KR20100127028A - 신규한 ｇｐｃｒ 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 GPCR (G Protein Coupled Receptor) 단백질 및 이를 코딩하는 유전자에 관한 것으로서, 상기 단백질 및 유전자, 및 이들의 신규한 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는 신규한 GPCR 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포 및 형질전환 동물에 대한 것이다. 또한 본 발명은 상기 신규한 GPCR 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 마커 검출용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 암 진단용 키트, 및 신규한 GPCR 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 유전자를 검출하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 GPCR의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 포함하는 암 치료 및 예방용 조성물, 및 본 발명의 신규한 GPCR 조절자 또는 암 치료제의 스크리닝 방법에 대한 것이다.

GPCR, 발암 유전자, oncogene, 암, 진단, 스크리닝

Description

신규한 ＧＰＣＲ 단백질 및 이를 용도 {A NOVEL G PROTEIN COUPLED RECEPTOR AND A USE THEREOF}

본 발명은 신규한 GPCR 단백질 및 이를 코딩하는 유전자에 관한 것으로서, 상기 단백질 및 유전자, 및 이들의 신규한 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는 신규한 GPCR (G Protein Coupled Receptor) 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포 및 형질전환 동물에 대한 것이다. 또한 본 발명은 상기 신규한 GPCR 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 마커 검출용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 암 진단용 키트 및 신규한 GPCR 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 유전자를 검출하는 방법에 관한 것이며, 본 발명의 GPCR 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 억제하는 올리고뉴클레오티드 또는 본 발명의 GPCR 단백질의 활성을 억제하는 항체를 포함하는 암 치료 및 예방용 조성물, 및 본 발명의 신규한 GPCR 단백질 조절자 또는 암 치료제의 스크리닝 방법에 대한 것이다.

인간 세포에는 다수의 수용체 종류가 존재하며, 그 중 G-단백질 결합 수용체 (G-protein coupled receptor, 이하 "GPCR" 또는 "GPCRs"라 함)가 막에 결합된 수용체 중 가장 큰 부류이다. 사람 게놈 내에는 대략 30,000개의 유전자가 있는 것으로 추산되고, 이들 중에서도 약 1,000개의 유전자가 GPCRs를 암호화하는 것으로 알려져 있다. 최근 척추동물 유전체 연구를 바탕으로 이러한 GPCR을 5가지 부류로 구분하고 있는데, 첫번째는 로돕신 (Rhodopsin) 수용체과로 670여개의 수용체 단백질을 포함한다. 상기 로돕신 수용체과는 아민 (알파 그룹), 펩타이드 (베타그룹), 지질 유사 물질 (감마 그룹), 뉴클레오타이드, 당단백질 (델타그룹) 등 다양한 리간드를 가지며, 다량의 약물 타겟 수용체가 여기에 속한다. 두 번째는 세크리틴 수용체과로서 펩티드 호르몬 (peptide hormone)에 대한 결합 도메인을 가지고 있다. 이 부류의 수용체는 항상성 유지에 중요하여 약물개발의 중요한 타겟이 되고 있다. 세 번째는 유착 수용체과로, 이 과의 특징은 GPCR 단백질 분해 도메인(GPCR Proteolytic site, GPS)을 갖는다는 것이다. 이 GPCR군은 N-말단이 아주 다양하며 밝혀진 리간드가 매우 적어 약물개발이 이루어지고 있지 않은 부류이다. 네 번째는 글루타메이트 (Glutamate) 수용체과로 22개의 GPCR 이 밝혀져 있으며 각 단백질의 특이성 연구는 아직 미미한 수준이다. 마지막 부류는 The Frizzled/Taste2 과인데 Wnt 당단백질을 리간드로 하는 10개의 Frizzled와 리간드를 필요로 하지 않는 5개의 SMO (smoothened), 그리고 25개의 다양한 맛을 느끼는데 필요한 Taste2 부류의 수용체를 포함한다. 또 다른 분류 방법으로는, GPCRs를 포함하는 수용체에서, 내생 리간드가 확인된 공지된 수용체와 내생 리간드가 확인되지 않은 오르판(orphan) 수용체가 있다.

GPCRs는 다양한 범위의 조직 및 세포 유형에서 발견되고 많은 상이한 생리학적 기전과 연관이 있다. 그것들은 넓은 범위의 리간드, 예를 들어, 갑상선자극호르몬 (PTH), 부신피질자극호르몬, 글루카곤 및 바소프레신과 같은 호르몬 5-HT, 아세틸콜린(무스카린성 AchR), 히스타민 같은 아민류 LPA, S1P 같은 지질류 아미노산 및 Ca²⁺, 핵산, 펩티드, 빛 등과 같은 다양한 신호전달물질에 의해 활성화된다. GPCRs의 광범위한 분포와 다양한 역할은 GPCRs이 다양한 병리학적 질병에서 중요한 역할을 수행할 수 있음을 나타낸다. 실제, GPCRs은 기관지수축, 고혈압, 당뇨병, 염증, 호르몬 장애, 세포사멸, 암, 신경전달 촉진 및 행동 장애 등 여러가지 질병에 관련되어 있음이 밝혀져 있다. 따라서 현재 GPCRs는 제약 제품의 발달에 있어서 중요한 영역이다. 현재 약물 개발 가능 GPCR은 360여개 정도로 여겨지고 있고, 그 중 46개가 약물로 개발된 상태여서 나머지 320여개 유전자가 약물개발 가능 GPCRs이고, 오르판 GPCRs(orphan GPCRs, oGPCRs) 유전자군은 약 150종으로 추정된다. 신약개발 분야에서 약물의 선택적 작용점으로 세포막 수용체가 전체 타겟의 50%를 차지하고 (Nature Reviews Drug Discovery, 2004. 2008) 그 중에서도 GPCR 활성조절 의약품이 사용빈도 100대 의약품 중 30%를 차지하고 있어 (400억달러, 의약품 시장 9%) 이러한 GPCR이 신약개발의 가장 중요한 표적이다 (Nature Reviews Drug Discovery, 2004, 2008).

GPCRs는 공통된 구조적 특징을 공유한다. 이들 수용체 모두는 7개의 소수성 막통과 부위를 공유하고, 이들 각각은 20~30개의 아미노산 길이이며, 다양한 길이 의 친수성 아미노산 서열에 의해 연결된다. 수용체의 아미노 (amino) 말단은 세포 외에 존재하고, 카복시 (carboxyl) 말단은 세포의 원형질 내에서 발견된다. GTP-결합 단백질 (G 단백질)은 G 단백질 결합 수용체를 자극하는 호르몬과 각종 다른 화학적 리간드의 결합에 의해 생성된 신호를 세포내 작용자로 전달해 주는 매개자로서 작용한다. 리간드가 GPCR에 결합한 후에, 수용체의 세포질 부위는 수용체와 G 단백질의 상호작용을 가능하게 하는 형태적 변화를 일으키고, 이것은 다음 아데닐레이트 사이클라제 (adenylate cyclase), 포스포리파제 C (phospholipase C)또는 이온 채널 (ion channel)과 같은 세포 내 중개자의 활성을 가능하게 한다. 이런 시스템은 하나의 리간드가 GPCR에 결합하는 것에 반응하여 많은 2차 전달자가 생성될 수 있을 정도로 원래의 신호가 증폭되도록 한다. 이 기작을 통하여, 세포는 그들의 외부 환경의 변화를 탐지하고 그에 반응할 수 있다. 일반적으로, 내생 리간드가 수용체와 결합하여 활성화 되면, 구조적 변화가 수반되고 수용체와 G-단백질간의 결합이 가능하게 한다. 최근 몇 년간의 단백질간의 상호작용 연구를 통하여 GPCR 단백질이 기존에 알려진 G 단백질 뿐만 아니라 GRK 나 SH2 도메인 (src homology 2 domain)을 가진 단백질, 연결자 Grb2 (adaptor Grb2) 등 여러 가지 다양한 단백질과 결합하여 신호전달에 관여하고 있음이 밝혀지고 있다.

정상적인 환경 하에서는, 신호전달은 최종적으로는 세포 활성화 또는 세포 억제라는 결과를 가져온다. 생리적 환경하에서는, GPCRs은 세포막에서 비활성화와 활성화 상태의 평형 상태로 존재한다. 비활성화 상태의 수용체는 세포내의 신호전달 경로에 연계되어 생물학적 반응을 나타낼 수 없다. 활성화 상태로 수용체의 구 조가 변화하면 전달 경로에 연계되어 (G-단백질을 통해) 생물학적 반응을 나타내는 것이 가능하게 된다. 수용체는 내생 리간드 또는 약물과 같은 화합물에 의해 활성화 상태로 안정화될 수 있다. 따라서 이들 유전자 군의 확보 및 이들의 새로운 리간드를 밝히는 등의 기능 연구는 새로운 신약후보 즉, siRNA, 항체, 폴리펩타이드, 효능제, 역 효능제 및 길항제 등의 물질을 개발하는 것과 같은 의미를 가진다.

생명체에 있어서, 발생, 분화, 항상성, 자극에 대한 반응, 세포분역 주기 조절, 노화 및 아팝토시스와 같은 현상들은 대부분 세포 내에서 특정 유전자가 선택되어 발현된 결과로서 이루어지며, 이는 질환과 관련된 세포의 기작에 대해서도 적용된다. 특히 종양 발생과 같은 병리학적 현상은 유전자의 변이 과정으로 유발되어, 결국 유전자 발현의 변화를 유도하게 된다.

종양 발생에 대한 여러 연구결과들을 살펴보면, 특정 염색체 부위의 소실 (loss of chromosomal heterozygosity), 발암 유전자들의 활성화 및 p53 유전자를 포함한 다른 종양 억제 유전자들의 불활성화와 같은 여러 가지 유전적 변화가 종양 조직에 축적되어 종양을 발생시킨다고 보고되고 있다 (Bishop, J. M., Cell, 64:249-270 (1991)). 나아가 암의 10-30%는 발암 유전자의 증폭으로 인하여 발암 유전자가 활성화됨으로써 일어난다고 보고되고 있다. 따라서 발암 유전자의 활성화는 다양한 암의 병리학적 연구에 중요한 역할을 하며, 이러한 발암 유전자를 규명하고, 조절하는 방법을 개발하는 것이 시급히 요구되고 있다.

따라서 본 발명자들은 발암 유전자를 밝히기 위해 예의 노력한 결과, 오르판 GPCR로 추정되는 신규한 유전자를 동정해 내는 한편, 상기 폴리뉴클레오티드 및 이에 의해 코딩되는 유전자 및 단백질의 과발현이 암을 유발한다는 것을 밝혀내고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 구성되는 GPCR (G Protein Coupled Receptor) 폴리펩티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포를 대리모의 자궁에 착상시켜 수득한 형질전환 동물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 GPCR 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 마커 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 GPCR 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 유전자를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 GPCR 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 억제하는 올리고뉴클레오티드 또는 본 발명의 GPCR 단백질의 활성을 억제하는 항체를 포함하는 암 치료 및 예방용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 GPCR 단백질을 발현하는 세포에 후보 화합물을 처리하여, 상기 단백질의 GPCR-매개 시그날 전달 활성의 증가 또는 감소를 측정하는 것을 포함하는 본 발명의 GPCR 단백질 조절자 또는 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

따라서, 상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성되는 GPCR (G Protein Coupled Receptor) 폴리펩티드에 관한 것이다.

본 발명의 신규한 GPCR 폴리펩티드 (이하, "본 발명의 GPCR 폴리펩티드" 또는 "본 발명의 GPCR 단백질"이라 한다)는, 서열번호 1 또는 2로 구성되며, 상기 서열은 서열번호 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 5의 전사체로부터 코딩될 수 있다. 본 발명자들은 상기 폴리펩티드가 GPCR임을 규명하였고, 상기 폴리펩티드에 대한 3 개의 전사 변형체 (transcriptionial variant)가 존재하며, 두 개의 이소폼 (isoform)이 존재한다는 것을 규명하였다. 본 발명의 GPCR 폴리펩티드는, 그 발현량이 비정상적으로 높은 경우 암을 유발하는 것으로 나타났으며, 따라서 본 발명의 상기 폴리펩티드는 암 치료 또는 전이 억제용 타겟으로 사용될 수 있다.

바람직하게 본 발명의 GPCR 단백질은, 상기 폴리펩티드 전체 또는 일부에 대한 단편을 포함한다. 바람직하게 상기 단편은 적어도 10개, 20개, 30개 또는 40개 의 아미노산, 바람직하게는 50개 이상의 아미노산, 더욱 바람직하게는 75개 이상의 아미노산, 보다 더욱 바람직하게는 100개 이상, 가장 바람직하게는 150개 이상의 아미노산을 포함하는 단편일 수 있으며, 상기 단편 서열을 서열번호 3의 폴리펩티드 서열과 적어도 50% 이상, 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩티드 서열일 수 있다. 또한 바람직하게 본 발명의 GPCR 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 구성된 단백질이다. 이들은 사람의 정상 조직 내에서 다양한 발현량을 보이고, 이소폼 1 (isoform 1) 의 경우 고환과 폐에서 많은 양이 존재하며, 흉선, 골수, 이자 등에는 그 양이 줄어들고, 작은 창자, 심장, 전립선등에는 다른 조직과 비교하여 더 적은 양이 존재한다. (도 1B, 1C) isoform 2 의 경우 다른 조직에 비해, 고환, 이자, 작은 창자, 전립선에서 그 발현량이 많이 존재함을 알 수 있었다.

다른 하나의 양태로서 본 발명은 상기 GPCR 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

본 발명의 GPCR 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (이하 "본 발명의 GPCR 폴리뉴클레오티드", "본 발명의 GPCR 유전자"라 한다)는 인간 게놈에 존재하는 유전자로서, 본 발명자들에 의해 그 기능이 최초로 동정된 유전자이다. 상기 폴리뉴클레오티드는 인간 1번 염색체 (chromosome)의 1p36.13에 존재하며, 여러 개의 얼터너티브 전사체 (alternative transcript)를 가진다. 구체적인 전사체의 서열은 본 발명의 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 개시되어 있다. 본 발명의 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드는 cDNA 서열로서 해독되지 않는 영역을 포함하고, 가장 긴 전사체는 약 2279개의 뉴클레오티드 길이를 가지며, isoform 1은 약 30 kDa, isoform 2는 약 23 kDa 분자량의 단백질 (해독 후 변형물은 제외)을 코딩한다. isofrom 2는 isoform 1의 N-말단 65개의 아미노산이 결손되어 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 이러한 GPCR (G-protein coupled receptor) 기능을 수행하는 단백질을 생산할 수 있고, 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 생산된 단백질의 구체적인 기능은 현재까지 알려진 GPCR 부류에는 속하지 않는 오르판 GPCR (orphan GPCR)이며, 인간에 존재하는 수용체를 코딩하는 신규 유전자로, 상기 유전자가 코딩하는 GPCR은 PQ 모티프 (motif) (시스티노신 (cystinosin)을 라이소좀으로 이동시키는데 중요하다고 알려진 모티프)를 가지는 단백질로서 두 개의 이소폼 (isoform)을 코딩한다.

본 발명의 GPCR 폴리뉴클레오티드는, 본 발명의 신규한 GPCR 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 모든 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 이러한 서열은 코돈의 축퇴성 (degeneracy), 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩 영역으로부터 발현되는 폴리펩티드를 구성하는 아미노산을 변화시키지 않는 범위 내에서 다양한 변형이 이루어질 수 있음은 당업자에게 자명하다. 또한 코딩 영역을 제외한 부분에서도 상기 폴리뉴클레오티드의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 일어날 수 있으며, 이렇게 변형된 유전자 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 즉, 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 동일한, 또는 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 가지는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 일어난 서열을 모두 포함하며, 따라서 바람직하게는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 적어도 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 유전자를 포함한다.

또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 바람직하게 본 발명의 GPCR 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터를 제조할 수 있는데, 상기 제조된 재조합 벡터를 숙주 세포에 형질전환 (transformation) 또는 형질감염 (transfection) 시킬 수 있다.

또한 본 발명의 재조합 벡터는 본 발명의 유전자를 적당한 벡터에 연결 (삽입)하여 획득할 수 있다. 본 발명의 유전자가 삽입될 벡터는 그것이 숙주 안에서 복제될 수 있는 한 특별히 제한되지는 않는다. 예를 들어, 플라스미드 DNA, 파지 DNA 등이 사용될 수 있다. 플라스미드 DNA의 구체적인 예로는 pcDNA3.1+ (Invitrogen) 같은 상업적인 플라스미드를 포함하며, 그 밖에 pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUB110, pTP5, YEp13, YEp24, YCp50, Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, gt10, gt11, ZAP 등이 사용될 수 있고, 레트로바이러스 (retrovirus), 아데노바이러스 (adenovirus) 또는 백시니아 바이러스 (vaccinia virus)와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스 (baculovirus)와 같은 곤충 바이러스가 또한 사용될 수 있으나, 상기 예에 의해 본 발명에서 사용 가능한 플라스미드가 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명의 유전자를 벡터로 삽입하기 위해, 정제된 DNA를 적당한 제한효소로 절단하여 적당한 벡터 DNA의 제한 부위 또는 클로닝 부위에 삽입하는 방법이 사용될 수 있고, 본 발명의 유전자가 벡터에 작동가능하게 연결되기 위하여, 본 발명의 벡터는 프로모터 및 본 발명의 유전자 이외에 인핸서 (enhancer)와 같은 시스 요소 (cis element), 스플라이싱 시그널 (splicing signal), 폴리 A 추가 시그널 (poly A addition signal), 선택 마커 (selection marker), 라이보좀 결합 서열 (ribosome binding sequence, SD sequence) 등을 추가로 포함할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다.

상기와 같이 제조된 벡터는 형질전환 (또는 형질감염)을 통하여 숙주 세포 내로 도입될 수 있는데, 본 발명에서 사용되는 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있 다. 일반적으로 형질전환 방법에는 CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 방법에 DMSO (dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로 박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있다.

상기와 같은 벡터 및 이를 이용한 형질전환 감염을 통하여 본 발명의 GPCR 단백질을 코딩하는 유전자를 숙주세포 내로 도입시킬 수 있게 된다.

본 발명에서 사용 가능한 숙주세포는 본 발명의 유전자를 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지 않는다. 또한 본 발명의 발암 유전자를 이용하여 지속적으로 증식할 수 있는 암 세포주를 수립할 수 있음은 당업자에게 자명하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 NIH3T3 세포에 본 발명의 신규한 GPCR 유전자를 포함하는 벡터를 트랜스펙션 시킴으로써, 순간적으로 또는 안정적으로 본 발명의 GPCR 단백질을 과발현하는 세포주를 수립하였다.

또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포를 대리모의 자궁에 착상시켜 수득한 형질전환 동물에 관한 것이다.

본 발명의 "형질전환 동물"이란 외부에서 도입된 유전자인 신규한 GPCR 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 재조합에 의하여, 동물의 염색체 상에 인공적으로 삽입시킴으로써 그 형질의 일부가 변화된 동물을 의미하며, 이용 가능 한 동물의 예를 들면 마우스, 쥐, 토끼, 돼지 등과 같은 포유류 및 조류 등이 있으나, 상기 예에 의해 형질전환 가능한 동물의 종류가 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 GPCR 단백질을 코딩하는 폴리펩티드는 적어도 8 세포기 이전의 수정란 단계에서 도입되는 것이 바람직하다. 제조된 형질전환 동물은 상기 유전자를 발현하는 동물모델로 사용될 수 있는데, 예를 들면, 발암 유전자 또는 단백질의 발현을 조절, 촉진 또는 저해시키는 제제 또는 항암제를 스크리닝하기 위한 질환 모델로 유용하게 사용될 수 있다.

형질전환 동물을 제조하기 위한 동물 세포의 수정란을 제조하는 방법은 당업계에서 사용되는 통상적인 방법이 제한 없이 사용될 수 있으며, 그 예로, 미세주입법 (microinjection technique), 줄기세포 삽입법 (Stem cell insertion technique), 레트로바이러스를 이용하는 방법 (retrovirus insertion technique), 및 정자-매개 유전자 전이법 (sperm-mediated gene tranfer technique) 등이 사용될 수 있으나 상기 예들에 의해 본 발명의 형질전환된 수정란의 제조방법이 제한되는 것은 아니다.

또한 상기의 방법으로 형질전환된 수정란은 이를 대리모의 자궁에 착상시킴으로써 형질전환 동물을 수득할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서 본 발명은, 본 발명의 GPCR 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 마커 검출용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 암 세포 또는 암 질환을 가진 개체를 정상세포 또는 정상 개체와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 암을 가진 세포 또는 개체에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산 (예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 (단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 들을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 암 진단 마커는 정상 세포 또는 조직의 세포에 비하여, 암 세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이는 신규한 GPCR 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.

본 발명에서 "mRNA 발현수준 측정"이란 암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 암 마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA 의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR (Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 "단백질 발현수준 측정"이란 암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서의 암 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA (enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석 (RIA: Radioimmunoassay), 방사면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩 (protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 본 발명의 GPCR 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편에 대한 프라이머 (primer) 쌍, 프로브 (probe), 또는 안티센스 뉴클레오티드 (anti-sense nucleotide)이며, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 당업자가 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 뉴클레오티드 서열을 용이하게 디자인 할 수 있다. 바람직하게 본 발명에서 사용 가능한 프라이머는 서열번호 8 및 서열번호 9에 개시된 프라이머 서열로 구성될 수 있다.

본 발명에서 용어, "프라이머 (primer)"는 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3'hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트 (template)와 염기쌍 (base pair)를 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명에서는 GPCR 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 암을 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 하여 적절하게 변형할 수 있다.

본 발명에서 용어, "프로브 (probe)" 란 mRAN와 특이적 결합을 이룰 수 있는, 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 라벨링 (labeling) 되어 있어 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오타이드 (oligonucleotide) 프로브, 단일 사슬 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중 사슬 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는, 본 발명의 GPCR 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 암 질환의 발병 여부를 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

상기 프라이머 또는 프로브는 8개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직하며, 하이브리드화 방법은 본 발명의 GPCR 폴리뉴클레오티드에 상기 프라이머 또는 프로브를 노출 또는 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 바람직하게 이들 서열은, 비특이적 결합을 최소화 하도록 적절히 조절된 조건에서 혼성화 되며, 예를 들면 약 80% 내지 90%의 동일한 서열의 검출을 위한 적절한 조건은, 0.25M Na₂HPO₄, pH 7.2, 6.5% SDS, 10% 덱스트란 설페이트 내, 42 에서 밤새 (overnight) 혼성화시키고, 0.1xSSC, 0.1% SDS 내, 55에서 최종 세척하는 것을 포함한다. 또한 약 90% 이상의 동일한 서열의 검출을 위한 적절한 조건은 0.25M Na₂HPO₄, pH 7.2, 6.5% SDS, 10% 덱스트란 설페이트 내, 65에서 밤새 혼성화시키고, 0.1xSSC, 0.1% SDS 내, 60에서 최종 세척하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 GPCR 단백질 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 항체이다. 본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 GPCR 폴리펩티드에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현 벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩 되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개의 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 이러한 본 발명의 GPCR 단백질에 대한 항체는 당업계의 공지된 방법으로 제조될 수 있는 모든 항체를 포함하며, 바람직하게 항체를 생산하기 위한 펩티드 서열은 서열번호 6 또는 7로 제시되어 있다.

본 발명의 암 진단 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태 뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

본 발명의 용어 "암 (cancer)"이란 세포의 사멸 조절과 관련된 질병으로서, 정상적인 아팝토시스 균형이 깨지는 경우 세포가 과다 증식하게 됨으로써 생기는 질병을 일컫는다. 이러한 비정상적 과다 증식 세포들은, 경우에 따라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴를 형성하고, 체내의 정상적인 구조를 파괴하거나 변형시키게 되는데, 이러한 상태를 암이라고 한다. 일반적으로 종양 (tumor)이라 하면 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자란 덩어리를 의미하며, 양성 종양 (benign tumor)과 악성 종양 (malignant)으로 구분할 수 있다. 악성 종양은 양성 종양에 비해 성장속도가 매우 빠르고, 주변 조직에 침윤하면서 전이 (metastasis)가 일어나 생명을 위협하게 된다. 이러한 악성 종양을 통상적으로 '암 (cancer)'이라하며, 암의 종류로는 뇌척수종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 중프종, 식 도암, 취암, 대장암, 간암, 위암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 대장암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 및 피부암을 포함하나, 상기 예들에 의해 암의 종류가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 암 마커 검출용 조성물은 상기 암 의 진단을 위한 마커로 이용될 수 있으며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 위암, 대장암 및 간암 세포, 및 이들 암을 가진 개체를 대상으로 본 발명의 신규한 GPCR 단백질의 발현을 관찰한 결과, 정상 세포 및 정상 개체인 대조군에 비해 그 발현량이 현저하게 증가함을 확인하였다.

전이성 암이란, 암의 성질을 구분하는 용어로서, 처음 발생한 종양의 부위에서 혈관, 림프관을 통하여 다른 부위로 전이하여 생간 암종을 의미한다. 암을 근본적으로 치료하기 위하여는 원발성 암을 치료하는 것은 물론이며, 특히 전이 부위에서의 제어가 중요하다. 전이성 암의 종류로는 혈액을 통해 전이되는 암으로 알려진 대장암, 전립선암, 부인과암, 위암, 다발성골수종, 간장암, 폐암, 췌장암, 갑상선암, 신장암, 담관암, 담낭암, 신경아세포종 및 호지킨 림프종 등을 들 수 있다. 또한 특히, 부인과암의 일종인 유방암, 전립선암, 폐암, 대장암은 골 및 간 등에 전이를 초래하기 쉬운 암으로 알려져 있다. 본 발명의 전이성 암은 상기 예들을 포함하며, 종양이 전이하는 성격을 가진 암이면 제한되지 않는다. 본원발명의 GPC 단백질의 이소폼 2는 전이성 암에서 특히 발현이 증가하는 것으로 관찰되었으며, 따라서 전이성 암을 진단하기 위한 마커로서 이소폼 2의 발현을 확인할 수 있고, 이소폼 2의 발현을 억제하는 경우, 일반적인 암 뿐만 아니라, 전이성암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 암 진단용 키트에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어 "진단"이란 생물학적 시료 또는 조직 샘플에서 본 발명의 GPCR 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 부재를 측정함으로써 상기 유전자의 발현과 관련된 질환의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다.

본 발명의 키트는 암 진단 마커인 신규한 GPCR 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현 수준을 확인함으로써 마커를 검출할 수 있다. 본 발명의 키트는 암 진단 마커의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체 또는 항원 결합능을 유지하는 이의 단편 뿐만 아니라, 상기 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 분석 방법에 적합한 하나 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물 또는 장치가 포함될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 유전자 정량 검출을 위한 진단 키트는 GPCR 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 1 종 이상의 올리고 뉴클레오티드를 포함할 수 있는데, 바람직하게 본 발명의 유전자 정량 검출을 위한 진단 키트는 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5에 대응하는 프라이머, 역전사 효소, Taq 폴리머레이즈, PCR용 프라이머 및 dNTP를 포함할 수 있으며, 폴리뉴클레오티드 발현 수준을 측정하기 위해 상기 'mRNA 발현 수준 측정'과 관련하여 기술된 분석 방법을 이용한 키트를 제한 없이 이용할 수 있다.

바람직하게, 본 발명의 신규한 GPCR 단백질의 수준을 측정하는 암 진단 키트는, 본 발명의 GPCR 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다. 또한 단백질 수준을 측정하는 키트는 '단백질 발현 수준 측정'을 위해 사용되는 상기 기술된 방법을 이용한 키트를 제한 없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 ELISA 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다.

항체를 이용한 단백질 발현 여부 측정은 GPCR 단백질 및 그의 항체 간의 항원-항체 복합체를 형성함으로써 측정되며, 다양한 방법에 의해 상기 복합체의 형성량을 측정함으로써 정량적으로 검출할 수 있게 된다.

본 발명에서 용어 항원-항체 복합체란 암 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨 (detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적인 측정이 가능하다.

예를 들면, 암 의심 개체 및 정상 대조군의 항원-항체 복합체 형성량을 비교함으로써 GPCR 단백질의 유의한 발현량 증가를 판단하여 특정 개체에서의 암 발병 여부를 진단할 수 있는데, 암이 의심되는 개체의 시료에 본 발명의 GPCR 단백질에 대한 항체를 처리하면, GPCR 단백질과 항체가 항원-항체 복합체를 형성하게 되고, 이는 상기 기술된 ELISA, RIA, 샌드위치 분석, 웨스턴 블럿, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니, 면역 확산법, 로켓 면역 전기 영동, 조직면역염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS, 단백질 칩 및 면역블럿 방법을 포함하는 키트에 의해 그 양을 측정할 수 있게 된다. 또한 상기 분석 결과를 정상 개체의 정량 결과와 비교 분석함으로써, 본 발명의 GPCR 단백질의 발현 증가에 따른 암 발병 여부를 진단할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서 본 발명은, 본 발명의 GPCR 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 검출하는 방법에 관한 것이다.

보다 구체적으로는, 유전자의 발현을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 검출할 수 있고, 생물학적 시료에서 mRNA 또는 단백질의 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다.

본 발명에서 용어 "생물학적 시료란 GPCR 유전자 또는 단백질 발현 수준을 검출할 수 있는 시료를 의미하며, 그 예로, 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 검출방법은, 정상 대조군에서의 유전자 발현 수준을 암 의심 개체의 유전자 발현 수준과 비교함으로써 암 의심 개체의 실제 암 질환 발병 여부를 진단할 수 있다. 즉, 암으로 추정되는 세포로부터 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하고, 정상 세포로부터 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 본 발명의 마커의 발현 수준이 정상 세포의 것보다 암으로 추정되는 세포 유래에서 더 높은 수준으로 발현되면 암으로 추정되는 세포를 암으로 예측할 수 있는 것이다.

바람직하게 상기 방법은, 본 발명의 GPCR 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 마커로 이용하는 경우, (a) 생물학적 시료를 제공하는 단계; (b) 상기 생물학적 시료에 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 처리하는 단계; (c) 상기 제제및 상기 제제에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 결합을 검출하는 단계; 및 (d) 검출된 양을 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 GPCR 폴리펩티드 마커를 이용하는 경우, (a) 생물학적 시료를 제공하는 단계; (b) 상기 생물학적 시료에 제1항의 단백질에 대한 항체를 처리하는 단계; (c) 항체-항원 복합체를 검출하는 단계; 및 (d) 검출된 양을 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함할 수 있고, 상기 방법을 이용하여 본 발명의 GPCR 단백질을 검출할 수 있게 된다.

또 다른 하나의 양태로서 본 발명은, 본 발명의 GPCR 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 억제하는 올리고뉴클레오티드 또는 본 발명의 GPCR 단백질의 활성을 억제하는 항체를 포함하는 암 치료 및 예방용 조성물에 관한 것이다.

본 발명자들은 본 발명의 신규한 GPCR 유전자 또는 단백질의 암 형성능을 확인하기 위하여, 유전자 발현 세포주 NIH3T3에서의 접촉성 증식억제 (contact inhibition)을 관찰하는 한편, 비부착성 증식능 (anchorage independent growth)을 확인한 결과, 본 발명의 GPCR 유전자를 안정적으로 발현하는 세포주에서 상기 억제 및 증식능이 모두 증가하는 것을 확인하였다. 아울러 본 발명의 GPCR 유전자를 포함하는 벡터를 면역력 없는 누드 마우스에 주사한 결과, 종양 형성이 유도되는 것을 확인하였다.

바람직하게 본 발명의 조성물은 GPCR 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 물질을 포함할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 물질은 siRNA, shRNA 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (antisense oligonucleotide)로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는 서열번호 20 내지 서열번호 23 및 서열번호 36 내지 서열번호 51 로 구성되는 서열로부터 선택되는 어느 하나 이상의 올리고 뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명의 용어 "siRNA (small interfering RNA)"는 RNA 간섭 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 약 20 뉴클레오티드 크기의 작은 핵산 분자를 의미하며, siRNA가 세포 내에 도입되면, 다이서 (Dicer) 단백질에 의해 인지되어 상기 GPCR 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 분해하여, 결국 유전자의 발현을 저해하게 된다.

"shRNA (short hairpin RNA)"는 siRNA 타겟 서열의 센스 및 안티센스 서열이 5-9개의 염기로 구성된 루프 (loop)를 사이에 두고 위치한 짧은 헤어핀 RNA (short hairpin RNA)를 의미한다.

최근 유전자 수준에서 단백질의 발현을 조절하기 위한 방법으로 RNA 간섭 (RNA interference, RNAi) 현상을 이용한 방법이 연구되고 있으며, 일반적으로 siRNA는 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 단백질 발현을 억제하는 것으로 밝혀졌다.

본 발명의 siRNA 또는 shRNA를 포함하는 조성물은, 이들 RNAs를 이용한 유전자 치료에서 이용되는 통상적인 방법에 따라 개체에 투여되어 발암 또는 전이 유전자의 발현을 저해할 수 있다. 예를 들면 Filleur 등, Cancer Res., 63(14): 3919-22, 2003 등의 문헌에 따라, 적은 양의 정맥 주사 방법 (low-volume intravenous injection)에 의해 siRNA로 유전자 발현 조절이 가능할 수 있다. 또한 siRNA 생체 내 흡수량과 안정성을 증가시키기 위하여 Chien 등, Cancer Gene Ther., 12(3) 321-8, 2005 등의 문헌에 따라 siRNA 주입에 있어서, 복합체를 제조하여 사용할 수도 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 siRNA를 제조하는 방법에는 siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법 (Sui G 등, (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:5515-5520), 인 비트로 전사를 이용한 siRNA의 합성법 (Brummelkamp TR 등, (2002) Science 296:550-553) 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 shRNA는 siRNA의 고가의 생합성 비용, 낮은 세포 형질감염 효율로 인한 RNA 간섭 효과의 단시간 유지 등의 단점을 극복하기 위한 것으로 RNA 중합효소 의 프로모터로부터 아데노 바이러스, 렌티 바이러스 및 플라스미드 발현 벡터 시스템을 이용하여 이를 세포 내로 도입하여 발현시킬 수 있으며, 이러한 shRNA는 세포 내에 존재하는 siRNA 프로세싱 효소(Dicer or Rnase )에 의해 정확한 구조를 갖는 siRNA로 전환되어 목적 유전자의 사일런싱을 유도함이 널리 알려져 있다.

용어 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적 서열 내에서, 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 지칭한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다. 이 안티센스 올리고머는 mRNA의 번역을 차단 또는 저해하고 mRNA의 스플라이스 변이체를 생산하는 mRNA의 프로세싱 과정을 변화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 안티센스 올리고머는 GPCR 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 상보적인 안티센스 올리고머이다. 본 발명의 안티-센스 유전자를 이용한 치료는, 통상적인 방법으로 개체에 투여될 수 있으며, 상기 조성물의 투여로서 발암 유전자의 발현을 예방 또는 억제할 수 있다. 예를 들면, J.S. kim et al., J controlled Release 53, 175-182 (1998)의 방법에 따라 안티-센서 올리고디옥시뉴클레오티드를 폴리-L-라이신 유도체와 정전기적 인력에 의해 혼합시키고, 상기 혼합체를 개체의 정맥에 투여하는 방법이 사용될 수 있으나, 본 발명의 안티-센스 유전자를 개체에 투여하는 방법이 상기 예에 의해 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는 본 발명의 조성물에는 공지의 치료제를 직접 또는 간접적으로 결합시키거나, 함께 포함시킬 수 있다. 항체와 결합될 수 있는 치료제에는 방사성핵종, 약제, 림포카인, 독소 및 이중특이적 항체 등을 포함되나, 본 발명의 조성물에 포함되는 치료제는 이에 제한되는 것은 아니며, 항체와 결합시킬 수 있거나 항체, siRNA, shRNA 및 안티센스 올리고뉴클레오티드와 함께 투여하여 암 치료 효과를 얻을 수 있는 공지의 치료제라면 가능하다.

상기한 방사선핵종에는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I 및 ¹⁸⁶Re 등이 있으며, 이로 제한되지 않는다.

상기한 약제 및 독소에는, 에토포시드, 테니포시드, 아드리아마이신, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신류, 시스-백금 및 시스-백금 동족체, 블레오마이신류, 에스페라미신류, 5-플루오로우라실, 멜팔란 및 기타 질소 머스타드 등이 있으며, 이로 제한되지 않는다.

또한 바람직하게 본 발명의 조성물은 GPCR 단백질의 활성 또는 발현을 억제하는 물질을 포함하는, 암의 성장 또는 전이를 억제하는 조성물일 수 있다. 바람직하게 상기 활성 억제 물질은 GPCR 단백질을 특이적으로 인식하는 항체이다. 이러한 항체는 단일클론항체 및 이에 대한 카이메릭 항체 (chimeric antibody), 인간화 항체 (humanized antibody) 및 인간 항체 (human antibody)를 모두 포함한다. 또한 상기 항체는 GPCR 단백질을 특이적으로 인식하는 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄 (heavy chain)와 2개의 경쇄 (light chain)의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체의 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv 등이 있다.

바람직하게, 본 발명의 조성물은 투여 방식에 따라 허용 가능한 담체를 포함 할 수 있다.

약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 첨가제와 함께 혼합될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체의 종류의 예로는 식염수 ,멸균수, 링거액, 완충 식염수,덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 상기 성분들 중 어느 하나의 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 통상적으로 사용되는 다른 첨가제를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한 투여 목적에 따라 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있고, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 또는 조직 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 상기와 같은 담체, 부형제 또는 첨가제의 종류는 당업계의 통상적인 제제를 모두 포함하며, 상기 예에 의해 사용가능한 담체, 부형제 또는 첨가제의 종류가 제한 되는 것은 아니다.

상기와 같은 조성물 또는 혼합물은 목적 또는 필요에 따라 당업계에서 사용되는 통상적인 방법, 투여 경로, 투여량에 따라 적절하게 개체에 투여될 수 있다.투여 경로의 예로는 경구, 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 면역억제 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의해 투여된다. 비 경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다. 또한 당업계에 공지된 방법에 따라 적절한 투여량 및 투여 횟수가 선택될 수 있으며, 실제로 투여되는 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레 오티드, siRNA 또는 shRNA를 포함하는 조성물의 양 및 투여 횟수는 예방 또는 치료하고자 하는 증상의 종류, 투여 경로, 성별, 건강 상태, 식이, 개체의 연령 및 체중, 및 질환의 중증도와 같은 다양한 인자에 의해 절절하게 결정될 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서 본 발명은, 본 발명의 GPCR 단백질을 발현하는 세포에 후보 화합물을 처리하여, 상기 단백질의 GPCR-매개 시그날 전달 활성의 증가 또는 감소를 측정하는 것을 포함하는 본 발명의 GPCR 단백질 조절자를 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본 발명의 GPCR 단백질을 발현하는 세포는, 필요에 따라 상기 기술된 재조합 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포, 또는 형질전환 동물을 이용하여 적절하게 선택될 수 있으며, 당해 세포에 GPCR-매개 시그날 전달 활성에 관련되는 것으로 예상되는 후보 물질을 처리하여, 처리된 후보물질이 본 발명의 GPCR 단백질 조절자로서 기능하는지 확인할 수 있다. 보다 구체적으로는 상기 세포에 후보물질을 처리함으로써 본 발명의 GPCR-매개 시그널 전달 활성이 증가하는 경우 해당 후보물질이 본 발명의 GPCR 단백질에 대한 작용제 (agonist)임을 판단할 수 있으며, 반대로, 후보물질에 의해 GPCR-매개 시그널 전달 활성이 감소하는 경우 해당 후보물질이 길항제 (antagonist)라고 판단할 수 있다.

본 발명의 용어, "작용제 (agonist)"란 수용체와 결합하여 리간드 (ligand)에 대한 수용체의 생물학적 활성 또는 활성화를 직접 또는 간접적으로 상당히 유 도, 증진 또는 증강시킬 수 있는 분자를 말하며, 본 발명의 목적상 본 발명의 GPCR 단백질에 결합하여 생물학적 활성 또는 활성화를 유도 또는 증진 시킬 수 있는 물질을 의미한다. 본 발명의 용어, "길항제 (antagonist)"란 길항 작용을 나타내는 물질로서, 두 가지 이상의 물질을 함께 사용하는 경우, 한쪽 물질이 다른 물질의 효과를 감소시키거나 양쪽 물질의 효과가 상호 감소하는 물질을 의미하며, 본 발명의 목적상 GPCR 단백질에 대한 리간드와 상호 작용하여 효과를 감소시키는 물질을 말한다.

또한 상기 GPCR-매개 시그날 전달 활성의 증가 또는 감소를 확인하는 방법으로는 또한 시그날 전달 과정에 참여하는 다수의 단백질 또는 화합물 중 어느 하나 이상의 수준을 측정하는 방법과 같이 다양한 방법이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 cAMP의 수준을 측정함으로써 GPCR-매개 시그날 전달 활성의 증가 또는 감소 여부를 판단할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 신규한 GPCR 단백질에 영향을 미치는 외부 자극 요인을 검증하기 위하여, 몇몇 GPCR의 리간드로 알려진 물질을 처리한 후, 본 발명의 신규 GPCR 단백질의 과발현에 의해 세포 성장이 촉진되는지 확인하였다. 구체적으로 EGF, PDGF, 인슐린 (insulin), IGF-1, HGF, VEGF, 안지오텐신 II, 브래디키닌 (bradykinin), LPA 및 PTX를 처리하여 본 결과, PDGF, 인슐린 (insulin), IGF-1, VEGF, 안지오텐신 II, 브래디키닌 (bradykinin), LPA에서는 세포 성장이 촉진됨을 확인하였고, PTX를 처리한 경우에는 세포 성장이 저해됨을 확인하였다.

또 다른 하나의 양태로서 본 발명은, 본 발명의 GPCR 단백질을 발현하는 세포에 후보 화합물을 처리하여, 상기 단백질의 GPCR-매개 시그날 전달 활성의 증가 또는 감소를 측정하는 것을 포함하는 암 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본 발명의 암 치료제 스크리닝 방법은 상기 기술된 조절자의 스크리닝 방법과 유사하게 이루어질 수 있다. 즉, 후보 물질의 처리에 의해 GPCR-매개 시그날 전달 활성이 증가되는 경우, 발암 단백질 및 유전자인 본 발명의 GPCR 단백질 및 유전자의 발현이 증가하게 되므로, 상기 후보 물질을 암 질환을 촉진시키는 물질로 판단할 수 있다. 또한, 후보 물질에 의해 GPCR-매개 시그날 전달 활성이 감소하면, 해당 물질에 의해 발암성 유전자 및 단백질의 발현을 억제시킬 수 있으므로 처리된 후보 물질이 암 치료제로 사용될 수 있을 것으로 판단할 수 있게 된다. 이러한 스크리닝 방법에 있어서, 그 활성 측정은 cAMP의 발현 수준에 따라 용이하게 판단될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 실시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 신규한 GPCR 유전자 및 GPCR 단백질은 본 발명자들에 의해 그 기능이 최초로 동정된 것으로서, 암 전이 또는 억제용 타겟 유전자로서 활용될 수 있다. 또한 상기 유전자 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 검출함으로 써 암 질환의 발병 여부를 진단할 수 있으며, 상기 유전자에 대한 안티-센스 유전자, siRNA 또는 shRNA를 이용하여 본 발명의 신규한 GPCR 유전자의 발현을 억제함으로써 암 질환의 발병 또는 전이를 치료 또는 예방할 수 있을 것으로 기대된다. 나아가 상기 유전자를 포함하는 벡터 및 형질전환 세포, 형질전환 동물을 이용함으로써 GPCR 유전자의 기능을 더욱 구체적으로 규명하는 한편, 암 질환의 모델로 사용할 수 있다.

실시예 1: 신규 GPCR의 분석

위, 대장, 간암 세포주에서 과발현되어 있는 신규 오르판 GPCR 을 hstm1 ( h uman s even t rans m embrane protein 1) 으로 명명하였다 (이하, 본 발명의 실시예에서는 본 발명의 신규한 GPCR 유전자를 'hstm1'으로, 본 발명의 신규한 GPCR 단백질을 'hstm1 단백질' 또는 'hSTM1'으로 명명, 본 발명의 '신규 GPCR'과 혼용한다). 외부의 스트레스와 질소나 당의 량에 따라 발현량이 변하는 분열효모(S.pombe)의 유전자인 stm1⁺의 서열을 이용하여, 인간에서의 상동체인 신규한 오르판 GPCR을 동정하였고 이를 hstm1으로 명명하였다. 이 신규 수용체는 1번 염색체 (chromosome) 1p36.13 위치에 존재하고, 여러 개의 얼터너티브 전사체 (alternative transcript)를 가지며, 변이체 1 (hstm1a)은 hstm1 isoform 두 개중 N-말단 (N-terminal) 을 완전히 포함하는 전장의 유전자이다 (서열번호 1, 2). hstm1의 이소폼 1 (isoform 1)은 두 개의 다른 얼터너티브 스플라이싱 변이체 (alternative splicing variant) (서열번호 1, 2) 에서 만들어 질 수 있는데 이것은 또한 본 발명의 일부이다. hstm1의 이소폼 2 (isoform 2)는 얼터너티브 스플라이싱 변이체 3 (alternative splicing variant 3)(서열번호 3) 에 의해 만들어 지며, N-ternimal의 65개의 아미노산이 결손된 단백질을 코딩한다.

실시예 2. 인간의 정상 세포조직에서 신규 GPCR mRNA 량 조사

인간의 정상 세포조직의 전체 RNA (total RNA) 는 Clontech. Co. 로 부터 구입하였다. 인간 위 (cat. No 636578), 고환 (cat. No 636533), 흉선 (cat. No 636549), 골수 (cat. No 636548), 뇌 (cat. No 636530), 간 (cat. No 636531), 대장 (cat. No 636553), 신장 (cat. No 636529), 폐 (cat. No 636524), 유선 (cat. No 636570), 난소 (cat. No 636555), 심장 (cat. No 636532), 갑상선 (cat. No 636530), 이자 (cat. No 636577), 작은창자 (cat. No 636539), 전립선 (cat. No 636539) total RNA를 이용하였다. 각각 전체 RNA (total RNA) 1 에 oligo (dT)15 를 1 첨가하고 65도에서 10분간 끓여 식힌 후 RNase 억제제 (RNase inhibitor) 1 , 5X RT 완충액 (RT buffer) 4μl, dNTP 2μl, DTT 2μl, RT 효소 (RT enzyme) (reverse transcriptase) 0.5μl를 섞고 증류수를 이용해 전체 부피를 20μl로 조정한 후 42도에서 60분, 70도에서 5분간 반응시켜 c-DNA 를 제조하였다 (iNtRON Biotech) .

제조된 c-DNA 2μl와 GAPDH 프라이머 각 30 pmole를 넣고 증류수를 이용하여 10μl 로 최종 부피를 맞춘 후 2X Taq premix (Hot start) 10μl를 넣어 RT-PCR 을 수행하였다. 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분으로 22 사이클을 돌려 준비된 시료를 아가로스 젤에 로딩하여 양을 측정하고 모든 시료에서의 GAPDH PCR 산물의 양이 동일하게 나오게 보정하였다. 보정된 c-DNA와 동일한 양을 이용하여 hstm1 프라이머 (primer) 를 이용하여 위와 같은 조건으로 35 사이클을 돌려 PCR 산물을 아가로스 겔 (agarose gel) 에 로딩하여 각 조직에서의 mRNA 량을 가시적으로 측정하고, real-time PCR (Corbrtt Research 사의 RG-6000) 을 통하여 각 조직에서의 hstm1의 mRNA량을 정량적으로 측정하였다. 시약은 Qiagen 사의 2X Quantitect SYBR Green PCR Kit 를 사용하였다. 그 결과 위장에서의 mRNA량을 기준으로 볼 때 상대적으로 심장, 이자, 흉선, 전립선, 작은 창자에서 적은 양의 mRNA가 관찰되었으며, 폐, 고환에서 대조군과 비교하여 더 많은 양의 mRNA 발현이 있음을 알 수 있었다. 특히 고환에서의 발현량은 다른 조직과 현저한 차이를 보였다. 사용한 real-time 프라이머는 표 1에 나타낸 바와 같고 대조군 (control)으로 사용한 GAPDH의 프라이머 (primer)는 Qiagen (QT00079247) 제품을 사용하였다. real-time PCR 의 조건은 95℃ 5초, 55℃ 15초, 72℃ 20초 로 40~45 사이클 (cycle)을 수행하였다.

실시예 3. 인간의 위장관계 암세포주에서의 신규 GPCR mRNA 발현량 조사

위암, 대장암, 간암 세포주를 10% 소 태아 혈청과 항생제가 포함된 RPMI 배지로 6 웰 디쉬 (6-well dish)에 배양한 후 80% 컨플루언스 (confluence) 일 때 세포를 PBS 완충액 (buffer)로 씻어내고 TRIZOL 1 ml을 이용, 세포를 분해하여 전체 RNA (total RNA)를 분리하고 실시예 2와 동일한 방법으로 c-DNA 를 만든 후, GAPDH 로 정량하고 hstm1 량을 RT-PCR 과 real-time PCR 을 이용하여 조사하였다. 위장관계 조직인 위, 대장, 간암 세포주에서 모두 hstm1의 발현량이 정상 조직에서 보다 많이 발현되고 있었으며, 특히 위암 세포주에서 고르게 다량 발현하고 있음을 알 수 있다.

실시예 4. 인간의 위암 환자 임상 샘플에서의 신규 GPCR 발현량의 변화 조사

위암 환자에서 얻어진 정상조직와 위암조직에서 mRNA 를 분리하였다. Total RNA extraction kit(iNtRON Biotech.) 을 이용하였다. 위조직 20 mg 에 easy-BLUE 시약 (reagent) 1ml을 넣고 분쇄하여 클로로포름 (Chloroform) 200μl를 첨가 후 볼텍스 (vortex) 하여 10분간 원심분리하여 상층액 400μl를 새 튜브에 옮기고 isopropanol 400μl를 첨가하여 잘 섞어준 후 10분간 상온에 보관 후 13,000 rpm 에서 10분간 원심분리하여 RNA 를 분리하였다. 75% 알코올로 펠렛 (pellet)을 씻어준 후 건조시키고, DEPC 가 들어있는 증류수 50μl를 이용하여, RNA를 용해하였다. RNA 를 정량한 후 각 1μg 씩을 이용하여 실시예 2 와 같이 c-DNA를 만들고, hstm1 서열번호 8 및 서열번호 9의 primer 를 이용하여 real-Time PCR을 수행하였다. 그 결과, 조기위암이나 1, 2기 암 조직에서는 위정상 조직에 비해 유의성 있는 결과를 볼 수 없었으나 3기 이후의 위암조직에서는 hstm1 의 발현량이 유의성 있게 증가한 시료가 37 % 로 특히 미만형의 조직에서는 더 많은 비율의 증가가 있는 것으로 보아 hstm1 유전자의 발현이 3기 이후의 미만형과 진행성 위암과 관련성이 있음을 확인하였다.

실시예 5: 순간적으로 및 영구적으로 트랜스펙션된 NIH3T3 세포 제조

신규의 인간 고아 수용체 hstm1 의 특성을 추가로 조사하기 위하여, NIH3T3 세포를 리포펙타민 플러스 방법을 사용하여 순간적으로 또는 영구적으로 트랜스펙션시켰다.

세포 배양 및 트랜스펙션 (transfection) 방법

NIH3T3 세포를 10% 열 불활성화된 소 태아 혈청, 및 100 IU/ml 페니실린 G, 100μg/ml 스트렙토마이신 설페이트 (streptomycin sulfate)를 첨가한 DMEM (Gibco)에 유지시켰다. 세포를 5% CO₂ 환경의 37℃, 다양한 크기의 배양 플라스크에서 성장시켰다. 영구적으로 트랜스펙션된 세포에 대하여 실험 전 유지 세포주에 대해 400/ 제네티신( G418)을 함유하는 DMEM 베지에서 배양하였다.

NIH3T3 세포의 순간적인 트랜스펙션을 위하여 리포펙타민 플러스 (Life Technologies) 방법을 사용하였다. 트랜스펙션 하루 전에, NIH3T3 세포를 60 mm 디쉬나 6 웰 플레이트 (6 well plate)를 이용하여 DMEM 배지에 시딩(seeding)하고, 하나의 페트리 디쉬의 트랜스펙션에 대하여, 2μg DNA를 4μl 플러스 시약(Life Technologies)에 첨가하고, 혼합하고 실온에서 15분 동안 배양하였다 (용액 A).

6 의 리포펙타민 플러스 시약을 150μl의 혈청이 없는 배지에 첨가하였다(용액 B). 용액 A와 B를 배합하고, 살짝 혼합하고 실온에서 15분동안 배양하여 복합체를 형성시켰다. 15분 후에 900μl의 혈청이 없는 배지를 혼합물에 첨가하였다. 세포를 혈청이 없는 배지로 한번 세척하고 DNA-리포펙타민 플러스 복합체 (최종 부피 1200μl)를 세포에 첨가하고 5% CO₂ 배양기에서 37℃에서 5시간 동안 배양하였다. 이후, 배지를 제거하고 10% 열 불활성화된 소 태아 혈청으로 보충된, 3~5ml의 DMEM 을 세포에 첨가하고 배양기에 배양하였다.

리포펙타민 플러스 방법으로 일시적으로 트랜스펙션된 세포를 영구적으로 트랜스펙션된 안정 세포주 (stable cell line)를 제조하기 위하여 사용하였다. 트랜스펙션 후, 배지를 2 내지 3일 마다 400~1000 μg/ml 제네티신 (G418) 이 첨가된 선택배지로 교체하였다. 세포를 콜로니가 보일 때까지 성장시키고 (8 내지 10일 소요) 추가의 배양과 실험을 위하여 100 mm 배양 디쉬로 분리하였다. 모노클로날 세포를 96 웰 플레이트에서의 제한된 희석 시딩에 의해 제조하였다. 이러한 방법을 반복하여 완전히 모노크로날로 분리된 안정 세포주 을 다량으로 배양하여 모은 후 10 % DMSO, 20 % 혈청이 들어있는 배지에 넣어 액체질소에 보관하고 세포의 passage 가 15가 되지 않도록 유지하면서 실험하였다.

실시예 6: h stm1 stable 세포주를 이용한 신규 GPCR 유전자의 세포성장 촉진 및 종양 (tumor) 형성능 조사

1) hstm1을 영구적으로 트랜스펙션 시킨 세포주의 세포군 (foci) 형성 관찰:

유전자가 들어있지 않은 벡터만 트랜스펙션된 세포와 hstm1을 가지는 세포를 낮은 컨플루언스 (confluence) (500 cells/dish) 로 시딩한 후 하나의 세포에서 세포군 (foci) 이 형성되는지를 관찰하였다. 벡터만 들어간 세포주에서는 세포가 전체적으로 퍼져서 자라는 반면 hstm1을 발현하는 세포주에서는 세포군이 형성됨을 알 수 있었다 (도 3A 및 도 3B).

2) hstm1을 영구적으로 트랜스펙션 시킨 세포주의 접촉성 증식억제 (contact inhibition)에 의한 성장 저해 정도를 관찰:

대조군 세포주와 hstm1을 발현하는 세포주를 높은 컨플루언스 (confluence) (5 x10⁶ cell)로 시딩한 후 이틀에 한번씩 배지를 교환하며 5일간 배양하였다. 일반적으로 정상 세포주는 주위에 세포들이 많아져서 접촉이 일어나면 그 성장을 멈추게 된다. 하지만 hstm1을 발현하는 세포주의 경우 그 성장이 잘 멈추어 지지 않고 지속적으로 성장하여 세포간격이 아주 밀집되어 있음을 관찰하였다 (도 3A 및 도 3B).

3) 대조군 세포주와 hstm1을 발현하는 세포주를 같은 세포수가 되도록 계산 (counting) 하여 96 웰 디쉬에 시딩한 후 12시간 동안 부착시키고 그 시간을 T0 으로 하여 세포량을 WST assay (Takara, cat No. MK400, 세포가 들어있는 96 웰 디쉬에 wst 를 각 10μl 씩 분주하여 넣고, 적절한 시간이 지난 후 배지의 색깔의 변화를 분광광도계 (spectrophotometer) 를 이용하여 측정하는 방법으로 UV wavelength 450을 사용한다) 를 통하여 측정하고, 일부는 소혈청이 없는 배지로 교환하고, 일부는 10% 소혈청이 있는 배지에서 24 시간 배양한 후 T24 에 동일한 방법으로 세포성장 정도를 WST 분석을 통하여 측정한 후 T0 에 비례한 T24 의 값을 정량화하고, 대조군 세포주 대비 hstm1을 발현하는 세포주의 성장 촉진 정도를 관찰하였다. 소혈청이 없는 배지에서는 약간의 성장 촉진이 있었으며, 소혈청이 들어간 배지에서는 30% 가량의 성장촉진이 관찰되었다 (도 3C).

4) 소혈청이 들어간 배지에서 자란 세포주들을 트립신 (Trypsin)/EDTA 용액을 이용하여 떼어낸 후 12~24시간 동안 알코올로 고정한 후 다시 PBS 완충액 (buffer)으로 알코올을 씻어내고 RNase를 처리하여 RNA 를 제거하였다. 그 시료에 DAPI 용액을 첨가하여 DNA 를 염색시키고 세포주기 분석기 (Facs analysis) 를 이용하여 세포주기를 관찰하였다. 그 결과 hstm1을 발현하는 세포주는 세포성장이 빨라 G2기의 세포가 상대적으로 많았다 (도 3D).

FACS (Fluorescent activated cell sorter) 분석법

형광 발현 벡터인 pIRES-EGFP2가 안정적으로 삽입된 NIH3T3 세포(NIH3T3-IRES-EV)와 hSTM1 유전자가 포함된 발현 벡터인 pIRES-EGFP2-hSTM1 가 안정적으로 삽입, 발현되는 NIH3T3 세포를 60 mm Cell culture dish에 각각 4 X 10⁵, 5 X 10⁵ 개씩 배양하였다.

24 시간 동안 10% FBS (Fetal Bovine Serum), 1% 항생제 (antibiotics)가 포함되어있는 DMEM 성장배지에서 계속 키운 후, 같은 배지로 다시 한 번 갈아 주었으며, 세포가 디쉬의 표면을 70% 정도를 덮을 때까지 계속 배양시켜 주었다. 그 후, 1 X PBS로 세포를 헹구어 낸 후, 트립신-EDTA (Tripsin-EDTA)를 처리, 세포를 떼어내었다. 떼어낸 세포들은 각 각 PBS가 5 ml씩 분주되어 있는 15 ml 커닝 튜브 (corning tube)에 옮겨주고, 원심분리기를 사용하여 세포를 잘 가라앉혀 주었다. 원심분리 후에 상등액은 버려 내고, 다시 한 번 5 ml의 PBS를 사용하여 세포를 잘 씻어낸 후, 원심분리를 통해 세포를 잘 가라앉혔다. 상등액을 완전히 버린 후, 세포에 차가운 70 % 에탄올을 5 ml씩 첨가한 상태로 -20℃에서 1시간 이상 보관함으로써 세포를 고정시켜주었다. FACS 분석을 하기 3시간 전, 원심분리를 사용하여 세포를 모은 후, 상등액을 버리고, 5 ml의 PBS를 사용하여 세포를 헹구어 주는 과정을 2회 반복해 주었다. 원심분리 후, 세포에 PI (Propidium Iodide) 염색 용액 (staining solution)을 0.5 ml씩 넣어준 후, 파이펫을 사용하여 세포를 잘 섞어주었고 (PI staining solution: 3 mM sodium citrate, 50 μg/ml PI [Sigma, P4170] in PBS), 세포의 RNA가 염색되는 것을 방지하기 위해 RNA 분해효소인 RNase A를 10μg/ml이 되도록 첨가한 후, 4℃에서 3시간 동안 두거나 -20℃에 하루정도 둠으로써 시료를 준비하였다. 준비된 시료들은 FACS 기계를 통한 세포 주기의 분석에 사용하였다.

5) hstm1을 영구 발현하는 세포주의 비부착 증식 (anchorage-independent growth)을 조사하였다. 우선 1.8% 노벨 아가 (nobel agar) 용액을 만들어 20% 소 혈청이 들어있는 배지와 1:1로 섞어 60 mm 디쉬에 2.5 ml 씩 분주하여 굳히고, 5 x 10⁴ 세포를 20% 소혈청이 들어있는 배지에 준비하여 0.6% 노벨 아가 (noble agar) 용액과 1:1 로 섞어 앞서 만들어 놓은 디쉬 위에 부어 다시 굳힌 후 아기로즈 위에 건조를 막기 배지를 2 ml 첨가하고 20일 정도 콜로니가 형성될 때까지 위에 첨가한 배지를 이틀 간격으로 교환해 주며 배양하였다. 생성된 콜로니의 개수를 세어 그 차이를 관찰하였다. 그 결과 hstm1을 발현하는 세포주의 비부착 증식 (anchorage-independent growth)이 증가함을 알 수 있었다. (도 3E)

6) hstm1을 영구적으로 트랜스펙션 시킨 세포주와 벡터를 트랜스펙션 시킨 세포주를 각각 면역력이 없는 누드 마우스 (nude mouse)의 피하에 주사하여 종양 (tumor) 형성 여부를 관찰하였다. 실시예 5의 세포 배양 방법을 이용하여 배양한 세포주를 트립신 (trypsin)/EDTA 를 이용하여 수확하고, PBS 로 2번 씻어 내고 최종적으로 PBS 완충액 (buffer)에 재현탁 (resuspend) 하여 동일 수의 세포를 세어 누드 마우스에 주사하였다. 종양이 적당한 크기로 자란 주사 후, 35일 째에 종양 형성 여부를 관찰하였다. 그 결과 벡터 (vector)를 포함하는 NIH3T3 세포주를 주사한 면역결핍 쥐에서는 28일째에는 전혀 보이지 않았고 35일 째에는 10개중 3개에서 작은 크기의 종양이 형성되었으며, hstm1을 발현하는 세포주를 주사한 경우 10 마리중 9 마리에서 30일이 지난 후 대조군에 비하여 큰 종양이 형성되었음을 관찰할 수 있었다.

실시예 7. 신규 GPCR 과발현으로 인해 유도되는 유전자 발현 변화 관찰

hstm1의 과발현이 Tumor 형성촉진에 관여하는 기전 (mechanism)을 규명하기 위하여 세포성장 촉진과 관련된 신호전달 과정인 MAP 카이네이즈 경로 (MAP kinase pathway)와 항-아팝토시스 경로 (anti-apoptosis pathway)의 단백질 인자들을 웨스턴 블럿 (Western Blot) 분석법으로 조사하였다. 그 결과 상기 hstm1 유전자에 의해 세포성장과 관련된 MAP 카이네이즈 경로와 세포 사멸에 관련된 항-아팝토시스 경로가 활성화되어 세포 종양형성에 관여함을 알 수 있었다. 사용한 항체의 정보는 하기와 같다.

Western Blot 분석법

실시예 6에서 설명한 바와 같이 60 mm 디쉬에서 키워진 세포를 PBS로 한번 헹구어 낸 후, 차가운 단백질용 용해 완충액 (RIPA cell lysis buffer: 50 mM Tris-Cl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 10% Glycerol, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 20 mM NaF, 1 mM EDTA, Protease inhibitor)를 첨가하여, 세포의 단백질을 준비하였다. 준비되어진 각 단백질 시료를 30 μg씩 사용하여 10 % 혹은 12 % SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 겔 (gel)에 걸어 크기별로 단백질을 분리해 낸 후, 이를 PVDF 막에 잘 옮겨주었다.

단백질이 옮겨진 필터를 적당한 크기로 잘라낸 후, 각 단백질에 해당하는 항체를 붙여주었다. 항체에 대한 정보는 다음과 같다. : anti-hstm1 (제조), anti-p-raf (S438. 1:1000, Cell signal #9427), anti-p-raf (S259)(1: 1000, Cell signaling #9421), anti-phospho Erk1/2(1:10000, Pharmingen, 554093), anti-Erk1/2(1:3000, Santa Cruz, sc-7382), anti-Cyclin D1(1:3000, Pharmingen. 554180), anti-cyclin A (1:3000, Santa Cruz, sc-751), anti-cdk2 (1:1000, Santa Cruz, sc-6248), anti-c-myc (1:1000, Santa Cruz, sc-7890), anti-Akt (1:3000, Cell signal, #9272), anti-p-AKT(S473)(1:2000, Cell signal, #9271), anti-AKT(Thr-308)(1:2000, Cell signal, #9275), anti-p-GSK3b(1:3000, Cell signal, #9336), anti-p70S6K(1:2000, Cell signal #9202), anti-p-p70S6K(1:2000, Cell signal, #9208), anti-4EBP1 (1:3000, Cell signaling, #9452), anti-p-4EBP1(1:3000, Cell signaling, #9451), anti-eIF4E (1:3000, Cell signaling, #9742), anti-p-eIF4E (1:3000, Cell signaling , #9741), SP-1 (1:3000, Millipore, 07-645) Egr-1(1:5000, Santa cruz sc-110), anti-flag (1:5000, Sigma), anti-Gia1/2/3 (Santa Cruz. sc-26761, 1: 3000). 각각의 단백질의 양은 Immobilon^TM 웨스턴 블럿팅 검출 시약 (Western Blotting Detection reagents) (Millipore)를 사용하여 밴드 (band)로 확인 하였다. 각 시료에 대한 실험에 사용된 단백질의 양이 동일하다는 것을 베타-액틴 (beta-actin)에 대한 항체 (anti-beta-actin antibody, 1:10000, Cell signaling)를 통한 블럿팅에서 확인하였다. hstm1 단백질의 경우 서열번호 6 및 7의 펩타이드를 mouse 에 주사하여 얻은 혈청을 protein A agarose 를 이용하여 정제한 후 사용하였다 (5000:1).

실시예 8: 순간적으로 혹은 영구적으로 신규 GPCR 유전자가 트랜스펙션된 NIH3T3 세포에서 cAMP 측정

hstm1의 기능을 규명하기 위해서 hstm1을 일시적으로 과발현시킨 세포주와 안정 세포주 (stable cell line)에서 cAMP 측정하였다. 이 모든 실험은 대조군으로서 공 벡터만 들어있는 NIH3T3 세포와 병행하여 수행하였으며, cAMP 유도제 (inducer)인 포스콜린 (forskolin) (Sigma, F3917)을 처리하여 비교하였다. 3번 이상의 반복실험을 수행한 결과, hstm1을 영구적으로 과발현하는 세포주에서 30% 이상의 cAMP 수준의 저해가 있었으며, 포스콜린 자극된 cAMP 수준은 벡터만 가지는 NIH3T3 세포에 비해 높은 40% 이상의 억제를 보였다.

영구적으로 hstm1 트랜스펙션된 세포의 야생형 NIH3T3 세포에 대한 대표적인 농도 반응 결과 분석표가 각각 도 5 A에 도시되어 있다.

순간적으로 트랜스펙션된 경우에는 포스콜린 자극이 없을 경우 70% 가량의 cAMP 억제효과가 있는 것으로 나타나 그 효과가 더욱 컸으며, 포스콜린 자극된 cAMP 수준의 경우 약 40% 의 억제가 나타났다 (도 5B).

cAMP assay

NIH3T3-IRES-EV, NIH3T3-IRES-hSTM1 안정 세포주를 이용하여 hSTM1 유전자가 세포의 cAMP 농도에 어떠한 영향을 미치는지에 대한 연구를 promega사의 cAMP-Glo^TM assay kit을 사용하여 시행하였다.

먼저 NIH3T3-IRES-EV, NIH3T3-IRES-hSTM1a-A 세포를 각각 96-well plate에 well 당 5000 개의 세포를 분주 한 후 80%의 세포 농도가 될 때까지 배양하였다. 그 후, 세포를 PBS로 잘 씻어준 후, promega사의 매뉴얼 대로 각 웰 당 20 μl의 유도 완충액 (induction buffer)이나 20 μM의 포스콜린 (Forskolin)이 포함된 유도 완충액을 첨가해 주었다. 6시간의 배양 시간이 지난 후, 각 웰 당 20 μl의 cAMP-Glo^TM 용해 완충액 (lysis buffer)를 첨가하여 세포를 용해시켰으며, 각 웰의 시료를 새로운 루시퍼레이즈 분석 (luciferase assay)용 96 웰 플레이트 (불투명한 흰색)에 옮겼다. cAMP의 양을 측정하기 위하여, 매뉴얼에서 상기된 내용을 따라 각 웰 당 40 μl의 cAMP-Glo^TM 검출 용액 (Detection solution)을 넣어 주고 1분 동안 흔들어 반응을 촉진 시켜 준 후, 상온에서 20 분 동안 반응시켜주었으며, 80 μl의 Kinase-Glo 시약 (Reagent)을 넣은 상태로 다시 1분 동안 흔든 후 10분 동안 상온에서 반응시켜 주었다. 이 반응의 결과는 96-웰 마이크로 플레이트 리더 (96-well microplate reader)를 통하여 읽어주었다. 그래프에 나타낸 수치는 NIH3T3-IRES-EV 세포주의 시료에서 나온 cAMP의 농도를 1로 나타내었을 때에 대한 상대값이며, 3 번의 독립적인 실험의 평균값을 나타내었다.

순간적으로 트랜스펙션된 NIH3T3 세포에 대하여서는, 실시예 5에서 설명한 트랜스펙션 방법을 사용하였고 이후 과정은 상기 방법과 동일하게 실시하였다.

루시퍼레이즈 리포터 분석 (Luciferase Reporter assay)

CRE-luc Reporter DNA 플라스미드를 이용하여 hSTM1의 cAMP level 에 미치는 영향을 알아보았다. 우선 NIH3T3 마우스 섬유아세포 (mouse fibroblast)를 24-웰 플레이트에 각 웰당 4 X 10⁴ 개의 세포를 분주 한 후, 50 % 정도로 자랄 때까지 10 % FBS-DMEM배지에서 배양 하였다. 먼저 200 ng의 리포터 플라스미드 (Reporter plasmid)와 함께 10 ng 의 레닐라 (Renilla) (트랜스펙션 효율에 대한 대조군) 발현 벡터, 150-300 ng의 pCMV-hSTM1 발현벡터, 대조군으로서 pCMV-taq1 발현 벡터를 이용하여 총 500 ng의 DNA 혼합물 (mixture)을 만든 후, 이에 세포에 DNA를 주입하기 위해 사용되는 리포펙타민 시약, 플러스 시약 (Lipofectamine reagent, plus reagent) (Invitrogen)을 각각 1 μl씩을 제조사의 매뉴얼과 같이 넣어 주었으며, 15분 동안 배양 시켜 DNA 복합체를 형성시켰다. 이 동안 세포를 PBS로 깨끗이 씻어낸 후 무혈청 배지로 갈아주었으며, 생성된 DNA 복합체를 각 웰에 일정량씩 분주하였다. 4시간 동안의 배양 후, 다시 한번 PBS로 세포를 씻어 내었으며 10% FBS가 포함된 정상배지로 갈아주었다. DNA 복합체 (DNA complex)의 처리 후 48 시간이 지났을 때, 웰 당 100 μl의 세포 용해 완충용액 (luciferase assay용, Promega)을 처리하여 시료를 준비하였으며, 이 중 50 μl를 사용하여 50 μl의 루시페린 (Luciferin)과의 반응을 시켜 luminometer를 통한 각 리포터 (reporter)의 활성양을 측정하였으며, 그 후 정지 완충액 (Stop buffer)을 첨가하여 lumonometer를 통하여 레닐라 (Renilla) 효소의 활성도 또한 측정하였다. 이 각각의 리포터 활성도에 대한 수치는 각 시료의 레닐라 (renilla) 활성도 값으로 나눈 후, 대조군 (pCMV-taq1이 들어간 시료)에 대한 실험군 (pCMV-hSTM1가 들어간 시료)의 활성도 비례값으로 나타내었다. 그림은 4 번의 독립적인 실험의 평균값이다.

또한 cAMP의 수준의 변화는 하위 효능 인자인 단백질 카이네이즈 A (Protein Kinase A)의 활성에 영향을 주고 이에 의해 MAP 카이네이즈 (MAP kinase) 상위 인자인 raf1 카이네이즈의 인산화에 영향을 주는 것으로 알려져 있는데 hstm1의 경우 (영구적 및 순간적) raf1 카이네이즈의 인산화에 영향을 주어 세포성장을 촉진함을 p-raf1의 웨스턴 블럿 (western blot)을 통하여 조사하였다. 웨스턴 블럿 방법은 실시에 6에서와 같고 anti-p-raf (S259)(1: 1000, Cell signaling #9421) 항체를 이용하였다.

실시예 9. 외부 상위 신호 전달 물질에 의한 신규 GPCR의 세포 성장능 활성 검증

hstm1에 영향을 미치는 외부 자극 요인을 검증하기 위하여 세포 성장 인자 및 몇몇 GPCR의 리간드 (ligand)로 알려진 물질들이 hstm1 과발현에 의한 세포성장촉진에 영향을 미치는지를 알아보기 위하여 WST 분석 (실시에 6에서 설명 참조) 를 이용하여 세포성장 촉진 정도를 관찰하였다. 보통 cAMP 수준의 저하를 일으키는 G-단백질은 Gi 계열로서 PTX (Pertussis toxin, 백일해를 일으키는 독소) 에 의해 그 신호전달이 저해됨이 알려져 있다. 따라서 PTX 처리 유무에 따라 변화하는 성장인자를 찾음으로서 hstm1 상위 신호전달 물질을 찾고자 하였다. 그 결과 혈청 (serum)의 첨가에 의해 대조군에 비해 4배 가량의 성장 촉진이 일어났으며 그 효과는 PTX 처리에 의해 줄어듦을 알 수 있었다. 그러므로 hstm1의 세포성장 촉진에 PTX 에 의해 저해되는 신호전달과정이 관여함을 증명할 수 있었다 (도 6A).

구체적으로 EGF, PDGF, 인슐린 (Insulin), IGF-I, HGF, VEGF, 안지오텐신 (Angiotensin), 브래드키닌 (Bradkynin), LPA 등의 혈청 (serum) 내 성장인자와 리간드 (ligand)를 이용하여 세포성장 촉진 정도를 알아보았다. 성장촉진 인자와 그 농도의 상세 설명은 아래 표에 나타내었다. 그 결과 PDGF, 인슐린 (Insulin), IGF-I, VEGF, 안지오텐신 (angiotensin), 브래드키닌 (Bradkynin), LPA 등의 처리에 의해 세포성장이 촉진되고 또 PTX 처리에 의해 그 효과가 저해됨을 알 수 있었다. 따라서 상기 언급한 세포 성장 인자와 리간드는 hstm1의 세포성장 촉진에 영향을 끼치는 물질임을 알 수 있었다 (도 6B).

실시예 10. RT-PCR 을 이용한 유전자 발현 분석

각 안정 세포의 세포성장 촉진과 관련있는 유전자 발현 변화를 측정하기 위하여 실시예 9에서 밝혀진 세포 성장 인자 중 하나인 IGFI 과 II 와 사이클린 D1 (cyclin D1)에 대한 상대적 RNA량을 RT-PCR로 측정하였다. RNA 분리및 c-DNA 합성은 실시예 3, 4와 동일한 방법을 사용하였으며 PCR은 닥터 Taq (Dr. Taq Master mix, Doctor Protein사)를 사용하여 제조회사의 매뉴얼에 따라 수행하였고 프라이머의 경우 20 pmol의 스톡 (stock)을 각각 2μl씩 사용하였다. 각각의 유전자에 대한 PCR 프라이머 서열과 어닐링 (annealing) 온도에 대한 정보는 표 3과 같다.

그 결과 도 7A에서 보는 바와 같이 hstm1을 과발현하는 세포에서 IGF-I, IGF-II, 사이클린 D1 (cyclin D1)의 전사가 촉진되었음을 알 수 있었다.

실시예 11. IGF-I 과 IGF-II 의 세포성장에서 영향을 조사하기 위한 Immunoneutralization Assay

hstm1 발현세포에서 IGF-I, -II 의 발현이 증가함을 실시예 9를 통하여 알게 되었고 따라서 IGF-I, -II 를 항체를 이용하여 중화시켜 수용체에 결합하지 못하게 함으로서 hstm1 발현세포의 세포성장 촉진이 줄어드는지를 관찰하고자 실험을 수행하였다. IGF-I 과 IGF-II 의 항체를 배양액에 40 ug/ml 로 처리하여 배지속의 IGF-I, 혹은 IGF-II를 작용하지 못하도록 하고 세포성장 정도를 SRB 분석을 통하여 측정하고 같은 샘플을 단백질을 분리하여 웨스턴 블럿을 실시, 관련 항체를 이용하여 단백질의 변화를 관찰하였다. 그 결과 IGF-I 항체의 중화에 의해 세포성장은 대조군에서 12% 정도 감소하였고, 실험군은 25% 감소되었으나 (도 7 C, D) western blot 상에서는 p-Erk1/2와 cyclin D1, p-AKT의 양에는 큰 변화가 보이지 않았다 (도 7 B). IGF-II 항체에 의한 중화에서는 대조군에서는 18%, 실험군은 35% 정도 세포성장이 감소되었으며 (도 7 C, D), western blot 상에서도 보다 p-erk1/2와 cyclin D1, p-AKT 의 변화가 있음을 알 수 있었다 (도 7B). IGF-I 과 IGF-II 에 대한 항체를 모두 사용하여 실험한 경우 세포 성장 조사에서는 조금 더 성장이 느려진 것으로 나타났으나 웨스턴 블럿 상에서는 IGF-II 단독 처리와 다르지 않았다. 따라서 IGF-I,-II 특히 IGF-II 가 hstm1에 의한 세포성장 촉진에 관여하고 있음을 알 수 있었다.

면역중화 분석 (mmunoneutralization assay)

NIH3T3/IRES-EV 세포와 NIH3T3/IRES-hSTM1 세포를 각각 12 웰 플레이트에 웰 당 1 X 10⁵개씩, 96-웰 플레이트에는 웰 당 5000개씩 깔아 준 후, 세포의 농도가 50 %가 될 때까지 배양시켜 주었다. 그 후, 배지를 대조군에는 PBS가 함유된 5 % FBS-DMEM배지를, 실험군에는 IGF-1 항체 (Santacuz, 40 μg/ml) 혹은 IGF-2 항체 (Santacuz, 40 μg/ml) 또는 40 μg/ml의 IGF-1, IGF-2 antibody가 모두 들어가 있는 5% FBS-DMEM으로 갈아주었다. 24 시간의 배양 후, 12-웰 플레이트의 세포들은 PBS로 한번 헹구어 낸 후, 세포 용해 완충용액 (RIPA cell lysis buffer)를 사용하여 단백질을 분리, 항-사이클린 D1 (anti-Cyclin D1), 항-p-ERK1/2 (anti-phospho-ERK1/2), anti ERK1/2 항체, 항-p-AKT (anti-p-AKT) 항체를 사용한 웨스턴 블럿에 이용하였다. 96-웰 플레이트의 세포에는 배지와 동일량의 10% 포르말린 용액 (Formalin solution)을 넣어준 후 세포를 고정시켰으며, 30분 동안의 보관 후, PBS를 사용하여 세포를 말끔히 씻어내고 이를 하룻동안 말려주었다. 말려진 세포에는 1% SRB 용액을 첨가시킨 후 1 시간 동안 배양 시켜 세포를 염색시켜 주었으며, 이후 용액을 버린 후, 증류수로 세포를 다시 한 번 깨끗이 씻어내었고 이를 말려 주었다. 말려진 세포에 10 mM의 Tris용액을 넣어주어 세포에 염색된 시약을 뽑아내었으며, 이를 새로운 96-well plate에 옮겨 540 nm의 파장을 사용하여 흡광도를 측정하고 그 차이를 분석하여 세포의 증식력의 변화를 관찰하였다.

실시예 12. 신규 GPCR에 결합하는 G-단백질 동정

1) in vitro binding - His tagged hstm1 을 이용한 결합하는 G-단백질 동정

a. 6xHis tagged 단백질 준비 단계

6xHis를 단백질에 붙이는데 사용되는 대장균 발현 벡터인 pET28a에 hSTM1을 삽입하였다. pET28a, pET28a-hSTM1 을 BL21 대장균에 형질전환시킨 다음, OD600 = 0.5 되었을 때 최종농도가 0.5mM이 되도록 IPTG를 첨가시킨 후 20℃에서 8시간동안 항온 진탕 배양하여 각 단백질 발현을 유도하였다.

위 각 대장균을 원심분리하여 회수한 다음 1X 결합 완충액 (Binding Buffer) (20mM Tris, 500 mM NaCl, pH 7.5 + Protease inhibitors)에 부유시킨 다음 초음파파쇄기 (sonicator)를 이용하여 대장균을 깼다. 모두 깨진 대장균을 원심분리하여(12,000rpm, 30min, 4℃) 상층액을 주사기 필터(0.45um)를 이용하여 걸러내었다.

b. 6x His 태그된 단백질을 His 결합 아가로즈 레진에 결합시키는 단계

- 니켈이온이 붙어 있는 His 결합 아가로즈 레진 (His bind agarose resin)을 엘피스로 부터 구입한 후(ELPIS Cat. No. EBE-1031), 사용하고자하는 레진의 3배 양의 멸균수로 씻은 다음, 3배 양의 1X 결합 완충액 (binding buffer)으로 씻어 레진을 준비하였다.

- 1의 레진을 A)의 6xHis가 붙어 있는 단백질이 들어 있는 시료에 각각 첨가한 후, 4℃에서 3시간동안 회전시켜 섞어 줌으로써 His 레진과 단백질들이 결합할 수 있도록 하였다.

- 2의 시료를 컬럼에 넣은 후 0.6~0.7배의 결합 완충액 (Binding buffer)으로 3회 씻어주었다.

c. His bind 아가로즈 레진에 결합되어 있는 6xHis tagged 단백질과 반응시킬 total cell lysate를 준비하는 단계

SW620 cell line을 대량배양한 후 D-PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, GIBCO, Ca. No. 21600-010)로 회수한 후 초음파파쇄기 (Sonicator)로 세포를 깬 다음 원심 분리한 다음 (12,000rpm, 30min, 4℃) 주사기 필터(0.45um)를 이용하여 걸러내었다. 걸러진 전체 세포 용해물 (total cell lysate)에 약간의 His 레진을 첨가시킨 후 4℃에서 3시간동안 회전시켜 잡다한 단백질 등을 제거하여 시료를 준비하였다.

d. His bind 아가로즈 레진에 결합되어 있는 6xHis tagged 단백질과 상호작용하는 단백질을 검출하는 단계

단계 c의 cell lysate를 b의 His 단백질이 결합되어 있는 레진에 첨가한 후 4℃에서 12시간동안 섞어 준 후 D-PBS로 3회 씻어 주었다. 다양한 농도의 NaCl 완충액 (buffer)을 첨가하면서 His 단백질에 결합되어 있던 세포 용해물 (Cell lysate) 내 단백질들을 회수한 다음 SDS 샘플 완충액 (Sample buffer)을 넣고 95℃에서 15분 동안 변성시킨 후 10% SDS-PAGE 겔에 전기영동하였다. 각각의 단백질을 웨스턴 블럿으로 확인하였다. 사용한 항체는 항-His (anti-His), 항-Gia1/2/3 (anti-Gia1/2/3) 를 사용하였다. 그 결과 Gαi 서브유닛 (subunit) 이 hstm1에 결합함을 알 수 있었다.

2) 면역침전법 (immunoprecipitation) 이용 - Flag 태그된 (tagged) hstm1 을 이용한 결합하는 G-단백질 동정

SW620 세포주에 Flag 태그된 (taggd) hstm1 을 트랜스펙션 시키고 72시간 동안 배양 후 실시 예 11의 c 와 같은 방법으로 시료를 준비하고 Flag 비드 (bead) (sigma) 를 이용하여 Flag 태그된 hstm1을 비드에 결합시킨 후 나머지 단백질들을 상기 d 와 같은 방법으로 처리 한 후 전지영동하고 웨스턴 블럿으로 확인하였다. 사용한 항체는 항-flag (anti-flag)와 항-Gαi1/2/3 (anti-Gαi1/2/3) 이며 이에 대한 정보는 상기 실시예 6에 제시되어 있다.

실시예 13. siRNA를 이용한 세포신호 전달 과정 규명

1) G-protein siRNA 를 이용한 hstm1 신호전달 저해 규명및 관련 Gαi subunit 결정

hSTM1a의 신호전달 기전이 Gαi 단백질의 이소타입 (isotype) 중 어떠한 단백질에 의해 이루어지는지에 대한 연구를 siRNA방법을 사용한 유전자 넉-다운 (gene knock-down)을 시킴으로써 확인하였다. NIH3T3-IRES-EV 와 NIH3T3-IRES-hSTM1 세포주들을 6-웰 플레이트에 각각 1.5 X 10⁵, 2 X 10⁵개의 세포를 깔아준 후 세포가 배양 플레이트의 표면적을 40 % 정도 덮을 때까지 배양시켜주었다. 그 후, 500μl의 무혈청 DMEM에 Gαi-1, Gαi-2, Gαi-3에 대한 siRNA 및 scrambled siRNA (1+2) (stock: 20 nmol)를 각각 5 μl 씩 첨가시켰다. 이 각각의 시료들에 siRNA 트랜스펙션 시약인 hiperfect (Qiagen)를 제조사의 매뉴얼 대로 각각 15 μl씩 첨가시켜준 후, 교반기를 사용하여 잘 섞어 주었으며, 상온에서 siRNA 트랜스펙션 복합체가 생기도록 15분 동안 방치하였다. 이 동안 각 웰에 있는 배지를 새로운 10% FBS-DMEM 1.5 ml으로 갈아주었고, 15분이 지난 후에 각 시료들을 각 웰에 한 방울씩 천천히 첨가 시켜 주었다 (세포에 첨가된 siRNA의 최종 농도는 5 pmol이다). 48 시간의 배양 시간 후, 다시 한 번 hiperfect (Qiagen) 를 이용한 siRNA의 세포주입과정을 같은 농도의 siRNA를 사용하여 시행 하였으며, 두 번째의 siRNA의 첨가 후 24 시간이 지난 뒤에 세포에 세포 용해 완충용액 (RIPA cell lysis buffer)를 200 μl씩 첨가하거나 Trizol을 500 μl씩 첨가시킴으로써 단백질, 혹은 RNA을 각 시료에서 뽑아내었다.

단백질에 대한 시료의 경우, 각 시료에서 30 μg의 단백질만을 사용, SDS-PAGE, 웨스턴 블럿을 수행하여 siRNA를 통한 Gαi-1, Gαi-2, Gαi-3의 유전자 넉-다운 (gene knock-down)이 각각의 세포주에서 특정 단백질의 발현 양에 어떠한 변화를 주는지에 대하여 살펴보았다.

RNA 시료에서는 상기되어진 RT-PCR 실험 방법을 사용하여 siRNA를 통한 유전자 넉-다운이 각각의 세포주에서 특정 유전자의 mRNA 발현 양에 어떠한 변화를 주는지에 대하여 살펴보았다. 사용된 siRNA의 염기서열과 RT 프라이머 (primer)는 다음과 같다.

같은 시료에 대해 단백질 샘플을 준비하고 cyclinD1, β-actin 에 대해 western blot을 통하여 단백질량의 변화를 확인하였다. 그 결과 Gαi-2, Gαi-3의 siRNA 에 의해 hstm1의 세포신호전달이 저해됨을 알 수 있었다.

2) hstm1 siRNA를 이용한 암세포주의 성장능 저해 검증

위암 세포주와 간암 세포주를 이용하여 상기 1)에서 설명한 동일한 방법으로 hstm1의 siRNA 를 48시간 단독처리 후 세포성장 저해 정도를 관찰하였다. 도 9의 A 는 위암 세포주에서의 si-hstm1 처리 후 플레이트 (plate) 상의 세포를 나타낸 그림이고, 도 9의 B는 간암 세포주를 이용하여 실험한 결과이다. 세포 모양과 포화도면에서 si-hstm1을 처리한 시료에서 세포 성장이 전반적으로 늦음을 알 수 있었다. 그 결과를 WST 분석을 통하여 그래프로 나타내었다. (도 9 C) 정량적 그래프에서도 몇몇 반응이 없는 세포주도 있었지만 전반적으로 si-hstm1에 의해 위암 세포주 (5/7) 및 간암 세포주(2/4)의 성장이 늦어짐을 알 수 있었다. 사용한 siRNA 순열은 하기 표 6과 같고, 예상되는 hstm1의 siRNA 부위에 대한 siRNA 서열을 아래 표 7에 각각 나타내었다.

실시예 14. Migration 및 Invasion assay

hstm1을 과발현하는 세포주의 운동성을 조사하기 위하여 ibidi Culture-Insert (Cat No.80206) 가 들어 있는 디쉬를 이용하여 분리된 세포를 인서트(insert) 내부에만 넣어 바닥에 부착시키고 세포가 완전히 부착한 후 Culture-Insert를 떼어내어 인서트 사이에 만들어진 통로에 세포가 이동하는 모습을 관찰하였다. 현미경상으로 시간별로 관찰하면서 사진을 촬영하였다.

그 결과 hstm1을 과발현하는 세포주가 대조군에 비하여 세포간극으로의 세포의 이동이 많이 일어남을 알 수 있었고 이는 운동성이 많아졌음을 나타내는 결과이다 (도 10 A).

또한, hstm1을 과발현하는 세포주의 전이능력을 조사하기 위하여 Chemicon 의 ECM Invasion Chamber (70019) 를 사용하였다. 무혈청 (serum free) 배지를 챔버(chamber)의 내부에 넣어 30분간 두어 invasion assay에 적절한 상태로 만들고, 무혈청 배지에 재현탁(resuspend) 한 세포를 같은 수만큼 세어 챔버(chamber)의 내부에 넣고 챔버 의 바깥 웰에는 10% 혈청이 들어 있는 배지를 넣어 24시간 동안 CO₂ 배양기에 넣어 배양하였다. 24시간 후 챔버를 꺼내어 1% crystal violet 용액에 담구어 세포를 염색하고 나머지 염료를 물로 깨끗이 씻은 후 챔버 안에서 챔버 바깥으로 Invasion 된 세포 량을 관찰하였다 (도 10 B). 정량적인 분석을 위하여 염색된 세포로부터 1% 아세트산(Acetic acid) 용액으로 염료를 분리하고 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 흡관도를 측정하였다. 결과, hstm1을 과발현하는 세포주의 전이능력이 높아졌음을 알 수 있었다 (도 10 B).

도 1은 (A) 본 발명의 신규한 GPCR 유전자 (인간 hstm1 유전자) 이소폼 1 (isoform 1)의 전사 변이체 (transcription variant)를 나타낸 그림이다. (B) 각종 사람 조직에서의 본 발명의 GPCR 유전자 (hstm1 유전자)의 발현 정도를 RT PCR 을 통하여 나타낸 그림이며, (C) 각종 사람 조직에서의 본 발명의 GPCR 유전자 (hstm1 유전자)의 발현을 상대치로 나타낸 그래프이다.

도 2는 대표 소화기관 및 관련 장기 세포주에서의 본 발명의 GPCR 유전자 (hstm1 유전자)의 발현 정도를 RT PCR (A) 및 Real-time PCR (B) 을 통하여 상대치로 나타낸 그림이다. (C) 위암 환자의 비종양, 종양 조직에서의 본 발명의 GPCR 유전자 (hstm1 유전자)의 발현 변화를 real-time PCR을 이용하여 조사한 그래프이다

도 3은 (A) 본 발명의 GPCR 유전자 (hstm1 유전자)를 과발현하는 정상 세포주의 세포군 (foci) 형성 및 접촉성 증식억제 (contact inhibition)에 민감하지 않음을 나타내는 그림이다. (B) 본 발명의 GPCR 유전자 (hstm1 유전자)를 과발현하는 정상세포주의 대조군 대비, 세포 농도별 성장 및 세포군 (foci) 형성을 나타낸 그림이다. (C) 본 발명의 GPCR 유전자 (hstm1 유전자)를 과발현하는 정상세포주의 대조군 대비, 빨라진 성장속도를 나타내는 그림이다. (D) 본 발명의 GPCR 유전자 (hstm1 유전자)를 과발현하는 정상 세포주의 세포주기 분석 결과이다. (E) 본 발명의 GPCR 유전자 (hstm1 유전자)를 과발현하는 정상세포주의 비부착성 증식 (anchorage-independent growth)을 나타내는 그림과 그래프이다. (F) 면역 결손 마우스에 본 발명의 GPCR 유전자 (hstm1 유전자)를 과발현하는 정상세포주와 그 대비군을 피하에 주사하여 종양(tumor) 형성을 나타낸 도이다.

도 4는 본 발명의 GPCR 유전자 (hstm1 유전자)를 과발현하는 정상세포주의 세포성장 촉진과 종양형성 관련 MAP 카이네이즈 경로 (MAP Kinase pathway)(A) 및 세포사멸저해 관련 유전자발현을(B) 웨스턴 블럿을 이용하여 조사한 그림이다.

도 5는 (A) 본 발명의 GPCR 유전자 (hstm1 유전자)를 과발현하는 정상세포주의 cAMP 농도의 변화를 cAMP 활성화제 (cAMP activator)인 포스콜린 (forskolin) 의 농도에 따라 나타낸 그래프이다. (B) 본 발명의 GPCR 유전자 (hstm1 유전자)를 과발현과 포스콜린 (forskolin) 처리에 따른 cAMP 반응 요소 (cAMP response element) 인 CRE-Luc 리포터 분석 (CRE-Luc reporter assay) 결과를 나타낸 그래프이다. (C) 본 발명의 GPCR 유전자 (hstm1 유전자)를 일시적으로 과발현하는 정상세포주에서의 p-raf1 유전자의 인산화의 변화를 나타낸 그림이다. (D) 본 발명의 GPCR 유전자 (hstm1 유전자)를 안정적으로 과발현하는 정상세포주에서 p-raf1 유전자의 인산화의 변화를 나타낸 그림이다.

도 6은 (A) 본 발명의 GPCR 유전자 (hstm1 유전자)를 안정적으로 과발현하는 정상세포주의 혈청 반응 (serum response)와 PTX 처리 후 혈청 반응 (serum response)에서의 차이점을 나타낸 그래프이다. (B) 본 발명의 GPCR 유전자 (hstm1 유전자)를 과발현하는 정상세포주의 각종 성장 인자 (Growth factor)와 알려진 GPCR 리간드 (GPCR ligand) 에 대한 PTX 처리에 유, 무에 따른 변화된 반응을 나타낸 그래프이다.

도 7은 (A) 도 7에서 대조군 (control)에 비해 본 발명의 GPCR 유전자 (hstm1 유전자)를 과발현하는 정상 세포주에서 세포성장 반응이 더 민감한 인자중 하나의 예로서 IGFI, IGFII 의 전사량의 변화와 그의 하위 인자인 cyclin D1의 발현 변화를 나타낸 그림이다. (B) 본 발명의 GPCR 유전자 (hstm1 유전자)를 과발현하는 정상세포주에서의 민감한 세포성장 반응을 보인 성장 인자중에서 IGFI 의 신호전달을 저해하기 위하여 anti-IGFI, anti-IGFII 항체를 처리한 후 세포 성장에 있어서의 면역-보호 분석 (immuno-protection assay) 결과를 웨스턴 블럿 (western blot)으로 나타낸 그림이다. (C) anti-IGFI, anti-IGFII 항체를 처리한 후 세포 성장을 세포사진으로 나타낸 그림이다 (D) anti-IGFI, anti-IGFII 항체를 처리한 후 세포 성장을 WST 분석 (WST assay))으로 정량화한 그래프이다.

도 8은 (A) 박테리아에서 과 발현시킨 His 태그된 본 발명의 GPCR 단백질 (His 태그된 hstm1 단백질)을 이용하여 그 단백질에 결합하는 G-단백질 (G-protein)을 시험관 내 결합 분석 (in vitro binding assay)를 통하여 동정하는 그림이다. (B) 본 발명의 GPCR 유전자 (hstm1 유전자)를 일시적으로 과발현하는 세포 주에서 flag-태그된 본 발명의 GPCR (flag-태그된 hstm1)을 이용한 상호-면역침전 (co-immunoprecipitation) 실험 결과를 나타내는 그림이다. (C) Gαi1, 2, 3 의 siRNA 를 이용한 cyclin D1 과 SP1/Egr1 단백질의 변화와 IGFI, IGFII mRNA 량의 변화를 나타낸 그림이다.

도 9는 본 발명의 GPCR 유전자에 대한 siRNA (hstm1 siRNA) 를 이용한 위암 (A), 간암 (B) 세포주에서의 세포성장 저해를 나타낸 세포 그림이다. (C) 본 발명의 GPCR 유전자에 대한 siRNA (hstm1 siRNA)를 이용한 위암, 간암 세포주에서의 세포 성장 저해 정도를 나타낸 그래프이다.

도 10은 (A) 본 발명의 GPCR 유전자 (hstm1 유전자)를 안정적으로 과발현하는 정상세포주의 운동성을 관찰한 결과이고, 도 10 (B)는 본 발명의 GPCR 유전자 (hstm1 유전자)를 과발현하는 정상세포주의 전이능력을 나타낸 그림이며, 그 정량적인 결과를 나타낸 그래프이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A NOVEL G PROTEIN COUPLED RECEPTOR AND A USE THEREOF <130> PA080661KR <160> 51 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 291 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(29) <223> hstm1 isoform 1 <400> 1 Met Val Trp Lys Lys Leu Gly Ser Arg Asn Phe Ser Ser Cys Pro Ser 1 5 10 15 Gly Ser Ile Gln Trp Ile Trp Asp Val Leu Gly Glu Cys Ala Gln Asp 20 25 30 Gly Trp Asp Glu Ala Ser Val Gly Leu Gly Leu Ile Ser Ile Leu Cys 35 40 45 Phe Ala Ala Ser Thr Phe Pro Gln Phe Ile Lys Ala Tyr Lys Thr Gly 50 55 60 Asn Met Asp Gln Ala Leu Ser Leu Trp Phe Leu Leu Gly Trp Ile Gly 65 70 75 80 Gly Asp Ser Cys Asn Leu Ile Gly Ser Phe Leu Ala Asp Gln Leu Pro 85 90 95 Leu Gln Thr Tyr Thr Ala Val Tyr Tyr Val Leu Ala Asp Leu Val Met 100 105 110 Leu Thr Leu Tyr Phe Tyr Tyr Lys Phe Arg Thr Arg Pro Ser Leu Leu 115 120 125 Ser Ala Pro Ile Asn Ser Val Leu Leu Phe Leu Met Gly Met Ala Cys 130 135 140 Ala Thr Pro Leu Leu Ser Ala Ala Gly Pro Val Ala 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ttcatcaaag 900 cctacaagac gggcaacatg gaccaggcgc tgtccctgtg gttcctcctg ggctggattg 960 gcggagactc ctgcaacctc atcggctcct tccttgctga ccagctgccc ctgcagacct 1020 acacggctgt gtattatgtc ttggcagacc tggtgatgct gacgctgtac ttttactaca 1080 agttcaggac gcgcccctct ctgttgtctg cccccatcaa ctccgtgctg ttgttcctca 1140 tggggatggc gtgcgccaca ccgctgctga gtgctgctgg gcccgtggct gcccctaggg 1200 aagccttccg ggggcgggcg ctcctgtccg tggagtcggg cagcaagccc ttcacccggc 1260 aggaagtcat tggcttcgtc atcggctcca tctccagcgt gttgtacctg ctttcccggc 1320 tgcctcagat ccgcaccaac ttcctccgga agtccaccca ggggatctcc tactctctgt 1380 tcgcgctggt gatgctgggg aacacgctgt atgggctgag cgtgctgctc aaaaaccccg 1440 aggagggcca gagcgagggc agctacctgc tgcaccacct gccctggctt gtgggcagcc 1500 tgggcgtgct gctgctcgac accatcatct ccatccagtt cctggtgtac aggcgcagca 1560 ccgccgcctc ggagcttgag cccctcctcc ccagctgacc agaaccaggc tgagcgcagg 1620 aggacaggca ccaccggatg ccacaccagg caggaggagg tgtggacagt gatggtacgg 1680 cggccctgca tcagcctgcg ggtggcctct ggatcctccg tggaccgaac 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cacaatctcc ccaggtctgc agggaccgag 240 ggcctacact gcctcctccc acgccgtgct taggaaccct tgctggcctc agaacaccag 300 cgccctccct ccggtgcagc cctgcctggc cgggggcccc tcctccacag ccatggtctg 360 gaagaaactg ggctcccgca acttctccag ctgccccagt ggctccatcc agtggatatg 420 ggatgtgttg ggtgaatgtg cccaggacgg ctgggacgag gccagcgtgg gcctgggctt 480 gatctccatt ctctgctttg ctgcatctac cttcccccag ttcatcaaag cctacaagac 540 gggcaacatg gaccaggcgc tgtccctgtg gttcctcctg ggctggattg gcggagactc 600 ctgcaacctc atcggctcct tccttgctga ccagctgccc ctgcagacct acacggctgt 660 gtattatgtc ttggcagacc tggtgatgct gacgctgtac ttttactaca agttcaggac 720 gcgcccctct ctgttgtctg cccccatcaa ctccgtgctg ttgttcctca tggggatggc 780 gtgcgccaca ccgctgctga gtgctgctgg gcccgtggct gcccctaggg aagccttccg 840 ggggcgggcg ctcctgtccg tggagtcggg cagcaagccc ttcacccggc aggaagtcat 900 tggcttcgtc atcggctcca tctccagcgt gttgtacctg ctttcccggc tgcctcagat 960 ccgcaccaac ttcctccgga agtccaccca ggggatctcc tactctctgt tcgcgctggt 1020 gatgctgggg aacacgctgt atgggctgag cgtgctgctc aaaaaccccg aggagggcca 1080 gagcgagggc agctacctgc tgcaccacct gccctggctt gtgggcagcc tgggcgtgct 1140 gctgctcgac accatcatct ccatccagtt cctggtgtac aggcgcagca ccgccgcctc 1200 ggagcttgag cccctcctcc ccagctgacc agaaccaggc tgagcgcagg aggacaggca 1260 ccaccggatg ccacaccagg caggaggagg tgtggacagt gatggtacgg cggccctgca 1320 tcagcctgcg ggtggcctct ggatcctccg tggaccgaac cgtcccccca ggaacacacc 1380 ttcaggtaga ccccgaagcc tcaaggccgg ggctggagcg gagaccccag ggcctctcag 1440 gagacagtga ggctgcccct cctaccacct acctcattct gcctactcac cccaggggcc 1500 acagccacag cctgctggac tcaggactgt cctgtcaact ccagacaact gaataaacag 1560 gccgggtaca gtggctcgca cctgtaatcc tagcactttg ggaggccgaa gcgggtggac 1620 cacttgacgt ccgtagttcg agaccagcct ggccaacatg gtgaaacccc atctctacta 1680 aaaatacaaa aattagccag gtgtggtggc acacatctgt agtcccagct acttgggagg 1740 ctgaggcagg agaactgttt gaacctggga gacagaggtt gcggtgaacc gagatcgtgc 1800 cactgtactc cagcctgggt gacagagtga gactccgtct caaaaaaata aaaaagataa 1860 ccgaggaaac ggtacctccc catg 1884 <210> 5 <211> 1642 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gcgctggtga 780 tgctggggaa cacgctgtat gggctgagcg tgctgctcaa aaaccccgag gagggccaga 840 gcgagggcag ctacctgctg caccacctgc cctggcttgt gggcagcctg ggcgtgctgc 900 tgctcgacac catcatctcc atccagttcc tggtgtacag gcgcagcacc gccgcctcgg 960 agcttgagcc cctcctcccc agctgaccag aaccaggctg agcgcaggag gacaggcacc 1020 accggatgcc acaccaggca ggaggaggtg tggacagtga tggtacggcg gccctgcatc 1080 agcctgcggg tggcctctgg atcctccgtg gaccgaaccg tccccccagg aacacacctt 1140 caggtagacc ccgaagcctc aaggccgggg ctggagcgga gaccccaggg cctctcagga 1200 gacagtgagg ctgcccctcc taccacctac ctcattctgc ctactcaccc caggggccac 1260 agccacagcc tgctggactc aggactgtcc tgtcaactcc agacaactga ataaacaggc 1320 cgggtacagt ggctcgcacc tgtaatccta gcactttggg aggccgaagc gggtggacca 1380 cttgacgtcc gtagttcgag accagcctgg ccaacatggt gaaaccccat ctctactaaa 1440 aatacaaaaa ttagccaggt gtggtggcac acatctgtag tcccagctac ttgggaggct 1500 gaggcaggag aactgtttga acctgggaga cagaggttgc ggtgaaccga gatcgtgcca 1560 ctgtactcca gcctgggtga cagagtgaga ctccgtctca aaaaaataaa aaagataacc 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tgagtgagtt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF-1 Forward primer <400> 12 cctcttctac ctggcgctct 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF-1 Reverse primer <400> 13 gggacttctg agtcttgggc 20 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF-2 Forward primer <400> 14 ggaccgcggc ttctacttca g 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF-2 Reverse primer <400> 15 gaccccggcg ggcacgcagg a 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cyclin D1 Forward primer <400> 16 gaacacttcc tctccaaaat g 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cyclin D1 Reverse primer <400> 17 gttctgctgg gcctggcgca g 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSTM1a Forward primer <400> 18 tcatcaaagc ctacaagacg g 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSTM1a Reverse primer <400> 19 ggtggacttc cggaggaagt t 21 <210> 20 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scrambled-1 Forward siRNA <400> 20 guccacauuc gacgcccac 19 <210> 21 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scrambled-1 Reverse siRNA <400> 21 gugggcgucg aauguggac 19 <210> 22 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scrambled-2 Forward siRNA <400> 22 agcgcugaca acaguuuca 19 <210> 23 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scrambled-2 Reverse siRNA <400> 23 ugaaacuguu gucagcgcu 19 <210> 24 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G alpha i-1 Forward siRNA <400> 24 gcacagagug acuacaucc 19 <210> 25 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G alpha i-1 Reverse siRNA <400> 25 ggauguaguc acucugugc 19 <210> 26 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G alpha i-2 Forward siRNA <400> 26 ggagugcuga agaaggagu 19 <210> 27 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G alpha i-2 Reverse siRNA <400> 27 acuccuucuu cagcacucc 19 <210> 28 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G alpha i-3 Forward siRNA <400> 28 agcugcuuac auucagugc 19 <210> 29 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G alpha i-3 Reverse siRNA <400> 29 gcacugaaug uaagcagcu 19 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G alpha i-1 Forward primer <400> 30 ggcggatgat gctcgccaac t 21 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G alpha i-1 Reverse primer <400> 31 gatgacgtct gttacagcat c 21 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G alpha i-2 Forward primer <400> 32 gtgactacat ccctacacag c 21 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G alpha i-2 Reverse primer <400> 33 gacggcatcg aacacaaact g 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G alpha i-3 Forward primer <400> 34 gaaccgaatg catgaaagca t 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G alpha i-3 Reverse primer <400> 35 tgatgacatc cgtaacagca t 21 <210> 36 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hstm1-1 Forward siRNA <400> 36 ccgugcuguu guuccucau 19 <210> 37 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hstm1-1 Reverse siRNA <400> 37 augaggaaca acagcacgg 19 <210> 38 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hstm1-2 Forward siRNA <400> 38 uccagcgugu uguaccugc 19 <210> 39 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hstm1-2 Reverse siRNA <400> 39 gcagguacaa cacgcugga 19 <210> 40 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1361/2279 Forward siRNA <400> 40 ggggaucucc uacucucug 19 <210> 41 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1361/2279 Reverse siRNA <400> 41 cagagaguag gagaucccc 19 <210> 42 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1509/2279 Forward siRNA <400> 42 cugcugcucg acaccauca 19 <210> 43 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1509/2279 Reverse siRNA <400> 43 ugaugguguc gagcagcag 19 <210> 44 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1322/2279 Forward siRNA <400> 44 gccucagauc cgcaccaac 19 <210> 45 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1322/2279 Reverse siRNA <400> 45 guuggugcgg aucugaggc 19 <210> 46 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1511/2279 Forward siRNA <400> 46 gcugcucgac accaucauc 19 <210> 47 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1511/2279 Reverse siRNA <400> 47 gcugcucgac accaucauc 19 <210> 48 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1015/2279 Forward siRNA <400> 48 agaccuacac ggcugugua 19 <210> 49 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1015/2279 Reverse siRNA <400> 49 uacacagccg uguaggucu 19 <210> 50 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1052/2279 Forward siRNA <400> 50 ggugaugcug acgcuguac 19 <210> 51 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1052/2279 Reverse siRNA <400> 51 guacagcguc agcaucacc 19

Claims (24)

1. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 GPCR (G Protein Coupled Receptor) 폴리펩티드.
2. 제1항의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
3. 제2항에 있어서, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5로 표시되는 폴리뉴클레오티드.
4. 제2항의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터.
5. 제4항의 벡터로 형질전환된 숙주세포.
6. 제5항의 세포를 대리모의 자궁에 착상시켜 수득한 형질전환 동물.
7. 제2항의 폴리뉴클레오티드의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암 마커 검출용 조성물.
8. 제7항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제 는 상기 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프라이머 (primer) 쌍, 프로브 (probe) 또는 안티센스 (anti-sense) 뉴클레오티드인 조성물.
9. 제7항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준을 측정하는 제제는 항체인 조성물.
10. 제7항에 있어서, 상기 암은 위암, 대장암 또는 간암인 조성물.
11. 제7항에 있어서, 상기 암은 전이성암인 조성물.
12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 암 진단용 키트.
13. 제12항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 경쟁적 RT-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는 암 진단용 키트.
14. (a) 생물학적 시료를 제공하는 단계;

    (b) 상기 생물학적 시료에 제8항의 제제를 처리하는 단계;

    (c) 상기 제제와 상기 제제에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 결합을 검출하는 단계; 및

    (d) 검출된 양을 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 제2항의 폴리뉴클 레오티드를 검출하는 방법.
15. (a) 생물학적 시료를 제공하는 단계;

    (b) 상기 생물학적 시료에 제1항의 단백질에 대한 항체를 처리하는 단계;

    (c) 항체-항원 복합체를 검출하는 단계; 및

    (d) 검출된 양을 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 제1항의 단백질을 검출하는 방법.
16. 제2항의 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드를 포함하는, 암 치료 및 예방용 조성물.
17. 제16항에 있어서, 상기 올리고 뉴클레오티드는 제2항의 유전자에 대한 안티센스 올리고 뉴클레오티드, siRNA 또는 shRNA인 조성물.
18. 제17항에 있어서, 상기 siRNA는 서열번호 20 내지 서열번호 23 및 서열번호 36 내지 서열번호 51의 서열 중 어느 하나 이상의 서열로 구성되는 것인 조성물.
19. 제15항에 있어서, 상기 암은 위암, 대장암 또는 간암인 조성물.
20. 제15항에 있어서, 상기 암은 전이성암인 조성물.
21. 제1항의 폴리펩티드의 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암 치료 및 예방용 조성물.
22. 제1항의 폴레펩티드를 발현하는 세포에 후보 화합물을 처리하는 단계; 및

    GPCR-매개 시그날 전달 활성의 증가 또는 감소를 측정하는 단계를 포함하는, 제1항의 폴리펩티드 조절자의 스크리닝 방법.
23. 제22항에 있어서, 상기 GPCR-매개 시그날 전달 활성의 증가 또는 감소의 측정은 cAMP 수치의 증가 또는 감소의 측정으로 이루어지는 방법.
24. 제1항 폴리펩티드를 발현하는 세포에 후보 화합물을 처리하는 단계; 및

    GPCR-매개 시그날 전달 활성의 증가 또는 감소를 측정하는 단계를 포함하는, 암 치료제의 스크리닝 방법.

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