CN110305897A - 三基因报告系统及其建立方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种快速测定基因组编辑活性的三基因报告系统，该报告系统包括三基因报告细胞系和基因编辑系统活性的快速检测体系。所述三基因报告细胞系为在HEK‑293细胞AAVS1位点整合有TK‑Neo‑T2A‑GFP‑Ires‑Puro基因的单克隆HEK‑293‑AAVS‑TK‑Neo‑T2A‑GFP细胞系，TK‑Neo‑T2A‑GFP基因的序列如SEQ ID NO.1所示；所述基因编辑系统活性的快速检测体系为针对三报告基因TK、Neo和GFP基因分别设计单链引导RNA，构建质粒后转染报告细胞系。利用本发明的三基因报告系统可以在体外快速、有效、高通量的对基因组编辑工具的活性进行检测，有助于基因编辑系统的快速筛选和优化，为基因编辑工具的研发提供一个高效的筛选平台。

Description

三基因报告系统及其建立方法和应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种快速测定基因组编辑活性的三基因报告系统及其建立方法和应用。
背景技术
基因组编辑技术是利用核酸酶对基因组进行精确地定点修饰，包括对基因组进行靶向基因敲入(Knock-in)、基因敲除(Knock-out)以及基因替换(Replacement)。CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)-Cas系统的发现和应用为生物学的基础理论研究和转化应用提供了简单而强大的基因组编辑平台，因此迅速成为遗传操作的主流工具，并已成功应用于微生物、植物和动物等生物基因组编辑。由于CRISPR-Cas系统数量庞大，单一的标准难以将其归类。研究者根据Cas基因的组成和干扰靶基因的效应蛋白的数量，将CRISPR-Cas系统分为2大类，共5种型16个亚型。第一大类包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型，它们切割外源核酸需要多个Cas蛋白共同发挥作用；第二大类包括Ⅱ型和Ⅴ型，它们切割外源核酸只需要单一的效应蛋白，如Ⅱ型的Cas9蛋白和Ⅴ型的Cpf1蛋白。随后，研究者又发现了Ⅵ型新系统，对原有的分类进行了补充。2018年，Ⅵ型系统中的新成员——Cas13d(VI-D)被发现。至此CRISPR-Cas系统又可分为2大类，共6种型23个亚型。面对如此多已知和未知种类的CRISPR-Cas系统，如何在体外有效、快速、高通量筛选出候选有活性的基因编辑工具是领域内一直关注的问题。而建立高效的报告系统则有助于基因编辑系统的快速筛选和优化，能为基因编辑工具的研发提供一个有效的筛选平台。
发明内容
本发明要解决目前不能在体外有效、快速、高通量筛选出候选基因编辑工具活性的技术问题，提供一种快速测定基因组编辑活性的三基因报告系统，该三基因报告系统有助于基因编辑系统的快速筛选和优化，为基因编辑工具的研发提供一个有效的筛选平台。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
在本发明的一个方面，提供了一种pDonor-TK-Neo-T2A-GFP-Ires-Puro重组载体，所述重组载体包含tk基因、neo基因、T2A序列、GFP基因，IRES基因和嘌呤霉素抗性基因puro，其中，TK-Neo-T2A-GFP基因的序列如SEQ ID NO.1所示。
所述pDonor-TK-Neo-T2A-GFP-Ires-Puro重组载体构建方法的步骤如下：
1)人工合成T2A基因序列；
2)用PCR和OE-PCR扩增TK-Neo和T2A-GFP-Ires-Puro基因序列，利用In-Fusion克隆到pDonor-mT/mG载体上，得到重组pDonor-TK-Neo-T2A-GFP-Ires-Puro载体。pDonor-mT/mG载体的制备方法见http://www.addgene.org/17787，为已知技术。
本发明还提供了一种CRISPR/Cas9-AAVS1载体，所述载体是在pX330载体上插入针对哺乳动物细胞AAVS1位点的sgRNA序列，sgRNA序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种CRISPR/SaCas9载体，所述载体是在pX601载体上插入针对TK-Neo-T2A-GFP基因中TK、Neo和GFP三个报告基因位点分别设计的sgRNA序列，所述sgRNA序列如SEQ ID NO.3-5所示。
在本发明的另一方面，还提供了一种三基因报告细胞系，所述细胞系基因组上AAVS1位点整合有TK-Neo-T2A-GFP-Ires-Puro基因，其中，TK-Neo-T2A-GFP基因的序列如SEQ ID NO.1所示。在本发明的一具体实施例中，所述三基因报告细胞系是将重组载体pDonor-TK-Neo-T2A-GFP-Ires-Puro和基因编辑载体CRISPR/Cas9-AAVS1共转入HEK-293细胞，获得基因组上AAVS1位点整合有TK-Neo-T2A-GFP-Ires-Puro基因的单克隆HEK-293-AAVS-TK-Neo-T2A-GFP细胞系。
本发明还提供了一种整合有TK-Neo-T2A-GFP-Ires-Puro基因的三基因报告细胞系(单克隆HEK-293-AAVS-TK-Neo-T2A-GFP细胞系)的构建方法，具体步骤如下：
1)HEK-293细胞计数后接种于6孔板，每孔的细胞密度为3.0×105-5.0×105细胞/孔；
2)细胞生长1d后，使用细胞转染试剂将重组载体pDonor-TK-Neo-T2A-GFP-Ires-Puro和基因编辑载体CRISPR/Cas9-AAVS1共转入HEK-293细胞；
3)HEK-293转染1/2d后换液，2d后传代，稀释后接种到10cm培养皿，用1μg/ml浓度的抗生素嘌呤霉素Puromycin筛选；
4)10天后，在显微镜下挑选单克隆细胞，获得整合有TK-Neo和T2A-GFP-Ires-Puro基因的单克隆HEK-293-AAVS-TK-Neo-T2A-GFP细胞系。其中，6孔板中的细胞密度为优选为3.0×105细胞/孔。
在本发明的另一方面，还提供了一种快速测定基因组编辑活性的三基因报告系统，所述报告系统包括三基因报告细胞系和基因编辑系统活性的快速检测体系，所述报告细胞系为整合有TK-Neo-T2A-GFP-Ires-Puro基因的三基因报告细胞系，TK-Neo-T2A-GFP基因的序列如SEQ ID NO.1。其中，所述基因编辑系统活性的快速检测体系可以为CRISPR/SaCas9基因编辑系统。
本发明还提供了一种快速测定基因组编辑活性的三基因报告系统的建立方法，包括三基因报告细胞系的建立和基因编辑系统活性的快速检测体系构建方法，其中，基因编辑系统活性的快速检测体系构建方法是针对三报告基因胸苷激酶基因(TK基因)、新霉素基因(Neo基因)和绿色荧光蛋白基因(GFP基因)分别设计单链引导RNA(sgRNA)，构建质粒后转染报告细胞系。
在本发明一优选实施例中，所述基因编辑系统活性的快速检测体系为CRISPR/SaCas9基因编辑系统活性快速检测体系，其构建方法如下：
1)构建针对TK-Neo-T2A-GFP序列的CRISPR/SaCas9载体，在pX601载体上插入针对TK-Neo-T2A-GFP不同位点的sgRNA序列，sgRNA序列如SEQ ID NO.3-5；
2)HEK-293-AAVS-TK-Neo-T2A-GFP细胞计数后接种于24孔板，每孔的细胞密度为1.0×105细胞/孔；
3)将pX601-sgRNA载体转入HEK-293-AAVS-TK-Neo-T2A-GFP细胞中，1d后在荧光显微镜下观察细胞荧光情况；
4)2d后收集细胞，流式细胞术检测绿色荧光细胞的比率，以此来评估CRISPR/SaCas9基因编辑的效率。
本发明相比于现有技术而言，具有如下优点：本发明建立的快速测定基因组编辑活性的三基因报告系统，能够在体外有效、快速、高通量筛选出候选有活性的基因编辑工具，有助于基因编辑系统的快速筛选和优化，为基因编辑工具的研发提供一个有效的筛选平台。
附图说明
图1为本发明实施例1三基因报告细胞系的建立，其中A图为三基因报告系统定点敲入策略图；B图为三基因报告细胞系PCR鉴定图；C图为细胞荧光结果图；
图2为本发明实施例2的SaCas9基因编辑系统活性快速检测细胞荧光结果图；
图3为本发明实施例2的SaCas9基因编辑系统活性快速检测细胞流式结果图。
具体实施方式
现结合实施例和附图，对本发明做进一步详细的说明。
实施例1三基因报告细胞系的建立
1)构建重组载体pDonor-TK-Neo-T2A-GFP-Ires-Puro，载体包含tk基因、neo基因、T2A序列、GFP基因，IRES基因和嘌呤霉素抗性基因(puro基因)，TK-Neo-T2A-GFP基因的序列如SEQ ID NO.1；
2)构建针对哺乳动物细胞AAVS1位点的CRISPR/Cas9-AAVS1载体，在pX330载体上插入针对AAVS1位点的sgRNA序列，sgRNA序列如SEQ ID NO.2；
3)HEK-293细胞复苏：把冻存HEK-293细胞的管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。等液体都融化后(大概1～1.5min)，拿出来喷点酒精放到超净工作台里；把上述细胞悬液吸到装有5ml培养基的15ml的离心管中，1500rmp，离心5min；倒掉上清液，加1ml培养基把细胞悬浮起来。吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使细胞均匀分布在培养皿中；
标好细胞种类和日期、培养人姓名等，放到5％的CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。完全培养基的配制：DMEM(高糖)+10％FBS(胎牛血清)+1％Pen./Strep.(青霉素100U/ml，链霉素100ug/ml)
4)用胰蛋白酶消化对数生长期的HEK-293细胞，细胞计数后接种于6孔板，调整细胞密度为3.0×105-5.0×105细胞/孔；将重组载体pDonor-TK-Neo-T2A-GFP-Ires-Puro和基因编辑载体pX330-AAVS1共转入HEK-293细胞，转染12h后换液，48h后传代到10cm皿，用1ug/ml浓度的抗生素Puromycin筛选；10天后，在显微镜下挑单克隆细胞，获得基因组上AAVS1位点整合有TK-Neo-T2A-GFP-Ires-Puro基因的单克隆HEK-293-AAVS-TK-Neo-T2A-GFP细胞系，如图1所示。
5)单克隆HEK-293-AAVS-TK-Neo-T2A-GFP细胞扩大培养，该克隆中TK-Neo-T2A-GFP基因的拷贝数经过qPCR检测，确定为单拷贝。
实施例2基因编辑系统活性的快速检测(以CRISPR/SaCas9为例)体系构建
1)构建针对TK-Neo-T2A-GFP序列的CRISPR/SaCas9载体，在pX601载体上插入针对TK-Neo-T2A-GFP不同位点的sgRNA序列，命名为sgRNA_1/sgRNA_2/sgRNA_3，sgRNA序列如SEQ ID NO.3-5；
2)用胰蛋白酶消化对数生长期的HEK-293-AAVS-TK-Neo-T2A-GFP细胞计数后接种于12孔板，调整细胞密度为1.0×105细胞/孔，37℃，5％CO2培养箱内培养；
3)24h后，将pX601-sgRNA载体转入HEK-293-AAVS-TK-Neo-T2A-GFP细胞中，1d后在荧光显微镜下观察细胞荧光情况，相比于对照组，sgRNA_1/2/3三组中部分细胞绿色荧光蛋白失活，说明绿色荧光可以作为此系统的报告基因来评估CRISPR/SaCas9基因编辑的效率(图2)；
4)2d后收集细胞，流式细胞术检测绿色荧光细胞的比率，流式数据统计后可以看到sgRNA_1/2/3的基因敲除效率均在达到30％左右，此结果进一步验证了上述细胞荧光结果，说明此系统可以用来评估CRISPR/SaCas9基因编辑的效率(图3)。
序列表
<110> 中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）
<120> 三基因报告系统及其建立方法和应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2577
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<400> 1
atgcccacgc tactgcgggt ttatatagac ggtccccacg ggatggggaa aaccaccacc 60
acgcaactgc tggtggccct gggttcgcgc gacgatatcg tctacgtacc cgagccgatg 120
acttactggc gggtgctggg ggcttccgag acaatcgcga acatctacac cacacaacac 180
cgcctcgacc agggtgagat atcggccggg gacgcggcgg tggtaatgac aagcgcccag 240
ataacaatgg gcatgcctta tgccgtgacc gacgccgttc tggctcctca tatcgggggg 300
gaggctggga gctcacatgc cccgcccccg gccctcaccc tcatcttcga ccgccatccc 360
atcgccgccc tcctgtgcta cccggccgcg cggtacctta tgggcagcat gaccccccag 420
gccgtgctgg cgttcgtggc cctcatcccg ccgaccttgc ccggcaccaa catcgtgctt 480
ggggcccttc cggaggacag acacatcgac cgcctggcca aacgccagcg ccccggcgag 540
cggctggacc tggctatgct ggctgcgatt cgccgcgttt acgggctact tgccaatacg 600
gtgcggtatc tgcagtgcgg cgggtcgtgg cgggaggact ggggacagct ttcggggacg 660
gccgtgccgc cccagggtgc cgagccccag agcaacgcgg gcccacgacc ccatatcggg 720
gacacgttat ttaccctgtt tcgggccccc gagttgctgg cccccaacgg cgacctgtat 780
aacgtgtttg cctgggcctt ggacgtcttg gccaaacgcc tccgttccat gcacgtcttt 840
atcctggatt acgaccaatc gcccgccggc tgccgggacg ccctgctgca acttacctcc 900
gggatggtcc agacccacgt caccaccccc ggctccatac cgacgatatg cgacctggcg 960
cgcacgtttg cccgggagat gggatcggcc attgaacaag atggattgca cgcaggttct 1020
ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac aatcggctgc 1080
tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc 1140
gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc 1200
acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg 1260
ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag 1320
aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc 1380
ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt 1440
cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc 1500
gccaggctca aggcgcgcat gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc 1560
tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg 1620
ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag 1680
cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg 1740
cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttcg gctccggcga gggcagggga 1800
agtcttctaa catgcgggga cgtggaggaa aatcccggcc cagtgagcaa gggcgaggag 1860
ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag 1920
ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc 1980
atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac 2040
ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc 2100
gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac 2160
aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag 2220
ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta caactacaac 2280
agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag 2340
atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca gcagaacacc 2400
cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc 2460
ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc 2520
gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagtccg gactcagatc tcgataa 2577
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<400> 2
tcaccaatcc tgtccctag 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<400> 3
ggattcatcg actgtggccg g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<400> 4
gcacgcaggt tctccggccg c 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<400> 5
accacgcaac tgctggtggc c 21

Claims (10)

1.一种pDonor-TK-Neo-T2A-GFP-Ires-Puro重组载体，包含tk基因、neo基因、T2A序列、GFP基因，IRES基因和嘌呤霉素抗性基因puro，其中，TK-Neo-T2A-GFP基因的序列如SEQ IDNO.1所示。
2.权利要求1所述重组载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法的步骤如下：
1)人工合成T2A基因序列；
2)用PCR和OE-PCR扩增TK-Neo和T2A-GFP-Ires-Puro基因序列，利用In-Fusion克隆到pDonor-mT/mG载体上，得到重组pDonor-TK-Neo-T2A-GFP-Ires-Puro载体。
3.一种CRISPR/Cas9-AAVS1载体，其为pX330载体上插入针对哺乳动物细胞AAVS1位点的sgRNA序列，sgRNA序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种CRISPR/SaCas9载体，其为pX601载体上插入针对权利要求1所述TK-Neo-T2A-GFP基因中TK、Neo和GFP三个报告基因位点分别设计的sgRNA序列，所述sgRNA序列如SEQ IDNO.3-5所示。
5.一种三基因报告细胞系，所述细胞系基因组上AAVS1位点整合有TK-Neo-T2A-GFP-Ires-Puro基因，其中，TK-Neo-T2A-GFP基因的序列如SEQ ID NO.1所示。
6.权利要求5所述细胞系的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)HEK-293细胞计数后接种于6孔板；
2)使用细胞转染试剂将权利要求1和3中所述重组载体共转入HEK-293细胞；
3)HEK-293转染后换液、传代，用抗生素嘌呤霉素Puromycin筛选；
4)若干天后，在显微镜下挑选单克隆细胞，获得整合有TK-Neo和T2A-GFP-Ires-Puro基因的单克隆HEK-293-AAVS-TK-Neo-T2A-GFP细胞系，即为三基因报告细胞系。
7.一种快速测定基因组编辑活性的三基因报告系统，所述报告系统包括权利要求5所述的细胞系和基因编辑系统活性的快速检测体系。
8.根据权利要求7所述的三基因报告系统，其特征在于，所述基因编辑系统活性的快速检测体系为CRISPR/SaCas9基因编辑系统。
9.一种快速测定基因组编辑活性的三基因报告系统的建立方法，其特征在于，包括权利要求6所述的构建方法和基因编辑系统活性的快速检测体系构建方法，其中，基因编辑系统活性的快速检测体系构建方法是针对三报告基因胸苷激酶基因TK、新霉素基因Neo和绿色荧光蛋白基因GFP分别设计sgRNA，构建质粒后转染报告细胞系。
10.根据权利要求9所述的三基因报告系统的建立方法，其特征在于，所述基因编辑系统活性的快速检测体系构建方法包括如下步骤：
1)构建针对TK-Neo-T2A-GFP序列的CRISPR/SaCas9载体，在pX601载体上插入针对TK-Neo-T2A-GFP不同位点的sgRNA序列，sgRNA序列如SEQ ID NO.3-5；
2)HEK-293-AAVS-TK-Neo-T2A-GFP细胞计数后接种于24孔板；
3)将pX601-sgRNA载体转入HEK-293-AAVS-TK-Neo-T2A-GFP细胞中，在荧光显微镜下观察细胞荧光情况；
4)收集细胞，流式细胞术检测绿色荧光细胞的比率，以评估CRISPR/SaCas9基因编辑的效率。
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