CN103820453A - 一种能被马氏珠母贝MSX基因激活的Pif启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种能被马氏珠母贝MSX基因激活的Pif启动子及其应用。该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过基因组步移法扩增得到Pif启动子序列，本发明的Pif启动子具有能够与MSX基因结合的结合位点1和结合位点2。通过构建不同片段长度的Pif启动子的野生型和突变型载体，应用双荧光素酶报告基因系统鉴定MSX基因主要通过结合位点1作用于Pif启动子。本发明的能被马氏珠母贝MSX基因激活的Pif启动子能够启动下游目的基因的表达从而促进珍珠或珍珠贝的生长。

Description

一种能被马氏珠母贝MSX基因激活的Pif启动子及其应用

技术领域：

本发明属于水产科学和基因工程领域领域，具体涉及一种能被马氏珠母贝MSX基因激活的Pif启动子及其应用。

背景技术：

马氏珠母贝是一种重要的海产经济双壳贝类，主要用于培育海水珍珠。在我国，该物种主要分布于南方广东、广西和海南的沿海，每年的经济产值达10亿元以上。马氏珠母贝的贝壳和珍珠的形成是一个典型的生物矿化过程并具有相似的机理，根据目前已有的知识和认知，壳和珍珠的主要成分为碳酸钙，占95%以上，和少量的有机质，并认为壳和珍珠的形成主要由有机质的一种壳基质蛋白调控，指导碳酸钙沉积、核化、晶体化（Zhang，2006）。目前已分离或克隆的基质蛋白基因达30多种，如Pif基因是一种酸性基质蛋白，被发现在珍珠质的形成中具有重要的作用（Suzuki，2009），基因的高效表达对促进生长具有显著作用。同时，珍珠也是研究生命骨骼材料的极好对象。因此，对珍珠贝矿化机理的研究具有重要的科学价值和应用价值。

MSX(muscle segment homeobox)基因是同源异型盒基因（homeobox，HOX）家族的成员，包含果蝇肌节同源盒(muscle segment homeobox,MSH)基因相关的一系列基因。MSXs基因的表达产物为核转录因子，可与DNA序列直接结合调控目的基因的表达。虽然它不是一种基质蛋白，但发现在脊椎动物，MSX1或MSX2在胚胎发育、神经嵴组织，及各种器官形成（如骨片、牙齿、头骨、头发、肢体）中起重要的作用。

目前的研究基本上是单一的研究某一基质蛋白的功能（Fang，2012）。对于它如何被调控从而参与壳或珍珠的生物矿化过程还没有研究报道。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种能被马氏珠母贝MSX基因激活的Pif启动子。

本发明的能被马氏珠母贝MSX基因激活的Pif启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。提取马氏珠母贝基因组DNA，根据已有的Pif基因序列设计特异引物1（5′-TTGTGTCGGTGTCAAATCTG-3′）和引物2（5′-GCAAGTTCCATCTATTCGAGTTG-3′），用基因组步移法扩增得到Pif启动子序列，全长1358bp，扩增产物经测序后，采用TRANSFAC网站预测结合位点和核心序列，本发明的Pif启动子与MSX基因的结合位点1序列为ACTAATTGG，与MSX基因的结合位点2序列为GTAATTG，核心序列为-1125～-1bp。

进一步，将MSX基因克隆到pcDNA3.1/myc-His(A)载体中，得到pCDNA3.1-MSX表达载体；将全长1358bp的Pif启动子克隆到含有KpnI和NheI酶切位点的pGL3basic荧光素酶报告基因载体中，得到野生型表达载体P1358Luc，再以得到的野生型表达载体P1358Luc为模板，构建含不同长度Pif启动子野生型荧光素酶报告基因表达载体：P1125Luc（-1125—-1），P907Luc（-907—-1），P473Luc（-473—-1）和P106Luc（-106—-1）；将pCDNA3.1-MSX表达载体、空白表达载体pcDNA3.1/myc-His(A)载体、一系列野生型荧光素酶报告基因表达载体（包括表达载体P1358Luc、P1125Luc、P907Luc、P473Luc、P106Luc）和内参载体质粒pRL-TK共同转染C2C12细胞转染48h后，吸出培养基，用1×PBS漂洗一次，用裂解液裂解，检测荧光素酶。根据计算荧火虫荧光素酶的表达值与内参对照海肾素荧光素酶表达值的比值判别MSX基因对Pif启动子的激活效果，检测结果表明野生型表达载体P1125Luc上长度为1125bp的Pif启动子具有基本启动子活性，在pDNA3.1-MSX表达载体的作用下，长度为1125bp的Pif启动子被激活3.9倍，而由于Pif启动子在-1358～-1125bp存在负调控元件，因此野生型表达载体P1358Luc的启动子活性相比野生型表达载体P1125Luc低20倍。

因此，本发明的第二个目的是提供一种重组表达载体，其特征在于，含有能被马氏珠母贝MSX基因激活的Pif启动子。

所述的重组表达载体中的表达载体为pGL3basic荧光素酶报告基因载体。

根据MSX基因序列设计引物：1，GCGTAATACGACTCACTATAGGGAGATTCATGGATCTCCAAAGACAAT和2，GCGTAATACGACTCACTATAGGGAGAATGGTGATACGTCATACCTACG，按相关试剂盒手册体外合成双链RNA。将合成的双链RNA活体注射到马氏珠母贝的肌肉，7天后检测MSX和Pif的mRNA表达差异，同时取贝壳进行扫描电镜观察壳的微结构的变化。结果如图2A和图2B所示。图2A显示MSX基因被抑制后，MSX基因和Pif基因的表达都显著下降，显示MSX基因能调控Pif基因的表达。图2B显示MSX基因被抑制后，珍珠层晶体结构从对照组的六边型变为棱型或不规则形态，显示其可调控Pif基因的表达从而影响壳的形成。

本发明的第三个目的是提供一种能被马氏珠母贝MSX基因激活的Pif启动子在启动下游目的基因的表达从而促进珍珠或珍珠贝生长方面的作用。

本发明通过基因组步移法扩增得到Pif启动子序列，本发明的Pif启动子具有能够与MSX基因结合的结合位点1和结合位点2。通过构建不同片段长度的Pif启动子的野生型和突变型载体，应用双荧光素酶报告基因系统鉴定MSX基因主要通过结合位点1作用于Pif启动子。抑制MSX基因表达会导致Pif基因表达显著下降。本发明的能被马氏珠母贝MSX基因激活的Pif启动子的获得和功能鉴定对于阐释生物矿化机理和指导珍珠生产具有极大的科学意义和应用价值。

附图说明：

图1是野生型表达载体和突变型表达载体转染C2C12细胞后的荧光素酶检测结果；

图2是MSX基因被抑制后的MSX基因和Pif基因的表达结果及MSX被抑制后的珍珠层显微结构图，其中，A是MSX基因被抑制后的MSX基因和Pif基因的表达结果，PBS和GFP为对照，B是对照组的马氏珠母贝壳珍珠层的显微结构，放大倍数1000，C是MSX基因被抑制后的珍珠层显微结构，放大倍数为1000倍，D是MSX基因被抑制后的珍珠层显微结构，放大倍数为1500倍。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：MSX对珍珠贝壳形成基因Pif启动子的激活

（1）、Pif启动子的克隆与分析

提取马氏珠母贝基因组DNA，根据已有的Pif基因序列设计特异引物1（5′-TTGTGTCGGTGTCAAATCTG-3′）和巢式引物2（5′-GCAAGTTCCATCTATTCGAGTTG-3′），按照基因组步移试剂盒（购自Clontech,USA）的操作说明扩增Pif启动子序列。20μl反应体系为：水8μl，2×PrimerSTAR酶预混液10μl（购自TaKaRa Japan），上下游引物各0.5μl,模板1μl。具体的PCR反应程序为94℃变性15s；55℃复性15s；72℃延伸2min；共33个循环。扩增产物经测序后，采用TRANSFAC网站预测结合位点和核心序列，Pif启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，全长1358bp，MSX基因结合位点1序列为ACTAATTGG，MSX结合位点2序列为GTAATTG，Pif启动子的核心序列为-1125～-1bp。

（2）、不同类型表达载体的构建

MSX基因表达载体的构建：设计马氏珠母贝MSX基因序列扩增特异性引物1：5’CGGGGTACCATGCACCCGGTAGCTCTA-3’，包含1个KpnI酶切位点（下划线），特异性引物2：5’-CCGCTCGAGATGGTGATACGTCATACCTAC-3’，包含1个XhoI酶切位点（下划线）。扩增获得的序列经KpnI和XhoI酶切后按常规操作克隆到pcDNA3.1/myc-His(A)载体（购自Invitrogen,Carlsbad,CA,USA），构建得到pCDNA3.1-MSX表达载体。

Pif启动子野生型系列载体构建：以马氏珠母贝全基因组DNA为模板，用上游引物p1358：GGGGTACCTCCGAACTGCCAGTAAGT（下划线是KpnI酶切位点）和下游引物p0：CTAGCTAGCGACCCTTGTCTTATCT（下划线是NheI酶切位点）扩增1358bp的Pif启动子全长序列（位点-1358～-1bp），用切胶回收试剂盒（购自Omega,USA）纯化回收目的片段，T4连接酶（购自Takara,Japan）连接到含有KpnI和NheI酶切位点的pGL3basic荧光素酶报告基因载体（购自Promega,Madison,WI,USA），转化到Dh5α感受态细胞（购自上海依科赛生物制品有限公司），挑取克隆体，经过测序和比对得到野生型表达载体P1358Luc；然后，以得到的野生型表达载体P1358Luc为模板，分别用上游引物p1125:GGGGTACCGCATGAAGAAAGATCAGGTG；p907:GGGGTACCCCCTCTCACATTCGTTATGTAC;p473:GGGGTACCACCTGGTGAAAGTATCTTATGC;p106:GGGGTACCTTTCCTATAAATTACATGGCG（上游引物中的下划线是KpnI酶切位点）和下游引物p0:CTAGCTAGCGACCCTTGTCTTATCT（下划线是NheI酶切位点）扩增不同长度的Pif启动子片段；按上述常规操作克隆到含有KpnI和NheI酶切位点的pGL3basic荧光素酶报告基因载体（购自Promega,Madison,WI,USA），构建含不同长度Pif启动子野生型荧光素酶报告基因表达载体：P1125Luc（位点-1125～-1bp），P907Luc（位点-907～-1bp），P473Luc（位点-473～-1bp）和P106Luc（位点-106～-1bp）。

Pif启动子突变型载体构建：用重叠PCR的方法进行缺失突变。第一套特异性引物为A：5′-CGGGGTACCGCATGAAGAAAGATCAGGTGATTCTTTA-3′，B：5′-GCTTTTTCATTAAAATTATTTCATA-3′，C：5′-ATATGACTGGTGGAAAAATATGCAAATA-3′。以1358bp的Pif启动子全长序列为模板，引物A和B扩增出长度为126bp的片段AB；引物A和C扩增出长度为727bp的片段AC。第二套引物为D：5′-ATTTTAATGAAAAAGCTACATATATG-3′，E：5′-TATTTGCATATTTTTCCACCAGTCATAT-3′，F：5′-GCCCGGGCTAGCGACCCTTGTCTTATCT-3′，以1358bp的Pif启动子全长序列为模板，引物D和F扩增出长度为1027bp的片段DF，引物为E和F扩增出长度为419bp的片段EF。最后以A和F为上下游引物，片段AB和片段DF在相同的摩尔比前提下为模板，扩增出缺失结合位点1“ACTAATTGG”的Pif启动子序列，再按常规操作将该Pif启动子序列克隆到pGL3basic荧光素酶报告基因载体上，从而得到突变型载体P1125Δ1Luc；以A和F为上下游引物，片段AC和片段EF在相同的摩尔比前提下为模板，产生缺失结合位点2“GTAATTG”的Pif启动子序列，再按常规操作将该Pif启动子序列克隆到pGL3basic荧光素酶报告基因载体上，从而得到突变型载体P1125Δ2Luc。以缺失结合位点1“ACTAATTGG”的Pif启动子序列为模板，以A和C为上下游引物，扩增出片段AC’，以A和F为上下游引物，以片段AC’和片段EF在相同的摩尔比前提下为模板，产生结合位点1“ACTAATTGG”和结合位点2“GTAATTG”均缺失的Pif启动子序列，再按常规操作将该Pif启动子序列克隆到pGL3basic荧光素酶报告基因载体上，从而得到结合位点1和2均缺失的突变型载体P1125ΔΔ。

（3）、双荧光素酶报告基因系统检测MSX基因对珍珠贝壳形成基因Pif启动子的激活效果

C2C12细胞（购自武汉博士德生物技术工程有限公司）在转染前一天铺板48孔板，铺板密度为1×10⁵/mL，每孔加250μl。为了检测Pif启动子的启动子活性部位，在EP管中分别配置Pif启动子野生型系列载体（100ng/孔），再添加内参载体质粒pRL-TK（100ng/孔）、pCDNA3.1-MSX表达载体（200ng/孔），对照组为Pif启动子野生型系列载体（100ng/孔）、内参载体质粒pRL-TK（100ng/孔）、空白表达载体pcDNA3.1/myc-His(A)载体（200ng/孔）。向上述每个EP管中加入40μl不含血清和抗生素的DEME，用加样枪混合均匀。然后将脂质体悬液（1μl/well）加入40μl/well不含血清和抗生素的DEME中，在室温孵育5min，最后将两者混合在一起，充分混匀静置20min，使EP管中的质粒与脂质体充分结合。分别吸去48孔板中的培养液，用不含血清和抗生素的DEME洗一次，每个孔加170μl不含血清和抗生素的DEME，然后在每个孔中加入80μl的质粒/脂质体混合物。在37℃5%CO₂培养箱中培养6h后，吸弃培养板中的转染培养液，向各孔加入250μl有血清的DEME培养液，在37℃5%CO2培养箱中继续培养42h。转染48h后，吸出培养基，用1×PBS漂洗一次，用裂解液裂解，检测荧光素酶。检测结果表明野生型表达载体P1125Luc上长度为1125bp的Pif启动子具有基本启动子活性，在pDNA3.1-MSX表达载体的作用下，长度为1125bp的Pif启动子被激活3.9倍，而由于Pif启动子在-1358～-1125bp存在负调控元件，因此野生型表达载体P1358Luc的启动子活性相比野生型表达载体P1125Luc低20倍。

为了检测结合位点在MSX基因激活Pif启动子中的作用，将野生型表达载体P1125Luc，突变型载体P1125Δ1Luc、突变型载体P1125Δ2Luc、结合位点1和2均缺失的突变型载体P1125ΔΔ（各100ng/孔）分别与内参载体质粒pRL-TK（100ng/孔）和pCDNA3.1-MSX表达载体（200ng/孔）混匀，对照组中为空白表达载体pcDNA3.1/myc-His(A)载体。按上述的方法共转染到C2C12细胞。48h后，检测荧光素酶。

检测结果如图1所示。表明野生型表达载体P1125Luc的报告基因被MSX基因激活3.9倍，而突变型载体P1125Δ2Luc的报告基因表达被MSX基因激活4.1倍，两者间无显著差异；突变型载体P1125Δ1Luc的报告基因被MSX基因只激活2.8倍；结合位点1和2均缺失的突变型载体P1125ΔΔ的报告基因被激活2.1倍。表明MSX基因主要通过结合位点1作用于Pif启动子并诱导Pif基因的表达。

实施例2：MSX被抑制后Pif的表达和珍珠贝壳结构的变化，鉴定其调控壳生物矿化过程

设MSX dsRNA注射组、阴性对照GFP dsRNA注射组和空白对照PBS注射组三个组。每个组注射5个二龄马氏珠母贝成贝。根据MSX基因序列设计引物MSXF：GCGTAATACGACTCACTATAGGGAGATTCATGGATCTCCAAAGACAAT和MSXR：GCGTAATACGACTCACTATAGGGAGAATGGTGATACGTCATACCTACG，根据GFP基因序列设计引物GFPF：GCGTAATACGACTCACTATAGGGAGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG和GFPR：GCGTAATACGACTCACTATAGGGAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATG。下划线为T7启动子序列。用pCDNA3.1-MSX表达载体为模板，MSXF/MSXR为引物，扩增648bp的MSX片段；用pEGFP-C1（购自Clontech,USA）为模板，GFPF/GFPR为引物，扩增718bp的GFP片段。以纯化的MSX和GFP片段为模板，用RiboMAXTM Large Scale RNA ProductionSystem（T7）kit（购自Promega，USA）试剂盒体外合成MSX dsRNA和GFP dsRNA，RNase-free DNase I（购自TAKARA，Japan）消化dsRNA，将MSX dsRNA和GFP dsRNA用PBS稀释到40μg/100μl。MSX dsRNA注射组，每个成贝注射MSX dsRNA100μl；阴性对照GFP dsRNA注射组，每个成贝各注射GFP dsRNA100μl；空白对照PBS注射组，每个成贝各注射100μl PBS溶液。将三个组放在室内稳定条件下养殖，7天后，取成贝的外套膜组织提取RNA，常规QPCR技术检测MSX和Pif基因的表达（β-actin为内参）；同时，取每个贝相同部位的壳清洗、阴干后用扫描电镜观察壳的微型结构，结果如图2所示。

结果显示于图2A和图2B。图2A显示MSX基因被抑制后，MSX和Pif的表达都显著下降，表明MSX基因能激活Pif启动子从而调控Pif的表达。图2B显示MSX被抑制后，珍珠层晶体结构从对照组的六边型变为棱型或不规则形态，表明其可激活Pif启动子从而影响壳的形成。

Claims (4)

1.一种能被马氏珠母贝MSX基因激活的Pif启动子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.一种含有权利要求1所述的能被马氏珠母贝MSX基因激活的Pif启动子的重组表达载体。

3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体中的表达载体为pGL3basic荧光素酶报告基因载体。

4.权利要求1所述的能被马氏珠母贝MSX基因激活的Pif启动子在启动下游目的基因的表达从而促进珍珠或珍珠贝生长方面的作用。

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