JP2023511626A - ヒト化ｐｎｐｌａ３遺伝子座を含む非ヒト動物および使用方法 - Google Patents

ヒト化ｐｎｐｌａ３遺伝子座を含む非ヒト動物および使用方法 Download PDF

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Abstract

ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物、ならびにそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物を作製および使用する方法が提供される。ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む非ヒト動物細胞または非ヒト動物は、ヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質またはキメラＰＮＰＬＡ３ンタンパク質を発現し、その断片はヒトＰＮＰＬＡ３に由来する。ヒトＰＮＰＬＡ３を標的化するように設計されたヌクレアーゼ剤などのヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬のインビボ有効性を評価するために、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含むそのような非ヒト動物を使用するための方法が提供される。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
この出願は、２０２０年１月２８日に出願された米国出願第６２／９６６，８３７号の利益を主張し、これはすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＥＦＳ ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表への参照
ファイル５５４１８７ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔに記載された配列表は３０８キロバイトであり、２０２１年１月２０日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。
パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）は、肝臓および脂肪組織において最も高い発現を伴う脂肪滴関連タンパク質である。これは、脂肪肝、線維症、および肝硬変に関与する遺伝子として同定されている。慢性肝疾患の適応症には、満たされていない大きな必要性が存在する。脂肪症および脂肪性肝炎の分子機構におけるＰＮＰＬＡ３についての生物学的役割を理解することは、大きな関心対象である。
ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む、非ヒト動物、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物ゲノム、ならびにそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物ゲノムを作製および使用する方法が提供される。非ヒト動物ＰＮＰＬＡ３遺伝子のヒト化に使用するためのヒト化非ヒト動物ＰＮＰＬＡ３遺伝子、ヌクレアーゼ剤および／または標的化ベクター、ならびにそのようなヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子を作製および使用する方法も提供される。
一態様では、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む、非ヒト動物、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物ゲノムが提供される。一態様では、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む、非ヒト動物、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物ゲノムが提供され、ヒト化ＰＮＰＬＡ３タンパク質は、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座から発現される。いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物ゲノムにおいて、非ヒト動物、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物ゲノムは、それらのゲノムにおいて、ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座を含み、内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座のセグメントは、削除され、対応するヒトＰＮＰＬＡ３配列で置き換えられている。
いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物ゲノムでは、ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座は、ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインを含むＰＮＰＬＡ３タンパク質をコードする。いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物ゲノムでは、ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインは、配列番号５の１４８位に対応する位置において野生型である。いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物ゲノムでは、ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインは、Ｉ１４８Ｍ突然変異および／またはＫ４３４Ｅ突然変異を含む。任意選択的に、ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインは、Ｉ１４８Ｍ突然変異およびＫ４３４Ｅ突然変異を含む。任意選択的に、ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインは、配列番号１０に記載される配列を含み、任意選択的に、ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインは、配列番号２０に示されるコード配列によってコードされる。任意選択的に、ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインは、Ｋ４３４Ｅ突然変異を含むが、Ｉ１４８Ｍ突然変異を含まない。任意選択的に、ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインは、配列番号６５に記載される配列を含み、任意選択的に、ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインは、配列番号６６に示されるコード配列によってコードされる。いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物ゲノムでは、ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインは、野生型ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインである。任意選択的に、ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインは、配列番号８に記載される配列を含み、任意選択的に、ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインは、配列番号１８に示されるコード配列によってコードされる。
いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物ゲノムでは、ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座は、ヒトＰＮＰＬＡ３膜貫通ドメインを含むＰＮＰＬＡ３タンパク質をコードする。任意選択的に、ヒトＰＮＰＬＡ３膜貫通ドメインは、配列番号７に記載される配列を含み、任意選択的に、ヒトＰＮＰＬＡ３膜貫通ドメインは、配列番号１７に記載されるコード配列によってコードされる。
いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物ゲノムでは、ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座は、ヒトＰＮＰＬＡ３細胞質ドメインを含むＰＮＰＬＡ３タンパク質をコードする。任意選択的に、ヒトＰＮＰＬＡ３細胞質ドメインは、配列番号６に記載される配列を含み、任意選択的に、ヒトＰＮＰＬＡ３細胞質ドメインは、配列番号１６に記載されるコード配列によってコードされる。
いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物ゲノムでは、コード配列および非コード配列の両方を含む内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の領域が削除され、コード配列および非コード配列の両方を含む対応するヒトＰＮＰＬＡ３配列で置き換えられている。いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物ゲノムでは、ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座は、内因性Ｐｎｐｌａ３プロモーターを含み、ヒトＰＮＰＬＡ３配列は、内因性Ｐｎｐｌａ３プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物ゲノムでは、内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の少なくとも１つのイントロンおよび少なくとも１つのエキソンが削除され、対応するヒトＰＮＰＬＡ３配列で置き換えられている。
いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物ゲノムでは、ヒトＰＮＰＬＡ３コード配列全体が、内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座に挿入されている。任意選択的に、ヒトＰＮＰＬＡ３開始コドンとヒトＰＮＰＬＡ３終止コドンとの間に配列を含むヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子座の領域が、内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座に挿入されている。
いくつかのこのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物ゲノムでは、ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子座の５’ＵＴＲが、内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座に挿入され、ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子座の３’ＵＴＲが、内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座に挿入されているか、またはヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子座の５’ＵＴＲおよびヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子座の３’ＵＴＲの両方が、内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座に挿入されている。
いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物ゲノムでは、最後のエキソンを除く内因性Ｐｎｐｌａ３エキソンのすべてが、ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座において削除されている。任意選択的に、介在するすべてのイントロンを含む、最初のエキソンから最後から２番目のエキソンまでの内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の領域が、ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座において削除されている。
いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物ゲノムでは、内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の最後のイントロンの全部または一部が、ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座において削除されていない。任意選択的に、ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座において削除されていない内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の最後のイントロンの部分は、内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の下流の遺伝子の発現に影響を与える調節エレメントを含む。
いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物ゲノムでは、介在するすべてのイントロンを含む、最初のエキソンから最後から２番目のエキソンまでの内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の領域が、ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座において削除され、ヒトＰＮＰＬＡ３開始コドンとヒトＰＮＰＬＡ３終止コドンとの間に配列を含むヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子座の領域で置き換えられており、ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座は、内因性Ｐｎｐｌａ３プロモーターを含み、ヒトＰＮＰＬＡ３配列は、内因性Ｐｎｐｌａ３プロモーターに作動可能に連結されている。任意選択的に、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座によってコードされるＰＮＰＬＡ３タンパク質は、Ｉ１４８Ｍ突然変異および／またはＫ４３４Ｅ突然変異を含む。任意選択的に、ヒト化ＰＩＮＰＬＡ３遺伝子座によってコードされるＰＮＰＬＡ３タンパク質は、野生型ヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質である。
いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物ゲノムでは、（ｉ）ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座におけるヒトＰＮＰＬＡ３配列は、配列番号６２または６９に記載の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を含み、かつ／／または（ｉｉ）ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座は、配列番号５、９、もしくは６３に記載の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を含むタンパク質をコードし、かつ／または（ｉｉｉ）ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座は、配列番号１５、１９、もしくは６４に記載の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を含むコード配列を含み、かつ／または（ｉｖ）ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座は、配列番号２１、２２、６７、もしくは６８に記載の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を含む。
いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物ゲノムでは、ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座は、選択カセットまたはレポーター遺伝子を含まない。
いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物ゲノムでは、非ヒト動物は、ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座についてホモ接合性である。
いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物ゲノムでは、非ヒト動物は、その生殖系列にヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む。
いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物ゲノムでは、非ヒト動物は、哺乳動物である。任意選択的に、非ヒト動物はラットまたはマウスである。任意選択的に、非ヒト動物はマウスである。
いくつかのそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物ゲノムでは、非ヒト動物の肝臓（例えば、固形飼料を与えられた条件下）もしくは非ヒト動物細胞におけるヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座から、または非ヒト動物ゲノムからのＲＮＡ発現は、対照非ヒト動物（例えば、固形飼料を与えられた条件下）の肝臓もしくは対照非ヒト動物細胞における非ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座から、または対照非ヒト動物ゲノムからのＲＮＡ発現より高い。任意選択的に、固形飼料を与えられた条件下での非ヒト動物の肝臓におけるヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座からのＲＮＡ発現は、高ショ糖食（ＨＳＤ）または高フルクトース食（ＨＦＤ）条件下の非ヒト動物の肝臓におけるヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座からのＲＮＡ発現の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、または少なくとも２５％である。
別の態様では、ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を生成するための標的化ベクターであって、内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトＰＮＰＬＡ３配列で置き換えられている、標的化ベクターが提供される。いくつかのこのような標的化ベクターでは、標的化ベクターは、内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の５’標的配列を標的とする５’相同性アームと内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の３’標的配列を標的とする３’相同性アームとが隣接する対応するヒトＰＮＰＬＡ３配列を含む挿入核酸を含む。
別の態様では、ヒト化非ヒト動物ＰＮＰＬＡ３遺伝子であって、非ヒト動物Ｐｎｐｌａ３遺伝子のセグメントが削除され、対応するヒトＰＮＰＬＡ３配列で置き換えられている、ヒト化非ヒト動物ＰＮＰＬＡ３遺伝子が提供される。
別の態様では、インビボでヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の活性を評価する方法が提供される。いくつかのそのような方法は、（ａ）ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む上記の非ヒト動物のうちのいずれかにヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬を投与することと、（ｂ）非ヒト動物におけるヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の活性を評価することと、を含む。
いくつかのそのような方法において、投与することは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介送達、流体力学的送達（ＨＤＤ）、または注射を含む。
いくつかのそのような方法において、ステップ（ｂ）は、非ヒト動物の肝臓におけるヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の活性を評価することを含む。いくつかのそのような方法において、ステップ（ｂ）は、肝脂肪含有量を測定すること、および／または非ヒト動物における肝脂肪滴中のＰＮＰＬＡ３レベルを測定することを含む。
いくつかのそのような方法において、ステップ（ｂ）は、ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座によってコードされるＰＮＰＬＡ３メッセンジャーＲＮＡの発現を測定することを含む。いくつかのそのような方法において、ステップ（ｂ）は、ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座によってコードされるＰＮＰＬＡ３タンパク質の発現を測定することを含む。
いくつかのそのような方法において、ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬は、ゲノム編集剤であり、ステップ（ｂ）は、ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座の改変を評価することを含む。任意選択的に、ステップ（ｂ）は、ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座内の挿入または欠失の頻度を測定することを含む。
いくつかのそのような方法において、ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬は、ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子の領域を標的化するように設計されたヌクレアーゼ剤を含む。任意選択的に、ヌクレアーゼ剤は、Ｃａｓタンパク質およびヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を標的化するように設計されたガイドＲＮＡを含む。任意選択的に、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。
いくつかのそのような方法において、ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬は、外因性ドナー核酸を含み、外因性ドナー核酸は、ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的化するように設計されている。任意選択的に、外因性ドナー核酸は、ＡＡＶを介して送達される。いくつかのそのような方法において、ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬は、ＲＮＡｉ剤またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかのそのような方法において、ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬は、抗原結合タンパク質である。いくつかのそのような方法において、ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬は、小分子である。
別の態様では、インビボでヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の活性を最適化する方法が提供される。いくつかのそのような方法は、（Ｉ）インビボでヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の活性を評価する上記の方法のいずれかを、そのゲノム内にヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む第１の非ヒト動物において１回目に実行することと、（ＩＩ）可変要素を変更し、ステップ（Ｉ）の方法を、そのゲノム内にヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む第２の非ヒト動物において変更された可変要素を用いて２回目に実行することと、（ＩＩＩ）ステップ（Ｉ）のヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の活性をステップ（ＩＩ）のヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の活性と比較し、より高い活性をもたらす方法を選択することと、を含む。
いくつかのそのような方法において、ステップ（ＩＩ）における変更された可変要素は、ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬を非ヒト動物に導入する送達方法である。いくつかのそのような方法において、ステップ（ＩＩ）における変更された可変要素は、ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬を非ヒト動物に導入する投与経路である。いくつかのそのような方法において、ステップ（ＩＩ）における変更された可変要素は、非ヒト動物に導入されたヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の濃度または量である。いくつかのそのような方法において、ステップ（ＩＩ）における変更された可変要素は、非ヒト動物に導入されたヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の形態である。いくつかのそのような方法において、ステップ（ＩＩ）における変更された可変要素は、非ヒト動物に導入されたヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬である。
別の態様では、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む上記の非ヒト動物のいずれかを作製する方法が提供される。
いくつかのそのような方法は、（ａ）非ヒト動物宿主胚に、ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座をそのゲノムに含む遺伝子改変された非ヒト動物胚性幹（ＥＳ）細胞であって、内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトＰＮＰＬＡ３配列で置き換えられている、非ヒト動物胚性幹（ＥＳ）細胞を導入することと、（ｂ）非ヒト動物宿主胚を代理母において妊娠させることであって、代理母は、ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座を含むＦ０子孫遺伝子改変非ヒト動物を産生する、妊娠させることと、を含む。
いくつかのそのような方法は、（ａ）非ヒト動物１細胞期胚のゲノムを改変して、そのゲノムに、内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトＰＮＰＬＡ３配列で置き換えられたヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座を含み、それにより、非ヒト動物の遺伝子改変胚を生成することと、（ｂ）非ヒト動物の遺伝子改変胚を代理母において妊娠させることであって、代理母が、ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座を含むＦ０子孫遺伝子改変非ヒト動物を産生する、妊娠させることと、を含む。
いくつかのそのような方法は、（ａ）非ヒト動物胚性幹（ＥＳ）細胞に、内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の５’標的配列に対応する５’相同性アームと内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の３’標的配列に対応する３’相同性アームとが隣接するヒトＰＮＰＬＡ３配列を含む核酸インサートを含む標的化ベクターを導入することであって、標的化ベクターが内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座を組換えて、そのゲノムにヒトＰＮＰＬＡ３配列を含むヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む遺伝子改変された非ヒトＥＳ細胞を産生する、導入することと、（ｂ）遺伝子改変された非ヒトＥＳ細胞を非ヒト動物宿主胚に導入することと、（ｃ）非ヒト動物宿主胚を代理母において妊娠させることであって、代理母は、ヒトＰＮＰＬＡ３配列を含むヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座をそのゲノムに含むＦ０子孫遺伝子改変非ヒト動物を産生する、妊娠させることと、を含む。任意選択的に、標的化ベクターは、少なくとも１０ｋｂの長さの大きな標的化ベクターであるか、または５’および３’相同性アームの合計は、少なくとも１０ｋｂの長さである。
いくつかのそのような方法は、（ａ）非ヒト動物１細胞期胚に、内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の５’標的配列に対応する５’相同性アームと内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の３’標的配列に対応する３’相同性アームとが隣接するヒトＰＮＰＬＡ３配列を含む核酸インサートを含む標的化ベクターを導入することであって、標的化ベクターが内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座を組換えて、そのゲノムにヒトＰＮＰＬＡ３配列を含むヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む遺伝子改変された非ヒト１細胞期胚を産生する、導入することと、（ｂ）遺伝子改変された非ヒト動物１細胞期胚を代理母において妊娠させて、ヒトＰＮＰＬＡ３配列を含むヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座をそのゲノムに含む遺伝子改変されたＦ０世代非ヒト動物を産生することと、を含む。
いくつかのそのような方法において、ステップ（ａ）は、内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座内の標的配列を標的化するヌクレアーゼ剤を導入することをさらに含む。任意選択的に、ヌクレアーゼ剤は、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む。任意選択的に、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。任意選択的に、ステップ（ａ）は、内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座内の第２の標的配列を標的化する第２のガイドＲＮＡを導入することをさらに含む。任意選択的に、ステップ（ａ）は、内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座内の第３の標的配列を標的とする第３のガイドＲＮＡおよび内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座内の第４の標的配列を標的とする第４のガイドＲＮＡを導入することをさらに含む。
いくつかのそのような方法において、非ヒト動物は、マウスまたはラットである。任意選択的に、非ヒト動物は、マウスである。
（正確な縮尺ではない）マウスＰｎｐｌａ３遺伝子座のヒト化のための標的化スキームの概略図を示す。図の上部は、内因性野生型マウスＰｎｐｌａ３遺伝子座ならびにＩ１４８ＭおよびＫ４３４Ｅ突然変異を伴う内因性ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子座を示し、図の下部は、自己削除選択カセットがある場合またはない場合のヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を示す。マウス５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）は白いボックスで指定され、マウスエキソン（コード配列）は薄い灰色のボックスで指定され、ヒト５’および３’ＵＴＲは前方斜め線のボックスで指定され、ヒトエキソン（コード配列）は黒色のボックスで指定される。自己削除ユビキチンピューロマイシン選択カセットは、縦線のボックスで指定される。 （正確な縮尺ではない）マウスＰｎｐｌａ３遺伝子座のヒト化をスクリーニングするためのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイの概略図を示す。対立遺伝子獲得（ＧＯＡ）アッセイには、８１６４ｈＴＵおよび８１６４ｈＴＤが含まれる。対立遺伝子喪失（ＬＯＡ）アッセイには、８１６４ｍＴＵ、９１４６ｍＴＭ、および８１６４ｍＴＤが含まれる。ＣＲＩＳＰＲアッセイには、９１４６ｍＴＧＵ２および９１４６ｍＴＧＤ２が含まれる。突然変異アッセイは、８１６４ｈＴＵ ＡＳとして示される。ｍＰｎｐｌａ３ ＧＵ、ＧＵ２、ＧＤ、およびＧＤ２についてのガイドＲＮＡ標的配列の位置も示され、ガイドＲＮＡ標的配列が提供される。 野生型マウスＰＮＰＬＡ３タンパク質、野生型ヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質、ならびにＩ１４８ＭおよびＫ４３４Ｅ突然変異を伴うヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質（それぞれ、ｍＰＮＰＬＡ３、ｈＰＮＰＬＡ３、およびｈＰＮＰＬＡ３＿ｍｕｔ）のアラインメントを示す。細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、および内腔ドメインが示され、Ｉ１４８ＭおよびＫ４３４Ｅ突然変異の位置がボックスで囲まれている。 （正確な縮尺ではない）マウスＰｎｐｌａ３遺伝子座のヒト化のための標的化スキームの概略図を示す。図の上部は、内因性野生型マウスＰｎｐｌａ３遺伝子座ならびにＫ４３４Ｅ突然変異を伴う内因性ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子座を示し、図の下部は、自己削除選択カセットがある場合またはない場合のヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を示す。マウス５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）は白いボックスで指定され、マウスエキソン（コード配列）は薄い灰色のボックスで指定され、ヒト５’および３’ＵＴＲは前方斜め線のボックスで指定され、ヒトエキソン（コード配列）は黒色のボックスで指定される。自己削除ユビキチンピューロマイシン選択カセットは、縦線のボックスで指定される。 ヒト化ＰＮＰＬＡ３マウスの表現型検査および特徴付けのための研究タイムラインを示す。ＢＷ＝体重。ＨＳＤ＝高ショ糖食。 マウスＰｎｐｌａ３野生型肝臓およびヒト化マウスＰＮＰＬＡ３－Ｉ１４８Ｍ／Ｋ４３４Ｅ肝臓からのヒト化ＰＮＰＬＡ３およびマウスＰｎｐｌａ３のＲＴ－ＰＣＲを示す。ＲＮＡレベルは、ｍＴＢＰに正規化された。マウスは、４週間、固形飼料、高ショ糖食（ＨＳＤ）、または高フルクトース食（ＨＦｒｕＤ）を与えられた。＊＝固形飼料とＨＳＤまたはＨＦＤとを比較。＾＝同じ食事でＷＴとヒト化とを比較。＊＊＝ｐ＜０．０１。＊＊＊＝ｐ＜０．００１。＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。 マウスＰｎｐｌａ３野生型およびヒト化ＰＮＰＬＡ３－Ｉ１４８Ｍ／Ｋ４３４Ｅマウス肝臓からのヒトＰＮＰＬＡ３およびマウスＰｎｐｌａ３のＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションを示す。マウスは、４週間、固形飼料、高ショ糖食（ＨＳＤ）、または高フルクトース食（ＨＦＤ）を与えられた。＊＊＝ｐ＜０．０１。＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
定義
本明細書で互換的に使用される、「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、コード化および非コード化アミノ酸ならびに化学的または生化学的に修飾または誘導体化したアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を含む。これらの用語には、修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドなどの修飾されたポリマーも含まれる。「ドメイン」という用語は、特定の機能または構造を有するタンパク質またはポリペプチドの任意の部分を指す。
タンパク質は、「Ｎ末端」および「Ｃ末端」を有すると言われている。「Ｎ末端」という用語は、遊離アミン基（－ＮＨ２）を有するアミノ酸によって終端されたタンパク質またはポリペプチドの開始部に関する。「Ｃ末端」という用語は、遊離カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）によって終端されたアミノ酸鎖（タンパク質またはポリペプチド）の末端部に関する。
本明細書で互換的に使用される、「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはそれらの類似体もしくは修飾バージョンを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含む。これらには、一本鎖、二本鎖、および多重鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、ならびにプリン塩基、ピリミジン塩基、または他の天然、化学的に修飾された、生化学的に修飾された、非天然、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。
１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸塩がホスホジエステル結合を介して一方向で、その隣の３’酸素に結合する手法でオリゴヌクレオチドを作製するように、モノヌクレオチドが反応するため、核酸は、「５’末端」および「３’末端」を有すると言われている。オリゴヌクレオチドの末端は、その５’リン酸塩がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に連結されていない場合、「５’末端」と称される。オリゴヌクレオチドの末端は、その３’酸素が別のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸塩に連結されていない場合、「３’末端」と称される。核酸配列は、より大きなオリゴヌクレオチドの内部に存在するとしても、５’および３’末端を有するとも言われ得る。線状または環状ＤＮＡ分子のいずれかにおいて、別個の要素は、「上流」または「下流」の５’もしくは３’要素であると称される。
「ゲノムに組み込まれた」という用語は、ヌクレオチド配列が細胞のゲノムに組み込まれるように、細胞に導入されている核酸を指す。細胞のゲノムへの核酸の安定した組み込みのために、任意のプロトコルが使用され得る。
「標的化ベクター」という用語は、相同組換え、非相同末端結合媒介ライゲーション、または細胞のゲノム中の標的位置への組換えの任意の他の手段によって導入され得る組換え核酸を指す。
「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源の少なくとも１つの要素を含み、かつウイルスベクター粒子へのパッケージングに十分な、またはそれを許容する要素を含む、組換え核酸を指す。ベクターおよび／または粒子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他の核酸を、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで細胞に導入する目的で利用することができる。ウイルスベクターの多くの形態が既知である。
細胞、組織（例えば、肝臓サンプル）、脂肪滴、タンパク質、および核酸に関して「分離された」という用語は、通常インサイチュで存在し得る他の細菌、ウイルス、細胞、または他の成分に関して比較的精製されている細胞、組織（例えば、肝臓サンプル）、脂肪滴、タンパク質、および核酸を含み、細胞、組織（例えば、肝臓サンプル）、脂肪滴、タンパク質、および核酸の実質的に純粋な調製物までを含み、ならびにそれらの実質的に純粋な調製物を含む。「単離された」という用語はまた、天然に存在する対応物を有さず、化学的に合成され、それにより他の細胞、組織（例えば、肝臓サンプル）、脂肪滴、タンパク質、および核酸が実質的に混入していないか、またはそれらに天然に付随する（例えば、他の細胞タンパク質、ポリヌクレオチド、もしくは他の成分）ほとんどの他の成分（例えば、細胞成分）から分離もしくは精製されている細胞、組織（例えば、肝臓サンプル）、脂肪滴、タンパク質、および核酸も含む。
「野生型」という用語は、（変異体、病変した、改変したなどとは対照的に）正常な状態または文脈に見られるような構造および／または活性を有する実体を含む。野生型遺伝子およびポリペプチドは、多くの場合、複数の異なる形態（例えば、対立遺伝子）で存在する。
「内因性配列」という用語は、ラット細胞またはラット内で天然に存在する核酸配列を指す。例えば、マウスの内因性Ｐｎｐｌａ３配列は、マウスのＰｎｐｌａ３遺伝子座で天然に存在する天然のＰｎｐｌａ３配列を指す。
「外因性」分子または配列には、その形態の細胞には通常存在しない分子または配列が含まれる。通常の存在には、細胞の特定の発生段階および環境条件に関する存在が含まれる。外因性分子または配列には、例えば、内因性配列のヒト化バージョンなど、細胞内の対応する内因性配列の変異バージョンが含まれ得るか、または細胞内であるが、異なる形態の（すなわち、染色体内ではない）内因性配列に対応する配列が含まれ得る。対照的に、内因性分子または配列は、その形態で、特定の細胞において、特定の発生段階で、特定の環境条件下で通常存在する分子または配列を含む。
核酸またはタンパク質の文脈で使用される場合の「異種」という用語は、核酸またはタンパク質が、同じ分子内で一緒に自然に発生しない少なくとも２つのセグメントを含むことを示す。例えば、「異種」という用語は、核酸のセグメントまたはタンパク質のセグメントに関して使用される場合、核酸またはタンパク質が、自然界で互いに同じ関係（例えば、一緒に結合）で見出されない２つ以上のサブ配列を含むことを示す。一例として、核酸ベクターの「異種」領域は、自然界で他の分子と関連して見出されない、別の核酸分子内の、または別の核酸分子に結合した核酸のセグメントである。例えば、核酸ベクターの異種領域は、自然界のコード配列に関連して見出されない配列に隣接するコード配列を含み得る。同様に、タンパク質の「異種」領域は、自然界の他のペプチド分子（例えば、融合タンパク質、またはタグ付きタンパク質）に関連して見出されない、別のペプチド分子内にあるか、またはそれに結合しているアミノ酸のセグメントである。同様に、核酸またはタンパク質は、異種標識または異種分泌または局在化配列を含み得る。
「コドン最適化」は、アミノ酸を指定する３塩基対のコドンの組み合わせの多様性によって示されるように、コドンの縮重を利用し、一般に、天然アミノ酸配列を維持しながら、天然配列の少なくとも１つのコドンを、宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって、特定の宿主細胞における発現の増強のために核酸配列を修飾するプロセスを含む。例えば、ＰＮＰＬＡ３タンパク質をコードする核酸は、天然に存在する核酸配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、または他の任意の宿主細胞を含む、所与の原核細胞または真核細胞においてより高い頻度で使用される代替コドンへと改変することができる。コドン使用表は、例えば「コドン使用データベース」で容易に入手できる。これらの表は、様々な方法で適合させることができる。すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＮａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８：２９２を参照されたい。特定の宿主における発現のための特定の配列のコドン最適化のためのコンピュータアルゴリズム（例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅを参照のこと）もまた利用可能である。
「遺伝子座」という用語は、遺伝子（または重要な配列）、ＤＮＡ配列、ポリペプチドコード配列、または生物のゲノムの染色体上の位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）の特定の位置（ｌｏｃａｔｉｏｎ）を指す。例えば、「Ｐｎｐｌａ３遺伝子座」は、Ｐｎｐｌａ３遺伝子、Ｐｎｐｌａ３ＤＮＡ配列、ＰＮＰＬＡ３をコードする配列、またはそのような配列が常駐すると同定されている生物のゲノムの染色体上のＰｎｐｌａ３の位置の特定の位置を指し得る。「Ｐｎｐｌａ３遺伝子座」は、例えば、エンハンサー、プロモーター、５’および／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、またはそれらの組み合わせを含む、Ｐｎｐｌａ３遺伝子の調節エレメントを含み得る。
「遺伝子」という用語は、自然に存在する場合、少なくとも１つのコーディング領域と少なくとも１つの非コーディング領域を含む可能性のある染色体内のＤＮＡ配列を指す。産物（例えば、非限定的に、ＲＮＡ産物および／またはポリペプチド産物）をコードする染色体中のＤＮＡ配列は、非コードイントロンで中断されたコード領域および５’端と３’端の両方のコード領域に隣接して位置する配列を含み得、遺伝子が全長のｍＲＮＡ（５’および３’の非翻訳配列を含む）に対応するようなる。追加的に、調節配列を含む他の非コード配列（例えば、非限定的に、プロモーター、エンハンサー、および転写因子結合部位）、ポリアデニル化シグナル、配列内リボソーム進入部位、サイレンサー、絶縁配列、およびマトリックス結合領域も遺伝子に存在し得る。これらの配列は、遺伝子のコード領域に近接（例えば、非限定的に、１０ｋｂ以内）し得るか、または離れた部位にあり得、それらは、遺伝子の転写と翻訳のレベルまたは速度に影響を及ぼす。
「対立遺伝子」という用語は、遺伝子のバリアント形態を指す。いくつかの遺伝子は、染色体上の同じ位置、または遺伝子座に位置する様々な異なる形態を有する。二倍体生物は、各遺伝子座に２つの対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各対は、特定の遺伝子座の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座に２つの同一の対立遺伝子がある場合はホモ接合として、および２つの対立遺伝子が異なる場合はヘテロ接合として記載されている。
「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩが特定のポリヌクレオチド配列のための適切な転写開始部位でＲＮＡ合成を開始することを指示することができるＴＡＴＡボックスを通常含むＤＮＡの調節領域である。プロモーターは、転写開始速度に影響を及ぼす他の領域をさらに含み得る。本明細書に開示されるプロモーター配列は、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの転写を調節する。プロモーターは、本明細書に開示される１つ以上の細胞型（例えば、マウス細胞、ラット細胞、多能性細胞、１細胞期胚、分化細胞、またはそれらの組み合わせ）において活性であり得る。プロモーターは、例えば、構成的に活性なプロモーター、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、時間的に制限されたプロモーター（例えば、発生的に調節されたプロモーター）、または空間的に制限されたプロモーター（例えば、細胞特異的または組織特異的プロモーター）であり得る。プロモーターの例は、例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２において見出すことができ、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
「作動可能な連結」または「作動可能に連結されている」とは、その両方の成分が正常に機能し、かつ成分の少なくとも１つが他の成分のうちの少なくとも１つに及ぶ機能を媒介し得る可能性を許すような、２つ以上の成分（例えば、プロモーターおよび別の配列エレメント）の並列を含む。例えば、プロモーターが、１つ以上の転写調節因子の存在または非存在に応じてコード配列の転写のレベルを制御する場合、そのプロモーターは、コード配列に作動可能に連結され得る。作動可能な連結は、そのような配列が相互に近接していること、またはトランスに作用する（例えば、調節配列が、コード配列の転写を制御するために離れて作用し得る）ことを含み得る。
本明細書で提供される方法および組成物は、様々な異なる成分を使用する。記載全体の一部の成分には、活性バリアントおよび断片を有し得る。「機能性」という用語は、生物学的活性または機能を示すタンパク質または核酸（またはその断片、もしくはバリアント）の生来の能力を指す。機能的断片またはバリアントの生物学的機能は、元の分子と比較して同じであり得るか、または実際に変更され得る（例えば、それらの特異性または選択性または有効性に関して）が、分子の基本的な生物学的機能を保持する。
「バリアント」という用語は、集団で最も一般的な配列とは異なるヌクレオチド配列（例えば、１ヌクレオチド）、または集団で最も一般的な配列とは異なるタンパク質配列（例えば、１アミノ酸）を指す。
「断片」という用語は、タンパク質に言及する場合、全長タンパク質よりも短いか、または少ないアミノ酸を有するタンパク質を意味する。「断片」という用語は、核酸に言及する場合、全長の核酸よりも短いか、または少ないヌクレオチドを有する核酸を意味する。断片は、例えば、タンパク質断片を指す場合、Ｎ末端断片（すなわち、タンパク質のＣ末端の一部の除去）、Ｃ末端断片（すなわち、タンパク質のＮ末端の一部の除去）、または内部断片（すなわち、タンパク質のＮ末端とＣ末端の各々の一部の除去）であり得る。断片は、例えば、核酸断片を指す場合、５’断片（すなわち、核酸の３’末端の一部の除去）、３’断片（すなわち、核酸の５’末端の一部の除去）、または内部断片（すなわち、核酸の５’末端と３’末端の各々の一部の除去）であり得る。
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウィンドウで最大の一致のためにアラインさせる場合、同じである２つの配列の残基を指す。タンパク質に関して、配列同一性のパーセンテージを使用する場合、同一ではない残基位置は多くの場合に、保存的アミノ酸置換によって異なり、その保存的アミノ酸置換では、アミノ酸残基は同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されており、したがって、分子の機能特性を変化させない。配列が保存的置換で異なる場合、配列同一性パーセントを、置換の保存的性質について補正するために、上方に調整され得る。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われている。この調整を行う手段は、周知である。典型的には、これは、保存的置換を完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとしてスコアリングして、それによって、配列同一性パーセンテージを増加させることを含む。したがって、例えば、同一のアミノ酸が１のスコアを与えられ、非保存的置換が０のスコアを与えられる場合に、保存的置換は、０～１のスコアを与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で実行されるように計算される。
「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインされた配列（完全にマッチする残基の数が最大）を比較することによって決定される値を含み、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントのための（付加また欠失を含まない）参照配列と比較した場合に、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に発生する位置の数を決定して一致した位置の数を得ること、一致した位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割ること、および結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。別段の定めがない限り（例えば、短い方の配列が、連結された非相同配列を含む）、比較ウィンドウは、比較される２つの配列のうちの短い方の完全長である。
別段の記載がない限り、配列同一性／類似性の値は、次のパラメータ：５０のＧＡＰ重量および３の長さ重量、ならびにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用するヌクレオチド配列の同一性％および類似性％；８のＧＡＰ重量および２の長さ重量、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用するアミノ酸配列の同一性％および類似性％；またはその任意の同等のプログラムを使用し、ＧＡＰバージョン１０を使用して得られた値を含む。「同等のプログラム」は、問題の任意の２つの配列について、ＧＡＰバージョン１０によって生成された対応するアラインメントと比較した場合、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の一致および同一のパーセント配列同一性を有するアラインメントを生成する任意の配列比較プログラムを含む。
「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列中に通常存在するアミノ酸の、類似のサイズ、電荷、または極性の、異なるアミノ酸との置換を指す。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、またはロイシンなどの非極性（疎水性）残基の、別の非極性残基との置換が含まれる。同様に、保存的置換の例には、アルギニンとリジンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、またはグリシンとセリンとの間などの、１つの極性（親水性）残基の別のものとの置換が含まれる。追加的に、リジン、アルギニン、もしくはヒスチジンなどの塩基性残基から別のものへの置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などのある酸性残基から別の酸性残基への置換は、保存的置換の追加の例である。非保存的置換の例には、非極性（疎水性）アミノ酸残基、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、もしくはメチオニンから極性（親水性）残基、例えば、システイン、グルタミン、グルタミン酸、もしくはリシンへの、および／または極性残基から非極性残基への置換が含まれる。典型的なアミノ酸の分類を以下で要約する。
Figure 2023511626000002
「相同」配列（例えば、核酸配列）は、例えば、既知の参照配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるような、既知の参照配列と同一であるか、または実質的に同様である配列を含む。相同配列は、例えば、オルソログ配列およびパラロガス配列を含み得る。例えば、相同遺伝子は典型的には、種分化事象（オルソログ遺伝子）または遺伝子重複事象（パラロガス遺伝子）のいずれかを介して、共通の祖先ＤＮＡ配列に由来する。「オルソログ」遺伝子には、種分化によって共通の祖先遺伝子から進化した様々な種の遺伝子が含まれる。オルソログは典型的には、進化の過程で同じ機能を保持する。「パラロガス」遺伝子には、ゲノム内の重複によって関連する遺伝子が含まれる。パラログは、進化の過程で新しい機能を進化させることができる。
「インビトロ」という用語は、人工環境、および人工環境（例えば、試験管または単離された細胞もしくは細胞株）内で生じるプロセスまたは反応を含む。「インビボ」という用語は、天然環境（例えば、細胞または生物または身体）、および天然環境内で生じるプロセスまたは反応を含む。「エクスビボ」という用語は、個体の身体から取り出された細胞、およびそのような細胞内で起こるプロセスまたは反応を含む。
「レポーター遺伝子」という用語は、異種プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントに作動可能に連結されたレポーター遺伝子配列を含む構築物が、プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントの活性化に必要な因子を含む（または含むように作製され得る）細胞に導入された場合に容易かつ定量的にアッセイされる遺伝子生成物（典型的には酵素）をコードする配列を有する核酸を指す。レポーター遺伝子の例には、これらに限定されないが、ベータガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）をコードする遺伝子、細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする遺伝子、および蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。「レポータータンパク質」は、レポーター遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。
本明細書で使用される「蛍光レポータータンパク質」という用語は、蛍光に基づいて検出可能なレポータータンパク質を意味し、蛍光は、レポータータンパク質から直接、レポータータンパク質の蛍光発生基質上の活性、または蛍光タグ付き化合物への結合に親和性のあるタンパク質のいずれかからのものであり得る。蛍光タンパク質の例には、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、およびＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、およびＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＢＦＰ、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、およびＴ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＣＦＰ、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、およびＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ＲＦＰ、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、およびＪｒｅｄ）、オレンジ色蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、およびｔｄＴｏｍａｔｏ）、およびフローサイトメトリー方法により細胞内の存在を検出することができる任意の他の好適な蛍光タンパク質が挙げられる。
二本鎖切断（ＤＳＢ）に応答した修復は、主に２つの保存されたＤＮＡ修復経路である相同組換え（ＨＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して生じる。すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｓｐａｒｅｋ＆Ｈｕｍｐｈｒｅｙ（２０１１）Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２２（８）：８８６－８９７を参照されたい。同様に、外因性ドナー核酸によって媒介された標的核酸の修復は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝的情報の交換の任意のプロセスを含み得る。
「組換え」という用語は、２つのポリヌクレオチド間で遺伝的情報を交換する任意のプロセスを含み、任意のメカニズムによって起こり得る。組換えは、相同性指向修復（ＨＤＲ）または相同組換え（ＨＲ）を介して起こり得る。ＨＤＲまたはＨＲには、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし得る核酸修復の形式が含まれ、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験した分子）の修復のテンプレートとして「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝的情報の伝達をもたらす。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、そのような伝達は、壊れた標的とドナーとの間に形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／またはドナーが標的の一部となる遺伝的情報を再合成するために使用される合成依存性鎖アニーリング、および／または関連するプロセスを含み得る。場合によっては、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部が標的ＤＮＡに組み込まれる。すべての目的のために各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ １５３：９１０－９１８、Ｍａｎｄａｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７：ｅ４５７６８：１－９、およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：５３０－５３２を参照されたい。
非相同末端結合（ＮＨＥＪ）は、相同テンプレートを必要とせずに、切断末端を互いにまたは外因性配列への直接ライゲーションによる、核酸における二本鎖切断の修復を含む。ＮＨＥＪによる非隣接配列のライゲーションは、多くの場合、二本鎖切断の部位の近くで欠失、挿入、または転座をもたらし得る。例えば、ＮＨＥＪはまた、切断末端を外因性ドナー核酸の末端と直接ライゲーションすることにより、外因性ドナー核酸の標的化組み込みをもたらすことができる（すなわち、ＮＨＥＪベースの捕捉）。そのようなＮＨＥＪ媒介標的化組み込みは、相同性指向修復（ＨＤＲ）経路が容易に使用することができない場合（例えば、非分裂細胞、一次細胞、および相同性に基づくＤＮＡ修復を不十分に行う細胞）、外因性ドナー核酸の挿入に好ましい場合がある。加えて、相同性指向修復とは対照的に、切断部位に隣接する配列同一性の大きな領域に関する知識は必要なく、これは、ゲノム配列の知識が限られているゲノムを有する生物への標的化挿入を試みるときに有益であり得る。組み込みは、外因性ドナー核酸と切断されたゲノム配列との間の平滑末端のライゲーションを介して、または切断されたゲノム配列においてヌクレアーゼ剤によって生成されたものに適合するオーバーハングに隣接する外因性ドナー核酸を使用する粘着末端（すなわち、５’または３’オーバーハングを有する）のライゲーションを介して進行することができる。例えば、ＵＳ２０１１／０２０７２２、ＷＯ２０１４／０３３６４４、ＷＯ２０１４／０８９２９０、およびＭａｒｅｓｃａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２３（３）：５３９－５４６を参照されたく、これらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。平滑末端がライゲーションされている場合、断片結合に必要なマイクロホモロジーの生成領域のために、標的および／またはドナーの切除が必要になる場合があり、これにより、標的配列に望ましくない改変が生じ得る。
１つ以上の列挙された要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、具体的に列挙されていない他の要素を含み得る。例えば、タンパク質を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」組成物は、タンパク質を単独で、または他の成分との組み合わせで含み得る。「から本質的になる」という移行句は、請求項の範囲が、特許請求の範囲に記載された特定の要素、および特許請求された発明の基本的かつ新規の特性に実質的に影響をしない要素を包含すると解釈されることを意味する。したがって、本発明の請求項で使用される場合の「から本質的になる」という用語は、「含む」と同等であると解釈されることを意図するものではない。
「任意選択的な」または「任意選択的に」は、引き続いて記載された事象または状況が起こっても起こらなくてもよく、および説明が、当該事象または状況が起こる場合の例およびそれが起こらない場合の例を含むことを意味する。
値の範囲の指定は、その範囲内の、またはその範囲を定義するすべての整数、およびその範囲内の整数によって定義されるすべての部分範囲を含む。
文脈から特に明らかでない限り、「約」という用語は記載された値の±５である値を包含する。
「および／または」という用語は、関連する列挙された項目の１つ以上のありとあらゆる可能な組み合わせ、ならびに代替物（「または」）で解釈されるときの組み合わせの欠如を指し、包含する。
「または」という用語は、特定のリストの任意の１つのメンバーを指し、そのリストのメンバーの任意の組み合わせも含む。
冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」の単数形は、文脈が別段に明確に規定していない限り、複数形の言及を含む。例えば、「タンパク質」または「少なくとも１つのタンパク質」という用語は、それらの混合物を含む複数のタンパク質を含み得る。
統計的に有意なとは、ｐ≦０．０５を意味する。
Ｉ．概要
本明細書では、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む、非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物、ならびにそのような非ヒト動物細胞および非ヒト動物を作製および使用する方法が開示される。非ヒト動物Ｐｎｐｌａ３遺伝子をヒト化する標的化遺伝子改変を含むヒト化非ヒト動物Ｐｎｐｌａ３遺伝子、ならびに非ヒト動物Ｐｎｐｌａ３遺伝子のヒト化に使用するためのヌクレアーゼ剤および標的化ベクターも本明細書に開示される。ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む非ヒト動物から調製された単離された肝臓サンプル（例えば、分画肝臓サンプル）、およびヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む非ヒト動物から調製された単離された脂肪滴も本明細書に開示される。
ＰＮＰＬＡ３は、肝臓および脂肪組織において最も高い発現を伴う脂肪滴関連タンパク質である。これは、ヒトの遺伝分析により、脂肪肝、線維症、および肝硬変に関与する遺伝子として同定されている。ＰＮＰＬＡ３における一般的なミスセンス突然変異（Ｉ１４８ＭまたはＩｌｅ１４８→Ｍｅｔ１４８）は、脂肪症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、および肝がんのリスクが高いことと関連している。ＰＮＰＬＡ３ Ｉ１４８Ｍマウスが生成されているが、マウスとヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質との間の類似性が低いため、ヒトＰＮＰＬＡ３機能の理解は非常に限られている。さらに、ヒトおよびマウスＰＮＰＬＡ３の発現パターンは大きく異なる。固形飼料を与えられた条件下でのマウス肝臓Ｐｎｐｌａ３ＲＮＡ発現レベルは非常に低く、これはヒトで観察されるものと一致していない。本明細書に開示されるヒト化ＰＮＰＬＡ３マウスは、固形飼料を与えられた条件下で、より高いＰＮＰＬＡ３ ＲＮＡ発現レベルを示し、ヒトで観察されるものとより一致している。本明細書で生成されたヒト化ＰＮＰＬＡ３野生型およびＩ１４８Ｍマウスは、ヒトＰＮＰＬＡ３野生型およびＩ１４８Ｍ機能を研究するための新しいモデルである。ヒト化ＰＮＰＬＡ３ Ｉ１４８Ｍマウスは、非ヒト化マウスよりも高い基底ＲＮＡ発現を示し、これは、ヒトで観察されたものとより一致している。
ＩＩ．ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む非ヒト動物
本明細書に開示される非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物は、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む。ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む細胞または非ヒト動物は、ヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質または部分的にヒト化されたキメラＰＮＰＬＡ３タンパク質を発現し、天然のＰＮＰＬＡ３タンパク質の１つ以上の断片がヒトＰＮＰＬＡ３からの対応する断片（例えば、細胞外ドメインの全部または一部）で置き換えられている。
Ａ．ＰＮＰＬＡ３
本明細書に記載される細胞および非ヒト動物は、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む。１－アシルグリセロール－３－リン酸Ｏ－アシルトランスフェラーゼＰＮＰＬＡ３（ＰＮＰＬＡ３、アシルグリセロールトランスアシラーゼ、アジポヌトリン、ＡＤＰＮ、カルシウム非依存性ホスホリパーゼＡ２－イプシロン、ｉＰＬＡ２－イプシロン、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、およびパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有タンパク質３としても既知である）は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子（パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３、ＡＤＰＮ、Ｃ２２ｏｒｆ２０、ｉＰＬＡ２－イプシロン、およびｉＰＬＡ（２）イプシロンとしても既知である）によってコードされる。ＰＮＰＬＡ３は、肝臓および脂肪組織において最も高い発現を伴う脂肪滴関連タンパク質である。ＰＮＰＬＡ３は、脂肪細胞においてトリアシルグリセロール加水分解を媒介するトリアシルグリセロールリパーゼである。膜に結合しているように見えるＰＮＰＬＡ３は、脂肪細胞におけるエネルギー使用／貯蔵のバランスに関与し得る。ＰＮＰＬＡ３は、１－アシル－ｓｎ－グリセロール３－リン酸（２－リゾホスファチジン酸／ＬＰＡ）の補酵素Ａ（ＣｏＡ）依存性アシル化を特異的に触媒して、トリグリセリドとグリセロリン脂質の両方についての重要な代謝中間体および前駆体であるホスファチジン酸（ＰＡ）を生成する。これは、他のリゾリン脂質をエステル化しない。これはさらに、低トリアシルグリセロールリパーゼおよびＣｏＡ非依存性アシルグリセロールトランスアシラーゼ活性を有しており、したがって、トリグリセリドのアシル鎖リモデリングにおいて役割を果たし得る。
１４８位での多型変化は、インスリン分泌レベルおよび肥満に影響を与える。ＰＮＰＬＡ３における一般的なミスセンス突然変異（Ｉ１４８ＭまたはＩｌｅ１４８→Ｍｅｔ１４８）は、非アルコール性脂肪性肝疾患、ならびに進行型の非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）および肝硬変についてのリスクに関連している。Ｉ１４８Ｍバリアントは、肝臓の脂肪含有量および血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ濃度の増加に関連している。Ｉ１４８Ｍバリアントは、１－アシルグリセロール－３－リン酸Ｏ－アシルトランスフェラーゼ活性を増加させる。肥満の対象では、Ｉｌｅ－１４８対立遺伝子の保因者における肥満度指数およびウエストが高くなっている。Ｉｌｅ－１４８保因者は、経口ブドウ糖負荷試験に応答してインスリン分泌の低下も示す。Ｍｅｔ－１４８対立遺伝子保因者は、肥満度指数が低いほどインスリン抵抗性が高いようである。
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を有する対象および有しない対象では、Ｉ１４８Ｍ Ｋ４３４Ｅバリアントは、組織学的ＮＡＦＬＤおよび脂肪性肝炎と関連していたが、Ｋ４３４ＥバリアントのないＩ１４８Ｍは関連していなかった。４３４位にリジンが存在すると、ＰＮＰＬＡ３の発現が減少し、脂肪症および肝障害の素因に対するＩ１４８Ｍバリアントの影響が減少する。すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｏｎａｔｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ６３（３）：７８７－７９８を参照されたい。Ｋ４３４Ｅ突然変異は、Ｉ１４８Ｍ表現型を増強するが、それ自体で表現型を生じるには十分ではない。
ヒトＰＮＰＬＡ３は第２２染色体上の２２ｑ１３．３１に位置する（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ ８０３３９、アセンブリＧＲＣｈ３８．ｐ１３（ＧＣＦ＿０００００１４０５．３９）、位置ＮＣ＿００００２２．１１（４３９２３８０５．．４３９４７５８２））。この遺伝子は９個のエキソンを有すると報告されている。野生型ヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質には、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９ＮＳＴ１が割り当てられている。ヒトＰＮＰＬＡ３の少なくとも２つのアイソフォームが既知である（Ｑ９ＮＳＴ１－１およびＱ９ＮＳＴ１－２）。１つのアイソフォーム（標準的なアイソフォーム）である、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０７９５０１．２（Ｑ９ＮＳＴ１－１）についての配列は、配列番号５に記載される。このアイソフォームをコードするｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０２５２２５．３が割り当てられ、配列番号２４に記載される。例示的なコード配列（ＣＤＳ）は、配列番号１５（ＣＣＤＳ ＩＤ ＣＣＤＳ１４０５４．１）に記載される。Ｉ１４８ＭおよびＫ４３４Ｅ突然変異を有するヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質についての配列は配列番号９に記載され、対応するコード配列は配列番号１９に記載される。Ｋ４３４Ｅ突然変異を有するヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質についての配列は配列番号６３に記載され、対応するコード配列は配列番号６４に記載される。配列番号５に記載される完全長のヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質は、細胞質ドメイン（アミノ酸１～４１）、膜貫通ドメイン（アミノ酸４２～６２）、および内腔ドメイン（アミノ酸６３～４８１）を含む、４８１個のアミノ酸を有する。これらのドメイン間の描写は、ＵｎｉＰｒｏｔで示されるとおりである。ヒトＰＮＰＬＡ３への言及には、標準的な（野生型）形態ならびにすべての対立遺伝子形態およびアイソフォームが含まれる。任意の他の形態のヒトＰＮＰＬＡ３は、野生型形態との最大アライメントに対して番号が付けられたアミノ酸を有し、アラインされたアミノ酸は同じ番号で示される。
マウスＰｎｐｌａ３は第１５染色体上の１５；１５ Ｅ２に位置する（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ １１６９３９；アセンブリＧＲＣｍ３８．ｐ６（ＧＣＦ＿０００００１６３５．２６）；位置ＮＣ＿００００８１．６（８４１６７７７６．．８４１８９５２１））。この遺伝子は８個のエキソンを有すると報告されている。野生型マウスＰＮＰＬＡ３タンパク質には、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９１ＷＷ７が割り当てられている。マウスＰＮＰＬＡ３についての配列である、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿４７３４２９．２は、配列番号１に記載されている。マウスＰＮＰＬＡ３をコードする例示的なｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０５４０８８．３が割り当てられ、配列番号２３に記載されている。例示的なコード配列（ＣＤＳ）は、配列番号１１（ＣＣＤＳ ＩＤ ＣＣＤＳ３７１６５．１）に記載されている。配列番号１に記載される標準的な完全長マウスＰＮＰＬＡ３タンパク質は、細胞質ドメイン（アミノ酸１～４２）、膜貫通ドメイン（アミノ酸４３～６３）、および内腔ドメイン（アミノ酸６４～４１３）を含む、４１３個のアミノ酸を有する。これらのドメイン間の描写は、ＵｎｉＰｒｏｔで示されるとおりである。マウスＰＮＰＬＡ３への言及には、標準的な（野生型）形態ならびにすべての対立遺伝子形態およびアイソフォームが含まれる。任意の他の形態のマウスＰＮＰＬＡ３は、野生型形態との最大アライメントに対して番号が付けられたアミノ酸を有し、アラインされたアミノ酸は同じ番号で示される。
ラットＰｎｐｌａ３は第７染色体上の７ｑ３４に位置する（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ ３６２９７２、アセンブリＲｎｏｒ＿６．０（ＧＣＦ＿０００００１８９５．５）、位置ＮＣ＿００５１０６．４（１２５０３４７６０．．１２５０５６１６５））。この遺伝子は９個のエキソンを有すると報告されている。野生型ラットＰＮＰＬＡ３タンパク質には、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｄ３Ｚ９Ｊ９が割り当てられている。ラットＰＮＰＬＡ３についての配列である、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１２６９２５３．１は、配列番号２５に記載されている。ラットＰＮＰＬＡ３をコードするｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１２８２３２４．１が割り当てられ、配列番号２６に記載されている。例示的なコード配列（ＣＤＳ）は、配列番号２７に記載されている。配列番号２５に記載される標準的な完全長ラットＰＮＰＬＡ３タンパク質は、４２５個のアミノ酸を有する。これらのドメイン間の描写は、ＵｎｉＰｒｏｔで示されるとおりである。ラットＰＮＰＬＡ３への言及には、標準的な（野生型）形態ならびにすべての対立遺伝子形態およびアイソフォームが含まれる。任意の他の形態のラットＰＮＰＬＡ３は、野生型形態との最大アライメントに対して番号が付けられたアミノ酸を有し、アラインされたアミノ酸は同じ番号で示される。
Ｂ．ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座
ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座であって、内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトＰＮＰＬＡ３配列（例えば、対応するヒトＰＮＰＬＡ３ゲノム配列）で置き換えられており、ヒト化ＰＮＰＬＡ３タンパク質が、ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座から発現される、ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座が本明細書に開示される。ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座は、Ｐｎｐｌａ３遺伝子全体が、対応するオーソロガスなヒトＰＮＰＬＡ３配列で置き換えられているＰｎｐｌａ３遺伝子座であり得るか、またはそれは、Ｐｎｐｌａ３遺伝子の一部のみが、対応するオーソロガスなヒトＰＮＰＬＡ３配列（すなわち、ヒト化）で置き換えられているＰｎｐｌａ３遺伝子座であり得るか、またはそれは、Ｐｎｐｌａ３遺伝子の一部が削除され、オーソロガスなヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子の一部が挿入されているＰｎｐｌａ３遺伝子座であり得る。いくつかの例では、挿入されるオーソロガスなヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子座の部分は、内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座から削除されるよりも多くのヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む。内因性Ｐｎｐｌａ３配列の特定のセグメントに対応するヒトＰＮＰＬＡ３配列は、ヒトＰＮＰＬＡ３および内因性Ｐｎｐｌａ３が最適にアラインされる（完全に一致する残基の最大数）ときに内因性Ｐｎｐｌａ３配列の特定のセグメントとアラインするヒトＰＮＰＬＡ３の領域を指す。対応するオーソロガスなヒト配列は、例えば、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）またはゲノムＤＮＡを含み得る。任意選択的に、対応するオーソロガスなヒトＰＮＰＬＡ３配列のコドン最適化型が使用され得、非ヒト動物におけるコドン使用頻度に基づいてコドン最適化されるように改変される。置換または挿入された（すなわち、ヒト化された）領域は、エキソンなどのコード領域、イントロンなどの非コード領域、非翻訳領域、もしくは調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、もしくは転写リプレッサー結合要素）、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。一例として、ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子の１、２、３、４、５、６、７、８、または９個すべてのエキソンに対応するエキソンをヒト化することができる。例えば、ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子のエキソン１～９に対応するエキソンをヒト化することができる。例として、ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子の１、２、３、４、５、６、７、８、もしくは９つすべてのエキソンは、内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座に挿入され得、かつ／またはヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子の１、２、３、４、５、６、７、８、もしくは９つすべてのエキソンに対応する内因性Ｐｎｐｌａ３エキソンは、内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座から削除され得る（例えば、最後のエキソンを除くすべての内因性エキソンは削除され得、ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子の９つすべてのエキソンで置き換えられ得る）。代替的に、抗ヒトＰＮＰＬＡ３抗原結合タンパク質によって認識されるエピトープをコードするＰＮＰＬＡ３の領域、またはヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬（例えば、小分子）によって標的化される領域をヒト化することができる。同様に、ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子の１、２、３、４、５、６、７、または８つすべてのイントロンに対応するイントロンは、ヒト化され得るか、または内因性のままであり得る。例えば、ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子のエキソン１と９との間のイントロン（すなわち、イントロン１～８）に対応するイントロンをヒト化することができる。例として、ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子の１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つすべてのイントロンは、内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座に挿入され得、かつ／またはヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子の１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つすべてのイントロンに対応する内因性Ｐｎｐｌａ３イントロンは、内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座から削除され得る（例えば、最後のイントロンの部分を除くすべての内因性イントロンは削除され得、ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子の８つすべてのイントロンで置き換えられ得る）。特定の例として、内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の最後のイントロンの全部または一部は、ヒト化された内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座では削除されていない。例えば、ヒト化された内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座において削除されていない内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の最後のイントロンの一部は、調節エレメントまたは推定もしくは予測される調節エレメントを含み得る。調節エレメントまたは推定もしくは予測される調節エレメントは、内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の下流の遺伝子（例えば、マウスにおけるＳａｍｍ５０などの、内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子のすぐ下流の遺伝子）の発現に影響を与え得る。
調節配列を含む隣接する非翻訳領域も、ヒト化され得るか、または内因性のままであり得る。例えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、もしくは５’ＵＴＲと３’ＵＴＲの両方をヒト化することができるか、または５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、もしくは５’ＵＴＲと３’ＵＴＲの両方を内因性のままにすることができる。ヒトの５’および３’ＵＴＲの一方または両方を挿入することができ、および／または内因性の５’および３’ＵＴＲの一方または両方を削除することができる。特定の例において、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの両方が内因性のままである。別の特定の例において、ヒト３’ＵＴＲは内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座に挿入されるが、内因性Ｐｎｐｌａ３の３’ＵＴＲは削除されない。オーソロガス配列による置換の程度に応じて、プロモーターなどの調節配列は、内因性であるか、または置換するヒトオーソロガス配列によって供給され得る。例えば、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座は、内因性の非ヒト動物Ｐｎｐｌａ３プロモーターを含むことができる。
一部のヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座は、野生型ヒトまたはキメラ（非ヒト動物／ヒト）ＰＮＰＬＡ３タンパク質をコードすることができる。野生型ＰＮＰＬＡ３タンパク質は、標準的なＰＮＰＬＡ３タンパク質（例えば、標準的なヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質）からの突然変異を全く含まないものである。一部のヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座は、１４８位において野生型であるヒトまたはキメラ（非ヒト動物／ヒト）ＰＮＰＬＡ３タンパク質をコードすることができる。ヒト化ＰＮＰＬＡ３タンパク質が、標準的なヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質と最適にアラインしている場合、標準的なヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質（配列番号５）におけるＩ１４８位に対応するヒト化ＰＮＰＬＡ３の位置が野生型（例えば、１４８Ｉ）のままであるならば、ＰＮＰＬＡ３タンパク質は１４８位で野生型である。一部のヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座は、Ｉ１４８Ｍおよび／またはＫ４３４Ｅ突然変異を含むヒトまたはキメラ（非ヒト動物／ヒト）ＰＮＰＬＡ３タンパク質をコードすることができる。ヒト化ＰＮＰＬＡ３タンパク質が、標準的なヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質と最適にアラインしている場合、ヒト化ＰＮＰＬＡ３タンパク質におけるＩ１４８Ｍ突然変異は、標準的なヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質（配列番号５）におけるＩ１４８位に対応するヒト化ＰＮＰＬＡ３の位置でのメチオニン（Ｍ）に対する突然変異である。同様に、ヒト化ＰＮＰＬＡ３タンパク質が、標準的なヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質と最適にアラインしている場合、ヒト化ＰＮＰＬＡ３タンパク質におけるＫ４３４Ｅ突然変異は、標準的なヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質（配列番号５）におけるＫ４３４位に対応するヒト化ＰＮＰＬＡ３の位置でのグルタミン酸（Ｅ）に対する突然変異である。完全に一致する残基の数が最も多い場合、ヒト化ＰＮＰＬＡ３タンパク質および標準的なヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質は最適にアラインする。一部のヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座は、Ｉ１４８Ｍ突然変異を含むが、Ｋ４３４Ｅ突然変異を含まない、ヒトまたはキメラ（非ヒト動物／ヒト）ＰＮＰＬＡ３タンパク質をコードすることができる。一部のヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座は、Ｋ４３４Ｅ突然変異を含むが、Ｉ１４８Ｍ突然変異を含まない、ヒトまたはキメラ（非ヒト動物／ヒト）ＰＮＰＬＡ３タンパク質をコードすることができる。一部のヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座は、Ｉ１４８Ｍ突然変異もＫ４３４Ｅ突然変異も含まない、ヒトまたはキメラ（非ヒト動物／ヒト）ＰＮＰＬＡ３タンパク質をコードすることができる。一部のヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座は、Ｉ１４８Ｍ突然変異を含まない、ヒトまたはキメラ（非ヒト動物／ヒト）ＰＮＰＬＡ３タンパク質をコードすることができる。一部のヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座は、Ｋ４３４Ｅ突然変異を含まない、ヒトまたはキメラ（非ヒト動物／ヒト）ＰＮＰＬＡ３タンパク質をコードすることができる。
細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、および内腔ドメインをコードする領域の１つ以上もしくはすべてはヒト化することができるか、またはそのような領域の１つ以上は内因性のままにすることができる。マウスＰＮＰＬＡ３細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、および内腔ドメインについての例示的なコード配列は、それぞれ、配列番号１２～１４に記載されている。ヒトＰＮＰＬＡ３細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、および内腔ドメインについての例示的なコード配列は、それぞれ、配列番号１６～１８に記載されている。Ｉ１４８ＭおよびＫ４３４Ｅ突然変異を有するヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインについての例示的なコード配列は、配列番号２０に記載されている。Ｋ４３４Ｅ突然変異を有するヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインについての例示的なコード配列は、配列番号６６に記載されている。
例えば、細胞質ドメインをコードするＰｎｐｌａ３遺伝子座の領域の全部もしくは一部はヒト化することができ、かつ／または膜貫通ドメインをコードするＰｎｐｌａ３遺伝子座の領域の全部もしくは一部はヒト化することができ、かつ／または内腔ドメインをコードするＰｎｐｌａ３遺伝子座の領域の全部もしくは一部はヒト化することができる。一例において、３つすべてのドメイン（細胞質、膜貫通、および内腔ドメイン）をコードするＰｎｐｌａ３遺伝子座の領域の全部または一部はヒト化されている。任意選択的に、ヒトＰＮＰＬＡ３細胞質ドメインのＣＤＳは、配列番号１６と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一である（またはその縮重）（例えば、配列番号１６と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である（またはその縮重））、配列を含むか、配列から本質的になるか、または配列からなる。ヒト化ＰＮＰＬＡ３タンパク質は、天然のＰＮＰＬＡ３および／またはヒトＰＮＰＬＡ３の活性を保持することができる。任意選択的に、ヒトＰＮＰＬＡ３膜貫通ドメインのＣＤＳは、配列番号１７と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一である（またはその縮重）（例えば、配列番号１７と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である（またはその縮重））、配列を含むか、配列から本質的になるか、または配列からなる。ヒト化ＰＮＰＬＡ３タンパク質は、天然のＰＮＰＬＡ３および／またはヒトＰＮＰＬＡ３の活性を保持することができる。任意選択的に、ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインのＣＤＳは、配列番号１８、２０、または６６と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一である（またはその縮重）（例えば、配列番号１８、２０、または６６と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である（またはその縮重））、配列を含むか、配列から本質的になるか、または配列からなる。ヒト化ＰＮＰＬＡ３タンパク質は、天然のＰＮＰＬＡ３および／またはヒトＰＮＰＬＡ３の活性を保持することができる。例えば、細胞質、膜貫通、および内腔ドメインのすべてをコードするＰｎｐｌａ３遺伝子座の領域は、ヒト化ＰＮＰＬＡ３タンパク質が、ヒトＰＮＰＬＡ３細胞質ドメイン、ヒトＰＮＰＬＡ３膜貫通ドメイン、およびヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインを伴って産生されるようにヒト化することができる。
細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、または内腔ドメインをコードする領域の１つ以上は、内因性のままであり得る。任意選択的に、内因性ＰＮＰＬＡ３細胞質ドメインのＣＤＳは、配列番号１２と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一である（またはその縮重）（例えば、配列番号１２と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である（またはその縮重））、配列を含むか、配列から本質的になるか、または配列からなる。任意選択的に、内因性ＰＮＰＬＡ３膜貫通ドメインのＣＤＳは、配列番号１３と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一である（またはその縮重）（例えば、配列番号１３と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である（またはその縮重））、配列を含むか、配列から本質的になるか、または配列からなる。任意選択的に、内因性ＰＮＰＬＡ３内腔ドメインのＣＤＳは、配列番号１４と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一である（またはその縮重）（例えば、配列番号１４と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である（またはその縮重））、配列を含むか、配列から本質的になるか、または配列からなる。いずれの場合も、ヒト化ＰＮＰＬＡ３タンパク質は、天然のＰＮＰＬＡ３および／またはヒトＰＮＰＬＡ３の活性を保持することができる。
ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座によってコードされるＰＮＰＬＡ３タンパク質は、ヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質に由来する１つ以上のドメイン、および／または内因性（すなわち、天然）ＰＮＰＬＡ３タンパク質に由来する１つ以上のドメインを含み得る。マウスＰＮＰＬＡ３細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、および内腔ドメインについての例示的なアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２～４に記載されている。ヒトＰＮＰＬＡ３細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、および内腔ドメインについての例示的なアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号６～８に記載されている。Ｉ１４８ＭおよびＫ４３４Ｅ突然変異を有するヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインについての例示的なアミノ酸配列は、配列番号１０に記載されている。Ｋ４３４Ｅ突然変異を有するヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインについての例示的なアミノ酸配列は、配列番号６５に記載されている。
ＰＮＰＬＡ３タンパク質は、ヒトＰＮＰＬＡ３細胞質ドメイン、ヒトＰＮＰＬＡ３膜貫通ドメイン、およびヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインのうちの１つ以上またはすべてを含むことができる。一例として、ＰＮＰＬＡ３タンパク質は、ヒトＰＮＰＬＡ３細胞質ドメイン、ヒトＰＮＰＬＡ３膜貫通ドメイン、およびヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインを含むことができる。
ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座によってコードされるＰＮＰＬＡ３タンパク質はまた、内因性（すなわち、天然）非ヒト動物ＰＮＰＬＡ３タンパク質に由来する１つ以上のドメインも含み得る。一例として、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座によってコードされるＰＮＰＬＡ３タンパク質は、内因性（すなわち、天然）非ヒト動物ＰＮＰＬＡ３タンパク質に由来する細胞質ドメイン、および／または内因性（すなわち、天然）非ヒト動物ＰＮＰＬＡ３タンパク質に由来する膜貫通ドメイン、および／または内因性（すなわち、天然）非ヒト動物ＰＮＰＬＡ３タンパク質に由来する内腔ドメインを含み得る。
ヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質に由来するヒト化ＰＮＰＬＡ３タンパク質のドメインは、完全にヒト化された配列によってコードされ得る（すなわち、そのドメインをコードする配列全体が、挿入されたオーソロガスなヒトＰＮＰＬＡ３配列である）か、または部分的にヒト化された配列によってコードされ得る（すなわち、そのドメインをコードする配列の一部は、挿入されたオーソロガスなヒトＰＮＰＬＡ３配列であり、そのドメインをコードする残りの内因性（すなわち、天然）配列は、コードされるドメインがヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質のそのドメインと同一であるように、オーソロガスなヒトＰＮＰＬＡ３配列と同じアミノ酸をコードする）。例えば、細胞質ドメインをコードする（例えば、細胞質ドメインのＮ末端領域をコードする）Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の領域の一部は、内因性Ｐｎｐｌａ３配列のままであり得、残りの内因性Ｐｎｐｌａ３配列によってコードされる細胞質ドメインの領域のアミノ酸配列は、対応するオーソロガスなヒトＰＮＰＬＡ３アミノ酸配列と同一である。別の例として、内腔ドメインをコードする（例えば、内腔ドメインのＣ末端領域をコードする）Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の領域の一部は、内因性Ｐｎｐｌａ３配列のままであり得、残りの内因性Ｐｎｐｌａ３配列によってコードされる内腔ドメインの領域のアミノ酸配列は、対応するオーソロガスなヒトＰＮＰＬＡ３アミノ酸配列と同一である。
同様に、内因性ＰＮＰＬＡ３タンパク質に由来するヒト化ＰＮＰＬＡ３タンパク質のドメインは、完全に内因性の配列によってコードされ得る（すなわち、そのドメインをコードする配列全体が内因性のＰｎｐｌａ３配列である）か、または部分的にヒト化された配列によってコードされ得る（すなわち、そのドメインをコードする配列の一部は、オーソロガスなヒトＰＮＰＬＡ３配列で置き換えられるが、オーソロガスなヒトＰＮＰＬＡ３配列は、コードされるドメインが内因性ＰＮＰＬＡ３タンパク質のそのドメインと同一であるように、置き換えられた内因性Ｐｎｐｌａ３配列と同じアミノ酸をコードする）。例えば、細胞質ドメインをコードする（例えば、細胞質ドメインのＮ末端領域をコードする）Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の領域の一部は、オーソロガスなヒトＰＮＰＬＡ３配列で置き換えられ得、オーソロガスなヒトＰＮＰＬＡ３配列によってコードされる細胞質ドメインの領域のアミノ酸配列は、対応する内因性アミノ酸配列と同一である。別の例として、内腔ドメインをコードする（例えば、内腔ドメインのＣ末端領域をコードする）Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の領域の一部は、オーソロガスなヒトＰＮＰＬＡ３配列で置き換えられ得、オーソロガスなヒトＰＮＰＬＡ３配列によってコードされる内腔ドメインの領域のアミノ酸配列は、対応する内因性アミノ酸配列と同一である。
一例として、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座によってコードされるヒト化ＰＮＰＬＡ３タンパク質は、ヒトＰＮＰＬＡ３細胞質ドメインを含み得る。任意選択的に、ヒトＰＮＰＬＡ３細胞質ドメインは、配列番号６と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一である（例えば、配列番号６と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である）、配列を含むか、配列から本質的になるか、または配列からなる。別の例として、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座によってコードされるヒト化ＰＮＰＬＡ３タンパク質は、ヒトＰＮＰＬＡ３膜貫通ドメインを含み得る。任意選択的に、ヒトＰＮＰＬＡ３膜貫通ドメインは、配列番号７と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一である（例えば、配列番号７と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である）、配列を含むか、配列から本質的になるか、または配列からなる。別の例として、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座によってコードされるヒト化ＰＮＰＬＡ３タンパク質は、ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインを含み得る。任意選択的に、ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインは、配列番号８、１０、または６５と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一である（例えば、配列番号８、１０、または６５と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である）、配列を含むか、配列から本質的になるか、または配列からなる。ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインは、Ｉ１４８Ｍおよび／もしくはＫ４３４Ｅ突然変異を含み得るか、またはＩ１４８Ｍおよび／もしくはＫ４３４Ｅ突然変異を欠き得る（例えば、野生型ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインであり得る）。例えば、ヒトＰＮＬＡ３内腔ドメインは、Ｉ１４８ＭおよびＫ４３４Ｅ突然変異（例えば、配列番号１０）の両方を含むことができる。代替的に、ヒトＰＮＬＡ３内腔ドメインは、Ｋ４３４Ｅ突然変異（例えば、配列番号６５）のみを含むことができる。代替的に、ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインは、Ｉ１４８ＭおよびＫ４３４Ｅ突然変異の両方を欠き得るか、または野生型ヒトＰＮＰＬＡ３（例えば、配列番号８）のようにＩ１４８およびＫ４３４を保持することができる。いずれの場合も、ヒト化ＰＮＰＬＡ３タンパク質は、天然のＰＮＰＬＡ３の活性を保持することができ、かつ／またはヒトＰＮＰＬＡ３の活性を保持することができる。例えば、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座によってコードされるヒト化ＰＮＰＬＡ３タンパク質は、配列番号５、９、または６３と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一である（例えば、配列番号５、９、または６３と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である）、配列を含み得るか、配列から本質的になり得るか、または配列からなり得る。任意選択的に、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座によってコードされるヒト化ＰＮＰＬＡ３ ＣＤＳは、配列番号１５、１９、または６４と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一である（またはその縮重）（例えば、配列番号１５、１９、または６４と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である（またはその縮重））、配列を含み得るか、配列から本質的になり得るか、または配列からなり得る。ヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質は、Ｉ１４８Ｍおよび／もしくはＫ４３４Ｅ突然変異を含み得るか、またはＩ１４８Ｍおよび／もしくはＫ４３４Ｅ突然変異を欠き得る（例えば、野生型ヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質であり得る）。例えば、ヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質は、Ｉ１４８ＭおよびＫ４３４Ｅ突然変異の両方を含むことができる（例えば、配列番号９、例えば、配列番号１９によってコードされる）。代替的に、ヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質は、Ｋ４３４Ｅ突然変異を含み得るが、Ｉ１４８を保持し得る（例えば、配列番号６３、例えば、配列番号６４によってコードされる）。代替的に、ヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質は、Ｉ１４８ＭおよびＫ４３４Ｅ突然変異の両方を欠き得るか、または野生型ヒトＰＮＰＬＡ３のようにＩ１４８およびＫ４３４を保持することができる。例えば、ヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質は、野生型ヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質であり得る（例えば、配列番号５、例えば、配列番号１５によってコードされる）。いずれの場合も、ヒト化ＰＮＰＬＡ３タンパク質は、天然のＰＮＰＬＡ３の活性を保持することができ、かつ／またはヒトＰＮＰＬＡ３の活性を保持することができる。
任意選択的に、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座は他のエレメントを含むことができる。そのような要素の例には、選択カセット、レポーター遺伝子、リコンビナーゼ認識部位、または他の要素を含むことができる。代替的に、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座は、他のエレメントを欠き得る（例えば、選択マーカーまたは、選択カセットを欠き得る）。好適なレポーター遺伝子およびレポータータンパク質の例は、本明細書の他の場所に開示されている。好適な選択マーカーの例には、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、または単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｋ）が含まれる。リコンビナーゼの例には、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、およびＤｒｅリコンビナーゼが含まれる。Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子の一例はＣｒｅｉであり、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエキソンがイントロンによって分離され、原核細胞での発現を妨げる。そのようなリコンビナーゼは、核への局在化を促進するための核局在化シグナルをさらに含むことができる（例えば、ＮＬＳ－Ｃｒｅｉ）。リコンビナーゼ認識部位には、部位特異的リコンビナーゼによって認識され、組換え事象の基質として機能することができるヌクレオチド配列が含まれる。リコンビナーゼ認識部位の例には、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ｒｏｘ、ならびにｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、およびｌｏｘ５１７１などのｌｏｘ部位が含まれる。
レポーター遺伝子または選択カセットなどの他の要素は、リコンビナーゼ認識部位に隣接する自己欠失カセットである可能性がある。例えば、すべての目的のために各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ８，６９７，８５１およびＵＳ２０１３／０３１２１２９を参照されたい。例として、自己削除カセットは、マウスＰｒｍ１プロモーターに作動可能に連結されたＣｒｅｉ遺伝子（イントロンによって分離されたＣｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエキソンを含む）およびヒトユビキチンプロモーターに作動可能に連結されたネオマイシン耐性遺伝子を含み得る。Ｐｒｍ１プロモーターを使用することにより、Ｆ０動物のオスの生殖細胞で特異的に自己欠失カセットを削除することができる。選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、標的とされる細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結され得る。プロモーターの例は、本明細書の他の場所に記載されている。別の特定の例として、自己欠失選択カセットは、１つ以上のプロモーター（例えば、ヒトユビキチンおよびＥＭ７プロモーターの両方）に作動可能に連結されたハイグロマイシン耐性遺伝子コード配列、それに続くポリアデニル化シグナル、続いて１つ以上のプロモーター（例えば、ｍＰｒｍ１プロモーター）に作動可能に連結されたＣｒｅｉコード配列、続いて別のポリアデニル化シグナルを含み得、カセット全体がｌｏｘＰ部位に隣接している。
ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座はまた、条件付き対立遺伝子であり得る。例えば、条件付き対立遺伝子は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１１／０１０４７９９に記載されているように、多機能対立遺伝子であり得る。例えば、条件付き対立遺伝子は、以下を含むことができる：（ａ）標的遺伝子の転写に関してセンス方向の作動配列、（ｂ）センスまたはアンチセンス方向の薬物選択カセット（ＤＳＣ）、（ｃ）アンチセンス配向の目的のヌクレオチド配列（ＮＳＩ）、（ｄ）逆方向の条件付き反転モジュール（ＣＯＩＮ、エキソン分割イントロンと反転可能な遺伝子トラップのようなモジュールを利用）。例えばＵＳ２０１１／０１０４７９９を参照されたい。条件付き対立遺伝子は、第１のリコンビナーゼへの曝露時に再結合して、（ｉ）作動配列およびＤＳＣを欠き、（ｉｉ）センス方向のＮＳＩとアンチセンス方向のＣＯＩＮを含む、条件付き対立遺伝子を形成する再結合可能なユニットをさらに含むことができる。例えばＵＳ２０１１／０１０４７９９を参照されたい。
１つの例示的なヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座（例えば、ヒト化マウスＰＮＰＬＡ３遺伝子座またはヒト化ラットＰＮＰＬＡ３遺伝子座）において、介在するすべてのイントロンを含む、最初のエキソンから最後から２番目のエキソンまでの内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の領域は、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座において削除され、ヒトＰＮＰＬＡ３開始コドンとヒトＰＮＰＬＡ３終止コドンとの間に配列を含むヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子座の領域で置き換えられる。特定の例において、ヒト化Ｐｎｐｌａ３遺伝子座は、内因性Ｐｎｐｌａ３プロモーターを含み、ヒトＰＮＰＬＡ３配列は、内因性Ｐｎｐｌａ３プロモーターに作動可能に連結されている。１つの例示的なヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座（例えば、ヒト化マウスＰＮＰＬＡ３遺伝子座またはヒト化ラットＰＮＰＬＡ３遺伝子座）は、内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座（例えば、内因性マウスＰｎｐｌａ３遺伝子座）のエキソン１からエキソン７までの間の領域が削除されるものであり（例えば、イントロン７の一部を保存し、エキソン８を保存する（例えば、マウスイントロン７の一部を保存し、マウスエキソン８を保存する））、３’ＵＴＲおよびエキソン１から９までのすべてのイントロンを含む、エキソン１からエキソン９までのヒトＰＮＰＬＡ３の領域で置き換えられる）。削除された内因性Ｐｎｐｌａ３配列を置き換えるヒトＰＮＰＬＡ３配列は、完全にヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質をコードする。図１および４を参照されたい。ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座についての例示的な配列は、配列番号２１、２２、６７、および６８に記載されている。
１つの特定の例において、ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座におけるヒトＰＮＰＬＡ３配列は、配列番号６２または６９に記載される配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一である（例えば、配列番号６２または６９に記載される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である）、配列を含み得るか、配列から本質的になり得るか、または配列からなり得る。別の特定の例において、ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座は、配列番号５、９、または６３に記載される配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一である（例えば、配列番号５、９、または６３に記載される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である）、配列を含むか、配列から本質的になるか、または配列からなる、タンパク質をコードすることができる。別の特定の例において、ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座は、配列番号１５、１９、または６４に記載される配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一である（例えば、配列番号１５、１９、または６４に記載される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である）、配列を含むか、配列から本質的になるか、または配列からなる、コード配列を含むことができる。別の特定の例において、ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座は、配列番号２１、２２、６７、または６８に記載される配列と少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一である（例えば、配列番号２１、２２、６７、または６８に記載される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である）、配列を含み得るか、配列から本質的になり得るか、または配列からなり得る。
Ｃ．ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む、非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物
本明細書の他の場所に記載されるヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む、非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物が提供される。ゲノム、細胞、または非ヒト動物は、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座によってコードされるヒト化ＰＮＰＬＡ３タンパク質を発現し得る。ゲノム、細胞、または非ヒト動物は、雄または雌であり得る。ゲノム、細胞、または非ヒト動物は、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座に対してヘテロ接合またはホモ接合であり得る。二倍体生物は、各遺伝子座に２つの対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各対は、特定の遺伝子座の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座に２つの同一の対立遺伝子がある場合はホモ接合として、および２つの対立遺伝子が異なる場合はヘテロ接合として記載されている。ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む非ヒト動物は、その生殖系列にヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含むことができる。
本明細書で提供される非ヒト動物ゲノムまたは細胞は、例えば、Ｐｎｐｌａ３遺伝子座またはヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子座に相同もしくはオーソロガスなゲノム遺伝子座を含む任意の非ヒト動物ゲノムまたは細胞であり得る。ゲノムは、真核細胞に由来し得るか、または真核細胞であり得、これらには、例えば、動物細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、およびヒト細胞が含まれる。「動物」という用語は、例えば、哺乳類、魚類、爬虫類、両生類、鳥類、および虫類を含む、動物界の任意のメンバーを含む。哺乳動物細胞は、例えば、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、ラット細胞、またはマウス細胞であり得る。他の非ヒト哺乳動物には、例えば、非ヒト霊長類が含まれる。「非ヒト」という用語はヒトを除外する。
細胞はまた、任意のタイプの未分化または分化状態であり得る。例えば、細胞は、全能性細胞、多能性細胞（例えば、ヒト多能性細胞、またはマウス胚性幹（ＥＳ）細胞もしくはラットＥＳ細胞などの非ヒト多能性細胞）、または非多能性細胞（例えば、非ＥＳ細胞）であり得る。全能性細胞には、任意の細胞型を生じさせることができる未分化細胞が含まれ、多能性細胞には、２つ以上の分化細胞型に発達する能力を有する未分化細胞が含まれる。かかる多能性および／または全能性細胞は、例えば、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞などのＥＳ細胞またはＥＳ様細胞であり得る。ＥＳ細胞には、胚への導入時に発達中の胚の任意の組織に寄与することができる胚由来の全能性または多能性細胞が含まれる。ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来するものであり得、３つの脊椎動物胚葉（内胚葉、外胚葉、および中胚葉）のうちのいずれかの細胞に分化することができる。
本明細書で提供される細胞はまた、生殖細胞（例えば、精子または卵母細胞）であり得る。細胞は、有糸分裂能力のある細胞または有糸分裂的に不活性な細胞、減数分裂能力のある細胞または減数分裂的に不活性な細胞であり得る。同様に、細胞はまた、初代体細胞または初代体細胞ではない細胞であり得る。体細胞には、配偶子、生殖細胞、配偶子細胞、または未分化幹細胞ではない任意の細胞が含まれる。例えば、細胞は、肝芽細胞または肝細胞などの肝細胞であり得る。
本明細書で提供される好適な細胞には、初代細胞も含まれる。初代細胞には、生物、臓器、または組織から直接単離された細胞または細胞の培養物が含まれる。初代細胞には、形質転換も不死化もされていない細胞が含まれる。それらには、以前に組織培養で継代されなかったか、または以前に組織培養で継代されたが、組織培養で無限に継代することができない生物、臓器、または組織から得られた任意の細胞が含まれる。かかる細胞は、従来の技術によって単離することができ、例えば、肝細胞を含む。
本明細書で提供される他の好適な細胞には、不死化細胞が含まれる。不死化細胞には、通常は無限に増殖することはないが、変異または改変に起因して、正常な細胞老化を回避し、代わりに分裂を続けることができる多細胞生物からの細胞も含まれる。そのような変異または改変は、自然に発生し得るか、または意図的に誘導され得る。不死化細胞株の特定の例は、ＨｅｐＧ２ヒト肝がん細胞株である。多くの種類の不死化細胞が周知である。不死化細胞または初代細胞には、典型的には、培養または組換えの遺伝子またはタンパク質の発現に使用される細胞が含まれる。
本明細書で提供される細胞はまた、１細胞期胚（すなわち、受精卵母細胞または接合子）を含む。このような１細胞期胚は、任意の遺伝的背景（例えば、マウスの場合はＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６、１２９、またはそれらの組み合わせ）に由来し、新鮮または凍結することができ、自然繁殖または体外受精に由来することができる。
本明細書で提供される細胞は、正常で健康な細胞であり得るか、または罹患した細胞もしくは変異体を担持する細胞であり得る。
本明細書に記載のヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む非ヒト動物は、本明細書の他の場所に記載されている方法によって作製することができる。「動物」という用語は、例えば、哺乳類、魚類、爬虫類、両生類、鳥類、および虫類を含む、動物界の任意のメンバーを含む。特定の例において、非ヒト動物は非ヒト哺乳動物である。非ヒト哺乳動物には、例えば、非ヒト霊長類および齧歯動物（例えば、マウスおよびラット）が含まれる。「非ヒト動物」という用語は、ヒトを除外する。好ましい非ヒト動物には、例えば、マウスおよびラットなどのげっ歯類が含まれる。
非ヒト動物は、あらゆる遺伝的背景からのものであり得る。例えば、好適なマウスは、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、１２９およびＣ５７ＢＬ／６の雑種、ＢＡＬＢ／ｃ系統、またはスイスウェブスター系統からのものであり得る。１２９系統の例には、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／Ｓｖｌｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、および１２９Ｔ２が含まれる。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｅｓｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ １０（８）：８３６を参照されたい。Ｃ５７ＢＬ系統の例には、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／Ｋａｌ＿ｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａが含まれる。好適なマウスはまた、前述の１２９系統および前述のＣ５７ＢＬ／６系統の雑種（例えば、５０％１２９および５０％Ｃ５７ＢＬ／６）からのものであり得る。同様に、好適なマウスは、前述の１２９系統の雑種または前述のＢＬ／６系統の雑種（例えば、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統）からのものであり得る。
同様に、ラットは、例えば、ＡＣＩラット系統、Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統、Ｗｉｓｔａｒラット系統、ＬＥＡラット系統、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット系統、またはフィッシャーＦ３４４またはフィッシャーＦ６などのフィッシャーラット系統からのものであり得る。ラットはまた、上述の２つ以上の系統の雑種に由来する系統から得ることができる。例えば、好適なラットは、ＤＡ系統またはＡＣＩ系統からのものであり得る。ＡＣＩラット系統は、白い腹および足、ならびにＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有する黒いアグーチを持っていることを特徴としている。このような系統は、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給源から入手できる。Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統は、アグーチコートとＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有することを特徴としている。このようなラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ ＲｉｖｅｒおよびＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給源から入手できる。いくつかの好適なラットは近交系ラット系統に由来する可能性がある。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１４／０２３５９３３を参照されたい。
ヒト化遺伝子座を含む非ヒト動物の肝臓（または細胞）におけるヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座からのＲＮＡ発現は、対照非ヒト動物（例えば、野生型内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座などの非ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座を有する非ヒト動物）または対照非ヒト動物細胞（例えば、野生型内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座などのヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座を有しない非ヒト動物細胞）の肝臓における非ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座（例えば、内因性野生型Ｐｎｐｌａ３遺伝子座またはＩ１４８Ｍおよび／もしくはＫ４３４Ｅ突然変異を含む内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座）からのＲＮＡ発現よりも高くなり得る。例えば、固形飼料を与えられた条件（例えば、約４週間または４週間）下でのヒト化遺伝子座を含む非ヒト動物の肝臓（または細胞）におけるヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座からのＲＮＡ発現は、固形飼料を与えられた条件（例えば、約４週間または４週間）下での対照非ヒト動物（例えば、野生型内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座などの非ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座を有する非ヒト動物）の肝臓（または細胞）における非ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座（例えば、内因性野生型Ｐｎｐｌａ３遺伝子座またはＩ１４８Ｍおよび／もしくはＫ４３４Ｅ突然変異を含む内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座）からのＲＮＡ発現よりも高くなり得る。例えば、発現は、野生型Ｐｎｐｌａ３遺伝子座からと比較して、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座から、少なくとも約１．５倍高く、少なくとも約２倍高く、少なくとも約３倍高く、少なくとも約４倍高く、少なくとも約５倍高く、少なくとも約６倍高く、少なくとも約７倍高く、少なくとも約８倍高く、少なくとも約９倍高く、少なくとも約１０倍高く、少なくとも約１１倍高く、少なくとも約１２倍高く、少なくとも約１３倍高く、少なくとも約１４倍高く、少なくとも約１５倍高く、少なくとも約１６倍高く、少なくとも約１７倍高く、少なくとも約１８倍高く、少なくとも約１９倍高く、または少なくとも約２０倍高くなり得る（例えば、野生型Ｐｎｐｌａ３遺伝子座からと比較して、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座から、少なくとも１．５倍高い、少なくとも２倍高い、少なくとも３倍高い、少なくとも４倍高い、少なくとも５倍高い、少なくとも６倍高い、少なくとも７倍高い、少なくとも８倍高い、少なくとも９倍高い、少なくとも１０倍高い、少なくとも１１倍高い、少なくとも１２倍高い、少なくとも１３倍高い、少なくとも１４倍高い、少なくとも１５倍高い、少なくとも１６倍高い、少なくとも１７倍高い、少なくとも１８倍高い、少なくとも１９倍高い、または少なくとも２０倍高い）。追加的または代替的に、固形飼料を与えられた条件（例えば、約４週間または４週間）下でのヒト化遺伝子座を含む非ヒト動物の肝臓（または細胞）におけるヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座からのＲＮＡ発現は、高ショ糖食（ＨＳＤ）または高フルクトース食（ＨＦｒｕＤ）条件（例えば、約４週間または４週間）下でのヒト化遺伝子座を含む非ヒト動物の肝臓（または細胞）におけるヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座からのＲＮＡ発現の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％であり得る（例えば、高ショ糖食（ＨＳＤ）または高フルクトース食（ＨＦｒｕＤ）条件（例えば、約４週間または４週間）下でのヒト化遺伝子座を含む非ヒト動物の肝臓（または細胞）におけるヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座からのＲＮＡ発現の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、または少なくとも３０％である）。
ＩＩＩ．ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法
本明細書の他の場所に開示されるように、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物を作製するための様々な方法が提供される。同様に、本明細書の他の場所に開示されるように、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子もしくは遺伝子座を作製するため、またはヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノムもしくは非ヒト動物細胞を作製するための様々な方法が提供される。遺伝子改変された生物を産生するための任意の便利な方法またはプロトコルは、そのような遺伝子改変された非ヒト動物を産生するのに好適である。例えば、すべての目的のために各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５（１）：９１－９９、ＵＳ７，２９４，７５４、ＵＳ７，５７６，２５９、ＵＳ７，６５９，４４２、ＵＳ８，８１６，１５０、ＵＳ９，４１４，５７５、ＵＳ９，７３０，４３４、およびＵＳ１０，０３９，２６９を参照されたい（遺伝子改変マウスを作製するためのマウスＥＳ細胞およびＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法を記載している）。すべての目的のために各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１４／０２３５９３３Ａ１、ＵＳ２０１４／０３１０８２８Ａ１も参照されたい（ラットＥＳ細胞および遺伝子改変ラットの作製方法を記載している）。すべての目的のために各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４２：１９．１１．１－１９．１１．２２（ｄｏｉ：１０．１００２／０４７１１４３０３０．ｃｂ１９１１ｓ４２）およびＧａｍａ Ｓｏｓａ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｒａｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．２１４（２－３）：９１－１０９も参照されたい。そのような遺伝子改変された非ヒト動物は、例えば、標的化されたＰＮＰＬＡ３遺伝子座での遺伝子ノックインを介して生成することができる。
例えば、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法は、（１）ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む多能性細胞（例えば、マウスＥＳ細胞またはラットＥＳ細胞などの胚性幹（ＥＳ）細胞）を提供することと、（２）遺伝子改変された多能性細胞を非ヒト動物宿主胚に導入することと、（３）代理母に宿主胚を妊娠させることと、を含むことができる。
別の例として、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法は、（１）多能性細胞（例えば、マウスＥＳ細胞またはラットＥＳ細胞などの胚性幹（ＥＳ）細胞）のゲノムを改変して、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含むようにすることと、（２）ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む遺伝子改変された多能性細胞を同定または選択することと、（３）遺伝子改変された多能性細胞を非ヒト動物宿主胚に導入することと、（４）代理母に宿主胚を妊娠させることと、を含むことができる。ドナー細胞は、胚盤胞期または桑実胚前期（すなわち、４細胞期または８細胞期）などの任意の段階で宿主胚に導入することができる。任意選択的に、改変された多能性細胞（例えば、非ヒトＥＳ細胞）を含む宿主胚は、Ｆ０非ヒト動物を産生するために代理母に着床させおよび懐胎させる前に胚盤胞段階までインキュベートされ得る。次いで、代理母は、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む（かつ、生殖細胞系列を介して遺伝子改変を伝達することができる）Ｆ０世代の非ヒト動物を生成することができる。
代替的に、本明細書の他の場所に記載の非ヒト動物を生成する方法は、（１）多能性細胞を改変するための上記の方法を使用して、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含むように１細胞期胚のゲノムを改変することと、（２）遺伝子組換え胚を選択することと、（３）代理母に遺伝子組換え胚を妊娠させることと、を含むことができる。生殖細胞系列を介して遺伝子改変を伝達することができる子孫が生成される。
核移植技術はまた、非ヒト哺乳動物を生成するために使用することができる。簡単に言えば、核移植の方法は、（１）卵母細胞を除核するか、または除核された卵母細胞を提供するステップと、（２）除核した卵母細胞と組み合わせるドナー細胞または核を単離または提供するステップと、（３）細胞または核を除核した卵母細胞に挿入して、再構成された細胞を形成するステップと、（４）再構成された細胞を動物の子宮に着床させて胚を形成するステップと、（５）胚の発育させるステップと、を含むことができる。このような方法では、卵母細胞は一般に死亡した動物から回収されるが、生きている動物の卵管および／または卵巣からも単離され得る。卵母細胞は、除核前に様々な周知の培地で成熟させることができる。卵母細胞の除核は、多くの周知の方法で行うことができる。再構成された細胞を形成するための除核卵母細胞へのドナー細胞または核の挿入は、融合の前に透明帯の下にドナー細胞をマイクロインジェクションすることによって行うことができる。融合は、接触／融合面を横切るＤＣ電気パルスの印加（電気融合）、ポリエチレングリコールなどの融合促進化学物質への細胞の曝露、またはセンダイウイルスなどの不活化ウイルスによって誘発され得る。再構成された細胞は、核のドナーとレシピエントの卵母細胞の融合の前、最中、および／または後に、電気的および／または非電気的手段によって活性化することができる。活性化方法には、電気パルス、化学的に誘発されたショック、精子による浸透、卵母細胞における二価カチオンのレベルの増加、および卵母細胞における細胞タンパク質のリン酸化の低減（キナーゼ阻害剤による）が含まれる。活性化された再構成された細胞、または胚は、周知の培地で培養され、次いで動物の子宮に移植され得る。例えば、すべての目的のために各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００８／００９２２４９、ＷＯ１９９９／００５２６６、ＷＯ２００４／０１７７３９０、ＷＯ２００８／０１７２３４、およびＵＳ７，６１２，２５０を参照されたい。
改変細胞または１細胞期胚は、例えば、（ａ）例えば、５’および３’標的部位（例えば、挿入核酸による欠失および置換を目的とする内因性配列に隣接する標的部位）に対応する５’および３’相同性アームが隣接する挿入核酸を含む１つ以上の外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）を細胞に導入することであって、挿入核酸は、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を生成するためのヒトＰＮＰＬＡ３配列を含む、導入することと、（ｂ）内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座に組み込まれた挿入核酸をそのゲノムに含む少なくとも１つの細胞を同定すること（すなわち、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む少なくとも１つの細胞を同定することと）と、による組換えを介して生成され得る。同様に、改変された非ヒト動物ゲノムまたはヒト化非ヒト動物ＰＮＰＬＡ３遺伝子は、例えば、（ａ）ゲノムまたは遺伝子を、５’および３’標的部位に対応する５’および３’相同性アーム（例えば、５’および３’相同性アームに隣接する、欠失および／または挿入核酸での置換を目的とする内因性配列に隣接する標的部位（例えば、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を生成するためのヒトＰＮＰＬＡ３配列を含む））を含む１つ以上の外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）と接触させることによる組換えによって生成することができ、ここで、外因性ドナー核酸は、内因性非ヒト動物Ｐｎｐｌａ３遺伝子座のヒト化のために設計されている。
代替的に、改変された多能性細胞または１細胞期胚は、（ａ）細胞に（ｉ）ヌクレアーゼ剤であって、ヌクレアーゼ剤は、内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座内の標的部位でニックまたは二本鎖切断を誘導するヌクレアーゼ剤、ならびに（ｉｉ）例えば、５’および３’標的部位（例えば、欠失および挿入核酸による置換を目的とする内因性配列に隣接する標的部位）に対応する５’および３’相同性アームに隣接する挿入核酸を含む１つ以上の外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）を導入することであって、挿入核酸は、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を生成するためのヒトＰＮＰＬＡ３配列を含む、導入することと、（ｃ）内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座に組み込まれた挿入核酸をそのゲノムに含む少なくとも１つの細胞を同定すること（すなわち、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む少なくとも１つの細胞を同定することと）と、によって生成され得る。同様に、改変された非ヒト動物ゲノムまたはヒト化非ヒト動物ＰＮＰＬＡ３遺伝子は、ゲノムまたは遺伝子を：（ｉ）ヌクレアーゼ剤であって、ヌクレアーゼ剤は、内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座または遺伝子内の標的部位においてニックまたは二本鎖切断を誘導する、ヌクレアーゼ剤と、（ｉｉ）例えば、５’および３’標的部位（例えば、欠失および／または挿入核酸による置換を目的とした内因性配列に隣接する標的部位）に対応する５’および３’相同性アームに隣接する挿入核酸（例えば、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を生成するためのヒトＰＮＰＬＡ３配列を含む）を含む１つ以上の外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）であって、外因性ドナー核酸は、内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座のヒト化のために設計されている外因性ドナー核酸と、に接触させることによって生成することができる。ニックまたは二本鎖切断を所望の認識部位に誘導する任意のヌクレアーゼ剤を使用することができる。好適なヌクレアーゼの例には、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、およびクラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系）またはそのような系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）の成分が含まれる。例えば、すべての目的のために各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１３／０３０９６７０およびＵＳ２０１５／０１５９１７５を参照されたい。一例において、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡを含む。例えば、ガイドＲＮＡは、配列番号２８～３１のうちのいずれか１つを含むガイドＲＮＡ標的配列を標的とすることができる。別の例において、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質と、２つ以上、３つ以上、または４つ以上のガイドＲＮＡ（例えば、配列番号２８～３１のすべてを標的とするガイドＲＮＡ）と、を含む。
ゲノムを改変するステップは、例えば、外因性修復テンプレート（例えば、標的化ベクター）を利用して、Ｐｎｐｌａ３遺伝子座を改変して、本明細書に開示されるヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含むようにすることができる。一例として、標的化ベクターは、内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座（例えば、内因性非ヒト動物Ｐｎｐｌａ３遺伝子座）でヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子を生成するためのものであり得、標的化ベクターは、内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の５’標的配列を標的化する５’相同性アームおよび内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の３’標的配列を標的化する３’相同性アームに隣接するＰｎｐｌａ３遺伝子座に組み込まれるヒトＰＮＰＬＡ３配列を含む核酸インサートを含む。Ｐｎｐｌａ３遺伝子座での核酸インサートの組み込みは、Ｐｎｐｌａ３遺伝子座での目的の核酸配列の付加、Ｐｎｐｌａ３遺伝子座での目的の核酸配列の欠失、またはＰｎｐｌａ３遺伝子座での目的の核酸配列の置換（すなわち、内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座のセグメントの欠失およびオーソロガスなヒトＰＮＰＬＡ３配列での置換）をもたらし得る。
外因性修復テンプレートは、非相同末端結合を介した挿入または相同組換えのためのものであり得る。外因性修復テンプレートは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含むことができ、それらは一本鎖または二本鎖であり得、それらは直線状または環状の形態であり得る。例えば、修復テンプレートは、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）であり得る。外因性修復テンプレートはまた、標的化されていない内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座に存在しない異種配列を含み得る。例えば、外因性修復テンプレートは、リコンビナーゼ認識部位に隣接する選択カセットなどの選択カセットを含み得る。
１細胞期胚以外の細胞では、外因性修復テンプレートは、「大きな標的化ベクター」または「ＬＴＶＥＣ」であり得、これには、細胞内で相同組換えを行うことを目的とした他のアプローチで典型的に使用されるものよりも大きい核酸配列に対応し、それに由来する相同性アームを含む標的化ベクターが含まれる。例えば、すべての目的のために各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００４／００１８６２６、ＷＯ２０１３／１６３３９４、ＵＳ９，８３４，７８６、ＵＳ１０，３０１，６４６、ＷＯ２０１５／０８８６４３、ＵＳ９，２２８，２０８、ＵＳ９，５４６，３８４、ＵＳ１０，２０８，３１７、およびＵＳ２０１９－０１１２６１９を参照されたい。ＬＴＶＥＣにはまた、細胞内で相同組換えを行うことを目的とした他のアプローチで通常使用されるものよりも大きい核酸配列を有する核酸インサートを含む標的化ベクターが含まれる。例えば、ＬＴＶＥＣは、サイズの制限のために従来のプラスミドベースの標的化ベクターでは対応できない大きな遺伝子座の変更を可能にする。例えば、標的化された遺伝子座は、従来の方法を使用して標的化できないか、またはヌクレアーゼ剤（例えば、Ｃａｓタンパク質）によって誘導されるニックもしくは二本鎖切断の非存在下で不正確にのみ、または有意に低い効率でのみ標的化され得る細胞の遺伝子座であり得る（すなわち、５’および３’相同性アームが対応し得る）。ＬＴＶＥＣは、任意の長さであり得、通常は少なくとも１０ｋｂ長である。ＬＴＶＥＣの５’相同性アームと３’相同性アームの合計は、典型的には、少なくとも１０ｋｂである。ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子工学技術を使用する細菌相同組換え（ＢＨＲ）反応によって細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡ由来の大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の生成および使用は、例えば、ＵＳ６，５８６，２５１およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１（６）：６５２－６５９に記載され、これらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。インビトロアセンブリ法によるＬＴＶＥＣの生成は、例えば、ＵＳ２０１５／０３７６６２８およびＷＯ２０１５／２００３３４を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
この方法は、修飾された標的ゲノム遺伝子座を有する細胞または動物を同定することをさらに含み得る。標的化遺伝子改変を有する細胞および動物を同定するために様々な方法を使用することができる。スクリーニングステップは、例えば、親染色体の対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を評価するための定量的アッセイを含むことができる。例えば、すべての目的のために各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００４／００１８６２６、ＵＳ２０１４／０１７８８７９、ＵＳ２０１６／０１４５６４６、ＷＯ２０１６／０８１９２３、およびＦｒｅｎｄｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５－３０７を参照されたい。例えば、定量的アッセイは、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）などの定量的ＰＣＲを介して実施することができる。リアルタイムＰＣＲは、標的遺伝子座を認識する第１のプライマーセットおよび非標的参照遺伝子座を認識する第２のプライマーセットを利用することができる。プライマーセットは、増幅された配列を認識する蛍光プローブを含むことができる。好適な定量的なアッセイの他の例としては、蛍光媒介インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化プローブに対する定量的ハイブリダイゼーション、ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）プローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分子ビーコンプローブ、またはＥＣＬＩＰＳＥ（商標）プローブ技術が挙げられる（例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００５／０１４４６５５を参照されたい）。
本明細書で提供される様々な方法は、遺伝子改変された非ヒトＦ０動物の生成を可能にし、遺伝子改変されたＦ０動物の細胞は、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む。Ｆ０動物を生成するために使用される方法に応じて、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を有するＦ０動物内の細胞の数が変動することが認識されるであろう。例えば、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法を介した、マウスからの前桑実胚期胚（例えば、８細胞期マウス胚）へのドナーＥＳ細胞の導入は、Ｆ０マウスのより大きい割合の細胞集団が、標的化遺伝子改変を有する細胞を含むことを可能にする。例えば、非ヒトＦ０動物の細胞寄与の少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８５％、８６％、８７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、標的化改変を有する細胞集団を含むことができる。遺伝子改変されたＦ０動物の細胞は、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座に対してヘテロ接合であり得、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座に対してホモ接合であり得る。
ＩＶ．インビボまたはエクスビボでのヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の送達または有効性を評価するためのヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む非ヒト動物を使用する方法
インビボまたはエクスビボでのヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の送達または有効性を評価するために、本明細書の他の場所に記載されるヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む非ヒト動物を使用するための様々な方法が提供される。非ヒト動物はヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含むため、非ヒト動物はヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の有効性をより正確に反映する。
Ａ．インビボまたはエクスビボでのヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の有効性を試験する方法
本明細書の他の場所に記載されているように、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む非ヒト動物を使用して、インビボでのヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の送達または有効性を評価するための様々な方法が提供される。そのような方法は、（ａ）非ヒト動物にヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬を導入することと、（ｂ）ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の活性を評価することと、を含み得る。
ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬は、ヒトＰＮＰＬＡ３標的化抗体もしくは抗原結合タンパク質、またはヒトＰＮＰＬＡ３を標的化する他の任意の大分子もしくは小分子であり得る。代替的に、ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬は、ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子座（ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子）、ヒトＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡ、またはヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質を標的化する任意の生物学的または化学的薬剤であり得る。ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の例は、本明細書の他の場所に開示される。
そのようなヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬は、任意の送達方法（例えば、ＡＡＶ、ＬＮＰ、ＨＤＤ、または注射）および任意の投与経路によって投与することができる。複合体および分子を送達する手段ならびに投与経路は、本明細書の他の場所でより詳細に開示されている。特定の方法では、試薬は、ＡＡＶを介した送達を介して送達される。例えば、ＡＡＶ８を使用して肝臓を標的にすることができる。他の特定の方法では、試薬は、ＬＮＰを介した送達によって送達される。他の特定の方法では、試薬は、流体力学的送達（ＨＤＤ）によって送達される。用量は、任意の好適な用量であり得る。
ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の活性を評価するための方法は周知であり、本明細書の他の場所で提供されている。活性の評価は、任意の細胞型、任意の組織型、または任意の臓器型であり得る。いくつかの方法では、活性の評価は肝臓で行われる。
ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬がゲノム編集試薬（例えば、ヌクレアーゼ剤）である場合、そのような方法は、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座の改変を評価することを含み得る。一例として、評価することは、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座での非相同末端結合（ＮＨＥＪ）活性を測定することを含み得る。これは、例えば、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座内の挿入または欠失の頻度を測定することを含み得る。例えば、評価することは、非ヒト動物から単離される１つ以上の細胞におけるヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座の配列決定（例えば、次世代配列決定）を含み得る。評価は、非ヒト動物から標的臓器または組織（例えば、肝臓）を単離すること、および標的臓器または組織におけるヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座の改変を評価することを含み得る。評価はまた、標的臓器または組織内の２つ以上の異なる細胞型におけるヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座の改変を評価することを含み得る。同様に、評価は、非標的臓器または組織（例えば、２つ以上の非標的臓器または組織）を非ヒト動物から単離すること、および非標的臓器または組織におけるヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座の改変を評価することを含み得る。
そのような方法はまた、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座によって産生されるｍＲＮＡの発現レベルを測定すること、またはヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座によってコードされるタンパク質の発現レベルを測定することを含み得る。例えば、タンパク質レベルは、特定の細胞、組織、または臓器の型（例えば、肝臓）で測定することができる。ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座から発現されるＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡまたはＰＮＰＬＡ３タンパク質の発現を評価するための方法は、本明細書の他の場所で提供されており、周知である。
１つの特定の例として、ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬がゲノム編集試薬（例えば、ヌクレアーゼ剤）である場合、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座での編集パーセント（例えば、溶解した細胞のプールからＰＣＲ反応で読み取られた配列の総数に対して観察された挿入または欠失の総数）を評価することができる（例えば、肝細胞において）。
ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の活性の測定は、同様にまたは代替的に、肝臓の脂肪含有量の測定（例えば、高ショ糖食での）および／または肝臓の脂肪滴中のＰＮＰＬＡ３レベルの測定を含むこともできる。例えば、肝臓の脂肪含有量の減少または肝臓の脂肪滴中のＰＮＰＬＡ３レベルの減少は、ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬のより高い活性を示している可能性がある。他の活性の読み出しには、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）または肝脂肪症の他の既知の読み出し（例えば、兆候または症状）が含まれ得る。活性の増加は、ＮＡＦＬＤまたは肝脂肪症の兆候または症状の減少によって示され得る。
インビボでの活性を評価するための上記で提供される様々な方法はまた、本明細書の他の場所に記載されているように、エクスビボ（例えば、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む肝臓において）またはインビトロ（例えば、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む細胞において）でヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の活性を評価するために使用され得る。
Ｂ．インビボまたはエクスビボでのヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の送達または有効性を最適化する方法
細胞もしくは非ヒト動物へのヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の送達を最適化するため、またはインビボでのヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の活性もしくは有効性を最適化するために、様々な方法が提供される。そのような方法は、例えば、（ａ）ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む第１の非ヒト動物または第１の細胞において、上記のようなヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の有効性を試験する方法を１回目に実行することと、（ｂ）可変要素を変更し、方法を、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む第２の非ヒト動物（すなわち、同じ種の）または第２の細胞において変更された可変要素を用いて２回目に実行することと、（ｃ）ステップ（ａ）のヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の活性をステップ（ｂ）のヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の活性と比較し、より高い活性をもたらす方法を選択することと、を含み得る。
ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の送達、有効性、または活性を測定する方法は、本明細書の他の場所に開示されている。例えば、そのような方法は、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座の改変を測定することを含み得る。ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座のより効果的な改変は、非ヒト動物または細胞内の望ましい効果に応じて異なることを意味し得る。例えば、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座のより効果的な改変は、より高いレベルの改変、より高い精度、より高い一貫性、またはより高い特異性のうちの１つ以上またはすべてを意味し得る。ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座のより高いレベルの改変（すなわち、より高い効力）は、特定の標的細胞型内、特定の標的組織内、または特定の標的臓器（例えば、肝臓）内で標的とされる細胞のより高いパーセンテージを指す。より高い精度は、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座のより正確な改変を意味する（例えば、同じ改変を有するか、または余分な意図しない挿入および欠失（例えば、ＮＨＥＪインデル）なしに所望の改変を有する標的細胞のより高いパーセンテージ）。より高い一貫性とは、１つを超えるタイプの細胞、組織、または臓器（例えば、肝臓内のより多い数の細胞型の改変）が標的化されている場合、異なるタイプの標的細胞、組織、または臓器の間でヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座のより一貫した改変を意味する。特定の臓器が標的にされている場合、より高い一貫性は、臓器内（例えば、肝臓）のすべての場所全体でより一貫性のある改変を指すこともできる。より高い特異性は、標的とされるゲノム遺伝子座もしくは複数の遺伝子座に関するより高い特異性、標的とされる細胞型に関するより高い特異性、標的とされる組織型に関するより高い特異性、または標的とされる臓器に関するより高い特異性を指すことができる。例えば、ゲノム遺伝子座の特異性の増加は、オフターゲットゲノム遺伝子座の改変が少ないことを指す（例えば、標的ゲノム遺伝子座の改変に変えて、あるいは加えて、意図しないオフターゲットゲノム遺伝子座に改変を有する標的細胞のパーセンテージが低い）。同様に、細胞型、組織、または臓器型の特異性の増加は、特定の細胞型、組織型、または臓器型が標的にされている場合、オフターゲットの細胞型、組織型、または臓器型の改変が少ないことを指す。（例えば、特定の臓器（例えば、肝臓）が標的とされる場合、意図された標的ではない臓器または組織の細胞の改変が少ない）。
代替的に、そのような方法は、ＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡまたはＰＮＰＬＡ３タンパク質の発現を測定することを含み得る。一例において、より効果的なヒトＰＮＰＬＡ３標的化剤は、ＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡまたはＰＮＰＬＡ３タンパク質の発現のより大きな減少をもたらす。代替的に、そのような方法は、ＰＮＰＬＡ３活性を測定することを含み得る。一例において、より効果的なヒトＰＮＰＬＡ３標的化剤は、ＰＮＰＬＡ３活性のより大きな減少をもたらす。
変更される可変要素は、任意のパラメータにすることができる。一例として、変更された可変要素は、ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬または複数の試薬が細胞または非ヒト動物に導入されるパッケージングまたは送達方法であり得る。ＬＮＰ、ＨＤＤ、およびＡＡＶなどの送達方法の例は、本明細書の他の場所に開示されている。例えば、変更された可変要素はＡＡＶ血清型であり得る。同様に、投与はＬＮＰ媒介送達を含み得、変更された可変要素はＬＮＰ製剤であり得る。別の例として、変更された可変要素は、ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬または複数の試薬を細胞または非ヒト動物に導入するための投与経路であり得る。静脈内、硝子体内、実質内、および鼻腔内注入（ｎａｓａｌ ｉｎｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ）などの投与経路の例は、本明細書の他の場所に開示されている。
別の例として、変更された可変要素は、導入されたヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬または複数の試薬の濃度または量であり得る。別の例として、変更される可変要素は、導入された別のヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬（例えば、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、外因性ドナー核酸、ＲＮＡｉ剤、またはＡＳＯ）の濃度または量と比較した、導入された１つのヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬（例えば、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、外因性ドナー核酸、ＲＮＡｉ剤、またはＡＳＯ）の濃度または量であり得る。
別の例として、変更された可変要素は、試薬の活性または有効性を評価するタイミングと比較した、ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬または複数の試薬を導入するタイミングであり得る。別の例として、変更された可変要素は、ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬または複数の試薬が導入される回数または頻度であり得る。別の例として、変更される可変要素は、導入された別のヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬（例えば、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、外因性ドナー核酸、ＲＮＡｉ剤、またはＡＳＯ）の導入のタイミングと比較した、導入された１つのヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬（例えば、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、外因性ドナー核酸、ＲＮＡｉ剤、またはＡＳＯ）の導入のタイミングであり得る。
別の例として、変更された可変要素は、ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬または複数の試薬が導入される形態であり得る。例えば、ガイドＲＮＡは、ＤＮＡの形態またはＲＮＡの形態で導入することができる。Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、ＤＮＡの形態、ＲＮＡの形態、またはタンパク質の形態（例えば、ガイドＲＮＡと複合体を形成している）で導入することができる。外因性ドナー核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖、二本鎖、線状、環状などであり得る。同様に、各構成要素は、安定性のため、オフターゲット効果を低減するため、送達を容易にするためなどのための改変の様々な組み合わせを含むことができる。同様に、例えば、ＲＮＡｉ剤およびＡＳＯは、安定性、オフターゲット効果を低減するため、送達を容易にするためなどのための改変の様々な組み合わせを含むことができる。
別の例として、変更された可変要素は、導入されるヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬または複数の試薬であり得る。例えば、ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬がガイドＲＮＡを含む場合、変更された可変要素は、異なる配列（例えば、異なるガイドＲＮＡ標的配列を標的化する）を有する異なるガイドＲＮＡを導入することができる。同様に、ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬がＲＮＡｉ剤またはＡＳＯを含む場合、変更される可変要素は、異なる配列を有する異なるＲＮＡｉ剤またはＡＳＯを導入することであり得る。同様に、ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬がＣａｓタンパク質を含む場合、変更された可変要素は、異なるＣａｓタンパク質を導入することができる（例えば、異なる配列を有する異なるＣａｓタンパク質、または異なる配列を有する（例えば、コドン最適化）が、同じＣａｓタンパク質アミノ酸配列をコードする核酸を導入する）。同様に、ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬が外因性ドナー核酸を含む場合、変更された可変要素は、異なる配列（例えば、異なる挿入核酸または異なる相同性アーム（例えば、より長いまたはより短い相同性アームまたはヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子の異なる領域を標的化する相同性アーム））を有する異なる外因性ドナー核酸を導入することができる。
特定の例において、ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬は、Ｃａｓタンパク質と、ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を標的化するように設計されたガイドＲＮＡと、を含む。そのような方法では、変更された可変要素は、ガイドＲＮＡ配列および／またはガイドＲＮＡ標的配列であり得る。いくつかのそのような方法において、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡは、各々ＲＮＡの形態で投与することができ、変更された可変要素は、ガイドＲＮＡに対するＣａｓ ｍＲＮＡの比であり得る（例えば、ＬＮＰ製剤において）。いくつかのそのような方法において、変更された可変要素は、ガイドＲＮＡ改変であり得る（例えば、改変を有するガイドＲＮＡは、改変されていないガイドＲＮＡと比較される）。
Ｃ．ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬
ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬は、ヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質、ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子、またはヒトＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡを標的化する任意の試薬であり得る。ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬は、例えば、既知のヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬であり得るか、推定上のヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬（例えば、ヒトＰＮＰＬＡ３を標的化するように設計された候補試薬）であり得るか、またはヒトＰＮＰＬＡ３標的化活性についてスクリーニングされている試薬であり得る。
例えば、ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬は、ヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質のエピトープを標的化する抗原結合タンパク質（例えば、アゴニスト抗体）であり得る。「抗原結合タンパク質」という用語は、抗原に結合する任意のタンパク質を含む。抗原結合タンパク質の例としては、抗体、抗体の抗原結合断片、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ｓｃＦＶ、ビスｓｃＦＶ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、Ｖ－ＮＡＲ、ＶＨＨ、ＶＬ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２、ＤＶＤ（二重可変ドメイン抗原結合タンパク質）、ＳＶＤ（単一可変ドメイン抗原結合タンパク質）、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、またはデイビスボディが含まれる（すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，５８６，７１３号）。他のヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬には、ヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質を標的化する小分子が含まれる。
他のヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬には、ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子内の認識部位を切断するヌクレアーゼ剤（例えば、クラスター化された規則的に散在する短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ））などのゲノム編集試薬が含まれ得る。同様に、ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬は、ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子と組換えるように設計された外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクターまたは一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ））であり得る。
他のヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬には、ＲＮＡｉ剤が含まれ得る。「ＲＮＡｉ剤」は、配列特異的方法で、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などの標的ＲＮＡの翻訳の分解または阻害を促進することができる小さい二本鎖ＲＮＡまたはＲＮＡ様（例えば、化学的に修飾されたＲＮＡ）オリゴヌクレオチド分子を含む組成物である。ＲＮＡｉ剤のオリゴヌクレオチドは、結合したヌクレオシドのポリマーであり、各々を独立して修飾することも、修飾しないこともできる。ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡ干渉メカニズムを介して機能する（すなわち、哺乳動物細胞のＲＮＡ干渉経路機構（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体またはＲＩＳＣ）との相互作用を介してＲＮＡ干渉を誘導する）。ＲＮＡｉ剤は、その用語が本明細書で使用されるように、主にＲＮＡ干渉メカニズムを介して作用すると考えられているが、開示されたＲＮＡｉ剤は、特定の経路または作用メカニズムに拘束または限定されない。本明細書に開示されるＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、これらに限定されないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、およびダイサー基質が含まれる。本明細書に記載のＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、標的ＲＮＡの配列（すなわち、標準的な命名法を使用して一連の文字で記載された核酸塩基またはヌクレオチドの連続または順序）に少なくとも部分的に相補的である。
他のヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬には、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）が含まれ得る。一本鎖ＡＳＯおよびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、オリゴヌクレオチドがワトソン－クリックの塩基対を介して標的ＲＮＡに結合するという基本原理を共有している。理論に縛られることを望まないが、ＲＮＡｉの間に、低分子ＲＮＡ二重鎖（ＲＮＡｉ剤）がＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合し、一方の鎖（パッセンジャー鎖）が失われ、残りの鎖（ガイド鎖）が失われるＲＩＳＣと協力して相補的ＲＮＡに結合する。次に、ＲＩＳＣの触媒成分であるアルゴノート２（Ａｇｏ２）が標的ＲＮＡを切断する。ガイド鎖は常に相補的センス鎖またはタンパク質（ＲＩＳＣ）のいずれかに関連付けられている。対照的に、ＡＳＯは生き残り、一本鎖として機能する必要がある。ＡＳＯは標的ＲＮＡに結合し、リボソームまたはスプライシング因子などの他の因子がＲＮＡに結合するのをブロックするか、またはヌクレアーゼなどのタンパク質を動員する。目的の作用メカニズムに基づいて、ＡＳＯに対して様々な改変と標的領域が選択される。ギャップマーは、ＤＮＡの中央の８～１０塩基ギャップに隣接する各末端に２～５個の化学修飾ヌクレオチド（例えば、ＬＮＡまたは２’－ＭＯＥ）を含むＡＳＯオリゴヌクレオチドである。標的ＲＮＡに結合した後、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドはＲＮａｓｅ Ｈの基質として機能する。
Ｄ．非ヒト動物または細胞へのヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の投与
本明細書に開示される方法は、非ヒト動物または細胞に、核酸、タンパク質、核酸－タンパク質複合体、タンパク質複合体、または小分子を含む、様々な分子（例えば、治療用分子または複合体などのヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬）を導入することを含み得る。「導入すること」は、細胞の内部または非ヒト動物細胞の内部にアクセスできるような方法で、細胞または非ヒト動物に分子（例えば、核酸またはタンパク質）を提示することが含まれる。導入することは、任意の手段によって達成することができ、２つ以上の構成要素（例えば、２つの構成要素、またはすべての構成要素）を、任意の組み合わせで同時にまたは逐次的に細胞または非ヒト動物に導入することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡの導入前に細胞または非ヒト動物に導入することができ、またはガイドＲＮＡの導入後に導入することができる。別の例として、外因性ドナー核酸は、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡの導入前に導入することができるか、またはＣａｓタンパク質およびガイドＲＮＡの導入後に導入することができる（例えば、外因性ドナー核酸は、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡの導入の約１、２、３、４、８、１２、２４、３６、４８、または７２時間前または後に投与することができる）。例えば、ＵＳ２０１５／０２４０２６３およびＵＳ２０１５／０１１０７６２を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに、２つ以上の構成要素は、同じ送達方法または異なる送達方法によって細胞または非ヒト動物に導入することができる。同様に、２つ以上の成分は、同じ投与経路または異なる投与経路によって非ヒト動物に導入することができる。
いくつかの方法では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの構成要素が非ヒト動物または細胞に導入される。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ（例えば、インビトロ転写されたＲＮＡ）の形態で、またはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で非ヒト動物または細胞に導入することができる。ＤＮＡの形態で導入されると、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、非ヒト動物の細胞内で活性のあるプロモーターに作動可能に連結することができる。例えば、ガイドＲＮＡは、ＡＡＶを介して送達され、Ｕ６プロモーターの下で、インビボで発現され得る。そのようなＤＮＡは、１つ以上の発現構築物中にあり得る。例えば、そのような発現構築物は、単一の核酸分子の構成要素であり得る。代替的に、それらは、２つ以上の核酸分子の間で任意の組み合わせで分離することができる（すなわち、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードするＤＮＡおよび１つ以上のｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、別個の核酸分子の構成要素であり得る）。
同様に、Ｃａｓタンパク質は、任意の形態で提供することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓタンパク質などのタンパク質の形態で提供することができる。代替的に、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））またはＤＮＡなどの、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形態で提供することができる。任意選択的に、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、特定の細胞または生物におけるタンパク質への効率的な翻訳のためにコドン最適化することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、または任意の他の目的の宿主細胞においてより高い頻度で使用される代替コドンへと改変することができる。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸が非ヒト動物に導入されると、Ｃａｓタンパク質は、一時的、条件付き、または構成的に細胞内で発現され得る。
Ｃａｓタンパク質またはガイドＲＮＡをコードする核酸は、発現コンストラクト中のプロモーターに作動可能に連結され得る。発現構築物は、遺伝子または他の目的の核酸配列（例えば、Ｃａｓ遺伝子）の発現を指示することができ、かつそのような目的の核酸配列を標的細胞に移すことができる任意の核酸構築物を含む。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、１つ以上のｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクター内に存在し得る。代替的に、それは、１つ以上のｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターとは別のベクターまたはプラスミドであり得る。発現コンストラクトにおいて使用することができる好適なプロモーターとしては、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発生が制限された前駆細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または１細胞期胚のうちの１つ以上において活性なプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであり得る。任意選択的に、プロモーターは、一方向のＣａｓタンパク質と他の方向のガイドＲＮＡの両方の発現を駆動する双方向プロモーターであり得る。このような双方向プロモーターは、（１）遠位配列要素（ＤＳＥ）、近位配列要素（ＰＳＥ）、およびＴＡＴＡボックスの３つの外部制御要素を含む完全な従来の一方向Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、ならびに（２）ＤＳＥの５’末端に逆方向に融合されたＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを含む第２の基本的なＰｏｌ ＩＩＩプロモーターで構成することができる。例えば、Ｈ１プロモーターでは、ＤＳＥはＰＳＥとＴＡＴＡボックスに隣接しており、プロモーターは、Ｕ６プロモーターに由来するＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを追加することによって逆方向の転写が制御されるハイブリッドプロモーターを作成することにより、双方向にすることができる。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００７４５３５を参照されたい。双方向プロモーターを使用してＣａｓタンパク質とガイドＲＮＡをコードする遺伝子を同時に発現させることにより、コンパクトな発現カセットを生成して送達を容易にすることができる。
非ヒト動物または細胞に導入された分子（例えば、Ｃａｓタンパク質またはガイドＲＮＡまたはＲＮＡｉ剤またはＡＳＯ）は、導入された分子の安定性を増加させる担体（例えば、所与の貯蔵条件下（例えば、－２０℃、４℃、または周囲温度）での、分解産物が閾値未満、例えば出発核酸またはタンパク質の０．５重量％未満のままである期間を延長する、またはインビボでの安定性を増加させる）を含む組成物で提供することができる。そのような担体の非限定的な例には、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）ミクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－コグリコール－酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コキレート（ｃｏｃｈｌｅａｔｅｓ）、および脂質微小管が挙げられる。
細胞または非ヒト動物への分子（例えば、核酸またはタンパク質）の導入を可能にするために、様々な方法および組成物が本明細書で提供される。分子を様々な細胞型に導入するための方法は既知であり、例えば、安定したトランスフェクション法、一過性トランスフェクション法、およびウイルス媒介法が含まれる。
トランスフェクションプロトコル、ならびに分子を細胞に導入するためのプロトコルは異なり得る。非限定的なトランスフェクション法には、リポソーム、ナノ粒子、リン酸カルシウム（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２（２）：４５６－６７、Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４（４）：１５９０－４、およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ（１９９１）．Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ．ｐｐ．９６－９７）、デンドリマー、またはＤＥＡＥ－デキストランもしくはポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーを使用する化学物質ベースのトランスフェクション法が含まれる。非化学的方法には、電気穿孔法、ソノポレーション、および光トランスフェクションが含まれる。粒子ベースのトランスフェクションには、遺伝子銃の使用、またはマグネットアシストトランスフェクション（Ｂｅｒｔｒａｍ（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７，２７７－２８）が含まれる。ウイルス法もトランスフェクションに使用することができる。
細胞への核酸またはタンパク質の導入はまた、エレクトロポレーション、細胞質内注射、ウイルス感染、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、トランスフェクション、脂質媒介トランスフェクション、またはヌクレオフェクションによって媒介され得る。ヌクレオフェクションは、核酸基質を細胞質だけでなく核膜を介して核に送達することを可能にする改良されたエレクトロポレーション技術である。加えて、本明細書に開示される方法でのヌクレオフェクションの使用は、典型的には、通常の電気穿孔法よりもはるかに少ない細胞を必要とする（例えば、通常の電気穿孔法による７００万に対してわずか約２００万）。一例において、ヌクレオフェクションは、ＬＯＮＺＡ（登録商標）ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）システムを使用して行われる。
細胞（例えば、接合子）への分子（例えば、核酸またはタンパク質）の導入は、マイクロインジェクションによっても達成され得る。接合子（すなわち、１細胞期胚）では、マイクロインジェクションは母体および／または父方の前核または細胞質に行うことができる。マイクロインジェクションが１つの前核のみに行われる場合は、サイズが大きいため、父方の前核が適している。ｍＲＮＡのマイクロインジェクションは、好ましくは細胞質へ（例えば、ｍＲＮＡを翻訳機構に直接送達するために）のものであるが、一方で、Ｃａｓタンパク質もしくはＣａｓタンパク質をコードするかまたはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドのマイクロインジェクションは、核／前核へのものが好ましい。代替的に、マイクロインジェクションは、核／前核および細胞質の両方への注射によって実施することができ、針を最初に核／前核に導入し、最初の量を注射することができ、１細胞期胚から針を除去しながら、２番目の量を細胞質に注射することができる。Ｃａｓタンパク質が細胞質に注入される場合、Ｃａｓタンパク質は、核／前核への送達を確実にするために、核局在化シグナルを含むことが好ましい。マイクロインジェクションを実施する方法は周知である。例えば、Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｇｙ Ａ，Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ Ｍ，Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ Ｋ，Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｒ．，２００３，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）を参照されたく、またＭｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０７：１５０２２－１５０２６、およびＭｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０９：９３５４－９３５９も参照されたい。
分子（例えば、核酸またはタンパク質）を細胞または非ヒト動物に導入するための他の方法には、例えば、ベクター送達、粒子媒介送達、エクソソーム媒介送達、脂質ナノ粒子媒介送達、細胞透過性ペプチド媒介送達、または埋め込み型デバイス媒介配達が含まれ得る。特定の例として、核酸またはタンパク質は、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）マイクロスフェア、ポリ（Ｄ、Ｌ－乳酸－コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質渦巻状物、または脂質微小管などの担体中で、細胞または非ヒト動物に導入することができる。非ヒト動物への送達のいくつかの特定の例には、流体力学的送達、ウイルス媒介送達（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達）、および脂質ナノ粒子媒介送達が含まれる。
細胞または非ヒト動物への核酸およびタンパク質の導入は、流体力学的送達（ＨＤＤ）によって達成することができる。実質細胞への遺伝子送達では、必須のＤＮＡ配列のみを選択した血管から注射する必要があり、現在のウイルスおよび合成ベクターに関連する安全性の懸念が排除される。ＤＮＡは血流に注入されると、血液にアクセスできる様々な組織の細胞に到達することができる。流体力学的送達は、循環中の非圧縮性血液への大量の溶液の迅速な注射によって生成される力を利用して、大きくかつ膜不透過性の化合物が実質細胞に入るのを妨げる内皮および細胞膜の物理的障壁を克服する。ＤＮＡの送達に加えて、この方法は、ＲＮＡ、タンパク質、および他の小さな化合物をインビボで効率的に細胞内に送達するのに役立つ。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｏｎａｍａｓｓａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２８（４）：６９４－７０１を参照されたい。
核酸の導入は、ＡＡＶ媒介送達またはレンチウイルス媒介送達などのウイルス媒介送達によっても達成することができる。他の例示的なウイルス／ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、および単純ヘルペスウイルスが含まれる。ウイルスは、分裂細胞、非分裂細胞、または分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染し得る。ウイルスは、宿主ゲノムに組み込むことができるか、または代替的に宿主ゲノムに組み込まない。このようなウイルスは、免疫力が低減するように操作することもできる。ウイルスは、複製可能であり得、複製欠損性（例えば、ビリオン複製および／またはパッケージングの追加ラウンドに必要な１つ以上の遺伝子に欠損がある）であり得る。ウイルスは、一過性の発現、長期的な発現（例えば、少なくとも１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月、または３ヶ月）、または永続的な発現（例えば、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡの）を引き起こし得る。例示的なウイルス力価（例えば、ＡＡＶ力価）は、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、および１０１６ベクターゲノム／ｍＬを含む。
ｓｓＤＮＡ ＡＡＶゲノムは、２つのオープンリーディングフレーム、ＲｅｐおよびＣａｐで構成され、相補的ＤＮＡ鎖の合成を可能にする２つの末端逆位配列が隣接している。ＡＡＶトランスファープラスミドを構築する場合、導入遺伝子は、２つのＩＴＲの間に配置され、ＲｅｐおよびＣａｐは、トランスで供給され得る。ＲｅｐおよびＣａｐに加えて、ＡＡＶはアデノウイルス由来の遺伝子を含むヘルパープラスミドを必要とする場合がある。これらの遺伝子（Ｅ４、Ｅ２ａ、およびＶＡ）はＡＡＶ複製を仲介する。例えば、トランスファープラスミド、Ｒｅｐ／Ｃａｐ、およびヘルパープラスミドをアデノウイルス遺伝子Ｅ１＋を含むＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトして、感染性ＡＡＶ粒子を生成することができる。代替的に、Ｒｅｐ、Ｃａｐ、およびアデノウイルスヘルパー遺伝子を組み合わせて単一のプラスミドとすることもできる。同様のパッケージングセルおよび方法は、レトロウイルスなどの他のウイルスにも使用できる。
ＡＡＶの複数の血清型が確認されている。これらの血清型は、感染する細胞の種類（すなわち、それらの指向性）が異なり、特定の細胞型の優先的な形質導入を可能にする。ＣＮＳ組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が含まれる。心臓組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が含まれる。腎臓組織に対する血清型にはＡＡＶ２が含まれる。肺組織に対する血清型には、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、およびＡＡＶ９が含まれる。膵臓組織に対する血清型にはＡＡＶ８が含まれる。光受容細胞に対する血清型には、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ８が含まれる。網膜色素上皮組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ８が含まれる。骨格筋組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が含まれる。肝臓組織に対する血清型には、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９、特にＡＡＶ８が含まれる。
指向性は、キャプシドと異なるウイルス血清型からのゲノムの混合である偽型付けによってさらに洗練することができる。例えば、ＡＡＶ２／５は、血清型５のキャプシドにパッケージされた血清型２のゲノムを含むウイルスを示す。偽型ウイルスの使用は、形質導入効率を改善するだけでなく、指向性を変えることができる。異なる血清型に由来するハイブリッドキャプシドを使用して、ウイルスの指向性を改変することもできる。例えば、ＡＡＶ－ＤＪには、８つの血清型由来のハイブリッドキャプシドが含まれており、インビボで幅広い細胞型にわたって高い感染力を示す。ＡＡＶ－ＤＪ８は、ＡＡＶ－ＤＪの特性を示すが、脳への取り込みが増強された別の例である。ＡＡＶ血清型は、変異によっても修飾することができる。ＡＡＶ２の変異修飾の例には、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、およびＳ６６２Ｖが含まれる。ＡＡＶ３の変異修飾の例には、Ｙ７０５Ｆ、Ｙ７３１Ｆ、およびＴ４９２Ｖが含まれる。ＡＡＶ６の変異修飾の例には、Ｓ６６３ＶおよびＴ４９２Ｖが含まれる。他の偽型／修飾ＡＡＶバリアントには、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ８．２、およびＡＡＶ／ＳＡＳＴＧが含まれる。
導入遺伝子の発現を加速するために、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）バリアントを使用することができる。ＡＡＶは細胞のＤＮＡ複製機構に依存して、ＡＡＶの一本鎖ＤＮＡゲノムの相補的鎖を合成するため、導入遺伝子の発現が遅れる可能性がある。この遅延に対処するために、感染時に自発的にアニーリングすることができる相補的配列を含むｓｃＡＡＶを使用することができ、宿主細胞のＤＮＡ合成の必要性を排除する。しかしながら、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターも使用できる。
パッケージング容量を増加させるために、より長い導入遺伝子を、１つ目は３’スプライスドナー、２つ目は５’スプライスアクセプターである２つのＡＡＶトランスファープラスミドに分割することができる。細胞の共感染時に、これらのウイルスはコンカテマーを形成し、一緒にスプライシングされ、完全長の導入遺伝子を発現させることができる。これにより、より長い導入遺伝子の発現が可能になるが、発現の効率は低下する。容量を増加させるための同様の方法は、相同組換えを利用する。例えば、導入遺伝子は２つのトランスファープラスミドに分割できるが、共発現が相同組換えおよび全長導入遺伝子の発現を誘導するように、実質的な配列の重複がある。
核酸およびタンパク質の導入は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介送達によっても達成できる。例えば、ＬＮＰ媒介送達は、Ｃａｓ ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡの組み合わせ、またはＣａｓタンパク質およびガイドＲＮＡの組み合わせを送達するために使用することができる。このような方法による送達は、Ｃａｓの一時的発現をもたらし、生分解性脂質はクリアランスを改善し、忍容性を改善し、免疫原性を低下させる。脂質製剤は、生体分子を分解から保護すると同時に、細胞への取り込みを改善することができる。脂質ナノ粒子は、分子間力によって互いに物理的に結合した複数の脂質分子を含む粒子である。これらには、ミクロスフェア（単層および多層ベシクル、例えば、リポソームを含む）、エマルジョン中の分散相、ミセル、または懸濁液中の内相が含まれる。そのような脂質ナノ粒子は、送達のために１つ以上の核酸またはタンパク質をカプセル化するために使用することができる。カチオン性脂質を含む製剤は、核酸などのポリアニオンを送達するのに有用である。含めることができる他の脂質は、中性脂質（すなわち、非荷電または両性イオン脂質）、陰イオン脂質、トランスフェクションを増強するヘルパー脂質、およびナノ粒子がインビボで存在できる時間を増加させるステルス脂質である。好適なカチオン性脂質、中性脂質、アニオン性脂質、ヘルパー脂質、およびステルス脂質の例は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１６／０１０８４０Ａ１に見出すことができる。例示的な脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質および１つ以上の他の成分を含むことができる。一例において、他の成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質を含むことができる。別の例において、他の成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質およびＤＳＰＣなどの中性脂質を含むことができる。別の例において、他の成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質、ＤＳＰＣなどの任意の中性脂質、およびＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３などのステルス脂質を含むことができる。
ＬＮＰは、以下の１つ以上またはすべてを含み得る：（ｉ）カプセル化およびエンドソーム脱出のための脂質、（ｉｉ）安定化のための中性脂質、（ｉｉｉ）安定化のためのヘルパー脂質、および（ｉｖ）ステルス脂質。例えば、それらの各々が、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２２：１－９およびＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１を参照されたい。特定のＬＮＰにおいて、カーゴはガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含むことができる。特定のＬＮＰにおいて、カーゴは、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、およびガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含み得る。
カプセル化およびエンドソーム脱出のための脂質は、カチオン性脂質であり得る。脂質はまた、生分解性イオン化可能脂質などの生分解性脂質であり得る。好適な脂質の一例は、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノアートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノアートである脂質ＡまたはＬＰ０１である。例えば、それらの各々が、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２２：１－９およびＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１を参照されたい。好適な脂質の別の例は、（（５－（（ジメチルアミノ）メチル）－１，３－フェニレン）ビス（オキシ））ビス（オクタン－８，１－ジイル）ビス（デカノアート）とも呼ばれる、（（５－（（ジメチルアミノ）メチル）－１，３－フェニレン）ビス（オキシ））ビス（オクタン－８，１－ジイル）ビス（デカノアート）である脂質Ｂである。好適な脂質の別の例は、２－（（４－（（（３－（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン－１，３－ジイル（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（オクタデカ－９，１２－ジエノアート）である脂質Ｃである。好適な脂質の別の例は、３－（（（３－（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）－１３－（オクタノイルオキシ）トリデシル３－オクチルウンデカノアートである脂質Ｄである。他の好適な脂質としては、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３））としても既知である）が挙げられる。
本明細書に記載のＬＮＰでの使用に好適ないくつかのそのような脂質は、インビボで生分解性である。例えば、そのような脂質を含むＬＮＰには、脂質の少なくとも７５％が、８、１０、１２、２４、もしくは４８時間以内、または３、４、５、６、７、もしくは１０日以内に血漿から除去されるものが含まれる。別の例として、ＬＮＰの少なくとも５０％が、８、１０、１２、２４、もしくは４８時間以内、または３、４、５、６、７、もしくは１０日以内に血漿から除去される。
このような脂質は、それらが含まれる培地のｐＨに応じてイオン化可能であり得る。例えば、わずかに酸性の培地では、脂質は、プロトン化され、したがって正電荷を帯びることができる。逆に、例えば、ｐＨが約７．３５である血液などのわずかに塩基性の媒体では、脂質はプロトン化されない可能性があり、したがって電荷を帯びない可能性がある。いくつかの実施形態では、脂質は、少なくとも約９、９．５、または１０のｐＨでプロトン化され得る。そのような脂質が電荷を帯びる能力は、その固有のｐＫａに関連している。例えば、脂質は、独立して、約５．８～約６．２の範囲のｐＫａを有し得る。
中性脂質は、ＬＮＰを安定化し、その加工を改善するよう機能する。好適な中性脂質の例には、様々な中性、非荷電、または双性イオン性脂質が含まれる。本開示における使用に好適な中性リン脂質の例は、５－ヘプタデシルベンゼン－１，３－ジオール（レゾルシノール）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＬＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＡＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジラウリロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１－ミリストイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１－パルミトイル－２－ミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１，２－ジアラキドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１－ステアロイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１，２－ジエイコセノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、リソホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジリノレオイルホスファチジルコリンジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パルミトイルロレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、リソホスファチジルエタノールアミンおよびこれらの組み合わせを含むが、これらには限定されない。例えば、中性リン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、およびジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）からなる群から選択され得る。
ヘルパー脂質には、トランスフェクションを増強する脂質が含まれる。ヘルパー脂質がトランスフェクションを増強するメカニズムは、粒子安定性を増強することを含み得る。場合によっては、ヘルパー脂質は、膜の融合性を増強することができる。ヘルパー脂質は、ステロイド、ステロール、およびアルキルレゾルシノールを含む。好適な好適なヘルパー脂質の例には、コレステロール、５－ヘプタデシルレゾルシノール、およびヘミコハク酸コレステロールが含まれる。一例において、ヘルパー脂質は、コレステロールまたはヘミコハク酸コレステロールであり得る。
ステルス脂質は、ナノ粒子がインビボで存在することができる時間の長さを変える脂質を含む。ステルス脂質は、例えば、粒子凝集を低減し、粒子サイズを制御することによって、製剤化プロセスにおいて支援し得る。ステルス脂質は、ＬＮＰの薬物動態特性を調節し得る。好適なステルス脂質には、脂質部分に連結された親水性頭部基を有する脂質が含まれる。
ステルス脂質の親水性頭部基は、例えば、ＰＥＧ（時折、ポリ（エチレンオキシド）と称される）、ポリ（オキサゾリン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（グリセロール）、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリアミノ酸、およびポリＮ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドに基づくポリマーから選択されるポリマー部分を含み得る。ＰＥＧという用語は、ポリエチレングリコールまたは他のポリアルキレンエーテルポリマーを意味する。特定のＬＮＰ製剤において、ＰＥＧはＰＥＧ２０００とも呼ばれるＰＥＧ－２Ｋであり、平均分子量は約２，０００ダルトンである。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１を参照されたい。
ステルス脂質の脂質部分は、例えば、独立して約Ｃ４～約Ｃ４０の飽和または不飽和の炭素原子を含むアルキル鎖長を有するジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基を含むものを含むジアシルグリセロールまたはジアシルグリカミドから由来し得、ここで鎖は１つ以上の、例えばアミドまたはエステルなどの官能基を含み得る。ジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基は、１つ以上の置換アルキル基をさらに含み得る。
一例として、ステルス脂質は、ＰＥＧ－ジラウロイルグリセロール、ＰＥＧ－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、およびＰＥＧ－ジステアロイルグリカミド、ＰＥＧ－コレステロール（ｌ－［８’－（コレスト－５－エン－３［ベータ］－オキシ）カルボキシアミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＭＢ（３，４－ジテトラデコキシルベンジル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＧ）、ポリ（エチレングリコール）－２０００－ジメタクリレート（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＡ））、および１，２－ジステアリルオキシプロピル－３－アミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＡ）から選択され得る。１つの特定の例において、ステルス脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧであり得る。
ＬＮＰは、製剤中の成分脂質の異なるそれぞれのモル比を含むことができる。ＣＣＤ脂質のモル％は、例えば、約３０モル％～約６０モル％、約３５モル％～約５５モル％、約４０モル％～約５０モル％、約４２モル％～約４７モル％、または約４５％であり得る。ヘルパー脂質のモル％は、例えば、約３０モル％～約６０モル％、約３５モル％～約５５モル％、約４０モル％～約５０モル％、約４１モル％～約４６モル％、または約４４モル％であり得る。中性脂質のモル％は、例えば、約１モル％～約２０モル％、約５モル％～約１５モル％、約７モル％～約１２モル％、または約９モル％であり得る。ステルス脂質のモル％は、例えば、約１モル％～約１０モル％、約１モル％～約５モル％、約１モル％～約３モル％、約２モル％、または約１モル％であり得る。
ＬＮＰは、生分解性脂質（Ｎ）の正に帯電したアミン基と、カプセル化される核酸の負に帯電したリン酸基（Ｐ）との間で異なる比を有することができる。これは、方程式Ｎ／Ｐで数学的に表すことができる。例えば、Ｎ／Ｐ比は、約０．５～約１００、約１～約５０、約１～約２５、約１～約１０、約１～約７、約３～約５、約４～約５、約４、約４．５、または約５であり得る。Ｎ／Ｐ比はまた、約４～約７または約４．５～約６であり得る。特定の例において、Ｎ／Ｐ比は、４．５または６であり得る。
一部のＬＮＰでは、カーゴはＣａｓ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを含むことができる。Ｃａｓ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡは、異なる比であり得る。例えば、ＬＮＰ製剤は、約２５：１～約１：２５の範囲、約１０：１～約１：１０の範囲、約５：１～約１：５の範囲、または約１：１のＣａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡとの比を含み得る。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１～約１：５、または約１０：１のＣａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡ核酸との比を含み得る。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１０、２５：１、１０：１、５：１、３：１、１：１、１：３、１：５、１：１０、または１：２５のＣａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡ核酸との比を含み得る。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１～約１：２の、Ｃａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡ核酸との比を含み得る。特定の例において、Ｃａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡとの比は、約１：１または約１：２であり得る。
一部のＬＮＰでは、カーゴは外因性ドナー核酸およびｇＲＮＡを含むことができる。外因性ドナー核酸およびｇＲＮＡは、異なる比にすることができる。例えば、ＬＮＰ製剤は、約２５：１～約１：２５の範囲、約１０：１～約１：１０の範囲、約５：１～約１：５、または約１：１の外因性ドナー核酸とｇＲＮＡとの比を含み得る。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１～約１：５、約５：１～約１：１、約１０：１、または約１：１０の外因性ドナー核酸とｇＲＮＡとの比を含み得る。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１０、２５：１、１０：１、５：１、３：１、１：１、１：１：３、１：５、１：１０、または１：２５の外因性ドナー核酸とｇＲＮＡ核酸との比を含み得る。
好適なＬＮＰの特定の例は、４．５の窒素対リン酸塩（Ｎ／Ｐ）比を有し、４５：４４：９：２のモル比で生分解性カチオン性脂質、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを含む。生分解性カチオン性脂質は、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノアートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノアートであり得る。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２２：１－９を参照されたい。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡに対して重量比で１：１にすることができる。好適なＬＮＰの別の特定の例には、Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ－ＤＭＧが５０：３８．５：１０：１．５のモル比で含まれている。
好適なＬＮＰの別の特定の例は、６の窒素対リン酸塩（Ｎ／Ｐ）比を有し、５０：３８：９：３のモル比で生分解性カチオン性脂質、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを含む。生分解性カチオン性脂質は、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノアートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノアートであり得る。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡに対して重量比で１：２にすることができる。
免疫原性を低下させるために、送達様式を選択することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質およびｇＲＮＡは、異なる様式（例えば、バイモーダル（ｂｉ－ｍｏｄａｌ）送達）によって送達され得る。これらの異なる様式は、対象の送達された分子（例えば、Ｃａｓまたは核酸をコードする、ｇＲＮＡまたは核酸をコードする、または外因性ドナー核酸／修復テンプレート）に異なる薬力学または薬物動態特性を与える可能性がある。例えば、異なる様式は、異なる組織分布、異なる半減期、または異なる時間的分布をもたらす可能性がある。いくつかの送達様式（例えば、自律複製またはゲノム組み込みによって細胞内で持続する核酸ベクターの送達）は、分子のより持続的な発現および存在をもたらすが、他の送達様式は、一過性で持続性が低い（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質の送達）。例えばｍＲＮＡまたはタンパク質としてのより一時的な方法でのＣａｓタンパク質の送達は、Ｃａｓ／ｇＲＮＡ複合体が短期間のみ存在し、活性であることを保証し、ＭＨＣ分子によって細胞の表面に表示される細菌由来のＣａｓ酵素からのペプチドによって引き起こされる免疫原性を低下させることができる。このような一時的な送達は、オフターゲット修飾の可能性を低減することもできる。
インビボでの投与は、例えば、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局所、鼻腔内、または筋肉内を含む任意の好適な経路によることができる。全身投与様式には、例えば、経口および非経口経路が含まれる。非経口経路の例には、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、皮内、皮下、鼻腔内、および腹腔内経路が含まれる。特定の例は、静脈内注入である。鼻腔内注入および硝子体内注射は、他の特定の例である。局所投与様式には、例えば、髄腔内、脳室内、実質内（例えば、線条体（例えば、尾状核または被殻へ）、大脳皮質、前中心回旋、海馬（例えば、歯状回またはＣＡ３領域）、側頭皮質、扁桃体、前頭皮質、視床、小脳、髄質、視床、視蓋、被殻、またはニグラ実質への局所的な実質内送達）、眼内、眼窩内、結膜下、硝子体内、網膜下、および強膜を介した経路が含まれる。（全身的アプローチと比較して）有意に少量の成分は、全身的に投与された場合（例えば、静脈内）と比較して、局所的に投与された場合（例えば、実質内または硝子体内）に効果を発揮し得る。局所投与様式はまた、治療有効量の成分が全身投与されるときに起こり得る潜在的に毒性の副作用の発生率を低減または排除し得る。
インビボでの投与は、例えば、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局所、鼻腔内、または筋肉内を含む任意の好適な経路によることができる。特定の例は、静脈内注入である。ガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓタンパク質（またはガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓタンパク質をコードする核酸）を含む組成物は、１つ以上の生理学的および薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または助剤を使用して処方することができる。製剤は、選択した投与経路に依存する可能性がある。「薬学的に許容される」という用語は、担体、希釈剤、賦形剤、または補助剤が製剤の他の成分と適合性であり、そのレシピエントに実質的に有害ではないことを意味する。
投与の頻度および投与回数は、他の要因の中でもとりわけ、外因性ドナー核酸またはガイドＲＮＡ、またはＣａｓタンパク質（またはガイドＲＮＡもしくはＣａｓタンパク質をコードする核酸）の半減期および投与経路に依存し得る。細胞または非ヒト動物への核酸またはタンパク質の導入は、ある期間にわたって１回または複数回実施することができる。例えば、導入は、ある期間にわたって少なくとも２回、ある期間にわたって少なくとも３回、ある期間にわたって少なくとも４回、ある期間にわたって少なくとも５回、ある期間にわたって少なくとも６回、ある期間にわたって少なくとも７回、ある期間にわたって少なくとも８回、ある期間にわたって少なくとも９回、ある期間にわたって少なくとも１０回、ある期間にわたって少なくとも１１回、ある期間にわたって少なくとも１２回、ある期間にわたって少なくとも１３回、ある期間にわたって少なくとも１４回、ある期間にわたって少なくとも１５回、ある期間にわたって少なくとも１６回、ある期間にわたって少なくとも１７回、ある期間にわたって少なくとも１８回、ある期間にわたって少なくとも１９回、またはある期間にわたって少なくとも２０回、実施することができる。
Ｅ．インビボまたはエクスビボでのヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の送達、活性、または有効性の測定
本明細書に開示される方法は、ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の活性を検出または測定することをさらに含み得る。そのような試薬の活性を測定することは、肝臓の脂肪含有量を測定すること（例えば、高ショ糖食で）および／または肝臓の脂肪滴中のＰＮＰＬＡ３レベルを測定することを含み得る。例えば、肝臓の脂肪含有量の減少または肝臓の脂肪滴中のＰＮＰＬＡ３レベルの減少は、ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬のより高い活性を示している可能性がある。他の活性の読み出しには、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）または肝脂肪症の他の既知の読み出し（例えば、兆候または症状）が含まれ得る。活性の増加は、ＮＡＦＬＤまたは肝脂肪症の兆候または症状の減少によって示され得る。
ヒト－ＰＮＰＬＡ３標的化試薬がゲノム編集試薬である場合、測定は、改変についてヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を評価することを含み得る。標的化遺伝子改変を有する細胞を同定するために様々な方法を使用することができる。スクリーニングは、親染色体の対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を評価するための定量的アッセイを含むことができる。例えば、すべての目的のために各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００４／００１８６２６、ＵＳ２０１４／０１７８８７９、ＵＳ２０１６／０１４５６４６、ＷＯ２０１６／０８１９２３、およびＦｒｅｎｄｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５－３０７を参照されたい。例えば、定量的アッセイは、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）などの定量的ＰＣＲを介して実施することができる。リアルタイムＰＣＲは、標的遺伝子座を認識する第１のプライマーセットおよび非標的参照遺伝子座を認識する第２のプライマーセットを利用することができる。プライマーセットは、増幅された配列を認識する蛍光プローブを含むことができる。好適な定量的なアッセイの他の例としては、蛍光媒介インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化プローブに対する定量的ハイブリダイゼーション、ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）プローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分子ビーコンプローブ、またはＥＣＬＩＰＳＥ（商標）プローブ技術が挙げられる（例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００５／０１４４６５５を参照されたい）。次世代シーケンシング（ＮＧＳ）もまた、スクリーニングに使用することができる。次世代シーケンシングは、「ＮＧＳ」または「超並列シーケンシング」または「ハイスループットシーケンシング」と称され得る。ＮＧＳは、ＭＯＡアッセイに加えてスクリーニングツールとして使用して、標的となる遺伝子改変の正確な性質と、それが細胞タイプ、組織タイプ、または臓器タイプ間で一貫しているかどうかを定義することができる。
試薬が、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を不活性化するか、ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座の発現に影響を与えるか、またはヒト化ＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡの翻訳を防止するように設計されている場合、測定することは、ヒト化ＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡまたはタンパク質発現を評価することを含み得る。
非ヒト動物における評価は、任意の組織または臓器からの任意の細胞型にあり得る。例えば、評価は、同じ組織もしくは臓器（例えば、肝臓）からの複数の細胞型、または組織もしくは臓器内の複数の場所からの細胞で行うことができる。これは、標的組織もしくは臓器内のどの細胞型が標的化されているか、または組織もしくは臓器のどのセクションがヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬によって到達されているかについての情報を提供することができる。別の例として、評価は複数の種類の組織または複数の臓器で行うことができる。特定の組織、臓器、または細胞型が標的にされる方法では、これは、その組織または臓器がどれほど効果的に標的にされるか、および他の組織または臓器にオフターゲット効果があるかどうかについての情報を提供することができる。
使用できるアッセイの一例は、無傷の固定組織との関連で、単一ヌクレオチドの変化を含む、細胞特異的に編集された転写産物を定量化することができる方法である、ＲＮＡＳＣＯＰＥ（商標）およびＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）アッセイである。ＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）ＲＮＡ ＩＳＨアッセイは、遺伝子編集の特性評価においてＮＧＳおよびｑＰＣＲを補完することができる。ＮＧＳ／ｑＰＣＲは野生型および編集された配列の定量的平均値を提供できるが、組織内の編集された細胞の不均一性またはパーセンテージに関する情報は提供しない。ＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）ＩＳＨアッセイは、組織全体のランドスケープビューと、編集されたｍＲＮＡ転写物を含む標的組織内の実際の細胞数を定量化できる単一細胞分解能での野生型対編集された転写物の定量化とを提供できる。ＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）アッセイは、ペアオリゴ（「ＺＺ」）プローブを使用して非特異的なバックグラウンドなしでシグナルを増幅し、単一分子ＲＮＡ検出を実現する。しかしながら、ＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）プローブの設計とシグナル増幅システムにより、ＺＺプローブを使用した単一分子ＲＮＡの検出が可能になり、無傷の固定組織における単一ヌクレオチドの編集と変異を差次的に検出できる。
上記または下記で引用されているすべての特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、アクセッション番号などは、各項目が、参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されたのと同じ程度に、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。配列の異なるバージョンが違う時間にアクセッション番号に関連付けられている場合、本出願の有効な出願日においてアクセッション番号に関連付けられるバージョンを意味する。有効な出願日とは、該当する場合、アクセッション番号に関する実際の出願日以前または優先出願の出願日を意味する。同様に、刊行物、ウェブサイトなどの異なるバージョンが違う時間に公開されている場合、別段の指定のない限り、本出願の有効な出願日の直近に公開されたバージョンを意味する。別段に他の指示がない限り、本発明の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態、または態様を、任意の他のものと組み合わせて使用することができる。本発明は、明瞭さおよび理解の目的に対し図表および例を介していくつかの詳細が記載されているが、添付の特許請求の範囲内で、ある特定の変化および修正を実施することができることが明らかになろう。
配列の簡単な説明
添付の配列表に列記されているヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基のための標準的な文字略語、およびアミノ酸のための三文字表記を使用して示されている。ヌクレオチド配列は、配列の５’末端から始まって先へ（すなわち、各行で左から右へ）進み３’末端に至る標準規則に従っている。各ヌクレオチド配列の１本の鎖のみが示されているが、相補的鎖は、示されている鎖を任意に参照することによって含まれると理解される。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が提供される場合、同じアミノ酸配列をコードするそのコドン縮重バリアントもまた提供されることが理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端から始まって先へ（すなわち、各行で左から右へ）進みカルボキシ末端に至る標準規則に従っている。
Figure 2023511626000003
実施例１．ヒト化ＰＮＰＬＡ３ Ｉ１４８Ｍ／Ｋ４３４Ｅ遺伝子座を含むマウスの生成
２０．０ｋｂのマウスＰｎｐｌａ３遺伝子座を含む５’相同性アームおよび８．９ｋｂのマウスＰｎｐｌａ３遺伝子座を含む３’相同性アームを含む大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を生成して、マウスＰｎｐｌａ３遺伝子からの１３．３ｋｂの領域を、ＰＮＰＬＡ３ミスセンス突然変異Ｉ１４８ＭおよびＫ４３４Ｅをコードする突然変異を含むヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子の２３．３ｋｂの対応する配列に置き換えた。マウスおよびヒトのＰＮＰＬＡ３遺伝子に関する情報を表３に提供する。大きな標的化ベクターの生成の説明を表４に提供する。ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子工学技術を使用する細菌相同組換え（ＢＨＲ）反応によって細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡ由来の大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の生成および使用は、例えば、ＵＳ６，５８６，２５１およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１（６）：６５２－６５９に記載され、これらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。インビトロアセンブリ法によるＬＴＶＥＣの生成は、例えば、ＵＳ２０１５／０３７６６２８およびＷＯ２０１５／２００３３４を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Figure 2023511626000004
Figure 2023511626000005
具体的には、イントロン７の最初の１６０塩基対およびエキソン１～７（すなわち、コーディングエキソン１～エキソン７）のすべてのイントロンを含む、エキソン１（コーディングエキソン１；アミノ酸１から）から開始してエキソン７までの領域を、マウスＰｎｐｌａ３遺伝子座から削除した（Ｐｎｐｌａ３マウスエキソン８および隣接するイントロン７の４７６４塩基対を保存する）。クロマチン免疫沈降シーケンシング（ＣｈＩＰ－Ｓｅｑ）により、マウスＰｎｐｌａ３の最後のイントロンが、下流の遺伝子（Ｓａｍｍ５０）の発現に影響を与える可能性のある調節エレメントを有していることが示唆されているため、本発明者らは、その領域を削除または改変しないことに決めた。３’ＵＴＲおよびエキソン１～９（すなわち、コーディングエキソン１～エキソン９）のすべてのイントロンを含む、エキソン１／コーディングエキソン１（アミノ酸１から）からエキソン９を含む、ヒトＰＮＰＬＡ３からの領域を、削除したマウス領域の代わりに挿入した（このヒトＤＮＡ断片は、コーディングエキソン３においてバリアントＩ１４８Ｍ、およびコーディングエキソン９においてＫ４３４Ｅをコードする）。Ｉ１４８Ｍ突然変異は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）のリスクが高いことに関連している。Ｋ４３４Ｅ突然変異は、Ｉ１４８Ｍ表現型をより強くする。ｌｏｘＰ－ｍＰｒｍ１－Ｃｒｅｉ－ｐＡ－ｈＵｂ１－ｅｍ７－Ｎｅｏ－ｐＡ－ｌｏｘＰカセットを、ヒトＰＮＰＬＡ３ ３’ＵＴＲの下流に挿入した。これは、ＭＡＩＤ ８１６４対立遺伝子（配列番号２１）である。図１を参照されたい。カセット削除の後、ｌｏｘＰおよびクローニング部位は、ヒトＰＮＰＬＡ３ ３’ＵＴＲの下流に残った。これは、ＭＡＩＤ ８１６５（配列番号２２）である。図１を参照されたい。
マウスＰＮＰＬＡ３細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、および内腔ドメインについての配列は、それぞれ、配列番号２～４に記載され、対応するコード配列は、それぞれ、配列番号１２～１４に記載されている。ヒトＰＮＰＬＡ３細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、および内腔ドメイン（Ｉ１４８ＭおよびＫ４３４Ｅ突然変異を含む）についての配列は、それぞれ、配列番号６、７、および１０に記載され、対応するコード配列は、それぞれ、配列番号１６、１７、および２０に記載されている。野生型ヒトＰＮＬＰＡ３内腔ドメイン（Ｉ１４８ＭおよびＫ４３４Ｅ突然変異を有しない）の配列は、配列番号８に記載され、対応するコード配列は、配列番号１８に記載されている。予想されるコード化されたヒト化ＰＮＬＰＡ３タンパク質は、Ｉ１４８ＭおよびＫ４３４Ｅ突然変異とともに、ヒトＰＮＬＰＡ３細胞質、膜貫通、および内腔ドメインを有する。図１を参照されたい。野生型マウスＰＮＰＬＡ３タンパク質、野生型ヒトＰＮＬＰＡ３タンパク質、ならびにＩ１４８ＭおよびＫ４３４Ｅ突然変異を有する予想されるコードされたヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質のアラインメントを図３に提供する。マウスＰｎｐｌａ３コード配列およびヒトＰＮＰＬＡ３コード配列（Ｉ１４８ＭおよびＫ４３４Ｅ突然変異を含むヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質をコードする）は、それぞれ、配列番号１１および１９に記載されている。マウス野生型ＰＮＰＬＡ３タンパク質配列およびヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質配列（Ｉ１４８ＭおよびＫ４３４Ｅ突然変異を含む）は、それぞれ、配列番号１および９に記載されている。野生型ヒトＰＮＰＬＡ３コード配列は、配列番号１５に記載され、野生型ヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質配列は、配列番号５に記載されている。予想されるヒト化ＰＮＰＬＡ３コード配列および予想されるヒト化ＰＮＰＬＡ３タンパク質についての配列は、それぞれ、配列番号１９および９に記載されている。
突然変異対立遺伝子を生成するために、４つのガイドＲＮＡ（配列番号２８～３１に記載のガイドＲＮＡ標的配列）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素を、上記の大きな標的化ベクターとともにＦ１Ｈ４マウス胚性幹（ＥＳ）細胞に導入した。Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞は、雌のＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃマウスを雄の１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃマウスと交配することによって産生されたハイブリッド胚に由来した。例えば、ＵＳ２０１５－０３７６６５１およびＷＯ２０１５／２００８０５を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。具体的には、ヌクレオフェクションプロセスを、２×１０６マウスＥＳ細胞（系統Ｆ１Ｈ４）および０．４μｇのＰＮＰＬＡ３ ＬＴＶＥＣ、５μｇのＣａｓ９、ならびに各２．５μｇのｇＲＮＡ：ｇＵ、ｇＵ２、ｇＤおよびｇＤ２を用いて実行した。抗生物質の選択は、１００μｇ／ｍＬの濃度でＧ４１８を使用して実行した。抗生物質選択後、コロニーを採取し、増殖させ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）によってスクリーニングした。図２を参照されたい。内因性マウス対立遺伝子の喪失を検出するために対立遺伝子喪失アッセイを実行し、ヒト化対立遺伝子の獲得を検出するために対立遺伝子獲得アッセイを実行し、Ｉ１４８Ｍコード突然変異を検出するために対立遺伝子特異的アッセイを使用し、表５に記載されるプライマーおよびプローブセットを使用してＣＲＩＳＰＲおよび保持アッセイを実行した。
Figure 2023511626000006
対立遺伝子喪失（ＬＯＡ）および対立遺伝子獲得（ＧＯＡ）アッセイを含む対立遺伝子改変（ＭＯＡ）アッセイは、例えば、ＵＳ２０１４／０１７８８７９、ＵＳ２０１６／０１４５６４６、ＷＯ２０１６／０８１９２３、およびＦｒｅｎｄｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５－３０７に記載されており、これらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。対立遺伝子喪失（ＬＯＡ）アッセイは、従来のスクリーニングロジックを逆にし、変異が誘導された天然遺伝子座のゲノムＤＮＡサンプルのコピー数を定量化する。正しく標的化されたヘテロ接合性細胞のクローンでは、ＬＯＡアッセイは２つの天然の対立遺伝子（ＸまたはＹ染色体上にない遺伝子の場合）のうちの一方を検出し、もう一方の対立遺伝子は標的化された修飾によって破壊される。ゲノムＤＮＡサンプルにおける挿入された標的化ベクターのコピー数を定量化するために、対立遺伝子獲得（ＧＯＡ）アッセイと同じ原理を逆に適用することができる。
保持アッセイは、ＵＳ２０１６／０１４５６４６およびＷＯ２０１６／０８１９２３に記載され、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。保持アッセイは、標的化ベクターの５’および３’相同性アームにそれぞれ対応する５’および３’標的配列からのＤＮＡテンプレートのコピー数を評価することによって、標的ゲノム遺伝子座への核酸インサートの正確な標的化された挿入物と、標的ゲノム遺伝子座の外側のゲノム位置への核酸インサートのランダムなトランスジェニック挿入物とを区別する。具体的には、保持アッセイは、改変された標的ゲノム遺伝子座に保持されることを意図した５’標的配列ＤＮＡテンプレートおよび／または改変された標的ゲノム遺伝子座に保持されることを意図した３’標的配列ＤＮＡテンプレートのゲノムＤＮＡサンプル中のコピー数を決定する。２倍体細胞では、正確に標的化されたクローンはコピー数２を保持する。２を超えるコピー数は、一般に、標的ゲノム遺伝子座ではなく、標的ゲノム遺伝子座の外側でランダムに標的化ベクターがトランスジェニックに組み込まれていることを示す。一般的より少ないコピー数は、削除について標的化された領域を超えて拡大する大きな削除を示す。
ＣＲＩＳＰＲアッセイは、ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡによって破壊される領域をカバーするように設計されたＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイである。ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡが切断され、インデル（挿入または欠失）が生じると、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイは増幅に失敗するため、ＣＲＩＳＰＲ切断を報告する。
Ｆ０マウスを、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法を使用して改変されたＥＳ細胞から生成した。具体的には、上記のＭＯＡアッセイによって選択された上記のヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含むマウスＥＳ細胞のクローンを、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法を使用して、８細胞期胚に注射した。例えば、すべての目的のために各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ７，５７６，２５９、ＵＳ７，６５９，４４２、ＵＳ７，２９４，７５４、ＵＳ２００８／００７８０００、およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５（１）：９１－９９を参照されたい。ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法では、標的化マウスＥＳ細胞を、完全にＥＳ細胞由来のＦ０世代マウスを効率的にもたらす前桑実胚期胚、例えば、８細胞期胚に、レーザ支援注射を介して注射する。ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法では、注射された前桑実胚期胚を、胚盤胞期まで培養し、胚盤胞期胚を代理母に導入し、妊娠させて、Ｆ０世代マウスを産生する。標的修飾についてホモ接合性であるマウスＥＳ細胞のクローンから始めると、標的修飾についてホモ接合性のＦ０マウスが産生される。標的修飾についてヘテロ接合性のマウスＥＳ細胞のクローンから始めると、その後に育種を行って、標的修飾についてホモ接合性のマウスを産生することができる。
実施例２．ヒト化ＰＮＰＬＡ３ Ｉ１４８Ｍ／Ｋ４３４Ｅ遺伝子座を含むマウスの表現型検査
図５は、実施例１で生成されたヒト化ＰＮＰＬＡ３マウスの表現型検査および特徴付けの研究タイムラインを示す。マウスを、－１週目の体重に基づいて無作為化した。０週目に、マウスを高ショ糖食または高フルクトース食に４週間切り替えた。４週目に、マウスを犠牲にし、血液および組織を採取した。
実施例１で生成されたヒト化マウスを特徴付けるために、異なる食事による処理後、野生型マウスおよびヒト化ＰＮＰＬＡ３ Ｉ１４８Ｍ／Ｋ４３４Ｅ遺伝子座を含むマウスの肝臓サンプルにおいて、マウスＰｎｐｌａ３およびヒトＰＮＰＬＡ３ ＲＮＡレベルをそれぞれ評価した。図６は、マウスＰｎｐｌａ３野生型肝臓およびヒト化マウスＰＮＰＬＡ３－Ｉ１４８Ｍ／Ｋ４３４Ｅ肝臓からのヒトＰＮＰＬＡ３およびマウスＰｎｐｌａ３のＲＴ－ＰＣＲを示す。図７は、マウスＰｎｐｌａ３野生型およびヒト化ＰＮＰＬＡ３－Ｉ１４８Ｍ／Ｋ４３４Ｅマウス肝臓からのヒトＰＮＰＬＡ３およびマウスＰｎｐｌａ３のＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションを示す。マウスは、４週間、固形飼料、高ショ糖食（ＨＳＤ）、または高フルクトース食（ＨＦＤまたはＨＦｒｕＤ）を与えられた。ＲＮＡ抽出およびＲＴ－ＰＣＲのために肝臓サンプルを採取した。固形飼料の食事では、ヒト化ＰＮＰＬＡ３ Ｉ１４８Ｍ／Ｋ４３４ＥマウスにおけるＰＮＰＬＡ３ ＲＮＡ発現レベルは、野生型マウスにおける対応するレベルよりもはるかに高かった（ヒト化ＰＮＰＬＡ３ Ｉ１４８Ｍ／Ｋ４３４Ｅマウスにおける高いＲＮＡレベルの変動性のためにｐ＝０．２２）。ＨＳＤおよびＨＦｒｕＤは、野生型マウスおよびヒト化ＰＮＰＬＡ３ Ｉ１４８Ｍ／Ｋ４３４Ｅマウスの両方においてＰＮＰＬＡ３の発現を強く誘導した。これらの結果は、ヒトおよびマウスのＰＮＰＬＡ３の発現パターンが異なることを示す。固形飼料を与えた条件でのマウス肝臓Ｐｎｐｌａ３ ＲＮＡ発現レベルは非常に低く、これはヒトと一致していない。ヒト化ＰＮＰＬＡ３マウスは、固形飼料を与えた条件で、より高いＰＮＰＬＡ３ ＲＮＡ発現を示し、これは、ヒトにおいて発生することとより一致している。
実施例３．ヒト化ＰＮＰＬＡ３野生型（Ｉ１４８）遺伝子座を含むマウスの生成
実施例１に記載の大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を、野生型対立遺伝子１４８Ｉを保有する３２２ｂｐのＤＮＡ断片を使用する相同組換えおよびギブソンアセンブリによって改変して、ＰＮＰＬＡ３ １４８ＭをＰＮＰＬＡ３ １４８Ｉに戻した。バリアント４３４Ｅは、実施例１で使用した元の未改変の細菌人工染色体（ＢＡＣ）が付属していたため、改変しなかった。ＰＮＰＬＡ １４８Ｉおよび４３４Ｅ型は、酵素活性が１４８Ｉ／４３４Ｋに類似しており、１４８Ｉ／４３４Ｋと同様に肝臓の損傷がないため、野生型ＰＮＰＬＡ３として使用することができる。ヒト標準的ＰＮＰＬＡ３タンパク質配列は、１４８Ｉ／４３４Ｋであるが、４３４Ｅバリアントは、実施例１においてＬＴＶＥＣを生成するために使用されるヒトＢＡＣに天然に存在するバリアントである。実施例１と同様に、ｌｏｘＰ－ｍＰｒｍ１－Ｃｒｅｉ－ｐＡ－ｈＵｂ１－ｅｍ７－Ｎｅｏ－ｐＡ－ｌｏｘＰカセットを、ヒトＰＮＰＬＡ３ ３’ＵＴＲの下流に挿入した。これは、ＭＡＩＤ ７６２２対立遺伝子（配列番号６７）である。図４を参照されたい。カセット削除の後、ｌｏｘＰおよびクローニング部位は、ヒトＰＮＰＬＡ３ ３’ＵＴＲの下流に残った。これは、ＭＡＩＤ ７６２３（配列番号６８）である。図４を参照されたい。
マウスＰＮＰＬＡ３細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、および内腔ドメインについての配列は、それぞれ、配列番号２～４に記載され、対応するコード配列は、それぞれ、配列番号１２～１４に記載されている。ヒトＰＮＰＬＡ３細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、および内腔ドメイン（１４８Ｉおよび４３４Ｅを含む）についての配列は、それぞれ、配列番号６、７、および６５に記載され、対応するコード配列は、それぞれ、配列番号１６、１７、および６６に記載されている。野生型ヒトＰＮＬＰＡ３内腔ドメイン（Ｋ４３４Ｅ突然変異を有しない）の配列は、配列番号８に記載され、対応するコード配列は、配列番号１８に記載されている。予想されるコード化されたヒト化ＰＮＬＰＡ３タンパク質は、１４８Ｉおよび４３４Ｅとともに、ヒトＰＮＬＰＡ３細胞質、膜貫通、および内腔ドメインを有する。図４を参照されたい。マウスＰｎｐｌａ３コード配列およびヒトＰＮＰＬＡ３コード配列（１４８Ｉおよび４３４Ｅを含むヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質をコードする）は、それぞれ、配列番号１１および６４に記載されている。マウス野生型ＰＮＰＬＡ３タンパク質配列およびヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質配列（１４８Ｉおよび４３４Ｅを含む）は、それぞれ、配列番号１および６３に記載されている。野生型ヒトＰＮＰＬＡ３コード配列は、配列番号１５に記載され、野生型ヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質配列は、配列番号５に記載されている。予想されるヒト化ＰＮＰＬＡ３コード配列および予想されるヒト化ＰＮＰＬＡ３タンパク質についての配列は、それぞれ、配列番号６４および６３に記載されている。
突然変異対立遺伝子を生成するために、４つのガイドＲＮＡ（配列番号２８～３１に記載のガイドＲＮＡ標的配列）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素を、上記の大きな標的化ベクターとともにＦ１Ｈ４マウス胚性幹（ＥＳ）細胞に導入した。Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞は、雌のＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃマウスを雄の１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃマウスと交配することによって産生されたハイブリッド胚に由来した。例えば、ＵＳ２０１５－０３７６６５１およびＷＯ２０１５／２００８０５を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。具体的には、ヌクレオフェクションプロセスを、２×１０６マウスＥＳ細胞（系統Ｆ１Ｈ４）および０．４μｇのＰＮＰＬＡ３ ＬＴＶＥＣ、５μｇのＣａｓ９、ならびに各２．５μｇのｇＲＮＡ：ｇＵ、ｇＵ２、ｇＤおよびｇＤ２を用いて実行した。抗生物質の選択は、１００μｇ／ｍＬの濃度でＧ４１８を使用して実行した。抗生物質選択後、コロニーを採取し、増殖させ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）によってスクリーニングした。図２を参照されたい。内因性マウス対立遺伝子の喪失を検出するために対立遺伝子喪失アッセイを実行し、ヒト化対立遺伝子の獲得を検出するために対立遺伝子獲得アッセイを実行し、Ｉ１４８Ｍコード突然変異を検出するために対立遺伝子特異的アッセイを使用し、表５に記載されるプライマーおよびプローブセットを使用してＣＲＩＳＰＲおよび保持アッセイを実行した。
対立遺伝子喪失（ＬＯＡ）および対立遺伝子獲得（ＧＯＡ）アッセイを含む対立遺伝子改変（ＭＯＡ）アッセイは、例えば、ＵＳ２０１４／０１７８８７９、ＵＳ２０１６／０１４５６４６、ＷＯ２０１６／０８１９２３、およびＦｒｅｎｄｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５－３０７に記載されており、これらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。対立遺伝子喪失（ＬＯＡ）アッセイは、従来のスクリーニングロジックを逆にし、変異が誘導された天然遺伝子座のゲノムＤＮＡサンプルのコピー数を定量化する。正しく標的化されたヘテロ接合性細胞のクローンでは、ＬＯＡアッセイは２つの天然の対立遺伝子（ＸまたはＹ染色体上にない遺伝子の場合）のうちの一方を検出し、もう一方の対立遺伝子は標的化された修飾によって破壊される。ゲノムＤＮＡサンプルにおける挿入された標的化ベクターのコピー数を定量化するために、対立遺伝子獲得（ＧＯＡ）アッセイと同じ原理を逆に適用することができる。
保持アッセイは、ＵＳ２０１６／０１４５６４６およびＷＯ２０１６／０８１９２３に記載され、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。保持アッセイは、標的化ベクターの５’および３’相同性アームにそれぞれ対応する５’および３’標的配列からのＤＮＡテンプレートのコピー数を評価することによって、標的ゲノム遺伝子座への核酸インサートの正確な標的化された挿入物と、標的ゲノム遺伝子座の外側のゲノム位置への核酸インサートのランダムなトランスジェニック挿入物とを区別する。具体的には、保持アッセイは、改変された標的ゲノム遺伝子座に保持されることを意図した５’標的配列ＤＮＡテンプレートおよび／または改変された標的ゲノム遺伝子座に保持されることを意図した３’標的配列ＤＮＡテンプレートのゲノムＤＮＡサンプル中のコピー数を決定する。２倍体細胞では、正確に標的化されたクローンはコピー数２を保持する。２を超えるコピー数は、一般に、標的ゲノム遺伝子座ではなく、標的ゲノム遺伝子座の外側でランダムに標的化ベクターがトランスジェニックに組み込まれていることを示す。一般的より少ないコピー数は、削除について標的化された領域を超えて拡大する大きな削除を示す。
ＣＲＩＳＰＲアッセイは、ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡによって破壊される領域をカバーするように設計されたＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイである。ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡが切断され、インデル（挿入または欠失）が生じると、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイは増幅に失敗するため、ＣＲＩＳＰＲ切断を報告する。
Ｆ０マウスを、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法を使用して改変されたＥＳ細胞から生成した。具体的には、上記のＭＯＡアッセイによって選択された上記のヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含むマウスＥＳ細胞のクローンを、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法を使用して、８細胞期胚に注射した。例えば、すべての目的のために各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ７，５７６，２５９、ＵＳ７，６５９，４４２、ＵＳ７，２９４，７５４、ＵＳ２００８／００７８０００、およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５（１）：９１－９９を参照されたい。ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法では、標的化マウスＥＳ細胞を、完全にＥＳ細胞由来のＦ０世代マウスを効率的にもたらす前桑実胚期胚、例えば、８細胞期胚に、レーザ支援注射を介して注射する。ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法では、注射された前桑実胚期胚を、胚盤胞期まで培養し、胚盤胞期胚を代理母に導入し、妊娠させて、Ｆ０世代マウスを産生する。標的修飾についてホモ接合性であるマウスＥＳ細胞のクローンから始めると、標的修飾についてホモ接合性のＦ０マウスが産生される。標的修飾についてヘテロ接合性のマウスＥＳ細胞のクローンから始めると、その後に育種を行って、標的修飾についてホモ接合性のマウスを産生することができる。

Claims (72)

  1. ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座をゲノムに含む非ヒト動物であって、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトＰＮＰＬＡ３配列で置き換えられている、非ヒト動物。
  2. 前記ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座が、ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインを含むＰＮＰＬＡ３タンパク質をコードする、請求項１に記載の非ヒト動物。
  3. 前記ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインが、配列番号５の１４８位に対応する位置で野生型である、請求項２に記載の非ヒト動物。
  4. 前記ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインが、Ｉ１４８Ｍ突然変異および／またはＫ４３４Ｅ突然変異を含む、請求項２に記載の非ヒト動物。
  5. 前記ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインが、前記Ｉ１４８Ｍ突然変異および前記Ｋ４３４Ｅ突然変異を含む、請求項４に記載の非ヒト動物。
  6. 前記ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインが、配列番号１０に記載の配列を含み、任意選択的に前記ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインが、配列番号２０に記載のコード配列によってコードされる、請求項５に記載の非ヒト動物。
  7. 前記ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインが、前記Ｋ４３４Ｅ突然変異を含むが、前記Ｉ１４８Ｍ突然変異を含まない、請求項４に記載の非ヒト動物。
  8. 前記ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインが、配列番号６５に記載の配列を含み、任意選択的に前記ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインが、配列番号６６に記載のコード配列によってコードされる、請求項７に記載の非ヒト動物。
  9. 前記ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインが、野生型ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインである、請求項２に記載の非ヒト動物。
  10. 前記ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインが、配列番号８に記載の配列を含み、任意選択的に前記ヒトＰＮＰＬＡ３内腔ドメインが、配列番号１８に記載のコード配列によってコードされる、請求項９に記載の非ヒト動物。
  11. 前記ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座が、ヒトＰＮＰＬＡ３膜貫通ドメインを含むＰＮＰＬＡ３タンパク質をコードする、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  12. 前記ヒトＰＮＰＬＡ３膜貫通ドメインが、配列番号７に記載の配列を含み、任意選択的に前記ヒトＰＮＰＬＡ３膜貫通ドメインが、配列番号１７に記載のコード配列によってコードされる、請求項１１に記載の非ヒト動物。
  13. 前記ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座が、ヒトＰＮＰＬＡ３細胞質ドメインを含むＰＮＰＬＡ３タンパク質をコードする、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  14. 前記ヒトＰＮＰＬＡ３細胞質ドメインが、配列番号６に記載の配列を含み、任意選択的に前記ヒトＰＮＰＬＡ３細胞質ドメインが、配列番号１６に記載のコード配列によってコードされる、請求項１３に記載の非ヒト動物。
  15. コード配列および非コード配列の両方を含む前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の領域が削除され、コード配列および非コード配列の両方を含む対応するヒトＰＮＰＬＡ３配列で置き換えられている、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  16. 前記ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座が、内因性Ｐｎｐｌａ３プロモーターを含み、前記ヒトＰＮＰＬＡ３配列が、前記内因性Ｐｎｐｌａ３プロモーターに作動可能に連結されている、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  17. 前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の少なくとも１つのイントロンおよび少なくとも１つのエキソンが削除され、対応するヒトＰＮＰＬＡ３配列で置き換えられている、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  18. ヒトＰＮＰＬＡ３コード配列全体が、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座に挿入されている、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  19. 前記ヒトＰＮＰＬＡ３開始コドンと前記ヒトＰＮＰＬＡ３終止コドンとの間に前記配列を含む前記ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子座の領域が、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座に挿入されている、請求項１８に記載の非ヒト動物。
  20. 前記ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子座の５’ＵＴＲが、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座に挿入されており、ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子座の３’ＵＴＲが、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座に挿入されているか、または前記ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子座の前記５’ＵＴＲおよびヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子座の前記３’ＵＴＲの両方が、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座に挿入されている、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  21. 最後のエキソンを除く前記内因性Ｐｎｐｌａ３エキソンのすべてが、前記ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座において削除されている、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  22. 介在するすべてのイントロンを含む、第１のエキソンから最後から２番目のエキソンまでの前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の領域が、前記ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座において削除されている、請求項２１に記載の非ヒト動物。
  23. 前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の最後のイントロンの全部または一部が、前記ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座において削除されていない、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  24. 前記ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座において削除されていない前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の前記最後のイントロンの前記一部が、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の下流の遺伝子の発現に影響を与える調節エレメントを含む、請求項２３に記載の非ヒト動物。
  25. 介在するすべてのイントロンを含む、前記第１のエキソンから前記最後から２番目のエキソンまでの前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の領域が、前記ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座において削除されており、前記ヒトＰＮＰＬＡ３開始コドンと前記ヒトＰＮＰＬＡ３終止コドンとの間に前記配列を含む前記ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子座の領域で置き換えられており、
    前記ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座が、内因性Ｐｎｐｌａ３プロモーターを含み、前記ヒトＰＮＰＬＡ３配列が、前記内因性Ｐｎｐｌａ３プロモーターに作動可能に連結されている、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  26. 前記ヒト化ＰＮＰＬＡ３遺伝子座によってコードされる前記ＰＮＰＬＡ３タンパク質が、Ｉ１４８Ｍ突然変異および／またはＫ４３４Ｅ突然変異を含む、請求項２５に記載の非ヒト動物。
  27. ヒト化ＰＩＮＰＬＡ３遺伝子座によってコードされる前記ＰＮＰＬＡ３タンパク質が、野生型ヒトＰＮＰＬＡ３タンパク質である、請求項２５に記載の非ヒト動物。
  28. （ｉ）前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座における前記ヒトＰＮＰＬＡ３配列が、配列番号６２もしくは６９に記載の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を含み、かつ／または
    （ｉｉ）前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座が、配列番号５、９、もしくは６３に記載の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を含むタンパク質をコードし、かつ／または
    （ｉｉｉ）前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座が、配列番号１５、１９、もしくは６４に記載の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を含むコード配列を含み、かつ／または
    （ｉｖ）前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座が、配列番号２１、２２、６７、もしくは６８に記載の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  29. 前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座が、選択カセットまたはレポーター遺伝子を含まない、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  30. 前記非ヒト動物が、前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座に対してホモ接合である、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  31. 前記非ヒト動物が、その生殖系列に前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  32. 前記非ヒト動物が、哺乳動物である、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  33. 前記非ヒト動物が、ラットまたはマウスである、請求項３２に記載の非ヒト動物。
  34. 前記非ヒト動物が、マウスである、請求項３３に記載の非ヒト動物。
  35. 固形飼料を与えられた条件下での前記非ヒト動物の肝臓における前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座からのＲＮＡ発現が、固形飼料を与えられた条件下での対照の非ヒト動物の肝臓における非ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座からのＲＮＡ発現よりも高く、
    任意選択的に、固形飼料を与えられた条件下での前記非ヒト動物の前記肝臓における前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座からの前記ＲＮＡ発現が、高ショ糖食（ＨＳＤ）または高フルクトース食（ＨＦＤ）条件下での前記非ヒト動物の前記肝臓における前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座からの前記ＲＮＡ発現の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、または少なくとも２５％である、先行請求項のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  36. ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座をゲノムに含む非ヒト動物細胞であって、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトＰＮＰＬＡ３配列で置き換えられている、非ヒト動物細胞。
  37. ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノムであって、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトＰＮＰＬＡ３配列で置き換えられている、非ヒト動物ゲノム。
  38. ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を生成するための標的化ベクターであって、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトＰＮＰＬＡ３配列で置き換えられており、前記標的化ベクターが、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の５’標的配列を標的とする５’相同性アームと前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の３’標的配列を標的とする３’相同性アームとが隣接する前記対応するヒトＰＮＰＬＡ３配列を含む挿入核酸を含む、標的化ベクター。
  39. ヒト化非ヒト動物ＰＮＰＬＡ３遺伝子であって、前記非ヒト動物Ｐｎｐｌａ３遺伝子のセグメントが削除され、対応するヒトＰＮＰＬＡ３配列で置き換えられている、ヒト化非ヒト動物ＰＮＰＬＡ３遺伝子。
  40. インビボでヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の活性を評価する方法であって、
    （ａ）請求項１～３５のいずれか一項に記載の非ヒト動物に前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬を投与することと、
    （ｂ）前記非ヒト動物における前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の前記活性を評価することと、を含む、方法。
  41. 前記投与することが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介送達、流体力学的送達（ＨＤＤ）、または注射を含む、請求項４０に記載の方法。
  42. ステップ（ｂ）が、前記非ヒト動物の前記肝臓における前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の前記活性を評価することを含む、請求項４０または４１に記載の方法。
  43. ステップ（ｂ）が、肝脂肪含有量を測定すること、および／または前記非ヒト動物における肝脂肪滴中のＰＮＰＬＡ３レベルを測定することを含む、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. ステップ（ｂ）が、前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座によってコードされるＰＮＰＬＡ３メッセンジャーＲＮＡの発現を測定することを含む、請求項４０～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. ステップ（ｂ）が、前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座によってコードされるＰＮＰＬＡ３タンパク質の発現を測定することを含む、請求項４０～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬が、ゲノム編集剤であり、ステップ（ｂ）が、前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座の改変を評価することを含む、請求項４０～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. ステップ（ｂ）が、前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座内の挿入または欠失の頻度を測定することを含む、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬が、ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子の領域を標的化するように設計されたヌクレアーゼ剤を含む、請求項４０～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記ヌクレアーゼ剤が、Ｃａｓタンパク質および前記ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を標的化するように設計されたガイドＲＮＡを含む、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬が、外因性ドナー核酸を含み、前記外因性ドナー核酸が、前記ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的化するように設計されており、任意選択的に、前記外因性ドナー核酸が、ＡＡＶを介して送達される、請求項４０～５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬が、ＲＮＡｉ剤またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項４０～４５のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬が、抗原結合タンパク質である、請求項４０～４５のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬が、小分子である、請求項４０～４５のいずれか一項に記載の方法。
  55. インビボでヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の活性を最適化する方法であって、
    （Ｉ）ゲノムにヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む第１の非ヒト動物において、請求項４０～５４のいずれか一項に記載の方法を１回目に実施することと、
    （ＩＩ）可変要素を変更し、ゲノムにヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座を含む第２の非ヒト動物において、前記変更された可変要素を用いてステップ（Ｉ）の方法を２回目に実施することと、
    （ＩＩＩ）ステップ（Ｉ）の前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の前記活性を、ステップ（ＩＩ）の前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の前記活性と比較し、より高い活性をもたらす方法を選択することとを含む、方法。
  56. ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬を前記非ヒト動物に導入する送達方法である、請求項５５に記載の方法。
  57. ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬を前記非ヒト動物に導入する投与経路である、請求項５５に記載の方法。
  58. ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、前記非ヒト動物に導入された前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の濃度または量である、請求項５５に記載の方法。
  59. ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、前記非ヒト動物に導入された前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬の形態である、請求項５５に記載の方法。
  60. ステップ（ＩＩ）における前記変更された可変要素が、前記非ヒト動物に導入された前記ヒトＰＮＰＬＡ３標的化試薬である、請求項５５に記載の方法。
  61. 請求項１～３５のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、
    （ａ）非ヒト動物宿主胚に、ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座をゲノムに含む遺伝子改変された非ヒト動物胚性幹（ＥＳ）細胞を導入することであって、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトＰＮＰＬＡ３配列で置き換えられている、導入することと、
    （ｂ）前記非ヒト動物宿主胚を代理母において妊娠させることであって、前記代理母が、前記ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座を含むＦ０子孫遺伝子改変非ヒト動物を産生する、妊娠させることと、を含む、方法。
  62. 請求項１～３５のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、
    （ａ）非ヒト動物１細胞期胚のゲノムを改変して、そのゲノムに、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座のセグメントが削除され、対応するヒトＰＮＰＬＡ３配列で置き換えられたヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座を含み、それにより、非ヒト動物の遺伝子改変胚を生成することと、
    （ｂ）前記非ヒト動物の遺伝子改変胚を代理母において妊娠させることであって、前記代理母が、前記ヒト化内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座を含むＦ０子孫遺伝子改変非ヒト動物を産生する、妊娠させることと、を含む、方法。
  63. 請求項１～３５のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、
    （ａ）非ヒト動物胚性幹（ＥＳ）細胞に、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の５’標的配列に対応する５’相同性アームと前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の３’標的配列に対応する３’相同性アームとが隣接する前記ヒトＰＮＰＬＡ３配列を含む核酸インサートを含む標的化ベクターを導入することであって、
    前記標的化ベクターが、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座を組換えて、前記ヒトＰＮＰＬＡ３配列を含む前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座をゲノムに含む遺伝子改変された非ヒトＥＳ細胞を産生する、導入することと、
    （ｂ）前記遺伝子改変された非ヒトＥＳ細胞を非ヒト動物宿主胚に導入することと、
    （ｃ）前記非ヒト動物宿主胚を代理母において妊娠させることであって、前記代理母が、前記ヒトＰＮＰＬＡ３配列を含む前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座をゲノムに含むＦ０子孫遺伝子改変非ヒト動物を産生する、妊娠させることと、を含む、方法。
  64. 前記標的化ベクターが、少なくとも１０ｋｂの長さの大きな標的化ベクターであるか、または前記５’および３’相同性アームの合計が、少なくとも１０ｋｂの長さである、請求項６３に記載の方法。
  65. 請求項１～３５のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、
    （ａ）非ヒト動物１細胞期胚に、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の５’標的配列に対応する５’相同性アームと前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座の３’標的配列に対応する３’相同性アームとが隣接する前記ヒトＰＮＰＬＡ３配列を含む核酸インサートを含む標的化ベクターを導入することであって、
    前記標的化ベクターが、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座を組換えて、前記ヒトＰＮＰＬＡ３配列を含む前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座をゲノムに含む遺伝子改変された非ヒト１細胞期胚を産生する、導入することと、
    （ｂ）前記遺伝子改変された非ヒト動物１細胞期胚を代理母において妊娠させて、前記ヒトＰＮＰＬＡ３配列を含む前記ヒト化内因性ＰＮＰＬＡ３遺伝子座をゲノムに含む遺伝子改変されたＦ０世代非ヒト動物を産生することと、を含む、方法。
  66. ステップ（ａ）が、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座内の標的配列を標的化するヌクレアーゼ剤を導入することをさらに含む、請求項６３～６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記ヌクレアーゼ剤が、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項６７に記載の方法。
  69. ステップ（ａ）が、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座内の第２の標的配列を標的化する第２のガイドＲＮＡを導入することをさらに含む、請求項６７または６８に記載の方法。
  70. ステップ（ａ）が、前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座内の第３の標的配列を標的とする第３のガイドＲＮＡおよび前記内因性Ｐｎｐｌａ３遺伝子座内の第４の標的配列を標的とする第４のガイドＲＮＡを導入することをさらに含む、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記非ヒト動物が、マウスまたはラットである、請求項６１～７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記非ヒト動物が、マウスである、請求項７１に記載の方法。
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