CN108559731A - 一种可调控基因表达的人类胚胎干细胞系及其应用 - Google Patents

一种可调控基因表达的人类胚胎干细胞系及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可调控基因表达的人类胚胎干细胞系及其应用。本发明可调控基因表达的人类胚胎干细胞系包含可控表达外源性融合蛋白系统和至少一种向导RNA，所述可控表达外源性融合蛋白系统包括四环素诱导表达系统和以Cas9蛋白和具有转录激活活性的p300核心结构域构成的融合蛋白；所述向导RNA为靶向基因启动子区的14bp短序列或针对基因组区域的20bp的长序列。本发明可实时控制Cas9‑p300在人类胚胎干细胞中表达，实现在人类胚胎干细胞分化的不同阶段特定基因激活和切割双功能，大大的扩展了人类胚胎干细胞在医学和生命科学领域中的应用。

Description

一种可调控基因表达的人类胚胎干细胞系及其应用
技术领域
本发明属于基因工程和生物技术领域，涉及由CRISPR/Cas9介导的可控性激活切割双系统的Cas9-p300人类胚胎干细胞系及其构建方法及其应用。
背景技术
人类胚胎干细胞是一种多潜能性细胞，来自早期胚胎(4-5d)的内细胞团，具有自我更新和多向分化的潜能。1998年，美国科学家James Thomson首次体外成功培养人类胚胎干细胞，人类胚胎干细胞的科学研究和临床应用也拉开的帷幕。目前研究中，胚胎干细胞已经成功的分化成滋养层细胞、神经细胞、肝细胞、软骨细胞、造血细胞、心肌细胞等多种细胞，也成功的建立了个体发育模型，同时正在向干细胞的移植来重建机体功能和干细胞基因治疗等临床治疗方向努力发展，虽然胚胎干细胞的研究前景令人很乐观，但是也存在很多困难，如细胞培养技术条件要求高，资金消耗大等问题。
CRISPR/Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-Associated systems)，全名是常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关联蛋白系统，是细菌及古生菌的一种获得性免疫系统，能够通过单链RNA识别外源双链DNA，并借助Cas9核酸酶切割外源DNA，抵御外源DNA侵袭。2013年，张锋等科学家首次报道了CRISPR-Cas9系统在哺乳动物基因组编辑中的应用，开启了CRISPR-Cas9强大的基因编辑功能成为生命科学领域的新星，获得广泛研究和应用，近些年针对CRISPR-Cas9系统中的成份进行不同的修饰和更改，如突变Cas9中活性区的重要的氨基酸和缩短向导RNA的长度，来控制Cas9核酸酶是切割活性。
非同源末端连接(NHEJ)和同源重组修复(HDR)，是机体DNA受到损伤时常见的DNA修复机制，其中，NHEJ为主，HDR为辅，目前，基因敲入方法主要是基于后者HDR机制，此方法具有精确基因编辑的效果，但是存在效率低问题，当在大规模进行基因敲入时，这将给实验带来很大不方便，因此NHEJ是我们实验所关注的重点。定点在AAVS1位点进行外源基因的敲入，在即往的研究中已证明不影响整个细胞的生理过程和机制功能，因此我们利用CRISPR-Cas9核酸酶在AAVS1位点进行切割，利用机体的自身的NHEJ修复机制进行基因敲入，发现效率可观。
P300蛋白具有组蛋白乙酰转移酶活性，可使染色质结构重构，暴露基因的启动子和增强子于转录因子，起到调控基因的表达.有报导指出p300蛋白的基因激活作用效果优于VP64 等相似功能蛋白，但其在基因修饰领域的应用仍少于VP64等传统作用因子。本发明将 Cas9-p300基因定点敲入人类胚胎干细胞的AAVS1位点，结合四环素(DOX)诱导控制系统，实现实时控制Cas9-p300在人类胚胎干细胞的特定阶段表达，实现特定基因激活和切割双功能，可在人类胚胎干细胞分化的不同阶段实现单个或多个基因的激活或切割，或者基因激活和切割同时实现，从而扩大了人类胚胎干细胞应用。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种可控性表达Cas9-p300融和蛋白的人类胚胎干细胞系及其构建方法及其应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种可调控基因表达的人类胚胎干细胞系，其包含可控表达外源性融合蛋白系统和至少一种向导RNA，所述可控表达外源性融合蛋白系统包括四环素诱导表达系统和以Cas9蛋白和具有转录激活活性的p300核心结构域构成的融合蛋白；所述向导RNA为靶向基因启动子区的14bp短序列或针对基因组区域的20bp的长序列，。
其中，所述基因启动子区位于MYOD1、IL1RN、HBG1、FOXA2、SOX17、NKX2.1和miR145。所述基因组区域位于CCR5、IL1RN、HBG1和OCT4。
本发明还提供了一种供体表达载体，用于表达所述可控表达外源性融合蛋白系统，包括以下四个部分：
第一部分，控制系统元件，包括CMV启动子，M2rtTA表达序列，SV40polyA；
第二部分，融和蛋白表达元件，包括TRE启动子，Cas9-p300表达序列，SV40polyA；
第三部分，体内线性化元件，包括位于供体载体两端方向相同的23bp的AAVS1gRNA识别序列；
第四部分，抗性筛选元件，包括T2A，puromycin抗性基因表达序列，bGH polyA。
本发明还提供了上述可调控基因表达的人类胚胎干细胞系的构建方法，是通过CRISPR-CAS9切割基因组CRISPR-CAS9切割基因组AAVS1位点和供体载体两端AAVS1位点，并利用非同源末端直接连接把线性化的供体表达载体上有目的基因的片段敲入基因组AAVS1位点。
本发明基于长短向导RNA导致Cas9核酸酶表现不同活性，其中20bp长向导RNA与Cas9 形成的复合物具有识别和切割DNA双链的功能，14bp的短向导RNA与Cas9形成的复合物仅有识别功能无切割功能。因此，本发明的可调控基因表达的人类胚胎干细胞系可用于DNA 靶向激活/切割。
具体方法包括如下步骤：
(1)将可控表达外源性融合蛋白系统敲入人类胚胎干细胞系；
(2)构建表达向导RNA的载体，包括长向导RNA和/或短向导RNA；
(3)加入四环素，诱导步骤(1)所得人类胚胎干细胞系中Cas9-p300表达；
(4)将步骤(2)所得表达向导RNA的载体通过电转转入步骤(1)所得人类胚胎干细胞系，细胞内表达的融合蛋白与向导RNA结合，将Cas9-p300融合蛋白靶向目标基因区，实现基因的激活和/或切割。
相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：
本发明实现基因敲入的方法是基于基因修复机制中的NHEJ，相比于传统的基因敲入方法的HDR原理，本发明不仅大大的降低了构建质粒的难度，而且实现了高效率基因敲入。
本发明实现了在人类胚胎干细胞中，基于CRISPR/Cas9系统基因激活的功能，这可以使人类胚胎干细胞在分化的不同阶段实现特定单个或多个基因的激活。
本发明实现了在人类胚胎干细胞中，一个系统中同时实现了基因的切割和激活功能，这将给人类胚胎干细胞应用拓展更大的空间。
附图说明
图1是pBLuSKP质粒图谱。
图2是pBLuSKP-AAVS1-AAVS1质粒图谱。
图3是Puro-Cas9-donor质粒图谱。
图4是AAVS1-Neo-M2rtTA质粒图谱。
图5是Cas9-M2rtTA-puro质粒图谱。
图6是pBLu-AAVS1-Cas9-M2rtTA-AAVS1质粒图谱。
图7是pBLu-AAVS1-oligo-M2rtTA-AAVS1质粒图谱。
图8是P2U6-pCAG-Cas9-p300baeIMutant-mcherry质粒图谱。
图9是pBLu-AAVS1-Cas9-p300baeIMutant-M2rtTA-AAVS1质粒图谱。
图10是pU6-sEFgRNA质粒图谱。
图11是pU6-sgAAVS1-gEFRNA质粒图谱。
图12是本发明基因敲入系统的PCR基因型鉴定的引物设计的位置。
图13是本发明基因敲入系统PCR基因型鉴定结果。
图14是本发明可控激活和切割双系统正交性鉴定结果，(a)短向导RNA激活基因HBG1、 IL1RN和MYOD1的RT-PCR结果图；(b)长的向导RNA和短的向导的RNA切割基因组HBG1、IL1RN结果图，表明短的向导RNA在激活基因的同时不存切割活性。
图15是本发明功能鉴定结果图，(a)本发明的功能的模式图，包括可控激活和切割两个功能，在短的向导RNA引导下，本发明的系统可以实现靶向基因激活，在长的向导RNA引导下可以实现基因的切割的作用；(b)本发明的基因敲入系统的供体载体的设计，包括三部分，两端的AAVS1向导RNA切割位点，中间DOX诱导控制系统序列和Cas9-p300表达系统序列；(c)蛋白印迹(western blot)鉴定DOX诱导控制系统的可行性，选取本系统构建的 4种不同的单克隆，正常状态下，本系统不表达Cas9-p300蛋白，当加入DOX后，系统可以表达Cas9-p300蛋白；(d)本发明可控激活和切割双系统功能作用，同时转入本系统中针对特定基因的长和短的向导RNA，RT-PCR结果显示短向导RNA靶向基因IL1RN、HBG1和 MYOD1激活，T7EI结果显示长向导RNA靶向的基因CCR5进行了切割。
图16是本发明建立的细胞系的干细胞核型分析结果图。
图17是本发明系统胚胎干细胞干性的鉴定结果图，(a)胚胎干细胞标志物，包括OCT4、 SOX2、NANOG、GABRB3、LIN28、REX1、TDGF1和TERT的RT-PCR结果图，显示与野生型(WT)mRNA水平无差异；(b)NSG免疫缺陷小鼠皮下畸胎瘤的HE染色结果图，结果显示成功体内分化为三个胚层的结构均用黑色三角型所指示；(c)人类胚胎干细胞核心转录因子OCT4和SOX2的细胞免疫荧光结果图，结果与野生型(WT)表达水平一致。
图18是本发明系统的可控切割功能在胚胎干细胞中的应用结果图，靶向基因OCT4，(a) OCT4基因靶向位点切割的T7EI结果图，显示相比于对照组(Ctrl-gEGFP)，仅有向导RNA 靶向的位点被切割；(b)细胞免疫荧光结果图，显示OCT4成功敲除；(c)OCT4基因缺失后，人类胚胎干细胞形态学上出现分化；(d)OCT4基因缺失0天，6天，9天和12天，RT-PCR 检测三个胚层的标记物转录水平的表达量。
图19是本发明系统可控激活基因FOXA2、SOX17、NKX2.1和微小RNA145(miRRNA145)的RT-PCR结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。实施例中除特殊说明外，均为本领域常规试剂和方法步骤。
实施例
pBLuSKP-AAVS1-AAVS1质粒(图2)构建：
设计合成gAAVS1-HindIII-gAAVS1碱基序列OLIGO-F和OLIGO-R，具体如SEQ IDNO:1～2所示。
两条部分互补配对单链DNA片段合成双链的DNA片段，具体步骤如下:
10ul 100uM Oligo-F和10ul 100uM Oligo-R预混于1.5ml EP管中，用烧杯煮沸800ml的蒸馏水，将1.5ml EP管置于沸水中5分钟，取出1.5ml EP管室温放置过夜，用XholI+NotI 限制性内切酶切割(具体见下文)pBLuSKP质粒(图1)，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物，切胶回收2888bp条带，并利用NanoDrop测定回收片段浓度,将切割后线性化的pBLuSKP质粒与上述双链的DNA片段通过T4DNA连接酶连接(具体见下文)，然后将连接产物转化到 TOP10大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为 pBLuSKP-AAVS1-AAVS1(图2).
酶切体系50μL，具体包括：
XholI-HF:0.5μL，NotI-HF:0.5μL，10ⅹcutsmart buffer:5μL，质粒：3μg，ddH2O:至50μL， T4连接体系10μL，具体包括：T4ligase:1μL，10xT4ligase buffer:1μL，稀释15倍的双链的 DNA片段:2μL，线性化pBLuSKP质粒:2μL，ddH2O:4μL。
反应条件：25℃水浴1h。
Cas9-M2rtTA-puro质粒(图5)构建：
以AAVS1-Neo-M2rtTA质粒(图4)为模版进行PCR，设计合成PCR引物M2rtTA-F和M2rtTA-R，序列如SEQ ID NO:3～4所示。
用MfeI+MluI限制性内切酶切割(具体见下文)Puro-Cas9-donor质粒(图3)，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析酶产物和PCR(具体见下文)产物，切胶回收分别11430bp和3070bp条带，并利用NanoDrop测定回收片段浓度，将线性化的Puro-Cas9-donor质粒与PCR产物通过NEB 公司购买的Gibsion Assembly连接试剂盒连接(具体见下文)，然后将连接产物转化到TOP10 大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为 Cas9-M2rtTA-puro(图5)。
PCR体系如下：
模版质粒:1μL(10ng)，前向引物:1μL(10μM)，后向引物:1μL(10μM)，2ⅹTaq酶混合物:25μL，ddH2O:至50μL。
PCR程序如下：①95℃:2min，②95℃:30s，③58℃:30s，④72℃:3min，②③④循环39 次，⑤72℃2min，⑥16℃保存。
Gibsion assembly反应体系如下：Gibsion assembly混合物：3μL，PCR产物： 1μL，酶切产物：2μL。
pBLu-AAVS1-Cas9-M2rtTA-AAVS1质粒(图6)构建：
用HindIII限制性内切酶切割(具体见下文)pBLuSKP-AAVS1-AAVS1(图2)质粒和Cas9-M2rtTA-puro(图5)质粒，将线性化的质粒通过T4DNA连接酶连接(具体见下文)，然后将连接产物转化到TOP10大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板， 37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃、250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为pBLu-AAVS1-Cas9-M2rtTA-AAVS1(图6)。
酶切体系50μL，具体包括：HindIII-HF:0.5μL，10ⅹcutsmart buffer:5μL，质粒：3μg，ddH2O:至50μL。
T4连接体系10μL，具体如下：T4ligase:1μL，10x T4ligase buffer:1μL，线性化Cas9-M2rtTA-puro质粒:2μL，线性化pBLuSKP-AAVS1-AAVS1质粒:2μL，ddH2O:4μL。
反应条件：25℃水浴1h。
pBLu-AAVS1-oligo-M2rtTA-AAVS1(图7)质粒构建：
设计并合成碱基序列OlIGO-F2和OlIGO-R2，并引入AgeI+NheI酶切位点，具体如SEQ ID NO:5～6所示。
两条部分互补配对单链DNA片段合成双链的DNA片段.具体步骤如下:
10ul 100uM OLIGO-F2和10ul 100uM OLIGO-R2预混于1.5ml EP管中，用烧杯煮沸800ml的蒸馏水，将1.5ml EP管置于沸水中5分钟，取出1.5ml EP管室温放置过夜。
用AgeI+MluI限制性内切酶切割(具体见下文)pBLu-AAVS1-Cas9-M2rtTA-AAVS1(图6) 质粒，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析酶产物，切胶回收7500bp条带，并利用NanoDrop测定回收片段浓度,将线性化的pBLu-AAVS1-Cas9-M2rtTA-AAVS1质粒与上述双链的DNA片段通过 T4DNA连接酶连接(具体见下文)，然后将连接产物转化到TOP10大肠杆菌中，涂在含有 100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为 pBLu-AAVS1-oligo-M2rtTA-AAVS1(图7)。
酶切体系50μL，具体包括：
Mlu-HF:0.5μL，ageI-HF:0.5μL，10ⅹcutsmart buffer:5μL，质粒：3μg，ddH2O: 至50μL。
T4连接体系10μL，具体如下：
T4ligase:1μL，10x T4ligase buffer:1μL，稀释15倍的双链的DNA片段:2μL，线性化 AsCpf1/LbCpf1原始质粒:2μL，ddH2O:4μL。
反应条件：25℃水浴1h.
pBLu-AAVS1-Cas9-p300baeIMutant-M2rtTA-AAVS1质粒(图9)构建：
用AgeI和NheI限制性内酶切割pBLu-AAVS1-oligo-M2rtTA-AAVS1(图7)和 P2U6-pCAG-Cas9-p300baeIMutant-mcherry(图8)质粒，将线性化的质粒通过T4DNA连接酶连接(具体见下文)，然后将连接产物转化到TOP10大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为pBLu-AAVS1-Cas9-p300-M2rtTA-AAVS1质粒 (图9)。
酶切体系50μL，具体包括：
NheI-HF:0.5μL，ageI-HF:0.5μL，10ⅹcutsmart buffer:5μL，质粒：3μg，ddH2O:至50μL。
T4连接体系10μL，具体包括：
T4ligase:1μL，10x T4ligase buffer:1μL，线性化pBLu-AAVS1-oligo-M2rtTA-AAVS1质粒: 2μL，线性化P2U6-pCAG-Cas9-p300-mcherry质粒:2μL，ddH2O:4μL。
反应条件：25℃水浴1h。
pU6-sgAAVS1-sEFgRNA质粒(图11)构建：
设计并合成包含AAVS1位点的gRNA序列gRNA-F和gRNA-R，具体如SEQ ID NO:7～8所示。
两条部分互补配对单链DNA片段合成双链的DNA片段.具体步骤如下:
10ul 100uM gRNA-F和10ul 100uM gRNA-R预混于1.5ml EP管中，用烧杯煮沸800ml 的蒸馏水，将1.5ml EP管置于沸水中5分钟，取出1.5ml EP管室温放置过夜。
用baeI限制性内切酶切割(具体见下文)pU6-sgEFgRNA(图10)质粒，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析酶产物，切胶回收条带，并利用NanoDrop测定回收片段浓度，将线性化的pU6-sEFgRNA质粒与上述双链的DNA片段通过T4DNA连接酶连接(具体见下文)，然后将连接产物转化到TOP10大肠杆菌中，涂在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，然后挑取单个克隆，37℃、250rpm摇菌后提取质粒进行DNA测序，由此筛选到构建的载体，命名为pU6-sgAAVS1-sEFgRNA质粒(图11)。
酶切体系50μL，具体包括：
baeI:0.5μL，10ⅹcutsmart buffer:5μL，质粒：3μg，ddH2O:至50μL。
T4连接体系10μL，具体包括：
T4ligase:1μL，10x T4ligase buffer:1μL，稀释15倍的双链的DNA片段:2μL，线性化 Pu6-sgFEgRNA原始质粒:2μL，ddH2O:4μL。
反应条件：25℃水浴1h.
利用CRISPR/Cas9技术将Cas9-p300融和蛋白敲入的人类胚胎干细胞(hESC)AAVS1位点及其应用。
培养人类胚胎干细胞H9于六孔板中，冰上解冻Matrigel0.5h，配置 Matrigel:DMEM/F12＝1:80薄胶溶液，每孔加入1毫升包被胶，置于37℃，5％CO2孵箱2小时，然后每孔种植5*105个细胞，用mTeSRI培养，置于37℃，5％CO2孵箱，每天更换2毫升液体，4天后，用TrypLE消化细胞，收集细胞计数，离心去上清，PBS重悬后电转染，电转体系具体过程如下：
取5*106个细胞PBS重悬
在500μL细胞悬液中加入25μg质粒，比例如下表：
质粒名称 使用量(25μg)
pBLu-AAVS1-Cas9-p300-M2rtTA-AAVS1 9.4μg
pCAG-Cas9 9.4μg
pU6-sgAAVS1-sEFgRNA 6.2μg
将细胞质粒PBS混合液加入到4nm电转杯中，电转条件：300V，4ms，1puls，室温放置10分钟。
轻轻将液体转移到Matrigel已经包被好的六孔板中37℃，5％CO2孵箱培养，5天后，换用0.5μg/mLpuro抗性的培养液，筛选4天，再换用正常的mTeSRI培养液培养10-14天后挑取单克隆，并进行基因型鉴定(具体见下文)。
PCR基因型鉴定具体如下：
设计引物位点分别位于敲入基因位点的上游下游和中间，具体位置如图12所示，引物 5-F、5-R、3-F和3-R序列具体如SEQ ID NO:9～12所示。
收取单克隆并提取基因组的DNA并做PCR，鉴定条带大小如下表格所示，鉴定结果如图13所示，共有36个克隆，其中阳性克隆有18个，效率达50％，随机抽取了4个克隆测序，鉴定基因敲入成功，然后用抗flag抗体通过western blot进行在蛋白水平鉴定，结果显示Cas9-p300蛋白表达，结果如图15-c。
抽取纯合子15和杂合子24号单克隆，进行功能实验鉴定，包括Cas9-p300酶切割和基因激活活性：
激活和切割的双系统Cas9-p300的人类胚胎干细胞系切割功能鉴定如下所示：
设计针对CCR5位点的gRNA并转入人类胚胎干细胞中，具体过程如下：
培养人类胚胎干细胞于六孔板中，冰上解冻Matrigel，配置Matrigel:DMEM/F12＝1:80溶液，加入六孔板中，每孔1mL，置于37℃，5％CO2孵箱2小时，然后每孔种植5*105个细胞，用mteSRI培养，置于37℃，5％CO2孵箱，第二天至以后几天均换液为含有2μg/mlDOXmteSR，连续加2天后，每天换液体，用TrypLE消化细胞，收集细胞计数，离心去上清，PBS重悬后电转染，取3*106个细胞用PBS重悬，在悬中加入10μg表达Pu6-gRNA-CCR5质粒，将细胞质粒PBS混合液加入到4nm电转杯中，电转条件：300V、4ms、1puls，室温放置10分钟，轻轻将液体转移到Matrigel已经包被好的六孔板中，37℃，5％CO2孵箱培养，每天换液体，收取基因组DNA进行T7EI检验有Cas9-p300酶切割活性，结果如图15-d所示，具体过程如下：
PCR体系如下：
模版质粒:1μL(100ng)，前向引物:2.5μL(10μM)，后向引物:2.5μL(10μM)，2ⅹTaq酶混合物:25μL，ddH2O至50μL。
PCR程序如下：
①95℃:2min，②95℃:30s，③58℃:30s，④72℃:50s，②③④循环40次，⑤72℃2min，⑥16℃保存。
使用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物，利用NanoDrop测定浓度.取400ngPCR产物加入2uL 10xNEB缓冲液2，补水至20uL，然后退火，再加0.4uLT7核酸内切酶，37℃，2小时，用2％琼脂糖凝胶电泳分析切割产物，结果如图15，退火具体过程如下：
①95℃2min，②-2℃/s to 85℃，③-0.1℃/s to 25℃，④16℃保存。
激活和切割的双系统Cas9-p300的人类胚胎干细胞系激活功能鉴定：
选择激活基因Myod1、IL1RN和HBG1，针对三个基因的启动子区，分别设计并合成4条短的(14bp)向导RNA，利用构建pU6-sgAAVS1-sEFgRNA质粒一样的方法，合成可表达Myod1、IL1RN和HBG1三个基因启动子区的向导RNA，具体序列如下：
IL1RN向导RNA合成序列：g-IL1RN-RNA-F1、g-IL1RN-RNA-R1、g-IL1RN-RNA-F2、 g-IL1RN-RNA-R2、g-IL1RN-RNA-F3、g-IL1RN-RNA-R3、g-IL1RN-RNA-F4和 g-IL1RN-RNA-R4的序列如SEQ ID NO13～20。
HBG1向导RNA合成序列：g-HBG1-RNA-F1、g-HBG1-RNA-R1、g-HBG1-RNA-F2、 g-HBG1-RNA-R2、g-HBG1-RNA-F3、g-HBG1-RNA-R3、g-HBG1-RNA-F4和g-HBG1-RNA-R4 的序列如SEQ ID NO21～28。
MYOD向导RNA合成序列：g-Myod1-RNA-F1、g-Myod1-RNA-R1、g-Myod1-RNA-F2、 g-Myod1-RNA-R2、g-Myod1-RNA-F3、g-Myod1-RNA-R3、g-Myod1-RNA-F4和 g-Myod1-RNA-R4的序列如SEQ ID NO29～36。
培养人类胚胎干细胞于六孔板中，冰上解冻Matrigel，配置Matrigel:DMEM/F12＝1:80 溶液，加入六孔板中，每孔1mL，置于37℃，5％CO2孵箱2小时，然后每孔种植5*105个细胞，用mteSRI培养，置于37℃，5％CO2孵箱，第二天至以后几天均换液为含有2μg/mlDOXmteSR，连续加2天后，每天换液体，用TrypLE消化细胞，收集细胞计数，离心去上清， PBS重悬后电转染，取3*106个细胞用PBS重悬，在悬中加入10μg表达Pu6-gRNA-CCR5质粒，将细胞质粒PBS混合液加入到4nm电转杯中，电转条件：300V、4ms、1puls，室温放置 10分钟，轻轻将液体转移到Matrigel已经包被好的六孔板中，37℃，5％CO2孵箱培养，每天换液体，电转后48h收取细胞，利TRIZOL提取细胞中的全部mRNA，实验步骤参见(Qiagen’s RNA MiniKit:74106说明书)，设计并合成引物序列GAPDH-RT-F、GAPDH-RT-R、 MYOD1-RT-F、MYOD1-RT-R、IL1RN-RT-F、IL1RN-RT-R、HBG1-RT-F和HBG1-RT-R，具体如SEQ ID NO:37～44所示，进行Real-Time PCR实验，实验步骤参见(TaKaRa:RR036Q说明书中Biosystems 7500RT-TimePCR System,StepOnePlus)，结果如图14所示，结果显示三个基因均激活。
激活和切割的双系统Cas9-p300的人类胚胎干细胞系两个功能正交性鉴定：
设计并合成，针对HBG1和IL1RN的具有切割功能的长的(20bp)向导RNA(具体序列见下方)和上述已经证明具有激活功能短的(14bp)的向导RNA，电转进入人类胚胎干细胞中，48h后，收取全基因组DNA，利用T7EI实验进行验证，结果如图14，结果显示，短的向导RNA具有基因激活功能，但是不具有基因切割功能，充分证明，本发明的双系统具有正交性，这将将来的应用带来的更宽广的应用。
长的向导RNA序列如下：g-IL1RN-RNA-20-F3、g-IL1RN-RNA-20-R3、 g-HBG1-RNA-20-F2、g-HBG1-RNA-20-R2、g-CCR5-RNA-20-F和g-CCR5-RNA-20-R的序列如SEQ ID NO:45～50所示。
T7EI实验设计的PCR的引物序列如下：HBG1-T7EI-F1、HBG1-T7EI-R1、IL1RN-T7EI-F1、 IL1RN-T7EI-R1、CCR5-T7EI-F1和CCR5-T7EI-R1的序列如SEQ ID NO:51～56所示。
激活和切割的双系统Cas9-p300的人类胚胎干细胞系的双系统同时激活切割的鉴定：
选择基因MYOD1、HBG1和IL1RNA三个基因激活，CCR5进行切割，针对这些基因的不的向导RNA同时电转入本发明的双系统人类胚胎干细胞中，利用T7EI和RT-PCR进行验证，结果如图15-d所示，结果显示，本发明可以同时进行基因的激活和切割。
本发明的激活和切割的双系统Cas9-p300的人类胚胎干细胞系干性的鉴定和应用：
人类胚胎干细胞具有多能性，它可以发育成为外胚层、中胚层及内胚层三种胚层的细胞组织。本发明的双系统在人类胚胎干细胞中建立，为了证明本系统的细胞系还具有人类胚胎干细胞的干性，进行了人类胚胎干细胞核型分析(如图16)，标记基因OCT4、SOX2、NANOG、 GABRB3、LIN28、REX1、TDGF1和TERT的RT-PCR检测，核心转录因子OCT4和SOX2 的细胞的免疫荧光实验，小鼠皮下畸胎瘤实验及苏木-伊红染色(HE染色)，实验结果显示如图17，结果显示本发明所建立的细胞系，具有人类胚胎干细胞的干性，且这将为我们的系统的应用打开宽阔的大门。
进一步扩展本发明系统广泛的应用性，首先选择胚胎干细胞的核心转录因子OCT4作为靶向基因，已经有大量研究报导证明了转录因子OCT4是维持胚胎干细胞自我更新的核心因子，当缺失OCT4后，胚胎干细胞将向三个胚层分化，设计并合成靶向OCT4基因编码区的长向导RNA(20bp)(具体序列如下文)，用T7EI和细胞免疫荧光检测(图18-a、b)，成功敲除OCT4，结果表明本发明系统成功实现OCT4的敲除，形态上观察到胚胎干细胞不能维持自我更新的能力(图18-c)，向三个胚层分化，用RT-PCT检测三个胚层的一些代表性标记物，包括内胚层的AFP和SOX17，中胚层的BMP4和MIXL1，外胚层的SOX1和N-Cadherin(图 18-d)，结果表明本发明系统成功实现OCT基因的敲除，造成胚胎干细胞失去自我更新能力，出现三个胚层的分化。
本发明可以实现激活应用，胚胎干细胞分化为不同的胚层的细胞时，有不同的标志物，本发明系统可以实现在胚胎干细胞分化的不同阶段实现时时控制不同的标注物的表达，从而促进胚胎干细胞分化，提高分化的效率，为实现此，选择在肺分化的不同的阶段标记基因激活，包括FOXA2、SOX17和NKX2.1，分别设计并合成短的向导RNA(具体序列如下文)，通过电转，转入本发明的胚胎干细胞中上，结果(图19)显示，本发明的系统可以成功激活肺分化不同阶段的基因，在此基础上推广此发明，我们可以将本发明的系统应用于胚胎干细胞分化的不同细胞中，包括心肌细胞、神经细胞，胰腺细胞，肝脏细胞等，更有利于以后的细胞替代治疗、器官移植、神经修复、皮肤损伤修复和基因治疗的载体等应用，进而本发明使胚胎干细胞的临床应用更进一步。
上段中的向导RNA为OCT4-g1-F、OCT4-g1-R、OCT4-g2-F、OCT4-g2-R、SOX17-g1-F、SOX17-g1-R、SOX17-g2-F、SOX17-g2-R、SOX17-g3-F、SOX17-g3-R、SOX17-g4-F、 SOX17-g4-R、FOXA2-g1-F、FOXA2-g1-R、FOXA2-g2-F、FOXA2-g2-R、FOXA2-g3-F、 FOXA2-g3-R、FOXA2-g4-F、FOXA2-g4-R、NKX2.1-g1-F、NKX2.1-g1-R、NKX2.1-g2-F、 NKX2.1-g2-R、NKX2.1-g3-F、NKX2.1-g3-R、NKX2.1-g4-F、NKX2.1-g4-R、MIR145-g1-F、 MIR145-g1-R、MIR145-g2-F、MIR145-g2-R、MIR145-g3-F、MIR145-g3-R、MIR145-g4-F和 MIR145-g4-R，核苷酸系列依次如SEQ ID NO:57～92所示。
此外，本发明还可以应用于MicroRNA中，MicroRNA(miRNA)是一种小的内源性非编码RNA分子，一般由21－25个核苷酸组成。这些小的miRNA通常靶向一个或者多个 mRNA，通过翻译水平的抑制或断裂靶标mRNAs而调节基因的表达，广泛存在于从病毒到人类的各种生物中。这些RNA不仅能够阻断蛋白编码基因的表达，还发现与机体一些疾病关系密切。本发明同时也可以实现微小RNA的激活，从而可以实现胚胎干细胞更宽广的应用，如miR145已经研究与参与胚胎干细胞的自我更新和多能性，设计并合成靶向miR145启动子区的短(14bp)向导RNA(具体序列如下文)，实现miR145的激活，结果如图19所示，这将充分证明，本发明不仅可以实现基因的激活，还可以实现miRRNA的激活，这也扩展了本发明的激活和切割双系统的人类胚胎干细胞的应用。
根据上述说明书的揭示和指导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
序列表
<110> 南方医科大学
<120> 一种可调控基因表达的人类胚胎干细胞系及其应用
<160> 92
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> OLIGO-F人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcgaggtcac caatcctgtc cctagtggaa gcttgtcacc aatcctgtcc ctagtgggc 59
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> OLIGO-R人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggccgcccac tagggacagg attggtgaca agcttccact agggacagga ttggtgacc 59
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> M2rtTA-F人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gatcctctag tcagctgacg cgtggggatc cgctgtaagt ctg 43
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> M2rtTA-R人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gctgcaataa acaagttaac aacaacaatt gttacccggg gagcatgtca 50
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> OlIGO-F2人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgcgtttaac cggtgtcgac gctagct 27
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> OlIGO-R2人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccggagctag cgtcgacacc ggttaaa 27
<210> 7
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> gRNA-F人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcaccaatcc tgtccctagg ttta 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> gRNA-R人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctagggacag gattggtgac ggtg 24
<210> 9
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 5-F人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggttaatgtg gctctggtt 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 5-R人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cttgtactcg gtcatctcg 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 3-F人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgacggttca ctaaacgag 19
<210> 12
<211> 18
<212> DNA/RNA
<213> 3-R人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agaggttctg gcaaggag 18
<210> 13
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> g-IL1RN-RNA-F1人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tctctgaggt gctcgttta 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> g-IL1RN-RNA-R1人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gagcacctca gagacggtg 19
<210> 15
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> g-IL1RN-RNA-F2人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gataagaacc agttgttta 19
<210> 16
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> g-IL1RN-RNA-R2人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aactggttct tatccggtg 19
<210> 17
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> g-IL1RN-RNA-F3人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
agtcagccat cagcgttta 19
<210> 18
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> g-IL1RN-RNA-R3人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gctgatggct gactcggtg 19
<210> 19
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> g-IL1RN-RNA-F4人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
accctcctgg aaacgttta 19
<210> 20
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> g-IL1RN-RNA-R4人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gtttccagga gggtcggtg 19
<210> 21
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> g-HBG1-RNA-F1人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ggatgaagaa taaagttta 19
<210> 22
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> g-HBG1-RNA-R1人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tttattcttc atcccggtg 19
<210> 23
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> g-HBG1-RNA-F2人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
caatagcctt gacagttta 19
<210> 24
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> g-HBG1-RNA-R2人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tgtcaaggct attgcggtg 19
<210> 25
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> g-HBG1-RNA-F3人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
atatctgtct gaaagttta 19
<210> 26
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> g-HBG1-RNA-R3人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tttcagacag atatcggtg 19
<210> 27
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> g-HBG1-RNA-F4人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
agcagtatcc tcttgttta 19
<210> 28
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> g-HBG1-RNA-R4人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
aagaggatac tgctcggtg 19
<210> 29
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> g-Myod1-RNA-F1人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gctccggggc gtttgttta 19
<210> 30
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> g-Myod1-RNA-R1人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
aaacgccccg gagccggtg 19
<210> 31
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> g-Myod1-RNA-F2人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ctgcggccac cccggttta 19
<210> 32
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> g-Myod1-RNA-R2人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cggggtggcc gcagcggtg 19
<210> 33
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> g-Myod1-RNA-F3人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tccctgcccg gtaggttta 19
<210> 34
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> g-Myod1-RNA-R3人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ctaccgggca gggacggtg 19
<210> 35
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> g-Myod1-RNA-F4人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tggaaagggc gtgcgttta 19
<210> 36
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> g-Myod1-RNA-R4人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gcacgccctt tccacggtg 19
<210> 37
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> GAPDH-RT-F人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
agaaggctgg ggctcatttg 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> GAPDH-RT-R人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
aggggccatc cacagtcttc 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> MYOD1-RT-F人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
tccctctttc acggtctcac 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> MYOD1-RT-R人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
aacacccgac tgctgtatcc 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> IL1RN-RT-F人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ggaatccatg gagggaagat 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> IL1RN-RT-R人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
tgttctcgct caggtcagtg 20
<210> 43
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> HBG1-RT-F人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gctgagtgaa ctgcactgtg a 21
<210> 44
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> HBG1-RT-R人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gaattctttg ccgaaatgga 20
<210> 45
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> g-IL1RN-RNA-20-F3人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ttgaccaata gccttgacag ttta 24
<210> 46
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> g-IL1RN-RNA-20-R3人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
tgtcaaggct attggtcaac ggtg 24
<210> 47
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> g-HBG1-RNA-20-F2人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
catcaagtca gccatcagcg ttta 24
<210> 48
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> g-HBG1-RNA-20-R2人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
catcaagtca gccatcagcg ttta 24
<210> 49
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> g-CCR5-RNA-20-F人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
aggttggacc aagctatgcg ttta 24
<210> 50
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> g-CCR5-RNA-20-R人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
gcatagcttg gtccaacctc ggtg 24
<210> 51
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> HBG1-T7EI-F1人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
caggcctcac tggagctaga 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> HBG1-T7EI-R1人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
cagaggcaga ggacaggttg 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> IL1RN-T7EI-F1 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
atggcttcca cgtagtgctc 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> IL1RN-T7EI-R1 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
ctcaccagag cctgaaagca 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> CCR5-T7EI-F1人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
ctggccatct ctgacctgtt 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> CCR5-T7EI-R1人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
gtgcacaact ctgactgggt 20
<210> 57
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> OCT4-g1-F人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
atcttcagga ggtaagggtg ttta 24
<210> 58
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> OCT4-g1-R人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
acccttacct cctgaagatc ggtg 24
<210> 59
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> OCT4-g2-F人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
cttgcaggtg gtccgagtgg ttta 24
<210> 60
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> OCT4-g2-R人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
cactcggacc acctgcaagc ggtg 24
<210> 61
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> SOX17-g1-F人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
gggcctaacg acgcgttta 19
<210> 62
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> SOX17-g1-R人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
gcgtcgttag gccccggtg 19
<210> 63
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> SOX17-g2-F人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
gcaaggggcg ggcggttta 19
<210> 64
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> SOX17-g2-R人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
cgcccgcccc ttgccggtg 19
<210> 65
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> SOX17-g3-F人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
gctagttttc ccgggttta 19
<210> 66
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> SOX17-g3-R人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
ccgggaaaac tagccggtg 19
<210> 67
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> SOX17-g4-F人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
gtacgtcgat tccagttta 19
<210> 68
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> SOX17-g4-R人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
tggaatcgac gtaccggtg 19
<210> 69
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> FOXA2-g1-F人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
gccggcgtgt ttcagttta 19
<210> 70
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> FOXA2-g1-R人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
tgaaacacgc cggccggtg 19
<210> 71
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> FOXA2-g2-F人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
ttaagcagtc cctcgttta 19
<210> 72
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> FOXA2-g2-R人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
gagggactgc ttaacggtg 19
<210> 73
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> FOXA2-g3-F人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
ccatcattga ttccgttta 19
<210> 74
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> FOXA2-g3-R人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
ggaatcaatg atggcggtg 19
<210> 75
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> FOXA2-g4-F人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
tgctgtgggc acctgttta 19
<210> 76
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> FOXA2-g4-R人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
aggtgcccac agcacggtg 19
<210> 77
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> NKX2.1-g1-F人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
gattctctcc ggtagttta 19
<210> 78
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> NKX2.1-g1-R人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
taccggagag aatccggtg 19
<210> 79
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> NKX2.1-g2-F人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
gcccccgcag ctcagttta 19
<210> 80
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> NKX2.1-g2-R人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
tgagctgcgg gggccggtg 19
<210> 81
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> NKX2.1-g3-F人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
gaggcgtgtt agcggttta 19
<210> 82
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> NKX2.1-g3-R人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
cgctaacacg cctccggtg 19
<210> 83
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> NKX2.1-g4-F人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
gatcgactgc ctccgttta 19
<210> 84
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> NKX2.1-g4-R人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
ggaggcagtc gatccggtg 19
<210> 85
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> MIR145-g1-F人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
ctcgccccaa tacggttta 19
<210> 86
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> MIR145-g1-R人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
cgtattgggg cgagcggtg 19
<210> 87
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> MIR145-g2-F人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
gcaaggtagt cacggttta 19
<210> 88
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> MIR145-g2-R人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
cgtgactacc ttgccggtg 19
<210> 89
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> MIR145-g3-F人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
actccttcct tagggttta 19
<210> 90
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> MIR145-g3-R人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
cctaaggaag gagtcggtg 19
<210> 91
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> MIR145-g4-F人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
aagcctgaga aggggttta 19
<210> 92
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> MIR145-g4-R人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
cccttctcag gcttcggtg 19

Claims (10)

1.一种可调控基因表达的人类胚胎干细胞系，其特征在于，包含可控表达外源性融合蛋白系统和至少一种向导RNA，所述可控表达外源性融合蛋白系统包括四环素诱导表达系统和以Cas9蛋白和具有转录激活活性的p300核心结构域构成的融合蛋白；所述向导RNA为靶向基因启动子区的14bp短序列或针对基因组区域的20bp的长序列。
2.根据权利要求1所述的可调控基因表达的人类胚胎干细胞系，其特征在于，所述基因启动子区位于MYOD1、IL1RN、HBG1、FOXA2、SOX17、NKX2.1和miR145。
3.根据权利要求1所述的可调控基因表达的人类胚胎干细胞系，其特征在于，所述基因组区域位于CCR5、IL1RN、HBG1和OCT4。
4.一种供体表达载体，其特征在于，该表达载体用于表达权利要求1所述的可控表达外源性融合蛋白系统。
5.根据权利要求4所述的供体表达载体，其特征在于，其包括以下四个部分：
第一部分，控制系统元件，包括CMV启动子，M2rtTA表达序列，SV40polyA；
第二部分，融和蛋白表达元件，包括TRE启动子，Cas9-p300表达序列，SV40polyA；
第三部分，体内线性化元件，包括位于供体载体两端方向相同的23bp的AAVS1gRNA识别序列；
第四部分，抗性筛选元件，包括T2A，puromycin抗性基因表达序列，bGH polyA。
6.权利要求1所述的可调控基因表达的人类胚胎干细胞系的构建方法，其特征在于，通过CRISPR-CAS9切割基因组AAVS1位点和供体载体两端AAVS1位点，并利用非同源末端直接连接把权利要求4或5所述供体表达载体敲入基因组AAVS1位点。
7.根据权利要求6所述的可控表达外源性融合蛋白系统的构建方法，其特征在于，体内线性化的外源基因无需同源臂直接敲入基因组AAVS1位点上。
8.权利要求1或2或3所述的可调控基因表达的人类胚胎干细胞系在DNA靶向激活/切割中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将可控表达外源性融合蛋白系统敲入人类胚胎干细胞系；
(2)构建表达向导RNA的载体，包括长向导RNA和/或短向导RNA；
(3)加入四环素，诱导步骤(1)所得人类胚胎干细胞系中Cas9-p300表达；
(4)将步骤(2)所得表达向导RNA的载体通过电转转入步骤(1)所得人类胚胎干细胞系，细胞内表达的融合蛋白与向导RNA结合，将Cas9-p300融合蛋白靶向目标基因区，实现基因的激活和/或切割。
10.权利要求1或2或3所述可调控基因表达的人类胚胎干细胞系在人类胚胎干细胞分化中的应用。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110305908A (zh) * 2019-07-12 2019-10-08 南方医科大学 一种高效精准靶向的基因整合系统及其应用
CN110305897A (zh) * 2019-06-05 2019-10-08 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 三基因报告系统及其建立方法和应用
CN113801852A (zh) * 2021-10-18 2021-12-17 齐齐哈尔医学院 一种gpd1l缺失人胚胎干细胞细胞株及其构建方法和应用
CN114276995A (zh) * 2020-09-28 2022-04-05 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达ctla-4阻遏分子的多能干细胞及其衍生物

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105658805A (zh) * 2013-06-05 2016-06-08 杜克大学 Rna指导的基因编辑和基因调节
WO2017180915A2 (en) * 2016-04-13 2017-10-19 Duke University Crispr/cas9-based repressors for silencing gene targets in vivo and methods of use
CN107523588A (zh) * 2017-08-18 2017-12-29 深圳大学 一种四环素慢病毒诱导表达载体及其建立方法和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105658805A (zh) * 2013-06-05 2016-06-08 杜克大学 Rna指导的基因编辑和基因调节
WO2017180915A2 (en) * 2016-04-13 2017-10-19 Duke University Crispr/cas9-based repressors for silencing gene targets in vivo and methods of use
CN107523588A (zh) * 2017-08-18 2017-12-29 深圳大学 一种四环素慢病毒诱导表达载体及其建立方法和应用

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARNAUD PERRIN等: "Increased expression of laminin α-1 chain by dCas9-VP160", 《MOLECULAR THERAPY》 *
CHRISTOPHER A.DE SOLIS等: "The Development of a Viral Mediated CRISPR/Cas9 System with Doxycycline Dependent gRNA Expression for Inducible In vitro and In vivo Genome Editing", 《ORIGINAL RESEARCH ARTICLE》 *
JAMES E DAHLMAN等: "Orthogonal gene knockout and activation with a catalytically active Cas9 nuclease", 《NATURE BIOTECHNOLOGY》 *
JONATHAN H. SHRIMP等: "Chemical Control of a CRISPR-Cas9 Acetyltransferase", 《ACS CHEM.BIOL》 *
JUN LI等: "Gene replacements and insertions in rice by intron targeting using CRISPR–Cas9", 《NATURE PLANTS》 *
RYAN M. GENGA等: "Controlling transcription in human pluripotent stem cells using CRISPR-effector", 《METHODS》 *
SHUFENG MA等: "iKA-CRISPR hESCs for inducible and multiplex orthogonal gene knockout and activation", 《FEBS LETTERS》 *
宋洋: "人细胞中CRISPR/Cas9介导的AAVS1位点可诱导型Cas9表达盒的插入", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)基础科学辑》 *
曲纳等: "利用CRISPR/Cas9建立Nanog-EGFP小鼠胚胎干细胞系及在培养液成分筛选中的应用", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)基础科学辑》 *
莫菲特等: "《滋养层生物学与病理学》", 31 May 2008, 浙江大学出版社 *
谢一方等: "基因编辑技术的原理及其在癌症研究中的应用", 《中国肿瘤生物治疗杂志》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110305897A (zh) * 2019-06-05 2019-10-08 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 三基因报告系统及其建立方法和应用
CN110305897B (zh) * 2019-06-05 2023-03-31 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 三基因报告系统及其建立方法和应用
CN110305908A (zh) * 2019-07-12 2019-10-08 南方医科大学 一种高效精准靶向的基因整合系统及其应用
CN114276995A (zh) * 2020-09-28 2022-04-05 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达ctla-4阻遏分子的多能干细胞及其衍生物
CN113801852A (zh) * 2021-10-18 2021-12-17 齐齐哈尔医学院 一种gpd1l缺失人胚胎干细胞细胞株及其构建方法和应用
CN113801852B (zh) * 2021-10-18 2023-08-18 齐齐哈尔医学院 一种gpd1l缺失人胚胎干细胞细胞株及其构建方法和应用

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