JP2008505625A - リコンビナーゼを介したカセット交換を用いる、短いヘアピン型rna発現カセットの標的遺伝子組換え - Google Patents
リコンビナーゼを介したカセット交換を用いる、短いヘアピン型rna発現カセットの標的遺伝子組換え Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008505625A JP2008505625A JP2007519804A JP2007519804A JP2008505625A JP 2008505625 A JP2008505625 A JP 2008505625A JP 2007519804 A JP2007519804 A JP 2007519804A JP 2007519804 A JP2007519804 A JP 2007519804A JP 2008505625 A JP2008505625 A JP 2008505625A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- promoter
- locus
- ubiquitous
- vector
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 81
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 title claims abstract description 67
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 51
- 230000006798 recombination Effects 0.000 title claims abstract description 43
- 238000005215 recombination Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 title claims abstract description 35
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 title claims abstract description 34
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 title claims abstract description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 81
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 70
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 51
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 76
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 44
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 38
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 33
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 29
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 24
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 23
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 23
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 21
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 18
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 17
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 16
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 10
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 7
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 claims description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 7
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 claims description 6
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 6
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 claims description 5
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 claims description 5
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 claims description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 5
- 208000005229 Autosomal recessive Robinow syndrome Diseases 0.000 claims description 4
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 claims description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 claims description 4
- 108091061750 Signal recognition particle RNA Proteins 0.000 claims description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000001945 resonance Rayleigh scattering spectroscopy Methods 0.000 claims description 4
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 4
- 108020005075 5S Ribosomal RNA Proteins 0.000 claims description 3
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 claims description 3
- 102000004167 Ribonuclease P Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000621 Ribonuclease P Proteins 0.000 claims description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims description 3
- 108020004688 Small Nuclear RNA Proteins 0.000 claims description 3
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 claims description 3
- 238000009509 drug development Methods 0.000 claims description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 2
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 claims description 2
- -1 CamKII Proteins 0.000 claims description 2
- 101100226596 Gallus gallus FABP gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 claims description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 claims description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 2
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 claims description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims 1
- 102100030431 Fatty acid-binding protein, adipocyte Human genes 0.000 claims 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims 1
- 101001062864 Homo sapiens Fatty acid-binding protein, adipocyte Proteins 0.000 claims 1
- 241000902900 cellular organisms Species 0.000 claims 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 27
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 27
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract description 11
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 29
- 235000011449 Rosa Nutrition 0.000 description 26
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 16
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 16
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 15
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 15
- 101150036876 cre gene Proteins 0.000 description 12
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 12
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 11
- NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N Tamoxifen Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 10
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 9
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 9
- 208000035199 Tetraploidy Diseases 0.000 description 8
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 8
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 8
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 7
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 7
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 7
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 7
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 5
- 101150003028 Hprt1 gene Proteins 0.000 description 5
- 101100226589 Mus musculus Fabp1 gene Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 229960001603 tamoxifen Drugs 0.000 description 5
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 4
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 3
- 108010001132 DNA Polymerase beta Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 3
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 3
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 3
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000010468 interferon response Effects 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 2
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 108010052160 Site-specific recombinase Proteins 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- WLDHEUZGFKACJH-UHFFFAOYSA-K amaranth Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].C12=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(O)=C1N=NC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C2=CC=CC=C12 WLDHEUZGFKACJH-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000019975 dosage compensation by inactivation of X chromosome Effects 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 2
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 2
- AWDBHOZBRXWRKS-UHFFFAOYSA-N tetrapotassium;iron(6+);hexacyanide Chemical compound [K+].[K+].[K+].[K+].[Fe+6].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] AWDBHOZBRXWRKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 101000834253 Gallus gallus Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108050005077 Haptoglobin Proteins 0.000 description 1
- 108010034145 Helminth Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000756632 Homo sapiens Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001124309 Homo sapiens Nitric oxide synthase, endothelial Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 101710090055 Nitric oxide synthase, endothelial Proteins 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710193739 Protein RecA Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000012458 free base Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 244000000013 helminth Species 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 102000055702 human NOS3 Human genes 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000000738 kidney tubule Anatomy 0.000 description 1
- 102000005861 leptin receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010019813 leptin receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000006965 reversible inhibition Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021247 β-casein Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
- A01K2217/054—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing loss of function
- A01K2217/058—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing loss of function due to expression of inhibitory nucleic acid, e.g. siRNA, antisense
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本発明は、リコンビナーゼを介したカセット交換を用いる、短いヘアピン型RNA発現カセットの標的遺伝子組換えのための方法を提供する。標的遺伝子組換え及びリコンビナーゼを介した遺伝子組換えのための適切なヌクレオチド酸配列及びベクターが提供される。
Description
本発明は、リコンビナーゼを介したカセット交換を用いる、短いヘアピン型RNA発現カセットの標的遺伝子組換えのための方法を提供する。標的遺伝子組換え及びリコンビナーゼを介した遺伝子組換えのための適切なヌクレオチド酸配列及びベクターが提供される。
受精卵への精製DNAの核内注入によるトランスジェニックマウスの作製は、インビボで遺伝子又はプロモーター機能を検討するための広く使用されるアプローチである。しかし、発現のレベル及びパターンは、しばしば導入遺伝子のコピー数、立体配置及び組込み部位に強く依存して変動する。加えて、ファウンダーマウスは時として導入遺伝子を伝達しない。それ故、有用な系統を特定するためには多くの異なるファウンダーを作製し、試験する必要があり、これは多大の労力と時間を要する作業である(Bradley et. al., Nature Genet., 14: 121-123 (1996); Jasin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:8804-8808 (1996); Dobie et al., Trends Genet., 13:127-130 (1997); Garrick et al., Nature Genet, 18:56-59 (1998), Al-Shawi et al., Mol. Cell. Boil. 10:1192-1198 (1990))。
これらの制限を克服するために、胚幹細胞における相同的組換えを用いて、ゲノムのあらかじめ定められた部位に組み込まれた単一コピーの導入遺伝子を担持するマウスが生産されてきた (Shaw-White et al., Transgenic Res.; (1): 1-13 (1993); Bronson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93(17:9067-72 (1996); Hatada et al., J. Biol., Chem., 274(2):948-55 (1999); Vivian et al., Biotech niques, 27(1): 154-62 (1999); Evans et al., Physiol. Genomics, Mar. 13, 2(2):67-75 (2000); Cvetkovic et al., J. boil. Chem., 275(2): 1073-8 (2000); Guillot et al., Physiol. Genomics, Mar. 13, (2):77-83 (2000); Magness et al., Blood, 95(11):3568-77 (2000); Misra et al., BMC Biotechnol., 1(1): 12 (2001); Minami et al., Blood, 100(12):4019-25 (2002); Tang et al., Genesis, 32(3): 199-202 (2002))。これらの試験では、「標的遺伝子組換え」のために遍在Hprt遺伝子座が使用され、大なり小なり成功を収めた。ポリオーマエンハンサー/HSVチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのHprtの3番目のエクソンへのlacZ遺伝子の挿入は、両方向性及び細胞型依存性の可変的なβ−ガラクトシダーゼ発現をもたらした(Shaw-White et al., Transgenic Res.; (1): 1-13 (1993))。しかし、ヒト及びニワトリβ−アクチン遺伝子プロモーターの制御下で導入遺伝子は、Hprt遺伝子座に挿入したとき広汎な発現を生じさせ、転写産物のレベルは種々の組織において大きく異なった(Bronson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93(17:9067-72 (1996))。意外にも、これらの導入遺伝子の発現は、内在性Hprt遺伝子の発現と異なって、腎及び肝では低いか又は検出不能であると思われた(Bronson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93(17:9067-72 (1996))。Hatada et al. は、HPRT遺伝子座は、マウスのいくつかの組織においてハプトグロビン遺伝子プロモーター並びに単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターの両方の活性を抑制することを明らかにした(Hatada et al., J. Biol., Chem., 274(2) :948-55 (1999))。同様に、Hprt遺伝子座に位置するヒトeNOSプロモーター−LacZレポーター遺伝子は、さもなければ内在性eNOSを発現する肝脈管において不活性であることが認められた(Guillot et al., Physiol. Genomics, Mar. 13, (2):77-83 (2000)。最後に、HPRT遺伝子座はX染色体上にあるので、この遺伝子座における導入遺伝子発現は無作為なX染色体不活性化に供される。雌性の全ての細胞における導入遺伝子の発現は、それ故、ホモ接合体の生成を必要とする。
国際公開公報第WO04/63381号は、相同的組換えを通して挿入される導入遺伝子の強力且つ予測可能な発現を可能にする特定常染色体遺伝子座、すなわちRosa26に関して報告している。この染色体遺伝子座は、予測可能な導入遺伝子発現パターンを有するトランスジェニック生物(例えばマウス)の効率的な作製のための「標的遺伝子組換え」アプローチに関して有用であると認められた。前記出願において提供される「標的遺伝子組換え」法は連続的実験工程を含む。対象遺伝子に機能的に連結された適切なプロモーター(例えば誘導的又は構成的な、遍在又は組織特異的プロモーター)を含む遺伝子発現カセットを創造する;その後Rosa26遺伝子座への上記遺伝子発現カセットの標的挿入のためのベクターを作製する;続いて胚幹細胞における相同的組換え又は部位特異的組換えを通してRosa26遺伝子座に上記遺伝子発現カセットを挿入する;最後にそのような遺伝的に修飾されたES細胞の胚盤胞への注入によってトランスジェニックマウスを作製する。
以前に、rosa26遺伝子座は、マウス胚幹細胞のゲノムへのレトロウイルス配列及びβ−ガラクトシダーゼ−ネオマイシン耐性融合遺伝子のランダム挿入によって特定された(Zambrowicz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 3789- 94 (1997))。rosa26プロモーターは、異なる器官において異なるレベルであるが(Vooijs et al., EMBO reports, 21:292-297 (2001))、胚及び成体マウスの両方でプロモーターを持たない遺伝子の遍在的発現を媒介すると思われた(Kisseberth et al., Dev. Biol., 214:128-138 (1999); Zambrowicz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 3789-94 (1997))。
さらに、国際公開公報第WO99/53017号は、遍在的に発現される内在性プロモーター、例えばマウスRosa26遺伝子座のプロモーターの制御下にある異種遺伝子を遍在的に発現するトランスジェニック動物を作製するための方法を述べる。R. Dacquin et al., Dev. Dynamics 224 :245-251 (2002)及びK. A. Moses et al., Genesis 31:176-180 (2001)は、異種遺伝子の発現のために国際公開公報第WO99/53017号に従って得られるトランスジェニックマウス系統R26Rを使用している。国際公開公報第WO02/098217号は、プロモーターを持たない選択カセットを転写的に活性な遺伝子座、例えばRosa26遺伝子座に標的する方法を述べる。
最後に、国際公開公報第WO03/020743号は、導入された組織特異的内在性プロモーターが少なくともある程度の組織特異的活性を有するように、保護された導入遺伝子カセットをあらかじめ定められた遺伝子座(例えばRosa26遺伝子座)に標的することによるインビボでの導入遺伝子の発現を述べる。保護された導入遺伝子カセットは、(5’から3’方向に)転写終結シグナル、外来性組織特異的プロモーター及び対象遺伝子を含む。発現パターンは主として組織特異的外来性プロモーターの性質によって決定されるので、転写終結シグナルの存在は国際公開公報第WO03/020743号の方法にとって不可欠である。
RNA干渉(RNAi)は、数年前に遺伝子発現の阻害のためのツールとして発見された (Fire, A. et al., Nature 391, 806-811 (1998))。これは、それによって1本の鎖が標的遺伝子のコード領域に相補的となる、二重鎖RNA(dsRNA)分子の細胞への導入に基づく。導入されたRNA分子と特定mRNAの対合を通して、細胞機構によってmRNAが分解される。長いdsRNAは哺乳動物細胞においてインターフェロン応答を惹起するので、このテクノロジーは当初、インターフェロン応答を示さない生物又は細胞に限定された(Bass, B. L., Nature 411, 428-429 (2001))。短い(<30bp)干渉RNA(siRNA)はインターフェロン応答を回避するという所見は、その適用を哺乳動物細胞に拡大した(Elbashir, S.M. et al., Nature 411, 494-498 (2001))。
マウスにおけるRNAiは原則的に明らかにされたが、現在のテクノロジーではインビボで体系的な遺伝子機能分析を実施することは不可能である。これまで遺伝子発現の阻害は、マウスの尾静脈への精製siRNAの注入によって達成されてきた(McCaffrey, A.P. et al., Nature 418, 38-39 (2002); Lewis, D.H. et al., Nature Genet. 32, 107-108 (2002))。このアプローチを用いると、遺伝子阻害は特定器官に限定され、数日間しか持続しない。siRNAテクノロジーのさらなる改善は、遺伝子発現ベクターを用いた短いヘアピン型RNA(shRNA)分子の細胞内転写に基づく(図1参照; Brummelkamp, T.R. et al., Science 296, 550-553 (2002); Paddison, PJ. et al, Genes Dev. 16, 948-958 (2002); Yu, J.Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 6047-6052 (2002); Sui, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 5515-5520 (2002); Paul, CP. et al., Nature Biotechnol. 20, 505-508 (2002); Xia, H. et al., Nat. Biotechnol. 10, 1006-10 (2002); Jacque, J. M. et al., Nature 418(6896) :435-8 (2002))。マウスにおけるshRNAの作用は、尾静脈へのshRNA発現ベクターの注入を通してMcCaffrey et al., 2002によって明らかにされた。やはり、遺伝子阻害は一時的であり、空間的に限定された。これらの結果は、shRNAを介した遺伝子沈黙化の機構がマウスにおいて機能性であることを示すが、構成的RNAiがトランスジェニック動物において実現できるかどうかは明らかにしていない。 Brummelkamp, T.R. et al., Science 296, 550-553 (2002), Paddison, PJ. et al., Genes Dev. 16, 948-958 (2002), Hemann, M.T. et al., Nat. Genet. 33(3):396-400 (2003); and Devroe, E. et al., BMC Biotechnol. 2(1): 15 (2002)は、培養細胞系へのshRNAベクターの安定な組込みを通して遺伝子発現の長期的な阻害を示した。これらの実験は、shRNA導入遺伝子のランダムな組込み及び適切なsiRNA発現を有するクローンについてのスクリーニングを含み、マウスでの多数の異なるshRNA導入遺伝子の試験には適用できない。最後に、いくつかの報告がトランスジェニックマウス及びラットにおけるshRNAを介した遺伝子沈黙化を明らかにしている(Hasuwa, H. et al., FEBS Lett. 532(1-2): 227-30 (2002); Carmell, M.A. et al., Nat. Struct. Biol. 10(2):91-2 (2003); Rubinson, D.A. et al., Nat. Genet. 33(3):401-6 (2003); Kunath, T. et al., Nat. Biotechnol. (Apr. 7 2003))。しかし、これらの実験もやはり、shRNA発現の一定しないレベルとパターンを生じさせるshRNA導入遺伝子のランダム組込みを含んだ。そこで、適切なshRNA発現を有するES細胞クローン又はマウス系統の試験が必要とされたが、それらは多大の労力と時間を要する作業である。
大規模設定でのRNAiを介した遺伝子抑制による遺伝子のインビボでの有効性確認は、多数の器官における十分に高いレベルでの及び予測可能なパターンを有するsiRNAの発現を必要する。標的遺伝子組換えは、生物(例えばマウスなどの哺乳動物)において導入遺伝子の再現可能な発現を達成するための唯一のアプローチを提供する。国際公開公報第WO04/035782号は、初めて、ゲノムの規定遺伝子座に組み込まれたsiRNA発現ベクターの単一コピーが、生物の多数の器官における効率的なRNAiを介した遺伝子阻害のために十分に高いレベルのsiRNAを提供できることを開示する。
胚幹(ES)細胞ゲノムの規定遺伝子座への導入遺伝子の標的組込みのために2種類の手順が記述されている。一方は胚幹細胞における相同的組換え(HR)に基づき、他方は部位特異的組換えに基づく。最初の場合、HRの低い発生率によって効率が制限される。これに対し、部位特異的組換えは、真核細胞ゲノムへの導入遺伝子の標的挿入のための強力なツールであることが明らかになってきた。
部位特異的リコンビナーゼ、例えばFlp及びCreは、それぞれFRT及びloxPと称されるそれらの標的配列の2コピーの間での組換えを媒介する。2つの不適合性標的配列の使用、例えばF3と組み合わせたFRT(Schlake & Bode, Biochemistry, 1994 Nov. 1, 33(43): 12746-51)並びに逆方向認識標的部位(Feng et al., J. Mol. Biol. 292(4):779-85 (1999))は、同様の立体配置で標的配列を担持するあらかじめ規定された染色体遺伝子座へのDNAセグメントの挿入を可能にする。この交換システムは、リコンビナーゼを介したカセット交換(RMCE;Bode & Baer, Curr Opin Biotechnol. 2001 Oct;12(5):473-80)と呼ばれる。単一組換え部位を用いるアプローチと異なり、標的産物は、交換プラスミドに暴露されない限りリコンビナーゼの永続的な影響下でも安定である(Seibler & Bode (1997) Biochemistry 36, 1740- 1747.)。
これまでのところ、ESでのRMCEの成功の例はごくわずかしか記述されていない (Feng et al., J Mol Biol. 1999 Oct l;292(4):779-85; Seibler et al., Biochemistry. 1998 May 5;37(18):6229-34; Kolb, Anal Biochem. 2001 Mar15;290(2):260-71; Belteki et al., Nat Biotechnol. 2003 Mar;21(3):321-4.; Cesari et al., 2004, Genesis, 38:87-92.)。これらの実験では、交換ベクターのランダムな組込み並びに不完全な組換えがしばしば望ましくない導入遺伝子立体配置を生じさせた。RMCEの効率は、組換え部位の選択、選択戦略,及び染色体標的に強く依存して異なると思われた。所与の遺伝子座における効率的RMCEについての判定基準は、それ故、定義されておらず、当業者にとって予測不能である。
規定遺伝子座での効率的(>90%)RMCEの唯一の例は、染色体標的として組織特異的β−カゼイン遺伝子を使用した(Kolb, Anal Biochem. 2001 Mar15;290(2):260- 71)。しかし、交換ベクターのランダムな組込み又は不完全な組換えを排除するためにHPRT遺伝子が必要であった。この戦略の適用は、それ故、HPRT陰性ES細胞に限定される。加えて、β−カゼイン遺伝子座の細胞型特異的活性は多数の組織での導入遺伝子の発現には適さないと考えられる。合わせて考慮すると、遍在的に活性な遺伝子座における効率的RMCEのための一般的戦略はこれまで一度も達成されていない。
驚くべきことに、RMCEは遍在活性遺伝子座において高い効率で有効に実施できることが見出された。本発明は:
(1)リコンビナーゼを介したカセット交換によって発現カセットを真核細胞の遍在遺伝子座に導入することを含む、プロモーター又はその不活性前駆体に作動可能に連結された短いヘアピン型RNA構築物を含む発現カセットによって修飾された遍在遺伝子座を有するトランスジェニック真核細胞を作製するための方法;
(2)(a)出発細胞のゲノムに組み込む、遍在遺伝子座に相同なフランキングDNA配列及び2つの相互に不適合性の第一リコンビナーゼ認識部位(RRS)を有するアクセプターDNAを含むターゲティングベクターでの相同的組換えによって出発真核細胞のRosa26遺伝子座に機能性DNA配列を導入すること、及び
(b)アクセプターDNAに含まれる同じ2つの相互に不適合性の第一RRSによって隣接される発現カセットを含む、ドナーDNAを含む交換ベクターを用いて、アクセプターDNAとドナーDNAのRRSの間の組換えを触媒するリコンビナーゼを利用することにより、RMCE標的部位を有する工程(a)の組換え産物のリコンビナーゼを介したカセット交換を実施すること
を含む、上記(1)の方法;
(3)トランスジェニック真核細胞がマウスに由来し、遍在遺伝子座がRosa26遺伝子座であり、及び
(i)Rosa26遺伝子座に相同なDNA配列が、マウスRosa26遺伝子座の5’及び3’フランキングアームに由来し、好ましくは前記相同DNA配列がそれぞれ配列番号4及び5に示す配列を有しており;及び/又は
(ii)ターゲティング及び交換ベクターのRRSがF3/Frtであり、及びターゲティングベクターがリコンビナーゼFlp又はその突然変異体、好ましくはFlpeをコードし;及び/又は
(iii)ターゲティングベクターが陰性選択マーカーを含み;及び/又は
(iv)交換ベクターがプロモーターを持たない陽性選択マーカーを含み;及び/又は
(v)発現カセットのプロモーターがH1又はH6であり;
最も好ましくは、ターゲティングベクターが配列番号11に示す配列を有し、交換ベクターが配列番号12に示す配列又は短いヘアピン型RNA構築物内に修飾を有するその変異体を有する、
上記(1)又は(2)の方法;
(4)上記(1)−(3)で定義される交換ベクター;
(5)上記(1)、(2)及び(3)の方法によって得られる修飾された遍在遺伝子座を有する真核細胞;
(6)上記(1)及び(3)で定義される方法を用いることを含む、修飾遍在遺伝子座を有するトランスジェニック多細胞生物を作製するための方法;
(7)トランスジェニック多細胞生物が非ヒト哺乳動物であり、前記方法が上記(3)で定義されるようにES細胞を修飾することを含む、上記(6)の方法;
(8)それぞれ、上記で定義される方法(6)及び(7)によって得られるトランスジェニック多細胞生物及び非ヒト哺乳動物;及び
(9)遺伝子機能試験、薬剤開発、疾患モデルとして等のための、上記(5)の真核細胞、上記(8)のトランスジェニック多細胞生物、又は上記(8)のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の使用
を提供する。
(1)リコンビナーゼを介したカセット交換によって発現カセットを真核細胞の遍在遺伝子座に導入することを含む、プロモーター又はその不活性前駆体に作動可能に連結された短いヘアピン型RNA構築物を含む発現カセットによって修飾された遍在遺伝子座を有するトランスジェニック真核細胞を作製するための方法;
(2)(a)出発細胞のゲノムに組み込む、遍在遺伝子座に相同なフランキングDNA配列及び2つの相互に不適合性の第一リコンビナーゼ認識部位(RRS)を有するアクセプターDNAを含むターゲティングベクターでの相同的組換えによって出発真核細胞のRosa26遺伝子座に機能性DNA配列を導入すること、及び
(b)アクセプターDNAに含まれる同じ2つの相互に不適合性の第一RRSによって隣接される発現カセットを含む、ドナーDNAを含む交換ベクターを用いて、アクセプターDNAとドナーDNAのRRSの間の組換えを触媒するリコンビナーゼを利用することにより、RMCE標的部位を有する工程(a)の組換え産物のリコンビナーゼを介したカセット交換を実施すること
を含む、上記(1)の方法;
(3)トランスジェニック真核細胞がマウスに由来し、遍在遺伝子座がRosa26遺伝子座であり、及び
(i)Rosa26遺伝子座に相同なDNA配列が、マウスRosa26遺伝子座の5’及び3’フランキングアームに由来し、好ましくは前記相同DNA配列がそれぞれ配列番号4及び5に示す配列を有しており;及び/又は
(ii)ターゲティング及び交換ベクターのRRSがF3/Frtであり、及びターゲティングベクターがリコンビナーゼFlp又はその突然変異体、好ましくはFlpeをコードし;及び/又は
(iii)ターゲティングベクターが陰性選択マーカーを含み;及び/又は
(iv)交換ベクターがプロモーターを持たない陽性選択マーカーを含み;及び/又は
(v)発現カセットのプロモーターがH1又はH6であり;
最も好ましくは、ターゲティングベクターが配列番号11に示す配列を有し、交換ベクターが配列番号12に示す配列又は短いヘアピン型RNA構築物内に修飾を有するその変異体を有する、
上記(1)又は(2)の方法;
(4)上記(1)−(3)で定義される交換ベクター;
(5)上記(1)、(2)及び(3)の方法によって得られる修飾された遍在遺伝子座を有する真核細胞;
(6)上記(1)及び(3)で定義される方法を用いることを含む、修飾遍在遺伝子座を有するトランスジェニック多細胞生物を作製するための方法;
(7)トランスジェニック多細胞生物が非ヒト哺乳動物であり、前記方法が上記(3)で定義されるようにES細胞を修飾することを含む、上記(6)の方法;
(8)それぞれ、上記で定義される方法(6)及び(7)によって得られるトランスジェニック多細胞生物及び非ヒト哺乳動物;及び
(9)遺伝子機能試験、薬剤開発、疾患モデルとして等のための、上記(5)の真核細胞、上記(8)のトランスジェニック多細胞生物、又は上記(8)のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の使用
を提供する。
本発明の方法は、現在の前核注入のテクノロジーに比べていくつかの利点を提供する。特に、ターゲティングベクターは単一コピーの遺伝子発現カセットの挿入を可能にし、それによって多数のコピーの配置による導入遺伝子発現の変化を回避する。常染色体Rosa26遺伝子座を挿入部位として選択することにより、非ヒト動物における挿入された導入遺伝子の発現パターンが予測可能である;染色体位置作用によるランダムなX染色体不活性化及び/又は変調が回避される。これはまた、所与の導入遺伝子について多数のトランスジェニック系統を作製し、分析する必要性を排除する。最後に、部位特異的組込みのためのRosa26ターゲティングベクターは、多数の遺伝子発現カセットのために使用することができる。さらに、このRMCE戦略は、トランスジェニック動物及び生体器官におけるRNAを介した遺伝子沈黙化である、構成的及び誘導的遺伝子ノックダウンのためにより大きな柔軟性を提供する。
本発明に従った「生物」という用語は、脊椎動物、例えば哺乳動物(例えば非ヒト動物、例えばマウス及びラットを含むげっ歯動物;及びヒト)又は非哺乳動物(例えば魚)であり得るか、又は無脊椎動物、例えば昆虫又はぜん虫であり得るか、又は植物(高等植物、藻類又は真菌)であり得る。最も好ましい生物は、マウス及び魚である。
本発明に従った「真核細胞」及び「出発真核細胞」は、上記で定義した生物から単離して(前記生物に由来する)、インビトロで培養した細胞を含む。これらの細胞は、形質転換(不死化)又は非形質転換(生物に直接由来する;一次細胞培養)であり得る。「真核細胞」という用語はまた、真核単細胞、例えば酵母等を包含する。
本発明の方法(1)では、真核細胞が、脊椎動物、無脊椎動物及び植物を含む多細胞生物に由来し、好ましくは脊椎動物細胞であり、より好ましくはげっ歯動物、例えばマウス、ラット等を含む哺乳動物に由来するか、又は魚、例えばゼブラフィッシュに由来することが好ましい。
本発明の方法(1)では、機能性DNA配列が対象とするタンパク質/ペプチドをコードする遺伝子を含む(すなわち発現可能及び翻訳可能DNA配列である)ことが好ましく、より好ましくは前記機能性DNA配列が、(a)プロモーターに作動可能に連結された対象遺伝子を含む遺伝子発現カセットであるか、又は(b)そのような遺伝子発現カセットに(すなわち、例えばその組込み後に結果として起こる修飾反応によって、作動可能に連結された「対象プロモーター−遺伝子」構築物に)変換され得るDNA配列である。遺伝子発現カセット内の対象遺伝子は、リコンビナーゼ、レポーター遺伝子、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、製薬活性タンパク質及びペプチド、薬剤標的候補物質、疾患を引き起こす遺伝子産物、毒素等を含むが、これらに限定されない、一定の対象タンパク質/ペプチドをコードする遺伝子であり得る。
遺伝子発現カセットのプロモーター(Rosa26遺伝子に対して異種プロモーターである)は、好ましくは、構成的又は誘導的な、遍在性又は組織特異的プロモーターである。本発明に従ったベクター内の遍在プロモーターは、好ましくはポリメラーゼI、II及びIII依存性プロモーターから選択され、好ましくは、CMVプロモーター、CAGGSプロモーター、snRNAプロモーター、例えばU6、RNアーゼP RNAプロモーター、例えばH1、tRNAプロモーター、7SL RNAプロモーター、5S rRNAプロモーター等を含むが、これらに限定されないポリメラーゼII又はIII依存性プロモーターである。特に好ましい遍在プロモーターは、CAGGS、hCMV、PGKである。好ましい組織特異的プロモーターは、FABP(Saam & Gordon, J. Biol. Chem., 274:38071-38082 (1999))、Lck (Orban et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6861-5 (1992))、CamKII(Tsien et al., Cell 87: 1317-1326 (1996))、CD19 (Rickert et al., Nucleic Acids Res. 25:1317-1318 (1997))、ケラチン(Li et al., Development, 128:675-88 (201))、アルブミン(Postic & Magnuson, Genesis, 26:149-150 (2000))、aP2(Barlow et al., Nucleic Acids Res., 25 (1997))、インスリン(Ray et al., Int. J. Pancreatol. 25:157-63 (1999))、MCK (Bruning et al., Molecular Cell 2:559-569 (1998))、MyHC (Agak et al., J. Clin. Invest., 100:169-179 (1997)、WAP(Utomo et al., Nat. Biotechnol. 17: 1091-1096 (1999))、Col2A(Ovchinnikov et al., Genesis, 26:145-146 (2000))であり;好ましい誘導的プロモーター系は、Mx(Khun et al. Scinence, 269:1427-1429 (1995))、tet(Urlinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:7963-8 (2000))、Trex(Feng and Erikson, Human Gene Therapy, 10:419-27)である。適切な誘導的プロモーターは、tet、Gal4、lac等を含むが、これらに限定されない、オペレーター配列を含む上記プロモーターである。
ターゲティングベクター、組換えベクター、機能性DNA配列又は遺伝子発現カセットは、(選択)マーカー遺伝子(例えば大腸菌トランスポゾンのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子等)、リコンビナーゼ認識部位(組換えベクターの場合は、第一リコンビナーゼ認識部位とは異なり、loxP、FRT、それらの変異体等を含む)、ポリAシグナル(例えば合成ポリアデニル化部位又はヒト成長ホルモンのポリアデニル化部位等)、スプライス受容配列(例えばアデノウイルスのスプライス受容配列等)、イントロン、タンパク質検出のためのタグ、エンハンサー、選択マーカー等を含むが、これらに限定されない、1又はそれ以上の付加的な機能性配列をさらに含み得る。
好ましい実施形態では、本発明の方法(1)−(3)は相同的組換えを含む。その場合、Rosa26遺伝子座に相同なDNA配列は0.2−20kB、好ましくは1−10kBの長さであることが好ましい。方法(2)の特に好ましい実施形態では、真核細胞はマウスに由来し、Rosa26遺伝子座に相同なDNA配列はマウスRosa26遺伝子座の5’及び3’フランキングアームに由来し、好ましくは前記相同DNA配列はそれぞれ配列番号4及び5に示す配列を有しており、及びプロモーターはCAGGSプロモーターであり、最も好ましくはターゲティングベクターは配列番号7に示す配列を有する。
上述したように、本発明の方法(1)−(3)は、リコンビナーゼを介したカセット交換(RMCE)を含む。ゲノムへの導入遺伝子又はDNAセグメントの挿入は部位特異的組換えによって媒介され得る(Fukushige & Sauer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(17):7905-9 (1992))。cre又はFLPのような部位特異的リコンビナーゼは、それぞれloxP又はFRTのような2つの認識標的部位を組み換える。2つの不適合性認識標的部位(F3又はF5、Schlake & Bode, Biochemistry, 1994 Nov. 1, 33(43): 12746-51)又は逆方向認識標的部位(Feng et al., J. Mol. Biol. 292(4):779-85 (1999))の使用は、2つの不適合性又は逆方向標的部位によって隣接されるDNAセグメントの挿入を可能にする。この交換システムはリコンビナーゼを介したカセット交換(RMCE)と呼ばれている。好ましい実施形態では、FLPに基づくRMCEシステムをRosa26遺伝子座に挿入する。前記のリコンビナーゼを介した組み換えは、好ましくは:
(a1)出発細胞のゲノムに組み込む、2つの相互に不適合性の第一RRSを含むアクセプターDNAを出発細胞に導入すること、及び得られた細胞に、
(a2)上記で定義した組換えベクターを使用することにより、アクセプターDNAに含まれる同じ2つの相互に不適合性の第一RRSを含むドナーDNA、及び
(a3)アクセプターとドナーのRRSの間の組換えを触媒するリコンビナーゼ
を導入すること、の工程を含む。
(a1)出発細胞のゲノムに組み込む、2つの相互に不適合性の第一RRSを含むアクセプターDNAを出発細胞に導入すること、及び得られた細胞に、
(a2)上記で定義した組換えベクターを使用することにより、アクセプターDNAに含まれる同じ2つの相互に不適合性の第一RRSを含むドナーDNA、及び
(a3)アクセプターとドナーのRRSの間の組換えを触媒するリコンビナーゼ
を導入すること、の工程を含む。
前記のリコンビナーゼを介した組換え法では、
(i)RRSがloxP又はFRT部位又はその変異体(例えば単一突然変異体認識部位lox66及びlox71(Albert et al., The Plant J. 7:649-659 (1995))である;及び/又は
(ii)アクセプターDNAが陰性選択マーカー(例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子等)を含む;及び/又は
(iii)ドナーDNAが不活性陽性選択マーカー(例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼ等)を含む
ことが好ましい。
(i)RRSがloxP又はFRT部位又はその変異体(例えば単一突然変異体認識部位lox66及びlox71(Albert et al., The Plant J. 7:649-659 (1995))である;及び/又は
(ii)アクセプターDNAが陰性選択マーカー(例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子等)を含む;及び/又は
(iii)ドナーDNAが不活性陽性選択マーカー(例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼ等)を含む
ことが好ましい。
さらなる選択マーカーについては、その全体が参照してここに組み込まれる、米国特許第5,487,932号及び同第5,464,763号が参照される。
本発明に従ったベクター内の遍在プロモーターは、好ましくはポリメラーゼI、II及びIII依存性プロモーターから選択され、好ましくは、CMVプロモーター、CAGGSプロモーター、snRNAプロモーター、例えばU6、RNアーゼP RNAプロモーター、例えばH1、tRNAプロモーター、7SL RNAプロモーター、5S rRNAプロモーター等を含むが、これらに限定されないポリメラーゼII又はIII依存性プロモーターである。
遍在プロモーターは構成的プロモーターであり得るか、又は誘導的プロモーターであり得る。適切な誘導的プロモーターは、tet、Gal4、lac等を含むが、これらに限定されない、オペレーター配列を含む上記ポリメラーゼI、II及びIII依存性プロモーターである。
本発明の発現ベクターは、以下の特に好ましいアプローチ(構成的及び誘導的発現のため)に適する:
A.(遍在活性Pol II依存性遺伝子座(図2参照)に組み込まれる)shRNA構築物を駆動する、Pol III依存性プロモーター(構成的U6、H1等);
B.(遍在活性Pol II依存性遺伝子座(図3及び4)に組み込まれる)shRNA構築物を駆動する、Pol III依存性プロモーター(誘導的U6、H1等);又は
C.(遍在活性Pol II依存性遺伝子座(図5及び6)に組み込まれる)shRNA構築物を駆動する、ポリメラーゼII(Pol II)依存性プロモーター(誘導的CMV等)。
A.(遍在活性Pol II依存性遺伝子座(図2参照)に組み込まれる)shRNA構築物を駆動する、Pol III依存性プロモーター(構成的U6、H1等);
B.(遍在活性Pol II依存性遺伝子座(図3及び4)に組み込まれる)shRNA構築物を駆動する、Pol III依存性プロモーター(誘導的U6、H1等);又は
C.(遍在活性Pol II依存性遺伝子座(図5及び6)に組み込まれる)shRNA構築物を駆動する、ポリメラーゼII(Pol II)依存性プロモーター(誘導的CMV等)。
発現カセットの短いヘアピン型RNA構築物又はその不活性前駆体は、短いヘアピン型RNA(shRNA)又は相補的な短い干渉RNA(siRNA)鎖に対応する少なくとも1つのセグメントを含む。shRNAセグメントを発現カセット内で使用する場合、前記カセットは、好ましくは構造A−B−C又はC−B−Aのヌクレオチド(例えばDNA)配列を有する少なくとも1つのshRNAセグメントを含む。siRNAセグメントを発現カセット内で使用する場合、前記カセットは、好ましくは各々が上記で定義したような別々のプロモーター(例えば誘導的U6、H1等を含むPol IIIプロモーター)の制御下にある、少なくとも2つのDNAセグメントA及びC又はC及びAを含む。上記セグメントにおいて、
Aは、ノックダウンする遺伝子に少なくとも90%、好ましくは100%の相補的である15−35、好ましくは19−29bpのDNA配列であり(例えばホタルルシフェラーゼ;p53等)*、
Bは、発現されたRNAヘアピン分子のループを形成する、5−9bpを有するスペーサーDNA配列であり、及び
Cは、配列Aに少なくとも85%の相補的である15−35、好ましくは19−29bpのDNA配列である。
Aは、ノックダウンする遺伝子に少なくとも90%、好ましくは100%の相補的である15−35、好ましくは19−29bpのDNA配列であり(例えばホタルルシフェラーゼ;p53等)*、
Bは、発現されたRNAヘアピン分子のループを形成する、5−9bpを有するスペーサーDNA配列であり、及び
Cは、配列Aに少なくとも85%の相補的である15−35、好ましくは19−29bpのDNA配列である。
上記shRNA及びsiRNAセグメントは、終結及び/又はポリアデニル化配列をさらに含み得る。
所与の標的遺伝子のノックダウンのための適切なshRNA配列は、当技術分野において周知であるか(例えば以下の表1及び2に列記する特定shRNA配列参照)又は当業者によって容易に決定され得る。
所与の標的遺伝子のノックダウンのための適切なshRNA配列は、当技術分野において周知であるか(例えば以下の表1及び2に列記する特定shRNA配列参照)又は当業者によって容易に決定され得る。
所与の標的遺伝子のノックダウンのための適切なsiRNA配列は、当技術分野において周知であるか(例えばLee N. S. et al., J. Nat. Biotechnol. 20(5): 500-5 (2002) において言及される特定siRNA配列 gcctgtgcctcttcagctacc(配列番号215)及びgcggagacagcgacgaagagc(配列番号216)及びDu, Q. et al., Nucl. Acids Res. 21; 33(5): 1671-7 (2005) において言及される特定siRNA配列 cttattggagagagcacga(配列番号217))又は当業者によって容易に決定され得る。
本発明の方法(1)又は(2)の好ましい実施形態は以下の工程に関する:
1.遺伝子(例えばホタルルシフェラーゼ;p53)のコード領域のアンチセンス及びセンス鎖を含む短いヘアピン型DNAの作製。アンチセンスとセンス鎖は5−9bpのスペーサーによって分離する。
2.構成的又は誘導的プロモーター(Pol II又はPol III依存性)の制御下での上記shRNAの発現のための構築物の作製。
3.交換ベクターへの上記発現構築物の挿入及びその後のRMCEによるES細胞での遍在発現遺伝子座への交換ベクターの挿入。
4.ES細胞における遺伝子発現(例えばホタルルシフェラーゼ;p53)の構成的及び誘導的阻害の分析(例えばウエスタンブロット分析を通して)。
5.上記ES細胞を用いたマウスの作製及びいくつかの組織における遺伝子発現の阻害の分析(例えばホタルルシフェラーゼ;p53;例えばウエスタンブロット分析を通して)。
1.遺伝子(例えばホタルルシフェラーゼ;p53)のコード領域のアンチセンス及びセンス鎖を含む短いヘアピン型DNAの作製。アンチセンスとセンス鎖は5−9bpのスペーサーによって分離する。
2.構成的又は誘導的プロモーター(Pol II又はPol III依存性)の制御下での上記shRNAの発現のための構築物の作製。
3.交換ベクターへの上記発現構築物の挿入及びその後のRMCEによるES細胞での遍在発現遺伝子座への交換ベクターの挿入。
4.ES細胞における遺伝子発現(例えばホタルルシフェラーゼ;p53)の構成的及び誘導的阻害の分析(例えばウエスタンブロット分析を通して)。
5.上記ES細胞を用いたマウスの作製及びいくつかの組織における遺伝子発現の阻害の分析(例えばホタルルシフェラーゼ;p53;例えばウエスタンブロット分析を通して)。
本発明の実施形態(4)に従ったベクターは、安定な又は一過性の組込みに適する。前記ベクターは遺伝子導入に適する。
本発明のテクノロジーは以下の利点を提供する:
(i)トランスジェニック動物(例えばマウス)を作製することによる遺伝子発現の安定で全身的な阻害。
(ii)誘導的構築物を用いた遺伝子発現の可逆的阻害。
(i)トランスジェニック動物(例えばマウス)を作製することによる遺伝子発現の安定で全身的な阻害。
(ii)誘導的構築物を用いた遺伝子発現の可逆的阻害。
本発明者らは、遍在発現Rosa26遺伝子座における高い効率(>90%)のRMCEを示した。本発明のRMCE戦略では以下の特徴を組み合わせた:
1.本発明者らは、逆方向F3部位と組み合わせて野生型Flp標的部位(FRT)を使用する、Flpを介したRMCEを用いた。F3配列は、Flp結合エレメントの間に位置する8bpスペーサーの体系的突然変異誘発によって作製した(Schlake & Bode (1994) Biochemistry 33, 12746- 12751.)。F3/F3対は2つの野生型リコンビナーゼ認識部位(RRS)と同じ効率でFLPによって組み換えられ、一方FRT/F3対の組換えは触媒されない(Seibler & Bode (1997) Biochemistry 36, 1740- 1747.)。この特徴は、野生型と突然変異体RRSの他の対、例えば残存組換え能力を示すloxp/lox511とは対照的である(Lauth et al., 2002, Nucleic Acids Res. 30:e115)。
2.本発明者らは、交換ベクターのRMCEが成功するまで十分なリコンビナーゼ活性を与えるためにターゲティングベクターに構成的FLPe発現カセットを含めた。それ故、不完全な組換え中間体は回避されるはずである。
3.交換ベクター上のスプライス受容部位と共に陽性選択マーカーは機能性プロモーターを持たない。それ故、選択マーカーの発現は、RMCEの成功後に内在性Rosa26プロモーターによって媒介されるはずであり、交換ベクターのランダムな組込みを通してではない。
4.ターゲティングベクター上の蛍光タンパク質発現カセットは、抗生物質を含む培地の長期的培養を回避して、初期胚におけるRMCEの検出を可能にするはずである。
1.本発明者らは、逆方向F3部位と組み合わせて野生型Flp標的部位(FRT)を使用する、Flpを介したRMCEを用いた。F3配列は、Flp結合エレメントの間に位置する8bpスペーサーの体系的突然変異誘発によって作製した(Schlake & Bode (1994) Biochemistry 33, 12746- 12751.)。F3/F3対は2つの野生型リコンビナーゼ認識部位(RRS)と同じ効率でFLPによって組み換えられ、一方FRT/F3対の組換えは触媒されない(Seibler & Bode (1997) Biochemistry 36, 1740- 1747.)。この特徴は、野生型と突然変異体RRSの他の対、例えば残存組換え能力を示すloxp/lox511とは対照的である(Lauth et al., 2002, Nucleic Acids Res. 30:e115)。
2.本発明者らは、交換ベクターのRMCEが成功するまで十分なリコンビナーゼ活性を与えるためにターゲティングベクターに構成的FLPe発現カセットを含めた。それ故、不完全な組換え中間体は回避されるはずである。
3.交換ベクター上のスプライス受容部位と共に陽性選択マーカーは機能性プロモーターを持たない。それ故、選択マーカーの発現は、RMCEの成功後に内在性Rosa26プロモーターによって媒介されるはずであり、交換ベクターのランダムな組込みを通してではない。
4.ターゲティングベクター上の蛍光タンパク質発現カセットは、抗生物質を含む培地の長期的培養を回避して、初期胚におけるRMCEの検出を可能にするはずである。
方法(1)−(3)は、(上記で定義した工程(a)及び(b)に加えて)、Rosa26遺伝子座に組み込まれた所望の機能性交換カセットを有する真核細胞、好ましくはES細胞を単離すること;及び/又は(d)組み込まれた発現カセットの前駆体を修飾し、所望の修飾された機能性交換カセットを有する(ES)細胞を単離すること、の工程の1又はそれ以上をさらに含み得る。
方法(1)−(3)の工程(a)及び(b)は、好ましくはインビトロで実施される。工程(c)はインビトロ及びインビボで実施し得る。
本発明はまた、上記(1)−(3)で定義した方法を用いることを含む、修飾Rosa26遺伝子座を有するトランスジェニック多細胞生物を作製するための方法を提供する。これは、工程(a)−(c)に従って出発ES細胞を修飾することを含む、非ヒト哺乳動物を作製するための方法を含む。ES細胞はその後、以下の工程:
(d)工程(b)又は(c)で得たES細胞を胚盤胞に注入すること;及び
(e)Rosa26遺伝子座に1又はそれ以上の対象機能性遺伝子を担持するトランスジェニック非ヒト動物を作製すること(すなわち周知の交配手順によって)
の1又はそれ以上に従って処理し得る。
(d)工程(b)又は(c)で得たES細胞を胚盤胞に注入すること;及び
(e)Rosa26遺伝子座に1又はそれ以上の対象機能性遺伝子を担持するトランスジェニック非ヒト動物を作製すること(すなわち周知の交配手順によって)
の1又はそれ以上に従って処理し得る。
それぞれ方法(6)及び(7)によって得られるトランスジェニック多細胞生物及び非ヒト哺乳動物は、好ましくはそのRosa26遺伝子座に組み込まれた作動可能に機能性の遺伝子発現カセット(上記で定義したような)を有する。そのようなトランスジェニック多細胞生物及び非ヒト哺乳動物は、遺伝子機能試験、薬剤開発、疾患モデル動物として等に適する。
以下の実施例及び付属の図面によって本発明をさらに説明するが、それらは本発明を限定すると解釈されるべきではない。
(実施例)
以下の実施例及び付属の図面によって本発明をさらに説明するが、それらは本発明を限定すると解釈されるべきではない。
(実施例)
実験材料及び方法
細胞培養:ES細胞の培養及び標的突然変異誘発は、近交系及びF1胚の両方に由来するES細胞系に関してHogan et al., (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY.)、p. 253-289において述べられているように実施した(実施例1及び2)。実施例3では、Art4.12 ES細胞(Seibler et al., Nucl. Acid Res., 31(4) :e12 (2003)を使用した。
細胞培養:ES細胞の培養及び標的突然変異誘発は、近交系及びF1胚の両方に由来するES細胞系に関してHogan et al., (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY.)、p. 253-289において述べられているように実施した(実施例1及び2)。実施例3では、Art4.12 ES細胞(Seibler et al., Nucl. Acid Res., 31(4) :e12 (2003)を使用した。
マウス:全てのマウスは、Artemis Pharmaceuticals GmbHの動物施設においてマイクロアイソレーターケージ(Tecniplast Sealsave)で飼育した。四倍体胚盤胞の生成のためのB6D2F1はJanvierより入手した。polbflox/rosa(CreERT2)及びect2flox/rosa(CreERT2)マウスは、それぞれrosa(CreERT2)ESマウスをBT14と交配することによって生産した(Gu et al., Science, 265, 103-106.)。
四倍体胚相補発生法によるESマウスの生産:四倍体胚相補発生法によるマウスの生産は基本的に記述されているように実施した (Eggan et al., Proc Natl Acad Sd USA, 98, 6209-6214.)。
リガンドの投与:タモキシフェン不含塩基100mg(Sigma,T5648)をエタノール100μlに懸濁し、ヒマワリ油1ml(Sigma)に溶解した。この10mg/100μl タモキシフェン溶液を1−2分間超音波処理し、その後−20℃で保存した。経口投与のために溶液を55℃で解凍し、経口ゾンデ(FST Fine Science Tools GmbH,18061−20)によって4−8週齢のマウスに投与した。
ウエスタンブロット分析: SDS−PAGE(NuPAGE,Invitrogen)及びthe Breeze Immunodetection System(Invitrogen)を製造者のプロトコールに従って使用して、ウエスタンブロット分析を実施した。免疫検出は、ER抗体に対してはsc−543(HC−20,Santa Cruz Biotechnology,Inc.)、cre抗体に対してはPRB−106C、アクチン及びウサギポリクローナルIgG抗体(Santa Cruz Biotechnology,Inc.)に対してはアクチンsc−1616 Actin(I−19)を用いて実施した。
組織切片に関するX−Gal染色:β−ガラクトシダーゼ活性を検出するために、組織をTissue Tec OCT(Sakura Finetek Europe B.V.,The Netherlands)に包埋し、ドライアイスで凍結して、ミクロ切片に切断した。切片をスライドガラスに封入し、1−4時間室温で乾燥した。切片を室温で5分間固定溶液(0.1M PB(0.1M K2HPO4、pH7.3)中0.2%グルタルアルデヒド、5mM EGTA、2mM MgCl2)に固定し、洗浄緩衝液中(0.1M PB中2mM MgCl2、0.02%ノニデット−40)、室温で15分間ずつ3回洗った。その後、組織を、X−Gal溶液(洗浄緩衝液中、0.6mg/ml X−Gal(DMSO中にあらかじめ溶解した)、5mM カリウムヘキサシアノフェラートIII、5mM カリウムヘキサシアノフェラートII)を用いて37℃で一晩β−ガラクトシダーゼ活性に関して染色した。切片をPBS中室温で5分間ずつ2回洗い、ヌクレアーファーストレッド溶液で10分間対比染色して、蒸留水中で手早く洗浄し、一連の段階的エタノールを通して脱水し、Eukitt(Sigma,Germany)に封入した。
(標準実施例)
CreER Rosaターゲティングベクター:129SV/EV−BAC(Incyte Genomics)を、Ros26のエクソン2(Rscreen1s(GACAGGACAGTGCTTGTTTAAGG)(配列番号1)及びRscreen1as(TGACTACACAATATTGCTCGCAC)(配列番号2)を用いてマウスゲノムDNAから増幅した)に対するプローブでスクリーニングした。特定したBACクローンの中から、11kbのEcoRVサブフラグメントをpBSのHindIII部位に挿入した。2個のフラグメント(1kb SacII/XbaI及び4kb XbaIフラグメント、それぞれ配列番号4及び5)をホモロジーアームとして使用し、基本Rosa26ターゲティングベクターを作製するためにFRT隣接ネオマイシン耐性遺伝子を含むベクター(未公表)に挿入した。CAGGSプロモーター(配列番号6;ヌクレオチド1−1616)又はアデノウイルスからのスプライス受容部位(SA)(Friedrich G., Soriano P., Genes Dev., 5:1513-23 (1991)) を5’アームとFRT隣接ネオマイシン耐性遺伝子の間に挿入した。CreERT2及びポリアデニル化部位(pA;配列番号6、ヌクレオチド3921−4099)をSA又はCAGGSプロモーターの3’側でクローニングした。ベクターはCAGGSプロモーターの5’側転写終結配列を含まない。
CreER Rosaターゲティングベクター:129SV/EV−BAC(Incyte Genomics)を、Ros26のエクソン2(Rscreen1s(GACAGGACAGTGCTTGTTTAAGG)(配列番号1)及びRscreen1as(TGACTACACAATATTGCTCGCAC)(配列番号2)を用いてマウスゲノムDNAから増幅した)に対するプローブでスクリーニングした。特定したBACクローンの中から、11kbのEcoRVサブフラグメントをpBSのHindIII部位に挿入した。2個のフラグメント(1kb SacII/XbaI及び4kb XbaIフラグメント、それぞれ配列番号4及び5)をホモロジーアームとして使用し、基本Rosa26ターゲティングベクターを作製するためにFRT隣接ネオマイシン耐性遺伝子を含むベクター(未公表)に挿入した。CAGGSプロモーター(配列番号6;ヌクレオチド1−1616)又はアデノウイルスからのスプライス受容部位(SA)(Friedrich G., Soriano P., Genes Dev., 5:1513-23 (1991)) を5’アームとFRT隣接ネオマイシン耐性遺伝子の間に挿入した。CreERT2及びポリアデニル化部位(pA;配列番号6、ヌクレオチド3921−4099)をSA又はCAGGSプロモーターの3’側でクローニングした。ベクターはCAGGSプロモーターの5’側転写終結配列を含まない。
CAGGSプロモーター(Okabe, Fabs Letters 407:313-19 (1997))の制御下のCreERT2遺伝子(Fe[iota]l et al., (1997) Biochem Biophys Res Common., 237, 752-757)を、上述したようなCreER Rosaターゲティングベクターを使用することにより、ES細胞における相同的組換えによってrosa26遺伝子座に挿入した(図1)。CreERT2遺伝子に加えて、スプライス受容配列(Friedrich and Soziano (1991), Genes Dev., 9, 1513-1523)をrosa26遺伝子プロモーターの内在性活性についての対照として導入した(図1)。CreERT2についての試験基質を与えるためにloxP隣接ハイグロマイシン耐性遺伝子をrosa26の2番目の対立遺伝子に導入した(Seibler et al., Nucl. Acids. Res. Feb. 15, 2003, 31(4):(12) (2003)), in press)。両方のrosa26対立遺伝子で修飾されたES細胞を四倍体胚盤胞に注入し、完全にES細胞由来のマウスを作製した (Eggan et al., (2001). PNAS, 98, 6209-6214)。Rosa(SA−CreERT2/レポーター)及びRosa(CAGGS−CreERT2/レポーター)マウスにタモキシフェン1日5mgを5日間与え、最後の投与の3日後にレポーターの組換えを分析した。種々の器官からのゲノムDNAのサザン分析は、それぞれRosa(SA−CreERT2/レポーター)マウスにおける50%までの組換え及びRosa(CAGGS−CreERT2/レポーター)マウスにおける90%までの組換えを示した(図2A)。2番目の基質として、本発明者らはloxP隣接DNAポリメラーゼβ遺伝子セグメント(polβflox)(Gu et al., (1994). Science, 265, 103-106)を使用した。polβflox/rosa(SA−CreERT2)及びpolβflox/rosa(CAGGS−CreERT2)マウスにタモキシフェン1日5mgを5日間与え、3日後に分析した。サザンブロット分析は、rosa(SA−CreERT2/レポーター)マウスでは脳を除く全ての器官において細胞の90%以上でloxP隣接DNAポリメラーゼβ遺伝子セグメントが切り出されたことを明らかにした(図2B)。これに対し、rosa(CAGGS−CreERT2/レポーター)マウスでは誘導的組換えの度合が有意に高く、大部分の器官で100%の効率に達し、脳では70%までに達した。
rosa(SA−CreERT2)及びrosa(CAGGS−CreERT2)マウスにおけるCreERT2発現のパターンとレベルを検討するため、本発明者らは、Creに特異的な抗体を用いてウエスタン分析を実施した。CreERT2融合タンパク質に対応する74kDaバンドが、脳を含むrosa(CAGGS−CreERT2)マウスの全ての器官において検出可能であった(図3)。これに対し、rosa(SA−CreERT2)マウスでのCreERT2発現レベルはrosa(CAGGS−CreERT2)系統に比べて有意に低く、脳では検出不能であると思われた(図3)。
(標準実施例)
FABP−Cre Rosaターゲティングベクター(配列番号8):アデノウイルスからのスプライス受容部位(配列番号8、ヌクレオチド18569−18689)を、上記1.で述べた基本Rosa26ターゲティングベクターに挿入した。生じたプラスミドのSwaI及びAscI制限部位に、5’から3’方向にヒト成長ホルモン遺伝子からのポリアデニル化シグナル(配列番号8、ヌクレオチド18760−688;Bond et al, Science 289:1942-1946 (2000))、修飾Fabplプロモーター(配列番号8、ヌクレオチド702−1481; Fabpl-132ニ4x;Simon et al., J. Biol. Chem. 272:10652-10663 (1997))、合成イントロン(配列番号8、ヌクレオチド1521−1758)、Creコード配列(配列番号8、ヌクレオチド1778−2830)及び合成ポリAシグナル(配列番号8、ヌクレオチド2888−3066)を含む3195bpのXbablunt/AscI DNAフラグメントを挿入した。
FABP−Cre Rosaターゲティングベクター(配列番号8):アデノウイルスからのスプライス受容部位(配列番号8、ヌクレオチド18569−18689)を、上記1.で述べた基本Rosa26ターゲティングベクターに挿入した。生じたプラスミドのSwaI及びAscI制限部位に、5’から3’方向にヒト成長ホルモン遺伝子からのポリアデニル化シグナル(配列番号8、ヌクレオチド18760−688;Bond et al, Science 289:1942-1946 (2000))、修飾Fabplプロモーター(配列番号8、ヌクレオチド702−1481; Fabpl-132ニ4x;Simon et al., J. Biol. Chem. 272:10652-10663 (1997))、合成イントロン(配列番号8、ヌクレオチド1521−1758)、Creコード配列(配列番号8、ヌクレオチド1778−2830)及び合成ポリAシグナル(配列番号8、ヌクレオチド2888−3066)を含む3195bpのXbablunt/AscI DNAフラグメントを挿入した。
Fabpl-132ニ4xプロモーター(配列番号8;図4)の制御下のCre遺伝子を、2番目のRosa26対立遺伝子内にCreレポーター基質を担持するF1 ES細胞での相同的組換えによってRosa26遺伝子座に挿入した。Creを介した組換え時にレポーター構築物(配列番号9;図5)からのLacZ発現が活性化される。FABP−Cre/レポーター−基質二重トランスジェニックESマウスを作製するために標的ES細胞を四倍体胚盤胞に注入した。これらのマウスにおけるCre組換えパターンを、組織切片中のβ−ガラクトシダーゼ活性を分析することによって検討した(図6)。これらのマウスにおけるCreを介した組換えは腸上皮、肝及び腎の細管の上皮内の細胞の一部に限定され、それ故内在性Fabpl遺伝子の発現パターンを正確に反映した(Simon et al., J. Biol. Chem., 272: 10652-10663 (1997))。
Rosaターゲティング及び交換ベクター
Rosa26 RMCEターゲティングベクター(配列番号11):129 SV/EV−BACライブラリー(Incyte Genomics)をRosa26遺伝子座のエクソン2(配列番号3)に対するプローブでスクリーニングした。エクソン2プローブは、プライマーRscreen1s(GACAGGACAGTGCTTGTTTAAGG)(配列番号1)及びRscreen1as(TGACTACACAATATTGCTCGCAC)(配列番号2)を用いてマウスゲノムDNAから増幅した。特定したBACクローンから単離した11kbのEcoRVフラグメントをpBSのHindII部位に挿入した。11kb EcoRVフラグメントからの2個のサブフラグメント、1kb SacII/XbaI(配列番号4)及び4kb XbaIフラグメント(配列番号5)をホモロジーアームとして使用し、基本Rosa26ターゲティングベクター(配列番号10)を作製するためにFRT隣接ネオマイシン耐性遺伝子を含むベクター(未公表)に挿入した。アデノウイルスからのスプライス受容部位(SA)(Friedrich G., Soriano P., Genes Dev., 5:1513-23 (1991)) を5’アームとFRT隣接ネオマイシン耐性遺伝子の間に挿入した。細菌内のFlpを介した欠失によってネオマイシンは欠失した (Buchholz et al., Nucleic Acids Res. 1996, 24:3118-9)。標準クローニング手順によって最終的なRosa(RMCE)ターゲティングベクター(配列番号11、図7A)を作製し、このベクターは5’から3’方向に以下の順序で:ATG開始コドン、F3部位(Schlake & Bode (1994) Biochemistry 33,12746-12751;(配列番号11、ヌクレオチド1292−1339))、zsgreen ORF(Clontech;配列番号11、ヌクレオチド1407−2099)、合成ポリAシグナル(配列番号11、ヌクレオチド2121−2299)、PGK−ハイグロマイシン耐性遺伝子(配列番号11、ヌクレオチド2314−4335)、CAGGSプロモーター(配列番号11、ヌクレオチド4397−6012)、Flpe−リコンビナーゼ遺伝子(Buchholz et al., Nat Biotechnol. 1998, 16:657-62.)、合成ポリAシグナル(配列番号11、ヌクレオチド7728−7906)、及び3’ホモロジーアームの5’側のFRT部位(配列番号11、ヌクレオチド7922−7969)を有する。
Rosa26 RMCEターゲティングベクター(配列番号11):129 SV/EV−BACライブラリー(Incyte Genomics)をRosa26遺伝子座のエクソン2(配列番号3)に対するプローブでスクリーニングした。エクソン2プローブは、プライマーRscreen1s(GACAGGACAGTGCTTGTTTAAGG)(配列番号1)及びRscreen1as(TGACTACACAATATTGCTCGCAC)(配列番号2)を用いてマウスゲノムDNAから増幅した。特定したBACクローンから単離した11kbのEcoRVフラグメントをpBSのHindII部位に挿入した。11kb EcoRVフラグメントからの2個のサブフラグメント、1kb SacII/XbaI(配列番号4)及び4kb XbaIフラグメント(配列番号5)をホモロジーアームとして使用し、基本Rosa26ターゲティングベクター(配列番号10)を作製するためにFRT隣接ネオマイシン耐性遺伝子を含むベクター(未公表)に挿入した。アデノウイルスからのスプライス受容部位(SA)(Friedrich G., Soriano P., Genes Dev., 5:1513-23 (1991)) を5’アームとFRT隣接ネオマイシン耐性遺伝子の間に挿入した。細菌内のFlpを介した欠失によってネオマイシンは欠失した (Buchholz et al., Nucleic Acids Res. 1996, 24:3118-9)。標準クローニング手順によって最終的なRosa(RMCE)ターゲティングベクター(配列番号11、図7A)を作製し、このベクターは5’から3’方向に以下の順序で:ATG開始コドン、F3部位(Schlake & Bode (1994) Biochemistry 33,12746-12751;(配列番号11、ヌクレオチド1292−1339))、zsgreen ORF(Clontech;配列番号11、ヌクレオチド1407−2099)、合成ポリAシグナル(配列番号11、ヌクレオチド2121−2299)、PGK−ハイグロマイシン耐性遺伝子(配列番号11、ヌクレオチド2314−4335)、CAGGSプロモーター(配列番号11、ヌクレオチド4397−6012)、Flpe−リコンビナーゼ遺伝子(Buchholz et al., Nat Biotechnol. 1998, 16:657-62.)、合成ポリAシグナル(配列番号11、ヌクレオチド7728−7906)、及び3’ホモロジーアームの5’側のFRT部位(配列番号11、ヌクレオチド7922−7969)を有する。
交換ベクター(配列番号12):このベクターは、上述したRosa26ターゲティングベクターと同じ立体配置でF3部位及びFRT部位を含む。ベクターは標準クローニング手順を用いて作製し、5’から3’方向に以下の順序で:合成ポリAシグナル(配列番号12、ヌクレオチド23−201)、F3部位(配列番号12、ヌクレオチド216−263)、開始ATGを持たないネオマイシン耐性遺伝子(配列番号12、ヌクレオチド271−1559)、H1プロモーター(配列番号12、ヌクレオチド1763−1996)、ヘアピン配列(配列番号12、ヌクレオチド1997−2051)、及びFRT部位(配列番号12、ヌクレオチド2161−2208)を有する。
細胞培養:ES細胞培養及び相同的組換えは、先に記述されているように実施した (Hogan et al., (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY.), pp. 253-289.)。
交換ベクターによる細胞のトランスフェクション:トランスフェクションの1日前に、2×105ES細胞を2ml培地中で3cm皿にプレートした。トランスフェクションの前に、新鮮培地2mlを細胞に与えた。Fugene6試薬3μl(Roche;カタログ番号1 814 443)を無血清培地100μl(OptiMEM1とGlutamax−I Invitrogen;カタログ番号51985−035)と混合し、5分間インキュベートした。Fugene/OptiMEM溶液100μlを環状DNA2μg(c=0.33μg/μl)に添加し、15分間インキュベートした。このトランスフェクション複合体を培地に滴下し、巡回運動によって混合した。翌日、新鮮培地をトランスフェクト細胞に添加した。2日目から、培地を、250μg/ml G418(ゲネチシン;Invitrogen;カタログ番号10131−019)を含む培地に毎日交換した。トランスフェクション後7日目に、記述されている標準手順によって(Hogan et al., (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY.), pp. 253-289.)単一クローンを単離した。
RMCEのためのRosa26遺伝子座を作製するためのターゲティングベクターを図7Aに示す。ベクターは、RMCEのためのリコンビナーゼを提供するFLPe発現カセットを担持する。ハイグロマイシン耐性遺伝子を相同的組換えクローンの陽性選択のために使用した。加えて、交換ベクターの二次トランスフェクション後にRMCEを受けなかった組換えクローンを特定できるように、zsGreen遺伝子をFRTとF3部位の間に位置づけた。スプライス受容部位(SA)及びATG開始コドンは、RMCE後に内在性rosa26プロモーターを使用することによって交換ベクター上のトランケート型ネオマイシン耐性遺伝子(Δ5’neoR)の発現を促進するはずである。
ハイブリッドES細胞系ART4.12([C57BL/6×129S6/SvEvTac]F1)を相同的組換えのために使用した。これらの系統は、四倍体胚盤胞相補発生法を通して完全にES細胞由来のマウス(ESマウス)を誘導することができるからである (Seibler et al., Nucl. Acid Res., 31(4):e12 (2003)。ART4.12細胞をrosa26ターゲティングベクターでトランスフェクトし、ハイグロマイシンBを含む細胞培養培地でインキュベートした。サザンブロット分析によって確認したとき2%の頻度で独立した組換えRosa(RMCE)ES細胞クローンを得た(図8、1番目と2番目のレーン)。
交換ベクター(図7B)は、RMCEの陽性選択のためのトランケート型neoR遺伝子と共にFRT及びF3部位を担持する。shRNA発現カセットを、Rosa26遺伝子座への標的組込みのための試験導入遺伝子として使用した。ランダムに組み込まれたベクターを担持するES細胞でのトランケート型neoR遺伝子の発現を防ぐために上流のポリAシグナルを含めた。RMCE後の標的Rosa26遺伝子座の立体配置を図7Cに示す。
Rosa(RMCE)ES細胞を交換ベクターでトランスフェクトし、G418を含む培地中で選択した。G418耐性コロニーのサザンブロット分析は、クローンの>90%においてRMCEが成功裏に起こったことを明らかにした(図8)。これは、遍在的に発現される遺伝子座における標的遺伝子組換えのための効率的RMCEの初めての実証である。
shRNAトランスジェニックES細胞を四倍体胚盤胞に注入し、3週間後に3%の頻度でES細胞由来マウスを得た。15週齢マウスのリアルタイムPCR分析は、大部分の器官においてレプチン受容体mRNAの>80%低下を示し、shRNA導入遺伝子が遍在的に発現されることを指示した(Seibler et al. 2005, Nucl Acids Res 33(7) :e67)。
ヒトU6プロモーターの制御下のlacZ特異的shRNA(ヌクレオチド1998−2055、配列番号218)を、RMCEを通してART4.12/rosa26(RMCE)ES細胞に導入した(Seibler et al. 2005, Nucl Acids Res 33(7):e67)。G418耐性クローンのサザンブロット分析は、クローンの>90%においてRMCEが成功裏に起こったことを明らかにした。組換えES細胞を四倍体胚盤胞に注入し、ES細胞由来マウスを誘導した。Rosa26プロモーターに導入しておいた、遍在CAGGSプロモーターの制御下にlacZ(ヌクレオチド2161−5678、配列番号219)を担持するマウス系統を使用した交配を通して、高度発現β−ガラクトシダーゼ遺伝子が提供された。組織切片のX−Gal染色は、あらゆる単一細胞においてCAGGSプロモーターの制御下でのlacZの強力で一様な発現を明らかにし、一方shRNA構築物の存在は、細胞の圧倒的多数においてβ−ガラクトシダーゼ活性の著明な低下を生じさせた (Seibler et al. 2005, Nucl Acids Res 33(7):e67)。これらの結果は、lacZ特異的shRNAが全ての器官において効率的RNAiを媒介するのに十分なだけ発現されることを指示する。
CAGGS−Fluc(ヌクレオチド2100−5983、配列番号218)発現カセットを、rosa26遺伝子座でのRMCEを用いてES細胞ゲノムに挿入した (Seibler et al. 2005, Nucl Acids Res 33(7) :e67)。やはり、サザンブロット分析によって確認したときクローンの>90%においてRMCEが成功裏に起こっていた。組換えES細胞を胚盤胞に注入し、偽妊娠雌性への胚盤胞の導入後にマウスを得た。ヒトU6プロモーターの制御下のFluc特異的shRNA遺伝子及びCAGGS−Fluc導入遺伝子を、マウスの交配を通して組み合わせた。様々な器官からのタンパク質抽出物におけるルシフェラーゼ活性の測定は、shRNAの存在下でのルシフェラーゼの活性の強力な低下を明らかにしたが、shRNA不在下ではルシフェラーゼ活性の低下を示さず、両方の導入遺伝子が遍在的に発現されることを指示した (Seibler et al. 2005, Nucl Acids Res 33(7) :e67)。
Claims (20)
- リコンビナーゼを介したカセット交換(RMCE)によって発現カセットを真核細胞の遍在遺伝子座に導入することを含む、プロモーター又はその不活性前駆体に作動可能に連結された短いヘアピン型RNA構築物を含む発現カセットによって修飾された遍在遺伝子座を有するトランスジェニック真核細胞を作製するための方法。
- (a)出発細胞のゲノムに組み込む、遍在遺伝子座に相同なフランキングDNA配列及び2つの相互に不適合性の第一リコンビナーゼ認識部位(RRS)を有するアクセプターDNAを含むターゲティングベクターでの相同的組換えによって出発真核細胞のRosa26遺伝子座に機能性DNA配列を導入すること、及び
(b)アクセプターDNAに含まれる同じ2つの相互に不適合性の第一RRSによって隣接される発現カセットを含む、ドナーDNAを含む交換ベクターを用いて、アクセプターDNAとドナーDNAのRRSの間の組換えを触媒するリコンビナーゼを利用することにより、RMCE標的部位を有する工程(a)の組換え産物のRMCEを実施すること
を含む、請求項1に記載の方法。 - (i)真核細胞が、脊椎動物、無脊椎動物及び植物を含む多細胞生物に由来し、好ましくは脊椎動物細胞であり、より好ましくは哺乳動物、例えばヒト又はげっ歯動物、例えばマウス、ラット等を含む非ヒト哺乳動物に由来するか、又は魚、例えばゼブラフィッシュに由来する;及び/又は
(ii)真核細胞が一次細胞又は不死化細胞であり、好ましくは細胞が哺乳動物胚幹(ES)細胞である;及び/又は
(iii)遍在遺伝子座が、Rosa26、コラーゲン、β−アクチン、HPRT、U6、H1、tRNA、7SL RNA等から選択され、好ましくはRosa26遺伝子座である;及び/又は
(iv)方法がインビトロで実施される、
請求項1又は2に記載の方法。 - (i)発現カセットのプロモーターが異種プロモーターであり、好ましくは、構成的又は誘導的な、偏在性又は組織特異的プロモーターである;及び/又は
(ii)ターゲティングベクター、交換ベクター及び/又は発現カセットが、マーカー遺伝子、第一リコンビナーゼ認識部位とは異なる第二リコンビナーゼ認識部位、ポリAシグナル、イントロン等を含むが、これらに限定されない1又はそれ以上の付加的な機能性配列をさらに含む;及び/又は
(iii)ターゲティングベクター及び交換ベクターが、タンパク質検出のためのタグ、エンハンサー、選択マーカー等をさらに含む;及び/又は
(iv)ターゲティングベクターが、アクセプターDNAとドナーDNAの間の組換えを触媒するリコンビナーゼをコードする遺伝子をさらに含む;及び/又は
(v)工程(a)において遍在遺伝子座に相同なDNA配列が0.2−20kB、好ましくは1−10kBの長さである;及び/又は
(vi)相互に不適合性のRRSが、相互に不適合性のloxP、FRT、及びAtt部位又はその変異体の対から選択され、好ましくは以下の相互に不適合性のRRS対の群:F3/FRT、F5/FRT、F5/F3、lox/lox511、lox/lox2722、lox66/lox71及びAttB/AttPから選択される;及び/又は
(vii)細胞に付加され得る又は細胞によって発現され得るリコンビナーゼが、アクセプター/ドナーDNA内に存在する第一RSSのカセット交換に適するリコンビナーゼ、例えばCre、Flp、ФC31又はその突然変異体から選択される;及び/又は
(viii)短いヘアピン型RNA構築物が終止及び/又はポリアデニル化配列を含む、
請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。 - (i)遍在プロモーターが、ポリメラーゼI、II及びIII依存性プロモーターから選択され、好ましくはポリメラーゼII又はIII依存性プロモーターであり、最も好ましくはCMVプロモーター、CAGGSプロモーター、Mxプロモーター、PGKプロモーター、snRNAプロモーター、例えばU6、RNアーゼP RNAプロモーター、例えばH1、tRNAプロモーター、7SL RNAプロモーター、及び5S rRNAプロモーターであり、及び組織特異的プロモーターが、FABP、Lck、CamKII、CD19、ケラチン、アルブミン、aP2、インスリン、MCK、MyHC、WAP、Col2Aプロモーター等である;及び/又は
(ii)遍在プロモーターが構成的プロモーター又は誘導的プロモーターであり、好ましくはtet、Gal4、lac又はリコンビナーゼを介した調節のためのRRS等から選択されるオペレーター配列を含むプロモーターである、
請求項4に記載の方法。 - プロモーターが、
(i)遍在活性Pol II依存性遺伝子座に組み込むのに適したshRNA構築物を駆動する、Pol III依存性プロモーター、好ましくは構成的H1又はU6;
(ii)遍在活性Pol II依存性遺伝子座に組み込むのに適したshRNA構築物を駆動する、Pol III依存性プロモーター、好ましくは誘導的U6又はH1;又は
(iii)遍在活性Pol II依存性遺伝子座に組み込むのに適したshRNA構築物を駆動する、Pol II依存性プロモーター、好ましくは誘導的CMV
である、請求項4に記載の方法。 - 短いヘアピン型RNA構築物又はその不活性前駆体が、短いヘアピン型RNA(shRNA)又は2本の相補的な短い干渉RNA(siRNA)鎖に対応する少なくとも1つのセグメントを含み、好ましくはDNA配列A−B−C又はC−B−Aを有する少なくとも1つのshRNAセグメントを含むか、又は各々が別々の前駆体の制御下にある、少なくとも2つのsiRNAセグメントA及びC又はC及びAを含み、但し、
Aは、ノックダウンする遺伝子に少なくとも95%、好ましくは100%の相補性を有する15−35、好ましくは19−29bpのDNA配列であり、
Bは、発現されたRNAヘアピン分子のループを形成する、5−9bpを有するスペーサーDNA配列であり、及び
Cは、配列Aに少なくとも85%の相補性を有する15−35、好ましくは19−29bpのDNA配列である、
請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。 - トランスジェニック真核細胞がマウスに由来し、遍在遺伝子座がRosa26遺伝子座であり、及び
(i)Rosa26遺伝子座に相同なDNA配列が、マウスRosa26遺伝子座の5’及び3’フランキングアームに由来し、好ましくは前記相同DNA配列がそれぞれ配列番号4及び5に示す配列を有しており;及び/又は
(ii)ターゲティング及び交換ベクターのRRSがF3/Frtであり、及びターゲティングベクターがリコンビナーゼFlp又はその突然変異体、好ましくはFlpeをコードし;及び/又は
(iii)ターゲティングベクターが陰性選択マーカーを含み;及び/又は
(iv)交換ベクターがプロモーターを持たない陽性選択マーカーを含み;及び/又は
(v)発現カセットのプロモーターがH1又はH6であり;
最も好ましくは、ターゲティングベクターが配列番号11に示す配列を有し、交換ベクターが配列番号12に示す配列又は短いヘアピン型RNA構築物内に修飾を有するその変異体を有する、請求項3から7のいずれか一項に記載の方法。 - (c)遍在遺伝子座に組み込まれた所望の機能性交換カセット又はその不活性前駆体を有する真核細胞、好ましくはES細胞を単離すること;及び
(d)場合により組み込まれた発現カセットの前駆体を活性化するためにその前駆体を修飾し、所望の修飾された機能性交換カセットを有するES細胞を単離すること
の工程の1又はそれ以上をさらに含む、請求項2から8のいずれか一項に記載の方法。 - 請求項2から9で定義される発現カセット及びドナーDNAを含む交換ベクター。
- 請求項1から9に記載の方法によって得られる、修飾された遍在遺伝子座を有する真核細胞。
- (a)請求項1から9で定義される方法に従って真核細胞をトランスフェクトすること;又は
(b)請求項10で定義される交換ベクターを、対応するRMCE標的部位を有する非ヒト哺乳動物の初期胚に注入すること
を含む、修飾遍在遺伝子座を有するトランスジェニック多細胞生物を作製するための方法。 - トランスジェニック多細胞生物が非ヒト哺乳動物であり、前記遍在遺伝子座がRosa26遺伝子座であり、及び前記方法がES細胞を請求項1から9で定義されるように修飾することを含む、請求項12に記載の方法。
- (e)工程(c)又は(d)で得たES細胞を胚盤胞に注入すること;及び
(f)Rosa26遺伝子座に1又はそれ以上の対象機能性遺伝子を担持するトランスジェニック非ヒト多細胞生物又は非ヒト哺乳動物を作製すること
の工程の1又はそれ以上をさらに含む、請求項12又は13に記載の方法。 - それぞれ請求項12から14に記載の方法によって入手でき、及びその遺伝子座の少なくとも1つに組み込まれた作動可能に機能性の遺伝子発現カセットを有する、トランスジェニック多細胞生物又はそれに由来する組織培養、及びトランスジェニック非ヒト哺乳動物又はそれに由来する組織培養。
- (i)多細胞生物、又は多細胞生物に由来する組織培養又は細胞培養の細胞における構成的及び/又は誘導的遺伝子ノックダウンのための作用物質、又は(ii)請求項10で定義される交換ベクターを非ヒト哺乳動物の8細胞期胚の細胞に注入するための作用物質を生成するための、好ましくは請求項2から9で定義されるような、プロモーターの制御下での短いヘアピン型RNA構築物(shRNA)を含む交換ベクターの使用。
- 発現ベクターが、遍在遺伝子座、好ましくはそのRosa26遺伝子座における、多細胞生物のゲノム、又はその組織培養又は細胞培養の細胞のゲノムへの安定な組込みに適する、請求項16に記載の使用。
- 請求項2から9のいずれかで定義される発現ベクターを、生物、組織培養又は細胞培養の細胞のゲノム内に安定に組み込むことを含む、多細胞生物、又は前記多細胞生物に由来する組織培養又は細胞培養の細胞における構成的及び/又は誘導的遺伝子ノックダウンのための方法。
- (i)発現ベクターを多細胞生物、組織培養又は細胞培養のRosa26遺伝子座に組み込むこと;及び/又は
(ii)脊椎動物における構成的及び/又は誘導的遺伝子ノックダウンのための方法が、発現ベクターを脊椎動物のES細胞に組み込むことを含む、
請求項18に記載の方法。 - 遺伝子機能試験、薬剤開発、疾患モデル動物として等のための、請求項12に記載の真核細胞、請求項15に記載のトランスジェニック多細胞生物、組織培養又は非ヒト哺乳動物の使用。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP04103229A EP1614755A1 (en) | 2004-07-07 | 2004-07-07 | Target transgenesis of short hairpin RNA expression cassette using recombinase mediated cassette exchange |
PCT/EP2005/053245 WO2006003215A2 (en) | 2004-07-07 | 2005-07-07 | Targeted transgenesis of short hairpin rna expression cassettes using recombinase mediated cassette exchange |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008505625A true JP2008505625A (ja) | 2008-02-28 |
Family
ID=34929303
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007519804A Pending JP2008505625A (ja) | 2004-07-07 | 2005-07-07 | リコンビナーゼを介したカセット交換を用いる、短いヘアピン型rna発現カセットの標的遺伝子組換え |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20080313747A1 (ja) |
EP (2) | EP1614755A1 (ja) |
JP (1) | JP2008505625A (ja) |
AU (1) | AU2005259169A1 (ja) |
CA (1) | CA2573117A1 (ja) |
WO (1) | WO2006003215A2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012511307A (ja) * | 2008-11-28 | 2012-05-24 | オーストリア ヴィルトシャフツゼルヴィース ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 人工染色体ベクター |
JP2018164426A (ja) * | 2017-03-28 | 2018-10-25 | 国立大学法人 東京大学 | 変異型asxl1のノックインマウス |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2118278A4 (en) * | 2007-01-19 | 2010-04-14 | Sinai School Medicine | TARGETED GENE MODIFICATION OF STEM CELLS |
WO2008112226A2 (en) | 2007-03-13 | 2008-09-18 | Massachusetts Institute Of Technology | Cre-lox based gene knockdown constructs and methods of use thereof |
EP2112221A1 (en) | 2008-04-22 | 2009-10-28 | TaconicArtemis GmbH | Hybrid H1 Promoter for shRNA Expression |
DK2561078T3 (en) | 2010-04-23 | 2019-01-14 | Cold Spring Harbor Laboratory | NEW STRUCTURALLY DESIGNED SHRNAs |
US20120017289A1 (en) * | 2010-07-14 | 2012-01-19 | National Institute Of Immunology | Rapid method for generating gene knock down model |
WO2013006142A1 (en) * | 2011-07-05 | 2013-01-10 | Nanyang Technological University | A novel process and reagent for rapid genetic alterations in eukaryotic cells |
US11505792B2 (en) * | 2016-04-11 | 2022-11-22 | Applied Stemcell, Inc. | Site-specific integration of transgenes |
US20230365988A1 (en) * | 2020-11-27 | 2023-11-16 | Korea Mouse Phenotyping Center | Mouse model for bio-imaging of inflammatory signals, preparation method therefor and use thereof |
CN113584065A (zh) * | 2021-07-26 | 2021-11-02 | 赛业(苏州)生物科技有限公司 | 一种多方法联用的大片段dna重组方法 |
TW202328442A (zh) | 2021-09-10 | 2023-07-16 | 美商安進公司 | 平臺宿主對igf—培養基之適應 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004035782A2 (en) * | 2002-10-17 | 2004-04-29 | Artemis Pharmaceuticals Gmbh | Sirna mediated gene silencing in transgenic animals |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5948653A (en) * | 1997-03-21 | 1999-09-07 | Pati; Sushma | Sequence alterations using homologous recombination |
EP0939120A1 (en) * | 1998-02-27 | 1999-09-01 | Gesellschaft für biotechnologische Forschung mbH (GBF) | Method for marker-free repetitive DNA expression cassette exchange in the genome of cells or parts of cells |
US7074611B2 (en) * | 2001-04-27 | 2006-07-11 | Gie-Cerbn, Centre Europeen De Recherche En Biologie Et En Medecine (Gie) | Method for the stable inversion of DNA sequence by site-specific recombination and DNA vectors and transgenic cells thereof |
IL159015A0 (en) * | 2001-05-25 | 2004-05-12 | Genset Sa | Polypeptides, their preparation and use |
WO2003056022A2 (en) * | 2001-12-21 | 2003-07-10 | Oxford Biomedica (Uk) Limited | Method for producing a transgenic organism using a lentiviral expression vector such as eiav |
-
2004
- 2004-07-07 EP EP04103229A patent/EP1614755A1/en not_active Withdrawn
-
2005
- 2005-07-07 EP EP05769842.5A patent/EP1781796B1/en active Active
- 2005-07-07 WO PCT/EP2005/053245 patent/WO2006003215A2/en active Application Filing
- 2005-07-07 AU AU2005259169A patent/AU2005259169A1/en not_active Abandoned
- 2005-07-07 CA CA002573117A patent/CA2573117A1/en not_active Abandoned
- 2005-07-07 JP JP2007519804A patent/JP2008505625A/ja active Pending
- 2005-07-07 US US11/571,194 patent/US20080313747A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004035782A2 (en) * | 2002-10-17 | 2004-04-29 | Artemis Pharmaceuticals Gmbh | Sirna mediated gene silencing in transgenic animals |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012511307A (ja) * | 2008-11-28 | 2012-05-24 | オーストリア ヴィルトシャフツゼルヴィース ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 人工染色体ベクター |
JP2018164426A (ja) * | 2017-03-28 | 2018-10-25 | 国立大学法人 東京大学 | 変異型asxl1のノックインマウス |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2006003215A3 (en) | 2006-07-06 |
EP1781796A2 (en) | 2007-05-09 |
AU2005259169A1 (en) | 2006-01-12 |
CA2573117A1 (en) | 2006-01-12 |
US20080313747A1 (en) | 2008-12-18 |
WO2006003215A2 (en) | 2006-01-12 |
WO2006003215A9 (en) | 2012-12-27 |
EP1781796B1 (en) | 2013-09-11 |
EP1614755A1 (en) | 2006-01-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2008505625A (ja) | リコンビナーゼを介したカセット交換を用いる、短いヘアピン型rna発現カセットの標的遺伝子組換え | |
AU2004204167B2 (en) | Targeted transgenesis using the Rosa26 locus | |
US10988776B2 (en) | Methods of modifying genes in eukaryotic cells | |
CN108368502B (zh) | 使用单链dna的dna编辑 | |
Beard et al. | Efficient method to generate single‐copy transgenic mice by site‐specific integration in embryonic stem cells | |
Ohtsuka et al. | Pronuclear injection-based mouse targeted transgenesis for reproducible and highly efficient transgene expression | |
JP2021518141A (ja) | CRISPR/Cas系を使用した動物での転写モジュレーション | |
JP2018531013A (ja) | 細胞ゲノムの誘導性改変 | |
JP2018531013A6 (ja) | 細胞ゲノムの誘導性改変 | |
JP2021500867A (ja) | ヒト化ttr遺伝子座を含む非ヒト動物および使用方法 | |
JP2020533957A (ja) | Crisprリポーター非ヒト動物およびその使用 | |
US20090210955A1 (en) | Shrna and sirna expression in a living organism under control of a codon-optimized repressor gene | |
US20030084468A1 (en) | Methods of expressing transgenes | |
Pryzhkova et al. | Adaptation of the AID system for stem cell and transgenic mouse research | |
US20150232879A1 (en) | Conditional expression of transgenes in vivo | |
JP2023511626A (ja) | ヒト化pnpla3遺伝子座を含む非ヒト動物および使用方法 | |
Lye et al. | Technologies for the study of epididymal-specific genes | |
EP2327788A1 (en) | Conditional expression of transgenes in vivo | |
Class et al. | Patent application title: CONDITIONAL EXPRESSION OF TRANSGENES IN VIVO Inventors: Laura Schebelle (Erding, DE) Frank Schnutgen (Alzenau, DE) Thomas Floss (Munchen, DE) | |
US20050022259A1 (en) | Transgenic animal model for cancer and stem cells | |
JP2019126289A (ja) | ターゲティングベクター | |
Vidal et al. | Transgenic Technology and Its Role in Understanding Normal and Abnormal Mammalian Development | |
US20090025097A1 (en) | Shrna and sirna and mirna expression in a living organism under control of a codon-optimized repressor gene |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080602 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110405 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20111011 |