CN105506166A - Cd177阳性中性粒细胞对炎症性肠病肠粘膜炎症程度和结肠癌的临床诊断和预后评估 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及CD177阳性中性粒细胞对炎症性肠病肠粘膜炎症程度和结肠癌的临床诊断和预后评估。本发明通过大样本临床数据结合动物实验，一方面证实了炎症性肠病患者外周血及肠粘膜组织中CD177阳性中性粒细胞的数量可作为评估炎症程度的有力指标，结肠癌患者肿瘤组织中CD177阳性中性粒细胞的数量可为评估患者病情及预后提供可靠的证据，因此CD177阳性中性粒细胞的数量检测可为临床上全面评估患者病情及实行个体化诊疗方案提供便捷、准确的途径；另一方面证实了CD177具有一定的抗炎和抗肿瘤作用，因此可用于制备治疗炎症性肠病或结肠癌的药物。

Description

CD177阳性中性粒细胞对炎症性肠病肠粘膜炎症程度和结肠癌的临床诊断和预后评估
技术领域
本发明涉及疾病临床诊断和预后评估的标志物及治疗靶点，具体地说，涉及CD177基因或蛋白以及CD177阳性中性粒细胞在炎症性肠病肠粘膜炎症程度或结肠癌的临床诊断、预后评估和作为治疗靶点中的应用。
背景技术
炎症性肠病(inflammatoryboweldisease，IBD)包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)，是一种发生在胃肠道的慢性非特异性炎症性疾病。溃疡性结肠炎患者罹患结肠癌的风险较健康对照者显著升高。炎症性肠病及其癌变过程的原因和机制仍不清楚，可能与持续的肠道感染、肠黏膜屏障受损、肠黏膜组织内免疫调节紊乱、基因易感和环境等因素有关。近年来我国炎症性肠病和结肠癌患病人数呈明显上升趋势，造成了沉重的社会医疗经济负担。
目前炎症性肠病和结肠癌的诊断主要是内镜及组织病理学检查，创伤性较大，且临床上缺乏与肠粘膜炎症程度及癌变预后明显相关的特异性指标。因此，一种新的对炎症性肠病和结肠癌的诊断及预后评估的方法对临床上的诊疗过程来说是极其重要的。
CD177是一种58-64kDa糖基化磷脂酰肌醇锚定的糖蛋白，在中性粒细胞(PMN)上特异性表达，常与细胞膜表面的蛋白酶3(PR3)形成复合体。其基因定位于染色体19q13.2，并有两种等位基因(NB1、PRV-1)。在正常人外周血中平均有45％-65％的PMN表达CD177，而在急性细菌感染和接受G-CSF治疗后显著升高。CD177的功能仍不清楚，已知CD177+PMN(CD177阳性中性粒细胞)在抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)相关的血管炎、SLE患者显著升高，且这部分细胞颗粒蛋白(granuleprotein，GP)基因表达下降，提示CD177可能与PMN成熟有密切关系。另有研究发现过敏性哮喘患者外周血中IL-17A+CD177+PMN明显升高，而IL-17A进一步诱导PMN向肺组织浸润，从而加重肺部炎症损伤过程。这些研究提示CD177+PMN可能参与了一些自身免疫疾病的发生发展。然而，其在肠黏膜炎症发生过程的免疫应答效应和结肠癌肿瘤组织中的表达情况仍不清楚。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供CD177基因或蛋白或它们的增效剂以及CD177阳性中性粒细胞的新用途。
第一方面，本发明提供了CD177基因或蛋白在制备诊断试剂或试剂盒中的用途，所述的诊断试剂或试剂盒用于：
a)评估炎症性肠病患者的炎症程度；或
b)评估结肠癌患者的生存期或预后。
第二方面，本发明提供了检测CD177阳性中性粒细胞数量的试剂在制备诊断试剂或试剂盒中的用途，所述的诊断试剂或试剂盒用于：
a)评估炎症性肠病患者的炎症程度；或
b)评估结肠癌患者的生存期或预后。
第三方面，本发明提供了CD177基因或蛋白或它们的增效剂在制备药物中的应用，所述的药物用于治疗炎症性肠病或结肠癌。
第四方面，本发明提供了CD177阳性中性粒细胞在制备药物中的应用，所述的药物用于治疗炎症性肠病或结肠癌。
第五方面，CD177基因或蛋白或它们的增效剂在制备试剂中的应用，所述的试剂用于：
a)降低促炎性细胞因子或ki67的表达；
b)促进髓过氧化物酶、S100A8、S100A9或E-钙粘素的表达；
c)促进中性粒细胞活性氧的释放量；
d)提高中性粒细胞的迁移能力。
本发明优点在于：
本发明通过大样本临床数据结合动物实验，一方面证实了炎症性肠病患者外周血及肠粘膜组织中CD177阳性中性粒细胞的数量可作为评估炎症程度的有力指标，结肠癌患者肿瘤组织中CD177阳性中性粒细胞的数量可为评估患者病情及预后提供可靠的证据，因此CD177阳性中性粒细胞的数量检测可为临床上全面评估患者病情及实行个体化诊疗方案提供便捷、准确的途径；另一方面证实了CD177具有一定的抗炎和抗肿瘤作用，因此可用于制备治疗炎症性肠病或结肠癌的药物。
附图说明
图1为CD177mRNA表达的检测结果。图中A、B、C分别为人外周血、肠黏膜组织、结肠癌组织的检测结果。荧光定量PCR发现CD177mRNA在活动期IBD患者及结肠癌患者中表达升高。
图2为正常人、活动期CD、活动期UC、结肠癌患者癌组织、结肠癌患者癌旁组织的CD177免疫组化结果。发现CD177蛋白在活动期IBD患者及结肠癌患者中表达升高。
图3为CD177阳性中性粒细胞数量的检测结果。A为人外周血经流式细胞学检测中性粒细胞比例和CD177阳性中性粒细胞比例的结果，B、C为其统计图。流式细胞学检测显示CD177阳性中性粒细胞的比例在活动期IBD患者外周血中明显升高。
图4为CD177阳性中性粒细胞数量的检测结果。A为人肠黏膜经流式细胞学检测中性粒细胞比例和CD177阳性中性粒细胞比例的结果，B、C为其统计图。流式细胞学检测显示CD177阳性中性粒细胞的比例在活动期IBD患者肠粘膜中明显升高。
图5为CD177阳性中性粒细胞数量的检测结果。A为人肿瘤组织经流式细胞学检测中性粒细胞比例和CD177阳性中性粒细胞比例的结果，B为其统计图。流式细胞学检测显示CD177阳性中性粒细胞的比例在结肠癌患者肿瘤组织中明显升高。
图6为促炎性细胞因子检测结果。
图7为活性氧检测结果。
图8为髓过氧化物酶检测结果。
图9为S100a8和S100a9检测结果。
图10是用从受试者外周血中分离的中性粒细胞与SW480细胞进行共培养后，通过测试电阻抗来检测杀伤性的实验结果。发现CD177阳性中性粒细胞可能具有一定的抗肿瘤能力。
图11是结合肿瘤组织免疫组化结果的5年内结肠癌患者术后生存时间数据分析图。发现CD177阳性中性粒细胞比例高的结肠癌患者术后生存时间较长，且预后较好，进一步验证了CD177阳性中性粒细胞的抗肿瘤能力。
图12为正常小鼠和CD177基因敲除小鼠的结肠癌造模小鼠肿瘤组织Ki67的免疫组化染色结果。发现CD177基因敲除小鼠的肿瘤组织Ki67表达量升高。
图13为正常小鼠和CD177基因敲除小鼠的结肠癌造模小鼠肿瘤组织E-cadherin的免疫组化染色结果。发现CD177基因敲除小鼠的肿瘤组织E-cadherin表达量下降。
图14是取野生型和CD177基因敲除小鼠骨髓中中性粒细胞，用Transwell检测的迁移能力的数据分析结果。发现CD177基因敲除小鼠的中性粒细胞迁移率明显下降。
图15是取野生型和CD177基因敲除小鼠骨髓中中性粒细胞，并加入了各种趋化因子、阻滞剂或激动剂，用Transwell检测的迁移能力的数据分析结果。发现使用了p38抑制剂(SB203580)后野生型小鼠的中性粒细胞迁移率明显下降。
图16是取野生型和CD177基因敲除小鼠骨髓中中性粒细胞，用免疫印迹法分析了p38、Akt和Erk与其磷酸化蛋白的表达量变化的结果。发现磷酸化p38的表达量下降。
图17是取野生型和CD177基因敲除小鼠骨髓中中性粒细胞，加入p38激动剂(anisomycin)，发现CD177基因敲除小鼠中性粒细胞迁移能力明显升高。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
CD177蛋白及基因
在本文中，所用的CD177蛋白可以是天然存在的，比如其可被分离纯化自哺乳动物。此外，所述CD177蛋白也可以是人工制备的，比如根据常规基因工程技术来制备得到。任何合适的CD177蛋白均可适用于本发明。所述CD177蛋白包括全长的CD177蛋白或其生物活性片段。
经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的CD177蛋白的氨基酸序列也包括在本发明中。CD177蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述氨基酸替代的序列并不影响其活性或保留了其部分活性。适当替换氨基酸是本领域内的公知技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变已知分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必需氨基酸区域改变单个氨基酸并不会改变生物活性。
任何一种CD177蛋白的生物活性片段均可以应用到本发明中。在这里，CD177蛋白的生物活性片段的含义是指一种多肽，其仍然能保持全长的CD177蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％、60％至99％或者100％的全长CD177蛋白的活性。
本发明也可以采用经修饰或改良的全部或部分氨基酸的CD177蛋白，比如，可以为了促进半衰期、有效性、代谢和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的CD177蛋白。所述经过修饰或改良的CD177蛋白可以是一种CD177蛋白的共轭物，或其可被取代的或人工的氨基酸。所述经过修饰或改良的CD177蛋白或基因可以与天然CD177蛋白或基因有一定的不同点，但也能够扩张血管，且不会带来其它不良反应或毒性。也就是说，任何不影响CD177蛋白的生物活性或者说是基因的生物学功能的变化形式都可用于本发明中。
CD177增效剂及其用途
所述的“CD177增效剂”包括了激动剂、上调剂、稳定剂等，是指任何可提高CD177的活性、提高CD177的稳定性、上调CD177的表达、增加CD177有效作用时间的物质，这些物质均可用于本发明。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子等。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，蛋白水平的，也可以是上调CD177表达的病毒产品等。
实施例1大样本临床实验
1材料
1.1病例来源
搜集临床上活动期CD36例、缓解期CD30例、活动期UC30例、缓解期UC32例，结肠癌患者20例，健康对照者30例。
1.2实验材料
TRIzol总RNA抽提试剂盒，RNA逆转录试剂盒，SYBRGreen荧光定量PCR试剂盒，AmplexRed过氧化氢/过氧化物酶分析试剂盒。
2方法
2.1荧光定量PCR检测受试者CD177mRNA表达
1)受试者外周血经Ficoll分离单个核细胞，裂红，用TRIzol试剂抽提RNA。肠黏膜组织、癌组织或癌旁组织直接加TRIzol研磨抽提RNA。
2)根据RNA逆转录试剂盒说明，得到cDNA溶液。
3)按照Takara的SYBRGreen荧光定量PCR试剂盒说明配制反应体系，以GAPDH作为内参。CD177引物序列如下：
上游引物：ATGAGCGCGGTATTACTGCT(SEQIDNO.1)
下游引物：GGTCGGACACCTTCCACAC(SEQIDNO.2)
反应条件：预变性95℃30秒；PCR反应：95℃5秒，60℃30秒；溶解反应：95℃15秒，60℃1分钟，95℃15秒。设置35个循环。
4)数据分析。
2.2免疫组织化学染色检测受试者CD177蛋白表达
1)受试者肠黏膜组织、癌组织或癌旁组织经固定、脱色、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后制成石蜡切片。
2)石蜡切片经过烤片，脱蜡，抗原修复，封闭，一抗、二抗染色，苏木素复染，脱水，透明，封片。
2.3流式细胞学检测受试者外周血、肠粘膜组织及肿瘤组织中CD177阳性中性粒细胞数量
1)受试者外周血经Ficoll分离单个核细胞，裂红；肠黏膜组织、肿瘤组织或癌旁组织经去上皮消化得到细胞悬液。
2)取悬液中约50万个细胞染色，固定，上机，数据处理。
2.4吉姆萨染色检测IBD患者和健康对照者CD177阳性中性粒细胞形态变化
用免疫磁珠的方法分离IBD患者及健康对照者外周血高纯度的CD177阳性和阴性的中性粒细胞，吉姆萨染色，电镜扫描。
2.5CD177阳性中性粒细胞的炎症保护作用分析
应用实时荧光定量PCR方法检测正常人、溃疡性结肠炎患者和克罗恩病患者外周血CD177阳性中性粒细胞和CD177阴性中性粒细胞的六种促炎性细胞因子表达量。应用AmplexRed过氧化氢/过氧化物酶分析试剂盒和实时荧光定量PCR，给予20ngPMA刺激，检测正常人、溃疡性结肠炎患者和克罗恩病患者外周血CD177阳性中性粒细胞和CD177阴性中性粒细胞活性氧的释放量、髓过氧化物酶的表达量。应用实时荧光定量PCR检测正常人、溃疡性结肠炎患者和克罗恩病患者外周血CD177阳性中性粒细胞和CD177阴性中性粒细胞S100a8和S100a9的表达量。
2.6CD177阳性中性粒细胞抗肿瘤能力的检测
进一步分选健康对照者外周血高纯度的CD177阳性和CD177阴性的中性粒细胞，与结肠癌上皮细胞系共培养，用仪器检测结肠癌上皮细胞电阻抗。
2.7结肠癌患者随访
随访5年内结肠癌患者术后的生存时间，并结合肿瘤组织的免疫组化结果，研究CD177阳性中性粒细胞的抗肿瘤能力。
3结果
3.1CD177mRNA表达的检测
结果见图1。荧光定量PCR发现CD177mRNA在活动期IBD患者外周血和肠黏膜组织及结肠癌患者肿瘤组织中表达升高。
3.2CD177蛋白表达的检测
结果见图2。免疫组织化学染色发现CD177蛋白在活动期IBD患者肠黏膜组织及结肠癌患者肿瘤组织中表达升高。
3.3CD177阳性中性粒细胞数量的检测
结果见图3-5。流式细胞学检测显示CD177阳性中性粒细胞的比例在活动期IBD外周血、肠粘膜组织和结肠癌患者肿瘤组织中明显升高。
3.4CD177阳性中性粒细胞形态变化检测
吉姆萨染色结果显示IBD患者两群细胞在大体形态上没有明显区别，然而扫描电镜结果表明CD177阳性中性粒细胞胞浆中含有更多的蛋白酶颗粒。
3.5CD177阳性中性粒细胞的炎症保护作用分析
应用实时荧光定量PCR方法检测正常人、溃疡性结肠炎患者和克罗恩病患者外周血CD177阳性中性粒细胞和CD177阴性中性粒细胞的促炎性细胞因子表达量，结果见图6。显示CD177阳性中性粒细胞产生较少的促炎性细胞因子，提示CD177阳性的中性粒细胞可能具有一定的炎症保护作用。
应用AmplexRed过氧化氢/过氧化物酶分析试剂盒，给予20ngPMA刺激，检测正常人、溃疡性结肠炎患者和克罗恩病患者外周血CD177阳性中性粒细胞和CD177阴性中性粒细胞活性氧的释放量，结果见图7。应用AmplexRed过氧化氢/过氧化物酶分析试剂盒和实时荧光定量PCR，检测正常人、溃疡性结肠炎患者和克罗恩病患者外周血CD177阳性中性粒细胞和CD177阴性中性粒细胞髓过氧化物酶的表达量，结果见图8。应用实时荧光定量PCR检测正常人、溃疡性结肠炎患者和克罗恩病患者外周血CD177阳性中性粒细胞和CD177阴性中性粒细胞S100a8和S100a9的表达量，结果见图9。以上结果直接证明了CD177阳性的中性粒细胞具有较强的杀菌能力。
3.6CD177阳性中性粒细胞抗肿瘤能力的检测
结果见图10。电阻抗结果显示CD177阳性中性粒细胞对结肠癌上皮细胞具有较强的杀伤力，提示CD177阳性中性粒细胞可能具有一定的抗肿瘤能力。
3.7结肠癌患者随访结果
结果见图11，表1-2。通过随访5年内结肠癌患者术后的生存时间，结合瘤组织的免疫组化结果，我们发现CD177阳性中性粒细胞比例高的结肠癌患者术后生存时间较长，且预后较好，进一步验证了CD177阳性中性粒细胞的抗肿瘤能力。
表1应用Cox回归模型对结肠癌患者预后因素的单变量分析
注：在400倍的高倍镜视野中，CD177+中性粒细胞的数目＞5个，定义为高密度；CD177+中性粒细胞的数目≤5个，定义为低密度。
表2应用Cox回归模型对结肠癌患者预后因素的多变量分析
实施例2动物实验
1材料
1.1实验动物
WT和CD177基因敲除小鼠(CD177-/-小鼠)均为C57BL/6，6-8周龄。
CD177-/-小鼠来源：通过南京大学模式动物研究中心从美国UniversityofCaliforniaatDavis的基因敲除小鼠项目库(KOMP)引进了小鼠携带等位基因CD177缺失的精子(CD177tm1(KOMP)Vlcg,订购号KO-4530)，通过与C57BL/6小鼠交配后获得CD177knockout(KO)即CD177-/-小鼠，然后转移至我院动物中心饲养繁殖待实验使用。
1.2实验材料
眼科剪，眼科镊子，大培养皿，100目细胞筛，冰盒，冰桶，锥形瓶，磁力转子，弯头镊子，各种规格离心管、吸管，无菌手套，口罩，流式管。
2方法
2.1结肠炎诱导及相关检测
取6-8周成年小鼠，分为基因敲除组和对照组，喂7天DSS，然后喂水3天，处死，并检测。
2.2结肠癌诱导及相关检测
取6-8周成年小鼠，分为基因敲除组和对照组，按体重腹腔注射AOM，7天后喂7天DSS，接着喂14天水，以此3个循环，到第80天时结肠癌模型诱导完成，期间监测小鼠各项指标。
2.3小鼠中性粒细胞迁移能力的检测
1)提取小鼠骨髓中性粒细胞或者肠黏膜中性粒细胞。
2)将一定量的细胞种植于Transwell板上层，37℃孵育半小时后，下层加入一定的趋化因子，37℃孵育半小时后，拍照计数，数据处理。
3结果
3.1结肠炎诱导结果
与正常小鼠相比较，CD177基因敲除的小鼠更易发生结肠炎，表现为体重明显下降、腹泻、脓血便、皮肤毛发失去光泽，活动力下降，死亡率增加。第10天处死小鼠后，发现结肠长度明显变短，且病理学分析提示结肠炎症组织学评分明显增加，提示CD177具有炎症保护作用。
3.2结肠癌诱导结果
与正常小鼠相比较，CD177基因敲除小鼠更易发生结肠癌，表现为结肠肿瘤的数目明显增加，体积增大，且易发生淋巴结及肝转移。免疫组化结果显示在CD177基因敲除小鼠的结肠肿瘤组织中，ki67表达明显增加(图12)，E-钙粘素表达明显降低(图13)，提示CD177具有一定的抗肿瘤能力。
3.3小鼠中性粒细胞迁移能力的检测结果
结果见图14-17。分别提取野生型小鼠和CD177基因敲除小鼠骨髓中的中性粒细胞，用Transwell检测中性粒细胞的迁移能力，发现CD177基因敲除后，中性粒细胞的迁移能力明显降低，但此中性粒细胞在接受p38激动剂刺激后，迁移能力明显升高，说明CD177基因是通过影响p38的磷酸化而影响中性粒细胞的迁移能力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.CD177基因或蛋白在制备诊断试剂或试剂盒中的用途，其特征在于，所述的诊断试剂或试剂盒用于：
a)评估炎症性肠病患者的炎症程度；或
b)评估结肠癌患者的生存期或预后。
2.检测CD177阳性中性粒细胞数量的试剂在制备诊断试剂或试剂盒中的用途，其特征在于，所述的诊断试剂或试剂盒用于：
a)评估炎症性肠病患者的炎症程度；或
b)评估结肠癌患者的生存期或预后。
3.CD177基因或蛋白或它们的增效剂在制备药物中的应用，其特征在于，所述的药物用于治疗炎症性肠病或结肠癌。
4.CD177阳性中性粒细胞在制备药物中的应用，其特征在于，所述的药物用于治疗炎症性肠病或结肠癌。
5.CD177基因或蛋白或它们的增效剂在制备试剂中的应用，其特征在于，所述的试剂用于：
a)降低促炎性细胞因子或ki67的表达；
b)促进髓过氧化物酶、S100A8、S100A9或E-钙粘素的表达；
c)促进中性粒细胞活性氧的释放量；
d)提高中性粒细胞的迁移能力。
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