KR20170048002A - 암 치료 또는 예방용 약학적 조성물 및 이의 스크리닝 방법 - Google Patents

Abstract

Diva 유전자의 발현을 저해하는 물질을 유효성분으로 포함하는 암 치료 또는 예방용 약학적 조성물, Diva 유전자의 mRNA 또는 그의 단백질의 발현 수준 측정을 통한 암 치료용 물질을 스크리닝하는 방법, 암 진단용 조성물 및 개체의 암 발병을 진단하는 방법을 제공한다. 이에 따르면 암의 치료, 암 치료제의 스크리닝, 및 개체에서 암을 진단하는데 이용할 수 있다.

Description

암 치료 또는 예방용 약학적 조성물 및 이의 스크리닝 방법 {Pharmaceutical compositions for treating or preventing cancer and method for screening the same}

Diva의 발현을 저해하는 물질을 유효성분으로 포함하는 암 치료 또는 예방용 약학적 조성물, Diva의 발현 수준 측정을 통한 암 치료용 물질을 스크리닝하는 방법, Diva에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 암 진단용 조성물 및 이를 이용한 암 진단 방법에 관한 것이다.

암(cancer)은 세포가 정상적으로 분화되지 않고 성장이 조절되지 않으며, 주위 조직이나 멀리 떨어져 있는 조직으로 퍼져나가는 악성 종양을 말한다. 암은 크게 3가지로 분류되는데, 1) 상피세포에서 유래된 암종(carcinoma), 2) 결합조직과 근육에서 유래된 육종(sarcoma), 3) 신경조직에서 유래된 교종(glioma)이 있다.

현재 암치료를 위해 다양한 치료법이 개발 중이며, 그 중에서 표적 분자를 확인하고 표적 분자의 기능을 특이적으로 교란할 수 있는 암 치료법에 많은 관심이 집중되고 있다. 표적 치료기술은 암세포에만 특이적으로 작용하여 세포 사멸을 일으키고, 동시에 주변의 정상세포에는 영향을 주지 않도록 설계하는 것이 주된 목적이다. 표적지향 항암제는 일반적으로 기초적인 세포 기능의 복잡한 네트워크를 형성하는 세포 신호전달 체계와 연관된 단백질에 초점을 맞추고 있으며, 고전적인 화학요법이나 방사선 요법과 같은 치료법에 비하여 우수한 효과를 나타낸다.

특히 오로라 키나제(Aurora kinase)는 암세포의 성장과 확산의 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있어, 표적 지향 항암제의 중요한 타겟 중 하나이다. 오로라 키나제는 세포의 유사분열 단계에서 염색체의 정렬, 분리 및 세포질의 이동 등 광범위하게 세포 분열을 조절하는 세린/쓰레오닌 키나제 (serine/threonine kinase)이며, 3가지 종류 (오로라 A, 오로라 B, 오로라 C)로 분류된다. 실제로 오로라 A 및 오로라 B의 경우, 이들을 표적으로 하는 많은 선택적 억제제들이 현재 임상 진행 중이다. 그러나 오로라 키나제 A 항암제의 부작용으로 골수억제, 호중구감소증, 백혈구감소증, 점막염, 빈혈증 등이 보고되고 있으며, 또한, 임상 시험 중에 있는 오로라 키나제 A 억제제도 다른 다양한 종류의 키나제와 교차 반응이 존재해 세포 독성이 존재하는 것으로 알려져 있다. 따라서 이러한 부작용 없이 선택적으로 오로라 키나제가 관여하는 생물학적 기전을 억제할 수 있는 표적 항암제의 개발이 지속적으로 요구되는 실정이다.

일 양상은 암을 예방 또는 치료하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.

다른 양상은 암 치료용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

일 양상은 Diva 유전자의 발현 또는 Diva 단백질의 활성을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 암 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "Diva"는 다양한 세포 활동에 관여하는 항-에이팝토틱(anti-apoptotic) 또는 프로-에이팝토틱(pro-apoptotic) 조절제의 활성을 갖는 Bcl-2 패밀리에 속하는 단백질을 의미하며, "Bcl2l10" 또는 "Boo(Bcl-2 homology of ovary)"라고도 명명된다. Diva는 조직에 따라 항-에이팝토틱 또는 프로-에이팝토틱의 각각 다른 성질을 갖는 것으로 보고되었다.

본 발명의 실시예에 따르면, Diva 유전자가 오로라 키나제 A의 상위 유전자이자 새로운 발암유전자(oncogene)로서 발암기전에 관여할 수 있다. 따라서 암세포에서 Diva 유전자의 발현을 억제하는 물질 또는 Diva 단백질의 활성을 억제하는 물질은 암의 치료 및 예방에 효과적일 것임을 알 수 있다. Diva 유전자가 발암 기전에 관여한다는 것은 지금까지 전혀 알려지지 않았으며, 본 발명자가 최초로 제시하였다.

용어 "Diva 유전자의 발현 또는 Diva 단백질의 활성을 억제하는 물질"은 Diva 유전자 또는 Diva 단백질의 기능을 저해 또는 방해하는 물질을 의미한다. 이와 같은 저해 또는 방해는 Diva 유전자의 전사를 방해하거나, 또는 Diva 유전자의 mRNA의 번역을 저해함으로써 이루어질 수 있다. 또는 Diva 단백질의 활성 부위에 특이적으로 결합하거나, 단백질 구조 변형을 일으킴으로써, Diva 단백질의 활성을 감소 또는 불활성화시킬 수 있다. Diva 유전자의 발현 또는 Diva 단백질의 활성을 억제하는 물질은 Diva 유전자의 발현 또는 Diva 단백질의 활성을 감소 또는 방해하는 물질이라면, 화합물, 단백질, 아미노산, 펩티드, 바이러스, 탄수화물, 지질, 핵산 등 제한 없이 사용 가능하다.

상기 Diva 유전자의 발현을 억제하는 물질은 상기 mRNA의 번역을 억제하는 물질로서 저분자 화합물, 안티센스 핵산 서열의 제조나 RNAi 테크닉을 이용한 RNA, siRNA 또는 shRNA 등을 이용하는 것일 수 있다. 또한 상기 Diva 유전자의 발현을 억제시키는 물질은 상기 Diva 유전자의 전사를 조절한다고 알려져 있는 프로모터, 인핸서(enhancer), 또는 전사조절인자에 결합하는 단백질 또는 화합물을 이용하는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 물질은 Diva 유전자 또는 그의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA), 두 가닥 RNA (double strand RNA) 및 마이크로 RNA(miRNA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 또한, 구체적으로 Diva 단백질을 코딩하는 핵산에 대해 안티센스인 뉴클레오티드 분자를 저해제로 사용할 수 있다. '안티센스' 핵산은 Diva를 코딩하는 '센스' 핵산에 상보적인, 예를 들면 두 가닥 사슬 cDNA 분자의 코딩 가닥에 상보적이거나 mRNA 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 안티센스 핵산은 전체 Diva 코딩 가닥 또는 단지 그들의 일부(예: 코딩영역)에 상보적일 수 있다. 또한 상기 물질은 구체적으로 Diva 유전자의 mRNA를 타겟으로 하는 dsRNA, miRNA 또는 siRNA일 수 있으며, 더욱 구체적으로 서열번호 1의 서열을 갖는 siRNA 또는 서열번호 2의 서열을 갖는 dsRNA일 수 있다.

Diva 단백질의 활성을 억제하는 물질은 예를 들면 Diva 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 그의 항원 결합 특성을 갖는 항체 단편 및 그의 결합 활성을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 또한 상기 물질은 Diva 단백질에 상보적으로 결합하는 앱타머, 화합물, 펩티드, 또는 펩티드 미메틱스를 포함할 수 있다.

상기 항체는 Diva의 주입을 통해 제조된 것 또는 시판되어 구입한 것 모두 사용 가능하다. 또한, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프와 결합할 수 있는 단편 등을 포함할 수 있다. 다클론 항체는 상기 Diva를 동물에 주사하고 해당 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고, 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 만들어질 수 있다. 또한 상기 단클론 항체 또는 에피토프와 결합할 수 있는 단편 모두 당해 기술 분야에서 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물이 치료 또는 예방할 수 있는 암은, 예를 들면 갑상선암, 림프종, 위암, 간암, 결장암, 신장암, 난소암, 및 직장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 또한 상기 암은 구체적으로 난소암일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 Diva의 발현을 억제시킴으로써, 오로라 키나제 A 및/또는 Tpx2의 발현을 억제시키는 것일 수 있다.

일 구체예에서 약학적 조성물은, 상기 기재한 활성성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 경피내 또는 경구를 통해 투여될 수 있다. 달리, 상기 약제는 경구 투여 또는 표적 기관에 직접적으로 투여될 수 있다. 투여량은 환자의 연령, 건강상태 및 체중, 병행치료의 종류, 치료의 빈도 및 원하는 효과의 성질 등에 비추어 결정될 수 있다. 또한, 치료되는 질환, 부위-특이적 치료의 필요성, 투여되는 약물의 양과 같은 조건들을 고려하여 전신적 또는 국소적으로 투여할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 임의의 약학적 제형을 가질 수 있다. 예를 들면, 정제, 캡슐, 환제, 분말, 서방성 제형, 용액, 또는 현탁액으로서의 경구 투여에 적합한 형태이거나, 멸균 용액, 현탁액 또는 유화액으로서의 비경구 주사에 적합한 형태이거나, 연고 또는 크림으로서의 국소 투여에 적합한 형태이거나, 또는 좌제로서의 직장 투여에 적합한 형태일 수 있다. 상기 조성물은 정제, 환제, 주사제, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 정확한 투여량을 단일 투여하기에 적합한 단위 투여형일 수 있다.

상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.

본 발명에 따른 약학적 조성물을 제공하거나 약학적 조성물을 이용하여 암의 치료를 수행함에 있어서, 상기 약학적 조성물은 단독으로 또는 조합하여, 또는 다른 치료제 또는 진단제와 조합하여 사용할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 일반적으로 허용되는 의학적 관행에 따라 의도된 질환에 대해 전형적으로 처방되는 다른 약제와 동시 투여될 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은 일반적으로 포유동물, 예를 들면, 인간의 생체내(in vivo)에서 이용될 수 있다.

다른 양상은 암 세포와 후보 물질을 인큐베이션하는 단계; 상기 암 세포에서 Diva 유전자의 mRNA 또는 그의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 Diva 유전자의 mRNA 또는 그의 단백질의 발현 수준이 대조군에 비해 유의하게 감소한 경우 상기 후보 물질을 암 치료용 물질인 것으로 결정하는 단계를 포함하는, 암 치료용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 스크리닝 방법에 있어서, 상기 암은 갑상선암, 림프종, 위암, 간암, 결장암, 신장암, 난소암, 및 직장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 구체적으로는 난소암일 수 있다.

또한 상기 암세포는 인간을 포함하는 동물로부터 유래하는 것일 수 있다. 예를 들면 인간을 포함하는 포유류로부터 유래하는 것일 수 있으며, 구체적으로는 마우스, 원숭이 또는 인간으로부터 유래하는 것일 수 있다. 가장 구체적으로는 상기 암세포는 인간으로부터 유래한 것일 수 있다.

또한 본 스크리닝 방법에서 상기 암세포 대신 Diva를 발현하도록 형질전환된 세포를 이용할 수 있다. 상기 세포는 Diva를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 발현 벡터가 도입된 것일 수 있다. 상기 발현 벡터는 예를 들면 바이러스 발현 벡터, 포유류 발현 벡터, 곤충 발현 벡터, 효모 발현 벡터 또는 박테리아 발현 벡터 등을 이용할 수 있다.

상기 후보 물질, 예를 들면, 피검 화합물 또는 피검 조성물은 저분자 화합물, 항체, 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 두 가닥 RNA (double strand RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA), 핵산, 단백질, 펩티드, 기타 추출물 또는 천연물을 포함할 수 있다.

본 스크리닝 방법에 있어서, 상기 인큐베이션 단계는 암 세포와 후보 물질을 접촉시켜 후보물질이 암 세포 내로 들어가 Diva 유전자 또는 단백질의 활성을 억제하는 시간을 허용함으로써 수행될 수 있다. 또한, 상기 접촉 및/또는 인큐베이션은 시험관 내(in vitro)에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 인큐베이션 단계는 예를 들면, 암 세포에 약물 후보물질을 가하는 단계 및/또는 약물 후보물질이 처리된 암세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 Diva 유전자의 mRNA 발현 수준의 측정은 예를 들면 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응, 실시간 역전사 중합효소반응, RNase 보호 분석법(RPA), 노던 블롯팅 및 DNA 칩(Microarray) 혹은 RNA-seq.(RNA sequencing) 분석 등 기재된 방법 중 선택된 1개 이상에 의해 수행될 수 있다.

상기 Diva 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블랏, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군 등 기재된 방법 중 선택된 1개 이상에 의해 수행될 수 있다.

일 실시예에서, Diva 단백질이 정상세포보다 난소암을 비롯한 갑상선암, 위암, 간암, 대장암, 직장암, 및 신장암 등의 암세포주에서 높게 발현하는 것을 확인하였다. 따라서 Diva 유전자의 mRNA 또는 Diva 단백질의 발현 수준의 측정 및 대조군과의 비교를 통해, 암 치료용 물질을 선발할 수 있다. 상기 대조군은 후보물질이 처리 또는 인큐베이션되지 않은 암세포일 수 있다.

또 다른 양상은 Diva 유전자의 mRNA 또는 Diva 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.

상기 Diva에 관해서는 상기한 바와 같다.

용어 "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 진단은 개체에서 암의 발병 여부를 확인하는 것으로 해석될 수 있다.

용어 "유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제"란, 시료에 포함된 표적 유전자의 발현 여부를 확인하기 위하여, 상기 표적 유전자로부터 전사된 mRNA의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미한다.

상기 Diva 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 예를 들면 Diva 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다.

용어 "단백질의 수준을 측정하는 제제"란, 시료에 포함된 표적 단백질의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미한다. 상기 Diva 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 예를 들면 Diva 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 항원 결합 단편, 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 다양한 암 조직에서 Diva가 더 높은 수준으로 발현됨을 확인하였으며 (도 2), Diva의 발현 정도에 따라 또한 발암유전자로 알려진 오로라 키나제 A의 발현이 변화하는 것을 확인하였으므로, Diva 단백질을 다양한 암의 진행을 예측할 수 있는 조직학적 마커로서 사용할 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 진단용 조성물은 Diva 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하기 위한 제제뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다.

상기 조성물에서 언급된 용어 또는 요소 중 청구된 조성물 및 방법에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 청구된 조성물 및 방법에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.

또 다른 양상은 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 Diva 유전자의 mRNA 또는 그의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준보다 유의하게 높을 경우, 상기 개체가 암이 발병한 것으로 예측 또는 진단하는 단계를 포함하는 암의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

상기 Diva에 관해서는 상기한 바와 같다.

본 발명의 암의 진단을 위한 정보 제공 방법은 상기 진단용 조성물을 이용할 수 있다. 구체적으로 상기 진단용 조성물을 이용하여 Diva 유전자의 mRNA 또는 그의 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있다.

상기 mRNA 발현 수준의 측정은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩(Microarray) 혹은 RNA-seq. 분석 등 기재된 방법 중 선택된 1개 이상에 의해 수행되며, 상기 단백질의 발현 수준의 측정은 웨스턴 블랏, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군 등 기재된 방법 중 선택된 1개 이상에 의해 수행될 수 있다.

상기 진단의 대상이 되는 개체는 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 사람, 마우스(mouse), 쥐(rat), 소, 염소, 돼지, 말, 양, 개, 고양이, 또는 그 조합일 수 있다.

상기 생물학적 시료는 개체로부터 얻어지는 모든 시료, 예컨대, 세포, 조직, 오줌, 타액, 혈액, 혈장 또는 혈청 시료를 의미한다. 구체적으로 암세포인 것으로 의심되는 세포를 포함하는 것일 수 있다.

상기 진단 정보 제공 방법에 따르면, 개체의 시료 및 정상 대조군의 Diva 단백질의 발현량을 비교함으로써 개체에서 암의 발병을 진단할 수 있다. 구체적으로는, 암이 의심되는 환자의 시료와 정상 대조군의 Diva의 mRNA 또는 단백질의 발현량을 측정하고 비교하여, 개체의 시료에서 Diva의 mRNA 또는 단백질의 발현양이 더 증가하는 정도에 따라 암의 발병 여부 및 그 정도를 측정할 수 있다.

상기 방법에서 언급된 용어 또는 요소 중 청구된 조성물 및 방법에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 청구된 조성물 및 방법에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.

본 발명에 따라 Diva를 선택적으로 저해하면, 암세포에 높게 발현하는 Diva의 억제가 이루어짐에 따라 이를 통해 하위에 있는 Aurora A를 동시에 저해함으로써 암 치료에 있어서 시너지 효과를 기대할 수 있다. 또한, Diva의 발현이 다양한 종류의 암에서 발현을 하고 있기 때문에 본 발명은 다양한 종류의 암을 치료할 수 있는 효과를 가지며, 다양한 암에 대한 치료제를 효율적으로 스크리닝할 수 있다.

도 1은 난자의 성숙 과정 동안 Diva의 발현이 감소하면 하위 유전자인 Tpx2와 Aurora A의 단백질 발현이 감소되는 것을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 조직 마이크로어레이(Tissue microarray)를 통해 여러 인간의 암 조직에서 Diva가 발현하는 것을 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 정상 세포의 노던 블롯 결과로, 정상세포에는 Diva가 발현하지 않는 다는 것을 보여준다.
도 4는 난소암 세포주인 SKOV3에서 Diva의 발현을 감소시켰을 때 오로라 A가 감소되는 것을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과를 보여준다.
도 5은 정상세포주인 NIH3T3에서 Diva를 과발현 시켰을 때 일어나는 Tpx2와 Aurora A의 단백질 발현 증가를 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과를 보여준다.

이하 본 발명을 실시 예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시 예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 난자에서의 Diva 발현 감소에 의한 관련 유전자들의 감소 효과

난자 내 Diva의 발현을 감소시킬 경우, Tpx2와 오로라 A의 단백질 발현이 영향을 받는지 확인하기 위해, 난자에 Diva 유전자에 대한 dsRNA를 주입한 후 Tpx2와 오로라 A의 발현량을 확인하였다.

1.1. 생쥐의 난자 회수

생후 3주령된 C57BL/6 생쥐에 pregnant mare's serum gonadotropin (PMSG, Folligon, Intervet) 5 IU/ml를 주사하여 44~48시간째에 생쥐를 도살하고 난소만을 떼어냈다. 난자의 성숙을 억제하는 0.2 mM IBMX (I7018, Sigma)가 첨가된 M2 배양액에 난소를 모은 후 인슐린 주사기를 이용하여 난소를 터뜨려 GV 난자-난구 세포 복합체 (cumulus-enclosed oocyte complexes, COCs)를 모았다. 난자 크기에 맞는 미세유리관 파이펫을 통해 난자 주위에 둘러 쌓여있는 난구세포를 물리적으로 제거하여 난자만을 얻었다.

1.2. Diva dsRNA 준비와 난자로의 미세주입

생쥐 난소로부터 Trizol을 이용하여 전체 RNA를 추출하고, MMLV 역전사효소 (Promega)로 역전사(Reverse transcription) 반응을 수행하였다. 합성된 cDNA를 가지고 Diva primer를 이용해 PCR을 수행하였다. 사용한 정방향, 역방향 프라이머 서열은 각각 'CTCTGTGACTAGGCAGATCC (서열번호 3)', 'GTCTCTAGGCTGGAGGACTT (서열번호 4)'이다. PCR 반응 조건은 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초로 35 주기를 수행하였다. Diva의 증폭산물을 pGEM T-easy 벡터에 삽입하고 DH5α 컴피턴트 세포에 형질 전환시켜 다량의 재조합 된 클론을 얻은 후, 삽입된 유전자가 안티센스 또는 센스로 삽입되었는지를 PCR을 통해 확인하였다. in vitro 전사(transcription)를 위해 T7 프로모터로 반응할 수 있게 원형 벡터를 SpeI 제한효소를 사용하여 선형화시키고, MEGAscript RNAi Kit의 T7 RNA 폴리머라제를 이용하여 안티센스 RNA와 센스 RNA를 각각 합성하였다. 이렇게 합성된 상보적인 두 가닥의 RNA를 섞어 75℃에서 5분간 반응한 후 실온에서 서서히 식혀, 이중가닥 RNA (dsRNA)를 합성하였다. dsRNA 시료 내에 남아있는 단일 가닥 RNA를 제거하기 위해 1㎍/mL RNase A 를 첨가해 37℃에서 30분 처리하였다. 페놀-클로로포름 추출법으로 dsRNA를 준비하였고 최종 농도가 3㎍/ul 가 되도록 Tris-EDTA 버퍼로 희석하였다. 이에 따라 최종 산물로서 551 bp의 dsRNA를 수득하였다. 합성된 dsRNA의 안티센스 RNA 가닥은 서열번호 2의 서열을 갖는다.

constant-flow system을 사용하여 생쥐의 GV 난자의 세포질에 합성된 dsRNA를 10 pl씩 미세주입 후, Diva의 발현을 충분히 억제하기 위해 8시간 동안 배양하였다. Diva의 발현이 억제되었을 때, 난자의 성숙 정도를 확인해야 하기 때문에 이 단계에서 난자의 성숙이 일어나지 않아야 한다. 따라서 본 연구진은 0.2mM 3-이소부틸-1-메틸-잔틴 (IBMX)가 포함된 M16 배지를 사용하여 난자의 성숙을 억제하고 GV 단계가 유지되도록 하였다. 그 후, GV 난자가 Metaphase II 단계까지 성숙될 수 있도록 IBMX가 포함되지 않은 M16 배지에서 추가로 16시간을 배양하였다. Diva RNAi에 의한 결과가 오로지 Diva dsRNA에 의한 특이적인 영향인지 확인하기 위해 Diva dsRNA와 동일한 크기의 GFP dsRNA를 합성하여 같은 조건으로 미세주입, 배양하여 허위 대조군 (sham control)으로 사용하였다.

대조군 난자의 경우, M16 배지에서 16시간 배양하였을 때 정상적으로 제1극체가 방출되는 Metaphase II 단계까지 성숙하였으나, Diva dsRNA를 미세주입한 난자는 극체가 방출하지 않고 Metaphase I 단계에서 성숙이 멈추는 현상을 관찰하였다.

1.3. Diva 발현이 억제된 난자에서의 오로라 A와 Tpx2 의 단백질 발현량 비교

Diva의 발현을 감소시킬 경우, 실제로 Tpx2와 오로라 A의 단백질 발현이 영향을 받는지 확인하기 위해, 난자에 Diva 유전자에 대한 dsRNA를 주입한 후 Tpx2와 오로라 A의 발현량을 확인하였다.

아무 처리도 하지 않은 난자와 GFP dsRNA를 미세주입한 난자, Diva dsRNA를 미세주입한 난자를 각각 200개씩 사용하여 단백질을 추출하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.

각 그룹의 난자를 RIPA 버퍼를 이용하여 단백질을 추출한 뒤 10% SDS-PAGE 겔 상에 전기 영동한 후 폴리비닐디플루오라이드 (PVDF) 멤브레인에 transfer 하였다. 이를 5% 탈지분유를 포함한 TBS-T (20 mM Tris, 137 mM NaCl, 0.1% Tween 20; pH 7.6) 완충용액과 1시간 동안 반응시킨 후 Diva, 오로라 A, Tpx2 항체로 4℃에서 밤새 반응시켰다. 이후에 호스라디시 페록시다제가 부착된 이차항체와 실온에서 1시간 동안 처리하여 Enhanced chemiluminescence (ECL) 을 사용하여 단백질 발현을 확인하였다.

도 1은 난자의 성숙 과정 동안 Diva의 발현이 감소하면 하위 유전자인 Tpx2와 오로라 A의 단백질 발현이 감소되는 것을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과를 나타낸다.

도 1에서 나타난 바와 같이, Diva RNAi를 통해 난자에서 Diva의 발현이 감소된 것을 확인할 수 있었으며, Tpx2와 오로라 A의 단백질의 발현이 함께 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 Tpx2와 오로라 A가 Diva의 하위 유전자임을 나타내는 것이다. 오로라 A는 대표적인 발암 유전자로서 이미 다양한 암 조직에서 과발현된다는 사실이 다수 보고된 바가 있고, 오로라 A의 억제제가 이미 항암제의 새로운 표적물질로서 개발 중에 있다. 따라서 Diva가 오로라 A의 상위 유전자라는 결과는 Diva 또한 암 세포 내에서 발암 기전에 참여할 것이라는 예측이 가능하다. 아직까지 이와 관련된 논문이 발표된 바가 없으므로 앞으로의 암과 관련된 Diva의 기능에 대한 보고는 암 치료를 위한 새로운 표적 물질의 발견이라는 점에서 의미가 크다고 할 수 있다.

실시예 2. 다양한 인간 암 조직에서의 Diva 발현 확인

인간의 암 조직에서 Diva의 발현을 확인하기 위해, 조직 마이크로어레이(tissue microarray)를 수행하였다.

각 암환자로부터 얻은 난소암, 갑상선암, 위암, 간암, 대장암, 직장암, 신장암 조직으로 구성 제작된 조직 마이크로어레이를 사용하여 단백질 발현을 확인하였다. 조직 마이크로어레이(tissue microarray, TMA)는 적출한 각 조직을 10% 포르말린으로 고정하여, 파라핀 블록(paraffin-embedded HCC(donor block)을 제작하였고, 파라핀 블록으로부터 중심조직 생검편(core tissue biopsy; 직경 2 ㎜)을 취하여 트리핀 장치(trephine apparatus; Superbiochips Laboratories, Korea)를 이용하여 수령(recipient) 파라핀 블록(조직 어레이 블록: tissue array block)에 배열하여 제작하였다.

상기 조직 어레이 블록을 이용하여 면역조직화학적 실험을 수행하였다. 구체적으로, 자일렌(xylene)을 처리하여 파라핀 제거 과정(Deparaffining)과 3% 과산화수소(hydrogen peroxide)가 포함된 메탄올 용액에 10분 간 처리하여 항원 회수 과정(antigenic retrieval processes)을 거친 다음, 슬라이드의 조직들을 BCL2L10 항체(1:100)로 라벨링하였으며, 라벨링된 Diva는 아비딘-바이오틴 복합체(avidin-biotin complex; ABC)법에 의해 분석하였다. 이때, 색소원으로는 3,3'-다이아미노벤지딘(3,3'-Diaminobenzidine, DAB)을 사용하였다. 발색 후 멸균된 3차 증류수로 세척하고 헤마톡실린(hematoxylin)으로 대조 염색(conter staining) 후 수용성 봉입제로 봉입하였다. 항체에 대한 음성대조군으로써 1차 항체를 넣지 않은 희석 버퍼(dilution buffer)를 사용하였으며, 조직영역에서 세포의 10% 이상이 균일하게 염색되면 양성으로 간주하였다.

도 2는 조직 마이크로어레이(Tissue microarray)를 통해 여러 인간의 암 조직에서 Diva가 발현하는 것을 확인한 결과를 나타낸다.

도 3은 노던 블롯 결과로서, 난소를 제외한 정상 세포에는 Diva가 발현되지 않는 것을 보여준다.

도 2에 나타난 바와 같이, Diva는 난소암을 비롯한 갑상선암, 위암, 간암, 대장암, 직장암, 및 신장암 등 거의 모든 암조직에서 높게 발현하였다. 한편 정상 세포에서 Diva는 관찰되지 않았다 (도 3). 따라서 이 결과는 Diva 또한 정상세포 보다 암 세포에서 높게 발현하는 발암 유전자의 특징을 갖는다는 것을 보여주는 결과라고 볼 수 있다.

실시예 3. 난소암 세포에서의 Diva 발현 감소 효과

난자를 사용한 실험 결과를 바탕으로 여러 암 조직 중 난소암 세포주에서 Diva의 발현을 감소시켰을 때, 하위 유전자로 예상되는 오로라 키나제 A의 발현이 감소되는지 확인하였다.

구체적으로 난소암 세포주 SKOV3를 ATCC (American Type Culture Collection; Manassas, VA)로부터 구입하였으며, ATCC에 의해 제시된 프로토콜에 의해 세포주들을 성장 배지에서 배양하였다. 또한 Diva의 발현을 억제하기 위해 GCAAAUGGCUCUUCCUUGA 서열을 이용하여 siRNA를 바이오니아(Bionner)에서 제조하였다. SKOV3 세포에 제조한 Diva siRNA는 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000)을 이용하여 100nM의 인간 Diva siRNA 도입하였다. 이후, Diva siRNA가 도입된 SKOV3 세포는 RPMI 1640 배양액으로 37℃, 5% CO2 배양기(incubator)에서 48시간 배양하였다.

Diva siRNA 도입으로 인한 단백질 발현 감소는 웨스턴 블롯팅을 이용하여 확인하였다. 분비된 세포에 단백질 분해액(lysis buffer)를 이용하여 단백질을 추출한 뒤 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에 전기영동 하였다. 이후, 폴리비닐덴디플루오리드막(PVDF membrane)에 transfer한 후 5% 탈지분유를 포함한 TBS-T 완충 용액과 1시간 동안 반응시킨다. BCL2L10 1차 항체로 4℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 후 호스라디시 페록시다제(HRP) 가 부착된 2차 항체를 실온에서 1시간 반응시킨 후 강화 화학발광체 (ECL; enhanced chemiluminescence) 방법을 이용하여 단백질 발현을 확인하였다.

도 4는 난소암 세포주인 SKOV3에서 Diva의 발현을 감소시켰을 때 오로라 A가 감소되는 것을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과를 보여주는 도면이다.

도 4에서 나타난 바와 같이, 암세포에서 높게 발현하는 Diva의 발현을 난소암 세포주인 SKOV3에서 감소시킨 결과, 난자에서와 마찬가지로 Diva와 오로라 A의 단백질 발현이 감소되는 것을 확인하였다. 이를 통해 Diva가 높게 발현하는 난자와 난소암 세포주인 SKOV3에서 Diva의 발현이 감소되면 Diva의 하위 유전자이면서, 현재 암치료제의 표적으로 이용되는 오로라 A의 발현이 감소되는 것을 확인하였다.

실시예 4. 섬유아세포에서의 Diva 발현 유도 효과

Diva의 발현이 전혀 없는 세포에서 Diva의 과발현에 의한 Tpx2와 오로라A의 발현 변화를 확인하기 위해, 정상적인 마우스의 섬유아세포를 준비하였다. 마우스 섬유아세포주인 NIH3T3를 ATCC (American Type Culture Collection; Manassas, VA)로부터 구입하였으며, ATCC에 의해 제시된 프로토콜에 의해 5% 송아지 혈청(bovine calf serum)과 페니실린이 포함된 DMEM 배지(GIBCO)에서 배양하였다. 상기 NIH3T3에서 Diva 유전자를 과발현시키기 위해 과발현 벡터를 제조하였다. 생쥐 Diva의 전체 서열을 pcDNA3.1(+) 벡터 (Invitrogen)에 도입하여 최종적으로 Diva 플라스미드 벡터를 제조하였다. 비교를 위해 pcDNA3.1(+) 벡터 DNA를 같은 방법으로 형질주입하여 대조군으로 사용하였다.

형질주입하기 24시간 전, 100mm 디쉬에 NIH3T3 세포를 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지에 접종한다. 24시간 후, DMEM 배지를 제거하고 혈청이 포함된 DMEM 배지로 교체하여 제조된 Diva 플라스미드 DNA를 형질주입하였다. 형질주입 후 24시간이 경과하면 배지를 제거한 후, PBS 버퍼로 3회 워싱하여 세포를 수거한다.

RIPA 버퍼로 단백질을 추출하여 EMAX로 농도를 측정하고, 그룹별로 각 50㎍의 단백질을 사용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 도 5는 정상세포주인 NIH3T3에서 Diva를 과발현시 일어나는 Tpx2와 오로라 A의 단백질 발현 증가를 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과를 보여준다. Mock은 대조군으로서 pcDNA3.1(+) 벡터 DNA를 형질주입한 세포를 의미하고, Diva OE는 Diva 플라스미드 DNA를 형질주입하여 Diva 단백질이 과발현된 세포를 의미한다.

도 5에서 나타난 바와 같이, 흥미롭게도 Diva의 발현이 전혀 없는 정상적인 생쥐 NIH3T3 섬유아세포에 Diva를 과발현하게 되면 Tpx2와 오로라 A의 단백질 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 이는 Diva 발현 감소 시에 야기되는 하위유전자의 발현 패턴과 정 반대의 결과로, 이를 통해 Diva에 의한 Tpx2와 오로라 A의 발현을 다시 한 번 확인할 수 있었다. 따라서 Diva가 암세포의 세포증식에 관여하는 Tpx2와 오로라 A의 발현 조절에 중요 요인(key factor)임을 알 수 있었다.

<110> College of Medicine Pochon CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Pharmaceutical compositions for treating or preventing cancer and method for screening the same <130> PN11235 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Diva siRNA <400> 1 gcaaauggcu cuuccuuga 19 <210> 2 <211> 551 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Diva dsRNA <400> 2 gucucuaggc uggaggacuu ccucaguucu uauccaauua cccagaauug uuccuuagag 60 gguucacagg uagguaggua agaucgcuuu aaaaauuuua aacuuauaaa cguuuccaga 120 uaaaaaagau ggcuguugca aagaagccug acagaaaagc cugaaucagc aaucuucucc 180 agaagccgag cgguaaagga uucuugaaga agcggcaaaa gccaucccag ccgccgagag 240 ccuccagccu ggcgcggugc cgacgcccca ugagcagauu auacagaaag uucacuauga 300 gacagcaguc ucgggucacu augacacgau uccccagauc ccucuucugc uugacagcca 360 uguaagggcc uugauucaua agcguccccg cgaaggccag gagcaucacc aguuggcucc 420 agcugaaguc uuggucuuug gagagcaacu uaucugccau cuguuucacc agcuccaggc 480 gauugccccg gcuuucgcag aaggaggaaa aaaauucuug gugcuccugc uggaucugcc 540 uagucacaga g 551 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Diva forward primer <400> 3 ctctgtgact aggcagatcc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Diva reverse primer <400> 4 gtctctaggc tggaggactt 20

Claims (15)

1. Diva 유전자의 발현 또는 Diva 단백질의 활성을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 암 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 Diva 유전자의 발현을 억제하는 물질은 Diva 유전자 또는 그의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA), 두 가닥 RNA (double strand RNA) 및 마이크로 RNA(miRNA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인 암 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
3. 청구항 2에 있어서, 상기 Diva 유전자 발현을 억제하는 물질은 Diva 유전자의 mRNA를 표적으로 하는 miRNA인 것인 암 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
4. 청구항 2에 있어서, 상기 Diva 유전자 발현을 억제하는 물질은 서열번호 1 의 siRNA 또는 서열번호 2의 dsRNA인 것인 암 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 단백질의 활성을 억제하는 물질은 Diva 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 그의 항원 결합 특성을 갖는 항체 단편 및 그의 결합 활성을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인 암 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
6. 청구항 1에 있어서, 상기 암은 갑상선암, 림프종, 위암, 간암, 결장암, 신장암, 난소암, 및 직장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인 암 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
7. 암 세포와 후보 물질을 인큐베이션하는 단계;
   상기 암 세포에서 Diva 유전자의 mRNA 또는 그의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
   상기 Diva 유전자의 mRNA 또는 그의 단백질의 발현 수준이 대조군에 비해 유의하게 감소한 경우, 상기 후보 물질을 암 치료용 물질인 것으로 결정하는 단계를 포함하는, 암 치료용 물질을 스크리닝하는 방법.
8. 청구항 7에 있어서, 상기 Diva 유전자의 mRNA 발현 수준의 측정은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응, 실시간 역전사 중합효소반응, RNase 보호 분석법(RPA), 노던 블롯팅 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상에 의해 수행되는 것인 암 치료용 물질을 스크리닝하는 방법.
9. 청구항 7에 있어서, 상기 Diva 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블랏, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상에 의해 수행되는 것인 암 치료용 물질을 스크리닝하는 방법.
10. 청구항 7에 있어서, 상기 암은 갑상선암, 림프종, 위암, 간암, 결장암, 신장암, 난소암, 및 직장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인 암 치료용 물질을 스크리닝하는 방법.
11. Diva 유전자의 mRNA 또는 Diva 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 진단용 조성물.
12. 청구항 11에 있어서, 상기 Diva 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 Diva 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것인 암 진단용 조성물.
13. 청구항 11에 있어서, 상기 Diva 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 Diva 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 항원 결합 단편, 또는 폴리펩티드를 포함하는 것인 암 진단용 조성물.
14. 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 Diva 유전자의 mRNA 또는 그의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준보다 유의하게 높을 경우, 상기 개체가 암이 발병한 것으로 예측 또는 진단하는 단계를 포함하는 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
15. 청구항 14에 있어서, 상기 mRNA 발현 수준의 측정은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상에 의해 수행되며, 상기 단백질의 발현 수준의 측정은 웨스턴 블랏, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상에 의해 수행되는 것인 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.

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