CN111298121B - Ctrp6基因缺失在抑制肿瘤生长中的应用 - Google Patents

Ctrp6基因缺失在抑制肿瘤生长中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种CTRP6基因缺失在抑制肿瘤生长中的应用。本发明通过构建CTRP6基因功能缺失小鼠模型，研究CTRP6基因缺失对于肿瘤生长的影响。结果表明，CTRP6基因缺失能够抑制肿瘤生长。本发明生物技术的手段，在肿瘤治疗方面提供一定的理论依据，CTRP6基因(或蛋白)可以作为肿瘤治疗的药物靶点。

Description

CTRP6基因缺失在抑制肿瘤生长中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及CTRP6基因缺失在抑制肿瘤生长中的应用。
背景技术
近年来癌症的发病率和死亡率不断上升，是世界上最主要的致死原因之一。在我国，发病率较高的有肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、肠癌、食管癌、宫颈癌等。癌症的发病机制复杂，具有预防难，治疗效果差、转移率高等诸位多难题。目前癌症治疗手段有限，主要以手术治疗为主，辅助化疗、放疗。其中手术治疗对早期的、恶性程度低的肿瘤效果较好，其它情况治疗效果差，复发率高且易发生转移。而放疗易引发并发症，周期长，也无法彻底根除癌细胞。化疗的效果相对较好，但其作为全身性治疗法，在杀灭癌细胞的同时也会损伤正常细胞，副作用较大。近年来研究者致力于开发新的治疗方法，其中以免疫疗法最引人注目。另一个重要的方向就是药物靶点的发现，这是未来恶性肿瘤相关药物开发和治疗的必要前提。
补体C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白6(complement-C1q/tumor necrosis factor-related protein 6，CTRP6)，是由Wong等人发现的一种新的脂肪因子分泌蛋白，结构上与脂联素高度相似，具有一个氨基末端的信号肽，一个短的可变结构域，一个胶原样结构域和一个与补体蛋白C1q同源的羧基末端球形结构域。CTRP6具有多种生物学功能，主要包括调控脂肪细胞代谢、影响巨噬细胞炎症状态等，有文献报道了血液中CTRP6蛋白水平在肥胖、胰岛素抵抗人群中升高；也有部分报道了CTRP6与癌症相关的研究，涉及到的癌症类型包括口腔鳞状癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、肺腺癌以及结肠癌等，大多数是以癌细胞系为研究对象，研究CTRP6基因表达水平与细胞的生长、增殖、迁移的调控作用。相对而言，大部分研究不够深入，数据不够详实，各项研究之间也存在一定的矛盾，如CTRP6在卵巢癌患者血清和卵巢癌细胞培养液中表达水平均是降低的，表明CTRP6的表达水平与卵巢癌发生、发展具有负相关性；但在肝癌细胞和结肠癌细胞中，CTRP6却呈现高表达，与卵巢癌截然相反。此外，口腔鳞状癌和肝癌的研究工作相对较深入，但结论却无法互相印证。在口腔鳞状癌的研究中，重组CTRP6蛋白能够抑制癌细胞增殖和浸润，而肝癌的研究中，敲减CTRP6基因的表达水平，能够抑制肝癌细胞存活、迁移和浸润。因此，CTRP6基因(或蛋白)在肿瘤发生及治疗中的作用，尚无明确结论，尤其缺乏强有力的活体动物实验证据。
发明内容
本发明的目的是提供CTRP6基因缺失在抑制肿瘤生长中的应用。
第一方面，本发明首先保护如下(A)或(B)在制备抗肿瘤药物中的应用：
(A)用于沉默或抑制CTRP6基因的表达或引发CTRP6基因功能缺失的物质；
(B)用于降低CTRP6蛋白丰度和/或活性的物质。
第二方面，本发明保护一种抗肿瘤药物，包括如下(A)或(B)：
(A)用于沉默或抑制CTRP6基因的表达或引发CTRP6基因功能缺失的物质；
(B)用于降低CTRP6蛋白丰度和/或活性的物质。
在第一方面和第二方面中，所述(A)或(B)具体可为siRNA。示例性的，所述为siRNA1或siRNA2或siRNA3。siRNA1由正义链和反义链组成；所述正义链如序列表的序列1所示；所述反义链由序列表的序列2所示。siRNA2由正义链和反义链组成；所述正义链如序列表的序列3所示；所述反义链由序列表的序列4所示。siRNA3由正义链和反义链组成；所述正义链如序列表的序列5所示；所述反义链由序列表的序列6所示。其中，siRNA1效果最佳。
第三方面，本发明保护CTRP6基因和/或CTRP6蛋白作为靶标在筛选和/或制备抗肿瘤药物中的应用。
所述抗肿瘤药物通过如下(C)和/或(D)实现所述用途：
(C)沉默或抑制CTRP6基因的表达或引发CTRP6基因功能缺失；
(D)降低CTRP6蛋白丰度和/或活性。
第四方面，本发明保护siRNA1或siRNA2或siRNA3。
siRNA1由正义链和反义链组成；所述正义链如序列表的序列1所示；所述反义链由序列表的序列2所示。
siRNA2由正义链和反义链组成；所述正义链如序列表的序列3所示；所述反义链由序列表的序列4所示。
siRNA3由正义链和反义链组成；所述正义链如序列表的序列5所示；所述反义链由序列表的序列6所示。
第五方面，本发明保护所述siRNA1或siRNA2或siRNA3在制备抗肿瘤药物中的应用。
以上任一所述抗肿瘤药物为抑制肿瘤增大和/或抑制肿瘤细胞增殖的药物。
第六方面，本发明保护如下(A)或(B)在制备产品中的应用：
(A)用于沉默或抑制CTRP6基因的表达或引发CTRP6基因功能缺失的物质；
(B)用于降低CTRP6蛋白丰度和/或活性的物质；
所述产品的用途为如下(a1)-(a9)中的至少一种：
(a1)抑制肿瘤生长；
(a2)抑制肿瘤细胞增殖；
(a3)缓解肿瘤导致的器官肿大；
(a4)增强机体免疫力；
(a5)降低机体中癌基因表达量；
(a6)提高机体中抑癌基因的表达量；
(a7)降低机体中炎症因子基因的表达量；
(a8)提高机体中抑炎因子基因的表达量；
(a9)减少机体中病理性核分裂现象。
第七方面，本发明保护一种产品，包括如下(A)或(B)；
(A)用于沉默或抑制CTRP6基因的表达或引发CTRP6基因功能缺失的物质；
(B)用于降低CTRP6蛋白丰度和/或活性的物质；
所述产品的用途为如下(a1)-(a9)中的至少一种：
(a1)抑制肿瘤生长；
(a2)抑制肿瘤细胞增殖；
(a3)缓解肿瘤导致的器官肿大；
(a4)增强机体免疫力；
(a5)降低机体中癌基因表达量；
(a6)提高机体中抑癌基因的表达量；
(a7)降低机体中炎症因子基因的表达量；
(a8)提高机体中抑炎因子基因的表达量；
(a9)减少机体中病理性核分裂现象。
在第六方面和第七方面中，所述产品具体可为药物。所述(A)或(B)具体可为siRNA。示例性的，所述为siRNA1或siRNA2或siRNA3。siRNA1由正义链和反义链组成；所述正义链如序列表的序列1所示；所述反义链由序列表的序列2所示。siRNA2由正义链和反义链组成；所述正义链如序列表的序列3所示；所述反义链由序列表的序列4所示。siRNA3由正义链和反义链组成；所述正义链如序列表的序列5所示；所述反义链由序列表的序列6所示。其中，siRNA1效果最佳。
第八方面，本发明还保护CTRP6基因和/或CTRP6蛋白作为靶标在筛选和/或制备药物中的应用；所述药物的用途为如下(a1)-(a9)中的至少一种：
(a1)抑制肿瘤生长；
(a2)抑制肿瘤细胞增殖；
(a3)缓解肿瘤导致的器官肿大；
(a4)增强机体免疫力；
(a5)降低机体中癌基因表达量；
(a6)提高机体中抑癌基因的表达量；
(a7)降低机体中炎症因子基因的表达量；
(a8)提高机体中抑炎因子基因的表达量；
(a9)减少机体中病理性核分裂现象。
所述药物通过如下(C)和/或(D)实现所述用途：
(C)沉默或抑制CTRP6基因的表达或引发CTRP6基因功能缺失；
(D)降低CTRP6蛋白丰度和/或活性。
第九方面，本发明还保护一种药物筛选方法，包括如下步骤：筛选可实现如下(C)和/或(D)的物质作为候选药物；
(C)沉默或抑制CTRP6基因的表达或引发CTRP6基因功能缺失；
(D)降低CTRP6蛋白丰度和/或活性；
所述药物的用途为如下(a1)-(a9)中的至少一种：
(a1)抑制肿瘤生长；
(a2)抑制肿瘤细胞增殖；
(a3)缓解肿瘤导致的器官肿大；
(a4)增强机体免疫力；
(a5)降低机体中癌基因表达量；
(a6)提高机体中抑癌基因的表达量；
(a7)降低机体中炎症因子基因的表达量；
(a8)提高机体中抑炎因子基因的表达量；
(a9)减少机体中病理性核分裂现象。
以上任一所述机体可为生物机体，具体可为哺乳动物机体。示例性的，所述哺乳动物为人或鼠。
以上任一所述(a3)中，所述器官具体可为肝和/或脾和/或肺。
以上任一所述(a4)中，所述增强机体免疫力具体体现为T淋巴细胞分泌增多；
以上任一所述(a5)中，所述癌基因为k-ras基因和/或Bcl-2基因和/或c-fos基因和/或AKT1基因和/或AKT2基因和/或CyclinD1基因和/或CDK4基因和/或VEGF基因和/或EGFR基因和/或CCL5基因和/或MMP2基因；
以上任一所述(a6)中，所述抑癌基因为Bax基因和/或p53基因和/或CDKN2A基因；
以上任一所述(a7)中，所述炎症因子基因为TNF-α基因和/或IL-6基因和/或IL-1β基因和/或IL-2基因；
以上任一所述(a8)中，所述抑炎因子基因为IL-4基因和/或IL-10基因和/或TGF-β1基因。
以上任一所述肿瘤为肺癌和/或前列腺癌和/或乳腺癌。
以上任一所述肿瘤为人肺癌和/或人前列腺癌和/或人乳腺癌。
以上任一所述肿瘤为鼠肺癌和/或鼠前列腺癌和/或鼠乳腺癌。
以上任一所述肿瘤细胞为肺癌细胞和/或前列腺癌细胞和/或乳腺癌细胞。
以上任一所述肿瘤细胞为人肺癌细胞和/或人前列腺癌细胞和/或人乳腺癌细胞。
以上任一所述肿瘤细胞为鼠肺癌细胞和/或鼠前列腺癌细胞和/或鼠乳腺癌细胞。
所述肺癌细胞具体可为肺癌细胞系LLC。
所述前列腺癌细胞具体可为前列腺癌细胞系RM1。
所述乳腺癌细胞具体可为髓样乳腺癌细胞系E0771。
本发明通过构建CTRP6基因功能缺失小鼠模型，研究CTRP6基因缺失对于肿瘤生长的影响。结果表明，CTRP6基因缺失能够抑制肿瘤生长。本发明以生物技术的手段，在肿瘤治疗方面提供一定的理论依据，CTRP6基因(或蛋白)可以作为肿瘤治疗的药物靶点。
附图说明
图1为小鼠肿瘤模式图。
图2为小鼠形态和肿瘤组织形态图。
图3为小鼠体重、肿瘤大小、进食量、瘤体比和脏器指数。
图4为ELISA检测小鼠血清中TNFα含量。
图5为流式细胞术检测CTRP6缺失对小鼠肿瘤组织外周血淋巴细胞亚群的影响(CD4+和CD8+)。
图6为小鼠肿瘤组织HE切片。
图7为实时定量PCR小鼠肿瘤组织癌基因相关表达。
图8为实时定量PCR检测小鼠肿瘤、脾、胸腺和淋巴结组织炎症相关基因表达。
图9为CTRP6-siRNA的LLC细胞中肿瘤相关基因及炎症基因的表达。
图10为Edu染色检测细胞增殖分析。
图11为小鼠模型PCR鉴定结果。
图12为siRNA抑制效果检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
小鼠肺癌细胞系LLC、小鼠前列腺癌细胞系RM1和小鼠髓样乳腺癌细胞系E0771均购自上海子实生物科技有限公司。
实施例1、CTRP6基因功能缺失小鼠模型的构建
本实验委托苏州大学-剑桥基因组中心构建CTRP6基因功能缺失的小鼠模型(CTRP6基因在NCBI的登录号为XM_006521455.4，敲除策略为KO First，完整构建过程由苏州大学-剑桥基因组中心完成)，主要流程为：以C57BL/6N小鼠为材料，获得杂合子CTRP6+/-小鼠。将获得的杂合子CTRP6+/-小鼠进行交配繁殖后获得CTRP6-/-小鼠。CTRP6-/-小鼠即为CTRP6基因功能缺失的小鼠模型。经检测，CTRP6-/-小鼠发生CTRP6基因功能缺失，CTRP6蛋白活性无。
CTRP6-/-小鼠鉴定方法如下：提取小鼠尾尖组织基因组DNA，以基因组DNA为模板，分别采用引物对1(产物大小为301bp)和引物对2(产物大小为420bp)进行PCR扩增并将扩增产物通过电泳进行检测。
引物对1-F：5’-TCCTTTCAATGTCCAGGTGCTTT-3’；
引物对1-R：5’-GCACCATAGGAGATGTCAGGAGC-3’；
引物对2-F：5’-TCCTTTCAATGTCCAGGTGCTTT-3’；
引物对2-R：5’-CCACAACGGGTTCTTCTGTTAGTC-3’。
如果PCR扩增产物中含有420bp的DNA片段且不含有301bp的片段，则说明该小鼠为CTRP6基因功能缺失的纯合小鼠(CTRP6-/-小鼠)；如果PCR扩增产物中含有420bp的DNA片段且含有301bp的片段，则说明该小鼠为杂合小鼠(CTRP6+/-)；如果PCR扩增产物中含有301bp的DNA片段且不含有420bp的片段，则说明该小鼠为野生型小鼠。示例检测结果见图11。
实施例2、荷瘤小鼠模型的构建及CTRP6基因功能验证
荷瘤小鼠模型的构建流程示意图见图1。
一、肺癌荷瘤小鼠模型的构建
1、采用DMEM高糖培养基(10％血清+1％双抗)培养肺癌细胞系LLC至细胞数目满足实验需求，然后在无菌条件下用胰酶消化肿瘤细胞，1000rpm离心5min，弃上清，用生理盐水/PBS溶液溶解细胞沉淀，制成细胞悬液，将细胞浓度调整至107个/ml。
2、选取雄性4周龄的CTRP6-/-小鼠(KO)10只，将小鼠背部毛剔除，每只小鼠两后肢中间背部皮下注射0.2ml步骤1制备的细胞悬液。同时选取雄性4周龄的C57BL/6J小鼠(WT)，将小鼠背部毛剔除，每只小鼠两后肢中间背部皮下注射0.2ml步骤1制备的细胞悬液。
3、步骤2注射后第3天开始每隔一天定期测量体重、粮重及肿瘤大小，当肿瘤生长至20mm×20mm时，即小鼠注射后第21d时进行解剖。
在此期间WT和KO各有1只死亡。
二、前列腺癌荷瘤小鼠模型的构建
1、采用DMEM高糖培养基(10％血清+1％双抗)培养前列腺癌细胞系RM1至细胞数目满足实验需求，然后在无菌条件下用胰酶消化肿瘤细胞，1000rpm离心5min，弃上清，用生理盐水/PBS溶液溶解细胞沉淀，制成细胞悬液，将细胞浓度调整至107个/ml。
2、选取雄性4周龄的CTRP6-/-小鼠(KO)10只，将小鼠背部毛剔除，每只小鼠两后肢中间背部皮下注射0.2ml步骤1制备的细胞悬液。同时选取雄性4周龄的C57BL/6J小鼠(WT)，将小鼠背部毛剔除，每只小鼠两后肢中间背部皮下注射0.2ml步骤1制备的细胞悬液。
3、步骤2注射后第3天开始每隔一天定期测量体重、粮重及肿瘤大小，当肿瘤生长至20mm×20mm时，即小鼠注射后第21d时进行解剖。
在此期间WT和KO各有1只死亡。
三、乳腺癌荷瘤小鼠模型的构建
1、采用DMEM高糖培养基(10％血清+1％双抗)培养乳腺癌细胞系E0771至细胞数目满足实验需求，然后在无菌条件下用胰酶消化肿瘤细胞，1000rpm离心5min，弃上清，用生理盐水/PBS溶液溶解细胞沉淀，制成细胞悬液，将细胞浓度调整至107个/ml。
2、选取雌性4周龄的CTRP6-/-小鼠(KO)10只，将小鼠背部毛剔除，每只小鼠两后肢中间背部皮下注射0.2ml步骤1制备的细胞悬液。同时选取雌性4周龄的C57BL/6J小鼠(WT)，将小鼠背部毛剔除，每只小鼠两后肢中间背部皮下注射0.2ml步骤1制备的细胞悬液。
3、步骤2注射后第3天开始每隔一天定期测量体重、粮重及肿瘤大小，当肿瘤生长至20mm×20mm时，即小鼠注射后第31d时进行解剖。
四、各组小鼠成瘤及基本情况观察
各组小鼠形态及肿瘤形态观察结果见图2。结果显示，CTRP6缺失(KO)小鼠体型和肿瘤明显小于野生型(WT)小鼠。其中，CTRP6缺失对于肺癌小鼠模型肿瘤的抑制程度更高。
各组小鼠各阶段体重、粮重、肿瘤大小测量及解剖后瘤体和各器官观察结果见图3。结果显示，KO小鼠的体重和肿瘤体积明显小于WT小鼠(p<0.05)，其中雄鼠的差异比雌鼠更显著(图3A、3B)。KO小鼠的进食量略低于WT小鼠，但差异不显著(p>0.05)，每只小鼠的日均采食量3～4g(图3C)。KO小鼠肿瘤组织的瘤体比显著小于WT小鼠(p<0.01)(图3D)，进一步测量肝、脾、肺组织质量发现，KO小鼠的肝、脾、肺脏器指数均低于WT小鼠(p<0.05)(图3E)。结果表明，CTRP6缺失可以抑制肿瘤小鼠肝、脾、肺肿大。其中，CTRP6缺失抑制肝肿大的效果在LLC(肺癌)和E0771(乳腺癌)中更明显，CTRP6缺失抑制脾肿大的效果在LLC(肺癌)和RM1(前列腺癌)中更明显，CTRP6缺失抑制肺肿大的效果在RM1(前列腺癌)中更明显。
五、ELISA检测小鼠血清中TNFα的含量
1、各组小鼠于解剖前进行眼球取血，将血液置于4℃过夜，然后3500rpm，4℃离心10min，取上清，得到待检测样品。
2、取ELISA板，分别加入步骤1得到的待测样品或标准品50μl、生物素抗原50μl，37℃反应30min；洗板5次，加入50μl亲和素-HRP，37℃反应30min；洗板5次，加入显色液A、B各50μl，37℃避光显色10min；最后加入50μl终止液终止反应，在450nm处测各孔OD值。通过标准曲线回归方程计算出各样品的TNFα含量。
检测所使用试剂及标准品来自ELISA检测试剂盒，试剂盒购自南京建成生物有限公司，货号H052。
结果如图4所示。结果显示，KO小鼠在3种肿瘤模型小鼠血清中TNF-α的含量均略低于WT小鼠，但差异不显著(p>0.05)。
六、流式细胞术检测肿瘤组织中CD4+和CD8+细胞的表达
1、将乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤完整剥离，放入6孔板中，用PBS溶液将其洗净后，用研磨棒将组织置于70目筛网中研磨过滤，将过滤的组织转移至离心管中，1500rpm离心5min，弃上清，加入PBS润洗，1500rpm离心5min，弃上清，再加入适量PBS制成细胞悬液，取出100μl进行稀释计数。
2、根据计数结果，取200μl细胞悬液用PBS溶液定容至1ml置于；1.5ml离心管中，500g离心5min，弃上清，加入800μl Staining Buffer混匀沉淀，500g离心5min，使每个样品细胞数为106左右。
3、向每个样品中加入50μl流式抗体(CD4+、CD8+)(现配现用)，并设置空白、单染以及双染。然后4℃避光静置25min，直接加入1ml Staining Buffer，500g离心5min，弃上清，最后加入800μl Staining Buffer混匀沉淀，置于流式细胞仪上检测。
CD4+抗体：eBioscience货号：11-0041-82；
CD8+抗体：eBioscience货号：12-0061-82。
结果如图5所示。结果显示，KO小鼠在E0771肿瘤模型小鼠肿瘤组织中CD4+T淋巴细胞和CD4+-CD8+T淋巴细胞数目均高于WT小鼠，因而推测KO小鼠肿瘤组织中T淋巴细胞分泌增多，进而导致机体免疫力增强。
七、肿瘤组织HE染色检测
分别取三种肿瘤小鼠的部分肿瘤组织置于福尔马林溶液中固定一周后，进行HE染色并观察。
结果如图6所示。结果显示，WT小鼠的肿瘤组织切片具有双核、多核或异形核等病理性核分裂，且核体积稍大，核质比约1:1～1:2，核染色深。而KO小鼠只有部分病理性核分裂，核体积及核质比略低于WT小鼠。
八、实时定量RCR测定
各组小鼠解剖后分别取肿瘤、脾、胸腺、淋巴结组织，用Trizol法提取总RNA，并反转录为cDNA。以cDNA为模板，通过实时定量RCR扩增检测肿瘤组织的癌基因、抑癌基因、生长因子及趋化因子的表达丰度(检测引物见表1)。
结果如图7和图8所示。图7结果显示，KO小鼠在LLC肿瘤模型小鼠中的癌基因、生长因子和趋化因子中的表达量显著低于WT小鼠(p<0.05)，抑癌基因的表达量显著高于WT小鼠(p<0.05)，并且KO小鼠在RM1和E0771肿瘤模型小鼠肿瘤组织中的表达趋势一致，部但有分基因差异不显著。图8结果显示，KO小鼠在炎症基因(TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-2)的mRNA表达量显著低于WT小鼠(p<0.05)，抑炎基因(IL-10、TGF-β1、IL-4)的表达量显著高于WT小鼠，其中KO小鼠在RM1肿瘤小鼠模型中胸腺和淋巴结的表达量于WT小鼠差异不显著。
表1
Figure BDA0002392315630000091
Figure BDA0002392315630000101
实施例3、细胞实验及CTRP6基因功能验证
1、针对CTRP6基因设计若干特异siRNA，其中3组特异siRNA信息如下：
siRNA1：
正义链：5'-GCUGUUCGACAGGGUCUUU-3'(序列表的序列1)；
反义链：5'-CGACAAGCUGUCCCAGAAA-3'(序列表的序列2)。
siRNA2：
正义链：5'-GCUCGUGCCAGACACAUUA-3'(序列表的序列3)；
反义链：5'-CGAGCACGGUCUGUGUAAU-3'(序列表的序列4)。
siRNA3：
正义链：5'-GGACCUGAUGUCCUCUGAU-3'(序列表的序列5)；
反义链：5'-CCUGGACUACAGGAGACUA-3'(序列表的序列6)。
设计Scramble对照siRNA，信息如下：
正义链：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3'；
反义链：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3'。
2、培养肺癌细胞LLC至细胞密度为70～80％，分别加入3组特异siRNA(终浓度为20μM)，继续培养，待细胞长满后用Trizol收集细胞进行实时定量PCR检测CTRP6的表达情况，CTRP6检测引物如下：F:5'-GGTTCCTCTGGGCAGTATTCC-3'；
R:5'-TCGGGGTCACAGCATCGTC-3'。设置不添加CTRP6-siRNA的对照组和添加Scramble对照siRNA的对照组。
结果如图12所示。结果显示，siRNA干扰LLC细胞后，CTRP6的表达量显著降低，siRNA1、siRNA2和siRNA3展现不同的抑制效率，其中siRNA1抑制效率最高，为88.1％，siRNA2和siRNA3的抑制效率分别为26.8％和13.4％。
因此将siRNA1设为最佳CTRP6-siRNA用于后续实验。
3、培养肺癌细胞LLC至细胞密度为70～80％，加入CTRP6-siRNA(终浓度为20μM)继续培养，待细胞长满后用Trizol收集细胞进行实时定量PCR检测癌基因以及炎症基因的表达情况(检测引物见表1)。设置不添加CTRP6-siRNA的对照组和添加Scramble对照siRNA的对照组。
结果如图9所示，结果显示，CTRP6干扰LLC细胞后，细胞癌基因的表达量显著降低(p<0.05)，而抑癌基因和炎症基因的mRNA表达丰度无显著差异。
将CTRP6干扰的LLC肿瘤细胞进行Edu增殖检测，在试验中，细胞被Edu标记(蓝色)可用于检测新生成的细胞数量，同时用Hoechest染料对所有细胞核进行染色(红色)，将Edu标记与Hoechest标记进行重叠则可算出新生细胞的比例，结果表明，CTRP6-siRNA处理组细胞的增殖能力显著低于对照组(p<0.05)(图10)。
序列表
<110> 嘉兴学院
<120> CTRP6基因缺失在抑制肿瘤生长中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcuguucgac agggucuuu 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgacaagcug ucccagaaa 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcucgugcca gacacauua 19
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgagcacggu cuguguaau 19
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggaccugaug uccucugau 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccuggacuac aggagacua 19

Claims (3)

1.如下（A）或（B）在制备抗肿瘤药物中的应用：
（A）用于沉默或抑制CTRP6基因的表达或引发CTRP6基因功能缺失的物质；
（B）用于降低CTRP6蛋白丰度和/或活性的物质；
所述肿瘤为前列腺癌和/或髓样乳腺癌。
2.siRNA1或siRNA2或siRNA3在制备抗肿瘤药物中的应用；所述肿瘤为前列腺癌和/或髓样乳腺癌；
siRNA1由正义链和反义链组成；所述正义链如序列表的序列1所示；所述反义链由序列表的序列2所示；
siRNA2由正义链和反义链组成；所述正义链如序列表的序列3所示；所述反义链由序列表的序列4所示；
siRNA3由正义链和反义链组成；所述正义链如序列表的序列5所示；所述反义链由序列表的序列6所示。
3.如下（A）或（B）在制备产品中的应用：
（A）用于沉默或抑制CTRP6基因的表达或引发CTRP6基因功能缺失的物质；
（B）用于降低CTRP6蛋白丰度和/或活性的物质；
所述产品的用途为如下（a1）-（a3）中的至少一种：
（a1）抑制肿瘤生长；
（a2）抑制肿瘤细胞增殖；
（a3）缓解肿瘤导致的器官肿大；
所述肿瘤为前列腺癌和/或髓样乳腺癌；
所述肿瘤细胞为前列腺癌细胞和/或髓样乳腺癌细胞。
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