CN105907759A - 靶向沉默Gβ2的shRNA - Google Patents

靶向沉默Gβ2的shRNA Download PDF

Info

Publication number
CN105907759A
CN105907759A CN201610361177.3A CN201610361177A CN105907759A CN 105907759 A CN105907759 A CN 105907759A CN 201610361177 A CN201610361177 A CN 201610361177A CN 105907759 A CN105907759 A CN 105907759A
Authority
CN
China
Prior art keywords
shrna
beta2
silent
carried out
target fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610361177.3A
Other languages
English (en)
Inventor
朱筱娟
郭野
何潇潇
赵璐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Northeastern University China
Northeast Normal University
Original Assignee
Northeast Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Northeast Normal University filed Critical Northeast Normal University
Priority to CN201610361177.3A priority Critical patent/CN105907759A/zh
Publication of CN105907759A publication Critical patent/CN105907759A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于生物工程中的DNA重组技术领域，具体涉及特异性沉默靶标蛋白Gβ2的shRNA。本发明首先是根据鼠源的Gβ2序列设计出19bp的目的片段，合成的目的片段两端带有合适的酶切位点，将目的片段连接到pLL3.7载体上，连接，形成核心的沉默载体，转化，挑取阳性克隆进行PCR鉴定。鉴定正确后，进行DNA测序，随后通过免疫印记实验进行沉默效率的检测。设计合成了两个能够靶向鼠源Gβ2的19bp的shRNA，序列为 GGGATGTTCGGGATTCCAT和GGATCAGATGACGCCACTT。

Description

靶向沉默Gβ2的shRNA
技术领域
本发明属于生物工程中的DNA重组技术领域，具体涉及特异性沉默靶标蛋白Gβ2的shRNA。
背景技术
G蛋白β亚基2（G protein β subunit 2，Gβ2 ）是异源三聚体G蛋白的重要组成部分。能够与Gγ亚基组成二聚体，共同参与细胞内的信号转导过程。Gβ2由340个氨基酸残基组成，主要结构是七个重复的WD domain，空间折叠后形成螺旋桨型结构。之前研究报道说明WDdomain在进化上保守的功能性结构域，主要参与的参与组成RNA加工复合体，转录调节因子；也在细胞骨架建成、有丝分裂纺锤体建成、小泡形成及运输，以及细胞分裂等方面发挥作用。有文献报道证明Gβ2直接参与调节线粒体融合，调节神经靶标酯酶活性，并且与微管与纺锤体形成，神经突发生，以及wnt通路都有直接关系。
在传统观点认为，Gβ2的作用仅仅是形成Gβγ二聚体，作为Gα亚基的抑制因子，抑制三聚体G蛋白的持续激活。越来越多的报道证明，Gβ2所形成的Gβγ亚基有自己独立的功能，包括调节线粒体的裂变和融合，调节基因转录等等。因此Gβ2对细胞的多种生物学功能有调控作用，所以特异性的沉默Gβ2对细致精确的研究其功能至关重要。
发明内容
本发明的目的是合成特定的能够靶向沉默Gβ2的shRNA，为更加深入的研究Gβ2以及其在细胞信号转导和细胞运动中的作用提供了有效的手段。
本发明中所需要构建的主要是Gβ2的沉默载体。核心沉默载体构建分为两个大的步骤，首先是根据鼠源的Gβ2序列设计出19bp的目的片段，合成的目的片段两端带有合适的酶切位点，将目的片段连接到pLL3.7载体上，连接，形成核心的沉默载体，转化，挑取阳性克隆进行PCR鉴定。鉴定正确后，进行DNA测序，随后通过免疫印记实验进行沉默效率的检测。
本发明中设计合成了两个能够靶向鼠源Gβ2的19bp的shRNA，序列为
GGGATGTTCGGGATTCCAT和GGATCAGATGACGCCACTT能够特异性沉默Gβ2的表达。
载体的构建包括以下步骤：
第一步，序列设计
根据鼠源Gβ2基因序列在Invitrogen公司主页上用相应的软件设计特异性识别Gβ2的序列。
第二步，双链人工合成DNA序列构建
将人工合成的两条Sense和Antisense通过变性、退火形成双链DNA。
第三步，沉默载体的构建
将沉默载体pLL3.7双酶切后, 利用回收试剂盒回收线性化载体，将回收片段与退火所得双链DNA片段进行链接、转化、鉴定阳性克隆、测序得到构建成功的沉默载体。
第四步，沉默靶蛋白效率的检测
提取质粒，转染细胞后提取蛋白，利用免疫印迹检测沉默效率。
附图说明：
图1 ：pLL3.7载体双酶切凝胶电泳图；
图2 ：Gβ2 shRNA632菌液PCR结果凝胶电泳图，白色框中为阳性结果；
图3 ：Gβ2 shRNA730菌液PCR结果凝胶电泳图，白色框中为阳性结果；
图4 ：Western Blot沉默效率检测结果。
本发明中设计合成的19bp的目的片段，能够特异性的沉默Gβ2， Gβ2是三聚体G蛋白的重要组成部分。经研究表明，Gβ2在细胞信号转导和细胞运动过程中起到重要作用，构建成功的载体，能够特异性的沉默Gβ2，降低细胞运动能力。因此，Gβ2沉默载体的应用能够更为精细的研究细胞信号转导和细胞运动，为解释相关机制提供理论基础。
具体实施方式：
实施例一: 特异性沉默靶标蛋白Gβ2的表达载体构建
1、特异性沉默靶蛋白Gβ2的序列设计
（1）根据鼠源Gβ2基因序列在Invitrogen公司主页上用相应的软件设计，设计的原则：19bp的特异性结合Gβ2的序列的GC含量为45%-55%，退火温度45℃-65℃，同时要求序列起始的第一个碱基为G。将选取的片段进行BLAST人基因组比对，选择特异性序列。
（2）以HpaⅠ- GN18-TT-loop- 81NC-XhoⅠ形式合成一段55bp序列，81NC为N G18的反向互补，5’端为HpaⅠ酶切位点，3’端为XhoⅠ酶切位点。设计合成的片段分别靶向Gβ2的cDNA序列632- 650 （Gβ2 shRNA632）和730-748 （Gβ2 shRNA730） 。
2、 特异性沉默靶蛋白Gβ2的序列的合成与储存
（1）将合成的两段oligo溶解至50 µM，各取100µl混合。
（2）95 ℃变性5min，72 ℃孵育10min，关闭PCR仪。
（3）取出混匀，放在冰上备用，或者-20 ℃长期保存。
3、 沉默载体pLL3.7- Gβ2 shRNAs的构建
（1）取2µg pLL3.7载体，HpaⅠ和XhoⅠ双酶切，电泳，回收线性pLL3.7大片段【图1】
（2）连接和转化。将线性pLL3.7浓度稀释至160ng/µ，连接反应（Promege公司的T4 DNA连接酶）
4℃过夜连接，将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布在具有Amp抗性的LB平板
（3）阳性克隆鉴定。在转化平板上挑取单克隆摇菌，试剂盒提取质粒，通过PCR鉴定阳性克隆【图2-3】。鉴定引物为pLL3.7 test-F：5’-GCACAGACTTGTGGGAGAAG-3’，pLL3.7 test-R:5’CCTGCTGGAATCTCGTGAA-3’。以U6启动子为测序引物，送长春库美基因测序。
实施例二:
沉默靶蛋白效率的检测
（1） 将control、 Gβ2 shRNA分别与Flag-Gβ2表达载体通过PEI共同转染进入293T细胞
（2）提取细胞总蛋白，利用Western blot免疫印迹分析，转入Gβ2沉默载体后，Gβ2表达量显著降低，α-Tubulin为内参【图4】。
序列表
<110>东北师范大学
<120>特异性沉默靶标蛋白Gβ2的表达载体构建及作用
<141> 2015-01-15
<160>19
<210> 2
<211> 19
<212>
<213>人工序列
<220>
<221> misc_RNA
<222> (1)...(19)
<223>
<400> 1
GGGATGTTCGGGATTCCAT和GGATCAGATGACGCCACTT 。

Claims (1)

1.靶向沉默Gβ2的shRNA，其特征是序列为GGGATGTTCGGGATTCCAT和GGATCAGATGACGCCACTT。
CN201610361177.3A 2016-05-30 2016-05-30 靶向沉默Gβ2的shRNA Pending CN105907759A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610361177.3A CN105907759A (zh) 2016-05-30 2016-05-30 靶向沉默Gβ2的shRNA

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610361177.3A CN105907759A (zh) 2016-05-30 2016-05-30 靶向沉默Gβ2的shRNA

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105907759A true CN105907759A (zh) 2016-08-31

Family

ID=56742391

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610361177.3A Pending CN105907759A (zh) 2016-05-30 2016-05-30 靶向沉默Gβ2的shRNA

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105907759A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008138536A2 (en) * 2007-05-15 2008-11-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibody directed to g protein coupled receptors (gpcr)
CN102459326A (zh) * 2009-05-25 2012-05-16 韩国生命工学研究院 新的gpcr蛋白及其用途
CN105296488A (zh) * 2015-12-02 2016-02-03 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院 超声微泡介导的siRNA干扰GRK4在靶向调节尿钠排泄及血压水平中的应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008138536A2 (en) * 2007-05-15 2008-11-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibody directed to g protein coupled receptors (gpcr)
CN101687927A (zh) * 2007-05-15 2010-03-31 霍夫曼-拉罗奇有限公司 针对g蛋白偶联的受体（gpcr）的抗体
CN102459326A (zh) * 2009-05-25 2012-05-16 韩国生命工学研究院 新的gpcr蛋白及其用途
US20120141488A1 (en) * 2009-05-25 2012-06-07 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotech Novel g protein coupled receptor protein and use thereof
CN105296488A (zh) * 2015-12-02 2016-02-03 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院 超声微泡介导的siRNA干扰GRK4在靶向调节尿钠排泄及血压水平中的应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NAITO,Y. ET AL.: "WO 2005116204-A/586075：Double strand polynucleoties generating RNA interference", 《GENBANK》 *
TOMOKO KOHNO ET AL.: "Serum Starvation Activates NF-κB Through G Protein β2 Subunit-Mediated Signal", 《DNA AND CELL BIOLOGY》 *
ZAVZAVADJIAN, J.R.ET AL.: "Synthetic construct clone ATCC 10373438 G protein beta 2 mRNA,complete cds", 《GENBANK》 *
魏庆信等: "《转基因猪制备技术》", 31 October 2013, 中国农业出版社 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Tsuiji et al. Competition between a noncoding exon and introns: Gomafu contains tandem UACUAAC repeats and associates with splicing factor‐1
CN109983124A (zh) 使用可编程dna结合蛋白增强靶向基因组修饰
CN107849562A (zh) 基因组编辑系统及使用方法
WO2012164100A2 (en) Transcription terminator sequences
JP2018534937A5 (zh)
CN107022568A (zh) 哺乳动物细胞中高效多点插入非天然氨基酸的系统
CN106318976A (zh) 一种人类circRNA过表达载体框架、过表达载体及其制备方法
CN114438055B (zh) 新型的crispr酶和系统以及应用
Lyu et al. Evolution of the archaeal and mammalian information processing systems: towards an archaeal model for human disease
CN103805635A (zh) 一种基于J亚群禽白血病病毒env基因保守序列的siRNA重组干扰载体及其制备方法和应用
CN104480125B (zh) 一种卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因
CN105907759A (zh) 靶向沉默Gβ2的shRNA
CN108410902A (zh) 一种新型酿酒酵母表达体系及其构建方法
CN103667344B (zh) 一种激活促红细胞生成素基因表达的方法
CN108265074A (zh) 一种内生真菌高效遗传体系的构建方法及其应用
CN110218741B (zh) 采用串联sgRNA同步激活多个猪内源性干细胞因子转录活性的方法
CN109988777A (zh) 谷氨酰胺合成酶基因以及应用
CN103820453A (zh) 一种能被马氏珠母贝MSX基因激活的Pif启动子及其应用
CN103952410B (zh) 一种有效抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA及其应用
CN105802970A (zh) 靶向沉默Gβ1的shRNA
CN105925578A (zh) 靶向沉默Neogenin的shRNA
CN106497967B (zh) 木薯eIF4E3基因RNAi载体沉默效果的检测方法
Myslinski et al. Promoter strength and structure dictate module composition in RNA polymerase III transcriptional activator elements
CN106047862A (zh) 用于降低酵母双杂交文库假阴性率的反转录方法
CN105969771A (zh) 靶向沉默FOXG1的shRNA

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160831