JP5999602B2 - 遺伝子ターゲティングベクター、その作製方法及び利用方法 - Google Patents
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Description
(2)標的部位の5’上流領域と相同なDNA断片がスプライスアクセプター部位を含む(1)記載の方法。
(3)標的部位の3’下流領域と相同なDNA断片又は標的部位の5’上流領域と相同なDNA断片がリニア化部位を含む(1)又は(2)の方法。
(4)バイシストロン性発現を可能にするDNA配列が選択用マーカーの5’上流に存在することを特徴とする遺伝子ターゲティングベクター。
(5)選択用マーカーがポリA配列を持つが、プロモーターを持たない(4)のベタクー。
(6)選択用マーカーが部位特異的組換え酵素の標的配列で挟まれている(4)又は(5)のベクター。
(7)さらにスプライスアクセプター部位が導入されている(4)〜(6)のいずれかに記載のベクター。
(8)さらにリニア化部位が導入されている(4)〜(7)のいずれかに記載のベクター。
(9)(4)〜(8)のいずれかに記載の遺伝子ターゲティングベクターを用いて、細胞に遺伝子変異を導入することを含む、遺伝子ノックアウト細胞を作製する方法。
(10)遺伝子ターゲティングベクターを作製するために使用する選択用マーカーを含んでいるベクターであって、選択用マーカーの5'上流にバイシストロン性発現を可能にするDNA配列が組み込まれている前記ベクター。
(11)さらにスプライスアクセプター部位が導入されている(10)記載のベクター。
(12)遺伝子ターゲティングベクターを作製するために使用する選択用マーカーを含んでいるベクターであって、標的部位の5’上流領域と相同なDNA断片と標的部位の3’下流領域と相同なDNA断片を組み込むための部位、および、リニア化部位が組み込まれている前記ベクター。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2011‐118564の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
5'アーム増幅用のリバースプライマーは、標的遺伝子のエクソン上に設計しておくとよい。これにより、標的遺伝子上において上流のエクソンから選択用マーカー遺伝子(が挿入されたエクソン)へのナチュラルなスプライシングを可能にするSA部位(splice acceptor site:スプライスアクセプター部位)を5'アーム中に含めることができる。SA部位は、標的遺伝子のSA配列に限定されるわけではなく、他のSA部位を用いてもよい。
(材料及び方法)
ターゲティングベクターの構築
準備するもの
1. ExTaqTM ポリメラーゼ(タカラバイオ)
2. PCRプライマー: HPRT遺伝子の増幅を例にとる。
5'アーム増幅用
(1) HPRT 5'Fw, 5’- GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGCACATCACAGGTACCATATCAGTG -3’(配列番号1);
(2) HPRT 5'Rv (エクソン上に設定する), 5’- GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGCACATCTCGAGCAAGACGTTCAGT -3’(配列番号2);
3'アーム用
(3) HPRT 3'Fw, 5’- GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGCCTGCAGGATCACATTGTAGCCCTCTGTGTGC -3’ (配列番号3);
(4) HPRT 3'Rv (リニア化部位となるI-SceIサイトを付加しておく), 5’- GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGCTATATTACCCTGTTATCCCTAGCGTAACTCAGGGTAGAAATGCTACTTCAGGC -3’ (配列番号4)
3. MultiSite Gateway(登録商標) Three Fragment Vector Construction Kit(Invitrogen)
4. 薬剤耐性遺伝子が組み込まれたエントリークローン(pENTR IRES-Hyg)
pENTR IRES-Hygは、pENTR loxPプラスミド(Iiizumi, S, Nomura, Y, So, S, et al. (2006) Simple one-week method to construct gene-targeting vectors: application to production of human knockout cell lines. Biotechniques 41: 311-316)をNotIで消化した後、lox71, IRES, Hyg, pA, loxPを順次付加して作製した。lox71とloxPは合成リンカーDNAを用いて付加した。IRESとpAはpIRESベクター(タカラバイオ;http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.asp?unitid=U100004407)に由来する。HygはpENTR lox-Hyg(Iiizumi, S, Nomura, Y, So, S, et al. (2006) Simple one-week method to construct gene-targeting vectors: application to production of human knockout cell lines. Biotechniques 41: 311-316)に由来する。
5. デスティネーションベクター (pDEST R4-R3) (Invitrogen)
6. 抗生物質含有LB寒天培地:50 μg/mlカナマイシンまたは50 μg/mlアンピシリンを含むLB寒天培地
1. Nalm-6細胞(Adachi, N, So, S, Iiizumi, S, et al. (2006) The human pre-B cell line Nalm-6 is highly proficient in gene targeting by homologous recombination. DNA Cell Biol. 25: 19-24)より調製したゲノムDNAを鋳型として下記の条件でPCRを行い,att配列で挟まれたHPRTゲノム断片を取得した。5’アームの増幅にはプライマー(1)と(2)を、3’アームの増幅にはプライマー(3)と(4)を使用した。
3. BP組換え反応により、5’-エントリークローンおよび3’-エントリークローンを作製した(図2A)。下記のサンプルを0.5 mlチューブ内で混合した。
pDONR P4-P1R または pDONR P2R-P3 50 fmoles
PCRで増幅した5’-アームまたは3’-アーム 50 fmoles
全量 4 μl(TE溶液であわせる)
4. 1 μlのBPクロナーゼ II酵素ミックスを上記反応液に加え、よく混合した。
5. 25℃で4〜5時間インキュベートした。
6. 1 μlの2 μg/μl プロテイナーゼKを加え、よく混合した。
7. 37℃で10分インキュベートした。
8. 5 μlの反応液を50 μlの大腸菌コンピテントセルと混和し、形質転換を行った。回復培養後、組換え体を50 μg/ml カナマイシンを含むLB寒天培地に播いた。
9. カナマイシン耐性コロニーを10〜20個単離し、アルカリSDS法でプラスミドDNAを抽出した。アガロースゲル電気泳動により、目的のプラスミドと予想されるクローンを2〜3個選んだ。これらの候補プラスミドを適当な制限酵素で消化したのち、アガロースゲル電気泳動を行い、目的のプラスミドであることを確認した。
10. 得られた 5’、 3’ 各エントリークローンを市販のキットで精製し、定量した。
11. LR組換え反応により、ターゲティングベクター(pHPRT-IRES-Hyg)を作製した(図2B)。各サンプルを下記のとおりに0.5 mlチューブ内で混合した。
pDEST R4-R3 20 fmoles
5’-エントリークローン 10 fmoles
3’-エントリークローン 10 fmoles
pENTR IRES-Hyg 10 fmoles
全量 4 μl(TE溶液であわせる)
12. 1 μlのLRクロナーゼプラス酵素ミックスを上記反応液に加え、よく混合した。
13. 25℃で16時間インキュベートした。
14. 2 μlの2 μg/μl プロテイナーゼKを加え、よく混合した。
15. 37℃で10分インキュベートした。
16. 5 μlの反応液を50 μlの大腸菌コンピテントセルと混和し、形質転換を行った。回復培養後、組換え体を50 μg/ml アンピシリンを含むLB寒天培地に播いた。
17. アンピシリン耐性コロニーを10〜20個単離し、アルカリSDS法でプラスミドDNAを抽出した。アガロースゲル電気泳動により、目的のプラスミドと予想されるクローンを2〜3個選んだ。これらの候補プラスミドを適当な制限酵素で消化したのち、アガロースゲル電気泳動を行い、目的のプラスミド(すなわちターゲティングベクター)であることを確認した。
18. ターゲティングベクターをキットで精製し、定量した。
準備するもの
1. 制限酵素 I-SceI、10x I-SceI反応バッファー、10 mg/ml BSA(New England Biolabs)
2. PCI:TE飽和フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコールを25:24:1の割合で混合したもの(4℃保存)
3. CI:クロロホルムとイソアミルアルコールを24:1の割合で混合したもの(4℃保存)
4. 3 M 酢酸ナトリウム:酢酸ナトリウム 40.81 gを純水80 mlに溶かしたのち、酢酸でpHを5.2に合わせ、全量を100 mlとしたもの
5. TE溶液:10 mM トリス塩酸緩衝液(pH 8.0)、0.1 mM EDTA (pH 8.0)(4℃保存)
1. ターゲティングベクターを制限酵素 I-SceI で消化した。各試薬を下記のとおりに混合し、37℃で4時間以上インキュベートした。
10x I-SceI バッファー 40 μl
100x BSA (10 mg/ml) 4 μl
I-SceI 15 ユニット
全量 400 μl(滅菌水であわせる)
2. 40 μlの3 M酢酸ナトリウムと0.9 mlのエタノールを加え、よく混合した。
3. 15,000 rpmで5分遠心した。
4. 0.5 mlの70%エタノールで3回洗浄した。
5. 3回目の遠心後、クリーンベンチ内で滅菌済みチップを使って上清を除去し、風乾した。
6. TE溶液を加え、DNAを溶解した(DNA濃度が2〜4 μg/μlとなるようにした)。
7. 65℃で15分インキュベートした。
準備するもの
1. 増殖培地:ES培地(日水製薬)に10% 仔ウシ血清(HyClone)と50 μM 2-メルカプトエタノールを加えたもの。湯浴で37℃に保温しておく。
2. 直鎖化したターゲティングベクター
3. Cell Line Nucleofector Kit T(Lonza)
1. 対数増殖期にあるヒトNalm-6細胞(2×106個以上)を50 ml遠心チューブに回収した。
2. 1,100 rpmで5分遠心し、上清を静かに除いた。
3. 細胞塊にSolution Tを100 μl加え、よく懸濁した。
4. ターゲティングベクターを2 μg加え、よく混和したのち、付属のスポイトを使って全量をキュベットに移した。
5. キュベットをエレクトロポレーション装置(Nucleofector II, Lonza)にセットした。
6. プログラムC-005を実行した。
7. 全量をただちに増殖培地6 mlの入った60 mmディッシュに移した。
8. 37℃で20〜24時間培養した。
準備するもの
1. 2.25×ES培地:下記のとおりに各試薬を順次純水に溶かし、室温でよく撹拌したのち、ろ過滅菌したもの(4℃保存)
粉末ES培地 21.8 g
炭酸水素ナトリウム 4.7 g
L-グルタミン 0.68 g
2-メルカプトエタノール 8.1 μl
全量 1000 ml(純水であわせる)
2. 仔ウシ血清(HyClone)
3. 0.33% アガロース溶液:LEアガロース(Lonza)0.33 gに純水100 mlを加え、オートクレーブ滅菌する。滅菌後、アガロースが固まらないうちに均一にまぜ、40℃の湯浴で保温しておく。
4. 選択薬剤(100 mg/ml ハイグロマイシンB):1 gのハイグロマイシンBを純水10 mlに溶かし、ろ過滅菌したもの(4℃保存)
1. 2×ES培地(2.25×ES培地にその1/4量の仔ウシ血清を加えたもの)を調製し、40℃に保温しておいた。
2. アガロース培地を調製(2×ES培地に等量の0.33 %アガロース溶液を加え、激しく撹拌)したのち、使用直前まで40℃に保温しておいた。
3. 遺伝子導入後の細胞を1 mlずつ90 mmディッシュに分注した。
4. 各ディッシュに40 μlの選択薬剤(100 mg/ml ハイグロマイシン)を加えた。細胞に直接触れないようにした。
5. 40℃に保温しておいたアガロース培地9 mlを各ディッシュに加え、よく混合した。
6. 室温で20〜30分間静置し、アガロースを固化させた。
7. 37℃で2〜3週間培養し、コロニー形成を行った。
準備するもの
1. 選択培地(ハイグロマイシンB含有培地):増殖培地にハイグロマイシンBを0.4 mg/mlとなるよう加えたもの
2. 溶解バッファー:20 mM トリス塩酸緩衝液(pH 8.0)、250 mM 塩化ナトリウム、1% SDS
3. 10 mg/ml プロテイナーゼK:100 mgのプロテイナーゼKを純水10 mlに溶かし、ろ過滅菌したもの(-20℃保存)
4. 飽和NaCl溶液
5. ExTaqTM ポリメラーゼ
6. PCRプライマー: (遺伝子ターゲティングの確認用; Iiizumi et al. Nucleic Acids Res. 2008 Nov;36(19):6333-6342.)
HPRT-F, 5'-TGAGGGCAAAGGATGTGTTACGTG-3' (配列番号5)
HPRT-R, 5'-TTGATGTAATCCAGCAGGTCAGCA-3' (配列番号6)
1. 選択培地を0.5 mlずつ48ウェルプレートに分注した。
2. 50〜200個のコロニーを、イエローチップもしくはブルーチップを使って拾い、よくピペッティングしながら選択培地に移した。
3. 37℃で2〜3日培養した。
4. 各培養液を1.5 mlチューブへ移し、3,000〜3,500 rpmで5〜10分遠心し、細胞を回収した。
5. 上清を除去したのち、270 μlの溶解バッファーと1 μlの10 mg/mlプロテイナーゼKを加えた。
6. 37℃で一晩(または55℃で1時間)インキュベートした。
7. 80 μlの飽和NaCl溶液を加え、よく混合した。
8. さらに0.9 mlのエタノールを加え、よく混合した。
9. 15,000 rpm、4℃で15分遠心を行った。
10. 沈殿を除き、0.5 mlの70%エタノールで洗浄した。
11. 沈殿を30〜100 μlのTE溶液に溶解させた。
12. 調製したゲノムDNAを鋳型として、プライマーHPRT-FとHPRT-Rを用いて下記の反応条件でPCRを行い、ターゲットクローンをスクリーニングした。
結果を下記の表にまとめる。
結果を下記の表にまとめる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
配列番号1は、ヒトHPRT遺伝子を標的とする5’アーム増幅用のフォワードプライマーのDNA配列を示す。
5’- GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGCACATCACAGGTACCATATCAGTG -3’
(下線部はattB4配列である)
<配列番号2>
配列番号2は、ヒトHPRT遺伝子を標的とする5’アーム増幅用のリバースプライマーのDNA配列を示す。
5’- GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGCACATCTCGAGCAAGACGTTCAGT -3’
(下線部はattB1配列である)
<配列番号3>
配列番号3は、ヒトHPRT遺伝子を標的とする3’アーム増幅用のフォワードプライマーのDNA配列を示す。
5’- GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGCCTGCAGGATCACATTGTAGCCCTCTGTGTGC -3’
(下線部はattB2配列である)
<配列番号4>
配列番号4は、ヒトHPRT遺伝子を標的とする3’アーム増幅用のリバースプライマーのDNA配列を示す。
5’- GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGCTATATTACCCTGTTATCCCTAGCGTAACTCAGGGTAGAAATGCTACTTCAGGC -3’
(下線部はattB3配列である)
<配列番号5>
配列番号5は、遺伝子ターゲティングの確認用のPCRプライマー(HPRT-F)のDNA配列を示す。
HPRT-F, 5'-TGAGGGCAAAGGATGTGTTACGTG-3'
<配列番号6>
配列番号6は、遺伝子ターゲティングの確認用のPCRプライマー(HPRT-R)のDNA配列を示す。
HPRT-R, 5'-TTGATGTAATCCAGCAGGTCAGCA-3'
Claims (14)
- 標的部位の5’上流領域と相同なDNA断片、バイシストロン性発現を可能にするDNA配列が5’上流に存在する選択用マーカー及び標的部位の3’下流領域と相同なDNA断片を連結することを含む、遺伝子ターゲティングベクターを作製する方法であって、選択用マーカーはそのマーカー独自のプロモーターを持たないが、標的遺伝子とのバイシストロン性発現により発現がオンになり、バイシストロン性発現を可能にするDNA配列が、IRES、IRES2及び2Aペプチド配列からなる群より選択される少なくとも1つである前記方法。
- 標的部位の5’上流領域と相同なDNA断片がスプライスアクセプター部位を含む請求項1記載の方法。
- 標的部位の3’下流領域と相同なDNA断片又は標的部位の5’上流領域と相同なDNA断片がリニア化部位を含む請求項1又は2記載の方法。
- バイシストロン性発現を可能にするDNA配列が選択用マーカーの5’上流に存在することを特徴とする遺伝子ターゲティングベクターであって、選択用マーカーはそのマーカー独自のプロモーターを持たないが、標的遺伝子とのバイシストロン性発現により発現がオンになり、バイシストロン性発現を可能にするDNA配列が、IRES、IRES2及び2Aペプチド配列からなる群より選択される少なくとも1つである前記ベクター。
- 選択用マーカーがポリA配列を持つが、プロモーターを持たない請求項4記載のベクター。
- 選択用マーカーが部位特異的組換え酵素の標的配列で挟まれている請求項4又は5記載のベクター。
- さらにスプライスアクセプター部位が導入されている請求項4〜6のいずれかに記載のベクター。
- さらにリニア化部位が導入されている請求項4〜7のいずれかに記載のベクター。
- 請求項4〜8のいずれかに記載の遺伝子ターゲティングベクターを用いて、細胞に遺伝子変異を導入することを含む、遺伝子ノックアウト細胞を作製する方法(in vivoのヒトでの方法を除外する)。
- 遺伝子ターゲティングベクターを作製するために使用する選択用マーカーを含んでいるベクターであって、選択用マーカーの5'上流にバイシストロン性発現を可能にするDNA配列が組み込まれ、かつ、選択用マーカーはそのマーカー独自のプロモーターを持たず、バイシストロン性発現を可能にするDNA配列が、IRES、IRES2及び2Aペプチド配列からなる群より選択される少なくとも1つである前記ベクター。
- さらにスプライスアクセプター部位が導入されている請求項10記載のベクター。
- 選択用マーカーが、ピューロマイシン耐性遺伝子及び/又はハイグロマイシン耐性遺伝子であり、バイシストロン性発現を可能にするDNA配列が、IRES配列及び/又は2Aペプチド配列である請求項1記載の方法。
- 選択用マーカーが、ピューロマイシン耐性遺伝子及び/又はハイグロマイシン耐性遺伝子であり、バイシストロン性発現を可能にするDNA配列が、IRES配列及び/又は2Aペプチド配列である請求項4記載のベクター。
- 請求項13記載の遺伝子ターゲティングベクターを用いて、細胞に遺伝子変異を導入することを含む、遺伝子ノックアウト細胞を作製する方法(in vivoのヒトでの方法を除外する)。
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