ES2783424T3

ES2783424T3 - Animales no humanos que tienen un gen de muerte celular programada 1 humanizado

Info

Publication number: ES2783424T3
Application number: ES15738177T
Authority: ES
Inventors: Elena Burova; Alexander O Mujica; Ka-Man Venus Lai; Andrew J Murphy
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2014-06-19
Filing date: 2015-06-19
Publication date: 2020-09-17
Anticipated expiration: 2035-06-19
Also published as: CA2951278A1; EP3157956A1; US10390522B2; LT3157956T; US20180206462A1; KR20230003455A; IL287519B1; US20240298619A1; PL3157956T3; JP6904707B2; AU2021203100A1; RU2016149434A3; CN106604635A; DK3157956T3; US20150366174A1; MX2016016903A; CY1122940T1; CN106604635B; SG11201609638RA; US20200053992A1

Abstract

Un ratón cuyo genoma comprende un gen de muerte celular Programada 1 humanizado (Pdcd1) en un locus de Pdcd1 endógeno, en donde dicho ratón expresa un polipéptido de muerte celular programada 1 (PD-1) humanizado de dicho gen de Pdcd1 humanizado, cuyo polipéptido PD-1 humanizado tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 6 y comprende una porción humana y una porción endógena, en donde la porción humana comprende los aminoácidos 26-169 de un polipéptido PD-1 humano y la porción endógena comprende la porción intracelular de un polipéptido PD-1 de ratón endógeno.

Description

DESCRIPCIÓN

Animales no humanos que tienen un gen de muerte celular programada 1 humanizado

Antecedentes

Aunque en la investigación y el desarrollo de la medicina se ha dedicado un gran interés a la inmunoterapia del cáncer y se han realizado avances significativos, el cáncer es aún un desafío importante para el campo de la salud en todo el mundo. Este desafío importante se debe, en parte, a la capacidad de las células cancerosas de evadir los mecanismos de control del sistema inmunológico, lo que es, parcialmente, el resultado de la inhibición y/o regulación negativa de la inmunidad antitumoral. Aun así, no se dispone del desarrollo de sistemas in vivo para determinar de manera óptima el potencial terapéutico de nuevas terapias contra el cáncer diseñadas para activar y/o promover la inmunidad antitumoral y determinar los aspectos moleculares de cómo las células cancerosas proporcionan señales inhibitorias a las células inmunológicas (por ejemplo, células T). Tales sistemas proporcionan una fuente para los ensayos de evaluación de la eficacia terapéutica de agentes candidatos que promueven un ambiente antitumoral in vivo.

Iwai, y otros (International immunology 17.2 (2004): 133-144) se refieren al bloqueo de PD-1 que inhibe la diseminación hematógena de células tumorales poco inmunogénicas mediante el aumento del reclutamiento de células T efectoras. Selby, y otros (Journal of Clinical Oncology 31.15 Suppl. (2013): 3061-3061) se refiere a la actividad antitumoral del bloqueo concomitante de las moléculas del punto de regulación inmunológico de CTLA-4 y PD-1 en modelos preclínicos.

Resumen

La presente descripción abarca el reconocimiento de la conveniencia de diseñar animales no humanos que permitan la obtención de sistemas mejorados para la identificación y el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos que puedan usarse para el tratamiento del cáncer. La presente descripción abarca, además, el reconocimiento de la conveniencia de diseñar animales no humanos que permitan la obtención de sistemas mejorados para la identificación y el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos que puedan usarse para tratar enfermedades, trastornos o afecciones autoinmunitarios (o inflamatorios). Adicionalmente, la presente descripción abarca, además, el reconocimiento de que los animales no humanos que tienen un gen de Pdcd1 humanizado y/o que de cualquier otra manera expresan, contienen, o producen un polipéptido PD-1 humano o humanizado son convenientes, por ejemplo, para su uso en la identificación y desarrollo de agentes terapéuticos contra el cáncer que regulen positivamente la inmunidad antitumoral. Los animales no humanos descritos en la presente descripción proporcionan sistemas in vivo mejorados para la identificación y el desarrollo de terapias de combinación que incluyen el uso de PD-1 como diana.

La invención proporciona un ratón cuyo genoma comprende un gen de muerte celular programada 1 (Pdcd1) humanizado en un locus de Pdcd1 endógeno, en donde dicho ratón expresa un polipéptido de muerte celular programada 1 (PD-1) humanizado de dicho gen de Pdcd1 humanizado, cuyo polipéptido PD-1 humanizado tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 6 y comprende una porción humana y una porción endógena, en donde la porción humana comprende los aminoácidos 26-169 de un polipéptido PD-1 humano y la porción endógena comprende la porción intracelular de un polipéptido PD-1 de ratón endógeno.

La invención proporciona, además, una célula o tejido aislados de ratón cuyo genoma comprende un gen de Pdcd1 humanizado en un locus de Pdcd1 endógeno, en donde dicho gen de Pdcd1 humanizado codifica un polipéptido PD-1 humanizado, cuyo polipéptido PD-1 humanizado tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 6 y comprende una porción humana y una porción endógena, en donde la porción humana comprende aminoácidos 26-169 de un polipéptido PD-1 humano y la porción endógena comprende la porción intracelular de un polipéptido PD-1 endógeno de ratón, en donde el gen de Pdcd1 humanizado se une operativamente a un promotor de Pdcd1 de ratón, y en donde la célula de ratón es opcionalmente una célula madre embrionaria de ratón.

La invención proporciona adicionalmente un embrión de ratón generado a partir de una célula madre embrionaria de ratón de la invención.

La invención proporciona adicionalmente un método para obtener un ratón, en donde: (A) el genoma del ratón comprende un gen de Pdcd1 que codifica un polipéptido PD-1 que tiene una porción humana y una porción endógena, en donde el gen de Pdcd1 se une operativamente a un promotor de Pdcd1 de ratón, el método que comprende modificar el genoma de un ratón de modo que comprende un gen de Pdcd1 humanizado en un locus de Pdcd1 endógeno, en donde dicho ratón expresa un polipéptido PD-1 humanizado a partir de dicho gen de Pdcd1 humanizado, cuyo polipéptido PD-1 humanizado tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica a SEQ ID NO: 6 y comprende una porción humana y una porción endógena, en donde la porción humana comprende los aminoácidos 26-169 de un polipéptido PD-1 humano y la porción endógena comprende la porción intracelular de un polipéptido PD-1 endógeno de ratón; o (B) el ratón expresa un polipéptido PD-1 a partir de un gen de Pdcd1 endógeno, en donde el polipéptido PD-1 comprende una secuencia humana, el método que comprende (a) insertar un fragmento genómico humano de un gen de Pdcd1 humano en un gen de Pdcd1 endógeno de ratón endógeno gen en un locus de Pdcdl endógeno en una célula madre embrionaria de ratón para formar un gen de Pdcdl humanizado que codifica un polipéptido PD-1 humanizado, en donde dicho polipéptido PD-1 humanizado tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a SEQ ID NO: 6 y comprende una porción humana y una porción endógena, en donde la porción humana comprende los aminoácidos 26-169 de un polipéptido PD-1 humano y la porción endógena comprende la porción intracelular de un polipéptido PD-1 de ratón endógeno; (b) obtener la célula madre embrionaria de ratón generada en (a); y (c) crear un ratón mediante el uso de la célula madre embrionaria del ratón de (b).

La invención proporciona, además, un método para evaluar las propiedades farmacocinéticas de un fármaco dirigido a PD-1 humano, que comprende: administrar el fármaco a un ratón de la invención; y realizar un ensayo para determinar una o más propiedades farmacocinéticas del fármaco dirigido a PD-1 humano en donde el fármaco es opcionalmente un anticuerpo anti-PD-1.

La invención proporciona además un modelo de tumor de ratón obtenido mediante: a) proporcionar un ratón de la invención; y b) implantar una o más células tumorales en el ratón de (a); obtener de esta manera dicho modelo de tumor de ratón.

También se describe en la presente un animal no humano que tiene un genoma que comprende un gen de Pdcd1 que incluye material genético de dos especies diferentes (por ejemplo, un ser humano y uno no humano). En algunos aspectos, el gen de Pdcd1 de un animal no humano como se describe en la presente descripción codifica un polipéptido PD-1 que contiene porciones humanas y no humanas, en donde las porciones humanas y no humanas se unen entre sí y forman un polipéptido PD-1 funcional. En algunos aspectos, el gen de Pdcd1 de un animal no humano como se describe en la presente descripción codifica un polipéptido PD-1 que contiene un dominio extracelular, en su totalidad o en parte, de un polipéptido PD-1 humano.

También se describe en la presente un animal no humano que expresa un polipéptido PD-1, dicho polipéptido PD-1 comprende una porción humana y una porción endógena. En algunos aspectos, un polipéptido PD-1 descrito en la presente se traduce en una célula del animal no humano con un péptido señal no humano; en algunos aspectos determinados, un péptido señal de roedor.

En algunos aspectos, una porción endógena comprende una porción intracelular de un polipéptido PD-1 endógeno. En algunos aspectos, una porción endógena comprende, además, una porción transmembrana de un polipéptido PD-1 endógeno. En algunos aspectos, una porción endógena tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, o al menos 95 % idéntica a una secuencia de aminoácidos correspondiente de un polipéptido PD-1 de ratón que aparece en la Figura 8. En algunos aspectos, una porción endógena tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a una secuencia de aminoácidos correspondiente de un polipéptido PD-1 de ratón que aparece en la Figura 8. En algunos aspectos, una porción endógena tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a una secuencia de aminoácidos correspondiente de un polipéptido PD-1 de ratón que aparece en la Figura 8.

En algunos aspectos, una porción humana comprende los aminoácidos 35-145, 27-145, 27-169, 26-169 o 21-170 de un polipéptido PD-1 humano. En algunos aspectos, una porción humana comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, o al menos 95 % idéntica a una secuencia de aminoácidos correspondiente de un polipéptido PD-1 humano que aparece en la Figura 8. En algunos aspectos, una porción humana comprende una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a una secuencia de aminoácidos correspondiente de un polipéptido PD-1 humano que aparece en la Figura 8. En algunos aspectos, una porción humana comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a una secuencia de aminoácidos correspondiente de un polipéptido PD-1 humano que aparece en la Figura 8.

En algunos aspectos, un gen de Pdcd1 endógeno codifica un polipéptido PD-1, que comprende una porción humana y una porción endógena. En algunos aspectos determinados, un gen de Pdcd1 endógeno comprende los exones 1, 4 y 5 de Pdcd1 endógeno. En algunos aspectos determinados, un gen de Pdcd1 endógeno comprende, además, un exón 3 de Pdcd1 endógeno en su totalidad o en parte. En algunos aspectos determinados, un gen de Pdcd1 endógeno comprende la SEQ ID NO:21. En algunos aspectos determinados, un gen de Pdcd1 endógeno comprende la SEQ ID NO:22. En algunos aspectos determinados, un gen de Pdcd1 endógeno comprende la SEQ ID n O:21 y la SEQ ID NO:22.

En algunos aspectos, un polipéptido PD-1 expresado por un animal no humano como se describe en la presente descripción tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, o al menos 95 % idéntica a la SEQ ID NO:6. En algunos aspectos, un polipéptido PD-1 expresado por un animal no humano como se describe en la presente descripción tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO:6. En algunos aspectos, un polipéptido PD-1 expresado por un animal no humano como se describe en la presente descripción tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la SEQ ID NO:6.

También se describe en la presente un locus de Pdcd1 humanizado que comprende uno o más exones de un gen de Pdcd1 no humano unidos operativamente a uno o más exones, en su totalidad o en parte, de un gen de Pdcd1 humano.

En algunos aspectos, un locus de Pdcdl humanizado comprende, además, las regiones 5' y 3' no traducidas (UTR) de Pdcd1 no humano que flanquean el uno o más exones de un gen de Pdcd1 humano. En algunos aspectos, un locus de Pdcd1 humanizado está bajo el control de un promotor de roedor; en algunos aspectos determinados, un promotor endógeno de roedor.

En algunos aspectos, un locus de Pdcd1 humanizado comprende los exones 1, 3, 4 y 5 de Pdcd1 no humano unidos operativamente a un exón 2 de Pdcd1 humano. En algunos aspectos, un locus de Pdcd1 humanizado comprende los exones 1,4 y 5 de Pdcd1 no humano, un exón 2 de Pdcd1 humano y comprende, además, un exón 3 de Pdcd1, dicho exón 3 de Pdcd1 comprende una porción humana y una porción no humana, y en donde dichos exones no humanos y humanos se unen operativamente. En algunos aspectos, una porción humana de un exón 3 de Pdcd1 incluye nucleótidos que codifican una secuencia de tallo de PD-1. En algunos aspectos, una porción humana de un exón 3 de Pdcd1 incluye aproximadamente 71 pb de un exón 3 de Pdcd1 humano. En algunos aspectos, una porción no humana de un exón 3 de Pdcd1 incluye nucleótidos que codifican una secuencia transmembrana. En algunos aspectos, una porción no humana de un exón 3 de Pdcd1 incluye aproximadamente 91 pb de un exón 3 de Pdcd1 de roedor.

También se describe en la presente un animal no humano que comprende un gen de Pdcd1 que comprende una porción endógena y una porción humana, donde las porciones endógena y humana se unen operativamente a un promotor de Pdcd1 de roedor. En algunos aspectos, el promotor de Pdcd1 de roedor es un promotor endógeno de Pdcd1 de roedor.

En algunos aspectos, una porción endógena comprende los exones 1,4 y 5 de Pdcd1 endógeno. En algunos aspectos, una porción endógena comprende, además, el exón 3 de Pdcd1 endógeno en su totalidad o en parte. En algunos aspectos, los exones 1, 3 en su totalidad o en parte, 4 y 5 de un gen de Pdcd1 endógeno son al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, o al menos 95 % idénticos a los exones 1, 3 en su totalidad o en parte, 4 y 5 correspondientes de un gen de Pdcd1 endógeno que aparece en la Figura 8. En algunos aspectos, los exones 1,3 en su totalidad o en parte, 4 y 5 de un gen de Pdcd1 endógeno son sustancialmente idénticos a los exones 1, 3 en su totalidad o en parte, 4 y 5 correspondientes de un gen de Pdcd1 endógeno que aparece en la Figura 8. En algunos aspectos, los exones 1, 3 en su totalidad o en parte, 4 y 5 de un gen de Pdcd1 endógeno son idénticos a los exones 1, 3 en su totalidad o en parte, 4 y 5 correspondientes de un gen de Pdcd1 endógeno que aparece en la Figura 8.

En algunos aspectos, una porción humana codifica los aminoácidos 21-170, 26-169, 27-169, 27-145 o 35-145 de un polipéptido PD-1 humano.

En algunos aspectos, una porción humana comprende el exón 2 de un gen de Pdcd1 humano. En algunos aspectos, una porción humana comprende, además, un exón 3 de Pdcd1 humano en su totalidad o en parte. En algunos aspectos, los exones 2 y 3, en su totalidad o en parte, de Pdcd1 humano son al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, o al menos 95 % idénticos a los exones 2 y 3, en su totalidad o en parte, correspondientes de un gen de Pdcd1 humano que aparece en la Figura 8. En algunos aspectos, los exones 2 y 3, en su totalidad o en parte, de Pdcd1 humano son sustancialmente idénticos a los exones 2 y 3, en su totalidad o en parte, correspondientes de un gen de Pdcd1 humano que aparece en la Figura 8. En algunos aspectos, los exones 2 y 3, en su totalidad o en parte, de Pdcd1 humano son idénticos a los exones 2 y 3, en su totalidad o en parte, correspondientes de un gen de Pdcd1 humano que aparece en la Figura 8. En algunos aspectos, una porción humana comprende una secuencia con codones optimizados para la expresión en un animal no humano; en algunos aspectos, la expresión en un roedor; en algunos aspectos determinados, la expresión en un ratón; en algunos aspectos determinados, la expresión en una rata.

En algunos aspectos, una porción humana comprende una secuencia que es al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, o al menos 95 % idéntica a la SEQ ID NO:23. En algunos aspectos, una porción humana comprende una secuencia que es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO:23. En algunos aspectos, una porción humana comprende una secuencia que es idéntica a la SEQ ID NO:23. En algunos aspectos, una porción humana comprende la SEQ ID NO:23.

En la presente también se describe un polipéptido PD-1 producido (o generado) por un animal no humano como se describe en la presente descripción. En algunos aspectos determinados, un polipéptido PD-1 producido por un animal no humano como se describe en la presente descripción comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, o al menos 95 % idéntica a la SEQ ID NO:6. En algunos aspectos determinados, un polipéptido PD-1 producido por un animal no humano como se describe en la presente descripción comprende una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO:6. En algunos aspectos determinados, un polipéptido PD-1 producido por un animal no humano como se describe en la presente descripción comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la SEQ ID NO:6.

En la presente se describe además una célula o tejido aislado a partir de un animal no humano como se describe en la presente. En la presente también se describe una célula o tejido aislados que comprende un gen de Pdcd1 como se describe en la presente descripción. En algunos aspectos, una célula es un linfocito. En algunos aspectos, una célula se selecciona de una célula B, una célula dendrítica, un macrófago, un monocito (por ejemplo, un monocito activado), una célula NK, y una célula T (por ejemplo, una célula T activada). En algunos aspectos, un tejido se selecciona de tejido adiposo, vejiga, cerebro, mama, médula ósea, ojo, corazón, intestino, riñón, hígado, pulmón, ganglio linfático, músculo, páncreas, plasma, suero, piel, bazo, estómago, timo, testículo, ovario, y una combinación de estos.

En la presente descripción se describe además una célula madre embrionaria no humana cuyo genoma comprende un gen de Pdcd1 como se describe en el presente documento. En algunos aspectos, una célula madre embrionaria no humana es una célula madre embrionaria de ratón y es de una cepa 129, una cepa C57BL/6 o una cepa BALB/c. En algunos aspectos, una célula madre embrionaria no humana es una célula madre embrionaria de ratón y es de una cepa 129, una cepa C57BL/6 o una mezcla de estas. En algunos aspectos, una célula madre embrionaria no humana es una célula madre embrionaria de ratón y es de una mezcla de las cepas 129 y C57BL/6.

En algunos aspectos, una célula madre embrionaria no humana tiene un genoma que comprende un gen de Pdcd1 que comprende la SEQ ID NO:19, la SEQ ID NO:20, la SEQ ID NO:21, la SEQ ID No : 22 o una combinación de las mismas.

En la presente se describe además el uso de una célula madre embrionaria no humana como se describe en la presente para producir un animal no humano. En algunos aspectos determinados, una célula madre embrionaria no humana es una célula madre embrionaria de ratón y se usa para producir un ratón que comprende un gen de Pdcd1 como se describe en la presente descripción. En algunos aspectos determinados, una célula madre embrionaria no humana es una célula madre embrionaria de rata y se usa para producir una rata que comprende un gen de Pdcd1 como se describe en la presente descripción.

En la presente descripción se describe además un embrión no humano que comprende, se produce, se obtiene, o se genera a partir de una célula madre embrionaria no humana que comprende un gen de Pdcd1 como se describe en el presente documento. En algunos aspectos determinados, un embrión no humano es un embrión de roedor; en algunos aspectos, un embrión de ratón; en algunos aspectos, un embrión de rata.

En la presente se describe además el uso de un embrión no humano como se describe en la presente para producir un animal no humano. En algunos aspectos determinados, un embrión no humano es un embrión de ratón y se usa para producir un ratón que comprende un gen Pdcd1 como se describe en la presente descripción. En algunos aspectos determinados, un embrión no humano es un embrión de rata y se usa para producir una rata que comprende un gen de Pdcd1 como se describe en la presente descripción.

En la presente también se describe un vector de transformación (o constructo de ácido nucleico) como se describe en la presente descripción. En la presente también se describe un vector de transformación (o constructo de ácido nucleico) que comprende un gen de Pdcd1 humanizado como se describe en la presente descripción. En la presente también se describe un vector de transformación (o constructo de ácido nucleico) que comprende un gen de Pdcd1 que codifica un polipéptido PD-1 que comprende un dominio extracelular humano en su totalidad o en parte; en algunos aspectos determinados un polipéptido PD-1 que comprende los aminoácidos 21-170, 26-169, 27-169, 27-145 o 35 145 de un polipéptido PD-1 humano.

En algunos aspectos, un vector de transformación (o constructo de ácido nucleico) comprende uno o más exones, en su totalidad o en parte, de un gen de Pdcd1 no humano unidos operativamente a uno o más exones, en su totalidad o en parte, de un gen de Pdcd1 humano. En algunos aspectos, un vector de transformación (o constructo de ácido nucleico) comprende las regiones 5' y 3' no traducidas (UTR) de Pdcd1 no humano que flanquean el uno o más exones de un gen de Pdcd1 humano. En algunos aspectos, un vector de transformación (o constructo de ácido nucleico) comprende uno o más marcadores de selección. En algunos aspectos, un vector de transformación (o constructo de ácido nucleico) comprende uno o más sitios de recombinación sitio específica. En algunos aspectos, un vector de transformación (o constructo de ácido nucleico) comprende un exón 2 de Pdcd1 humano. En algunos aspectos, un vector de transformación (o constructo de ácido nucleico) comprende un exón 2 de Pdcd1 humano y un exón 3 de Pdcd1 humano en su totalidad o en parte.

En la presente también se describe un el uso de un vector de transformación (o constructo de ácido nucleico) para generar una célula madre embrionaria no humana modificada como se describe en la presente descripción. En la presente también se describe un el uso de un vector de transformación (o constructo de ácido nucleico) para generar un embrión no humano modificado como se describe en la presente descripción. En la presente también se describe un el uso de un vector de transformación (o constructo de ácido nucleico) para generar un animal no humano como se describe en la presente descripción.

Se describe además en la presente descripción un método para producir un animal no humano que expresa un polipéptido PD-1 a partir de un gen de Pdcd1 endógeno, en donde el polipéptido PD-1 comprende una secuencia humana, el método comprende (a) insertar un fragmento genómico en un gen de Pdcd1 endógeno en una célula madre embrionaria de roedor, dicho fragmento genómico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PD-1 humano en su totalidad o en parte; (b) obtener la célula madre embrionaria de roedor generada en (a); y, crear un roedor con el uso de la célula madre embrionaria de roedor de (b).

En algunos aspectos, una secuencia humana comprende los aminoácidos 35-145, 27-145, 27-169, 26-169 o 21-170 de un polipéptido PD-1 humano.

En algunos aspectos, una secuencia de nucleótidos comprende el exón 2 de Pdcd1 humano. En algunos aspectos, una secuencia de nucleótidos comprende, además, el exón 3 de Pdcd1 humano en su totalidad o en parte. En algunos aspectos, una secuencia de nucleótidos comprende uno o más marcadores de selección. En algunos aspectos, una secuencia de nucleótidos comprende uno o más sitios de recombinación sitio específica.

En la presente además se describe un método para producir un animal no humano cuyo genoma comprende un gen de Pdcd1 que codifica un polipéptido PD-1 que tiene una porción humana y una porción endógena, dichas porciones se unen operativamente a un promotor de Pdcd1 de roedor, el método comprende modificar el genoma de un animal no humano de manera que este comprenda un gen de Pdcd1 que codifica un polipéptido PD-1 que tiene una porción humana y una porción endógena, dichas porciones se unen operativamente a un promotor de Pdcd1 de roedor, para de esta manera producir dicho animal no humano.

En algunos aspectos, un promotor de Pdcd1 de roedor es un promotor endógeno de Pdcd1 de roedor.

En algunos aspectos, una porción humana comprende los aminoácidos 35-145, 27-145, 27-169, 26-169 o 21-170 de un polipéptido PD-1 humano.

En algunos aspectos, un gen de Pdcd1 se modifica de manera que incluya el exón 2 de Pdcd1 humano. En algunos aspectos, un gen de Pdcd1 se modifica de manera que incluya el exón 2 de Pdcd1 humano y el exón 3 de Pdcd1 humano en su totalidad o en parte.

En algunos aspectos, la modificación del genoma de un animal no humano se realiza en una célula madre embrionaria no humana seguido de la generación de un animal no humano con dicha célula madre embrionaria no humana. En algunos aspectos determinados, la célula madre embrionaria no humana es una célula madre embrionaria de roedor; en algunos aspectos, una célula madre embrionaria de ratón; en algunos aspectos, una célula madre embrionaria de rata.

En la presente descripción se describe además un animal no humano que puede obtenerse por los métodos según se describen en el presente documento.

En la presente descripción también se describe un método para reducir el crecimiento tumoral en un animal no humano, el método comprende las etapas de administrar un fármaco dirigido a la proteína PD-1 humano a un animal no humano cuyo genoma comprende un gen de Pdcd1 que codifica un polipéptido PD-1 que tiene una porción humana y una porción endógena, dichas porciones se unen operativamente a un promotor de Pdcd1 de roedor; la administración se realiza en condiciones y durante un tiempo suficiente para reducir el crecimiento tumoral en el animal no humano.

En la presente descripción también se describe un método para destruir células tumorales en un animal no humano, el método comprende las etapas de administrar un fármaco dirigido a la proteína PD-1 humano a un animal no humano cuyo genoma comprende un gen de Pdcd1 que codifica un polipéptido PD-1 que tiene una porción humana y una porción endógena, dichas porciones se unen operativamente a un promotor de Pdcd1 de roedor; la administración se realiza en condiciones y durante un tiempo suficiente para que el fármaco medie la muerte de las células tumorales en el animal no humano.

En la presente descripción también se describe un método para evaluar las propiedades farmacocinéticas de un fármaco dirigido a la proteína PD-1 humano, el método comprende las etapas de administrar el fármaco a un animal no humano cuyo genoma comprende un gen de Pdcd1 que codifica un polipéptido PD-1 que tiene una porción humana y una porción endógena, dichas porciones se unen operativamente a un promotor de Pdcd1 de roedor; y realizar un ensayo para determinar una o más propiedades farmacocinéticas del fármaco dirigido a la proteína PD-1 humano.

En muchos aspectos, un animal no humano como se describe en la presente descripción es un roedor cuyo genoma incluye un gen de Pdcd1 que codifica un polipéptido PD-1 que tiene una porción humana y una porción endógena, dichas porciones se unen operativamente a un promotor de Pdcd1 de roedor. En muchos aspectos, un promotor de Pdcd1 de roedor es un promotor endógeno de Pdcd1 de roedor. En muchos aspectos, una porción humana comprende los aminoácidos 35-145, 27-145, 27-169, 26-169 o 21-170 de un polipéptido Pd -1 humano.

En algunos aspectos, un fármaco dirigido a la proteína PD-1 humano es un antagonista de PD-1. En algunos aspectos, un fármaco dirigido a la proteína PD-1 humano es un agonista de PD-1. En algunos aspectos, un fármaco dirigido a la proteína PD-1 humano es un anticuerpo anti-PD-1. En algunos aspectos, un fármaco dirigido a la proteína PD-1 humano se administra por vía intravenosa, intraperitoneal, o subcutánea.

También se describe en la presente un modelo de tumor en un animal no humano, cuyo animal no humano expresa un polipéptido PD-1 que comprende una porción humana y una porción endógena.

En la presente descripción también se describe un modelo de tumor en un animal no humano, dicho animal no humano tiene un genoma que comprende un gen de Pdcd1 que comprende una porción endógena y una porción humana, en donde las porciones endógena y humana se unen operativamente a un promotor de Pdcd1 de un animal no humano.

En la presente descripción también se describe un modelo de tumor en un animal no humano que se obtiene al (a) proporcionar un animal no humano cuyo genoma comprende un gen de Pdcd1 que incluye una porción endógena y una porción humana, dichas porciones endógena y humana se unen operativamente a un promotor de Pdcd1 de un animal no humano; y (b) implantar una o más células tumorales en el roedor de (a); para de esta manera proporcionar dicho modelo de tumor en un animal no humano.

En algunos aspectos, un modelo de tumor en un animal no humano descrito en la presente descripción es un modelo de tumor en roedor. En algunos aspectos, un promotor de Pdcd1 de un animal no humano es un promotor de Pdcd1 de roedor.

En la presente descripción también se describe un método para la identificación o validación de un fármaco o vacuna, el método comprende las etapas de suministrar un fármaco o vacuna a un animal no humano cuyo genoma incluye un gen de Pdcd1 que codifica un polipéptido PD-1, dicho polipéptido PD-1 comprende una porción humana y una porción endógena, y controlar uno o más de la respuesta inmunológica al fármaco o vacuna, el perfil de seguridad del fármaco o vacuna, o el efecto sobre una enfermedad, trastorno o afección. En algunos aspectos, el control del perfil de seguridad incluye determinar si el animal no humano exhibe un efecto secundario o una reacción adversa como resultado del suministro del fármaco o vacuna. En algunos aspectos, un efecto secundario o una reacción adversa se selecciona de morbilidad, mortalidad, alteración del peso corporal, alteración del nivel de una o más enzimas (por ejemplo, hepáticas), alteración en el peso de uno o más órganos, pérdida de función (por ejemplo, sensorial, motora, de órganos, etcétera), aumento de la susceptibilidad a una o más enfermedades, alteraciones al genoma del animal no humano, aumento o disminución del consumo de alimentos y complicaciones de una o más enfermedades. En algunos aspectos, la enfermedad, trastorno o afección se induce en el animal no humano. En algunos aspectos, la enfermedad, trastorno o afección que se induce en el animal no humano se asocia con una enfermedad, trastorno o afección que padecen uno o más pacientes humanos que necesitan tratamiento. En algunos aspectos determinados, el fármaco es un anticuerpo.

En la presente se describe además el uso de un animal no humano como se describe en la presente en el desarrollo de un fármaco o vacuna para usar en medicina, tal como su uso como un medicamento.

En la presente descripción también se describe el uso de un animal no humano como se describe en la presente descripción en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer, una neoplasia, una enfermedad infecciosa, una enfermedad, trastorno o afección inflamatorios, o una enfermedad, trastorno o afección autoinmunitarios.

En diversos aspectos, un gen de Pdcd1 descrito en la presente descripción codifica un polipéptido PD-1 que tiene una porción humana y una porción endógena, dichas porciones se unen operativamente a un promotor de Pdcd1 de roedor. En diversos aspectos, un promotor de roedor es un promotor endógeno de roedor. En diversos aspectos, una porción humana comprende un exón 2 de Pdcd1 humano. En diversos aspectos, una porción humana comprende un exón 2 de Pdcd1 humano y comprende, además, un exón 3 de Pdcd1 humano en su totalidad o en parte.

En diversos aspectos, un animal no humano descrito en la presente descripción no expresa de manera detectable un polipéptido PD-1 no humano endógeno de longitud completa. En diversos aspectos, un animal no humano descrito en la presente descripción no expresa de manera detectable una porción extracelular de un polipéptido PD-1 endógeno. En diversos aspectos, un animal no humano descrito en la presente descripción no expresa de manera detectable un dominio V inmunoglobulínico N-terminal de un polipéptido PD-1 endógeno.

En diversos aspectos, un animal no humano descrito en la presente descripción es un roedor; en algunos aspectos, un ratón; en algunos aspectos, una rata. En algunos aspectos, un ratón descrito en la presente descripción se selecciona del grupo que consiste en una cepa 129, una cepa BALB/C, una cepa C57BL/6, y una cepa mixta 129xC57BL/6; en algunos aspectos determinados, 50 % 129 y 50 % C57BL/6; en algunos aspectos determinados, 25 % 129 y 75 % C57BL/6.

Como se usa en esta solicitud, los términos “alrededor de” y “aproximadamente” se usan como equivalentes. Cualquier número usado en esta solicitud con o sin alrededor de/aproximadamente pretende abarcar cualquiera de las fluctuaciones normales apreciadas por un experto en la técnica en cuestión.

Otras características, objetos y ventajas descritas en la presente descripción se hacen evidentes en la descripción detallada de ciertos aspectos que sigue. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción detallada, si bien indica determinados aspectos como se describe en la presente, se proporciona solamente a modo de ilustración, no de limitación. Diversos cambios y modificaciones pueden resultar evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción detallada.

Breve descripción de las figuras

El Dibujo que se incluye en la presente descripción, que se compone de las siguientes Figuras, es solamente con propósitos de ilustración y no de limitación.

La Figura 1 muestra un diagrama, que no está a escala, de la organización genómica de los genes de muerte celular programada 1 (Pdcd1) no humano (por ejemplo, de ratón) y humano. Los exones y las regiones no traducidas (UTR) se enumeran por debajo para cada exón y por encima para cada UTR.

La Figura 2 muestra un diagrama, que no está a escala, de un método ilustrativo para la humanización de un gen de muerte celular programada 1 (Pdcd1) no humano. Los sitios de unión de nucleótidos seleccionados se marcan con una línea por debajo de cada unión. Las secuencias de estas uniones de nucleótidos seleccionadas se indican con las SEQ ID NO.

La Figura 3 muestra un diagrama, que no está a escala, de la organización genómica de genes de muerte celular programada 1 (Pdcd1) de ratón y humano que indica los sitios aproximados de las sondas usadas en un ensayo descrito en el Ejemplo 1.

La Figura 4 muestra histogramas ilustrativos de células T detectadas en el portal de CD19 y CD8 aisladas a partir de un ratón de tipo silvestre y un ratón heterocigoto para la humanización de un gen de Pdcd1 endógeno como se describe en el Ejemplo 1 que expresa proteína PD-1 de ratón y/o humanizada. Se indican las poblaciones de células estimuladas y sin estimular, así como las células teñidas con un control de isotipo.

La Figura 5 muestra curvas de crecimiento tumoral ilustrativas durante 21 días en ratones homocigotos para la humanización de un gen de Pdcd1 endógeno como se describe en el Ejemplo 1. Control: anticuerpo no específico para PD-1, Ab a-hPD-1: anticuerpo específico para PD-1 humano. Las flechas indican los días de tratamiento con el anticuerpo. El número de ratones libres de tumor en el día 21 se muestra para cada grupo de tratamiento.

La Figura 6 muestra el análisis por PCR en tiempo real ilustrativo de la expresión del ARNm de CD8b, CD3, IFN-g y PD-1 en bazos en ratones homocigotos para la humanización de un gen de Pdcd1 endógeno como se describe en el Ejemplo 1 después del tratamiento con un anticuerpo anti-PD-1. A, promedio de cinco ratones por grupo. B, niveles de expresión para ratones individuales en cada grupo de tratamiento. Control: anticuerpo no específico para PD-1; a-PD-1: anticuerpo anti-PD-1.

La Figura 7 muestra curvas de crecimiento tumoral ilustrativas durante 60 días en ratones homocigotos para la humanización de un gen de Pdcd1 endógeno como se describe en el Ejemplo 1, los cuales se administraron con 0,3 - 25 mg/kg de anticuerpo anti-hPD-1 o 25 mg/kg del anticuerpo de control (anticuerpo no específico para PD-1). Las flechas indican los días de tratamiento con el anticuerpo. El número de ratones libres de tumor en el día 60 se muestra para cada grupo de tratamiento.

La Figura 8 expone secuencias ilustrativas de Pdcd1 y PD-1 murinas, humanas y humanizadas, y una secuencia de ácido nucleico humana ilustrativa para la humanización de un gen de Pdcd1 no humano. Para las secuencias de ARNm, la letra en negritas indica la secuencia codificante y los exones consecutivos, cuando se indican, se encuentran separados por texto subrayado alterno; para las secuencias de ARNm humanizadas, las secuencias humanas se encuentran dentro de paréntesis. Para las secuencias de proteínas, los péptidos señal se encuentran subrayados, las secuencias extracelulares con letras en negritas, las secuencias de dominio V inmunoglobulínico se encuentran dentro de paréntesis, y las secuencias intracelulares en letras itálicas; y para las secuencias de proteínas humanizadas, las secuencias no humanas se indican en letra normal, y las secuencias humanas se indican en letra en negritas.

DEFINICIONES

Esta invención no se limita a los métodos y condiciones experimentales particulares descritos en la presente descripción, ya que estos métodos y condiciones pueden variar. Además, debe entenderse que la terminología usada en la presente descripción es solamente para el propósito de describir aspectos particulares, y no pretende ser limitante, dado que el alcance de la presente invención se define en las reivindicaciones.

A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos y frases usados en la presente descripción incluyen los significados que se atribuyen a los términos y frases en la técnica, a menos que se indique claramente lo contrario o resulte claramente evidente a partir del contexto en el cual se usa el término o frase. Aunque cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente descripción puede usarse en la práctica o prueba de la presente invención, a continuación se describirán métodos y materiales particulares.

El término "aproximadamente”, como se aplica en la presente descripción a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia indicado. En aspectos determinados, el término "aproximadamente” o "alrededor de” se refiere a un intervalo de valores que caen dentro de 25 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, o menos en cualquier dirección (mayor o menor) del valor de referencia indicado a menos que se indique de cualquier otra manera o resulte evidente de cualquier otra manera a partir del contexto (excepto cuando tal número exceda el 100 % de un valor posible).

El término "biológicamente activo” incluye una característica de cualquier agente que tiene actividad en un sistema biológico, in vitro o in vivo (por ejemplo, en un organismo). Por ejemplo, un agente que, cuando está presente en un organismo, tiene un efecto biológico dentro de ese organismo, se considera biológicamente activo. En aspectos particulares, cuando una proteína o polipéptido es biológicamente activo, una porción de esa proteína o polipéptido que comparte al menos una actividad biológica de la proteína o polipéptido se refiere típicamente como una porción "biológicamente activa”.

El término "comparable” incluye a dos o más agentes, entidades, situaciones, conjuntos de condiciones, etcétera que pueden no ser idénticos entre sí pero que son suficientemente similares para permitir la comparación entre ellos de manera que puedan obtenerse conclusiones razonablemente en base a las diferencias o las similitudes observadas. Los expertos en la técnica comprenderán, en contexto, el grado de identidad necesario en cualquier circunstancia determinada para dos o más de tales agentes, entidades, situaciones, conjuntos de condiciones, etcétera, para considerarse comparables.

El término "conservador', por ejemplo, como en una sustitución de aminoácido conservadora, incluye la sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo de aminoácido que tiene un grupo R de cadena lateral con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácido conservadora no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de interés de una proteína, por ejemplo, la capacidad de un receptor de unirse a un ligando. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen: cadenas laterales alifáticas tales como glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; cadenas laterales hidroxialifáticas tales como serina y treonina; cadenas laterales que contienen amida tales como asparagina y glutamina; cadenas laterales aromáticas tales como fenilalanina, tirosina, y triptófano; cadenas laterales básicas tales como lisina, arginina, e histidina; cadenas laterales ácidas tales como ácido aspártico y ácido glutámico; y, cadenas laterales que contienen azufre tales como cisteína y metionina. Los grupos de sustituciones conservadoras de aminoácidos incluyen, por ejemplo, valina/leucina/isoleucina, fenilalanina/tirosina, lisina/arginina, alanina/valina, glutamato/aspartato, y asparagina/glutamina. En algunos aspectos, una sustitución de aminoácido conservadora puede ser una sustitución de cualquier residuo nativo en una proteína con alanina, como se usa en, por ejemplo, la mutagénesis por barrido de alanina. En algunos aspectos, se produce una sustitución conservadora que tiene un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 descrita en Gonnet y otros (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45. En algunos aspectos, la sustitución es una sustitución moderadamente conservadora en donde la sustitución tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.

El término "control” incluye el significado que se entiende en la técnica de un "control” que es un estándar contra el cual se comparan los resultados. Típicamente, los controles se usan para aumentar la integridad en los experimentos mediante el aislamiento de variables para llegar a una conclusión sobre tales variables. En algunos aspectos, un control es una reacción o un ensayo que se realiza simultáneamente con una reacción o un ensayo de prueba para proporcionar un comparador. Como se usa en la presente descripción, un “control" puede incluir un “animal de control’. Un “animal de control’ puede tener una modificación como se describe en la presente descripción, una modificación que es diferente a como se describe en la presente descripción, o puede no tener modificaciones (es decir, un animal de tipo silvestre). En un experimento, se aplica la "prueba" (es decir, la variable que se analiza). En el segundo experimento, el "control," no se aplica la variable que se analiza. En algunos aspectos, un control es un control histórico (es decir, de una prueba o un ensayo realizados anteriormente, o una cantidad o resultado que se conoce previamente). En algunos aspectos, un control es o comprende un registro impreso o guardado de cualquier otra manera. Un control puede ser un control positivo o un control negativo.

El término "interrupción” incluye el resultado de un evento de recombinación homóloga con una molécula de ADN (por ejemplo, con una secuencia homóloga endógena tal como un gen o locus génico). En algunos aspectos, una interrupción puede lograr o representar una inserción, una deleción, una sustitución, un reemplazo, una mutación con pérdida de sentido, o un desplazamiento del marco de una(s) secuencia(s) de ADN, o cualquier combinación de estos. Las inserciones pueden incluir la inserción de genes completos o fragmentos de genes, por ejemplo, exones, que pueden ser de un origen distinto al de la secuencia endógena (por ejemplo, una secuencia heteróloga). En algunos aspectos, una interrupción puede aumentar la expresión y/o actividad de un gen o producto génico (por ejemplo, de una proteína codificada por un gen). En algunos aspectos, una interrupción puede disminuir la expresión y/o actividad de un gen o producto génico. En algunos aspectos, una interrupción puede alterar la secuencia de un gen o un producto génico codificado (por ejemplo, una proteína codificada). En algunos aspectos, una interrupción puede truncar o fragmentar un gen o un producto génico codificado (por ejemplo, una proteína codificada). En algunos aspectos, una interrupción puede extender un gen o un producto génico codificado; en algunos de tales aspectos, una interrupción puede lograr el ensamblaje de una proteína de fusión. En algunos aspectos, una interrupción puede afectar el nivel pero no la actividad de un gen o producto génico. En algunos aspectos, una interrupción puede afectar la actividad pero no la actividad de un gen o producto génico. En algunos aspectos, una interrupción puede no tener un efecto significativo sobre el nivel de un gen o producto génico. En algunos aspectos, una interrupción puede no tener un efecto significativo sobre la actividad de un gen o producto génico. En algunos aspectos, una interrupción puede no tener un efecto significativo sobre el nivel o la actividad de un gen o producto génico.

Los términos “determinar”, “medir’, “evaluar’, “valorar', “ensayar' y “analizar’ se usan indistintamente para referirse a cualquier forma de medición, e incluyen determinar si un elemento está presente o no. Estos términos incluyen determinaciones cuantitativas y/o cualitativas. El ensayo puede ser relativo o absoluto. “Ensayar para determinar la presencia de” puede ser determinar la cantidad de algo presente y/o determinar si está presente o ausente.

El término “régimen de dosificación” o “régimen terapéutico” incluye un conjunto de dosis unitarias, en algunos aspectos, más de una, que se administran individualmente a un sujeto, típicamente separadas por períodos de tiempo. En algunos aspectos, un agente terapéutico determinado tiene un régimen de dosificación recomendado, que puede involucrar una o más dosis. En algunos aspectos, un régimen de dosificación comprende una pluralidad de dosis cada una de las cuales se separan entre sí por un período de tiempo de la misma longitud; en algunas modalidades, un régimen de dosificación comprende una pluralidad de dosis y al menos dos períodos de tiempo diferentes que separan las dosis individuales.

La frase "locus endógeno" o “gen endógeno” incluye un locus genético que se encuentra en un organismo parental o de referencia. En algunos aspectos, el locus endógeno tiene una secuencia que se encuentra en la naturaleza. En algunos aspectos, el locus endógeno es un locus de tipo silvestre. En algunos aspectos, el organismo de referencia es un organismo de tipo silvestre. En algunos aspectos, el organismo de referencia es un organismo modificado genéticamente. En algunos aspectos, el organismo de referencia es un organismo criado en un laboratorio (ya sea de tipo silvestre o modificado genéticamente).

La frase "promotor endógeno" incluye un promotor que se asocia naturalmente, por ejemplo, en un organismo de tipo silvestre, con un gen endógeno.

El término "heterólogo” incluye un agente o entidad de una fuente diferente. Por ejemplo, cuando se usa en referencia a un polipéptido, gen, o producto génico o presente en una célula u organismo particular, el término aclara que el polipéptido, gen, o producto génico relevante: 1) se modificó por la acción del hombre; 2) se introdujo en la célula u organismo (o un precursor de este) por la acción del hombre (por ejemplo, por medio de ingeniería genética); y/o 3) no se produce o no está presente naturalmente en la célula u organismo relevante (por ejemplo, el tipo de célula o el tipo de organismo relevante).

El término "célula huésped” incluye una célula en la cual se ha introducido un ácido nucleico o una proteína heterólogos (por ejemplo, exógenos). Después de leer esta descripción los expertos entenderán que tales términos no se refieren solamente a la célula particular en cuestión, sino que se usan, además, para referirse a la progenie de tal una célula. Debido a que pueden producirse determinadas modificaciones en las generaciones posteriores ya sea debido a una mutación o a influencias del ambiente, tal progenie puede no ser, de hecho, idéntica a la célula parental, pero aun así se incluye dentro del alcance del término "célula huésped'. En algunos aspectos, una célula huésped es, o comprende, una célula procariota o eucariota. En general, una célula huésped es cualquier célula que sea adecuada para recibir y/o producir un ácido nucleico o una proteína heterólogos, independientemente del reino de la vida al que pertenece la célula. Las células ilustrativas incluyen las de organismos procariotas y eucariotas (unicelulares o pluricelulares), células bacterianas (por ejemplo, cepas de E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., etcétera), células de micobacterias, células fúngicas, células de levaduras (por ejemplo, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, etcétera), células vegetales, células de insectos (por ejemplo, SF-9, SF-21, células de insectos infectadas con baculovirus, Trichoplusia ni, etcétera), células de animales no humanos, células humanas, o fusiones de células tales como, por ejemplo, hibridomas o cuadromas. En algunos aspectos, la célula es una célula humana, de mono, simio, hámster, rata o ratón. En algunos aspectos, la célula es eucariota y se selecciona de las siguientes células: CHO (por ejemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por ejemplo, COS-7), célula de retina, Vero, CV1, renal (por ejemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (por ejemplo, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidérmica), CV-1, U937, 3T3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, MMT 060562, célula de Sertoli, célula BRL 3A, célula HT1080, célula de mieloma, célula tumoral, y una línea celular derivada de una célula mencionada anteriormente. En algunos aspectos, la célula comprende uno o más genes virales, por ejemplo, una célula de la retina que expresa un gen viral (por ejemplo, una célula PER.C6™). En algunos aspectos, una célula huésped es, o comprende, una célula aislada. En algunos aspectos, una célula huésped es parte de un tejido. En algunos aspectos, una célula huésped es parte de un organismo.

El término "humanizado" incluye ácidos nucleicos o proteínas cuyas estructuras (es decir, secuencias de nucleótidos o aminoácidos) incluyen porciones que se corresponden sustancialmente o idénticamente con las estructuras de un gen o proteína particulares que se encuentran en la naturaleza en un animal no humano, e incluyen, además, porciones que se diferencian de la encontrada en el gen o proteína no humanos particulares en cuestión y en lugar de eso se corresponden de manera más cercana a estructuras comparables que se encuentran en un gen o proteína humanos correspondientes. En algunos aspectos, un gen “humanizado” es uno que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos sustancialmente igual a la de un polipéptido humano (por ejemplo, una proteína humana o porción de esta - por ejemplo, una porción característica de esta). Para proporcionar un ejemplo, en el caso de un receptor de membrana, un gen “humanizado" puede codificar un polipéptido que tiene una porción extracelular, en su totalidad o en parte, que tiene una secuencia de aminoácidos igual a la de una porción extracelular humana y la secuencia restante igual a la de un polipéptido no humano (por ejemplo, de ratón). En algunos aspectos, un gen humanizado comprende al menos una porción de una secuencia de ADN de un gen humano. En algunos aspectos, un gen humanizado comprende una secuencia de ADN completa de un gen humano. En algunos aspectos, una proteína humanizada comprende una secuencia que tiene una porción que aparece en una proteína humana. En algunos aspectos, una proteína humanizada comprende una secuencia completa de una proteína humana y se expresa a partir de un locus endógeno de un animal no humano que corresponde al homólogo o al ortólogo del gen humano.

El término "identidad', por ejemplo, como en relación con una comparación de secuencias, incluye la identidad determinada mediante un número de algoritmos diferentes conocidos en la técnica que pueden usarse para medir la identidad de secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos. En algunos aspectos, las identidades como se describen en la presente descripción, se determinan mediante el uso de un alineamiento ClustalW v. 1.83 (lento) que emplea una penalización por apertura de interrupción de 10,0, una penalización por extensión de interrupción de 0,1, y el uso de una matriz de similitud de Gonnet (MACVECTOR™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008).

El término "aislado" incluye una sustancia y/o entidad que (1) se ha separado de al menos algunos de los componentes con los que se asociaba cuando se produjo inicialmente (ya sea en la naturaleza y/o en un entorno experimental), y/o (2) se ha diseñado, producido, preparado, y/o fabricado por la mano del hombre. Las sustancias y/o entidades aisladas pueden separarse de aproximadamente 10 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 %, o más de aproximadamente 99 % de los otros componentes con los que se asociaron inicialmente. En algunos aspectos, los agentes aislados son aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 %, o más de aproximadamente 99 % puros. Una sustancia es “pura" si está sustancialmente libre de otros componentes. En algunos aspectos, como entenderán los expertos en la técnica, una sustancia aún puede considerarse “aislada" o incluso “pura", después de combinarse con otros componentes determinados tales como, por ejemplo, uno o más vehículos o excipientes (por ejemplo, tampón, disolvente, agua, etcétera); en tales aspectos, el porcentaje de aislamiento o pureza de la sustancia se calcula sin incluir tales vehículos o excipientes. Para proporcionar un ejemplo, en algunos aspectos, un polímero biológico tal como un polipéptido o un polinucleótido que se produce en la naturaleza se considera “aislado" cuando: a) en virtud de su origen o fuente de obtención no se asocia con algunos o todos los componentes que lo acompañan en su estado nativo en la naturaleza; b) está sustancialmente libre de otros polipéptidos o ácidos nucleicos de la misma especie de la especie que lo produce en la naturaleza; o c) se expresa por, o se encuentra de cualquier otra manera en asociación con componentes de una célula u otro sistema de expresión que no es de la especie que lo produce en la naturaleza. Por lo tanto, por ejemplo, en algunos aspectos, un polipéptido que se sintetiza químicamente o se sintetiza en un sistema celular diferente del que lo produce en la naturaleza se considera un polipéptido "aislado". Alternativamente o adicionalmente, en algunos aspectos, un polipéptido que se ha sometido a una o más técnicas de purificación puede considerarse un polipéptido “aislado" en la medida que se ha separado de otros componentes: a) con los que se asocia en la naturaleza; y/o b) con los que se asociaba cuando se produjo inicialmente.

La frase “animal no humano" incluye cualquier organismo vertebrado que no es un ser humano. En algunos aspectos, un animal no humano es un ciclóstomo, un pez óseo, un pez cartilaginoso (por ejemplo, un tiburón o una raya), un anfibio, un reptil, un mamífero, y un ave. En algunos aspectos, un mamífero no humano es un primate, una cabra, una oveja, un cerdo, un perro, una vaca, o un roedor. En algunos aspectos, un animal no humano es un roedor tal como una rata o un ratón.

La frase "ácido nucleico" incluye cualquier compuesto y/o sustancia que es una cadena oligonucleotídica, o que puede incorporarse a esta. En algunos aspectos, un “ácido nucleico" es un compuesto y/o sustancia que es, o que pueda incorporarse en una cadena oligonucleotídica por medio de un enlace fosfodiéster. Como resultará evidente a partir del contexto, en algunos aspectos, “ácido nucleico" incluye residuos de ácidos nucleicos individuales (por ejemplo, nucleótidos y/o nucleósidos); en algunos aspectos, “ácido nucleico" incluye una cadena oligonucleotídica que comprende residuos de ácidos nucleicos individuales. En algunos aspectos, un “ácido nucleico" es o comprende a RN; en algunos aspectos, un “ácido nucleico" es o comprende ADN. En algunos aspectos, un “ácido nucleico" es, comprende, o consiste en uno o más residuos de ácidos nucleicos naturales. En algunos aspectos, un “ácido nucleico" es, comprende, o consiste en uno o más análogos de ácidos nucleicos. En algunos aspectos, un análogo de ácido nucleico se diferencia de un “ácido nucleico" en que no utiliza una cadena principal con enlaces fosfodiéster. Por ejemplo, en algunos aspectos, un “ácido nucleico" es, comprende, o consiste en uno o más “ácidos nucleicos peptídicos", que se conocen en la técnica y tienen enlaces peptídicos en lugar de enlaces fosfodiéster en la cadena principal, y se consideran dentro del alcance descrito en la presente descripción. Alternativamente o adicionalmente, en alguno aspectos, un “ácido nucleico’’ tiene uno o más enlaces fosforotioato y/o 5'-N-fosforamidita en lugar de enlaces fosfodiéster. En algunos aspectos, un “ácido nucleico" es, comprende, o consiste en uno o más nucleósidos naturales (por ejemplo, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina, y desoxicitidina). En algunos aspectos, un “ácido nucleico" es, comprende, o consiste en uno o más análogos de nucleósidos (por ejemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolopirimidina, 3-metiladenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinilcitidina, C-5 propiniluridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propiniluridina, C5-propinilcitidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-deazaadenosina, 7-deazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina, 2-tiocitidina, bases metiladas, bases intercaladas, y combinaciones de estos). En algunos aspectos, un “ácido nucleico" comprende uno o más azúcares modificados (por ejemplo, 2'-fluororribosa, ribosa, 2'-desoxirribosa, arabinosa, y hexosa) en comparación con los que se encuentran en los ácidos nucleicos naturales. En algunos aspectos, un “ácido nucleico" tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico funcional tal como un ARN o una proteína. En algunos aspectos, un “ácido nucleico" incluye uno o más intrones. En algunos aspectos, un “ácido nucleico" se prepara mediante uno o más de aislamiento a partir de una fuente natural, síntesis enzimática por polimerización basada en una plantilla complementaria (in vivo o in vitro), reproducción en una célula o sistema recombinante, y síntesis química. En algunos aspectos, un “ácido nucleico" es de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 o más residuos de largo. En algunos aspectos, un “ácido nucleico" es monocatenario; en algunos aspectos, un “ácido nucleico" es bicatenario. En algunos aspectos, un “ácido nucleico" tiene una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un elemento que codifica, o es el complemento de una secuencia que codifica, un polipéptido. En algunos aspectos, un “ácido nucleico" tiene actividad enzimática.

La frase "unidos operativamente" incluye una yuxtaposición en donde los componentes descritos se encuentran en una relación que les permite funcionar en su manera prevista. Una secuencia control "unida operativamente" a una secuencia codificante está ligada de manera que la expresión de la secuencia codificante se logra en condiciones compatibles con las secuencias control. Las secuencias "unidas operativamente" incluyen ambas, las secuencias de control de la expresión contiguas al gen de interés y las secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés. El término "secuencia de control de la expresión" incluye secuencias de polinucleótidos, que son necesarias para efectuar la expresión y procesamiento de las secuencias codificantes a las que se unen. Las “secuencias de control de la expresión" incluyen: secuencias adecuadas de iniciación, de terminación, promotoras y potenciadoras de la transcripción; señales eficientes de procesamiento del ARN tales como señales de corte y empalme y de poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARNm citoplasmático; secuencias que potencian la eficiencia de la traducción (es decir, la secuencia consenso Kozak); secuencias que potencian la estabilidad de las proteínas; y cuando convenga, secuencias que potencian la secreción de proteínas. La naturaleza de tales secuencias control difiere según el organismo huésped. Por ejemplo, en procariotas, tales secuencias control generalmente incluyen promotor, sitio de unión al ribosoma, y secuencias de terminación de la transcripción, mientras que en eucariotas, típicamente, tales secuencias control incluyen promotores y secuencias de terminación de la transcripción. El término “secuencias control’ está destinado a incluir componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y puede incluir, además, componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de parejas de fusión.

El término “paciente" o “sujeto" incluye cualquier organismo al que se administra o puede administrarse una composición proporcionada, por ejemplo, con propósitos experimentales, de diagnóstico, profilácticos, estéticos, y/o terapéuticos. Los pacientes típicos incluyen animales (por ejemplo, mamíferos tales como ratones, ratas, conejos, primates no humanos, y/o seres humanos). En algunos aspectos, un paciente es un animal no humano. En algunos aspectos, un paciente (por ejemplo, un paciente animal no humano) puede tener una modificación como se describe en la presente, una modificación que es diferente a como se describe en la presente o puede no tener modificaciones (es decir, un paciente animal no humano de tipo silvestre). En algunos aspectos, un animal no humano padece de uno o más trastornos o afecciones, o es susceptible a estos. En algunos aspectos, un animal no humano muestra uno o más síntomas de un trastorno o afección. En algunos aspectos, un animal no humano se ha diagnosticado con uno o más trastornos o afecciones.

El término "polipéptido" incluye cualquier cadena polimérica de aminoácidos. En algunos aspectos, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos presente en la naturaleza. En algunos aspectos, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que no está presente en la naturaleza. En algunos aspectos, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que contiene porciones que se producen en la naturaleza separadas entre sí (es decir, a partir de dos o más organismos diferentes, por ejemplo, porciones humanas y no humanas). En algunos aspectos, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que está modificada genéticamente en el hecho de que se diseña y/o produce mediante la acción del hombre.

El término "recombinante", se destina a incluir polipéptidos (por ejemplo, polipéptidos PD-1 como se describen en la presente descripción) que se diseñan, se modifican, se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por medios recombinantes, tales como polipéptidos que se expresan con el uso de un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped, polipéptidos aislados a partir de una biblioteca combinatoria, de polipéptidos humanos recombinantes (Hoogenboom H. R., (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy H., e Highsmith W. E., (2002) Clin.

Biochem. 35:425-445; Gavilondo J. V., y Larrick J. W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H., y Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378), anticuerpos aislados a partir de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulinas humanas (ver por ejemplo, Taylor, L. D., y otros (1992) Nucl. Acids Res.

20:6287-6295; Kellermann S-A., y Green L. L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Little M. y otros (2000) Immunology Today 21:364-370; Murphy, A.J., y otros (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111(14):5153-5158) o polipéptidos que se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por cualquier otro medio que involucre el corte y empalme entre elementos de secuencia seleccionados. En algunos aspectos, uno o más de tales elementos de secuencias seleccionados se encuentran en la naturaleza. En algunos aspectos, uno o más de tales elementos de secuencias seleccionados se diseñan in silico. En algunos aspectos, uno o más de tales elementos de secuencia seleccionados son el resultado de la mutagénesis (por ejemplo, in vivo o in vitro) de un elemento de secuencia conocido, por ejemplo, a partir de una fuente natural o sintética. Por ejemplo, en algunos aspectos, un polipéptido recombinante se compone de secuencias que se encuentran en el genoma de un organismo fuente de interés (por ejemplo, humano, ratón, etcétera). En algunos aspectos, un polipéptido recombinante tiene una secuencia de aminoácidos que es el resultado de la mutagénesis (por ejemplo, in vitro o in vivo, por ejemplo, en un animal no humano), de manera que las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos recombinantes son secuencias que, si bien se originan de secuencias de polipéptidos y se relacionan con estas, pueden no existir naturalmente dentro del genoma de un animal no humano in vivo.

El término "reemplazo" incluye un proceso a través del cual una secuencia de ácido nucleico “reemplazada” (por ejemplo, un gen) que se encuentra en un locus huésped (por ejemplo, en un genoma) se elimina de ese locus, y un ácido nucleico diferente, de “reemplazo” se coloca en su lugar. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico reemplazada y las secuencias de ácidos nucleicos de reemplazo son comparables entre sí porque, por ejemplo, son homólogas entre sí y/o contienen elementos correspondientes (por ejemplo, elementos que codifican proteínas, elementos reguladores, etcétera). En algunos aspectos, una secuencia de ácido nucleico reemplazada incluye uno o más de un promotor, un potenciador, un sitio donante de corte y empalme, un sitio receptor de corte y empalme, un intrón, un exón, una región no traducida (UTR); en algunos aspectos, una secuencia de ácido nucleico de reemplazo incluye una o más secuencias codificantes. En algunos aspectos, una secuencia de ácido nucleico de reemplazo es un homólogo de la secuencia de ácido nucleico reemplazada. En algunos aspectos, una secuencia de ácido nucleico de reemplazo es un ortólogo de la secuencia reemplazada. En algunos aspectos, una secuencia de ácido nucleico de reemplazo es, o comprende, una secuencia de ácido nucleico humana. En algunos aspectos, que incluyen cuando la secuencia de ácido nucleico de reemplazo es, o comprende, una secuencia de ácido nucleico humana, la secuencia de ácido nucleico reemplazada es, o comprende, una secuencia de roedor (por ejemplo, una secuencia de ratón o de rata). La secuencia de ácido nucleico así colocada puede incluir una o más secuencias reguladoras que son parte de la secuencia de ácido nucleico fuente usada para obtener la secuencia así colocada (por ejemplo, promotores, potenciadores, regiones 5' o 3' no traducidas, etcétera). Por ejemplo, en diversos aspectos, el reemplazo es una sustitución de una secuencia endógena con una secuencia heteróloga que da como resultado la producción de un producto génico a partir de la secuencia de ácido nucleico así colocada (que comprende la secuencia heteróloga), pero no la expresión de la secuencia endógena; el reemplazo es de una secuencia genómica endógena con una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una función similar a la del polipéptido codificado por la secuencia endógena (por ejemplo, la secuencia genómica endógena codifica un polipéptido p D-1, y el fragmento de ADN codifica uno o más polipéptidos PD-1 humanos). En diversos aspectos, un gen endógeno o un fragmento de este se reemplaza con un gen humano correspondiente o un fragmento de este. Un gen humano correspondiente o un fragmento de este es un gen humano o un fragmento que es un ortólogo de, o es sustancialmente similar o igual en estructura y/o función, al gen endógeno o fragmento de este que se reemplaza.

La frase "proteína de muerte celular programada 1" o “proteína PD-1” incluye una proteína transmembrana de tipo I que pertenece a la familia CD28/CTLA-4 de reguladores de células T. La estructura proteica de una proteína PD-1 incluye un dominio V inmunoglobulínico amino terminal extracelular, un dominio transmembrana y una cola intracelular carboxilo terminal, dicha cola intracelular contiene un motivo inhibidor de inmunorreceptor basado en tirosina (ITIM) y un motivo de cambio de inmunorreceptor basado en tirosina. La proteína PD-1 se expresa en la superficie celular e interactúa con PD-L1 y PD-L2, miembros de la familia B7 de ligandos inmunorreguladores (Collins, M. y otros (2005) Genome Biol. 6:223). La proteína PD-1 se expresa, entre otras, en células T activadas, células B, macrófagos, monocitos, mastocitos, y además, en muchos tumores. Se ha demostrado que la proteína PD-1 se encuentra involucrada en la regulación negativa de la respuesta inmunológica y, particularmente, en la regulación negativa de las respuestas de células T. A modo de ilustración, las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los genes Pdcd1 de ratón y humano, que codifican proteínas PD-1, se proporcionan en la Figura 8. Después de leer esta descripción los expertos reconocerán que uno o más genes Pdcd1 endógenos en un genoma (o todos) pueden reemplazarse con uno o más genes Pdcd1 heterólogos (por ejemplo, variantes polimórficas, subtipos o mutantes, genes de otras especies, formas humanizadas, etcétera).

Una "célula que expresa PD-1” incluye una célula que expresa una proteína de membrana PD-1 de tipo I. En algunos aspectos, una célula que expresa PD-1 expresa una proteína de membrana PD-1 de tipo I en su superficie. En algunos aspectos, una proteína PD-1 se expresa en la superficie de la célula en una cantidad suficiente para mediar las interacciones célula a célula. Las células que expresan PD-1 ilustrativas incluyen células B, macrófagos y células T. Las células que expresan PD-1 regulan diversos procesos celulares por medio de la interacción de la proteína PD-1 expresada en la superficie de células inmunológicas (por ejemplo, células T y B) y desempeñan un papel en la determinación de la diferenciación y el destino de estas células. En algunos aspectos, los animales no humanos de la presente invención demuestran la regulación de diversos procesos celulares (como se describe en la presente) por medio de proteínas PD-1 humanizadas expresadas en la superficie de una o más células del animal no humano. En algunos aspectos, los animales no humanos descritos en la presente descripción demuestran una regulación negativa de la señalización a través de receptores de células T (TCR) por medio de proteínas PD-1 humanizadas expresadas en la superficie de una o más células del animal no humano. En algunos aspectos, los animales no humanos demuestran una regulación negativa de las respuestas inmunológicas por medio de proteínas PD-1 humanizadas expresadas en la superficie de una o más células del animal no humano.

El término “referencia’’ incluye un estándar o agente, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de control contra el cual se compara un agente, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de interés. En algunos aspectos, un agente, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de referencia se somete a prueba y/o se determina sustancialmente de manera simultánea con la prueba o determinación del agente, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de interés. En algunos aspectos, un agente, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de referencia es una referencia histórica, materializada opcionalmente en un medio tangible. En algunos aspectos, una referencia puede referirse a un control. Como se usa en la presente descripción, una “referencia’’ puede incluir un “animal de referencia’’. Un “animal de referencia" puede tener una modificación como se describe en la presente descripción, una modificación que es diferente a como se describe en la presente descripción o puede no tener modificaciones (es decir, un animal de tipo silvestre). Típicamente, como entenderán los expertos en la técnica, un agente, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de referencia se determina o caracteriza en condiciones comparables a las utilizadas para determinar o caracterizar el agente, animal (por ejemplo, un mamífero), cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de interés.

El término “sustancialmente’’ incluye la condición cualitativa de exhibir una medida o grado total o casi total de una característica o propiedad de interés. Un experto en materia biológica comprenderá que los fenómenos biológicos y químicos raramente, o nunca, llegan a completarse y/o se completan o logran o evitan un resultado absoluto. Por lo tanto, el término “sustancialmente’’ se usa en la presente descripción para capturar la carencia potencial de totalidad inherente en muchos fenómenos biológicos y químicos.

La frase “homología sustancial’ incluye una comparación entre secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos. Como apreciarán los expertos en la técnica, generalmente dos secuencias se consideran “sustancialmente homologas’’ si contienen residuos homólogos en posiciones correspondientes. Los residuos homólogos pueden ser residuos idénticos. Alternativamente, los residuos homólogos pueden ser residuos no idénticos con características estructurales y/o funcionales adecuadamente similares. Por ejemplo, como bien conocen los expertos en la técnica, ciertos aminoácidos se clasifican típicamente como aminoácidos “hidrófobos” o “hidrófilos’’, y/o porque tienen cadenas laterales “polares’’ o “no polares’’. La sustitución de un aminoácido por otro del mismo tipo puede considerarse frecuentemente una sustitución “homologa’’. Las clasificaciones de aminoácidos típicas se resumen en la Tabla 1 y 2.

TABLA 1

Alanina Ala A No polar Neutro 1,8 Arginina Arg R Polar Positivo -4,5 Asparagina Asn N Polar Neutro -3,5 Ácido aspártico Asp D Polar Negativo -3,5 Cisteína Cys C No polar Neutro 2,5 Ácido glutámico Glu E Polar Negativo -3,5 Glutamina Gln Q Polar Neutro -3,5 Glicina Gly G No polar Neutro -0,4 Histidina His H Polar Positivo -3,2 Isoleucina Ile I No polar Neutro 4,5 Leucina Leu L No polar Neutro 3,8 Lisina Lys K Polar Positivo -3,9 Metionina Met M No polar Neutro 1,9 Fenilalanina Phe F No polar Neutro 2,8 Prolina Pro P No polar Neutro -1,6 Serina Ser S Polar Neutro -0,8 Treonina Thr T Polar Neutro -0,7 Triptófano Trp W No polar Neutro -0,9 Tirosina Tyr Y Polar Neutro -1,3 Valina Val V No polar Neutro 4,2

Aminoácidos ambiguos 3-Letras 1-Letra

Asparagina o ácido aspártico Asx B

Glutamina o ácido glutámico Glx Z

Leucina o Isoleucina Xle J

Aminoácido no especificado o desconocido Xaa X

Como se conoce bien en esta técnica, las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos pueden compararse con el uso de cualquiera de una variedad de algoritmos, que incluyen los disponibles en programas informáticos comerciales tales como BLASTN para las secuencias de nucleótidos y BLASTP, gapped BLAST, y PSI-BLAST para las secuencias de aminoácidos. Tales programas ilustrativos se describen en Altschul y otros (1990) Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul y otros. (1997) Methods in Enzymology; Altschul y otros, "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Baxevanis y otros (1998) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley; y Misener y otros (eds.) (1999) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press. Además de identificar las secuencias homólogas, los programas mencionados anteriormente típicamente proporcionan una indicación del grado de homología. En algunos aspectos, dos secuencias se consideran sustancialmente homólogas si al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de sus residuos correspondientes son homólogos en un tramo de residuos en cuestión. En algunos aspectos, el segmento relevante es una secuencia completa. En algunos aspectos, el tramo en cuestión es de al menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o más residuos. En algunos aspectos, el tramo en cuestión incluye residuos contiguos a lo largo de una secuencia completa. En algunos aspectos, el tramo en cuestión incluye residuos discontinuos a lo largo de una secuencia completa. En algunos aspectos, el tramo en cuestión es de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o más residuos.

La frase “identidad sustancial’ incluye una comparación entre secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos. Como apreciarán los expertos en la técnica, generalmente, dos secuencias se consideran “sustancialmente idénticas" si contienen residuos idénticos en posiciones correspondientes. Como se conoce bien en esta técnica, las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos pueden compararse con el uso de cualquiera de una variedad de algoritmos, que incluyen los disponibles en programas informáticos comerciales tales como BLASTN para las secuencias de nucleótidos y BLASTP, gapped BLAST, y PSI-BLAST para las secuencias de aminoácidos. Tales programas ilustrativos se describen en Altschul y otros (1990) Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul y otros, Methods in Enzymology; Altschul y otros (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Baxevanis y otros (1998) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley; y Misener y otros, (eds.) (1999) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press. Además de identificar secuencias idénticas, los programas mencionados anteriormente típicamente proporcionan una indicación del grado de identidad. En algunos aspectos, dos secuencias se consideran sustancialmente idénticas si al menos el 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de sus residuos correspondientes son idénticos en un segmento relevante de residuos. En algunos aspectos, el segmento relevante es una secuencia completa. En algunos aspectos, el tramo en cuestión es de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o más residuos.

La frase "vector de transformación" o "constructo de transformación" incluye una molécula de polinucleótido que comprende una región de transformación. Una región de transformación comprende una secuencia que es idéntica o sustancialmente idéntica a una secuencia en una célula, tejido o animal diana y proporciona la integración del constructo de transformación en una posición dentro del genoma de la célula, tejido o animal por medio de la recombinación homóloga. Se incluyen, además, las regiones de transformación que se dirigen hacia el objetivo con el uso de sitios de reconocimiento de recombinasas sitio específicas (por ejemplo, sitios loxP o Frt). En algunos aspectos, un constructo de transformación descrito en la presente descripción comprende, además, una secuencia de ácido nucleico o gen de interés particular, un marcador de selección, secuencias de control y/o reguladoras, y otras secuencias de ácidos nucleicos que permiten la recombinación mediada por la adición exógena de proteínas que ayudan o facilitan la recombinación que involucra tales secuencias. En algunos aspectos, un constructo de transformación descrito en la presente descripción comprende, además, un gen de interés en su totalidad o en parte, en donde el gen de interés es un gen heterólogo que codifica una proteína, en su totalidad o en parte, que tiene una función similar a la de una proteína codificada por una secuencia endógena. En algunos aspectos, un constructo de transformación descrito en la presente descripción comprende, además, un gen humanizado de interés, en su totalidad o en parte, en donde el gen humanizado de interés codifica una proteína, en su totalidad o en parte, que tiene una función similar a la de una proteína codificada por la secuencia endógena.

La frase “cantidad con eficacia terapéutica" incluye una cantidad que produce el efecto deseado para el cual esta se administra. En algunos aspectos, el término se refiere a una cantidad que es suficiente, cuando se administra a un sujeto (por ejemplo, un animal) que padece de una enfermedad, trastorno, y/o afección, o es susceptible a estos, de acuerdo con un régimen de dosificación terapéuti

aspectos, una cantidad con eficacia terapéutica es una que reduce la incidencia y/o gravedad, y/o retrasa la aparición de uno o más síntomas de la enfermedad, trastorno, y/o afección. Los expertos en la técnica apreciarán que el término "cantidad con eficacia terapéutica" de hecho no requiere que se logre un tratamiento con éxito en un individuo particular. Más bien, una cantidad con eficacia terapéutica puede ser aquella cantidad que proporciona una respuesta farmacológica deseada particular en un número significativo de sujetos cuando se administra a sujetos que necesitan un tratamiento de este tipo. En algunos aspectos, la referencia a una cantidad con eficacia terapéutica puede ser una referencia a una cantidad según se mide en uno o más tejidos específicos (por ejemplo, un tejido afectado por la enfermedad, trastorno o afección) o fluidos (por ejemplo, sangre, saliva, suero, sudor, lágrimas, orina, etcétera). Los expertos en la técnica apreciarán que, en algunos aspectos, una cantidad con eficacia terapéutica de un agente o terapia particular puede formularse y/o administrarse en una dosis única. En algunos aspectos, un agente con eficacia terapéutica puede formularse y/o administrarse en una pluralidad de dosis, por ejemplo, como parte de un régimen de dosificación.

El término “tratamiento" (también “tratar' o “que trata’’), en su sentido más amplio incluye cualquier administración de una sustancia (por ejemplo, las composiciones proporcionadas) que parcialmente o completamente alivia, mejora, mitiga, inhibe, retarda la aparición, reduce la gravedad, y/o reduce la incidencia de uno o más síntomas, características, y/o causas de una enfermedad, trastorno, y/o afección particular. En algunos aspectos, dicho tratamiento puede administrarse a un sujeto que no exhibe signos de la enfermedad, trastorno y/o afección en cuestión y/o de un sujeto que sólo exhibe signos tempranos de la enfermedad, trastorno, y/o afección. Alternativamente o adicionalmente, en algunos aspectos, el tratamiento puede administrarse a un sujeto que exhibe uno o más signos establecidos de la enfermedad, trastorno y/o afección en cuestión. En algunos aspectos, el tratamiento puede ser de un sujeto que se ha diagnosticado que padece de la enfermedad, trastorno, y/o afección en cuestión. En algunos aspectos, el tratamiento puede ser de un sujeto que se conoce que tiene uno o más factores de susceptibilidad correlacionados estadísticamente con un mayor riesgo de desarrollo de la enfermedad, trastorno, y/o afección en cuestión.

El término “variante" incluye una entidad que muestra una identidad estructural significativa con una entidad de referencia, pero se diferencia estructuralmente de la entidad de referencia en la presencia o nivel de una o más porciones químicas en comparación con la entidad de referencia. En muchos aspectos, una “variante" difiere, además, funcionalmente de su entidad de referencia. En general, el hecho de que una entidad particular se considere adecuadamente como una “variante" de una entidad de referencia se basa en su grado de identidad estructural con la entidad de referencia. Como apreciarán los expertos en la técnica, cualquier entidad de referencia biológica o química tiene determinados elementos estructurales característicos. Una “variante", por definición, es una entidad química definida que comparte uno o más de tales elementos estructurales característicos. Para proporcionar algunos ejemplos, una molécula pequeña puede tener un elemento estructural central característico (por ejemplo, un macrociclo central) y/o una o más porciones colgantes características de manera que una variante de la molécula pequeña es una que comparte el elemento estructural central y las porciones colgantes características pero se diferencia en otras porciones colgantes y/o en los tipos de enlaces presentes (simples vs. dobles, E vs. Z, etcétera) dentro del núcleo central, un polipéptido puede tener un elemento de secuencia característico que comprende una pluralidad de aminoácidos que tienen posiciones designadas relacionadas entre sí en el espacio lineal o tridimensional y/o que contribuyen a una función biológica particular, un ácido nucleico puede tener un elemento de secuencia característico que comprende una pluralidad de residuos de nucleótidos que tienen posiciones designadas con respecto a otras en el espacio lineal o tridimensional. Por ejemplo, una “variante de polipéptido" puede diferenciarse de un polipéptido de referencia como resultado de una o más diferencias en la secuencia de aminoácidos y/o una o más diferencias en las porciones químicas (por ejemplo, carbohidratos, lípidos, etcétera) unidas covalentemente a la cadena principal del polipéptido. En algunos aspectos, una “variante de polipéptido" muestra una identidad de secuencia general con un polipéptido de referencia que es al menos de 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, o 99 %. Alternativamente o adicionalmente, en algunos aspectos, una “variante de polipéptido" no comparte al menos un elemento de secuencia característico con un polipéptido de referencia. En algunos aspectos, el polipéptido de referencia tiene una o más actividades biológicas. En algunos aspectos, una “variante de polipéptido" comparte una o más de las actividades biológicas del polipéptido de referencia. En algunos aspectos, una “variante de polipéptido" carece de una o más de las actividades biológicas del polipéptido de referencia. En algunos aspectos, una “variante de polipéptido" muestra un nivel reducido de una o más actividades biológicas en comparación con el polipéptido de referencia. En muchos aspectos, un polipéptido de interés se considera una “variante" de un polipéptido original o de referencia si el polipéptido de interés tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la del original excepto por un pequeño número de alteraciones de la secuencia en posiciones particulares. Típicamente, menos de 20 %, 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % de los residuos en la variante están sustituidos en comparación con el original. En algunos aspectos, una “variante" tiene 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1 residuos sustituidos en comparación con un original. Frecuentemente, una “variante" tiene un número muy pequeño (por ejemplo, menos de 5, 4, 3, 2, o 1) de residuos funcionales sustituidos (es decir, residuos que participan en una actividad biológica particular). Además, típicamente, una “variante" no tiene más de 5, 4, 3, 2, o 1 adiciones o deleciones, y frecuentemente no tiene adiciones o deleciones, en comparación con el original. Por otra parte, cualquiera de las adiciones o deleciones son típicamente menores que aproximadamente 25, aproximadamente 20, aproximadamente 19, aproximadamente 18, aproximadamente 17, aproximadamente 16, aproximadamente 15, aproximadamente 14, aproximadamente 13, aproximadamente 10, aproximadamente 9, aproximadamente 8, aproximadamente 7, aproximadamente 6, y comúnmente son menores que aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3, o aproximadamente 2 residuos. En algunos aspectos, el polipéptido parental o de referencia es uno que se encuentra en la naturaleza. Como entenderán los expertos en la técnica, una pluralidad de variantes de un polipéptido de interés particular puede encontrarse comúnmente en la naturaleza, particularmente cuando el polipéptido de interés es un polipéptido agente infeccioso.

El término “vector’ incluye una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se asocia. En algunos aspectos, los vectores son capaces de replicarse de manera extracromosómica y/o expresar los ácidos nucleicos a los que se encuentran unidos en una célula huésped tal como una célula eucariota y/o procariota. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes unidos operativamente se refieren en la presente descripción como “vectores de expresión.”

El término “de tipo silvestre” incluye una entidad que tiene una estructura y/o actividad como la que se encuentra en la naturaleza en un estado o contexto “normal” (a diferencia de mutante, enfermo, alterado, etcétera). Los expertos en la técnica apreciarán que los genes y polipéptidos de tipo silvestre existen frecuentemente en múltiples formas diferentes (por ejemplo, alelos).

Descripción detallada de ciertos aspectos

La presente descripción también describe, entre otras cosas, animales no humanos mejorados y/o diseñados que tienen material genético humanizado que codifica un gen de muerte celular programada 1 (Pdcdl) para determinar la eficacia terapéutica de moduladores de Pdcdl (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1) para el tratamiento del cáncer, y ensayos de respuestas de células T y transducción de señales. Se contempla que tales animales no humanos proporcionan una mejora en la determinación de la eficacia terapéutica de moduladores de PD-1 y su potencial para el bloqueo de PD-1. Por lo tanto, la presente descripción es particularmente útil para el desarrollo de terapias anti-PD-1 para el tratamiento de diversos cánceres, así como para aumentar las respuestas inmunológicas para tratar y/o eliminar una infección viral en animales no humanos. Particularmente, la presente descripción abarca la humanización de un gen de Pdcdl murino que da como resultado la expresión de una proteína PD-1 humanizada en la superficie de células del animal no humano. Tales proteínas PD-1 humanizadas tienen la capacidad de proporcionar una fuente de células humanas PD-1 para determinar la eficacia de agentes terapéuticos anti-PD-1 para promover respuestas inmunológicas antitumorales. En algunos aspectos, los animales no humanos descritos en la presente descripción demuestran el aumento de la respuesta inmunitaria mediante el bloqueo de la señalización de PD-1 a través de la proteína PD-1 humanizado expresado en la superficie de las células del animal no humano. En algunos aspectos, las proteínas PD-1 humanizadas tienen una secuencia correspondiente al dominio V inmunoglobulínico N-terminal, en su totalidad o en parte, de una proteína PD-1 humano. En algunos aspectos, las proteínas PD-1 humanizadas tienen una secuencia correspondiente a la cola intracelular de una proteína PD-1 murina; en algunos aspectos, una secuencia correspondiente al dominio transmembrana y la cola intracelular de una proteína PD-1 murina. En algunos aspectos, las proteínas PD-1 humanizadas tienen una secuencia correspondiente a los residuos de aminoácidos 21-170 (o 26 169, 27-169, o 27-145, o 35-145) de una proteína PD-1 humano. En algunos aspectos, los animales no humanos descritos en la presente descripción comprenden un gen de Pdcd1 endógeno que contiene material genético del animal no humano y una especie heteróloga (por ejemplo, un ser humano). En algunos aspectos, los animales no humanos descritos en la presente descripción comprenden un gen de Pdcd1 humanizado, en donde el gen de Pdcd1 humanizado comprende el exón 2 y el exón 3, en su totalidad o en parte, de un gen PDCD1 humano. En algunos aspectos determinados, los animales no humanos descritos en la presente descripción comprenden un gen de Pdcd1 humanizado, en donde el gen de Pdcd1 humanizado comprende 883 pb de un gen PDCD1 humano correspondientes al exón 2 y los primeros 71 pb del exón 3 (es decir, que codifica el tallo) de un gen PDCD1 humano.

Diversos aspectos se describen en detalle en las siguientes secciones. El uso de secciones no significa que limite la invención. Cada sección puede aplicarse a cualquier aspecto de la invención. En esta solicitud, el uso de “o” significa “y/o” a menos que se indique de cualquier otra manera.

Gen de muerte celular programada 1 (Pdcdl)

El gen de Pdcd1 (referido, además, como CD279) se descubrió originalmente como un gen regulado positivamente en un hibridoma de células T en apoptosis (Ishida, Y. y otros (1992) EMBO J. 11(11):3887-3895). El gen de Pdcd1 consiste en 5 exones que codifican PD-1, que es una proteína de membrana de tipo I (referida como PD-1) que incluye un dominio V inmunoglobulínico (IgV) N-terminal, un tallo (~20 aminoácidos de longitud), un dominio transmembrana, y una cola intracelular que contiene un motivo inhibidor de inmunorreceptor basado en tirosina (ITIM) y un motivo de cambio de inmunorreceptor basado en tirosina (ITSM). La proteína PD-1 se expresa en muchos tipos de células tales como, por ejemplo, células B, células dendríticas, monocitos activados, células asesinas naturales (NK) y células T activadas (Keir, M.E., y otros (2008) Annu. Rev. Immunol. 26:677-704). Además, se han informado diversas variantes de corte y empalme de PD-1 y varían en base al exón del cual carecen (Nielsen, C. y otros (2005) Cell. Immunol.

235:109-116). De hecho, se han observado determinadas variantes de corte y empalme como un factor causal en enfermedades autoinmunitarias (Wan, B. y otros (2006) J. Immunol. 177(12):8844-8850). Además, se ha informado que ratones con deficiencia de Pdcd1 desarrollan afecciones autoinmunitarias (Nishimura, H. y otros (1998) Intern. Immunol. 10(10): 1563-1572; Nishimura, H. y otros (1999) Immunity 11:141-151; Nishimura, H. y otros (2001) Science 291:319-322), lo que ha conducido a solidificar a PD-1 como un regulador negativo de linfocitos activados y sirve para proteger contra el desarrollo de una enfermedad autoinmunitaria. Curiosamente, se han descubierto tumores que usan la señalización de PD-1 para evadir la vigilancia del sistema inmunológico. Por lo tanto, actualmente PD-1 y al menos uno de sus ligandos (es decir, PD-L1) se exploran como objetivos para la terapia del cáncer mediante la promoción de la actividad antitumoral en microambientes tumorales por medio del bloqueo de PD-1 (ver por ejemplo, Pedoeem, A. y otros (2014) Clin. Immunol. 153:145-152; y Philips, G.K. y Atkins, M. (2014) Intern. Immunol. 8 páginas).

Se necesita una comprensión más rigurosa y detallada de las funciones mediadas por PD-1 y de la ruta de PD-1 para desarrollar terapias prácticas dirigidas para el tratamiento futuro del cáncer.

Secuencias de P d cd l y PD-1

Las secuencias ilustrativas de Pdcd1 y PD-1 murinas, humanas y humanizadas se exponen en la Figura 8. Además, una secuencia de ácido nucleico humana ilustrativa para la humanización de un gen de Pdcd1 no humano se expone en la Figura 8.

Animales no humanos con P d cd l humanizado

Se proporcionan animales no humanos que expresan proteínas PD-1 humanizadas en la superficie de células de los animales no humanos como resultado de una modificación genética de un locus endógeno (por ejemplo, un locus de Pdcd1) del animal no humano que codifica una proteína PD-1. Los ejemplos adecuados descritos en la presente descripción incluyen roedores, particularmente, ratones.

Un gen de Pdcd1 humanizado, en algunos aspectos, comprende material genético de una especie heteróloga (por ejemplo, seres humanos), en donde el gen de Pdcd1 humanizado codifica una proteína PD-1 que comprende la porción codificada del material genético de la especie heteróloga. En algunos aspectos, un gen de Pdcd1 humanizado descrito en la presente descripción comprende ADN genómico de una especie heteróloga que codifica la porción extracelular de una proteína PD-1 que se expresa en la membrana plasmática de una célula. Se proporcionan, además, animales no humanos, embriones, células y constructos de transformación para producir animales no humanos, embriones no humanos, y células que contienen dicho gen de Pdcd1 humanizado.

En algunos aspectos, se elimina un gen de Pdcd1 endógeno. En algunos aspectos, se altera un gen de Pdcd1 endógeno, en donde una porción del gen de Pdcd1 endógeno se reemplaza con una secuencia heteróloga (por ejemplo, una secuencia de PDCD1 humana, en su totalidad o en parte). En algunos aspectos, la totalidad o sustancialmente la totalidad de un gen de Pdcd1 endógeno se reemplaza con un gen heterólogo (por ejemplo, un gen PDCD1 humano). En algunos aspectos, una porción de un gen de Pdcd1 heterólogo se inserta en un gen de Pdcd1 no humano endógeno en un locus de Pdcd1 endógeno. En algunos aspectos, el gen heterólogo es un gen humano. En algunos aspectos, la modificación o humanización se realiza a una de las dos copias del gen de Pdcd1 endógeno, lo que da lugar a un animal no humano que es heterocigoto con respecto al gen de Pdcd1 humanizado. En otros aspectos, se proporciona un animal no humano que es homocigoto para un gen de Pdcd1 humanizado.

En diversos aspectos, un animal no humano contiene un gen PDCD1 humano, en su totalidad o en parte, en un locus de Pdcd1 no humano endógeno. Así, tales animales no humanos pueden describirse como que tienen un gen de Pdcd1 heterólogo. El gen de Pdcd1 reemplazado, insertado, modificado o alterado en el locus de Pdcd1 endógeno o una proteína expresada a partir de dicho gen puede detectarse con el uso de una variedad de métodos que incluyen, por ejemplo, p Cr , transferencia de Western, transferencia de Southern, polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), o un ensayo de ganancia o pérdida de alelos. En algunos aspectos, el animal no humano es heterocigoto con respecto al gen de Pdcd1 humanizado.

En diversas aspectos, un gen de Pdcd1 humanizado incluye un gen de Pdcd1 que tiene un segundo exón con una secuencia al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a un segundo exón que aparece en un gen PDCD1 humano de la Figura 8.

En diversos aspectos, un gen de Pdcd1 humanizado incluye un gen de Pdcd1 que tiene un segundo exón con una secuencia que es sustancialmente idéntica a un segundo exón que aparece en un gen PDCD1 humano de la Figura 8.

En diversos aspectos, un gen de Pdcd1 humanizado incluye un gen de Pdcd1 que tiene un segundo exón con una secuencia que es idéntica a un segundo exón que aparece en un gen PDCD1 humano de la Figura 8.

En diversas aspectos, un gen de Pdcd1 humanizado incluye un gen de Pdcd1 que tiene un tercer exón con una secuencia al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a un tercer exón que aparece en una secuencia de ARNm de Pdcd1 humanizado de la Figura 8.

En diversos aspectos, un gen de Pdcd1 humanizado incluye un gen de Pdcd1 que tiene un tercer exón con una secuencia que es sustancialmente idéntica a un tercer exón que aparece en una secuencia de ARNm de Pdcd1 humanizado de la Figura 8.

En diversos aspectos, un gen de Pdcdl humanizado incluye un gen de Pdcdl que tiene un tercer exón con una secuencia que es idéntica a un tercer exón que aparece en una secuencia de ARNm de Pdcd1 humanizado de la Figura 8.

En diversos aspectos, un gen de Pdcd1 humanizado incluye un gen de Pdcd1 que comprende una secuencia al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a la SEQ ID NO:21 o la SEQ ID NO:23.

En diversos aspectos, un gen de Pdcd1 humanizado incluye un gen de Pdcd1 que comprende una secuencia que es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO:21 o la SEQ ID No :23.

En diversos aspectos, un gen de Pdcd1 humanizado incluye un gen de Pdcd1 que comprende una secuencia que es idéntica a la SEQ ID NO:21 o la SEQ ID NO:23.

En diversos aspectos, un gen de Pdcd1 humanizado incluye un gen de Pdcd1 que tiene un segundo exón y una porción de un tercer exón que tienen cada uno una secuencia al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a un segundo exón y una porción de un tercer exón que aparecen en un gen PDCD1 humano de la Figura 8.

En diversas modalidades, un gen de Pdcd1 humanizado de conformidad con la presente invención incluye un gen de Pdcd1 que tiene un primer, cuarto y quinto exón que tienen cada uno una secuencia al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a un primer, cuarto y quinto exones que aparecen en un gen de Pdcdl de ratón de la Figura 8.

En diversos aspectos, un gen de Pdcd1 humanizado incluye un gen de Pdcd1 que tiene un primer, una porción de un tercer, un cuarto y un quinto exones que tienen cada uno una secuencia al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a un primer, una porción de un tercer, un cuarto y un quinto exones que aparecen en un gen de Pdcd1 de ratón de la Figura 8.

En diversos aspectos, un gen de Pdcd1 humanizado incluye un gen de Pdcd1 que tiene una región 5' no traducida y una región 3' no traducida cada una de las cuales tiene una secuencia al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a una región 5' no traducida y una región 3' no traducida que aparecen en un gen de Pdcd1 de ratón de la Figura 8.

En diversos aspectos, un gen de Pdcd1 humanizado incluye un gen de Pdcd1 que tiene una secuencia de nucleótidos codificante (por ejemplo, una secuencia de ADNc) al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a una secuencia de nucleótidos codificante que aparece en una secuencia de nucleótidos codificante de Pdcd1 humanizado de la Figura 8.

En diversos aspectos, una secuencia de ARNm de Pdcd1 humanizado comprende una secuencia que es al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a una secuencia de ARNm humanizada que aparece en la Figura 8.

En diversos aspectos, un gen de Pdcd1 humanizado codifica un polipéptido PD-1 que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a una secuencia de aminoácidos que aparece en una secuencia de polipéptido PD-1 de la Figura 8.

En diversos aspectos, una proteína PD-1 humanizada producida por un animal no humano descrita en la presente descripción tiene una porción extracelular con una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a una porción extracelular de una proteína PD-1 humano que aparece en la Figura 8.

En diversos aspectos, una proteína PD-1 humanizada producida por un animal no humano descrita en la presente descripción tiene una porción extracelular, dicha porción extracelular comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a los residuos de aminoácidos 21-170 que aparecen en una proteína PD-1 humano o humanizada de la Figura 8.

En diversos aspectos, una proteína PD-1 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente descripción tiene una porción extracelular, dicha porción extracelular comprende una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a los residuos de aminoácidos 21-170 que aparecen en una proteína PD-1 humano o humanizada de la Figura 8.

En diversos aspectos, una proteína PD-1 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente descripción tiene una porción extracelular, dicha porción extracelular comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a los residuos de aminoácidos 21-170 que aparecen en una proteína PD-1 humano o humanizada de la Figura 8.

En diversos aspectos, una proteína PD-1 humanizada producida por un animal no humano descrita en la presente descripción tiene una porción extracelular, dicha porción extracelular comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a los residuos de aminoácidos 26-169 que aparecen en una proteína PD-1 humano o humanizada de la Figura 8.

En diversos aspectos, una proteína PD-1 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente descripción tiene una porción extracelular, dicha porción extracelular comprende una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a los residuos de aminoácidos 26-169 que aparecen en una proteína PD-1 humano o humanizada de la Figura 8.

En diversos aspectos, una proteína PD-1 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente descripción tiene una porción extracelular, dicha porción extracelular comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a los residuos de aminoácidos 26-169 que aparecen en una proteína PD-1 humano o humanizada de la Figura 8.

En diversos aspectos, una proteína PD-1 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente descripción tiene una porción extracelular, dicha porción extracelular comprende una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a los residuos de aminoácidos 27-169 que aparecen en una proteína PD-1 humano o humanizada de la Figura 8.

En diversos aspectos, una proteína PD-1 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente descripción tiene una porción extracelular, dicha porción extracelular comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a los residuos de aminoácidos 27-169 que aparecen en una proteína PD-1 humano o humanizada de la Figura 8.

En diversos aspectos, una proteína PD-1 humanizada producida por un animal no humano descrita en la presente descripción tiene una porción extracelular, dicha porción extracelular comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a los residuos de aminoácidos 27-145 que aparecen en una proteína PD-1 humano o humanizada de la Figura 8.

En diversos aspectos, una proteína PD-1 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente descripción tiene una porción extracelular, dicha porción extracelular comprende una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a los residuos de aminoácidos 27-145 que aparecen en una proteína PD-1 humano o humanizada de la Figura 8.

En diversos aspectos, una proteína PD-1 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente descripción tiene una porción extracelular, dicha porción extracelular comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a los residuos de aminoácidos 27-145 que aparecen en una proteína PD-1 humano o humanizada de la Figura 8.

En diversos aspectos, una proteína PD-1 humanizada producida por un animal no humano descrita en la presente descripción tiene una porción extracelular, dicha porción extracelular comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a los residuos de aminoácidos 35-145 que aparecen en una proteína PD-1 humano o humanizada de la Figura 8.

En diversos aspectos, una proteína PD-1 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente descripción tiene una porción extracelular, dicha porción extracelular comprende una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a los residuos de aminoácidos 35-145 que aparecen en una proteína PD-1 humano o humanizada de la Figura 8.

En diversos aspectos, una proteína PD-1 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente descripción tiene una porción extracelular, dicha porción extracelular comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a los residuos de aminoácidos 35-145 que aparecen en una proteína PD-1 humano o humanizada de la Figura 8.

En diversas aspectos, una proteína PD-1 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente descripción tiene un dominio V inmunoglobulínico N-terminal que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a un dominio V inmunoglobulínico N-terminal de una proteína PD-1 humano o humanizada que aparece en la Figura 8.

En diversas aspectos, una proteína PD-1 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente descripción tiene un dominio V inmunoglobulínico N-terminal que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a un dominio V inmunoglobulínico N-terminal que aparece en una proteína PD-1 humano o humanizada de la Figura 8.

En diversos aspectos, una proteína PD-1 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente descripción tiene un dominio V inmunoglobulínico N-terminal que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a un dominio V inmunoglobulínico N-terminal que aparece en una proteína PD-1 humano o humanizada de la Figura 8.

En diversos aspectos, una proteína PD-1 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente descripción tiene un dominio transmembrana que tiene una secuencia que es al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a un dominio transmembrana de una proteína PD-1 de ratón que aparece en la Figura 8.

En diversos aspectos, una proteína PD-1 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente descripción tiene una cola intracelular que tiene una secuencia que es al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a una cola intracelular de una proteína PD-1 de ratón que aparece en la Figura 8.

En diversos aspectos, una proteína PD-1 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente descripción tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a los residuos de aminoácidos 27-169 (o 26-169) que aparecen en una proteína PD-1 humano de la Figura 8.

En diversos aspectos, una proteína PD-1 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente descripción tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a los residuos de aminoácidos 27 169 (o 26-169) que aparecen en una proteína PD-1 humano de la Figura 8.

En diversos aspectos, una proteína PD-1 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente descripción tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a los residuos de aminoácidos 27-169 (o 26-169) que aparecen en una proteína PD-1 humano de la Figura 8.

En diversos aspectos, una proteína PD-1 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente descripción tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 50 % (por ejemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) idéntica a una secuencia de aminoácidos de una proteína PD-1 humanizada que aparece en la Figura 8.

En diversos aspectos, una proteína PD-1 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente descripción tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a una secuencia de aminoácidos de una proteína PD-1 humanizada que aparece en la Figura 8.

En diversos aspectos, una proteína PD-1 humanizada producida por un animal no humano descrito en la presente descripción tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a una secuencia de aminoácidos de una proteína PD-1 humanizada que aparece en la Figura 8.

Se proporcionan composiciones y métodos para producir animales no humanos que expresan una proteína PD-1 humanizada, que incluye formas polimórficas específicas, variantes alélicas (por ejemplo, diferencias en un solo aminoácido) o isoformas de corte y empalme alternativo, que incluyen composiciones y métodos para producir animales no humanos que expresan tales proteínas a partir de un promotor humano y una secuencia reguladora humana. En algunos aspectos, se proporcionan, además, composiciones y métodos para producir animales no humanos que expresan tales proteínas a partir de un promotor endógeno y una secuencia reguladora endógena. En algunos aspectos determinados, los promotores endógenos y las secuencias reguladoras endógenas son promotores endógenos de roedor y secuencias reguladoras endógenas de roedor. Los métodos incluyen insertar el material genético que codifica una proteína PD-1 humano en su totalidad o en parte en un sitio preciso en el genoma de un animal no humano que corresponde a un gen de Pdcdl endógeno para de esta manera crear un gen de Pdcdl humanizado que expresa una proteína PD-1 que es humana en su totalidad o en parte. En algunos aspectos, los métodos incluyen insertar ADN genómico correspondiente al exón 2 y al exón 3, en su totalidad o en parte, de un gen PDCD1 humano en un gen de Pdcd1 endógeno del animal no humano para de esta manera crear un gen humanizado que codifica una proteína PD-1 que contiene una porción humana que contiene aminoácidos codificados por los exones insertados.

Cuando sea adecuado, la región codificante del material genético o secuencia(s) de polinucleótido(s) que codifica(n) una proteína PD-1 humano (o humanizada) en su totalidad o en parte pueden modificarse de manera que incluyan codones optimizados para la expresión en células en el animal no humano (por ejemplo, ver las patentes de los Estados Unidos núms. 5,670,356 y 5,874,304). Las secuencias con optimización de codones son secuencias sintéticas, y, preferentemente, codifican el polipéptido idéntico (o un fragmento biológicamente activo de un polipéptido de longitud completa que tiene sustancialmente la misma actividad que el polipéptido de longitud completa) codificado por el polinucleótido original sin optimización de codones. En algunos aspectos, la región codificante del material genético que codifica una proteína PD-1 humano (o humanizada), en su totalidad o en parte, puede incluir una secuencia alterada para optimizar el uso de codones en un tipo de célula particular (por ejemplo, una célula de roedor). Por ejemplo, los codones del ADN genómico correspondiente al exón 2 y una porción del exón 3 (por ejemplo, 71 pb) de un gen PDCD1 humano a insertar en un gen de Pdcd1 endógeno de un animal no humano (por ejemplo, un roedor) pueden optimizarse para su expresión en una célula del animal no humano. Una secuencia de este tipo puede describirse como una secuencia con optimización de codones.

Un enfoque del gen de Pdcd1 humanizado emplea una modificación relativamente mínima del gen endógeno y da como resultado la transducción natural de las señales mediadas por PD-1 en el animal no humano, en diversos aspectos, debido a que la secuencia genómica de las secuencias de Pdcd1 se encuentran modificadas en un solo fragmento y por lo tanto conservan su funcionalidad normal mediante la inclusión de las secuencias reguladoras necesarias. Así, en tales aspectos, la modificación del gen de Pdcd1 no afecta otros genes circundantes u otros genes endógenos que interactúan con Pdcd1 (por ejemplo, PD-L1, PD-L2, etcétera). Además, en diversos aspectos, la modificación no afecta el ensamblaje de una proteína transmembrana PD-1 funcional en la membrana celular y mantiene sus funciones efectoras normales por medio de la unión y posterior transducción de señales a través de la porción citoplasmática de la proteína que no se afecta por la modificación.

Una ilustración esquemática (que no está a escala) de la organización genómica de un gen de Pdcd1 murino endógeno y un gen PDCD1 humano se proporciona en la Figura 1. Un método ilustrativo para la humanización de un gen de Pdcd1 murino endógeno con el uso de un fragmento genómico que contiene el exón 2 y una porción del exón 3 de un gen PDCD1 humano se proporciona en la Figura 2. Como se ilustra, un fragmento de ADN genómico de 883 pb que contiene el exón 2 y una porción del exón 3 (por ejemplo, los primeros 71 pb) de un gen PDCD1 humano se inserta en el lugar de una secuencia de 900 pb de un locus del gen de Pdcd1 murino endógeno con un constructo de transformación. El fragmento de ADN humano de 883 pb puede clonarse directamente a partir de ADN humano o sintetizarse a partir de una secuencia fuente (por ejemplo, núm. de registro de Genbank NM_005018.2). Este ADN genómico incluye la porción del gen que codifica sustancialmente la totalidad de la porción extracelular (por ejemplo, los residuos de aminoácidos 27-169 o 26-169) de una proteína PD-1 humano responsable de la unión al ligando.

Un animal no humano (por ejemplo, un ratón) que tiene un gen de Pdcd1 humanizado en el locus de Pdcd1 endógeno puede producirse mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, puede producirse un vector de transformación que introduce un gen de Pdcd1 humano en su totalidad o en parte con un gen marcador de selección. La Figura 2 ilustra un vector de transformación que contiene un locus de Pdcd1 endógeno de un genoma de ratón que comprende una inserción de un fragmento de ADN humano de 883 pb que incluye el exón 2 y los primeros 71 pb del exón 3 de un gen PDCD1 humano. Como se ilustra, el constructo de transformación contiene un brazo de homología en 5' que contiene una secuencia corriente arriba del exón 2 de un gen de Pdcd1 murino endógeno (~61,7 Kb), seguido de un casete de selección con fármaco (por ejemplo, un gen de resistencia a neomicina flanqueado a ambos lados por secuencias loxP; ~5 Kb), un fragmento de ADN genómico que contiene el exón 2 y los primeros 71 pb del exón 3 de un gen de Pdcd1 humano (883 pb), y un brazo de homología en 3' que contiene la secuencia restante de un exón 3 murino endógeno (es decir, la porción que codifica una porción transmembrana de una proteína PD-1), el exón 4 y el exón 5 de un gen de Pdcd1 murino endógeno (~84 Kb). El constructo de transformación contiene un casete de selección con fármaco autoeliminable (por ejemplo, un gen de resistencia a neomicina flanqueado por secuencias loxP; ver las patentes de los Estados Unidos núms. 8,697,851, 8,518,392 and 8,354,389). Después de la electroporación en células madre embrionarias, se crea un gen de Pdcd1 endógeno modificado que intercambia 900 pb de un gen de Pdcd1 endógeno de tipo silvestre con 883 pb de un gen PDCD1 humano (es decir, el exón 2 y los primeros 71 pb del exón 3), contenido en el vector de transformación. Se crea un gen de Pdcd1 humanizado lo que da como resultado una célula o animal no humano que expresa una proteína PD-1 humanizada que contiene los aminoácidos codificados por el fragmento de ADN humano de 883 pb (es decir, el exón 2 y 71 pb del exón 3 de un gen PDCD1 humano). El casete de selección con fármaco se elimina de una manera dependiente del desarrollo, es decir, la progenie derivada de los ratones cuyas células de la línea germinal contienen el gen de Pdcd1 humanizado descrito anteriormente liberarán el marcador de selección de las células diferenciadas durante el desarrollo (ver la parte inferior de la Figura 2).

Aunque los aspectos que emplean un gen de Pdcdl humanizado en un ratón (es decir, un ratón con un gen de Pdcdl que codifica una proteína PD-1 que incluye una porción humana y una porción de ratón) se analizan exhaustivamente en la presente descripción, se proporcionan, además, otros animales no humanos que comprenden un gen de Pdcd1 humanizado. En algunos aspectos, tales animales no humanos comprenden un gen de Pdcd1 humanizado unido operativamente a un promotor de Pdcdl de roedor. En algunos aspectos, tales animales no humanos comprenden un gen de Pdcd1 humanizado unido operativamente a un promotor endógeno de Pdcd1; en algunos aspectos, un promotor endógeno de Pdcd1 de roedor. En algunos aspectos, tales animales no humanos expresan una proteína PD-1 humanizada a partir de un locus endógeno, en donde la proteína PD-1 humanizada comprende los residuos de aminoácidos 21-170 (o 26-169, o 27-169, 27-145 o 35-145) de una proteína PD-1 humano. Tales animales no humanos incluyen cualquiera de los que pueden modificarse genéticamente para expresar una proteína PD-1 como se describe en la presente descripción, que incluyen, por ejemplo, mamíferos, por ejemplo, ratón, rata, conejo, cerdo, bovino (por ejemplo, vaca, toro, búfalo), ciervo, oveja, cabra, pollo, gato, perro, hurón, primate (por ejemplo, tití, mono rhesus), etcétera. Por ejemplo, para los animales no humanos donde las células ES genéticamente modificables adecuadas no están fácilmente disponibles, pueden emplearse otros métodos para producir un animal no humano que comprende la modificación genética. Tales métodos incluyen, por ejemplo, la modificación de un genoma de células que no son ES (por ejemplo, un fibroblasto o una célula pluripotente inducida) y el empleo de transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) para transferir el genoma modificado genéticamente a una célula adecuada, por ejemplo, un ovocito enucleado, y la gestación de la célula modificada (por ejemplo, el ovocito modificado) en un animal no humano en condiciones adecuadas para formar un embrión.

Los métodos para modificar el genoma de un animal no humano (por ejemplo, un genoma de cerdo, vaca, roedor, pollo, etcétera) incluyen, por ejemplo, emplear una nucleasa de dedos de zinc (ZFN) o una nucleasa efectora tipo activador de la transcripción (TALEN) para modificar un genoma de manera que incluya un gen de Pdcd1 humanizado.

En algunos aspectos, un animal no humano descrito en la presente descripción es un mamífero. En algunos aspectos, un animal no humano descrito en la presente descripción, es un mamífero pequeño, por ejemplo, de la superfamilia Dipodoidea o Muroidea. En algunos aspectos, un animal modificado genéticamente descrito en la presente descripción es un roedor. En algunos aspectos, un roedor descrito en la presente descripción se selecciona de un ratón, una rata y un hámster. En algunos aspectos, un roedor descrito en la presente descripción se selecciona de la superfamilia Muroidea. En algunos aspectos, un animal modificado genéticamente descrito en la presente es de una familia seleccionada de Calomyscidae (por ejemplo, hámster similar a ratón), Cricetidae (por ejemplo, hámster, ratas y ratones del Nuevo Mundo, ratones campestres), Muridae (ratones y ratas verdaderos, jerbos, ratones espinosos, ratas crestadas), Nesomyidae (ratones trepadores, ratones de roca, ratas coliblancas, ratas y ratones de Madagascar), Platacanthomyidae (por ejemplo, lirones espinosos), y Spalacidae (por ejemplo, ratas topo, ratas de bambú, y zokor). En algunos aspectos determinados, un roedor modificado genéticamente descrito en la presente descripción se selecciona de un ratón o rata verdaderos (familia Muridae), un jerbo, un ratón espinoso, y una rata crestada. En algunos aspectos determinados, un ratón modificado genéticamente descrito en la presente es un miembro de la familia Muridae. En algunos aspectos, un animal no humano descrito en la presente descripción es un roedor. En algunos aspectos determinados, un roedor como se describe en la presente se selecciona de un ratón y una rata. En algunos aspectos, un animal no humano descrito en la presente descripción es un ratón.

En algunos aspectos, un animal no humano descrito en la presente descripción, es un roedor que es un ratón de una cepa C57BL seleccionada de C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, y C57BL/Ola. En algunos aspectos determinados, un ratón descrito en la presente es de una cepa 129 seleccionada del grupo que consiste en una cepa que es 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (por ejemplo, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (ver, por ejemplo, Festing y otros, 1999, Mammalian Genome 10:836; Auerbach, W. y otros, 2000, Biotechniques 29(5):1024-1028, 1030, 1032). En algunos aspectos determinados, un ratón modificado genéticamente como se describe en la presente es una mezcla de una cepa 129 mencionada anteriormente y una cepa C57BL/6 mencionada anteriormente. En algunos aspectos determinados, un ratón descrito en la presente descripción, es una mezcla de las cepas 129 mencionadas anteriormente, o una mezcla de las cepas BL/6 mencionadas anteriormente. En algunos aspectos determinados, una cepa 129 de la mezcla como se describe en la presente descripción es una cepa 129S6 (129/SvEvTac). En algunos aspectos, un ratón descrito en la presente descripción es una cepa BALB, por ejemplo, la cepa BALB/c. En algunos aspectos, un ratón descrito en la presente descripción es una mezcla de una cepa BALB y otra cepa mencionada anteriormente.

En algunos aspectos, un animal no humano descrito en la presente descripción es una rata. En algunos aspectos determinados, una rata descrita en la presente descripción, se selecciona de una rata Wistar, una cepa LEA, una cepa Sprague Dawley, una cepa Fischer, L344, L6, y Dark Agouti. En algunos aspectos determinados, una cepa de rata como se describe en la presente descripción, es una mezcla de dos o más cepas seleccionadas del grupo que consiste en Wistar, LEA, Sprague Dawley, Lischer, F344, F6, y Dark Agouti.

Métodos que emplean animales no humanos que tienen genes P d cd l humanizados

La investigación de la función de PD-1 ha empleado el uso de diversos animales no humanos mutantes y transgénicos para Pdcd1 (por ejemplo, ver Nishimura, H. y otros (1998) Intern. Immunol. 10(10):1563-1572; Nishimura, H. y otros (1999) Immunity 11:141-151; Nishimura, H. y otros (2001) Science 291:319-322; Iwai, Y. y otros (2004) Intern. Immunol. 17(2):133-144; Keir, M. E. y otros (2005) J. Immunol. 175:7372-7379; Keir, M. E. y otros (2007) J. Immunol.

179:5064-5070; Carter, L.L. y otros (2007) J. Neuroimmunol. 182:124-134; Chen, L. y otros (2007) Europ. Soc. Organ Transplant. 21:21-29; Okazaki, T. y otros (2011) J. Exp. Med. 208(2):395-407; la patente de los Estados Unidos núm.

7,414,171; y la patente europea núm. 1334 659 B1). Tales animales mutantes y transgénicos han sido útiles para determinar los aspectos moleculares de la expresión y la función de PD-1 y su regulación de diversos procesos celulares. Sin embargo, no lo han sido sin limitación. Por ejemplo, los ratones con deficiencia de PD-1 generados por incorporación de un ADNc de PD-1 humano en el exón 1 de un gen de Pdcd1 de ratón no expresaron proteína PD-1 humano aún después de la estimulación con PMA (Carter, L.L. y otros, más arriba). Además, las diferencias fenotípicas considerables entre animales mutantes para PD-1 en diferentes fondos genéticos ha complicado la investigación, especialmente cuando se intenta asignar diversas funciones y/o actividades reguladoras a PD-1. Sin embargo, se han creado otros animales transgénicos que sobreexpresan PD-1 (Chen, L. y otros, más arriba). Tales animales han mostrado diferentes patrones de expresión del transgén, que pueden atribuirse razonablemente al diseño de los constructos. Además, debido al uso del mismo material genético fuente (es decir, ratón), la sobreexpresión de PD-1 puede haber correspondido a la proteína PD-1 endógena en lugar de la proteína PD-1 transgénica debido a posibles efectos de la posición del transgén. Si bien se ha demostrado la utilidad de ratones transgénicos para PD-1 para elucidar algunas funciones biológicas mediadas por PD-1, estos han demostrado variabilidad en los resultados obtenidos, que se basa, al menos en parte, en los diferentes enfoques empleados para producirlos. Por lo tanto, los sistemas in vivo actuales que explotan la biología mediada por PD-1 son incompletos. Los aspectos moleculares de la función biológica y las rutas de señalización mediadas por PD-1 no se han explotado en ratones transgénicos en todo su potencial.

Los animales no humanos descritos en la presente proporcionan un sistema in vivo mejorado y una fuente de materiales biológicos (por ejemplo, células) que expresan PD-1 humano (o humanizado), los cuales son útiles para una variedad de ensayos. En diversos aspectos, los animales no humanos descritos en la presente descripción se usan para desarrollar agentes terapéuticos dirigidos a PD-1 y/o que modulan la señalización de PD-1 (por ejemplo, que interfieren en las interacciones con PD-L1 y/o PD-L2). En algunos aspectos, los animales no humanos descritos en la presente descripción se usan para identificar, tamizar y/o desarrollar agentes terapéuticos candidatos (por ejemplo, anticuerpos) que se unen a la proteína PD-1 humano. En algunos aspectos, los animales no humanos descritos en la presente descripción, se usan para seleccionar y desarrollar productos terapéuticos candidatos (por ejemplo, anticuerpos) que bloquean la interacción de PD-1 humano con PD-L1 y/o PD-L2 humano. En algunos aspectos, los animales no humanos descritos en la presente se usan para determinar el perfil de unión de antagonistas y/o agonistas de un PD-1 humanizado sobre la superficie de una célula de un animal no humano como se describe en la presente; en algunos aspectos, los animales no humanos descritos en la presente se usan para determinar el epítopo o epítopos de uno o más anticuerpos terapéuticos candidatos que se unen a PD-1 humano.

En diversos aspectos, los animales no humanos descritos en la presente se usan para determinar los perfiles de farmacocinética de los anticuerpos anti-PD-1. En diversos aspectos, uno o más animales no humanos descritos en la presente y uno o más animales no humanos de control o de referencia cada uno se exponen a uno o más anticuerpos terapéuticos candidatos anti-PD-1 a diversas dosis (por ejemplo, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 7,5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, o 50 mg/kg o más). Los anticuerpos terapéuticos candidatos pueden dosificarse por medio de cualquier ruta de administración deseada que incluye las rutas de administración parenterales y no parenterales. Las rutas parenterales incluyen, por ejemplo, intravenosa, intraarterial, intraportal, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intraespinal, intratecal, intracerebroventricular, intracraneal, intrapleural u otras rutas de inyección. Las rutas no parenterales incluyen, por ejemplo, oral, nasal, transdérmica, pulmonar, rectal, bucal, vaginal, ocular. La administración puede ser, además, por infusión continua, administración local, liberación sostenida a partir de implantes (geles, membranas o similares), y/o inyección intravenosa. La sangre se aísla de los animales no humanos (humanizados y control) en diversos puntos de tiempo (por ejemplo, 0 h, 6 h, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, o hasta 30 o más días). Diversos ensayos pueden realizarse para determinar los perfiles farmacocinéticos de los anticuerpos terapéuticos candidatos administrados mediante el uso de muestras obtenidas a partir de animales no humanos como se describen en la presente descripción, que incluyen, pero no se limitan a, IgG total, respuesta contra el anticuerpo terapéutico, aglutinación, etcétera.

En diversos aspectos, los animales no humanos descritos en la presente se usan para medir el efecto terapéutico del bloqueo o la modulación de la señalización de PD-1 y el efecto sobre la expresión génica como un resultado de los cambios celulares. En diversos aspectos, un animal no humano descrito en la presente descripción o células aisladas a partir de ellos se exponen a un agente terapéutico candidato que se une a una proteína PD-1 humanizada (o una porción humana de una proteína PD-1) en la superficie de una célula del animal no humano y, después de un período de tiempo posterior, se analizan para determinar los efectos sobre los procesos dependientes de PD-1, por ejemplo, adhesión, apoptosis, producción de citocinas, inflamación, proliferación, tolerancia a lo propio e infección viral (o respuestas).

Los animales no humanos descritos en la presente descripción expresan la proteína PD-1 humanizada, así pueden generarse células, líneas celulares, y cultivos celulares que sirven como fuente de proteína PD-1 humanizada para su uso en ensayos funcionales y de unión, por ejemplo, para evaluar la unión o función de un antagonista o agonista de PD-1, particularmente cuando el antagonista o agonista es específico para una secuencia o epítopo de la proteína PD-1 humano o, alternativamente, específico para una secuencia o epítopo de la proteína PD-1 humano que se asocia con PD-L1 y/o PD-L2. En diversos aspectos, los epítopos PD-1 que se unen por anticuerpos candidatos terapéuticos pueden determinarse mediante el uso de células aisladas de animales no humanos descritos en la presente. En diversos aspectos, una proteína PD-1 humanizada expresada por un animal no humano como se describe en la presente descripción puede comprender una variante de secuencia de aminoácidos. Se han informado variantes de proteínas PD-1 humanos (por ejemplo, polimorfismos) asociadas con enfermedades autoinmunitarias e infecciosas (por ejemplo, ver Lee, Y.H. y otros (2014) Z. Rheumatol. PMID: 24942602; Mansur, A. y otros (2014) J. Investig. Med.

62(3):638-643; Nasi, M. y otros (2013) Intern. J. Infect. Dis. 17:e845-e850; Piskin, I.E. y otros (2013) Neuropediatrics 44(4):187-190; Carter, L.L. y otros (2007) J. Neuroimmunol. 182(1-2):124-134; Wan, B. y otros (2006) J. Immunol.

177(12):8844-8850). Las variantes de PD-1 humano ilustrativas incluyen las que se enumeran en la página web SNP GeneView de NCBI y se resumen en la Tabla 3. En diversos aspectos, los animales no humanos descritos en la presente expresan una variante de proteína PD-1 humanizada. En diversos aspectos, la variante es polimórfica en una posición de aminoácido asociada con la unión al ligando. En diversos aspectos, los animales no humanos descritos en la presente se usan para determinar el efecto de la unión del ligando a través de la interacción con una variante polimórfica de PD-1 humano. En algunos aspectos determinados, los animales no humanos descritos en la presente expresan una variante de PD-1 humano que aparece en la Tabla 3.

TABLA 3

Posición en Posición en Núm. ID de Alelo Aminoácido Posición del Posición del cromosoma ARNm _Variantecodón aminoácido 241851110 883 rs372765600 A Gln[Q] 2 272

G Arg [R] 2 272 241851118 875 rs368411538 T Asp [D] 3 269

C Asp [D] 3 269 241851121 872 rs2227981 A Ala [A] 3 268

C Ala [A] 3 268 G Ala [A] 3 268 T Ala [A] 3 268 241851135 858 rs146642159 T Cys [C] 1 264

C Arg [R] 1 264 241851138 855 rs143359677 A Thr [T] 1 263

G Ala [A] 1 263 241851160 833 rs141228784 T Ser[S] 3 255

C Ser[S] 3 255 241851163 830 rs200434733 C Pro [P] 3 254

T Pro [P] 3 254 241851171 822 rs201961957 A Ile [I] 1 252 G Val [V] 1 252 241851188 805 rs201540918 T Met [M] 2 246 C Thr [T] 2 246 241851190 803 rs201481671 A Gln[Q] 3 245 G Gln[Q] 3 245 241851210 783 rsl37861407 A Met [M] 1 239 G Val [V] 1 239 241851220 773 rs370462869 A Pro [P] 3 235 G Pro [P] 3 235 241851237 756 rsl47213978 C Arg [R] 1 230 T Trp [W] 1 230 241851264 729 rs373940258 A Met [M] 1 221 G Val [V] 1 221 241851274 719 rs373831349 G Pro [P] 3 217 T Pro [P] 3 217 241851279 714 rs376257658 A Met [M] 1 216 G Val [V] 1 216 241851281 712 rs2227982 T Val [V] 2 215 C Ala [A] 2 215 241851954 690 rsl48456597 A Thr [T] 1 208 C Pro [P] 1 208 241851961 683 rsl46821282 G Thr [T] 3 205 T Thr [T] 3 205 C Thr [T] 3 205 241852204 654 rs144217487 A Thr [T] 1 196 G Ala [A] 1 196 241852205 653 rs141119263 T Ala [A] 3 195 C Ala [A] 3 195 241852209 649 rs200312345 A Gln[Q] 2 194 G Arg [R] 2 194 241852258 600 rs55667829 T Leu [L] 1 178 C Leu [L] 1 178 241852271 587 rs377191240 T Val [V] 3 173 C Val [V] 3 173 241852310 548 rs370660750 G Pro [P] 3 160 C Pro [P] 3 160 241852644 481 rs138031190 A Gln[Q] 2 138 T Leu [L] 2 138 241852658 467 rs374762232 A Gln[Q] 3 133 G Gln[Q] 3 133 241852661 464 rs41400345 A Ala [A] 3 132 G Ala [A] 3 132 241851190 803 rs201481671 A Gln[Q] 3 245 G Gln[Q] 3 245 241851210 783 rs137861407 A Met [M] 1 239 G Val [V] 1 239 241851220 773 rs370462869 A Pro [P] 3 235 G Pro [P] 3 235 241851237 756 rs147213978 C Arg [R] 1 230 T Trp [W] 1 230 241851264 729 rs373940258 A Met [M] 1 221 G Val [V] 1 221 241851274 719 rs373831349 G Pro [P] 3 217 T Pro [P] 3 217 241851279 714 rs376257658 A Met [M] 1 216 G Val [V] 1 216 241851281 712 rs2227982 T Val [V] 2 215 C Ala [A] 2 215 241851954 690 rs148456597 A Thr [T] 1 208 C Pro [P] 1 208 241851961 683 rs146821282 G Thr [T] 3 205 T Thr [T] 3 205 C Thr [T] 3 205 241852204 654 rs144217487 A Thr [T] 1 196 G Ala [A] 1 196 241852205 653 rs141119263 T Ala [A] 3 195 C Ala [A] 3 195 241852209 649 rs200312345 A Gln[Q] 2 194 G Arg [R] 2 194 241852258 600 rs55667829 T Leu [L] 1 178 C Leu [L] 1 178 241852271 587 rs377191240 T Val [V] 3 173 C Val [V] 3 173 241852310 548 rs370660750 G Pro [P] 3 160 C Pro [P] 3 160 241852644 481 rs138031190 A Gln[Q] 2 138 T Leu [L] 2 138 241852658 467 rs374762232 A Gln[Q] 3 133 G Gln[Q] 3 133 241852661 464 rs41400345 A Ala [A] 3 132 G Ala [A] 3 132 241852691 434 rs367833850 T Leu [L] 3 122 C Leu [L] 3 122 241852697 428 rs186074812 T Thr [T] 3 120 C Thr [T] 3 120 241852715 410 rs141299049 A Arg [R] 3 114 G Arg [R] 3 114 241852716 409 rs55679128 A Gln[Q] 2 114 G Arg [R] 2 114 241852720 405 rs200323895 A Thr [T] 1 113 G Ala [A] 1 113 241852729 396 rs190602950 A Met [M] 1 110 G Val [V] 1 110 241852730 395 rs370268595 T Ser[S] 3 109 C Ser[S] 3 109 241852743 382 rs368009835 G Gly[G] 2 105 A Asp [D] 2 105 241852746 379 rs138016578 A His [H] 2 104 G Arg [R] 2 104 241852750 375 rs56124337 A Arg [R] 1 103 G Gly[G] 1 103 241852751 374 rs55637807 T Asn[N] 3 102 C Asn[N] 3 102 241852755 370 rs371902970 T Leu [L] 2 101 C Pro [P] 2 101 241852788 337 rs144257658 T Val [V] 2 90 G Gly[G] 2 90 241852808 317 rs55804130 T Pro [P] 3 83 C Pro [P] 3 83 241852817 308 rs373755187 A Ala [A] 3 80 T Ala [A] 3 80 C Ala [A] 3 80 241852860 265 rs28615468 C Thr [T] 2 66 A Asn[N] 2 66 241852866 259 rs142434414 G Gly[G] 2 64 T Val [V] 2 64 241852877 248 rs181904226 A Ser[S] 3 60 G Ser[S] 3 60 241852892 233 rs55993679 T Ser[S] 3 55 C Ser[S] 3 55 241852904 221 rs373582646 G Thr [T] 3 51 C Thr [T] 3 51 241852910 215 rs141718335 T Asn[N] 3 49 C Asn[N] 3 49 241852922 203 rs374726495 T Thr [T] 3 45 C Thr [T] 3 45 241852928 197 rs147586902 C Val [V] 3 43 G Val [V] 3 43

241852930 195 rs368829632 A Met [M] 1 43

G Val [V] 1 43

241852951 174 rs373081859 G Ala [A] 1 36

A Thr [T] 1 36

241852952 173 rs41444844 G Pro [P] 3 35

C Pro [P] 3 35

241852974 151 rs56234260 T Leu [L] 2 28

C Pro [P] 2 28

241858780 127 rs368550965 A Gln[Q] 2 20

G Arg [R] 2 20

241858800 107 rs370111035 A Ala [A] 3 13

G Ala [A] 3 13

241858808 99 rs142544044 A He [I] 1 11

G Val [V] 1 11

Las células de los animales no humanos descritos en el presente documento pueden aislarse y usarse sobre una base ad hoc, o pueden mantenerse en cultivo por muchas generaciones. En diversos aspectos, las células de un animal no humano descritas en la presente descripción se inmortalizan (por ejemplo, por medio del uso de un virus) y se mantienen en cultivo indefinidamente (por ejemplo, en cultivos en serie).

En diversos aspectos, las células y/o animales no humanos descritos en la presente se usan en diversos regímenes de inmunización para determinar las funciones mediadas por PD-1 en la respuesta inmunitaria a un antígeno. En diversos aspectos, se caracterizan los productos terapéuticos candidatos que unen a, o bloquean una o más funciones de, PD-1 humano (o humanizado) en un animal no humano, descrito en la presente. Las mediciones adecuadas incluyen diversos ensayos celulares, ensayos de proliferación, análisis de inmunoglobulinas séricas (por ejemplo, titulación de anticuerpos), ensayos de citotoxicidad, caracterización de interacciones entre ligando y receptor (por ejemplo, ensayos de inmunoprecipitación). En diversos aspectos, los animales no humanos descritos en la presente se usan para caracterizar las funciones mediadas por PD-1 en la regulación de una respuesta inmunitaria a un antígeno. En diversos aspectos, el antígeno se asocia con una enfermedad, trastorno o afección autoinmunitarios. En diversos aspectos, el antígeno se asocia con una enfermedad, trastorno o afección inflamatorios. En diversos aspectos, el antígeno es un antígeno de prueba (por ejemplo, ovoalbúmina u OVA). En algunos aspectos, el antígeno es una diana asociada con una enfermedad o afección que padecen uno o más pacientes humanos que necesitan tratamiento.

En diversos aspectos, los animales no humanos descritos en la presente se usan en evaluaciones séricas para determinar los títulos de la producción de anticuerpos para evaluar los aspectos farmacotoxicológicos de los productos terapéuticos candidatos que se dirigen a PD-1 humano. En algunos aspectos, la producción de autoanticuerpos en los animales no humanos descritos en la presente es el resultado de una o más enfermedades, trastornos o afecciones autoinmunitarias inducidos en el animal no humano.

En diversos aspectos, los animales no humanos descritos en la presente descripción se usan para el desafío con uno o más antígenos para determinar el potencial terapéutico de compuestos o agentes biológicos para modular la regulación dependiente de PD-1 de una respuesta inmunológica, que incluye pero no se limita a, las respuestas dependientes de células T y dependientes de células B específicas a un antígeno determinado.

En diversos aspectos, las células y/o los animales no humanos descritos en la presente se usan en un ensayo de supervivencia y/o proliferación (por ejemplo, que emplean células T o B) para seleccionar y desarrollar productos terapéuticos candidatos que modulan la señalización de PD-1 humano. La activación o pérdida de PD-1 desempeña un papel importante en la regulación de las respuestas de células T, y la regulación de la tolerancia a lo propio por PD-1 puede ser el resultado de la activación de epítopos específicos del dominio extracelular de PD-1, por lo tanto, los moduladores de PD-1 candidatos (por ejemplo, antagonistas o agonistas) pueden identificarse, caracterizarse y desarrollarse con el uso de células de animales no humanos descritos en la presente descripción y/o un animal no humano como se describe en la presente descripción. En algunos aspectos, las células y/o los animales no humanos descritos en la presente se usan en ensayo(s) de supervivencia o muerte para determinar el efecto sobre la proliferación o la apoptosis de una(s) célula(s) específica(s) (por ejemplo, células cancerosas) en presencia y ausencia de PD-1.

En diversos aspectos, las células y/o los animales no humanos descritos en la presente se usan en el xenotrasplante de células o tejido heterólogos (por ejemplo, humanos) para determinar las funciones mediadas por PD-1 en la respuesta fisiológica (por ejemplo, inmunitaria) a las células o el tejido humanos trasplantados. En diversos aspectos, se caracterizan los productos terapéuticos candidatos que unen, o bloquean una o más funciones de, PD-1 humano en un animal no humano, descrito en la presente. Las mediciones adecuadas incluyen diversos ensayos celulares, ensayos de proliferación, análisis de inmunoglobulinas séricas (por ejemplo, titulación de anticuerpos), ensayos de citotoxicidad, y caracterización de las interacciones entre ligando y receptor (ensayos de inmunoprecipitación). En diversos aspectos, los animales no humanos descritos en la presente se usan para caracterizar las funciones mediadas por PD-1 en la regulación de una respuesta inmunitaria a un antígeno. En algunos aspectos, el antígeno se asocia con una neoplasia. En diversos aspectos, el antígeno se asocia con una enfermedad, trastorno o afección autoinmunitarios. En diversos aspectos, el antígeno se asocia con una enfermedad, trastorno o afección inflamatorios. En algunos aspectos, el antígeno es una diana asociada con una enfermedad o afección que padecen uno o más pacientes humanos que necesitan tratamiento.

En diversos aspectos, los animales no humanos descritos en la presente, se usan en experimentos de trasplante o transferencia adoptiva para determinar el potencial terapéutico de compuestos o agentes biológicos para modular la regulación dependiente de PD-1 de linfocitos nuevos y su función inmunológica. En diversos aspectos, los animales no humanos descritos en la presente se trasplantan con células T humanas; en algunos aspectos, células T vírgenes; en algunos aspectos, células T activadas.

En diversos aspectos, las células de los animales no humanos descritos en la presente se usan en ensayos de células T para determinar el potencial terapéutico de compuestos o agentes biológicos para modular la regulación dependiente de PD-1 de la respuesta y función dependientes de células T. Los ensayos de células T ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, ELISpot, tinción de citocinas intracelulares, restricción del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), ensayos de supresión viral, ensayos de citotoxicidad, ensayos de proliferación y ensayos de supresión de células T reguladoras.

En diversos aspectos, las células de los animales no humanos descritos en la presente se usan en un ensayo de transmigración de células para seleccionar y desarrollar productos terapéuticos candidatos que modulen PD-1 humano. La transmigración de células involucra la migración de células a través del endotelio y los ensayos de transmigración permiten la medición de interacciones con el endotelio, y la transmigración de éste, por leucocitos o células tumorales.

En diversos aspectos, las células de los animales no humanos descritos en la presente se usan en ensayos de crecimiento (o proliferación) de células tumorales para determinar el potencial terapéutico de compuestos o agentes biológicos para modular la regulación y/o la apoptosis de células tumorales, dependiente de PD-1.

En y/o, las células de los animales no humanos descritos en la presente se usan en ensayos de producción de citocinas para determinar el potencial terapéutico de compuestos o agentes biológicos para modular la regulación dependiente de PD-1 de la liberación de citocinas a partir de células T. En algunos aspectos, las células de los animales no humanos descritos en la presente descripción se usan para la detección (y/o medición) de la liberación de citocinas intracelulares como resultado de la interacción de la proteína PD-1 humanizada con un fármaco dirigido a la proteína PD-1 humano o un ligando de PD-1 (por ejemplo, PD-L1 o PD-L2).

En diversos aspectos, una enfermedad, trastorno o afección autoinmunitarias se inducen en uno o más animales no humanos descritos en la presente para proporcionar un sistema in vivo para determinar el potencial terapéutico de compuestos o agentes biológicos para modular la regulación dependiente de PD-1 de una o más funciones de la enfermedad, trastorno o afección autoinmunitarias. Las enfermedades, trastornos o afecciones autoinmunitarios ilustrativos que pueden inducirse en uno o más animales no humanos descritos en la presente descripción incluyen diabetes, encefalomielitis autoinmunitaria experimental (por ejemplo, un modelo para la esclerosis múltiple), artritis reumatoide, y lupus eritematoso sistémico.

Los animales no humanos descritos en la presente descripción proporcionan un sistema in vivo para el análisis y prueba de un fármaco o vacuna. En diversos aspectos, un fármaco o vacuna candidato puede suministrarse a uno o más animales no humanos descritos en la presente, seguido del control de los animales no humanos para determinar una o más respuestas inmunitarias frente al fármaco o vacuna, el perfil de seguridad del fármaco o vacuna, o el efecto sobre una enfermedad o afección. En algunos aspectos, la vacuna tiene como objetivo un virus tal como, por ejemplo, el virus de la inmunodeficiencia humana o el virus de la hepatitis (por ejemplo, h Cv ). Los métodos ilustrativos usados para determinar el perfil de seguridad incluyen mediciones de toxicidad, concentración de dosis óptima, eficacia del fármaco o vacuna, y posibles factores de riesgo. Tales fármacos o vacunas pueden mejorarse y/o desarrollarse en tales animales no humanos.

Los animales no humanos descritos en la presente proporcionan un sistema in vivo para evaluar las propiedades farmacocinéticas de un fármaco dirigido a PD-1 humano. En diversos aspectos, un fármaco dirigido a PD-1 humano puede suministrarse o administrarse a uno o más animales no humanos descritos en la presente, seguido del control de los animales no humanos (o células aisladas a partir de estos), o la realización de uno o más ensayos en éstos, para determinar el efecto del fármaco sobre el animal no humano. Las propiedades farmacocinéticas incluyen, pero no se limitan a, la manera en que un animal procesa el fármaco hacia diversos metabolitos (o detección de la presencia o ausencia de uno o más metabolitos del fármaco, que incluyen, metabolitos tóxicos), tiempo de vida media del fármaco, niveles circulantes del fármaco después de su administración (por ejemplo, concentración sérica del fármaco), respuesta contra el fármaco (por ejemplo, anticuerpos contra el fármaco), absorción y distribución del fármaco, vía de administración, vías de excreción y/o eliminación del fármaco. En algunos aspectos, las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de los fármacos (por ejemplo, moduladores de PD-1) se controlan en o a través del uso de los animales no humanos descritos en la presente.

Los animales no humanos de la presente invención proporcionan un sistema in vivo para evaluar la toxicidad por acción sobre la diana de un fármaco dirigido a PD-1 humano. En diversos aspectos, un fármaco dirigido a p D-1 humano puede suministrarse o administrarse a uno o más animales no humanos descritos en la presente, seguido del control de los animales no humanos (o células aisladas a partir de estos), o la realización de uno o más ensayos en éstos, para determinar el efecto tóxico sobre la diana del fármaco sobre el animal no humano. Típicamente, los fármacos se destinan a modular una o más funciones de sus objetivos. Para proporcionar un ejemplo, un modulador de PD-1 se destina a modular funciones mediadas por PD-1 (por ejemplo, transducción de señales de PD-1) a través de su interacción de alguna manera con la molécula PD-1 en la superficie de una o más células. En algunos aspectos, un modulador de este tipo puede tener un efecto adverso que es una exageración de la(s) acción(es) farmacológica(s) deseada(s) del modulador. Tales efectos se denominan efectos por acción sobre la diana. Los efectos por unión a la diana ilustrativos incluyen una dosis demasiado elevada, activación/inactivación crónica, y acción correcta en un tejido incorrecto. En algunos aspectos, los efectos por unión a la diana de un fármaco dirigido a PD-1 identificados en los animales no humanos descritos en la presente descripción, o a través del uso de estos, se usan para determinar una(s) función(es) de PD-1 previamente desconocida(s).

Los animales no humanos de la presente invención proporcionan un sistema in vivo para evaluar la toxicidad por acción fuera de la diana de un fármaco dirigido a PD-1 humano. En diversos aspectos, un fármaco dirigido a p D-1 humano puede suministrarse o administrarse a uno o más animales no humanos descritos en la presente, seguido del control de los animales no humanos (o células aisladas a partir de estos), o la realización de uno o más ensayos en éstos, para determinar el efecto tóxico fuera de la diana del fármaco sobre el animal no humano. Los efectos por acción fuera de la diana pueden producirse cuando un fármaco interactúa con una diana no prevista (por ejemplo, reactividad cruzada a un epítopo común). Tales interacciones pueden producirse en un tejido previsto o no previsto. Para proporcionar un ejemplo, los isómeros especulares (enantiómeros) de un fármaco pueden conducir a efectos tóxicos por acción fuera de la diana. Además, un fármaco puede interactuar de manera inadecuada con diferentes subtipos de receptores y activarlos de manera no intencional. Los efectos por acción fuera de la diana ilustrativos incluyen la activación/inhibición incorrecta de una diana incorrecta independientemente del tejido en el que se encuentra la diana incorrecta. En algunos aspectos, los efectos por acción fuera de la diana de un fármaco dirigido a PD-1 humano se determinan mediante la comparación de los efectos de la administración del fármaco a los animales no humanos de la presente invención con uno o más animales no humanos de referencia.

En algunos aspectos, la realización de un ensayo incluye determinar el efecto sobre el fenotipo y/o el genotipo del animal no humano al que se administra el fármaco. En algunos aspectos, la realización de un ensayo incluye determinar la variabilidad lote a lote de un modulador de PD-1 (por ejemplo, un antagonista o un agonista). En algunos aspectos, la realización de un ensayo incluye determinar las diferencias entre los efectos de un fármaco dirigido a PD-1 administrado a un animal no humano descrito en la presente y a un animal no humano de referencia. En diversos aspectos, los animales no humanos de referencia pueden tener una modificación como se describe en la presente descripción, una modificación que es diferente a como se describe en la presente descripción (por ejemplo, una que tiene una interrupción, deleción o un gen de Pdcd1 no funcional de cualquier otra manera) o puede no tener modificaciones (es decir, un animal no humano de tipo silvestre).

Los parámetros ilustrativos que pueden medirse en animales no humanos (o en células aisladas a partir de ellos y/o con el uso de éstas) para evaluar las propiedades farmacocinéticas, la toxicidad por unión a la diana, y/o la toxicidad sin asociación a la diana de un fármaco dirigido a la proteína PD-1 humano incluyen, pero no se limitan a, aglutinación, autofagia, división celular, muerte celular, hemólisis mediada por complemento, integridad del ADN, título de anticuerpos específicos para el fármaco, metabolismo del fármaco, arreglos de expresión génica, actividad metabólica, actividad mitocondrial, estrés oxidativo, fagocitosis, biosíntesis de proteínas, degradación de proteínas, secreción de proteínas, respuesta al estrés, concentración del fármaco en el tejido diana, concentración del fármaco en tejido que no es diana, actividad transcripcional y similares. En algunos aspectos, los animales no humanos como se describen en la presente se usan para determinar una dosis con eficacia farmacéutica de un modulador de PD-1.

Los animales no humanos descritos en la presente proporcionan un sistema in vivo mejorado para el desarrollo y caracterización de productos terapéuticos candidatos para usar en cáncer. En diversos aspectos, los animales no humanos descritos en la presente pueden implantarse con un tumor, seguido de la administración de uno o más productos terapéuticos candidatos. En algunos aspectos, los productos terapéuticos candidatos pueden incluir un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico) o un cóctel de anticuerpos; en algunos aspectos, los productos terapéuticos candidatos incluyen una terapia de combinación tal como, por ejemplo, la administración de anticuerpos monoespecíficos dosificados de manera secuencial o simultánea. El tumor puede dejarse durante el tiempo suficiente para su establecimiento en uno o más sitios dentro del animal no humano. La proliferación, crecimiento, supervivencia, etcétera de las células tumorales puede medirse antes y después de la administración con el producto(s) terapéutico(s) candidato(s). La citotoxicidad de los productos terapéuticos candidatos puede medirse, además, en el animal no humano según sea conveniente.

Los animales no humanos descritos en la presente descripción pueden usarse para desarrollar uno o más modelos de enfermedad para evaluar o valorar productos terapéuticos candidatos y/o regímenes terapéuticos (por ejemplo, monoterapia, terapia de combinación, prueba de intervalo de dosis, etcétera) para tratar eficazmente enfermedades, trastornos o afecciones que afectan a los humanos. Diversas afecciones de enfermedad pueden establecerse en los animales no humanos descritos en la presente seguido de la administración de una o más moléculas candidatas (por ejemplo, fármacos dirigidos a PD-1) de manera que pueda determinarse la eficacia de una o más moléculas candidatas en una afección de enfermedad. En algunos aspectos, los modelos de enfermedad incluyen enfermedades, trastornos o afecciones autoinmunitarios, inflamatorios y/o neoplásicos.

Para proporcionar un ejemplo, los animales no humanos descritos en la presente proporcionan un modelo animal mejorado para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de un tumor o células tumorales. En diversos aspectos, los animales no humanos descritos en la presente pueden implantarse con una o más células tumorales, seguido de la administración de uno o más productos terapéuticos candidatos (por ejemplo, anticuerpos). En algunos aspectos, la administración de uno o más productos terapéuticos candidatos se realiza posterior a la implantación de una o más células tumorales (por ejemplo, minutos u horas pero típicamente en el mismo día) y uno o más productos terapéuticos candidatos se evalúan en los animales no humanos descritos en la presente para determinar su eficacia en la prevención del establecimiento de un tumor sólido y/o el crecimiento de células tumorales en dichos animales no humanos. En algunos aspectos, la administración de uno o más productos terapéuticos candidatos se realiza posterior a la implantación de una o más células tumorales (por ejemplo, días después) y, en algunos aspectos determinados, después de un tiempo suficiente de manera que una o más células tumorales implantadas alcancen un tamaño predeterminado (por ejemplo, volumen) en los animales no humanos descritos en la presente; y uno o más productos terapéuticos candidatos se evalúan para determinar su eficacia en el tratamiento de uno o más tumores establecidos. Los animales no humanos pueden colocarse en diferentes grupos de tratamiento de conformidad con la dosis de manera que pueda determinarse una dosis o intervalo de dosis óptima que se correlacione con el tratamiento eficaz de un tumor establecido.

Las moléculas candidatas pueden administrarse a modelos de enfermedad en animales no humanos con el uso de cualquier método de administración que incluye rutas de administración parenterales y no parenterales. Las rutas parenterales incluyen, por ejemplo, intravenosa, intraarterial, intraportal, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intraespinal, intratecal, intracerebroventricular, intracraneal, intrapleural u otras rutas de inyección. Las rutas no parenterales incluyen, por ejemplo, oral, nasal, transdérmica, pulmonar, rectal, bucal, vaginal, ocular. La administración puede ser, además, por infusión continua, administración local, liberación sostenida a partir de implantes (geles, membranas o similares), y/o inyección intravenosa. Cuando se evalúa una terapia de combinación en los animales no humanos descritos en la presente, las moléculas candidatas pueden administrarse por medio de la misma ruta de administración o por medio de rutas de administración diferentes. Cuando se evalúa un régimen de dosificación en los animales no humanos descritos en la presente descripción, las moléculas candidatas pueden administrarse bimensualmente, mensualmente, trisemanalmente, bisemanalmente, semanalmente, diariamente, a intervalos variables y/o en concentraciones escalonadas para determinar un régimen de dosificación que demuestre un efecto terapéutico o profiláctico deseado en un animal no humano en el que se han establecido uno o más modelos de enfermedad.

Los animales no humanos descritos en la presente proporcionan un sistema in vivo mejorado para el desarrollo y la caracterización de productos terapéuticos candidatos para usar en enfermedades infecciosas. En diversos aspectos, los animales no humanos descritos en la presente pueden infectarse mediante la inyección con un virus (por ejemplo, MHV, HIV, HCV, etcétera) o patógeno (por ejemplo, bacterias), seguido de la administración de uno o más productos terapéuticos candidatos. En algunos aspectos, los productos terapéuticos candidatos pueden incluir un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico) o un cóctel de anticuerpos; en algunos aspectos, los productos terapéuticos candidatos incluyen una terapia de combinación tal como, por ejemplo, la administración de anticuerpos monoespecíficos dosificados de manera secuencial o simultánea; en algunos aspectos, los productos terapéuticos candidatos pueden incluir una vacuna. El virus o patógeno puede dejarse durante el tiempo suficiente para su establecimiento en uno o más sitios o células dentro del animal no humano de manera que se desarrollen uno o más síntomas asociados con la infección del virus o patógeno en el animal no humano. La proliferación y el crecimiento de células T puede medirse antes y después de la administración con el(los) producto(s) terapéutico(s) candidato(s). Además, puede medirse la supervivencia, el análisis de citocinas séricas y/o intracelulares, la histopatología del hígado y/o el bazo en animales no humanos infectados con el virus o patógeno. En algunos aspectos, los animales no humanos descritos en la presente se usan para determinar la extensión del daño a los órganos asociados con la infección viral. En algunos aspectos, los animales no humanos descritos en la presente se usan para determinar el perfil de expresión de citocinas en diversos órganos de los animales no humanos infectados con un virus particular.

Los animales no humanos descritos en el presente documento pueden emplearse para evaluar la eficacia de un fármaco terapéutico dirigido a células humanas. En diversos aspectos, un animal no humano descrito en la presente se trasplanta con células humanas, y un candidato a fármaco dirigido a tales células humanas se administra a dicho animal no humano. Después se determina la eficacia terapéutica del fármaco mediante el control de las células humanas en el animal no humano después de la administración del fármaco. Los fármacos que pueden someterse a prueba en los animales no humanos incluyen compuestos moleculares pequeños, es decir, compuestos de pesos moleculares menores que 1500 kD, 1200 kD, 1000 kD, u 800 Dalton, y compuestos moleculares grandes (tales como proteínas, por ejemplo, anticuerpos), que tienen efectos terapéuticos previstos para el tratamiento de enfermedades y afecciones humanas al dirigirse a células humanas (por ejemplo, unión a ellas y/o acción sobre ellas).

En algunos aspectos, el fármaco es un fármaco contra el cáncer, y las células humanas son células cancerosas, que pueden ser células de un cáncer primario o células de líneas celulares establecidas a partir de un cáncer primario. En estos aspectos, un animal no humano descrito en el presente documento recibe un trasplante de células cancerosas humanas, y se le suministra un fármaco anticancerígeno al animal no humano. La eficacia del fármaco puede determinarse al evaluar si el crecimiento o la metástasis de las células cancerosas humanas en el animal no humano se inhibe como resultado de la administración del fármaco.

En aspectos específicos, el fármaco contra el cáncer es una molécula de anticuerpo, que se une a un antígeno en células cancerosas humanas. En aspectos particulares, el fármaco anticancerígeno es un anticuerpo biespecífico que se une a un antígeno en células cancerosas humanas, y a un antígeno en otras células humanas, por ejemplo, células del sistema inmunológico humano (o "células inmunológicas humanas") tales como células B y células T.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se proporcionan para los expertos en la técnica una descripción de cómo realizar y usar métodos y composiciones de la presente invención. A menos que se indique de cualquier otra manera, la temperatura se indica en Celsius, y la presión es la atmosférica o cercana a ella.

Ejemplo 1. Humanización de un gen de muerte celular programada 1 (Pdcdl) endógeno

Este ejemplo muestra métodos ilustrativos para la humanización de un gen de Pdcd1 endógeno que codifica la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1) en un mamífero no humano tal como un roedor (por ejemplo, un ratón). Los métodos descritos en este ejemplo pueden emplearse para humanizar un gen de Pdcd1 endógeno de un animal no humano con el uso de cualquier secuencia humana, o combinación de secuencias humanas (o fragmentos de secuencias) según convenga. En este ejemplo, un fragmento de ADN humano de ~883 pb que contiene el exón 2, el intrón 2, y los primeros 71 pb del exón 3 de un gen PDCD1 humano que aparece en el registro de GenBank NM_005018.2 (s Eq ID NO:23) se emplea para humanizar un gen de Pdcd1 endógeno de un ratón. Un vector de transformación para la humanización del material genético que codifica un dominio IgV N-terminal extracelular, de un gen de Pdcd1 endógeno se construyó con el uso de la tecnología VELOCIGENE® (ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 6,586,251 y Valenzuela y otros, 2003, Nature Biotech. 21(6):652-659).

Brevemente, el clon RP23-93N20 del cromosoma artificial bacteriano (BAC) de ratón (Invitrogen) se modificó para eliminar la secuencia que contiene el exón 2, el intrón 2 y parte del exón 3 de un gen de Pdcd1 endógeno e insertar el exón 2, el intrón 2 y parte del exón 3 de un gen PDCD1 humano con el uso de un fragmento de ADN humano de ~883 pb, que codifica los aminoácidos 26-169 de un polipéptido PD-1 humano. El ADN endógeno que contiene el exón 1, la porción del exón 3 (es decir, que codifica el dominio transmembrana), 4 y 5 así como las regiones 5' y 3' no traducidas (UTR) se conservaron. El análisis de secuencia del fragmento de ADN humano de ~883 pb confirmó todos los exones de PDCD1 humano (es decir, el exón 2 y 71 pb del exón 3) y las señales de corte y empalme. El análisis de secuencia reveló que la secuencia coincidía con el genoma de referencia y el transcrito de PDCD1 NM_005018.2.

En más detalle, en primer lugar, se construyó un pequeño donante de recombinación homóloga en bacterias a partir de un fragmento de ADN sintético que contiene lo siguiente: [(HindIII)-(78 pb de ratón corriente arriba)-(sitios de enzimas de restricción XhoI/NheI)-(883 pb de PDCD1 humano)-(75 pb de ratón corriente abajo)- (HindIII)]. Este fragmento se sintetizó en Genescript Inc. (Piscataway, NJ) y se clonó en un vector plasmídico con resistencia a ampicilina. Los sitios XhoI-NheI se emplearon para unir un casete de neomicina autoeliminable de ~4,996 pb flanqueado por sitios de reconocimiento de recombinasa (loxP-hUb1-em7-Neo-pA-mPrm1-Crei-loxP; ver las patentes de los Estados Unidos núms. 8,697,851, 8,518,392 y 8,354,389). La selección posterior empleó neomicina. Los sitios HindIII flanqueantes se usaron para linealizar el vector de transformación antes de su recombinación homóloga con el clon RP23-93N20 de BAC de ratón. Según el diseño, la unión entre el fragmento de PDCD1 humano de 883 pb y los 75 pb de ratón corriente abajo preservó el marco abierto de lectura en el exón 3 (Figura 2). El vector de transformación resultante contenía, de 5' a 3', un brazo de homología en 5' que contiene ~61,7 kb de ADN genómico de ratón del clon RP23-93N20 de BAC, un casete de neomicina autoeliminable flanqueado por sitios loxP, un fragmento de ADN genómico humano de 883 pb (que contiene el exón 2 hasta los primeros 71 pb del exón 3 de un gen de Pdcd1 humano) y ~84 kb de ADN genómico de ratón del clon RP23-93N20 de BAC.

El clon RP23-93N20 de BAC modificado descrito anteriormente se usó para electroporar células madre embrionarias (ES) de ratón para crear células ES modificadas que comprenden un gen de Pdcd1 endógeno humanizado desde el exón 2 hasta parte del exón 3 (es decir, deleción de 900 pb del gen de Pdcd1 endógeno e inserción de 883 pb de una secuencia humana). Las células ES transformadas positivamente que contienen un gen de Pdcd1 humanizado se identificaron mediante un ensayo (Valenzuela y otros, más arriba) que detectó la presencia de las secuencias de PDCD1 humano (por ejemplo, el exón 2 y parte del exón 3) y confirmó la pérdida y/o retención de las secuencias de Pdcd1 de ratón (por ejemplo, el exón 2 y parte del exón 3, y/o los exones 1, 4 y 5). La Tabla 4 expone los cebadores y sondas que se usaron para confirmar la humanización de un gen de Pdcdl endógeno como se describió anteriormente (Figura 3). La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción corriente arriba incluyó lo siguiente, que indica la secuencia endógena de ratón (contenida dentro del paréntesis debajo con un sitio de restricción XhoI en letras itálicas) corriente arriba del extremo 5' del casete de neomicina autoeliminable del punto de inserción unido de manera contigua a un sitio loxP (en letras negritas) y la secuencia del casete presente en el punto de inserción: (TCAAAGGACA GAATAGTAGC CTCCAGACCC TAGGTTCAGT TATGCTGAAG GAAGAGCCCT CTCGAG)AT AACTT CGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTATATGCAT GGCCTCCGCG CCGGGTTTTG GCGCCTCCCG CGGGCGCCCC CCTCCTCACG (SEQ ID NO:19). La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción corriente abajo en el extremo 3' del casete de neomicina autoeliminable incluyó lo siguiente, que indica la secuencia del casete (contenida dentro del paréntesis debajo con la secuencia loxP en letras negritas y un sitio de restricción NheI en letras itálicas) contigua con la secuencia genómica de Pdcd1 humano corriente abajo del punto de inserción: (CTGGAATAAC TTCGTATAAT GTATGCTATA CGAAGTTATG CTAGTAACTA TAACGGTCCT AAGGTAGCGA GCTAGC) AAGAGGCTCT GCAGTGGAGG CCAGTGCCCA TCCCCGGGTG GCAGAGGCCC CAGCAGAGAC TTCTCAATGA CATTCCAGCT GGGGTGGCCC TTCCAGAGCC CTTGCTGCCC GAGGGATGTG AGCAGGTGGC CGGGGAGGCT TTGTGGGGCC ACCCAGCCCC (SEQ ID NO:20). La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción corriente abajo en el extremo 3' de la secuencia genómica de PDCD1 humano incluyó lo siguiente, que indica la secuencia de PDCD1 humano contigua con la secuencia genómica de Pdcdl de ratón (contenida dentro del paréntesis debajo): CCCTTCCAGA GAGAAGGGCA GAAGTGCCCA CAGCCCACCC CAGCCCCTCA CCCAGGCCAG CCGGCCAGTT CCAAACCCTG (GTCATTGGTA TCATGAGTGC CCTAGTGGGT ATCCCTGTAT TGCTGCTGCT GGCCTGGGCC CTAGCTGTCT TCTGCTCAAC) (SEQ ID NO:21). La secuencia de nucleótidos a través del punto de inserción corriente arriba después de la deleción del casete de neomicina (77 pb restantes) incluyó lo siguiente, que indica la yuxtaposición de las secuencias genómicas de ratón y humana con la secuencia loxP restante de la secuencia del casete (contenida dentro del paréntesis debajo con los sitios de restricción XhoI y NheI en letras itálicas y la secuencia loxP en letras negritas): TCAAAGGACA Ga At AGTAGC CTCCAGACCC TAGGTTCAGT TATGCTGAAG GAAGAGCCCT (CTCGAG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTATGCTAGT AACTATAACG GTCCTAAGGT AGCGA GCTAGC) AAGAG GCTCTGCAGT GGAGGCCAGT GCCCATCCCC GGGTGGCAGA GGCCCCAGCA GAGACTTCTC AATGACATTC CAGCTGGGGT GGCCCTTCCA

(SEQ ID NO:22).

Después, los clones de células ES positivas se usaron para su implantación en ratones hembras con el uso del método VELOCIMOUSE® (ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 7,294,754 y Poueymirou y otros, 2007, Nature Biotech. 25(1):91 -99) para generar una camada de crías que contienen una inserción del exón 2 de PDCD1 humano y parte del exón 3 de PDCD1 humano en un gen de Pdcd1 endógeno de un ratón. Los ratones que tienen la humanización del exón 2 y 3 en parte (es decir, el fragmento de ADN humano de 883 pb) de un gen de Pdcd1 endógeno se volvieron a confirmar e identificar mediante la genotipificación del ADN aislado a partir de pedazos de cola con el uso de una modificación del ensayo de alelos (Valenzuela y otros, más arriba) que detectó la presencia de las secuencias del gen PDCD1 humano. Las crías se genotipifican y las cohortes de animales heterocigotos para el constructo del gen de Pdcd1 humanizado se seleccionan para su caracterización.

TABLA 4

Nombre Cebador Secuencia (5'-3')

Directo CCCAGCAGAGACTTCTCAATGAC (SEQ ID NO:7) 7106 hTU Sonda TGGCCCTTCCAGAGCCCTTG (SEQ ID NO:8)

Inverso CGGCCACCT GCTCACATC (SEQ ID NO:9)

Directo GGCATCTCTGTCCTCTAGCTC (SEQ ID NO: 10) 7106 hTD Sonda AAGCACCCCAGCCCCTCT AGTCTG (SEQ ID NO: 11)

Inverso GGGCTGTGGGCACTTCTG (SEQ ID NO: 12)

Directo CCTTCCTCACAGCTCTTT GTTC (SEQ ID NO: 13) 7106 TU Sonda TCTGCATTTCAGAGGTCCCCAATGG (SEQ ID NO: 14)

Inverso GAGCCAGGCTGGGTAGAAG (SEQ ID NO: 15)

Directo CGGTGTCCT AGAACTCTATT CTTT G (SEQ ID NO: 16) 7106 TD Sonda TCCTGGAGACCTCAACAAGATATCCCA (SEQ ID NO: 17)

Inverso TGAAACCGGCCTTCTGGTT (SEQ ID NO: 18)

Ejemplo 2. Expresión de proteína PD-1 humanizada en células T activadas

Este Ejemplo demuestra que los animales no humanos (por ejemplo, roedores) modificados de manera que contengan un gen de Pdcd1 humanizado de conformidad con el Ejemplo 1 expresan una proteína PD-1 humanizada en la superficie de linfocitos activados. En este Ejemplo, las células T activadas de ratones heterocigotos para la humanización de un gen de Pdcd1 endógeno como se describió en el Ejemplo 1 se tiñeron con anticuerpos anti-PD-1 para determinar la expresión de PD-1 en células T estimuladas aisladas a partir de ratones de tipo silvestre y humanizados.

Brevemente, los bazos se recolectaron y se procesaron a partir de un ratón de tipo silvestre y un ratón heterocigoto para la humanización de un gen de Pdcd1 endógeno como se describió en el Ejemplo 1 en suspensiones de células individuales mediante disociación mecánica. Las células se lavaron en medio (RPMI suplementado con 10 % de FBS) y se resuspendieron a 1x106/ml y se sembraron 200 pl (200 000 células) en placas de 96 pocillos. Las células en pocillos seleccionados se estimularon con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 (ambos a 1 pg/ml) durante 72 horas. Las células se tiñeron para FACS de conformidad con las especificaciones del fabricante con anticuerpos que reconocen CD4, CD8, CD19 y proteína PD1 humana (clon MIH4, BD Biosciences) o de ratón (clon J43, eBioscience). Las células teñidas se analizaron en el citómetro de flujo LSRII y los datos se analizaron con el uso del programa informático Flowjo. Las células T CD8+ se detectaron en el portal (CD19'CD8+) para la expresión de proteína PD1 humana y de ratón. Los resultados ilustrativos se muestran en la Figura 4.

Como se muestra en la Figura 4, los ratones que portan un gen de Pdcdl humanizado como se describió en el Ejemplo 1 expresan un polipéptido PD-1 que comprende una porción humana y una porción endógena de ratón. La porción humana se expresa de manera detectable por medio del reconocimiento con un anticuerpo que reconoce un polipéptido PD-1 completamente humano.

Ejemplo 3. Eficacia in vivo de moduladores de PD-1

Este Ejemplo demuestra que los animales no humanos (por ejemplo, roedores) modificados de manera que contengan un gen de Pdcd1 humanizado de conformidad con el Ejemplo 1 pueden usarse en un ensayo in vivo para tamizar moduladores de PD-1 (por ejemplo, anticuerpos anti-PD-1) y determinar diversas características tales como, por ejemplo, inhibición del crecimiento tumoral y/o muerte de células tumorales. En este Ejemplo, se tamizan diversos anticuerpos anti-PD-1 en ratones homocigotos para la humanización de un gen de Pdcd1 endógeno como se describió en el Ejemplo 1 para determinar la dosis óptima de anticuerpo que inhibe el crecimiento tumoral y la medida en que los anticuerpos anti-PD-1 median la muerte de células tumorales.

Brevemente, los ratones se dividieron uniformemente de conformidad con el peso corporal en cinco grupos de tratamiento o de control para el Estudio 1 (n=5/grupo), ocho grupos de tratamiento o de control para el Estudio 2 (n=5/grupo), y cinco grupos de tratamiento o de control para el Estudio 3 (n=7/grupo). En el día cero, los ratones se anestesiaron por inhalación de isoflurano y después se inyectaron por vía subcutánea con células MC38.ova en suspensión de 100 pl de DMEM en el costado derecho (Estudio 1: 5x105; Estudio 2/3: 1x106). Las células MC38.ova (adenocarcinoma de colon de ratón) se diseñaron de manera que expresan ovoalbúmina de pollo para aumentar la inmunogenicidad tumoral. Para el Estudio 1, los grupos de tratamiento se inyectaron por vía intraperitoneal con 200 pg de cualquiera de los tres anticuerpos anti-PD-1, o un anticuerpo de control de isotipo con especificidad irrelevante en los días 3, 7, 10, 14, y 17 del experimento, mientras que un grupo de ratones se dejó sin tratar. Para el Estudio 2, los grupos de tratamiento se inyectaron por vía intraperitoneal con cualquiera de los tres anticuerpos anti-PD-1 a 10 mg/kg o 5 mg/kg por/dosis, un anticuerpo anti-PD-1 (Ab B, IgG4) a 10 mg/kg por dosis, o un anticuerpo de control de isotipo con especificidad irrelevante a 10 mg/kg en los días 3, 7, 10, 14, y 17 del experimento. Para el Estudio 3, los grupos de tratamiento se inyectaron por vía intraperitoneal con cualquiera de dos anticuerpos anti-PD-1 a 5 mg/kg o 2,5 mg/kg por/dosis, o un anticuerpo de control no específico para PD-1 (control) a 5 mg/kg en los días 3, 7, 10, 14, y 17 del experimento. La Tabla 5 expone el protocolo de dosificación y tratamiento experimental para los grupos de ratones.

Para cada uno de los estudios, se registraron los volúmenes tumorales promedios determinados por mediciones con calibre y el porcentaje de supervivencia en el Día 14 o 17 y en el Día 23 o 24 de cada experimento para cada grupo de tratamiento. El número de ratones libres de tumor también se evaluó al finalizar el estudio (Día 42 para el Estudio 1 y Día 31 para el Estudio 2 y el Estudio 3). El volumen tumoral promedio (mm3)(±SD), el porcentaje de supervivencia, y el número de ratones libres de tumor se calcularon para cada estudio (Tablas 7-9). Las curvas de crecimiento tumoral ilustrativas se proporcionan en la Figura 5.

Como se muestra en la Tabla 6 para el Estudio 1, los ratones tratados con Ab A no desarrollaron ningún tumor detectable durante el curso del estudio. Los ratones tratados con Ab C exhibieron una reducción sostenida del volumen tumoral en comparación con los controles en los días 17 y 24 del estudio; y 3 de 5 ratones estaban libres de tumor al finalizar el experimento. Por el contrario, el tratamiento con Ab B no demostró eficacia significativa en la reducción del volumen tumoral en este estudio en comparación con los controles. En el día 23 del estudio, 1 de 5 ratones murió en el grupo que recibió Ab B, y 2 de 5 ratones murieron en el grupo de tratamiento con control de isotipo. En los grupos sin tratamiento y de control de isotipo, algunos ratones exhibieron regresión espontánea de tumores (1 de 5 ratones y 2 de 5 ratones, respectivamente).

Como se muestra en la Tabla 7 para el Estudio 2, los ratones tratados con Ab A a 10 mg/kg no desarrollaron tumores detectables durante el curso del estudio. Los grupos de ratones tratados con 10 mg/kg de cualquiera de Ab C o Ab D exhibieron una reducción sustancial del volumen tumoral en comparación con los controles en los días 17 y 24 del estudio. Cuatro de 5 ratones en cada grupo tratados con 10 mg/kg de cualquiera de Ab C o Ab D estaban libres de tumor en el Día 31, mientras que en el grupo de tratamiento con control de isotipo solo 1 de 5 animales estaba libre de tumor como resultado de la regresión espontánea del tumor. El anticuerpo Ab B probado a 10 mg/kg demostró una reducción sustancial del volumen tumoral en comparación con los controles en los días 17 y 24 del estudio, pero este anticuerpo fue el anticuerpo anti-PD1 menos eficaz con solo 2 de 5 ratones sobrevivientes al finalizar el experimento.

Se observó una respuesta dependiente de la dosis en la supresión del tumor a las dosis probadas (5 mg/kg y 10 mg/kg) en los grupos tratados con Ab A, Ab C, y Ab D. La terapia con Ab A o Ab C a 5 mg/kg fue menos eficaz, con 4 de 5 ratones libres de tumor al finalizar el experimento en el día 31, mientras que 5 de 5 ratones se mantuvieron libres de tumor en el grupo con dosis de 10 mg/kg de Ab A. La prueba de Dunett de comparaciones múltiples en ANOVA de 2 vías reveló que las diferencias en el crecimiento tumoral entre el grupo tratado con anticuerpo de control de isotipo a 10 mg/kg como referencia y los grupos tratados a 10 mg/kg con Ab A, Ab C o Ab D fueron estadísticamente significativas con valor de p<0,005. Las diferencias en el crecimiento tumoral entre el grupo tratado con anticuerpo de control de isotipo a 10 mg/kg como referencia y los grupos tratados a 5 mg/kg con Ab A, Ab C o Ab D también fueron estadísticamente significativas con un valor de p<0,05.

Como se muestra en la Tabla 8 para el Estudio 3, 6 de 7 ratones tratados con Ab A o Ab C a 5 mg/kg estaban libres de tumor al finalizar el experimento, mientras que no hubo animales libres de tumor en el grupo de control de isotipo. Un ratón que portaba un tumor en el grupo de control con IgG4 murió en el día 17 después del implante. Solo 4 de 7 ratones tratados con Ab C a 2,5 mg/kg se mantuvieron libres de tumor al finalizar el experimento. La diferencia en los volúmenes tumorales en el día 21 entre los anticuerpos anti-PD-1 probados y un grupo de control de isotipo fue estadísticamente significativa según se determinó por ANOVA de una vía con la prueba posterior de comparaciones múltiples de Dunnett con p<0,01. Los cuatro anticuerpos anti-PD-1 probados fueron igualmente más eficaces a la dosis de 5 mg/kg que a la dosis de 2,5 mg/kg.

Como se muestra en la Figura 5, los anticuerpos anti-PD-1 inhibieron significativamente el crecimiento tumoral en un modelo profiláctico de crecimiento tumoral de MC38.ova en ratones con proteína PD-1 humanizada producidos de conformidad con el Ejemplo 1. La terapia con Ab anti-PD-1 a 10 mg/kg promovió la regresión del tumor en todos los ratones (5 de 5) durante el curso del experimento, mientras que solo uno de los cinco animales se mantuvo libre de tumor en el grupo de control como resultado de la regresión espontánea del tumor. La terapia con anti-PD-1 a 5 mg/kg fue ligeramente menos eficaz, con cuatro de cinco ratones libres de tumor al finalizar el experimento. El ANOVA de una vía con prueba posterior de comparaciones múltiples de Dunnett reveló una diferencia significativa en los volúmenes tumorales entre los tratamientos con anticuerpos anti-PD-1 y de control con un valor de p < 0,05 (5 mg/kg) y un valor de p < 0,01 (10 mg/kg).

En un experimento similar, se investigó la integridad funcional de la señalización de PD-1 en ratones con proteína PD-1 humanizada producidos de conformidad con el Ejemplo 1 por medición de las respuestas de células T CD8+ y de células T CD3+ y la producción de IFNy en bazos de ratones portadores de tumores tratados con anticuerpo anti-PD-1.

Brevemente, se obtuvieron células del bazo de ratones con proteína PD-1 humanizada (75 % C57BL/6/25 % 129) tratados con anticuerpo anti-PD-1 o de control al finalizar los experimentos en el día 21 (descritos anteriormente). Se aisló el ARN total, y se realizó la PCR en tiempo real del ADNc obtenido por transcripción inversa con el uso de oligonucleótidos y la mezcla de sondas taqman específica para CD8b de ratón (cebador directo: GCTCTGGCTG GTCTTCAGTA TG, SEQ ID NO:24; cebador inverso: TTGCCGTATG GTTGGTTTGA AC, SEQ ID NO:25; sonda: AGCAGCTCTG CCCTCAT, SEQ ID NO:26), CD3Z de ratón (Mm00446171_m1, Applied Biosystems), IFN-y de ratón (Mm01168134_m1, Applied Biosystems), PD-1 humano (cebador directo: ACt TCc ACAT GAGCGTGG, SEQ ID NO:27; cebador inverso: GGGCTGTGGG CACTTCTG, SEQ ID NO:28; sonda: GCAGATCAAA GAGAGCCTGC, SEQ ID NO:29) y PD-1 de ratón (Mm01285676_m1, Applied Biosystems). Las muestras se normalizaron con relación a la expresión de ciclofilina B de ratón. Los resultados ilustrativos se proporcionan en la Figura 6.

Como se muestra en la Figura 6, la administración de un anticuerpo anti-hPD-1 indujo el aumento de la producción de células T CD8+ y CD3+ en los bazos de ratones humanizados (producidos de conformidad con el Ejemplo 1) portadores de tumores de MC38.ova. Además, la actividad del anticuerpo anti-hPD-1 en ratones con proteína PD-1 humanizada portadores de tumor, fue dependiente de IFNy, lo que confirmó la señalización adecuada a través de PD-1 humanizada en la superficie celular. En general, se observó un aumento en las células T e IFNy en comparación con los ratones tratados con control para los cuatro grupos de tratamiento.

La expresión de ARNm de PD-1 humano se midió con sondas específicas para secuencias humanas diseñadas para la porción extracelular de la proteína PD-1 y confirmaron la expresión adecuada de la proteína PD-1 humanizada en la superficie celular. Adicionalmente, la medición de la expresión de ARNm de PD-1 de ratón con cebadores diseñados para detectar la porción extracelular de PD-1 de ratón no produjo un producto.

En conjunto, este Ejemplo demuestra que los animales no humanos descritos en la presente pueden usarse para evaluar la eficacia in vivo de fármacos (por ejemplo, un anticuerpo) dirigidos a PD-1, y tales animales son útiles para discriminar el efecto terapéutico de anticuerpos anti-PD-1. Por otra parte, los animales no humanos descritos en la presente descripción pueden usarse para evaluar la medida en la que los fármacos dirigidos a PD-1 pueden inhibir el crecimiento tumoral y/o mediar la muerte de células tumorales. Los animales no humanos (por ejemplo, ratones) descritos en la presente muestran una señalización funcional de PD-1 y respuestas inmunológicas dependientes de PD-1 adecuadas por medio de una proteína PD-1 humanizada como se evidencia por la expansión de células T y la expresión de citocinas (por ejemplo, IFN-y).

TABLA 5

Estudio # Anticuerpo Dosificación

Control de isotipo 200 |jg

Sin tratamiento N/A

1 Ab A 200 jg

Ab B 200 jg

Ab C 200 jg

Control de isotipo 10 mg/kg

Ab A 10 mg/kg

2 Ab A 5 mg/kg

Ab B 10 mg/kg

Ab C 10 mg/kg

Ab C 5 mg/kg

Ab D 10 mg/kg

Ab D 5 mg/kg

Control de isotipo 5 mg/kg

Ab A 5 mg/kg

Ab A 2,5 mg/kg

Ab C 5 mg/kg

Ab C 2,5 mg/kg

TABLA 6

Estudio 1

Volumen tumoral promedio (mm3, Supervivencia (%) Ratones libres de Grupo de tratamiento _±SD)tumor (n=5) Día 17 Día 23 Día 17 Día 23 Día 42

200 jg/ratón 200 jg/ratón 200 jg/ratón 200 jg/ratón 200 jg/ratón Sin tratamiento 189 (±110) 554 (±317) 100 % 100 % 1/5 Control de isotipo 86 (±114) 515 (±859) 100 % 60 % 2/5 Ab A 0 (0) 0 (0) 100 % 100 % 5/5 Ab B 89 (±176) 445 (±889) 100 % 80 % 3/5 Ab C 14 (±19) 205 (±312) 100 % 100 % 3/5

TABLA 7

Estudio 2

Volumen tumoral promedio (mm3; Supervivencia (%) Ratones libres de tumor Grupo de tratamiento _±SD)

Día 17 Día 24 Día 17 Día 24 Día 31 (n=5) 5 mg/kg 10 5 mg/kg 10 5 mg/kg 10 5 mg/kg 10 5 mg/kg 10 mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg Isotipo ⁹

Control N/A ⁴⁴

_(±434)N/A 824

_(±858)N/A 100 % N/A 60 % N/A 1/5 Ab A 17 (±38) 104

0 (0) _(±233)0 (0) 100 100 100 100 4/5 5/5

359

Ab B N/A ¹²⁴

_(±209)N/A _(±657)N/A 100 N/A 80 N/A 2/5 Ab C 91

_(±204)12 (±28) 228 96

(±509) _(±215)100 100 80 100 4/5 4/5 Ab D 94 10 (±21) 328 67

_(±160)(±559) _(±150)100 100 80 100 3/5 4/5

TABLA 8

Estudio 3

Volumen tumoral promedio (mm3; Ratones libres de _____________±SD)____________ ^{Supervivencia (%)}tumor Grupo de tratamiento

Día 14 Día 21 Día 14 Día 21 Día 31 (n=7) 2,5 5 mg/kg 2,5 5 mg/kg 2,5 5 mg/kg 2,5 5 mg/kg 2,5 5 mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg

Isotipo 405

N/A 94 (±44) N/A ^ 0 ^ N/A 100 N/A 86 N/A 0/7 Control

Ab A 0 (0) 0 (0) 19 (±51)13 (±35) 100 100 100 100 6/7 6/7 Ab C 41 (±68) 7 (±20) (±173) 16 (±42) 100 100 100 100 4/7 6/7

Ejemplo 4. Modelo de roedor de terapia tumoral con anti-PD-1

Este Ejemplo demuestra que los animales no humanos (por ejemplo, roedores) modificados de manera que contengan un gen de Pdcd1 humanizado de conformidad con el Ejemplo 1 pueden usarse en un modelo de tumor para determinar la(s) dosis terapéutica(s) óptima(s) de moduladores de PD-1 (por ejemplo, anticuerpos anti-PD-1). En este Ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1 se administra a ratones homocigotos para la humanización de un gen de Pdcd1 endógeno como se describió en el Ejemplo 1 para determinar la dosis terapéutica óptima para el tratamiento de tumores establecidos.

Brevemente, los ratones que contienen un gen de Pdcd1 humanizado (como se describió en el Ejemplo 1) se implantaron por vía subcutánea con 1x106 células MC38.Ova (descritas anteriormente) y posteriormente se distribuyeron de manera aleatoria en seis grupos de tratamiento (n=8 - 9 por grupo) una vez que los volúmenes tumorales alcanzaron 80 - 120 mm3 (día 0). A los ratones se les administró por vía intraperitoneal un anticuerpo antihPD-1 en un intervalo de dosis escalonadas de 0,3-25 mg/kg (es decir, 0,3, 1, 3, 10 o 25 mg/kg) o un anticuerpo de control de isotipo a 25 mg/kg. Los anticuerpos se dosificaron en los días 0, 3, 7, 10 y 13. Los volúmenes tumorales se controlaron por mediciones con calibre dos veces por semana durante la duración del experimento (60 días). Las curvas de crecimiento tumoral ilustrativas se proporcionan en la Figura 7.

Como se muestra en la Figura 7, ninguno de los ratones a los que se administró el anticuerpo de control estaba libre de tumor al finalizar el experimento. Por el contrario, un intervalo de dosis de 3 - 25 mg/kg de anticuerpo anti-hPD-1 dio como resultado aproximadamente 44-55 % de ratones libres de tumor entre los diferentes grupos de tratamiento. En conjunto, este Ejemplo demuestra que los animales no humanos descritos en la presente pueden usarse como un modelo de tumor en roedor para determinar la dosis y/o intervalo de dosis óptimos de fármacos (por ejemplo, un anticuerpo) dirigidos a PD-1 para tratar eficazmente tumores establecidos.

Claims

REIVINDICACIONES

i . Un ratón cuyo genoma comprende un gen de muerte celular Programada 1 humanizado (Pdcdl) en un locus de Pdcd1 endógeno,

en donde dicho ratón expresa un polipéptido de muerte celular programada 1 (PD-1) humanizado de dicho gen de Pdcd1 humanizado, cuyo polipéptido PD-1 humanizado tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 6 y comprende una porción humana y una porción endógena, en donde la porción humana comprende los aminoácidos 26-169 de un polipéptido PD-1 humano y la porción endógena comprende la porción intracelular de un polipéptido PD-1 de ratón endógeno.
2. El ratón de la reivindicación 1, en donde el polipéptido PD-1 humanizado:

(a) se traduce en una célula del ratón con un péptido señal de ratón; o

(b) comprende además la porción transmembrana del polipéptido PD-1 endógeno de ratón.
3. Una célula o tejido aislados de ratón cuyo genoma comprende un gen de Pdcd1 humanizado en un locus de Pdcd1 endógeno,

en donde dicho gen de Pdcd1 humanizado codifica un polipéptido PD-1 humanizado, cuyo polipéptido PD-1 humanizado tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 6 y comprende una porción humana y una porción endógena,

en donde la porción humana comprende los aminoácidos 26-169 de un polipéptido PD-1 humano y la porción endógena comprende la porción intracelular de un polipéptido PD-1 de ratón endógeno,

en donde el gen de Pdcd1 humanizado se une operativamente a un promotor de Pdcd1 de ratón, y en donde la célula de ratón es opcionalmente una célula madre embrionaria de ratón.
4. Un embrión de ratón generado a partir de una célula madre embrionaria de ratón de acuerdo con la reivindicación 3.
5. Un método para producir un ratón, en donde:

(A) el genoma del ratón comprende un gen de Pdcd1 que codifica un polipéptido PD-1 que tiene una porción humana y una porción endógena, en donde el gen de Pdcd1 se une operativamente a un promotor de Pdcd1 de ratón, el método que comprende

modificar el genoma de un ratón de manera que comprenda un gen de Pdcd1 humanizado en un locus de Pdcd1 endógeno,

en donde dicho ratón expresa un polipéptido PD-1 humanizado de dicho gen de Pdcd1 humanizado, cuyo polipéptido PD-1 humanizado tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 6 y comprende una porción humana y una porción endógena,

en donde la porción humana comprende los aminoácidos 26-169 de un polipéptido PD-1 humano y la porción endógena comprende la porción intracelular de un polipéptido PD-1 de ratón endógeno; o

(B) el ratón expresa un polipéptido PD-1 a partir de un gen de Pdcd1 endógeno, en donde el polipéptido PD-1 comprende una secuencia humana, el método que comprende

(a) insertar un fragmento genómico humano de un gen de Pdcd1 humano en un gen de Pdcd1 endógeno de ratón en un locus de Pdcd1 endógeno en una célula madre embrionaria de ratón para formar un gen de Pdcd1 humanizado, unido operativamente a un promotor de Pdcd1 endógeno de ratón, que codifica un polipéptido PD-1 humanizado,

en donde dicho polipéptido PD-1 humanizado tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 6 y comprende una porción humana y una porción endógena, en donde la porción humana comprende los aminoácidos 26-169 de un polipéptido PD-1 humano y la porción endógena comprende la porción intracelular de un polipéptido PD-1 endógeno de ratón;

(b) obtener la célula madre embrionaria de ratón generada en (a); y,

(c) crear un ratón con el uso de la célula madre embrionaria de ratón de (b).
6. El método de acuerdo con la reivindicación 5(A) o (B), en donde:

el polipéptido PD-1 humanizado comprende la secuencia transmembrana del polipéptido PD-1 endógeno de ratón.
7. Un método para evaluar las propiedades farmacocinéticas de un fármaco dirigido a PD-1 humano, el método que comprende:

administrar el fármaco a un ratón de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2; y

realizar un ensayo para determinar una o más propiedades farmacocinéticas del fármaco dirigido a PD-1 humano en donde el fármaco es opcionalmente un anticuerpo anti-PD-1.
8. Un modelo de tumor en ratón que se obtiene al:

a) proporcionar un ratón de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2; y

b) implantar una o más células tumorales en el ratón de (a); de esta manera se obtiene dicho modelo de tumor en ratón.