CN112370527B - Dnajc19基因作为靶点在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种DNAJC19基因作为靶点在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。该药物为抑制DNAJC19基因表达的药物，该药物包括作为活性成分的抑制DNAJC19基因表达的抑制剂，以及该抑制剂在药学上可接受的辅助成分；抑制剂为shRNA、siRNA、dsRNA、miRNA、cDNA、反义RNA/DNA、低分子化合物、肽和抗体等中的至少一种。本发明发现了DNAJC19/HSPA9/AKT1信号通路参与NSCLC细胞的增殖和迁移，并验证了通过抑制DNAJC19的表达能够有效的降低非小细胞肺癌侵袭、迁移和生长能力，大大减弱了肿瘤细胞的生长和转移，使DNAJC19成为NSCLC患者的治疗靶标。

Description

DNAJC19基因作为靶点在制备治疗非小细胞肺癌药物中的 应用

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种DNAJC19基因作为靶点在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。

背景技术

非小细胞肺癌(NSCLC)是全球癌症发病率最高的。随着复杂的手术和放射治疗方式的应用，特别是包括酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)和程序性死亡-1/程序性死亡配体1(PD-1/PD-L1)抑制剂，NSCLC患者的总体生存率一直在提高。然而，大多数肺癌患者的特点是预后差，生存率低，因为疾病进展如转移或复发。需要更深入地了解NSCLC的生物学特性以提高对肿瘤细胞的治疗功效。

DNAJC19作为酵母Pam18/Tim14(yPam18)的同源蛋白，是线粒体内膜线粒体蛋白输入机制的一个组成部分，由该基因编码，并参与转运蛋白从内细胞膜到ATP的ATP依赖性转运。在线粒体基质中，DNAJC19蛋白与线粒体抑制复合物相互作用，后者通过干扰磷脂稳态导致线线粒体嵴改变而破坏线粒体的功能完整性。另外，DNAJC19突变可能会发生一些临床特征，包括整体发育迟缓，共济失调，扩张型心肌病，隐睾症甚至尿道下裂。

众所周知，线粒体功能障碍作为肿瘤细胞的常见表型被认为归因于许多癌症的发展和进展。这增加了DNAJC19的过表达或突变导致肿瘤发生，肿瘤发展，进展，治疗抗性甚至预后的可能性。然而，缺乏相关的临床数据来显示DNAJC19的这种功能，因此，肺癌调节的潜在机制仍远未阐明。

如今，我们发现更多驱动癌基因如表皮生长因子受体(EGFR)或编码受体酪氨酸激酶间变性淋巴瘤激酶(ALK)，ROS原癌基因1(ROS1)的基因重排，并在转染过程中重新排列(RET)在NSCLC患者中，已被进化用作新的靶向治疗。然而，近8～40％的驱动癌基因在NSCLC中仍然未知。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种DNAJC19基因作为靶点在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用，通过敲除或抑制DANJC19基因的表达，能够有效的降低非小细胞肺癌侵袭、迁移和生长能力，大大减弱了肿瘤细胞的生长和转移，为NSCLC患者提供治疗靶标。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

DNAJC19基因作为靶点在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用，该药物为抑制DNAJC19基因表达的药物。

进一步地，该药物包括作为活性成分的抑制DNAJC19基因表达的抑制剂，以及该抑制剂在药学上可接受的辅助成分。

进一步地，抑制DNAJC19基因表达的抑制剂为shRNA、siRNA、dsRNA、miRNA、cDNA、反义RNA/DNA、低分子化合物、肽和抗体等中的至少一种。

进一步地，抑制DNAJC19基因表达的抑制剂为shRNA。

进一步地，shRNA靶序列为：TTTGCAGGCCGTTACGTTT；控制序列为：TTCTCCGAACGTGTCACGT。

进一步地，药物为抑制非小细胞肺癌迁移、侵袭和/或生长的药物。

进一步地，药物通过抑制DNAJC19基因的表达来调节HSPA9/AKT1信号通路，抑制非小细胞肺癌迁移、侵袭和/或生长。

DNAJC19基因作为标志物在制备非小细胞肺癌检测和/或疗效评价试剂中的应用。

一种抗非小细胞肺癌联合药物，包括上述药物，以及与其联用的化疗药物。

进一步地，化疗药物为顺铂。

DNAJC19基因作为标志物在制备非小细胞肺癌对化疗药物顺铂的敏感性和/或预后评价试剂中的应用。

一种非小细胞肺癌检测和/或疗效评价用试剂盒，包括检测DNAJC19基因表达量的引物。

本发明的有益效果为：

通过敲除或抑制DANJC19基因的表达，能够有效的降低非小细胞肺癌侵袭、迁移和生长能力，并发现了DNAJC19/HSPA9/AKT1信号通路参与NSCLC细胞的增殖和迁移。通过抑制DNAJC19的表达，能调节HSPA9和AKT1之间的表达和相互作用，大大减弱了肿瘤细胞的生长和转移，使DNAJC19成为NSCLC患者的治疗靶标。

附图说明

图1为DNAJC19基因在不同组织中的表达量检测；

图2为构建表达针对人DNAJC19基因的小发夹RNA的重组慢病毒载体；

图3为shRNA抑制DNAJC19对NSCLC肿瘤细胞的体外生长，存活力和迁移能力的影响；

图4为DNAJC19对AKT1表达的影响；

图5为DNAJC19对HSPA9/AKT1信号通路的影响；

图6为DNAJC19对小鼠体内异种移植瘤生长和肿瘤转移的影响。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1人体样本和细胞培养

在成都医学院附属第一医院通过手术收集了39例NSCLC患者的人体标本。表1总结了患者的特征。人体样本的收集和使用已获得伦理审查委员会的批准。

表1 NSCLC患者临床病理特征与DNAJC19的相关性

人肺癌细胞系A549和NCI-H1299获自美国典型培养物保藏中心(美国马萨萨斯州马纳萨斯)，并在补充有10％热灭活的FBS的RPMI1640培养基(康宁)中培养(澳大利亚)。将细胞在5％CO₂/95％空气加湿培养箱中维持在37℃。

实施例2方法

1、细胞转染

使用慢病毒(上海基因化学有限公司)进行细胞转染。DNAJC19，AKT1和MYC表达载体以及DNAJC19的shRNA均购自Genechem Co.(中国上海)。DNAJC19 shRNA靶序列如下：TTTGCAGGCCGTTACGTTT，控制序列为TTCTCCGAACGTGTCACGT。

2、Celigo，MTT和流式细胞仪分析

将指示的细胞以2,000个细胞/孔的密度种植在96孔板(Corning)中。细胞接种24小时后，使用Celigo(Nexcelom)每天计数细胞数，持续5天。将指示的细胞以2,000个细胞/孔的密度种植在96孔板中。使用MTT方法分别评估了细胞接种后24、48、72、96和120小时的细胞活力(中国上海迪果)。再使用Annexin V-APC试剂盒(eBioscience)，通过流式细胞仪分析检测凋亡细胞。

3、RNA提取和qRT-PCR

使用Trizol试剂(上海普飞生物技术有限公司)提取总RNA。逆转录(RT)和PCR分别使用高容量cDNA逆转录试剂盒和QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒(Qiagen)进行。

引物序列(上海基因化学有限公司)如下：

DNAJC19-F：5′-ACAAAACGGGAAGCAGCATTA-3′；

DNAJC19-R：5'-AGGAGATCCTCCTTTGTCAGG-3'；

GAPDH-F：5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'；

GAPDH-R：5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'。

4、细胞迁移测定

细胞迁移通过Transwell(孔径为8μm；Corning)进行。具体过程为：将悬浮在无血清培养基中的A549和NCI-H1299细胞接种到上腔室中，并在下腔室中分别填充具有30％FBS的RPMI-1640。在37℃下孵育16小时后，将细胞固定并染色。使用倒置显微镜(CKX41，奥林巴斯，日本)对迁移的细胞数进行计数。

5、免疫印迹，免疫组化和免疫细胞化学测定

进行蛋白质印迹，免疫组化(IHC)和免疫细胞化学(ICC)。针对DNAJC19，AKT1，MYC，GAPDH和HSPA9的抗体购自Abcam(美国马萨诸塞州剑桥市)。

6、免疫沉淀

使用免疫沉淀技术检测了HSPA9和AKT1之间的相互作用。处理24小时后，将A549细胞在预冷的细胞裂解缓冲液中裂解5分钟。裂解液在4℃下用20μL Proteins A/G(Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.)预净化45分钟，然后在4℃下与HSPA9抗体偶联过夜。免疫沉淀后，添加蛋白G在4℃下孵育3小时，然后用裂解缓冲液洗涤5次以除去所有未沉淀的蛋白，然后在SDS缓冲液中煮沸5分钟。使用蛋白质印迹分析分析洗脱液中沉淀的HSPA9或AKT1蛋白。以正常的IgG抗体用作对照。

7、动物实验

使用6周大的Balb/c雌性裸鼠进行动物实验。将1×10⁷个DNAJC19-knockdown的A549细胞或阴性对照A549细胞悬浮在100μL磷酸盐缓冲盐水中，并皮下注射到异种移植模型的每只小鼠中，每组有10只小鼠。杀死小鼠后，解剖异种移植肿瘤，然后称重。然后将样品切成两部分，一是石蜡包埋，另一是保留液氮。

对于肿瘤转移模型，通过尾静脉给小鼠注射DNAJC19-nockdown或阴性对照的A549细胞(2×10⁶)(每组n＝5)。32天后，使用用于小动物的活成像系统(Lumina LT，PerkinElmer)评估转移瘤。在扫描期间用异氟烷麻醉动物。

8、统计

数据表示为平均值±标准偏差(SD)。使用单向方差分析(ANOVA)和Tukey的多重比较程序来比较多个组。P﹤0.05的值被认为具有统计学意义。该测定至少独立地进行了三次。

实施例3 DNAJC19在NSCLC肿瘤组织中高表达

首先，我们使用MEXPRESS数据库分析了NSCLC患者DNAJC19表达与临床特征之间的关系。DNAJC19在原发性肿瘤中的表达比在实体正常组织中更高(图1A)。然后，我们使用免疫组化方法研究了39例NSCLC患者中DNAJC19的表达。不出所料，与癌旁组织相比，癌组织中DNAJC19明显过表达(图1B和表1)。此外，DNAJC19在不同情况下也不相同(图1C)。接下来，我们分析了DNAJC19表达与临床病理特征之间的相关性。如表1所示，在DNAJC19的低表达和高表达之间，除了组织外，在性别，年龄，T分期，N分期和肿瘤类型等临床参数上差异不显着。此外，我们使用Kaplan-Meier方法进行了生存分析。低水平的DNAJC19与无进展生存期而非总生存期增加有关。这些数据表明DNAJC19较高，在NSCLC患者中可能预后不良。

实施例4 shRNA抑制DNAJC19会降低NSCLC肿瘤细胞的体外生长，存活力和迁移能力

根据临床数据，发现DNAJC19过表达可能暗示NSCLC患者的预后不良。因此，进行了体外实验，以研究DNAJC19蛋白是否以及如何在肺癌细胞中发挥作用，具体过程如下。

首先，评估了DNAJC19在不同肺癌细胞中的mRNA表达。如图2A所示，DNAJC19的mRNA水平不同，但在A549、95-D，NCI-H1975和NCI-H1299中通常较高。在这些研究中，我们使用两条细胞系(包括最低水平的A549和水平相对较高的NCI-H1299)进行DNAJC19 mRNA表达以进行以下研究方案。

我们通过BLOCK-iT^TM RNAi Designer(http://rnaidesigner.lifetechnologies .com/rnaiexpress/des ign.do)提供的在线工具设计了DNAJC19的shRNA(GeneBank登录号NM_145261)。靶序列为：TTTGCAGGCCGTTACGTTT和控制序列为：TTCTCCGAACGTGTCACGT分别由上海杰纳瑞生物技术有限公司合成。寡核苷酸退火后，我们通过应用线性化载体GV115(上海基因化工有限公司)成功构建了表达针对人DNAJC19基因的小发夹RNA的重组慢病毒载体(图2B，C和D)。接下来，我们用Lv-shRNA DNAJC19或对照shRNA处理A549和NCI-H1299(图2E和F)，以研究细胞的生长，活力和迁移。

在图3A中，在第4天和第5天，分别通过A549或NCI-H1299中的Celigo测定，Lv-shRNA组的细胞生长明显比shRNA对照组的细胞生长受到抑制(图3A)。

与shRNA对照组相比，Lv-shRNA组在第4天和第5天通过MTT分别在A549或NCI-H1299中显着降低了细胞活力(图3B)。

我们还发现，分别通过在A549或NCI-H1299中进行迁移和侵袭试验，Lv-shRNA组的迁移和侵袭受到了显着抑制，而在shRNA对照组中却受到了抑制(图3C和D)。

A549细胞中对照和shRNA的相对抑制率分别为100.0％和43.0％，在NCI-H1299细胞中分别为100.0％和49.0％(图3C和D)。表明DNAJC19的抑制可降低shRNA治疗肺癌的细胞生长，活力迁移和侵袭。

实施例5

1、AKT1参与DNAJC19信号传导的调控

DNAJC19蛋白在生物学上负责细胞增殖。因此，我们进行了Western分析以解剖相关的蛋白质组，包括A549细胞中的m-TOR，MMP2，CDH2，p38，NFkB-P65，连环蛋白，ERK1/2，MYC和AKT1。我们发现MYC和AKT1的蛋白质水平显着下降(图4A)。

接下来，在用shRNA敲低DNAJC19后，我们进行了MYC(OE1表示Lv-MYC)或AKT1(OE2表示Lv-AKT1)的过表达，以通过Celigo分析观察A549肺癌细胞的细胞生长。如图4B所示，与单独的DNAJC19 shRNA抑制组相比，当将DNAJC19 shRNA与Lv-MYC处理组合时，A549细胞的生长几乎不受影响。显着地，在DNAJC19 shRNA处理后，当施用Lv-AKT1时，A549肺癌细胞的生长能力在很大程度上得以恢复(图4B)。这些数据提示AKT1可能受肺癌细胞中DNAJC19信号通路的调节。然后，我们通过MTT分析进一步测试了细胞活力，并用DNAJC19的shRNA处理过的A549细胞中的迁移。如所预期的，与仅DNAJ19治疗组的shRNA相比，DNAJC19 shRNA加Lv-AKT1组的A549生存力明显增强(图4C)。与单独的shRNA DNAJC19组相比，shRNA DNJC19与Lv-AKT1的联合组在A549细胞系中的迁移能力也得到了明显的挽救，然后得到了提升(图4D和E)。表明AKT1可能参与了用DNAJC19 shRNA处理的A549肺癌细胞的分子事件。

2、DNAJC19通过HSPA9蛋白调节NSCLC A549细胞中的AKT1

众所周知，DNAJC19属于线粒体蛋白，而AKT1是一种核蛋白，DNAJC19如何调节AKT1？首先使用STRING预测蛋白质之间的相互作用，我们发现HSPA9可能在DNAJC19和AKT1之间起桥梁作用(图5A)。我们评估了shRNA DNAJC19在A549细胞中的表达后HSPA9转录和翻译的表达水平。蛋白质印迹结果表明，在shRNA敲除组中，细胞质或细胞核中DNAJC19的表达明显高于shRNA对照组(图5B)，这也与ICC数据一致(图5C)。基于上述数据，AKT1的表达降低可能受益于对A549细胞中shRNA DNAJC19的处理而引起的HSPA9表达增加的负调控。接下来，我们使用免疫沉淀来研究HSPA9和AKT1之间的分子相互作用。当添加AKT1抗体时，我们没有看到与HSPA9的沉淀反应(图5D)。因此，我们预测HSPA9通过影响表达而不是将NSCLCA549细胞中的AKT1蛋白结合在一起，从而在DNAJC19和AKT1之间起到桥梁的作用

3、DNAJC19在小鼠体内异种移植瘤生长和肿瘤转移中具有积极作用

DANJC19可以通过体外调节HSPA9/AKT1来促进肺肿瘤细胞的增殖，迁移和侵袭，使得DNAJC19可能成为抗肿瘤的新的靶标。因此，我们使用A549细胞处理Lv-shRNA-DNAJC19或Lv-shControl-DNAJC19进行体内动物模型。在异种移植小鼠模型中，与Lv阴性对照RNAi组(NC组)相比，Lv-shRNA组(KD组)明显抑制了异种移植物的肿瘤生长(图6A和B)，肿瘤重量(P<0.001)(图6C)或第21、25、27天(P<0.001)和第23天29(P<0.0001)时的肿瘤体积(图6D)。此外，在转移肿瘤模型中，与Lv阴性对照RNAi组相比，Lv-shRNA组(KD组)不仅观察到较少的转移性疾病，而且观察到发生转移的小鼠更少(80％，4/5)(NC组)(图6E)。表明shRNA抑制DNAJC19能够抑制肿瘤生长和肿瘤转移，也说明了DNAJC19在小鼠体内异种移植瘤的生长和体内肿瘤转移中起积极作用，使得DNAJC19能够作为NSCLC中另一种潜在抗癌靶点。

Claims (3)

1.DNAJC19基因抑制剂在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用，其特征在于，所述药物为抑制DNAJC19基因表达的药物；所述药物中抑制DNAJC19基因表达的成分为shRNA；所述shRNA的靶序列为：TTTGCAGGCCGTTACGTTT；控制序列为：TTCTCCGAACGTGTCACGT。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为抑制非小细胞肺癌迁移、侵袭和/或生长的药物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物通过抑制DNAJC19基因的表达来调节HSPA9 / AKT1信号通路，抑制非小细胞肺癌迁移、侵袭和/或生长。

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