JP5374584B2 - 改良タンパク質発現系 - Google Patents
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Description
Chungら、Molecular and Cellular Biology、第10巻、第12号、1992は、アクチン5C遠位プロモーターにおける正及び負の制御要素の特徴決定に関する。
Angelichioら、Nucleic Acids Research、第19巻、第18号、5037〜5043、1991は、培養ショウジョウバエ(Drosophila)細胞での異種遺伝子発現における使用のためのいくつかのプロモーター及びポリアデニル化シグナルの比較に関する。
(i)いずれかの末端にてフランキング制限部位配列を有するか又は有さない、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号33、配列番号36、配列番号37又は配列番号68のヌクレオチド配列;
(ii) (i)の配列のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する機能的ヌクレオチド配列;
(iii) ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する、(i)又は(ii)のいずれか1つの配列の少なくとも6連続ヌクレオチドの機能的フラグメントであるヌクレオチド;
(iv) 上記(iii)の機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する機能的ヌクレオチド配列;
(v) (i)、(ii)、(iii)及び(iv)のいずれか1つの配列の2つ以上の配列を含む第1キメラヌクレオチド配列;
(vi) 少なくとも6ヌクレオチドを含み、かつ(iii)及び/又は(iv)の少なくとも2ヌクレオチドの配列からの連続ヌクレオチド範囲(stretches)を含むショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する第2キメラヌクレオチド配列であって、該連続範囲のそれぞれが単独ではショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有さない配列
からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含むプロモーターDNAポリヌクレオチドに関する。
(i)いずれかの末端にてフランキング制限部位配列を有するか又は有さない、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号33、配列番号36、配列番号37又は配列番号68のヌクレオチド配列;
(ii) (i)の配列のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する機能的ヌクレオチド配列;
(iii) ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する、(i)又は(ii)のいずれか1つの配列の少なくとも6連続ヌクレオチドの機能的フラグメントであるヌクレオチド;
(iv) 上記(iii)の機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する機能的ヌクレオチド配列;
(v) (i)、(ii)、(iii)及び(iv)のいずれか1つの配列の2つ以上の配列を含む第1キメラヌクレオチド配列;
(vi) 少なくとも6ヌクレオチドを含み、かつ(iii)及び/又は(iv)の少なくとも2ヌクレオチドの配列からの連続ヌクレオチド範囲を含むショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する第2キメラヌクレオチド配列であって、該連続範囲のそれぞれが単独ではショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有さない配列
からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含むプロモーターDNAポリヌクレオチド
を含むDNAポリヌクレオチドに関する。
(i)いずれかの末端にてフランキング制限部位配列を有するか又は有さない、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号33、配列番号36、配列番号37又は配列番号68のヌクレオチド配列;
(ii) (i)の配列のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する機能的ヌクレオチド配列;
(iii) ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する、(i)又は(ii)のいずれか1つの配列の少なくとも6連続ヌクレオチドの機能的フラグメントであるヌクレオチド;
(iv) 上記(iii)の機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する機能的ヌクレオチド配列;
(v) (i)、(ii)、(iii)及び(iv)のいずれか1つの配列の2つ以上の配列を含む第1キメラヌクレオチド配列;
(vi) 少なくとも6ヌクレオチドを含み、かつ(iii)及び/又は(iv)の少なくとも2ヌクレオチドの配列からの連続ヌクレオチド範囲を含むショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する第2キメラヌクレオチド配列であって、該連続ヌクレオチド範囲のそれぞれが単独ではショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有さない配列
からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含むプロモーターDNAポリヌクレオチドを含む、昆虫細胞における興味対象のポリペプチドの異種発現に適するDNAポリヌクレオチドを含む細胞に関する。
(a) 興味対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を得るステップと、
(b) 興味対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、昆虫細胞における興味対象のポリペプチドの異種発現に適するDNAポリヌクレオチドに挿入するステップであって、前記ポリヌクレオチドが、
(i)いずれかの末端にてフランキング制限部位配列を有するか又は有さない、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号33、配列番号36、配列番号37又は配列番号68のヌクレオチド配列;
(ii) (i)の配列のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する機能的ヌクレオチド配列;
(iii) ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する、(i)又は(ii)のいずれか1つの配列の少なくとも6連続ヌクレオチドの機能的フラグメントであるヌクレオチド;
(iv) 上記(iii)の機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する機能的ヌクレオチド配列;
(v) (i)、(ii)、(iii)及び(iv)のいずれか1つの配列の2つ以上の配列を含む第1キメラヌクレオチド配列;
(vi) 少なくとも6ヌクレオチドを含み、かつ(iii)及び/又は(iv)の少なくとも2ヌクレオチドの配列からの連続ヌクレオチド範囲を含むショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する第2キメラヌクレオチド配列であって、該連続範囲のそれぞれが単独ではショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有さない配列
からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含むプロモーターDNAポリヌクレオチドを含むステップと、
(c) ステップ(b)で得られたポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換するステップと、
(d) ステップ(b)で得られたポリヌクレオチドの発現を可能にして、ポリペプチドを生成するステップと、
(e) そこからポリペプチドを得るステップと
を含む方法に関する。
(a) 興味対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を得るステップと、
(b) 興味対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、昆虫細胞における興味対象のポリペプチドの異種発現に適するDNAポリヌクレオチドに挿入するステップであって、前記ポリヌクレオチドが、
(i)いずれかの末端にてフランキング制限部位配列を有するか又は有さない、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号33、配列番号36、配列番号37又は配列番号68のヌクレオチド配列;
(ii) (i)の配列のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する機能的ヌクレオチド配列;
(iii) ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する、(i)又は(ii)のいずれか1つの配列の少なくとも6連続ヌクレオチドの機能的フラグメントであるヌクレオチド;
(iv) 上記(iii)の機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する機能的ヌクレオチド配列;
(v) (i)、(ii)、(iii)及び(iv)のいずれか1つの配列の2つ以上の配列を含む第1キメラヌクレオチド配列;
(vi) 少なくとも6ヌクレオチドを含み、かつ(iii)及び/又は(iv)の少なくとも2ヌクレオチドの配列からの連続ヌクレオチド範囲を含むショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する第2キメラヌクレオチド配列であって、該連続ヌクレオチド範囲のそれぞれが単独ではショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有さない配列
からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含むプロモーターDNAポリヌクレオチドを含むステップと、
(c) ステップ(b)で得られたポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換するステップと、
(d) ステップ(b)で得られたポリヌクレオチドの発現を可能にして、ポリペプチドを生成するステップと、
(e) そこからポリペプチドを得るステップと
を含む方法により生成されるポリペプチドに関する。
本明細書で用いる場合、用語「プロモーターDNAポリヌクレオチド」は、それに機能的に連結された(operably linked)コード配列の発現のための調節配列を細胞に提供するヌクレオチド配列を意味する。一般的に、コード配列は、プロモーター配列に対して3'に位置する。プロモーターDNAポリヌクレオチドは、近位エレメント及びより遠位の上流のエレメント、並びにその他の機能的フラグメント又はエレメント(しばしばエンハンサーと呼ばれる)とからなり得る。
いくつかの実施形態において、配列同一性は、通常の方法、例えばSmith及びWaterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482、Pearson及びLipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性方法の検索により、Thompsonら, 1994, Nucleic Acids Res 22:467380のCLUSTAL Wアルゴリズムを用いて、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行により決定される(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group中のGAP、BESTFIT、FASTA及びTFASTA)。BLASTアルゴリズム(Altschulら, 1990, Mol. Biol. 215:403〜10)も用いてよく、このためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information www.ncbi.nlm.nih.gov/)から得ることができる。上記のアルゴリズムのいずれを用いる場合も、「ウィンドウ」長、ギャップペナルティなどについてデフォルトパラメータを用いる。
第1のポリヌクレオチドが、第2のポリヌクレオチドと比較して改良された/より高い「タンパク質発現レベル」を示すと記載する場合、本明細書において、第1のポリヌクレオチドが、第2のポリヌクレオチドが提供するよりも、参照細胞(典型的には、ショウジョウバエS2細胞のような昆虫細胞)を、同じ条件下でポリヌクレオチドの発現を得るためにこれらのポリヌクレオチドで形質転換して培養する場合に、より多い量の回収可能なタンパク質発現生成物を提供することを意味する。
いくつかの実施形態において、プロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号1のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、プロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号2のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、プロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号3のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、プロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号4のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、プロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号5のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、プロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号6のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、プロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号33のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、プロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号36のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、プロモーターDNAポリヌクレオチドは、配列番号37のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、プロモーターDNAポリヌクレオチドは、残基1若しくは1〜2若しくは1〜3若しくは1〜4若しくは1〜5若しくは1〜6を所望により欠損するか、及び/又は残基587〜592若しくは588〜592若しくは589〜592若しくは590〜592若しくは591〜592若しくは592を所望により欠損する配列番号 68のヌクレオチド配列を含む。
配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号33、配列番号36又は配列番号37のヌクレオチド配列;
配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号33、配列番号36又は配列番号37のいずれか1つの配列と少なくとも80%の配列同一性を有する配列;
配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号33、配列番号36又は配列番号37のいずれか1つの配列の少なくとも6連続ヌクレオチドの機能的フラグメント;
配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号33、配列番号36又は配列番号37のいずれか1つの配列の少なくとも6連続ヌクレオチドの機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有する配列。
このようなキメラ配列の例は、配列番号68に示すハイブリッドプロモーター配列である。
(i) 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号33、配列番号36又は配列番号37のヌクレオチド配列;
(ii) (i)の配列のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する機能的ヌクレオチド配列;
(iii) ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する、(i)又は(ii)のいずれか1つの配列の少なくとも6連続ヌクレオチドの機能的フラグメントであるヌクレオチド;及び
(iv) (iii)の機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する機能的ヌクレオチド配列
から選択される2つ以上の配列を含むキメラヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、タンパク質発現レベルの増加は、配列番号1若しくは配列番号4の配列を有するプロモーターDNAポリヌクレオチドのいずれか1つのタンパク質発現レベル又はpOPIE2プロモーターに対して約50パーセント〜約300パーセントである。いくつかの実施形態において、タンパク質発現レベルの増加は、配列番号1若しくは配列番号4の配列を有するプロモーターDNAポリヌクレオチドのいずれか1つのタンパク質発現レベル又はpOPIE2プロモーターに対して300パーセントを超える。
いくつかの実施形態において、タンパク質発現レベルの増加は、配列番号1若しくは配列番号4の配列を有するプロモーターDNAポリヌクレオチドのいずれか1つのタンパク質発現レベル又はpOPIE2プロモーターに対して2倍〜10倍である。
いくつかの実施形態において、タンパク質発現レベルの増加は、配列番号1若しくは配列番号4の配列を有するプロモーターDNAポリヌクレオチドのいずれか1つのタンパク質発現レベル又はpOPIE2プロモーターに対して10倍〜100倍、例えば20〜80倍、例えば20〜40倍である。
活性の増加は、参照と同じかつ標準的な条件下で測定され比較されることが理解される。
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、細菌プロモーター、例えばpKANR細菌プロモーター、例えばカナマイシンプロモーターの機能的フラグメントをさらに含む。
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、昆虫細胞における選択マーカーの発現を駆動するのに適する第2のプロモーターDNAポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、この第2のプロモーターは:
(i) 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号33、配列番号36又は配列番号37のヌクレオチド配列;
(ii) (i)の配列のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有するヌクレオチド配列;
(iii) ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する、(i)又は(ii)のいずれか1つの配列の少なくとも6連続ヌクレオチドの機能的フラグメントであるヌクレオチド;
(iv) (iii)の機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有するヌクレオチド配列;
(v) (i)、(ii)、(iii)及び(iv)のいずれか1つの配列の2つ以上の配列を含む第1キメラヌクレオチド配列、及び
(vi) 少なくとも6ヌクレオチドを含み、かつ(iii)及び/又は(iv)の少なくとも2ヌクレオチドの配列からの連続ヌクレオチド範囲を含むショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する第2キメラヌクレオチド配列であって、該連続範囲のそれぞれが単独ではショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有さない配列
からなる群より選択される。
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、少なくとも1つの転写インスレーターエレメント、例えばSu(Hw)又はGypsy (GSu(Hw))インスレーター配列をさらに含む(Mol Cell Biol. 1997 April; 17(4): 2202〜2206)。
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、昆虫細胞における選択のために適するジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)コード配列をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、少なくとも1つのポリアデニル化シグナル配列、例えばSV40ポリAシグナル及び/又はOPIE2ポリAシグナルをさらに含む。
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、大腸菌の起点をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、少なくとも1つのタンパク質排出シグナルポリヌクレオチド配列、例えばBIP及びCPYからなるリストから選択されるものをさらに含む。
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、少なくとも1つのHISタグ配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、HISタグ配列は、N末端HISタグである。いくつかの実施形態において、HISタグ配列は、以下の配列による:atgaaacaccaacaccaacatcaacatcaacatcaacatcaa (配列番号38)。
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、興味対象のポリペプチドをコードする遺伝子を、単離DNAポリヌクレオチドに挿入するために、プロモーターDNAポリヌクレオチドの下流にマルチクローニング部位をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、B型肝炎ウイルスからの少なくとも1つのPREエレメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、B型肝炎ウイルスからのPREエレメントは、配列番号40、例えば配列番号40のヌクレオチド10〜574による。
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、少なくとも1つのOri-ベータエレメントをさらに含む。
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、少なくとも1つのマトリクス付着領域(MAR)エレメントをさらに含む。
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、プロモーターDNAポリヌクレオチド配列に対して異種のポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号33、配列番号36、配列番号37又は配列番号68のヌクレオチド配列のいずれか1つの配列の少なくとも3連続ヌクレオチドの機能的フラグメント、並びにそれと少なくとも80%の配列同一性を有する機能的ヌクレオチド配列である少なくとも1つのヌクレオチド配列をさらに含み、該機能的フラグメントは、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーターエンハンサー活性を有する。
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドは、発現ベクターである。
いくつかの実施形態において、本発明による単離DNAポリヌクレオチドを含む細胞は、上記の単離DNAポリヌクレオチドを安定的に形質移入されている。
本明細書で用いる場合、「安定的に形質移入する」とは、本発明によるDNAポリヌクレオチドを形質移入されて、それらのゲノムに挿入された新しい遺伝子を有する培養細胞の永続的な系統を生成する細胞である。通常、このことは、所望の遺伝子を「選択」遺伝子、すなわち抗生物質(例えばゼオシン)に対する耐性を与える遺伝子につなげることにより行われる。培養培地中に抗生物質を入れることにより、耐性遺伝子が組み込まれた細胞のみが生存し、これらの実質的に全てに、本発明によるDNAポリヌクレオチドが組み込まれる。
「発現ベクター」は、ベクターに挿入できる、遺伝子配列に由来するmRNAの合成のために必要な調節シグナルを含むプラスミド又はウイルスDNAを意味する。遺伝子配列は、例えば上記で規定されるキメラポリヌクレオチドである。
本明細書で用いる場合、「ポリアデニル化配列」とは、転写されたときに発現宿主により認識されて、転写されたmRNAにポリアデノシン残基を付加するDNA配列のことをいう。これは、発現されるポリペプチドをコードするDNAの3'末端に機能的に連結される。適切なポリアデニル化配列は、Angelichioら、1991、Comparison of several promoters and polyadenylation signals for use in heterologous gene expression in cultured Drosophila cells, Nucleic Acids Research、第19巻、第18号、5037〜5043に記載されるようなOPIE2ポリAテイル及び後期SV40ポリAテイルを含む。
本明細書で用いる場合、用語「発現」とは、本発明の単離DNAポリヌクレオチド(これが、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む場合)に由来するmRNAの転写及び安定的蓄積から、ポリペプチド生成物へのその後のmRNAの翻訳を経て、最終的に宿主細胞により行われるポリペプチド生成物の転写後修飾までの宿主細胞における完全な生物学的プロセスのことをいう。「過剰発現」とは、通常の非形質転換細胞における生成レベルを超える、形質転換細胞における遺伝子生成物の生成のことをいう。
この定義の範囲内のその他の適切な「タンパク質排出シグナルポリヌクレオチド配列」は、分泌のためのショウジョウバエBiPシグナル配列及びCPYを含む。
ショウジョウバエBiPタンパク質は、免疫グロブリン結合シャペロンタンパク質をコードする。この分泌シグナルは、高レベルのBiPに、S2細胞の分泌経路を効率的に標的にさせる(Kirkpatrick, R.B.ら(1995) J. Biol. Chem. 270: 19800〜19805)。
本明細書で用いる場合、用語「マトリクス付着領域」又は「MAR」又は「足場/マトリクス付着領域」とは、核マトリクスが付着する真核染色体のDNAにおけるヌクレオチド配列のことをいう。MARは、核内のクロマチンの構造的機構を媒介する。これらのエレメントは、クロマチン足場のためのDNAの係留点を構成し、クロマチンを構造ドメインに組織化する働きをする。個別の遺伝子についての研究により、S/MARエレメントにより媒介されるクロマチンの動的で複雑な機構が、遺伝子発現の調節において重要な役割を有するとの結論が得られた。
本明細書で用いる場合、用語「Ori-ベータエレメント」又は「oriB」とは、複製起点(origin of replication)のことをいう。複製起点(複製起点(replication origin)ともよばれる)は、複製が開始されるゲノム又はプラスミドの特定の配列である。これは、原核生物及び真核生物のような生物におけるDNA複製、又は2本鎖RNAウイルスのようなRNAウイルスにおけるRNA複製のいずれかであり得る。DNA複製は、この点から2方向又は1方向に進み得る。複製起点は、DNAを認識し、巻き戻し、そのコピーを開始するタンパク質複合体であるプレ複製複合体に結合する。この定義内のある具体的な「Ori-ベータエレメント」は、キイロショウジョウバエOri-ベータエレメントである。
筋肉細胞のような非分裂細胞における核移入は、非ウイルス遺伝子送達系の問題の1つである。これは、抗原のより低い合成をもたらし、よって、その後、乏しい抗原提示をもたらし得る。非分裂細胞における非ウイルスDNAの核輸送を増進するSV40エンハンサー領域の72 bp反復が同定された。エンハンサー領域は、いくつかの転写因子結合部位を有する。プラスミドが細胞質に入るとすぐに、いくつかの転写因子がこれに結合し、核局在化シグナルを提供することにより、非ウイルスDNAを核へ迅速に移送することが可能になる(Exp Cell Res. 1999, 253, 713)。遺伝子発現の増進も、エレクトロポレーションによりマウス筋肉に注入されたSV40エンハンサーエレメント含有ベクターを用いて観察された(Gene Ther., 2001, 8, 494)。
いくつかの真核又はウイルスmRNAは、それらが翻訳され得る細胞質へと核の外へ輸送されることを妨げる阻害配列を含有する。B型肝炎ウイルスS転写産物は、転写後制御エレメント(PRE)として知られる領域を含み、これは、それらの輸送をシスに活性化する機能を有する。このエレメントは、ヒト免疫不全ウイルスRev-応答エレメント(RRE)に部分的に置換できる。このエレメント又は同様の機能を有するエレメントを、抗原(例えばHIV-1 Gag)をコードする遺伝子の3'非翻訳領域において付加することが、抗原の発現レベルを増加し、免疫応答を改善できる。
本発明のLICを可能にするベクターのいくつかの具体的な実施形態を、配列番号69〜73に示す。
1. 昆虫選択マーカーと発現を駆動する昆虫プロモーター、例えば配列番号5、配列番号6又は配列番号2によるヌクレオチド配列を有する切断型キイロショウジョウバエアクチン5Cプロモーター又はHSP70プロモーター;
2. 細菌プロモーター、例えばpKANR細菌プロモーター;
3. ゼオシン選択マーカーとSV40ポリAテイル;
4. 大腸菌起点;
5. 配列番号6によるヌクレオチド配列を有するハイブリッドキイロショウジョウバエ612bpアクチン5Cプロモーターであって、アクチンコア配列の部分又は全体(例えば配列番号6のヌクレオチド478〜572)が、配列番号1、配列番号2、配列番号37によるヌクレオチド配列を有するHSP70コアプロモーターで置き換えられているプロモーター、又はタンパク質発現を駆動するそのフラグメント;
6. BIPタンパク質排出シグナル配列;
7. マルチクローニング部位;及び
8. OPIE2ポリAテイル。
1. 昆虫選択マーカーと発現を駆動する昆虫プロモーター、例えば配列番号5、配列番号6又は配列番号2によるヌクレオチド配列を有する切断型キイロショウジョウバエアクチン5Cプロモーター又はHSP70プロモーター;
2. 細菌プロモーター、例えばpKANR細菌プロモーター;
3. ゼオシン選択マーカーとSV40ポリAテイル;
4. 大腸菌起点;
5. 配列番号3のヌクレオチド2076〜2532によるヌクレオチド配列を有するキイロショウジョウバエ457bpアクチン5Cプロモーター;
6. BIPタンパク質排出シグナル配列;
7. マルチクローニング部位;及び
8. OPIE2ポリAテイル。
1. 昆虫選択マーカーと発現を駆動する昆虫プロモーター、例えば配列番号5、配列番号6又は配列番号2によるヌクレオチド配列を有する切断型キイロショウジョウバエアクチン5Cプロモーター又はHSP70プロモーター;
2. 細菌プロモーター、例えばpKANR細菌プロモーター;
3. ゼオシン選択マーカーとSV40ポリAテイル;
4. 大腸菌起点;
5. 配列番号3のヌクレオチド2076〜2532によるヌクレオチド配列を有するキイロショウジョウバエ457bpアクチン5Cプロモーターのハイブリッドであって、アクチンコア配列の部分又は全体(例えば配列番号3のヌクレオチド2392〜2487)が、配列番号1、配列番号2、配列番号37によるヌクレオチド配列を有するHSP70コアプロモーターで置き換えられているハイブリッド、又はタンパク質発現を駆動するそのフラグメント;
6. BIPタンパク質排出シグナル配列;
7. マルチクローニング部位;及び
8. OPIE2ポリAテイル。
1. 昆虫選択マーカーと発現を駆動する昆虫プロモーター、例えば配列番号5、配列番号6又は配列番号2によるヌクレオチド配列を有する切断型キイロショウジョウバエアクチン5Cプロモーター又はHSP70プロモーター;
2. 細菌プロモーター、例えばpKANR細菌プロモーター;
3. ゼオシン選択マーカーとSV40ポリAテイル;
4. 大腸菌起点;
5. 配列番号1、配列番号2、配列番号37によるヌクレオチド配列を有するHSP70コアプロモーター又はタンパク質発現を駆動するそのフラグメントと、HSP70コアプロモーターに対してシスのアクチン5Cプロモーターの1つ以上の機能的フラグメント(アクチン5c調節エレメント);
6. BIPタンパク質排出シグナル配列;
7. マルチクローニング部位;及び
8. OPIE2ポリAテイル。
1. Su(Hw)エレメントは、発現カセット(発現プロモーター、興味対象の遺伝子及びポリAテイル)の前及び後に配置され得る;及び/又は
2. ゼオシン選択マーカーは、発現ベクター中で以下のもので置き換えてよい:
a. ネオマイシン選択マーカー若しくは
b. ブラストサイジン選択マーカー若しくは
c. ハイグロマイシン選択マーカー若しくは
d. ピューロマイシン選択マーカー;及び
3. 発現構築物は、HISタグとともに又はなしで作製される。
1. 細菌選択マーカーと細菌プロモーター
a. pKANR細菌プロモーター
b. ゼオシン選択マーカー(ZeoR及び/又はKanR)
2. 昆虫選択マーカーと発現を駆動する昆虫プロモーター
a. 切断型キイロショウジョウバエアクチン5Cプロモーター又はHSP70プロモーター
b. ゼオシン選択マーカーとSV40ポリAテイル
3. 大腸菌起点
4. タンパク質発現を駆動するための切断型キイロショウジョウバエアクチン5C又はHSP70プロモーター
5. BIPタンパク質排出シグナル配列
6. HISタグ
7. マルチクローニング部位
8. OPIE2ポリAテイル。
以下のエレメントを発現ベクターに加えて、発現レベルを増大し得る。
1. 興味対象遺伝子発現カセットの上流及び下流に遍在性クロマチンオープニングエレメント;及び/又は
2. SV40のプレエレメントと72 bpエレメント;及び/又は
3. MAR(マトリクス付着領域);及び/又は
4. キイロショウジョウバエからのACE3とori-ベータ;及び/又は
5. 転写インスレーターエレメント、su(Hw)結合部位(Mol Cell Biol. 1997 April; 17(4): 2202〜2206.);及び/又は
6. BIPを置き換えるためのCPYエレメント(もしCPYがS2において機能的であるとわかったならば);及び/又は
7. dhfrを、昆虫細胞での選択のために挿入できる;及び/又は
8. 別のカナマイシン又はアンピシリン耐性カセットを細菌での選択のために挿入してよい;及び/又は
9. OPIE2ポリAテイルを後期SV40ポリAテイルで置き換える;及び/又は
10. タンパク質発現を駆動するためのプロモーターの下流にイントロンを導入する;及び/又は
11. ライゲーション非依存性クローニングカセットを含め得る。
(i) 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号33、配列番号36又は配列番号37又は配列番号58のヌクレオチド配列;
(ii) (i)の配列のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列;
(iii) (i)又は(ii)のいずれか1つの配列の少なくとも6連続ヌクレオチドの機能的フラグメント;
(iv) (iii)の少なくとも6ヌクレオチドの機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列;
(v) (i)、(ii)、(iii)及び(iv)のいずれか1つの配列の2つ以上の配列を含むキメラヌクレオチド配列。
本明細書で用いる場合、用語「中程度のストリンジェンシー」とは、約50%ホルムアミド、6×SSC中、約42℃でのポリヌクレオチドハイブリッド形成条件と、約60℃、0.5×SSC、0.1% SDS中での洗浄条件のことをいう。
本発明の別の態様は、宿主細胞からのポリペプチドの発現及び回収に関する。
詳細に上述したように、本発明のこの態様は、全般的に、
(i) 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号33、配列番号36又は配列番号37又は配列番号58のヌクレオチド配列;
(ii) (i)の配列のいずれか1つと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有するヌクレオチド配列;
(iii) ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する、(i)又は(ii)のいずれか1つの配列の少なくとも6連続ヌクレオチドの機能的フラグメントであるヌクレオチド;
(iv) (iii)の機能的フラグメントと少なくとも80%の配列同一性を有し、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有するヌクレオチド配列;
(v) (i)、(ii)、(iii)及び(iv)のいずれか1つの配列の2つ以上の配列を含む第1キメラヌクレオチド配列、及び
(vi) 少なくとも6ヌクレオチドを含み、かつ(iii)及び/又は(iv)の少なくとも2ヌクレオチドの配列からの連続ヌクレオチド範囲を含むショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有する第2キメラヌクレオチド配列であって、該連続範囲のそれぞれが単独ではショウジョウバエS2細胞におけるプロモーター活性を有さない配列
からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含むプロモーターDNAポリヌクレオチドが、分泌ポリペプチドを発現する場合に、改良された収率を示すことを見出したことを利用する。
(a) 興味対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を得るステップと、
(b) 興味対象のポリペプチドをコードする上記ポリヌクレオチド配列を、請求項1〜27のいずれか1項に記載の単離DNAポリヌクレオチドに挿入するステップと、
(c) ステップ(b)で得られたポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換するステップと、
(d) ステップ(b)で得られたポリヌクレオチドの発現を可能にして、上記のポリペプチドを生成するステップと、
(e) そこからポリペプチドを得るステップと
を含む。
形質転換及び形質転換細胞(酵母又はより高等)の培養についてのより一般的な教示は、Sambrook Jら, "Molecular Cloning: A laboratory Manual", 第3版において見出し得る。
本発明の方法のステップ(a)は、通常、ベクターを宿主細胞に導入するステップと、その後、ベクター内に存在する選択マーカー遺伝子を発現する形質転換体を選択するステップとを含む。有用な選択マーカー遺伝子は、上で詳細に述べた。
実施例1
略称
株化細胞
ショウジョウバエS2細胞は、ATCCに由来した(CRL-1963、ロット番号3225543)。
ATCCからのショウジョウバエS2細胞のバイアルを復活させ、組織培養フラスコ中で増殖させた。細胞数が108細胞を超えたときに、2×107のショウジョウバエS2細胞を1mLの凍結培地(Excell420+50% FBS+10% DMSO)中に含む20本のバイアルからなる細胞バンクを確立して、−80℃にて貯蔵した。
pZOp2F-NheI (p2260、MR#3070株)。このベクターは、異なるプロモーターを有するクローニングベクターについてStratageneからのQuikChange Site-Direct Mutagenesisキットを用いることにより、SV40の下流にNheI部位を有して創出した。
QuickChangeを、プライマー975及び976を用い、p1205を鋳型として用いて作製した。PCR生成物をDpnIで37℃にて1時間処理し、DH10B細胞を形質転換し、0.75 ug/mlのゼオシンを含むLB寒天プレートに播種し、ONでインキュベートした。
プラスミドは、プライマー590を用いて完全に配列決定した。
得られたプラスミドにおいて、プライマー590、981、986及び917を用いて、挿入断片を完全に配列決定した。
PCRフラグメントを制限エンドヌクレアーゼNheI及びHindIIIで消化し、NheI及びHindIIIで消化し、 SAPで処理したp2260にクローニングした。サーモサイクラー中で1晩ライゲーションした。ライゲーション生成物でDH10B細胞を形質転換し、0.75 ug/mlのゼオシンを含むLB寒天プレートに播種し、ONでインキュベートした。
得られたプラスミドにおいて、プライマー590、981、986及び917を用いて、挿入断片を完全に配列決定した。
PCRフラグメントを制限エンドヌクレアーゼNheI及びHindIIIで消化し、NheI及びHindIIIで消化し、 SAPで処理したp2260にクローニングした。サーモサイクラー中で1晩ライゲーションした。ライゲーション生成物でDH10B細胞を形質転換し、0.75 ug/mlのゼオシンを含むLB寒天プレートに播種し、ONでインキュベートした。
得られたプラスミドにおいて、プライマー590、984及び917を用いて、挿入断片を完全に配列決定した。
pHP15a (p2270、MR#3080株)
全てZeoR遺伝子の上流で、EM7プロモーターの代わりにptrcプロモーター、OpIE2の代わりにアクチン5Cプロモーターを含むベクター。
構築物は、SOE-PCRにより構築した。第1のPCR1フラグメントは、プライマー4007及び4009を用い、p2263を鋳型として用いて作製した。得られたPCR生成物は、234 bpのサイズを有する。
第2のPCR2フラグメントは、プライマー4008及び4000を用い、p2263を鋳型として用いて作製した。フラグメントは、1134 bpのサイズを有する。
SOE-PCRは、PCR1とPCR2生成物を混合することにより作製した。最後に、フラグメントを、プライマー4000及び4009を用いて増幅する。
得られたフラグメントは1433 bpであり、制限エンドヌクレアーゼEcoRI及びNcoIを用いて消化し、EcoRI及びNcoIで消化し、SAPで処理したp2263にクローニングした。サーモサイクラー中で1晩ライゲーションした。ライゲーション生成物でDH10B細胞を形質転換し、0.75 ug/mlのゼオシンを含むLB寒天プレートに播種し、ONでインキュベートした。
得られたプラスミドにおいて、プライマー1892、2232、2233、2234、2235、2236、2007、4000、4002、4007及び4009を用いて、挿入断片を完全に配列決定した。
このベクターは、pHP15aとほぼ同様であるが、ZeoR遺伝子の上流にて、アクチン5Cプロモーターの代わりにHsp70プロモーターを含む。ワンステップPCR増幅により構築した。PCRは、プライマー4001及び4002を用い、p2270を鋳型として用いて行った。得られたフラグメントは、アクチン5cプロモーターを含む290 bpであった。
PCRフラグメントを制限エンドヌクレアーゼXmnI及びSphIで消化し、XmnI及びSphIで消化し、SAPで処理したp2270にクローニングした。サーモサイクラー中で1晩ライゲーションした。ライゲーション生成物でDH10B細胞を形質転換し、0.75 ug/mlのゼオシンを含むLB寒天プレートに播種し、ONでインキュベートした。
得られたプラスミドにおいて、プライマー2007、4000及び4001を用いて、挿入断片を完全に配列決定した。
構築物は、SOE-PCRにより構築した。第1のPCR1フラグメントは、プライマー4003及び4009を用い、p2270を鋳型として用いて行った。得られたPCR生成物は、296 bpのサイズを有する。
第2のPCR2フラグメントは、プライマー4004及び2007を用い、p2270を鋳型として用いて行った。フラグメントは、189 bpのサイズを有する。
SOE-PCRは、PCR1とPCR2生成物を混合することにより行った。最後に、フラグメントを、プライマー4009及び2007を用いて増幅する。
得られた450 bpのフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼSphI及びNcoIを用いて消化し、SphI及びNcoIで消化し、SAPで処理したp2270にクローニングした。サーモサイクラー中で1晩ライゲーションした。ライゲーション生成物でDH10B細胞を形質転換し、0.75 ug/mlのゼオシンを含むLB寒天プレートに播種し、ONでインキュベートした。
得られたプラスミドにおいて、プライマー2007及び4003を用いて、挿入断片を完全に配列決定した。
アクチン5cプロモーターからの切断型配列1486 bpを含むpHP17 (p2276、MR#3086株)
ベクターp2262を、制限エンドヌクレアーゼSphI及びNheIで消化し、ベクターを、Klenowを用いて再び連結した。ライゲーション生成物でDH10B細胞を形質転換し、0.75 ug/mlのゼオシンを含むLB寒天プレートに播種し、ONでインキュベートした。
コロニーを、プライマー590及び980を用いるコロニーPCRによりスクリーニングした。正しい挿入断片は、1510 bpのサイズのDNAフラグメントを示す。
得られたプラスミドにおいて、プライマー590、917、990、992、993、994、995及び2509を用いて、挿入断片を完全に配列決定した。
ベクターp2262を、制限エンドヌクレアーゼSphI及びNheIで消化し、ベクターを、Klenowを用いて再び連結した。ライゲーション生成物でDH10B細胞を形質転換し、0.75 ug/mlのゼオシンを含むLB寒天プレートに播種し、ONでインキュベートした。
コロニーを、プライマー590及び980を用いるコロニーPCRによりスクリーニングした。正しい挿入断片は、660 bpのサイズのDNAフラグメントを示す。
得られたプラスミドにおいて、プライマー590、917、993、995及び2509を用いて、挿入断片を完全に配列決定した。
第2のPCR2フラグメントは、プライマー4035及び986を用い、p22630を鋳型として用いて作製した。フラグメントは、190 bpのサイズを有する。
SOE-PCRは、PCR1とPCR2生成物を混合することにより行った。最後に、フラグメントを、プライマー986及び987を用いて増幅する。
得られた362 bpのフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼNheI及びHindIIIを用いて消化し、NheI及びHindIIIで消化し、SAPで処理したp2263にクローニングした。サーモサイクラー中で1晩ライゲーションした。ライゲーション生成物でDH10B細胞を形質転換し、0.75 ug/mlのゼオシンを含むLB寒天プレートに播種し、ONでインキュベートした。
得られたプラスミドにおいて、プライマー982を用いて、挿入断片を完全に配列決定した。
pHP18-Afl II (p2288、MR#3098株) ベクターはSOE-PCRにより構築した。第1のPCR1フラグメントは、プライマー987及び4038を用い、p2277を鋳型として用いて作製した。第2のPCR2フラグメントは、プライマー4037及び986を用い、p2277を鋳型として用いて作製した。フラグメントは、224 bpのサイズを有する。
SOE-PCRは、PCR1とPCR2生成物を混合することにより行った。最後に、フラグメントを、プライマー986及び987を用いて増幅する。
得られた689 bpのフラグメントを、制限エンドヌクレアーゼNheI及びHindIIIで消化し、NheI及びHindIIIで消化し、SAPで処理したp2277にクローニングした。サーモサイクラー中で1晩ライゲーションした。ライゲーション生成物でDH10B細胞を形質転換し、0.75 ug/mlのゼオシンを含むLB寒天プレートに播種し、ONでインキュベートした。
得られたプラスミドにおいて、プライマー980を用いて、挿入断片を完全に配列決定した。
ベクターp2288を、制限エンドヌクレアーゼAflII及びHindIIIで消化し、得られた生成物は178 bpのサイズを有し、フラグメントを、AflII及びHindIIIで消化したp2287にクローニングした。サーモサイクラー中で1晩ライゲーションした。ライゲーション生成物でDH10B細胞を形質転換し、0.75 ug/mlのゼオシンを含むLB寒天プレートに播種し、ONでインキュベートした。
コロニーは、プライマー4000及び917を用いるコロニーPCRによりスクリーニングした。正しい挿入断片は、予測されるサイズのDNAフラグメントを示す。得られたプラスミドにおいて、プライマー980及び917を用いて、挿入断片を完全に配列決定した。
ベクターp2287を、制限エンドヌクレアーゼAflII及びHindIIIを用いて消化し、得られた生成物は144 bpのサイズを有し、これをAflII及びHindIIIで消化したp2288にクローニングした。サーモサイクラー中で1晩ライゲーションした。ライゲーション生成物でDH10B細胞を形質転換し、0.75 ug/mlのゼオシンを含むLB寒天プレートに播種し、ONでインキュベートした。
コロニーは、プライマー993及び901を用いるコロニーPCRによりスクリーニングした。正しい挿入断片は、478 bpのサイズのDNAフラグメントを示す。得られたプラスミドにおいて、プライマー986及び917を用いて、挿入断片を完全に配列決定した。
材料
凍結バイアル、1.8 ml: Nunc cat.no. 377267
Excell420: SAFC cat.no. 14420
胎児ウシ血清FBS、500 ml: Life Technologies cat.no. 10099-141
0.2μmの通気口を有する蓋を有する振とうフラスコ250ml: Corning cat.no. 431144 (実動容量:25〜70ml)
0.2μmの通気口を有する蓋を有する振とうフラスコ1000ml: Corning cat.no. 431147 (実動容量: 100〜225ml)
組織培養フラスコ25cm2: Greiner cat.no. 690160 (実動容量: 4〜8ml)
組織培養フラスコ75cm2: Greiner cat.no. 658170
1. 液体窒素から1つ(又はそれより多い)バイアルを取り出し、23℃の水浴に入れる。細胞がほぼ融解するまで穏やかな振とうにより迅速に融解する。バイアルを水浴から取り出す。それぞれのバイアルは、4E7細胞を1mlの凍結培地中に含む(40% Excell420+50% FBS+10% DMSO)
2. バイアルの外側を、70%エタノールで処理することにより迅速に除染し、細胞懸濁物を、7 mlの23℃培地(Excell420+10% FBS)を含む遠心管に静かに移し、330×gで2分間遠心分離する
3. 培地を廃棄してDMSOを除去し、細胞を、5mlの23℃培地(Excell420+10% FBS)に再懸濁し、懸濁物をT25に移す
4. 細胞が6E6〜9E6細胞/mlの密度に到達するまで23℃にてインキュベートする。これは、2〜4日かかるであろう。細胞を毎日検査して、細胞カウンタを用いて計数し、細胞濃度及び生存能を記載する。生存能は、典型的に、3〜4日以内に80〜90%まで増加する。
1. 細胞培養物をT25からT75に移し、10 mlの23℃培地(Excell420+10% FBS)を加える。細胞が6E6〜9E6細胞/mlの密度に到達するまで23℃にてインキュベートする。これは、2〜4日かかるであろう。細胞を毎日検査して、細胞カウンタを用いて計数し、細胞濃度及び生存能を記載する。生存能は、典型的に、>90%である。
2. T75中の細胞培養物を2つのT75に移し、10 mlの23℃培地(Excell420+10% FBS)をそれぞれに加える。細胞が6E6〜9E6細胞/mlの密度に到達するまで23℃にてインキュベートする。これは、2〜4日かかるであろう。細胞を毎日検査して、細胞カウンタを用いて計数し、細胞濃度及び生存能を記載する。生存能は、典型的に、>90%である。
3. 細胞培養物を2つのT75から250 mlのディスポーザブル振とうフラスコに移し、25 mlの23℃培地(Excell420)を加える。細胞を110 rpm及び23℃にて、細胞が1.5E7〜2E7細胞/mlの密度に到達するまでインキュベートする。これは、3〜4日かかるであろう。細胞を、移動させた2日後から検査し、細胞カウンタを用いて計数し、細胞濃度及び生存能を記載する。生存能は、典型的に、>90%である。
1. 細胞培養物をR250から遠心管に移し、細胞を、330×gにて5分間遠心分離する。細胞を新鮮な培地(Excell420)に、8E6細胞/mlの密度まで、適切な振とうフラスコ中で再懸濁する。110 rpm及び23℃にて、細胞が2.5E7〜3.5E7細胞/mlの密度に到達するまでインキュベートする。これは、3〜4日かかるであろう。細胞を、移動させた2日後から検査し、細胞カウンタを用いて計数し、細胞濃度及び生存能を記載する。生存能は、典型的に、>90%である。
2. 1000 ml振とうフラスコ中での細胞培養物を、8.5E9細胞の細胞総数が得られるまで増殖させる。3〜4日ごとに、細胞を遠心分離により分離し、8E6細胞/mlの細胞密度まで、新しい振とうフラスコ中の新鮮な培地(Excell420)中に再懸濁する。細胞は、最後の継代培養の2日後にマスター細胞バンクの調製のために用いる。
1. 細胞を検査して、細胞カウンタを用いて計数し、細胞濃度及び生存能を記載する。生存能は、典型的に、>90%である。8E9の細胞に相当する細胞懸濁物を遠心管に移し、330×gにて5分間遠心分離する。細胞を、200 mlの4℃凍結培地(40% Excell420、50% FBS及び10% DMSO)中に再懸濁し、それぞれの凍結バイアル中の1mlの細胞懸濁物に迅速に分ける。
2. 凍結バイアルを4℃のMr. Frosty凍結箱に移し、箱を−80℃の冷凍庫に入れる。
3. 凍結バイアルを6〜48時間後に、貯蔵のために液体窒素中に移す(実動容量: 12〜25ml)。
上記のようにして維持した成長している培養物からの細胞を用い、これは、形質移入の1〜2日前に遠心分離後に希釈又は再懸濁されている。生存能は、>90%である。
1. 形質移入あたりおよそ3.2E7の細胞に相当する細胞懸濁物を遠心管に移し、およそ125×gにておよそ3分間遠心分離する。
2. 形質移入あたりおよそ4mlのおよそ23℃の培地中に再懸濁し、4ml細胞懸濁物をそれぞれのT25に移す。
3. およそ6.3 ugの各DNAを、個別のエッペンドルフチューブに移す。
4. バッファーECを、DNAを含む各エッペンドルフチューブに加えて、最終容量を150 ulにする。
5. DNAとバッファーECを、ピペットを2回上下させることにより混合する。
6. 50 ulのEnhancerを、DNA及びバッファーECを含むエッペンドルフチューブに加える。
7. DNA混合物を1秒間ボルテックスする。
8. 20〜25℃にて2〜5分間インキュベートする。
9. 140 ulのEffecteneを、DNA混合物を含むエッペンドルフチューブに加える。
10. ピペットを5回上下させることにより混合する。
11. 20〜25℃にて5〜10分間インキュベートする。
12. 1.5 mlの培地をチューブに加え、ピペットを2回上下させることにより混合する。
13. DNA混合物を、T25中の細胞懸濁物に注意して滴下し、注意してフラスコを前後にはたく。
14. およそ23℃にてインキュベートする。
形質移入の後に、23℃にて2〜4日間、細胞を成長させ、生成させ、その後、細胞数、興味対象のタンパク質及び全タンパク質の決定のために試料を採取する。一過性の形質移入中に、選択剤は加えない。
形質移入の後に、1〜2日間細胞を成長させ、その後、1.5mg/mLのゼオシン (又は適切な濃度でのその他の適切な選択剤)を加える。細胞を、次いで、上記(Tフラスコ中での細胞の増殖;振とうフラスコでの細胞の増殖)のTフラスコ及び振とうフラスコ中で増殖させる。2〜4週間後に、ゲノムへの耐性マーカーの組み込みにより選択マーカーに対して耐性の細胞のみが存在し、株化細胞は安定とみなすことができる。選択剤は、この時点でさらなる培養及び増殖ステップから除外でき、細胞は、上記のようにして凍結できる。
本研究において用いたモデルタンパク質(RANK-リガンド)を分析するために、ELISAを用いた。Bradfordの全タンパク質分析を用いて、全タンパク質濃度を決定した。
タンパク質発現レベルが増進された一連のベクターを創出した。3つの主要なクラスのNN2発現ベクターがある:第1のクラスは、アクチン5Cプロモーター駆動タンパク質発現の異なるバリアントを含むベクターを含む。第2のクラスは、HSP70プロモーターを用いるベクターのことであり、第3のクラスは、ハイブリッドアクチン5C/HSP70プロモーターを含む。
変異アクチン5cプロモーター(配列アラインメントセクションにて変異を参照されたい)を調べて、そのタンパク質発現レベルを決定した(ベクターpHP11)。変異アクチン5Cプロモーターは、pOPIE2と比較して、一貫してより高い発現レベルをもたらした(図1を参照)。
2つのバージョンのキイロショウジョウバエS2 HSP70プロモーターも試験した。第1のプロモーターは、全長HSP70プロモーター(457bp、ベクターpHP 13)であり、第2のプロモーターは、切断型バージョンのHSP70であった(59bp〜342bp、配列セクションを参照、ベクターpHP12)。切断型バージョンは、全長プロモーターと比較して、5倍までのより高いタンパク質発現レベルを有することが見出された(図2を参照)。切断型HSP70プロモーターが、安定及び一過性の発現株において高いレベルで発現されたことも観察された(図3及び4を参照)。
pOPIE2プロモーターに対してタンパク質発現における3〜9倍の増加が、安定発現株において、アクチン5C及びHSP70プロモーターについて達成された(図3)。さらに、全長アクチン5cプロモーターに対する平均発現レベルの増加が、最短切断型アクチン5Cプロモーター(アクチン5C_3、ベクターpHP18)を用いることにより達成されたが、これが有意により高い発現であるかを確認するためには、さらに実験が必要である。しかし、この傾向は、一過性の形質移入についても観察できる(図4を参照)。最高の発現レベルは、HSP70プロモーターについて観察されたが、HSP70コアプロモーター配列は、pOPIE2及び切断型HSP70プロモーターと比較して、著しく低下した発現レベルを導いた。HSP70切断型プロモーターの発現レベルは、pOPIE2よりも常に高かったが、形質移入から形質転換まで大きく変動した。この構築物についての形質移入を最適化することにより、異なる安定ポリクローナル発現株における変動が低減されることが予測される。しかし、安定ポリクローナル系統は、一旦確立されると、時間経過に伴う発現の著しい変動を示さなかった。形質移入後に得られた安定ポリクローナル発現株は、よって、最良の発現ポリクローナルプールを見出すために、使用前にスクリーニングされる。
アクチン5C(ベクターpHP10)及びHSP70 (ベクターpHP16)のコアプロモーターを、pOPIE2と比較して、それらの相対的特性についてのさらなる洞察を得た。HSP70コアプロモーターの発現レベルは、アクチン5Cコアプロモーターよりも著しくより高いが、両方のプロモーターは、内部対照として用いたpOPIE2プロモーターよりも著しくより弱い(図5)。
さらに、異なる選択マーカーを含めて、ベクターの応用においてより大きい柔軟性が可能になる。以下のマーカーを含める:ゼオシン、ネオマイシン及びブラストサイジン。
変異アクチン5Cプロモーターの発現レベルを、市販のpOPIE2プロモーターと比較して、著しくより高いことが見出された(図1を参照)。タンパク質生成レベルのさらなる増加が、アクチン5Cプロモーターを、全長2532bp (配列番号3)から612bpに切断することにより達成された。導かれた切断型プロモーターは、pOPIE2プロモーターを含む市販のp2ZOp2Fベクターと比較した場合に、安定発現株について5倍のタンパク質生成の増加を有した。また、一過性の発現レベルは、p2ZOp2Fベクターを用いて得られた発現レベルと比較して12倍まで増加した(図3及び4を参照)。
キイロショウジョウバエS2細胞において、調節機構は、熱ショックからHSP70を誘導するだけでなく、通常の温度にて発現も妨げる(Federら、1992, Genes Dev. Aug;6(8):1402〜13)。驚くべきことに、切断型 HSP70プロモーターは、安定的に形質移入された発現株において、アクチン5C及びpOPIE2プロモーターと比較して、最高の発現レベルを示した(図3を参照)。しかし、ゲノム全長プロモーターの上流の端から58 bp、及びプロモーターの下流の端から114bpをクローニングの間に除去して、切断型プロモーターを創出した。この切断が、観察されたような調節解除された(構成性の)高い発現レベルを直接もたらしたようである。図2において、切断型HSP70プロモーターの構成性の高い発現レベルが、一過性形質移入における全長プロモーターの低いレベルの発現と比較されている。このことは、プロモーターの抑制の緩和を示す。
アクチン5CコアプロモーターとKanR細菌プロモーターとの著しく弱められた発現レベル(全長及びpOPIE2プロモーターと比較して)を用いると、形質移入株化細胞のゼオシン感受性が高められる(2倍)。より低い耐性は、より高いマルチコピー組み込み事象を選択して、ZeoR耐性マーカーの乏しい発現レベルを整えることを助け、より高い興味対象遺伝子タンパク質発現レベルを導く。安定発現株を作製する際に、より少ないゼオシンを用いて、高いコピー数遺伝子組み込み事象を選択する能力は、それ自体で有利であろう。なぜなら、ゼオシンは変異原であり、細胞に対して有害な予期せぬ影響を有し得るからである。
上で論じた実験において、切断型HSP70プロモーターが、安定発現株において最高の発現レベルを導いたことが見出された(図3)。しかし、一過性の形質移入の間の最高の発現レベルは、最短の切断型アクチン5Cプロモーター(アクチン5C_3)を用いて達成された(図4)。さらに、HSP70コアプロモーターが、一過性の形質移入の間に、アクチン5Cコアプロモーターと比較して、4倍高い発現レベルを有したことが見出された(図5)。
よって、アクチン5C及びHSP70からのコアプロモーターを、それぞれ切断型アクチン5C及び切断型HSP70のプロモーターに交換したハイブリッドプロモーターを作製することにした。これにより、原型のアクチン5Cプロモーターと比較して、アクチン5C-HSP70コアハイブリッドプロモーターにおいて、発現レベルの著しい増加が導かれると考えた。
pHP34sベクターについてのDNAの合成を、GeneART, Germanyに依頼した(配列番号58)。pHP34sから創出した全てのベクターは、GeneART, Germanyに依頼した合成DNA及びDNA-technology, Denmarkに依頼したプライマーを用いて作製した。
ハイブリッドプロモーターコード配列は、プラスミドpHP34s-ハイブリッド中で、GeneARTに依頼した合成HSP70プロモーターDNA (配列番号 37)からのHSP70コアプロモーターコード配列のPCRにより創出した(PCRプライマー: GCGAACTTAAGAGCGCCGGAGTATAAATAG (配列番号64)及びCCAAGCTTCTGCAGATTGTTTAGCTTG (配列番号65)。第2のPCRを、次いで行って、pHP34sからのプロモーターの上流部分にアクチン5cプロモーターを得て(プライマー: GGTTTGTCCAAACTCATCAATGTAT (配列番号66)及びTATACTCCGGCGCTCTTAAGTTCGCTCGCGTTCAAAACTTTTACC (配列番号 67))、2つのPCRフラグメントを、PCRを用いて融合させた。
イントロン(合成、配列番号60))は、GeneARTに依頼し、GeneARTによりpHP34s-ハイブリッドベクター中に、SacI及びEcoRI制限部位の間で挿入し、pHP34s-ハイブリッド.iベクターを創出した。
カナマイシン/ジェネテシン(G418)耐性マーカーベクターを創出し、pHP34s-ハイブリッド-KanRと命名した。ベクターを、KanR/NeoR遺伝子をコードするgeneARTに依頼した合成DNA (大腸菌及びS2細胞での発現のために最適化された)及び大腸菌プロモーターをpHP34s-ハイブリッドベクターに挿入することにより創出した。ベクター及び挿入断片を、XmnI及びSalIで消化し、直鎖状ベクター及びkanR含有フラグメントを、標準的な手順に従ってゲル精製し、連結した。
hRP1.12-RA-pHP34s-ハイブリッド、pHP34s、pHP34s-ハイブリッド-hSAR-FR及びpHP34s-ハイブリッド.iについてのベクターマップを、図10〜12に示す。
比較実験のために、2つのInvitrogenベクター(pMT/V5.HIS.A及びpAC5.1)を用いた。これらの2つのベクターは、選択マーカーを含まず、よって、これもまたInvitrogenから得られたハイグロマイシン耐性を与えるベクター(pCoHygro)と同時形質移入した。形質移入は、pHP34s由来ベクターについてと同じプロトコルに従って行ったが、ハイグロマイシン耐性ベクターは、pMT/V5.HIS.A及びpAC5.1ベクターに、10:1の比(ハイグロマイシン耐性ベクターよりも10倍より多い発現ベクター)で加えた。
残りのベクターを、上記の標準的な手順に従って形質移入した。
ハイグロマイシン耐性細胞を、1500 ug/mLのゼオシンの代わりに600 ug/mLのハイグロマイシンを培地に加えた以外は、上記のゼオシン耐性細胞について記載したのと同じ方法に従って、安定にした。
カナマイシン/ジェネテシン(G418)耐性を与えるベクターを、S2細胞において1200〜1500ug/mLのG418、又は大腸菌細胞について標準的なカナマイシン濃度を用いて選択を行った以外は、上記の方法に従って形質移入した。
CdCl2誘導
pMT/V5.HIS.Aベクターは、カドミウム誘導性プロモーターを有するので、発現比較試験のために、細胞をCdCL2で誘導した。細胞を、振とうフラスコ中で2〜3日成長させ、次いで、1mlの培地あたり1ulのストックを用いて誘導した(ストック: 1mM CdCl2 Sigma C-2544 lot13H0424: 1000 ml H2O中に183 mg)。細胞に、さらに3〜4日間、タンパク質生成させ、その後、分析用の試料を採取した。
残りのベクターは、構成プロモーターを有するので、誘導する必要はなかった。試料を、成長及び生成の3〜4日後に採取した。
実験は、振とうフラスコ中で2重又は3重で行った(以下の生データを参照)。
アクチン5cプロモーターの弱いコアプロモーターを、より強いHSP70コアプロモーターで交換することにより、切断型アクチン5cプロモーターに対して50%の発現増加が導かれた(図8を参照)。
我々は、新しいエレメント、イントロン、特にZieler H., Huynh CQ. 「Intron-dependent stimulation of marker gene expression in cultured insect cells」, Insect Mol Biol. 2002 1, 87〜95の論文に記載されたイントロンの効果も試験した。このイントロンのDNA配列は、配列番号60に示し、ここで、これは2つの制限部位で挟まれている。よって、本発明によると、プロモーター核酸配列と興味対象タンパク質のコード配列との間に配列番号60のようなプロモーターを含めることにより、本発明により得られる増加した発現レベルに著しいものを加えることができる。
図9は、イントロンの付加が、原型のハイブリッドプロモーターベクターと比較して、モデルタンパク質の発現を22%増加させ、2つのフランキングマトリクス付着領域の付加が発現を46%増進させたことを示す。1つのベクター中でのイントロンとマトリクス付着領域との組み合わせが、発現をさらに増進させることが期待される。
最後に、図13は、本発明のベクターが、2つの市販のベクターよりも著しくより高い発現収率を提供することを示す。
ベクター機能は、第2の選択マーカーであるカナマイシン/ジェネテシン(G418)を付加することによっても改良された。このことは、異なるタンパク質を発現する2つのベクターを1つの細胞に同時形質移入することを可能にする。これは、ゼオシン耐性マーカー、次いでカナマイシン耐性マーカー(任意の順序で)での連続的な形質転換も可能にする。
Claims (32)
- 配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6又は配列番号33のヌクレオチド配列から選択される配列に含まれている配列番号36のヌクレオチド配列が配列番号37のヌクレオチド配列に置換されているキメラ配列を含むプロモーターDNAポリヌクレオチドを含む、
昆虫細胞における興味対象のポリペプチドの異種発現に適する単離DNAポリヌクレオチド。 - プロモーターDNAポリヌクレオチドが、いずれかの末端にてフランキング制限部位配列
を有するか又は有さない、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号33、配列番号36、配列番号37又は配列番号68のヌクレオチド配列からなる群より選択される配列を含む請求項1に記載の単離DNAポリヌクレオチド。 - 配列番号68を含む請求項1又は2に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
- プロモーターDNAポリヌクレオチドが、配列番号1又は配列番号4の配列を有するプロ
モーターDNAポリヌクレオチドのいずれか1つのタンパク質発現レベルと比較して、増加
したタンパク質発現レベルを示す請求項1〜3のいずれか1項に記載の単離DNAポリヌク
レオチド。 - タンパク質発現レベルの増加が、配列番号1若しくは配列番号4の配列を有するプロモーターDNAポリヌクレオチドのいずれか1つのタンパク質発現レベルに対して約50パーセント〜約300パーセントである請求項4に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
- タンパク質発現レベルの増加が、配列番号1若しくは配列番号4の配列を有するプロモーターDNAポリヌクレオチドのいずれか1つのタンパク質発現レベル又はpOPIE2プロモーターに対して2倍〜10倍である請求項4に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
- 選択マーカー、例えばゼオシン選択マーカー、ネオマイシン選択マーカー、ハイグロマイシン選択マーカー、ピューロマイシン選択マーカー及びブラストサイジン選択マーカーからなる群より選択される選択マーカーをさらに含む請求項1〜6のいずれか1項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
- pKANR細菌プロモーターのような細菌プロモーターをさらに含む請求項7に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
- 昆虫細胞における選択マーカーの発現を駆動するのに適する第2のプロモーターDNAポリヌクレオチドをさらに含む請求項7又は8に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
- マルチクローニング部位に対して上流及び/又は下流に少なくとも1つの遍在性クロマチンオープニングエレメントをさらに含む請求項1〜9のいずれか1項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
- Gypsy (gsu(Hw))インスレーター配列のような少なくとも1つの転写インスレーターエレメントをさらに含む請求項1〜10のいずれか1項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
- 昆虫細胞における選択のために適するジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)コード配列をさらに含む請求項1〜11のいずれか1項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
- SV40ポリAシグナル及び/又はOPIE2ポリAシグナルのような少なくとも1つのポリアデニル化シグナル配列をさらに含む請求項1〜12のいずれか1項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
- 大腸菌の複製起点をさらに含む請求項1〜13のいずれか1項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
- 少なくとも1つのタンパク質排出シグナルポリヌクレオチド配列をさらに含む請求項1〜14のいずれか1項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
- 前記タンパク質排出シグナルポリヌクレオチド配列が、BIP及びCPYから選択される少なくとも1つである請求項15に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
- ウイルスDNAを実質的に含まない請求項1〜16のいずれか1項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
- 少なくとも1つのHISタグ配列をさらに含む請求項1〜17のいずれか1項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
- 興味対象のポリペプチドをコードする遺伝子を、単離DNAポリヌクレオチドに挿入するために、プロモーターDNAポリヌクレオチドの下流にマルチクローニング部位をさらに含む請求項1〜18のいずれか1項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
- SV40からの少なくとも1つの72bpエレメントをさらに含む請求項1〜19のいずれか1項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
- 少なくとも1つの増幅制御エレメントをさらに含む請求項1〜20のいずれか1項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
- 少なくとも1つのOri-ベータエレメントをさらに含む請求項1〜21のいずれか1項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
- 少なくとも1つのマトリクス付着領域(MAR)エレメントをさらに含む請求項1〜22のいずれか1項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
- 配列番号40、例えば配列番号40のヌクレオチド10〜574によるB型肝炎ウイルスからのPREエレメントのようなB型肝炎ウイルスからの少なくとも1つのPREエレメントをさらに含む請求項1〜23のいずれか1項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
- 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号33、配列番号36、配列番号37又は配列番号68のヌクレオチド配列のいずれか1つの配列の少なくとも3連続ヌクレオチドの機能的フラグメント、並びにそれと少なくとも80%の配列同一性を有する機能的ヌクレオチド配列である少なくとも1つのヌクレオチド配列をさらに含み、該機能的フラグメントが、ショウジョウバエS2細胞におけるプロモーターエンハンサー活性を有する請求項1〜24のいずれか1項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
- プロモーター DNAポリヌクレオチド配列の下流、かつマルチクローニング部位の上流にフランキング制限部位を含むか又は含まない少なくとも1つのイントロン、例えば配列番号60に示すイントロンをさらに含む請求項1〜25のいずれか1項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
- ライゲーション非依存性クローニング(LIC)に適合されている請求項1〜26のいずれか1項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
- 前記プロモーターDNAポリヌクレオチド配列に対して異種のポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列をさらに含む請求項1〜26のいずれか1項に記載の単離DNAポリヌクレオチド。
- 請求項1〜28のいずれか1項に記載の単離DNAポリヌクレオチドを含む細胞。
- キイロショウジョウバエのような昆虫の細胞である請求項29に記載の細胞。
- 前記単離DNAポリヌクレオチドを安定的に形質移入された請求項29又は30に記載の細胞。
- (a) 興味対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を得るステップと、
(b) 興味対象のポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列を、請求項1〜27のいずれか1項に記載の単離DNAポリヌクレオチドに挿入するステップと、
(c) ステップ(b)で得られたポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換するステップと、
(d) ステップ(b)で得られたポリヌクレオチドの発現を可能にして、前記ポリペプチドを生成するステップと、
(e) そこからポリペプチドを得るステップと
を含む、ポリヌクレオチドによりコードされる興味対象のポリペプチドを生成する方法。
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