FR2832726A1 - Vecteur de recombinaison homologue, preparations et utilisations - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne des compositions et méthodes pour la modification de gènes dans des cellules, et leurs utilisations. Elle concerne notamment des vecteurs comprenant a) une cassette encadrée par des séquences homologues à un gène cible ou par des sites de clonage destinés à l'insertion desdites séquences homologues, ladite cassette comprenant en 5' une unité bicistronique comprenant un gène de sélection positive et un gène marqueur liés fonctionnellement par un élément IRES, lesdits gênes étant dépourvus de promoteur, en aval de ladite unité bicistronique, une unité comprenant un gène de sélection négative lié à un promoteur et dont l'orientation transcriptlonnelle est identique ou opposée à celle de l'unité bicistronique, et, des sites de recombinaison site-spécifique encadrant l'unité bicistronique et l'unité comprenant le gène de sélection négative lié à un promoteur, et b), un gène toxique situé en aval de ladite cassette et pourvu d'un promoteur.

Description

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VECTEUR DE RECOMBINAISON HOMOLOGUE, PREPARATIONS ET
UTILISATIONS.

La présente invention concerne des compositions et méthodes pour la modification de gènes dans des cellules, et leurs utilisations. Elle concerne notamment des vecteurs, constructions génétiques, cellules et méthodes pour l'inactivation sélective de gènes par recombinaison homologue. Les vecteurs selon l'invention sont préférentiellement caractérisés par la présence a) d'une cassette encadrée par des séquences homologues à un gène cible ou par des sites de clonage destinés à l'insertion desdites séquences homologues, ladite cassette comprenant en 5'une unité bicistronique comprenant un gène de sélection positive et un gène marqueur liés fonctionnellement par un élément IRES lesdits gènes étant dépourvus de promoteur, en aval de ladite unité bicistronique, une unité comprenant un gène de sélection négative lié à un promoteur et dont l'orientation transcriptionnelle est identique ou opposée à celle de l'unité bicistronique, et, des sites de recombinaison site-spécifique encadrant l'unité bicistronique et l'unité comprenant le gène de sélection négative lié à un promoteur, et b), d'un gène toxique situé en aval de ladite cassette et de la séquence homologue 3' (ou du site de clonage correspondant), et pourvu d'un promoteur.

L'invention concerne par ailleurs l'utilisation des vecteurs définis ci-dessus pour provoquer des mutations et/ou invalider des gènes spécifiques dans des cellules ou dans des lignées ou populations cellulaires, notamment humaines, par recombinaison homologue in vitro ou ex vivo. L'invention permet ainsi de créer, à façon, des lignées ou populations cellulaires dans lesquelles un ou plusieurs gènes choisis ont été inactivés. L'invention couvre également un procédé d'inactivation ou de modification sélective de gènes, ainsi que les cellules, lignées ou populations cellulaires obtenues suite à la mise en oeuvre de ce procédé et leurs utilisations. L'invention peut être utilisée dans les domaines de la recherche, du criblage, pour la réalisation d'études ou encore dans le domaine thérapeutique

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ou vaccinal, pour la préparation de cellules destinées à être injectées.

La possibilité d'inactiver ou de modifier sélectivement un gène dans une cellule offre de nombreuses applications. En effet, cela permet d'étudier la fonction du gène inactivé, par exemple en étudiant le phénotype des cellules modifiées. Cela permet de rechercher des partenaires d'un gène, d'étudier l'expression d'un gène, ou de réduire par exemple la toxicité ou les propriétés indésirables liées à l'expression d'un (ou plusieurs) gènes. Dans le domaine thérapeutique (ou vaccinal), de nombreuses approches de thérapie cellulaire basées sur la préparation ex vivo de populations cellulaires ont été décrites. La présente invention peut être utilisée pour inactiver ou altérer un ou plusieurs gènes déterminés dans des cellules, dans le but de (ré) injecter ces cellules à un patient.

La mise à disposition de méthodologies et d'outils efficaces pour l'inactivation ou la modification sélective de gènes dans des cellules pourrait donc permettre de développer ces approches.

A cet égard, des méthodes d'enrichissement génétique basées sur la recombinaison homologue ont récemment été mises au point. Ces méthodes reposent sur l'utilisation de régions homologues à un gène cible, pour permettre son inactivation sélective in situ par double recombinaison homologue. Certaines de ces méthodes permettent de réduire le nombre de recombinaisons qui pourraient survenir au niveau de loci incorrects (non homologues) grâce à l'utilisation d'un gène de sélection négative situé au niveau des parties flanquantes du vecteur de ciblage. Les parties flanquantes sont les régions qui présentent une homologie avec la cible chromosomique et permettent ainsi la recombinaison homologue. Dans un tel vecteur les régions flanquantes 5'et 3'encadrent une région centrale au niveau de laquelle se situe le gène de sélection positive. Les gènes de sélection sont des unités d'expression indépendantes qui possèdent leurs propres promoteurs et leurs propres sites de polyadénylation.

D'autres méthodes permettent d'identifier les recombinaisons survenues au niveau du locus homologue au moyen de vecteurs dont le gène de sélection positif

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ne possède pas son propre promoteur et ne s'exprime, après la recombinaison homologue, que grâce au promoteur du gène cible. Dans une telle méthode des événements de recombinaison non homologues peuvent néanmoins se produire lorsque le vecteur s'intègre près d'un promoteur chromosomique qui permet une expression suffisamment forte pour générer un clone drogue résistant.

Un objectif de la présente invention est de pallier aux inconvénients des techniques de l'art antérieur et de fournir des méthodes et outils pour l'inactivation sélective et efficace de gènes in situ. Un objectif particulier de l'invention est d'éviter la formation de recombinants non homologues grâce à la combinaison au sein des vecteurs de l'invention, de différentes cassettes d'expression dont l'action combinée s'avère particulièrement efficace.

A cet égard, un premier objet de l'invention réside dans un vecteur comprenant : a) une cassette encadrée par des séquences homologues à un gène cible ou par des sites de clonage destinés à l'insertion desdites séquences homologues, ladite cassette comprenant : en 5', une unité bicistronique comprenant un gène de sélection positive et un gène marqueur liés fonctionnellement par un élément IRES, lesdits gènes étant dépourvus de promoteur, - en aval de ladite unité bicistronique, une unité comprenant un gène de sélection négative lié à un premier promoteur, dont l'orientation transcriptionnelle est identique ou opposée à celle de l'unité bicistronique, et des sites de recombinaison site-spécifique encadrant l'unité bicistronique et l'unité comprenant le gène de sélection négative, et b) un gène toxique situé en aval de la cassette a) et pourvu d'un second promoteur.

Le vecteur de recombinaison selon l'invention permet avantageusement d'éviter les événements de recombinaison non homologues et conduit à un enrichissement génétique supérieur à celui obtenu jusqu'ici par les méthodes

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classiques. Le vecteur est typiquement un plasmide, même si d'autres formes de réalisation peuvent être envisagées (épisome, chromosome artificiel, vecteur viral, etc.).

Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un vecteur tel que défini ciavant pour inactiver ou altérer (e. g., provoquer une ou plusieurs mutation (s) ponctuelle (s) et/ou altération (s) chromosomique (s) spécifique (s) et/ou délétion (s)) in vitro ou ex vivo, par recombinaison homologue, un (ou plusieurs) gène cible dans une cellule, une lignée ou une population cellulaire.

Un autre objet de l'invention concerne également un procédé d'inactivation ou d'altération d'un gène cible dans une cellule, une lignée ou une population cellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend a) l'introduction à l'intérieur de ladite cellule, lignée ou population cellulaire d'un vecteur tel que défini ci-avant et b) la sélection des cellules dans lesquelles le gène de sélection positive et/ou le gène marqueur s'expriment, lesdites cellules présentant ledit gène cible inactivé ou altéré.

D'autres aspects de l'invention concernent les cellules génétiquement modifiées telles qu'obtenues par la mise en oeuvre du procédé décrit ci-dessus, et leurs utilisations, par exemple en criblage, pour l'étude de la fonction de gènes ou de protéines, ou pour la préparation de médicaments de thérapie cellulaire.

Description du vecteur Comme indiqué, l'invention décrit de nouvelles constructions génétiques permettant l'inactivation ou l'altération spécifique de gènes in situ. Les constructions de l'invention sont notamment des vecteurs regroupant plusieurs régions fonctionnelles assurant une grande efficacité et une sélectivité accrue.

Les vecteurs selon l'invention comprennent ainsi une cassette d'expression a), destinée à s'insérer en tout ou partie, au moins temporairement, dans le génome

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de l'hôte cellulaire, et une unité supplémentaire d'expression b) d'un gène toxique, dont la description est réalisée ci-dessous : La cassette d'expression a) comprend plus particulièrement les éléments suivants : - en 5', une unité bicistronique comprenant un gène de sélection positive et un gène marqueur liés fonctionnellement par un élément IRES, lesdits gènes étant dépourvus de promoteur, - en aval de ladite unité bicistronique, une unité comprenant un gène de sélection négative lié à un premier promoteur, dont l'orientation transcriptionnelle est identique ou opposée à celle de l'unité bicistronique, et - des sites de recombinaison site-spécifique encadrant l'unité bicistronique et l'unité comprenant le gène de sélection négative.

Par ailleurs, l'ensemble des éléments ci-dessus est encadré par des séquences homologues à un gène cible d'intérêt, ou par des sites de clonage destinés à l'insertion de telles séquences homologues.

Au sens de l'invention, le terme gène désigne, de manière générale, tout acide nucléique codant un polypeptide donné. Il peut s'agir notamment d'un ADNc, d'un ADNg, d'un ADN synthétique, d'un ARN, etc., ou d'une combinaison de ceux-ci. Typiquement, le gène est un ADN comprenant une séquence codant le produit d'expression désiré. Le gène peut comporter en outre une ou des régions de terminaison de la transcription, typiquement un signal de polyadénylation.

Le vecteur comprend ainsi un gène de sélection positive et un gène marqueur, construits sans promoteur propre, et liés entre-eux de manière fonctionnelle ou opérationnelle par un élément IRES. En raison de l'absence de promoteur propre, ces gènes ne sont pas exprimés dans le vecteur. Leur expression ne peut donc avoir lieu qu'après un événement de recombinaison homologue dans la région 5' flanquante de la cassette (ou du vecteur), conduisant à placer le gène de sélection positive et le gène marqueur sous la dépendance du promoteur du gène cible dans le génome de la cellule.

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Dans ces conditions, les fonctions codées par le gène de sélection positive et le gène marqueur ne s'expriment que si un événement de recombinaison s'est produit entre la séquence homologue 5'placée dans le vecteur et la partie correspondante du gène cible. Ainsi, la sélection de clones dans lesquels la recombinaison s'est produite peut être faite simplement par détection du produit d'expression du gène marqueur et/ou du gène de sélection positive.

Comme indiqué, une séquence IRES ( Internal Ribosome Entry Sites ), située entre le gène de sélection positive et le gène marqueur, crée un messager bicistronique présentant deux phases ouvertes de lecture (gène cible/gène de sélection positive et gène marqueur). Le gène marqueur peut être indifféremment positionné en amont ou en aval de l'élément IRES et donc du gène de sélection positive. Le terme lié de manière fonctionnelle indique que les gènes sont fusionnés à la séquence IRES de manière à permettre la synthèse d'un messager bicistronique.

Le gène de sélection positive est choisi avantageusement parmi les gènes de résistance aux antibiotiques ou parmi les gènes induisant une auxotrophie. A cet égard on peut citer à titre d'exemple le gène his ou les gènes de résistance au G418, à l'hygromycine, à la kanamycine, à la puromycine ou à la généticine. Le gène his ou le gène néo sont préférentiellement utilisés, sous forme sauvage ou mutée. Le gène néo natif est encore plus préférentiellement utilisé. Il est entendu que d'autres gènes de résistance connus de l'homme du métier peuvent être utilisés. Le choix particulier de tel ou tel gène peut être effectué par l'homme du métier, en fonction du type cellulaire visé.

Le gène marqueur est choisi de préférence parmi les gènes dont le produit d'expression peut être visualisé ou détecté. On préfère tout particulièrement les gènes dont le produit d'expression coloré ou fluorescent, peut être visualisé directement par observation des cellules, le cas échéant après excitation. Le gène EGFP ( Enhanced Green Fluorescent Protein ) est ainsi particulièrement préféré. Il peut encore être choisi parmi LacZ, CD9, PAL (alkaline phosphatase),

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HRP (Horse Radish Peroxidase), RFP (Red Fluorescent Protein), la luciférase ou des dérivés de l'EGFP tels que l'ECFP ou l'EXFP. Grâce à un test colorimétrique basé sur l'expression ou la non expression du gène marqueur, il est ainsi possible de détecter rapidement les clones ayant intégré dans leur génome la cassette du vecteur.

La séquence IRES peut être toute séquence IRES fonctionnelle décrite dans l'art antérieur. On peut citer à titre d'exemple les éléments IRES du virus encéphalomyocarditis (ECMV). D'autres éléments IRES sont présents dans de multiples virus ou gènes cellulaires, notamment les virus MLV, HTLV, HCV, etc., dans des gènes codant des facteurs de croissance, tels FGF, IGF, VEGF, ou dans des oncogènes, par exemple.

La cassette comporte en outre, en aval (i. e., 3') de l'unité bicistronique, une unité comprenant un gène de sélection négative lié à un premier promoteur.

Contrairement à l'unité bicistronique, le gène de sélection négative comporte une région promotrice et peut donc s'exprimer indépendamment de tout événement de recombinaison. Ce gène s'exprime donc dans le vecteur avant l'événement de recombinaison, et également dans le génome de la cellule après l'événement de recombinaison. En revanche, ce gène ne sera pas exprimé après excision de la cassette intégrée au génome, et permet donc de vérifier la réalisation de cette étape supplémentaire facultative. Comme indiqué, le gène de sélection négative peut être positionné dans une orientation transcriptionnelle identique ou opposée à celle de l'unité bicistronique, de préférence dans une orientation identique.

Le gène de sélection négative est préférentiellement un gène de toxicité conditionnelle, c'est-à-dire par exemple un gène dont le produit d'expression n'est pas directement toxique en lui-même, mais exerce un effet toxique sur les cellules le contenant lorsqu'il est en présence d'une autre substance. A titre d'exemples particuliers, on peut citer notamment les gènes TK (codant une thymidine kinase), gpt d'E. coli, 5-FU, etc. Un gène toxique conditionne préféré est un gène TK, par exemple du virus de l'herpès simplex. Le gène de sélection négative peut

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également être un gène toxique tel que dta, notamment placé sous contrôle d'un promoteur conditionne.

Le gène de sélection négative peut être placé sous le contrôle de tout promoteur approprié au type cellulaire choisi. On peut citer des promoteurs d'origine virale, cellulaire, de phages, ou synthétique. Il peut s'agir de promoteurs forts ou faibles, constitutifs ou régulés, sélectifs ou ubiquitaires, etc. A titre d'exemples on peut citer notamment des promoteurs d'origine virale (e. g., CMV, LTR (dont MMTV), TK, SV40, HSV, RSV), cellulaire (PGK, Tet-regulated, actine), de levure (GaI1/GaI10, pADH1, nmt1), de procaryotes (T7, bla, Lac, Tryptophane, etc.).

Comme indiqué, les éléments décrits ci-dessus sont encadrés dans la cassette par des sites de recombinaison site-spécifique. La présence de ces sites permet en effet l'excision de la cassette (ou d'une partie de celle-ci) du génome des cellules sous l'action d'une protéine particulière (recombinase). Il est donc possible, après recombinaison homologue et intégration de la cassette dans le génome, d'en éliminer tout ou partie du génome. Ceci présente l'avantage de permettre d'effectuer plusieurs cycles d'inactivation (ou d'altération) sur une même population de cellules avec le système vecteur de l'invention, et ainsi d'inactiver (ou d'altérer) plusieurs gènes et/ou plusieurs allèles d'un même gène.

Différents systèmes de recombinaison site-spécifiques ont été rapportés dans l'art antérieur et peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention. On peut citer à titres d'exemples particuliers les systèmes Cre-Lox (Hoess R. H., Abremski K. ; J. Mol. Biol. 1985,181 (3), 351-362), FLP-FRT (Andrew B. J., Proteau GA., Beatty L. G., Sadawski P. D. ; Cell 1985,40 (4), 796-803) ou R (Chen J. W., Evans B. R., Yang S. H., Araki H., Oshima Y., Jayaram M. ; Mol. Cell. Biol. 1992,12 (9), 3757-3765). Dans le système Cre-Lox, des sites LoxP sont reconnus par l'action d'une recombinase (la recombinase CRE), conduisant à l'excision de toute séquence disposée entre les sites de même orientation par un événement de recombinaison spécifique. Dans un mode de réalisation préféré, la cassette comprend donc deux sites LoxP, dans la même orientation, encadrant les unités

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décrites ci-dessus, qui permettent sous l'action de la recombinase CRE d'éliminer la majeure partie de cassette intégrée au génome. Cette élimination peut se vérifier par la perte de l'expression du gène marqueur et du gène de sélection négative. Des exemples spécifiques de séquence de sites LoxP sont fournis dans les nucléotides 708-750 et 6301-6365 de la séquence SEQ ID NO : 1.

Pour permettre la recombinaison homologue spécifique d'un gène cible désiré, le vecteur selon l'invention comprend en outre deux régions d'homologies avec le gène cible (ou deux (multi) sites de clonage permettant l'insertion de ces régions d'homologies). La cassette est donc encadrée ou flanquée d'une région d'homologie 5'et d'une région d'homologie 3', permettant, par double recombinaison homologue, l'intégration de la cassette dans le génome cellulaire, en remplacement d'une portion du gène cible. Chaque région d'homologie comporte typiquement la séquence d'une région du gène cible, par exemple d'une région située dans une partie 5'et d'une région située dans une partie 3'du gène cible. Pour assurer une plus grande sélectivité, la région d'homologie comporte avantageusement une séquence parfaitement identique à la région correspondante du gène cible. Toutefois, il est entendu que certains mésappariements peuvent être tolérés. Chaque région d'homologie comporte préférentiellement une longueur suffisante pour assurer la spécificité de la recombinaison, de préférence une longueur supérieure à environ 100 pb, plus préférentiellement supérieure à environ 200 pb. De manière particulièrement préférée, la région d'homologie comprend de 0,2 à 2 kb, par exemple de 0,5 à 1,5 kb, de préférence de 0,6 à 0,8 ou de 0,6 à 2 kb. D'autre part, pour permettre ou faciliter l'expression de l'unité bicistronique par le promoteur du gène cible après l'étape de recombinaison, il est préférable que la région d'homologie 5'soit localisée dans la partie 5'du gène cible, typiquement entre le promoteur et le début de la phase codante. De manière particulièrement préférée, la région d'homologie 5'correspond à tout ou partie de la séquence du gène cible située entre le promoteur et le codon d'initiation ATG.

En plus de la cassette d'intégration décrite ci-dessus, les vecteurs de l'invention

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comprennent en outre un gène toxique, situé en aval (Le., en 3') de la cassette, sous contrôle d'un promoteur. La présence de ce gène toxique augmente la fréquence de double recombinaison homologue et confère donc au vecteur et aux méthodes de l'invention une efficacité supérieure. En effet, l'expression de ce gène étant toxique, la sélection des cellules ayant effectué une recombinaison homologue dans la région 3'du gène ciblé est facilitée, car cette recombinaison conduit à l'élimination du gène toxique. De ce fait, seules les cellules ayant éliminé le gène toxique survivent.

Typiquement, le gène toxique est un gène dont le produit d'expression induit la destruction directe ou conditionnelle de la cellule le contenant. La destruction est directe lorsque le produit d'expression exerce un effet toxique par lui-même, comme par exemple une toxine (exemple : gènes codant pour la toxine botulique ou pour la toxine tétanique), etc. Un exemple préféré de gène toxique est le gène dta. Des gènes de toxicité conditionnelle utilisables sont ceux décrits plus avant pour le gène de sélection négative, par exemple gpt, tk, 5-fu. Le gène toxique est toutefois préférentiellement différent du gène de sélection négative.

Le gène toxique peut être placé sous le contrôle de différents promoteurs, forts ou faibles, régulés ou constitutifs, sélectifs ou ubiquitaires, tels que définis ci-avant pour le gène de sélection négative. Toutefois, dans le cas d'un gène toxique tel que dta, produisant une toxicité directe, on préfère utiliser un promoteur faible, modéré ou régulé, de sorte que la toxicité ne conduise pas à la destruction de l'ensemble des cellules avant la recombinaison.

L'orientation transcriptionnelle du gène toxique peut être identique ou opposée à celle du gène de sélection négative et/ou de l'unité bicistronique.

Un objet de la présente invention concerne donc un vecteur comprenant un gène toxique différent du gène de sélection négative, lesdits gènes pouvant être choisis parmi gpt, tk ou dta, le gène toxique étant de préférence le gène dta et le gène de sélection négative étant de préférence le gène tk.

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Un objet particulier de l'invention réside dans un vecteur, caractérisé en ce qu'il comprend : a) une cassette encadrée par des séquences homologues à un gène cible ou par des sites de clonage destinés à l'insertion desdites séquences homologues, ladite cassette comprenant : en 5', une unité bicistronique comprenant un gène de résistance à un antibiotique et un gène marqueur dont le produit d'expression peut être visualisé, lesdits gènes étant dépourvus de promoteur et liés fonctionnellement par un élément IRES, - en aval de ladite unité bicistronique et dans la même orientation transcriptionnelle, une unité comprenant un gène de toxicité conditionnelle lié à un premier promoteur, et des sites de recombinaison LoxP encadrant l'unité bicistronique et l'unité comprenant le gène de toxicité, et b) un gène dont le produit d'expression est toxique pour la cellule le contenant, situé en aval de la cassette a) et pourvu d'un second promoteur, ledit second promoteur étant faible.

Un autre objet particulier de l'invention concerne un vecteur comprenant : a) une cassette encadrée par des séquences homologues à un gène cible ou par des sites de clonage destinés à l'insertion desdites séquences homologues, ladite cassette comprenant : en 5', une unité bicistronique comprenant un gène Néo et un gène
EGFP, lesdits gènes étant dépourvus de promoteur et liés fonctionnellement par un élément IRES, - en aval de ladite unité bicistronique et dans la même orientation transcriptionnelle, une unité comprenant un gène TK lié à un premier promoteur, et des sites de recombinaison LoxP encadrant l'unité bicistronique et l'unité comprenant le gène de toxicité, et b) un gène dta, situé en aval de la cassette a) sous contrôle du promoteur dta.

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Les différents éléments entrant dans la composition de la cassette et du vecteur selon l'invention peuvent être liés les uns aux autres de manière directe, ou séparés par des régions d'acides nucléiques neutres sur le plan fonctionnel (sites de clonage, régions non-codantes, etc. ). Les vecteurs de l'invention peuvent être préparés par des techniques connues de biologie moléculaire, comprenant des étapes de synthèse, clonage, ligation, sélection, etc., comme illustré dans les exemples.

Les vecteurs de l'invention peuvent être de nature et d'origine variées, comme par exemple des plasmides, épisomes, chromosomes artificiels, vecteurs viraux, etc.

Préférentiellement, les vecteurs de l'invention sont des vecteurs circulaires, double brin. Il s'agit tout particulièrement de plasmides. Les plasmides utilisés pour la construction peuvent être d'origine commerciale, comme notamment les plasmides pUC, pBR, pcDNA, pBluescript, etc. Il peut s'agir de plasmides mixtes, de synthèse, etc. Typiquement, les plasmides ne comportent pas, en dehors des éléments indiqués ci-dessus, d'autres régions homologues à un gène cible ou d'autres gènes de résistance ou de sélection. En outre, ces plasmides sont préférentiellement extra-chromosomiques, et ne comportent pas d'origine de réplication fonctionnelle dans la cellule hôte envisagée.

L'invention concerne également tout acide nucléique recombinant comprenant une cassette a) telle que définie ci-avant, éventuellement en combinaison avec une unité d'expression b) telle que définie ci-avant.

Procédé d'inactivation ou d'altération de gènes cibles Comme indiqué, l'invention est également relative à des procédés et méthodes pour l'inactivation ou l'altération de gènes cibles, utilisant des vecteurs tels que définis ci-avant.

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A cet égard, un objet particulier de l'invention réside dans un procédé d'inactivation ou d'altération d'un gène cible dans une cellule, une lignée ou une population cellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend a) l'introduction dans ladite cellule, lignée ou population cellulaire d'un vecteur tel que défini ci-avant et b) la sélection des cellules dans lesquelles le gène de sélection positive et/ou le gène marqueur s'expriment, lesdites cellules présentant ledit gène cible inactivé ou altéré.

Un autre objet de l'invention concerne un procédé d'inactivation ou d'altération d'un gène cible dans une cellule, comprenant la sélection de deux régions d'homologies du gène cible, une région 5'et une région 3' ; l'introduction d'acides nucléiques comprenant la séquence de ces régions dans un vecteur tel que défini ci-avant, au niveau des (multi) sites de clonage ; l'introduction du vecteur résultant dans le génome d'une cellule, lignée ou population hôte et la sélection des cellules, lignées ou populations dans lesquelles le gène cible est inactivé ou altéré.

L'invention peut être mise en oeuvre avec différents types cellulaires, sur des cultures primaires ou des lignées établies, sur des tissus ou cultures mixtes, etc.

Les cellules peuvent être des cellules eucaryotes, notamment de mammifère et plus particulièrement humaines. Elles peuvent être somatiques ou embryonnaires, souches ou différenciées. On peut citer par exemple des cellules de fibroblastes, hépatocytes, musculaires (squelettique, cardiaque, lisse, vaisseau sanguin, etc), nerveuses (neurone, gliales, astrocytes), cellule épithéliales, rénales, oculaires, etc. Il peut également s'agir de levures, cellules procaryotes ou végétales.

Parmi les lignées cellulaires on distingue notamment la lignée DT40 établie à partir d'un lymphom de poule connu pour être très recombinogène. Il peut également s'agir des lignées HCT116, DLD1 (lignées humaine établies à partir de cellules issues d'un carcinome colorectal), LF1 (fibroblastes de poumon embryonnaire humain), LL 1 (fibroblastes de peau embryonnaire humaine), TK6

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(lignée Iymphoblastique humaine), HaCaT (kératinocytes humains), U937 (monocytes humains), HCT15, SW480, Colo320, Co115, ES, Hb1100, Rat-1, PC12 (photochromocytome de rat), etc. Cette liste non exhaustive est donnée à titre d'exemple. D'autres lignées connues de l'homme du métier peuvent être choisies et utilisées dans le cadre de l'invention sans effort particulier de sa part.

L'un des grands intérêts de la recombinaison homologue qui la distingue des autres approches utilisant par exemple les iARN ou les oligonucléotides anti-sens, tient dans la capacité de cette technique à provoquer des mutations déterminées en un site spécifique du gène (knock-in versus knock-out). La présente invention permet donc non seulement d'invalider un ou plusieurs gènes mais également de provoquer des mutations ponctuelles, de générer des altérations chromosomiques spécifiques (en introduisant des séquences loxP sur deux chromosomes différents), ou encore de grandes délétions dans le génome.

La combinaison d'éléments génétiques appropriés dans un seul vecteur de recombinaison homologue permet ainsi d'améliorer, de façon particulièrement avantageuse, les fréquences d'invalidation d'un gène cible notamment et en particulier dans les cellules somatiques humaines.

Pour la mise en oeuvre des procédés de l'invention, les vecteurs peuvent être introduits (étape a)) dans les cellules par toute technique connue de l'homme du métier, adaptée au type cellulaire considéré. Généralement, les cellules et le vecteur sont mis en contact dans un dispositif approprié (plaque, boite, tube, poche, etc. ), pendant une période de temps suffisante pour permettre le transfert de vecteur dans les cellules. Typiquement, le vecteur est introduit dans les cellules par électroporation, précipitation au phosphate de calcium, ou en utilisant un ou des composés facilitant la transfection, tels que des lipides, polymères, liposomes et peptides, etc. Les cellules sont cultivées dans tout milieu adapté, tel que RPMI, DMEM, etc.

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La sélection des cellules dans lesquelles le gène cible a été inactivé ou altéré peut être effectuée sur la base de l'expression des gènes compris dans l'unité bicistronique, i. e., le gène de sélection positive et le gène marqueur. Typiquement, l'étape b) de sélection est réalisée grâce à la détection visuelle du produit d'expression du gène marqueur. Cette sélection est ensuite confirmée par vérification de l'expression du gène de sélection positive, par exemple de la résistance à un antibiotique donné.

Les cellules ainsi obtenues comprennent donc, dans leur génome, un gène cible inactivé ou altéré, comprenant une cassette telle que définie ci-avant en lieu et place d'une partie de la séquence du gène. Ces cellules sont directement utilisables pour l'étude de la fonction du gène inactivé ou altéré, ou pour la sélection de composés modulant l'expression du gène inactivé ou ciblé, comme décrit plus en détails dans la suite du texte.

Dans une variante avantageuse, le procédé comprend une ou des étapes supplémentaires visant à éliminer la cassette intégrée (ou une partie de celle-ci) du génome, pour permettre notamment la réalisation de cycles supplémentaire (s) d'inactivation de gènes. De manière avantageuse, l'élimination ou l'excision de la cassette est réalisée en utilisant le système de recombinaison site-spécifique présent dans la cassette.

A cet égard, dans un mode de réalisation particulier, le procédé de l'invention comprend une étape c) supplémentaire de mise en contact des cellules avec une recombinase spécifique des sites de recombinaison site-spécifique contenus dans le vecteur, et de sélection des cellules n'exprimant plus le gène marqueur et/ou le gène de sélection négative. Dans un mode de réalisation spécifique, la recombinase utilisée est la recombinase CRE (e. g., quand la cassette comprend des sites LoxP). La recombinase peut être ajoutée au milieu de culture sous forme de protéine, ou bien sous forme d'un acide nucléique codant la protéine. Dans ce cas, l'acide nucléique peut être introduit dans la même population de cellules, préalablement ou postérieurement à l'étape d'inactivation, l'expression de la

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recombinase étant induite par activation d'un promoteur. L'acide nucléique codant la recombinase peut également être introduit dans une autre population de cellules, la c-culture des cellules conduisant à mettre en contact les cellules inactivée avec l'enzyme. Préférentiellement, l'acide nucléique codant la recombinase est introduit dans la population de cellules après l'étape d'inactivation, par exemple au moyen d'un vecteur, typiquement d'un vecteur viral (adénovirus de préférence).

A l'issue de cette étape, les cellules présentent donc un allèle du gène cible inactivé ou altéré, mais ne contiennent plus dans leur génome la cassette entière provenant du vecteur. En particulier, ces cellules sélectionnées n'expriment plus le gène marqueur, ni le gène de sélection positive, ni le gène de sélection négative.

L'élimination de la cassette est préférentiellement vérifiée ou validée par détection de l'absence d'expression du gène de sélection négative, par exemple par démonstration de l'absence de sensibilité au ganciclovir, lorsque le gène de sélection négative est un gène TK.

Ces cellules peuvent être utilisées pour étudier la fonction du gène inactivé.

Préférentiellement, elles sont utilisables pour un nouveau cycle d'inactivation ou d'altération, visant soit à inactiver/altérer le second allèle du gène cible, soit à inactiver/altérer un autre gène cible.

Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de l'invention comprend donc au moins une étape supplémentaire d'introduction d'un vecteur tel que défini ciavant dans lesdites cellules et de sélection des cellules exprimant le gène de sélection positive et/ou le gène marqueur, permettant l'inactivation des deux allèles du gène cible ou d'un ou plusieurs allèles de plusieurs gènes cibles dans une cellule, une lignée ou une population cellulaire.

Ce cycle peut bien entendu être répété plusieurs fois pour inactiver/altérer d'autres gènes éventuels.

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Utilisations La technique de recombinaison homologue proposée par la présente invention et mettant en oeuvre un vecteur selon l'invention permet d'envisager plusieurs types d'applications : Il est par exemple possible d'invalider un ou plusieurs gènes d'intérêt médicaux dans différents types de lignées cellulaires qui seront ensuite utilisées dans le cadre du criblage d'agents pharmacologiques.

Grâce aux vecteurs et méthodologies décrits dans la présente demande, il est également possible de muter plusieurs gènes successivement dans la même lignée cellulaire. Cette approche permet ainsi d'inactiver les gènes codant pour les protéines d'un même complexe, d'une même voie biochimique ou de voies différentes.

La recombinaison homologue permet, par ailleurs, dans certain cas, de déterminer la fonction des isoformes générées par épissage alternatif des transcrits grâce à l'invalidation des exons spécifiques à l'ARNm codant pour l'une des isoformes.

L'utilisation d'un vecteur selon l'invention utilisant les propriétés d'un marqueur visualisable tel que la GFP notamment, permet de générer des lignées dans lesquelles le marqueur s'exprime sous le contrôle de séquences régulatrices du gène d'intérêt. Grâce à ces lignées marquées, il est possible d'étudier les facteurs qui régulent l'expression du gène dans des conditions physiologiques, c'est-à-dire sans surexpression, après transfection.

Un objet de l'invention concerne ainsi la création d'un gène hybride comprenant la totalité de la séquence du gène d'intérêt fusionnée à tout ou partie de la séquence de la GFP de manière à exprimer une protéine chimérique contenant tout ou partie de la GFP en position N-ou C-terminale. Cette fusion n'altère pas la fonction de la protéine permettant ainsi d'étudier sa localisation et sa dynamique intracellulaire

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sans provoquer la surexpression observée lors de la mise en oeuvre des techniques classiques utilisant la transfection.

Ce marqueur permet donc, dans le cadre de greffe de cellules chez l'animal et en particulier chez l'homme, de suivre le devenir du greffon. En effet, les vecteurs selon l'invention peuvent être utilisés pour traiter des cultures primaires de cellules et en particulier des cellules souches hématopoïétiques destinées à être utilisées dans le cadre d'un traitement par greffe de pathologies neuro-dégénératives.

La recombinaison homologue utilisant un vecteur selon l'invention peut également être utilisée pour réparer des gènes défectueux dans des cellules somatiques, éventuellement pluripotentes, préalablement à la greffe de ces cellules.

Un objet de l'invention concerne donc également les cellules obtenues par la mise en oeuvre du procédé et l'utilisation d'une cellule, lignée ou population cellulaire selon l'invention pour la préparation d'une composition cellulaire destinée à la mise en oeuvre d'une méthode de traitement thérapeutique, vaccinale ou chirurgicale chez l'homme ou l'animal.

Elle concerne également des compositions comprenant les cellules ainsi modifiées, notamment des compositions pharmaceutiques.

Elle concerne également des kits pour la mise en oeuvre de procédés de modification du génome de cellules in vitro ou ex vivo, comprenant un vecteur tel que décrit ci-avant.

D'autres aspects et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs, ainsi que des dessins sur lesquels : La figure 1 représente un vecteur de l'invention dans lequel les positions des différentes cassettes de la construction pBsk+cassettesdern-dta ? sont indiquées.

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La figure 2 représente la séquence nucléique d'un vecteur de l'invention (SEQ ID NO : 1). Les positions des éléments sont indiquées : Bases 1 à 652 : pBluescript SK Bases 653 à 710 : MCSA Bases 710 à 753 : Lox P Bases 754 0 1990 : Gène Néo Bases 1991 à 3580 : IRES/Gène EGFP Bases 3581 à 6300 : pGK promoteur/Gène TK/pGK polyA Bases 6301 à 6360 : Lox P Bases 6361 à 6400 : MCSB Bases 6401 à 8630 : pBluescript SK EXEMPLE 1 : Construction du vecteur de recombinaison homologue 1. Vecteur initial Utilisation du vecteur pBluescript SK dont le numéro d'accession dans GenBank est x52325 (Stratagene).

II. Modification du site de clonage multiple (MCS ou polylinker ) 1. L'insertion du MCSA est réalisée par : - digestion du plasmide pBluescript SK avec les enzymes de restriction kpnl et Hindlll (New England Biolabs/Ozyme), construction du MCSA, sans codon stop (TGA, TAA, TAG) dans sa séquence, mais avec les sites de coupure pour les enzymes de restriction suivants :
Fsel-Nsil Le MCSA est obtenu après l'hybridation de deux oligonucléotides sens et antisens. Il est ensuite coupé aux extrémités par les enzymes de restriction kpnl et Hindlll (New England Biolabs/Ozyme). legation du MCSA avec le pBluescript SK,

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Obtention du vecteur pBluescript SKA.

Les oligonucléotides nécessaires à la construction du MCSA ont pour séquence : SensMCSA (SEQ ID NO : 2) : 5'-ggggt acccc gaaga cgtcg acggc cggcc tgcat gcatg cacac gtggc ttctt ccata tgccc aagct tggg-3' AntisensMCSA (SEQ ID NO : 3) : 5'-cccaa gcttg ggcat atgga agaag ccacg tgtgc atgca tgcag gccgg ccgtc gacgt cttcg gggta cccc-5' 2. L'insertion du MCSB est réalisée par : - digestion du plasmide pBluescript SKA avec les enzymes de restriction EcoRi et Notl (New England Biolabs/Ozyme), construction du MCSB, possédant les sites de coupure pour les enzymes de restriction : EcoRI-BstEil-Psti-BamHi-Hpal-Nhel-Swal-Avril-Afli !Pacl-Xho-Notl Le MCSB est obtenu après hybridation de deux oligonucléotides sens et antisens.

Il est ensuite coupé aux extrémités par les enzymes de restriction EcoRI et Notl (New England Biolabs/Ozyme), legation du MCSB avec le pBulescript SKA, obtention du vecteur pbluescript SKAB Les oligonucléotides nécessaires à la construction du MCSB ont pour séquence : SensMCSB (SEQ ID NO : 4) : 5'-ccgga attcc gggtt acccc tgcag aacgg gatcc cggtt aacgc tagca tttaa atcct aggct taagt taatt aactc gaggg ggcgg ccgct actat-3' AntisensMCSB (SEQ ID NO : 5) : 5'-atagt agcgg ccgcc ccctc gagtt aatta actta agcct aggat ttaaa tgcta gcgtt aaccg ggatc ccgtt ctgca ggggt aaccc ggaat tccgg-3' 3. Visualisation du nouveau site de clonage multiple : Sites de clonage multiple initial du pBluescript SK :

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Kpn)-Apa)-Eco109-Xhot-Sait-C) ai-Hind) ii-EcoRV-EcoRi-Pst)-Smai-BamHi-Spei- Xbal-Notl Sites de clonage multiple insérés dans pBluescript SKAB :

Kpnl-Bbsl-Sall-Fse/-Nsil-Pmll- (Sapl) -Ndel-Hind 111-EcoRV -EcoRI-BstEII-PstlBamHi-Hpal-Nhel-Swal-Avril-Aflii-Paci-Xho-Notl ))). Insertion du gène de sélection négative Thymidine Kinase TK pour la sélection des clones ayant éliminé le gène de résistance Néomycine 1. Construction du pBluescript SKABTK : La construction est réalisée selon les étapes suivantes.

Le plasmide pT102 est digéré avec les enzymes de restriction suivantes : * Pstl et BamHI (New England Biolabs/Ozyme) : cassette pGKpolyA Numéro d'accession dans GenBank : X76683 (des bases 7894 et 8347) * EcoRI et Bstell (New England Biolabs/Ozyme) : cassette pGKpromoteur/gène TK.

Numéro d'accession dans GenBank : AF092543 promoteur pGK (des bases 3715 à 3207 en reverse complémentaire) et L19900 gène TK (des bases 741 à 2571).

- Le plasmide pBluescript SKAB est digéré avec les enzymes de restriction Pstl et BamHI (New England Biolabs/Ozyme), - ligation de la cassette pGKpolyA, - obtention du plasmide pBluescript SKABpolyA, - digestion du plasmide pBluescript SKABpolyA avec les enzymes de restriction EcoRI et Bstell (New England Biolabs/Ozyme), - ligation de la cassette pGKpromoteur/gène TK, - obtention du plasmide pBluescriptSKABTK.

2. Visualisation de la construction SKABTK obtenue

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Kpni-Bbsl-Sall-Fsel-Nsil-Pmll- (Sapl)-Ndel-Hind 111-EcoRV-EcoRIpGKpromoteur/gèneTK-Bs//-Ps-'pGKpo) yA-BamH/-/-/pa/-e/-SwaM/-//- Affil-Paci-Xho-Notl IV. Insertion du gène de sélection positive de résistance à la néomycine, gène Neo, sans promoteur 1. Construction du pBuescript SKABNeoTK : Le plasmide est construit selon le protocole suivant.

- Amplification PCR du plasmide pT102 avec l'oligonucléotide Hin3Neo à cheval sur le codon ATG d'initiation du gène Neo et l'oligonucléotide pASTOPSEI hybridant à l'extrémité 3'du polyA du gène Neo, - obtention d'un fragment d'ADN contenant la séquence du gène Neomycine phosphotransférase avec une séquence de polyadénylation mais sans promoteur Numéro d'accession dans GenBank : AF113968 Gène Neomycin p hos photransfe rase (des bases 2727 à 3430).

Les oligonucléotides utilisés pour l'amplification fidèle avec la Pfu turbo (stratagene) ont pour séquence : Hin3Neo (SEQ ID NO : 6) 5'cccaa gcttg ggjatgj ggatc ggcca ttgaa caaga tgga-3' pASTOPSE1 (SEQ ID NO : 7) 5'cggaa ttctc agtca gtcat gctga tctcg caggc tatg-3' - ligation du fragment PCR dans le vecteur pGEMT (Promega) - séquençage du plasmide pGEMTNeo (Genome express, Grenoble).

- digestion du plasmide pGEMTNeo avec les enzymes de restriction Hindlll et EcoRI (New England Biolabs/Ozyme) - digestion du plasmide pBluescript SKABTK avec les enzymes de restriction Hindlll et EcoRI (New England Biolabs/Ozyme).

- ligation de la cassette Neo dans le plasmide pBluescript SKABTK.

- obtention du plasmide pBluescript SKABNeoTK

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2. Visualisation de la construction pBluescript SKABNeoTK obtenue : Kpnl-Bbst-Sait-Fsel-Nsil-Pmil- (Sapi)-Ndet-Hindill-EcorVI gèneNeo/pGKpoly Ecor)-pGKpromoteur/gèneTK-BsF//-Ps-pGKpolyA-BamHI-Hpal-Nhel-Swal- A vrll-Af//l-Pacl-Xho-Notl V. Insertion de deux séquences loxP reconnues spécifiquement par la recombinase CRE : 1. Construction du loxP : Le loxP est obtenu après l'hybridation de deux oligonucléotides sens et antisens.

La séquence loxP contient les sites de coupure pour les enzymes de restriction :
BamHi-Ndel-----LoxP--Hindlll-Hpal Les oligonucléotides nécessaires à la construction des sites LoxP ont pour séquence : SensBNLoxpHH (SEQ ID NO : 8) : 5'-cggga tcccg catat gataa cttcg tataa tgtat gctat acgaa gttat atccc aagct tgggg ttaac cc-3' AntisensBNLoxpHH (SEQ ID NO : 9) : 5'-gggtt aaccc caagc ttggg atata acttc gtata gcata catta tacga agtta tcata tgcgg gatcc cg-3' 2. Insertion du premier site LoxP : - Digestion du plasmide pBluescript SKABNeoTK avec les enzymes de restriction Ndel et Hindlll (New England Biolabs/Ozyme), - digestion du plasmide LoxP avec les enzymes de restriction Ndel et Hindlll (New England Biolabs/Ozyme), - ligation du LoxP avec le pBluescript SKABNeoTK, - obtention du vecteur pBluescript SKAloxBNeoTK

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3. Insertion du deuxième site LoxP : - Digestion du plasmide pBluescript SKAloxBNeoTK avec les enzymes de restriction BamHI et Hpal (New England Biolabs/Ozyme), - digestion des extrémités du LoxP avec les enzymes de restriction BamHI et Hpal (New England Biolabs/Ozyme), - ligation du LoxP avec le pBluescript SKABloxNeoTK, - obtention du vecteur pBluescript SKAloxNeoTKloxB.

4. Visualisation de la construction pBluescript SKAloxNeoTKloxB obtenue : Kpnl-Bbsl-SaII-FseI-Nsil-PmII- (Sa, pI)-NdeIffl-HindIII-Ecorvl gèneNeo/p EcorI-pGKpromoteur/gèneTK-Z/--pGKpolyÀ-mHI-LoxF-HpaI-NheI-SwaI- AvrII-AflII-PacI-Xho- NotI Plusieurs vecteurs sont réalisables à ce stade. L'EGFP est utilisable pour le vecteur pNGTD mais pas pour le vecteur pNTD dont la construction se poursuit au paragraphe VII.

VI. Insertion du gène codant pour la protéine verte fluorescente EGFP pour optimiser la sélection des clones recombinants pour le vecteur pNGTD.

1. Construction d'un adaptateur EcoRI : L'adaptateur est obtenu après hybridation de deux oligucléotides sens et antisens.

La séquence de l'adaptateur contient le site de restriction EcoRI et l'extrémité cohésive du site de restrictin Aflll. Après ligation de cet adaptateur le site Aflll ne sera plus fonctionnel, dû à l'introduction d'une mutation.

Extrémité 3'EGFP Aflll Aflll*EcoRI Adaptateur

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<tb>
<tb> C <SEP> (ttaag) <SEP> C <SEP> t <SEP> t <SEP> a <SEP> a <SEP> T <SEP> ggaattcgg
<tb> GAATT <SEP> (c) <SEP> GAATT <SEP> a <SEP> ccttaagcc
<tb>
Les oligonucléotides necessaires à la construction de l'adaptateur ont pour sequence : SENSADAPTECO (SEQ ID NO : 10) 5'-ttaat ggaat tcgg-3'

ANTISADAPTECO (SEQ ID NO : 11) 5'-ccgaa ttcca-3' 2. Construction de pBluescript SKAloxNeoEGFPTKloxB : Le plasmide est construit selon le protocole suivant : - Digestion du plasmide pIRES2-EGFP (Clontech) avec les enzymes de restriction EcoRI et Aflll (New England Biolabs/Ozyme) : cassette IRES-EGFP.

- ligation de l'adaptateur à l'extrémité 3'de la cassette IRES-EGFP poly A, - digestion de la cassette IRES-EGFP avec l'enzyme de restriction EcoRI (New England Biolabs/Ozyme), - digestion du plasmide pBluescript SKAloxNeoTKloxB avec l'enzyme de restriction EcoRI (New England Biolabs/Ozyme), -ligation de la cassette IRES-EGFP avec le plasmide pBluescript SKAloxNeoTKloxB.

- obtention du vecteur pBluescript SKAloxNeoEGFPTKloxB.

3. Visualisation de la construction pBluescript SKAloxNeoEGFPKloxB obtenue :

KpnI-BbsI-SalI-FseI-NsiI-PmlI- (SapI)-NdoxP-HindIII-EcorV-gèneNeo/pGKpolyAEcorI-ÏRES-EGFPpoly A-EcorI-pGKpromoteur/gèneTK-BstEII-Ps-pGKpolyÂBamHI-LoxP-HpaI-NheI-SwaI-AvrII-AflII-PacI-Xho-NotI 4. Elimination de la séquence poly A du gène Néo pour pNGTD :

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La séquence est éliminée comme suit : - Digestion partielle avec l'enzyme de restriction Pstl - Ligation du plasmide sans la séquence de polyadénylation du gène Néo.

5. Visualisation de la construction obtenue :

Kpnl-BbsI-Sall-FseI-NsiI-PmII- (SapI)-NdeIffl-Hindlll-EcorV EGFP polyA-EcoRI-pGKpromoteur/gèneTK-BstEII-Pst-pGKpolyÀ-BamHI-LoxP- HpaI-NheI-SwaI-AvrII-AflII-PacI-Xho-NotI VII. Insertion du gène de sélection négative codant pour la toxine diphtérique A dta pour favoriser la recombinaison homologue.

1. Construction de pBluescript SKAloxNeoEGFPTKloxBdta : Le vecteur est construit selon le protocole suivant : a. Digestion du plasmide pdta avec les enzymes de restriction Xhol et Notl (New England Biolabs/Ozyme) : cassette pMcidta.

Numéro d'accession dans GenBank : E00489 gène dta (des bases 376-954). b. digestion du plasmide pBluescript SKAloxNeoEGFPTKloxB avec les enzymesde restriction Notl (digestion partielle) et Xhol (New England Biolabs/Ozyme), c. ligation de la cassette dta avec le plasmide pBluescript SKAloxNeoEGFPTKloxB, d. obtention du vecteur pBluescript SKAIoxNeoEGFPTKloxBdta.

2. Visualisation des constructions pBluescript SKAloxNeoEGFPTKloxBdta obtenues : pNGTD :

JSQD ! -Bbsl-Sall-Fsel-Nsil-Pmll- (Sapl) -Nde/-Hind 111-EcorV 1 gèneNeq -Eco rll'RES-EGFPjpolyA-EcorllpGKpromoteurlgène TKj-BstEII-Pst/1PGKpolyAj-BamHI- -Hpal-Nhet-Swal-Avrit-Afili-Pact-Xholpromoteu-Notl

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PNTD : Kpnl-Bbst-Sail-Fsel-Nsil-Pmil- (Sapi)-Ndel--Hindlll-EcorVgèneNeo/pGKpo) yA-Ecorl-pGKpromoteur/gèneTK-Bst/II-Pst/pGKpolyABamH/-LoxP-Hpal-Nhe/-Swal-Avrll-Af/l/-Pacl-Xholpromoteurdta-Notl EXEMPLE 2 : Insertion des séquences génomiques 5'et 3'flanquantes du gène à invalider 1. Choix des régions 5'et 3'flanquantes du gène ciblé - Avantageusement, la région 5'et 3'du gène ciblé est choisie par détermination de la séquence complète de la région du gène à invalider et identification de sa structure exon/intron et de sa carte de restriction précise. Sur la base de ces éléments, les sites de coupure pour les enzymes de restriction utilisables pour insérer les différentes régions génomiques peuvent être choisis : Pour la région génomique 5'flanquante du gène ciblé, les sites utilisables sont : Pour pNGTP : Fsel-Nsil Pour la région génomique 3'flanquante du gène ciblé, les sites utilisables sont : Nhel-Swal-Aflll-Pacl-Xho La digestion par l'enzyme Swal (New England Biolabs/Ozyme) créé des extrémités franches, permettant l'insertion de tout fragment d'ADN génomique dont les extrémités sont également franches.

II. Obtention des régions 5'et 3'flanquantes du gène ciblé Plusieurs possibilités d'obtention du fragment génomique 3'sont envisageables en fonction des sites de restriction présents dans cette région 3'du gène à invalider.

Ainsi le fragment est obtenu soit par amplification fidèle, soit par digestion enzymatique. Pour la région 5'flanquante, une amplification est mieux adaptée

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puisque la séquence du produit du gène ciblé doit être avantageusement en phase avec le cadre de lecture du gène de sélection positive (Néo). Il est entendu que la région d'homologie peut également être synthétisée artificiellement.

La région 5'flanquante a une taille de 800 à 2000 paires de bases en moyenne alors que la taille de la région 3'flanquante est constituée, approximativement, de 2000 à 5000 paires de bases.

1. Amplification fidèle avec la Pfu turbo (Stratagene) ou le Highexpand High Fidelity (Roche) des régions choisies : Les oligonucléotides nécessaires à l'amplification sont synthétisés artificiellement.

Ils présentent à une extrémité le site de restriction (SR) compatible pour son insertion dans le vecteur de recombinaison homologue.

Oligo sens : SR séquence spécifique du gène ciblé Oligo antisens : Séquence spécifique du gène ciblé SR Dans le cas de la région 5'flanquante, l'oligonucléotide antisens est situé de manière à créer une protéine de fusion entre le produit du gène ciblé et la neomycin phopotransferase .

Le fragment obtenu par amplification est digéré par les enzymes de restriction adaptées et est ensuite purifié sur gel.

2. Digestion enzymatique de la région 3'choisie : La digestion est réalisée avec les enzymes de restriction de l'ADN génomique selon les sites de restriction disponibles dans le MCS B du vecteur de recombinaison homologue.

Les différents fragments d'ADN digérés sont ensuite purifiés sur gel.

) !). insertion des régions 5'et 3'flanquantes du gène ciblé dans le vecteur de recombinaison homologue

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La digestion du vecteur pBluescript SKAloxNeoTKloxBdta est réalisée avec les enzymes de restriction identiques à celles qui sont choisies pour digérer les extrémités des fragments d'ADN correspondant aux régions 5'et 3'flanquantes du gène ciblé.

La ligation des régions 5'et 3'du gène ciblé est effectuée dans les sites de clonage respectivement en amont et en aval des cassettes de sélection positive et négative (Néo et TK) du vecteur de recombinaison homologue.

IV. Préparation du vecteur de recombinaison homologue pour la transfection et transfection Pour introduire le vecteur dans une population cellulaire, différentes stratégies sont utilisables. Parmi celles-ci, il est possible de linéariser le plasmide, puis de l'introduire par électro pro ration, selon le schéma général suivant : - Ouverture du vecteur avec Fsel en amont des cassettes de sélection, - purification du vecteur linéarisé , transfection par électroporation de cellules somatiques humaines choisies, - transfert dans une dizaine de récipients de culture T75 : culture une nuit, V. Sélection des clones exprimant le marqueur EGFP et stabilisation par résistance au G418 La sélection des clones obtenus ayant intégré le vecteur peut être réalisée selon le protocole suivant :
Sélection des clones EGFP+, - Culture des clones à faible densité dans une plaque à 96 puits (à raison de 8 plaques de 96 puits par récipient de culture T75), - sélection 14 à 21 jours en présence de G418 dans le milieu, transfert par trypsination des clones isolés dans un nouveau puits d'une plaque de 96 puits, sélection pendant 2 jours.

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VI. Isolement des clones invalidés pour le gène ciblé L'isolement et la vérification des clones dans lesquels le gène cible a été invalidé peuvent être réalisées selon le protocole suivant :
Amplification des clones et préparation de l'ADN génomique de chaque clone, isolement rapide des clones positifs par amplification PCR grâces aux oligonucléotides spécifiques du gène ciblé (ces oligonucléotides donnent après amplification un fragment d'ADN de taille différente pour le gène sauvage ou invalidé), congélation des clones positifs hétérozygotes.

VII. Obtention de clones homozygotes pour le gène ciblé Pour la réalisation de clones homozygotes, il est possible grace à l'invention de réaliser un second cycle d'inactivation, portant sur le second allèle. Préalablement, la cassette intégrée au niveau du premier allèle est éliminée, au moins en partie.

1. Elimination de la cassette de sélection : Cette étape est avantageusement réalisée comme suit :
Amplification du clone hétérozygote en milieu de sélection dans un récipient de culture T25, infection avec un adénovirus-Cre (adénovirus recombinant défectif pour la réplication, dont le génome recombinant comporte une région codant la recombinase CRE) pendant une nuit, ou transfection par le vecteur d'expression de la Cre transfert dans une plaque à 96 puits en absence de sélection et en présence de gancyclovir (la croissance des cellules montre l'élimination simultanée des gènes Néo et Thymidine Kinase),

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culture pendant deux semaines afin d'éliminer la présence de la protéine cre recombinase, vérification de l'élimination des cassettes par amplification PCR après avoir choisi des oligonucléotides spécifiques du gène ciblé encadrant les cassettes de sélection (Ces oligonucléotides donnent une amplification de taille différente selon l'élimination ou non des cassettes Néo et TK), - congélation des clones hétérozygotes sans cassette de sélection, amplification du clone hétérozygotes sans sélection dans un récipient de culture T75.

2. Sélection des clones homozygotes : La préparation des clones homozygotes est obtenue par une nouvelle transfection (par électroporation) des clones hétérozygotes, selon le protocole décrit précédemment, puis transfert dans une dizaine de récipients de culture T75. Les clones homozygotes sont sélectionnés comme suit : une nuit après la transfection, les clones sont mis à pousser à faible densité dans une plaque à 96 puits en présence de sélection, - sélection des clones EGFP+ - sélection pendant 14 à 21 jours à l'aide de G418, - transfert des clones isolés dans un nouveau puits d'une plaque de 96 puits, - sélection 2 jours, - amplification des clones et préparation de l'ADN génomique pour chaque clone, isolement des clones positifs par amplification PCR,
Congélation des clones positifs homozygotes.

Bien entendu, il est possible d'invalider un second gène en utilisant le même vecteur de recombinaison homologue après élimination de la cassette Néo (voir Vil. 1).

Claims (28)

1. REVENDICATIONS 1. Vecteur caractérisé en ce qu'il comprend : a) une cassette encadrée par des séquences homologues à un gène cible ou par des sites de clonage destinés à l'insertion desdites séquences homologues, ladite cassette comprenant : en 5', une unité bicistronique comprenant un gène de sélection positive et un gène marqueur liés fonctionnellement par un élément IRES, lesdits gènes étant dépourvus de promoteur, - en aval de ladite unité bicistronique, une unité comprenant un gène de sélection négative lié à un premier promoteur, dont l'orientation transcriptionnelle est identique ou opposée à celle de l'unité bicistronique, et des sites de recombinaison site-spécifique encadrant l'unité bicistronique et l'unité comprenant le gène de sélection négative, et b) un gène toxique situé en aval de la cassette a) et pourvu d'un second promoteur.
2. 2. Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que le gène de sélection positive est un gène de résistance à un antibiotique ou un gène induisant une auxotrophie, par exemple le gène his ou les gènes de résistance à la Néomycine, à l'hygromycine, à la kanamycine, à la puromycine ou à la généticine.
3. 3. Vecteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le gène marqueur est un gène dont le produit d'expression peut être visualisé, de préférence le gène EGFP.
4. 4. Vecteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le gène de sélection négative est un gène de toxicité conditionnelle, de préférence choisi parmi gpt et tk, plus préférentiellement le gène tk.
5. 5. Vecteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le gène toxique est un gène dont le produit d'expression induit la destruction

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   directe ou conditionnelle de la cellule le contenant, de préférence choisi parmi gpt, tk et dta, plus préférentiellement le gène dta.
6. 6. Vecteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le gène de sélection négative et le gène toxique sont différents.
7. 7. Vecteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'élément IRES provient du virus encephalomyocarditis (ECMV).
8. 8. Vecteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le premier promoteur est un promoteur viral, par exemple le promoteur du gène CMV, TK, LTR.
9. 9. Vecteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le second promoteur est un promoteur faible, modéré ou régulé, par exemple le promoteur du gène dta.
10. 10. Vecteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les sites de recombinaison site-spécifique sont des sites LoxP.
11. 11. Vecteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que chaque séquence homologue comprend au moins 0,2 kb de la séquence du gène cible, préférentiellement de 0,6 à 2 kb.
12. 12. Vecteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un plasmide.
13. 13. Vecteur, caractérisé en ce qu'il comprend : a) une cassette encadrée par des séquences homologues à un gène cible ou par des sites de clonage destinés à l'insertion desdites séquences homologues, ladite cassette comprenant : en 5', une unité bicistronique comprenant un gène de résistance à un antibiotique et un gène marqueur dont le produit d'expression peut être

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    visualisé, lesdits gènes étant dépourvus de promoteur et liés fonctionnellement par un élément IRES, en aval de ladite unité bicistronique et dans la même orientation transcriptionnelle, une unité comprenant un gène de toxicité conditionnelle lié à un premier promoteur, et des sites de recombinaison LoxP encadrant l'unité bicistronique et l'unité comprenant le gène de toxicité, et b) un gène dont le produit d'expression est toxique pour la cellule le contenant, situé en aval de la cassette a) et pourvu d'un second promoteur, ledit second promoteur étant faible.
14. 14. Utilisation d'un vecteur selon l'une quelconque des revendications précédentes pour inactiver in vitro ou ex vivo, par recombinaison homologue, un gène cible dans une cellule, une lignée ou une population cellulaire.
15. 15. Utilisation d'un vecteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 pour provoquer, in vitro ou ex vivo, une ou plusieurs mutations ponctuelles et/ou altérations chromosomiques spécifiques et/ou délétions au sein d'un gène cible dans une cellule, une lignée ou une population cellulaire.
16. 16. Utilisation d'un vecteur selon l'une des revendications 1 à 13 pour la préparation in situ d'un gène hybride contenant tout ou partie de la séquence d'un gène cible en fusion avec la séquence codant un marqueur, notamment EGFP, ledit gène hybride exprimant dans ladite cellule une protéine chimérique contenant tout ou partie du produit d'expression du gène cible fusionné à la séquence en acide aminés de la protéine marqueur, ladite protéine chimérique pouvant être détectée ou visualisée dans les cellules.
17. 17. Procédé d'inactivation ou d'altération d'un gène cible dans une cellule, une lignée ou une population cellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend a) l'introduction à l'intérieur de ladite cellule, lignée ou population cellulaire d'un vecteur selon l'une des revendications 1 à 13 et b) la sélection des cellules dans lesquelles le gène de

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    sélection positive et/ou le gène marqueur s'expriment, lesdites cellules présentant ledit gène cible inactivé ou altéré.
18. 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'étape b) est réalisée grâce à la détection visuelle du produit d'expression du gène marqueur.
19. 19. Procédé selon l'une des revendications 17 ou 18, caractérisé en ce qu'il comprend une étape c) supplémentaire de mise en contact des cellules avec une recombinase spécifique des sites de recombinaison site-spécifique contenus dans le vecteur, et de sélection des cellules n'exprimant plus le gène marqueur et/ou le gène de sélection négative.
20. 20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape supplémentaire d'introduction d'un vecteur selon l'une des revendications 1 à 13 dans lesdites cellules et de sélection des cellules exprimant le gène de sélection positive et/ou le gène marqueur, permettant l'inactivation des deux allèles du gène cible ou d'un ou plusieurs allèles de plusieurs gènes cibles dans une cellule, une lignée ou une population cellulaire.
21. 21. Procédé selon l'une des revendications 17 à 20, caractérisé en ce que le vecteur est introduit dans les cellules par électroporation, précipitation au phosphate de calcium, ou en utilisant un ou des composés facilitant la transfection, tels que des lipides, polymères, liposomes et peptides.
22. 22. Procédé selon l'une des revendications 17 à 21, caractérisé en ce que les cellules sont des cellules de mammifère.
23. 23. Cellule, lignée ou population cellulaire, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un gène inactivé ou altéré grâce au procédé selon l'une des revendication 17 à 22.
24. 24. Cellule selon la revendication 23, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule eucaryote, notamment de mammifère et plus particulièrement humaine.

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25. 25. Cellule selon l'une des revendications 23 ou 24, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule somatique ou embryonnaire, souche ou différenciée.
26. 26. Cellule selon la revendication 23, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une levure, d'une cellule procaryote ou végétale.
27. 27. Utilisation d'une cellule, lignée ou population cellulaire selon l'une des revendications 23 à 26, pour le criblage de molécules capables de moduler l'expression du ou des gènes inactivés.
28. 28. Utilisation d'une cellule, lignée ou population cellulaire selon l'une des revendications 23 à 26 pour la préparation d'une composition cellulaire destinée à la mise en oeuvre d'une méthode de traitement thérapeutique, vaccinale ou chirurgicale chez l'homme ou l'animal.