD177的中性粒细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述CD177+中性粒细胞水平在确诊NEC患儿外周血中较低。
在本发明的一些实施方式中，所述确诊NEC患儿为NEC II期患儿或NEC III期患儿。
在本发明的一些实施方式中，所述CD177+中性粒细胞为外周血中的CD177+中性粒细胞。
本发明的第二个方面，提供一种新生儿坏死性小肠结肠炎检测产品，包括用于检测CD177+中性粒细胞的试剂。
在本发明的一些实施方式中，所述新生儿坏死性小肠结肠炎检测产品至少包括1)-2)中的一种用途：
1)辅助诊断新生儿坏死性小肠结肠炎；
2)辅助区分新生儿坏死性小肠结肠炎不同分期。
在本发明的一些实施方式中，所述辅助区分新生儿坏死性小肠结肠炎不同分期为辅助区分NEC I期患儿以及确诊NEC患儿。
在本发明的一些实施方式中，所述确诊NEC患儿为NEC II期患儿或NEC III期患儿。
在本发明的一些实施方式中，所述检测产品包括芯片、制剂或试剂盒。
在本发明的一些实施方式中，所述检测产品通过选自由免疫检测法、原位杂交、PCR检测、免疫印迹法及其组合组成的组的一种或多种方法分析检测样品。可以理解的是，上述检测产品可通过本领域已知的技术来实现检测CD177+中性粒细胞的水平，而上述本领域已知的技术包括但不限于免疫检测法、原位杂交、PCR检测和免疫印迹法，这些方法可以结合使用。
在本发明的一些实施方式中，所述检测产品通过免疫检测法分析检测样品。
在本发明的一些实施方式中，所述检测产品通过流式细胞术分析检测样品。可以理解的是，还可通过包括但不限于荧光定量PCR的方法对经流式细胞术分选纯化后的细胞的CD177的基因表达水平进行检测。
在本发明的一些实施方式中，通过流式细胞术分析受试者样本与对照样本中的CD177+中性粒细胞的水平。
在本发明的一些实施方式中，所述检测产品通过检测受试者样本中的CD177+中性粒细胞水平来判断受试者是否存在确诊新生儿坏死性小肠结肠炎的风险。
在本发明的一些实施方式中，所述判断的方法为：当受试者样本中的CD177+中性粒细胞的水平低于最佳截止值时，则判断受试者有确诊新生儿坏死性小肠结肠炎的风险；当受试者样本中的CD177+中性粒细胞的水平大于最佳截止值时，则判断受试者有患NEC I期的风险或未患NEC；所述对照样本为排除炎症性疾病、消化道畸形和遗传代谢病患儿的非新生儿坏死性小肠结肠炎患儿或健康人的外周血。具体的，所述受试者有确诊新生儿坏死性小肠结肠炎患病的风险为受试者有确诊为NEC II期或NEC III期的风险。
在本发明的一些实施方式中，所述受试者样本包括受试者的外周血和外周血经处理或加工后的产物中的至少一种。上述检测产品可以用于分析包括外周血、外周血经加工或处理的产物等的样本中的CD177+中性粒细胞水平。
在本发明的一些实施方式中，所述外周血经处理或加工后的产物为去除红细胞后的外周血。
在本发明的一些实施方式中，所述用于检测CD177+中性粒细胞的试剂包括用于识别或检测CD177的a1-a3中的至少一种：
a1：免疫检测试剂；
a2：原位杂交试剂；
a3：PCR检测试剂。
在本发明的一些实施方式中，所述用于检测CD177+中性粒细胞的试剂包括b1-b3中的至少一种：
b1：特异性结合CD177的抗体；
b2：特异性识别CD177基因的探针；
b3：特异性扩增CD177基因的引物。
在本发明的一些实施方式中，所述检测产品还包括对照样本。
在本发明的一些实施方式中，所述对照样本为非新生儿坏死性小肠结肠炎患儿或健康人的外周血或外周血经处理或加工后的产物。所述非新生儿坏死性小肠结肠炎患儿为排除炎症性疾病、消化道畸形和遗传代谢病患儿的患儿。具体的，所述外周血经处理或加工后的产物为去除红细胞后的外周血。
在本发明的一些实施方式中，所述特异性结合CD177的抗体为特异性结合CD177的单克隆抗体或特异性结合CD177的多克隆抗体。
在本发明的一些实施方式中，所述特异性结合CD177的抗体为荧光素标记的CD177抗体。
在本发明的一些实施方式中，所述荧光素选自FITC、PE、PerCP-Cy5.5、PE-Cy7、APC-Cy7和V500。
在本发明的一些实施方式中，所述特异性结合CD177的抗体为PE标记的CD177抗体。
在本发明的一些实施方式中，所述特异性结合CD177的抗体为anti-Human CD177PE。
本发明的有益效果是：
确诊NEC患儿外周血中的CD177+中性粒细胞水平显著降低，且确诊NEC患儿外周血中的CD177+中性粒细胞水平与Bell分期呈负相关。因此，CD177+中性粒细胞作为标志物制备得到的新生儿坏死性小肠结肠炎检测产品能够用于有效辅助诊断或区分NEC I期患儿和确诊NEC患儿(包括NEC II期患儿和NEC III期患儿)。
本发明发现CD177+中性粒细胞可以作为确诊NEC患儿标志物，这有利于后续深入开展NEC相关分子机制研究，为加强和促进NEC防治工作提供理论基础。，
附图说明
图1为本发明实施例1中对照组(Cont)与疾病组外周血中CD177+中性粒细胞水平检测结果(其中，图A为对照组与确诊NEC组(NEC，包括NEC II期患儿和NEC III期患儿)外周血中CD177+中性粒细胞水平检测结果；图B为对照组与NEC I期患儿(NEC I)、NEC II期患儿(NEC II)、NEC III期患儿(NEC III)外周血中CD177+中性粒细胞水平检测结果)。
图2为本发明实施例1中CD177+中性粒细胞对对照组(Cont)与疾病组外周血的ROC曲线(其中，图A为CD177+中性粒细胞对对照组与确诊NEC组(NEC，包括NEC II期患儿和NECIII期患儿)外周血的ROC曲线；图B为CD177+中性粒细胞对对照组与NEC II期患儿(NEC II)外周血的ROC曲线；图C为CD177+中性粒细胞对对照组与NEC III期患儿(NEC III)外周血的ROC曲线)。
图3为本发明实施例2中对照组(Cont)与疾病组外周血中CD177+中性粒细胞水平检测结果(其中，图A为对照组与确诊NEC组(NEC，包括NEC II期患儿和NEC III期患儿)外周血中CD177+中性粒细胞水平检测结果；图B为对照组与NEC I期患儿(NEC I)、NEC II期患儿(NEC II)、NEC III期患儿(NEC III)外周血中CD177+中性粒细胞水平检测结果)。
图4为本发明实施例2中CD177+中性粒细胞对对照组(Cont)与疾病组外周血的ROC曲线(其中，图A为CD177+中性粒细胞对对照组与确诊NEC组(NEC，包括NEC II期患儿和NECIII期患儿)外周血的ROC曲线；图B为CD177+中性粒细胞对对照组与NEC II期患儿(NEC II)外周血的ROC曲线；图C为CD177+中性粒细胞对对照组与NEC III期患儿(NEC III)外周血的ROC曲线)。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
下列实施例中采用的试剂、方法和设备均为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。
下列实施例中使用的红细胞裂解液由天根生化提供，anti-Human CD45 APC-CY7(货号：25-0459-T100)由Tonbo Biosciences提供；anti-Human CD66b FITC(货号：305104)由BioLegend提供；anti-Human CD177 PE(货号：ab69777)由Abcam提供；流式缓冲液(货号：130-091-221)由Miltenyi提供；死细胞染料7-AAD(货号：ab228563)由Abcam提供。
下述CD177+中性粒细胞为阳性表达中性粒细胞表面抗原CD177的中性粒细胞。
实施例1
1.样本和分组
疾病组：根据《实用新生儿学》(第四版)NEC修正版的Bell分期标准，选取2020年4月-2020年12月在广州市妇女儿童医疗中心住院治疗的NEC患儿28例，其中NEC I期患儿8例，NEC II期患儿13例，NEC III期患儿7例。
对照组(Cont)：选取同期住院与疾病组矫正胎龄、性别、出生体重匹配的18例非NEC患儿(排除炎症性疾病、消化道畸形和遗传代谢病患儿)。
采取上述患儿的新鲜外周血于EDTA抗凝管中，用于流式细胞技术检测CD177+中性粒细胞。
2.流式细胞技术(Flow Cytometry，FCM)检测CD177+中性粒细胞
具体检测步骤如下：
1)取0.2mL左右新鲜EDTA抗凝的外周血，加入2mL红细胞裂解液，混匀后室温裂解红细胞15min，随后在500g条件下离心5min。
2)弃红色上清，再加入2mL PBS，在500g条件下离心5min，以洗涤细胞。
3)弃上清，加入100μL流式染色缓冲液、1μL anti-Human CD45 APC-CY7、1μLanti-Human CD66b FITC、2μL anti-Human CD177 PE，4℃避光孵育30min(或者常温避光孵育20min)后，再加入1mL流式染色缓冲液混匀，在500g条件下离心5min，以洗涤细胞。
其中，anti-Human CD45 APC-CY7用于标记免疫细胞；anti-Human CD66b FITC用于标记中性粒细胞；anti-Human CD177 PE用于标记CD177+中性粒细胞。
4)弃上清，加入100μL流式染色缓冲液、1μL死细胞染料7-AAD，室温避光孵育5min后，加入适量流式染色缓冲液混匀细胞，转移到流式管中，于BD流式细胞仪上检测分析CD177+中性粒细胞。
通过流式细胞技术分析8例NEC I期患儿、13例NEC II期患儿、7例NEC III期患儿与18例非NEC患儿外周血中CD177+中性粒细胞的水平。结果显示：确诊NEC组(NEC，包括NECII和NEC III)外周血中CD177+中性粒细胞水平明显低于对照组(p<0.0001)，如图1中图A所示；在疾病组中，NEC II期患儿(p<0.0004)及NEC III期患儿(p<0.0001)均显著低于NEC I期患儿，且NEC I期患儿外周血中CD177+中性粒细胞水平与对照组无显著性差异，如图1中图B所示。
3.ROC曲线分析
在预测确诊NEC患儿时，AUC值为0.9139，最佳截止值对应灵敏性为85.00％，特异性为88.89％，如图2中图A所示；预测NEC II期患儿时，AUC值为0.8761，最佳截止值对应灵敏性为84.62％，特异性为83.33％，如图2中图B所示；预测NEC III期患儿时，AUC值为0.9841，最佳截止值对应灵敏性为100％，特异性为88.89％，如图2中图C所示。
由此可见，CD177+中性粒细胞对NEC II期患儿和NEC III期患儿有较高的特异性。
实施例2
重新采集样本进行检测，以验证上述实施例中的结论的准确性。
1.样本和分组
疾病组：根据《实用新生儿学》(第四版)NEC修正版的Bell分期标准，选取2021年2月-2021年10月在广州市妇女儿童医疗中心住院治疗的NEC患儿23例，其中NEC I期患儿7例，NEC II期患儿8例，NEC III期患儿8例。
对照组(Cont)：选取同期住院与疾病组矫正胎龄、性别、出生体重匹配的20例非NEC患儿(排除炎症性疾病、消化道畸形和遗传代谢病患儿)。
采取上述患儿的新鲜外周血于EDTA抗凝管中，用于流式细胞技术检测CD177+中性粒细胞。
2.流式细胞技术(Flow Cytometry，FCM)检测CD177+中性粒细胞
具体检测步骤如下：
1)取0.2mL左右新鲜EDTA抗凝的外周血，加入2mL红细胞裂解液，混匀后室温裂解红细胞15min，随后在500g条件下离心5min。
2)弃红色上清，再加入2mL PBS，在500g条件下离心5min，以洗涤细胞。
3)弃上清，加入100μL流式染色缓冲液、1μL anti-Human CD45 APC-CY7、1μLanti-Human CD66b FITC、2μL anti-Human CD177 PE，4℃避光孵育30min(或者常温避光孵育20min)后，再加入1mL流式染色缓冲液混匀，在500g条件下离心5min，以洗涤细胞。
其中，anti-Human CD45 APC-CY7用于标记免疫细胞；anti-Human CD66b FITC用于标记中性粒细胞；anti-Human CD177 PE用于标记CD177+中性粒细胞。
4)弃上清，加入100μL流式染色缓冲液、1μL死细胞染料7-AAD，室温避光孵育5min后，加入适量流式染色缓冲液混匀细胞，转移到流式管中，于BD流式细胞仪上检测分析CD177+中性粒细胞。
通过流式细胞技术分析7例NEC I期患儿、8例NEC II期患儿、8例NEC III期患儿与20例非NEC患儿外周血中CD177+中性粒细胞的水平。结果显示：确诊NEC组(NEC，包括NEC II和NEC III)外周血中CD177+中性粒细胞水平明显低于对照组(p<0.0001)，如图3中图A所示；在疾病组中，NEC II期患儿(p<0.0025)及NEC III期患儿(p<0.0001)均显著低于NEC I期患儿，且NEC I期患儿外周血中CD177+中性粒细胞水平与对照组无显著性差异，如图3中图B所示。
3.ROC曲线分析
CD177+中性粒细胞用于预测确诊NEC患儿的AUC值为0.9109，最佳截止值对应灵敏性为87.50％，特异性为90.00％，如图4中图A所示；CD177+中性粒细胞用于预测NEC II期患儿的AUC值为0.8688，最佳截止值对应灵敏性为87.50％，特异性为80.00％，如图4中图B所示；CD177+中性粒细胞用于预测NEC III期患儿时，AUC值为0.9531，最佳截止值对应灵敏性为100％，特异性为90.00％，如图4中图C所示。
本实施例的结果表明CD177+中性粒细胞对确诊NEC患儿(即NEC II期患儿和NECIII期患儿)有较高的特异性。
上述实施例表明：上述方法的灵敏性和特异性较好。
上述通过流式细胞术检测外周血中CD177+中性粒细胞的方法相对于临床上腹部X线平片等辅助诊断检查在新生儿NEC确诊及分期预测中具有操作简单、无介入、通量高、成本低、无辐射等危害的优势。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.CD177+中性粒细胞在制备新生儿坏死性小肠结肠炎检测产品中的应用，其特征在于，所述CD177+中性粒细胞为阳性表达中性粒细胞表面抗原CD177的中性粒细胞。
2.一种新生儿坏死性小肠结肠炎检测产品，其特征在于，包括用于检测CD177+中性粒细胞的试剂。
3.根据权利要求2所述的检测产品，其特征在于，所述试剂包括用于识别或检测CD177的a1-a3中的至少一种：
a1：免疫检测试剂；
a2：原位杂交试剂；
a3：PCR检测试剂。
4.根据权利要求3所述的检测产品，其特征在于，所述试剂包括b1-b3中的至少一种：
b1：特异性结合CD177的抗体；
b2：特异性识别CD177基因的探针；
b3：特异性扩增CD177基因的引物。
5.根据权利要求4所述的检测产品，其特征在于，所述特异性结合CD177的抗体为荧光素标记的CD177抗体。
6.根据权利要求2所述的检测产品，其特征在于，所述新生儿坏死性小肠结肠炎检测产品至少包括1)-2)中的一种用途：
1)辅助诊断新生儿坏死性小肠结肠炎；
2)辅助区分新生儿坏死性小肠结肠炎不同分期。
7.根据权利要求6所述的检测产品，其特征在于，所述辅助区分新生儿坏死性小肠结肠炎不同分期为辅助区分NEC I期患儿以及确诊NEC患儿。
8.根据权利要求6所述的检测产品，其特征在于，所述检测产品通过检测受试者样本中的CD177+中性粒细胞水平来判断受试者是否存在确诊新生儿坏死性小肠结肠炎的风险。
9.根据权利要求8所述的检测产品，其特征在于，所述受试者样本包括受试者的外周血和外周血经处理或加工后的产物中的至少一种。
10.根据权利要求2所述的检测产品，其特征在于，所述检测产品还包括对照样本。
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