PT2770822T

PT2770822T - Ratinhos geneticamente modificados que expressam moléculas quiméricas de complexo principal de histocompatibilidade (mhc) ii

Info

Publication number: PT2770822T
Application number: PT128061991T
Authority: PT
Inventors: Stevens Sean; J Murphy Andrew; Macdonald Lynn; Tu Naxin; Gurer Cagan; Voronina Vera
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 2011-10-28
Filing date: 2012-10-26
Publication date: 2017-09-18
Also published as: DK3590332T3; AU2021200438B2; ES2774488T3; US11219195B2; EP3272214A1; AU2018201402C1; BR112014009941B1; CY1122700T1; PL3590332T3; CN108401986A; HUE034374T2; IL260209B; SG11201400938UA; KR102113108B1; ES2640241T3; NZ623146A; US20190239496A1; EP2770822B9; IN2014CN03892A; EP2770822B1

Description

DESCRIÇÃO

RATINHOS GENETICAMENTE MODIFICADOS QUE EXPRESSAM MOLÉCULAS QUIMÉRICAS DE COMPLEXO PRINCIPAL DE HISTOCOMPATIBILIDADE

(MHC) II

Campo da invenção A presente invenção refereâse a um roedor (por exemplo, um ratinho ou um rato) que é geneticamente manipulado para expressar uma proteína do Complexo Principal de

Histocompatibilidade (MHC) de classe II humanizada. A invenção refereâse, ainda, a métodos para produzir um roedor geneticamente modificado que expressa uma proteína do MHC II humanizada. Também são revelados no presente documento métodos para utilização de roedores, células e tecidos que expressam uma proteína do MHC de classe II humanizada para identificar péptidos que ativam linfócitos e acionam células T, e para desenvolver vacinas humanas e outras terapêuticas.

Antecedentes da invenção

Na resposta imunitária adaptativa, os antigénios estranhos são reconhecidos por moléculas recetoras em linfócitos B (por exemplo, imunoglobulinas) e linfócitos T (por exemplo, recetor de célula T ou TCR) . Esses antigénios estranhos encontramâse presentes na superfície de células como fragmentos de péptido por proteínas especializadas, geralmente denominadas como moléculas de complexo principal de histocompatibi 1 idade (MHC) . As moléculas do MHC são codificadas por múltiplos loci que encontram sob uma forma de aglomeração de genes ligados que abrange cerca de 4 Mb. Em ratinhos, os genes do MHC estão codificados no cromossoma 17, e por motivos históricos são denominados como os genes de histocompatibilidade 2 (Hâ2). Em seres humanos, os genes estão codificados no cromossoma 6 e são chamados de genes de antigénio de leucócito humano (HLA). Os loci em ratinhos e seres humanos são poligénicos; os mesmos incluem três classes altamente polimórficas de genes do MHC (classes I, II e III) que exibem organização semelhante em genomas humanos e murinos (consulte a Figura 2 e a Figura 3, respetivamente).

Os loci de MHC exibem o maior grau de polimorfismo no genoma; alguns genes são representados por >300 alelos (por exemplo, HLAâDRp humano e HLAâB humano). Todos os genes do MHC de classe I e II podem apresentar fragmentos de péptido, mas cada gene expressa uma proteína com características de ligação diferentes, que refletem polimorfismos e variantes alélicas. Cada indivíduo tem uma gama exclusiva de fragmentos de péptido que podem estar presentes na superfície de célula para células B e T no curso de uma resposta imunitária.

Quer os seres humanos quer os ratinhos têm genes do MHC de classe II (consulte as Figuras 2 e 3) . Em seres humanos, os genes clássicos do MHC II são chamados HLAâDP, HLAâDQ e HLAâDR, enquanto que em ratinhos, os mesmos são Hâ2A e Hâ 2E (frequentemente abreviados como IâA e IâE, respetivamente) . Proteínas adicionais codificadas por genes no locus do MHC II, HLAâDM e HLAâDO em seres humanos, e Hâ2M e Hâ20 em ratinhos, não são encontradas na superfície de célula, mas residem no compartimento endocítico e asseguram o carregamento apropriado de moléculas do MHC II com péptidos. As moléculas de classe II consistem em duas cadeias polipeptídicas: cadeia α e cadeia β. A porção extracelular da cadeia α contém dois domínios extracelulares, al e «2; e a porção extracelular da cadeia β também contém dois domínios extracelulares, βΐ e β2 (consulte a Figura 1) . As cadeias o: e β têm ligações não covalentes entre si.

As moléculas do MHC de classe II são expressas em células que apresentam antigénio (APCs), por exemplo, células B, macrófagos, células dendríticas, células endoteliais durante um processo de inflamação, etc. As moléculas do MHC II expressas na superfície de APCs apresentam, tipicamente, antigénios gerados em vesículas intracelulares para células T CD4+. A fim de participar no recrutamento de célula T CD4+, o complexo do MHC de classe II com o antigénio de interesse deve ser suficientemente estável para sobreviver tempo suficiente para ecrutar uma célula T CD4+. Quando uma célula T CD4+ auxiliar é recrutada por um péptido estranho/complexo do MHC II na superfície de APC, a célula T é ativada para libertar citocinas que ajudam na resposta imunitária ao invasor.

Nem todos os antigénios vão provocar a ativação de célula T devido aos mecanismos de tolerância. No entanto, em algumas doenças (por exemplo, cancro, doenças autoimunes), os péptidos derivados de autoproteínas tornam-se o alvo do componente celular do sistema imunitário, o que resulta na destruição de células que apresentam tais péptidos. Têm havido avanços significativos no reconhecimento de antigénios que são clinicamente significativos (por exemplo, antigénios associados aos vários tipos de cancro). No entanto, a fim de aprimorar a identificação e seleção de péptidos que vão provocar uma resposta adequada numa célula T humana, em particular, para péptidos de antigénios clinicamente significativos, permanece uma necessidade de sistemas in vivo e in vitro que imitam os aspetos do sistema imunitário humano. Assim, há uma necessidade de sistemas biológicos (por exemplo, animais não humanos e células geneticamente modificadas) que podem exibir componentes de um sistema imunitário humano.

Sumário da invenção É fornecido um sistema biológico para gerar ou identificar péptidos que se associam a proteínas do MHC de classe II humanas e quimeras das mesmas, e se ligam a células T CD4+. São fornecidos roedores que contêm células nãoâhumanas que expressam moléculas humanizadas que funcionam na resposta imunitária celular. Os loci de roedor humanizados que codificam proteínas do MHC II humanizadas também são descritos. As células de roedor humanizadas que expressam moléculas do MHC humanizadas também são descritas. São descritos sistemas in vivo e in vitro que contêm células de roedor humanizadas, em que as células de roedor expressam uma ou mais moléculas de sistema imunitário humanizadas. É fornecido no presente documento um roedor (por exemplo, um ratinho ou um rato) que contém no seu genoma uma sequência de nucleótidos que codifica um complexo do MHC II humanizado, em que uma porção humana do complexo do MHC II humanizado contém um domínio extracelular de um complexo do MHC II humano, por exemplo, domínios alfa 1 e alfa 2 do MHC II humanizados e domínios β beta 1 e beta 2 do MHC II humanizados conforme citado na reivindicação 1.

Num aspeto, é fornecido no presente documento um animal roedor que contém uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido a do MHC II humano/de roedor quimérico num locus de gene a do MHC II endógeno em que uma porção humana de tal polipéptido a do MHC II humano/de roedor quimérico contém um domínio extracelular a do MHC II humano, em que o domínio extracelular a do MHC II humano no animal contém domínios al e c*2 do MHC II humano. 0 roedor expressa um complexo do MHC II funcional numa superfície de uma célula do animal. Numa forma de realização, uma porção não humana do polipéptido a do MHC II humano/de roedor quimérico compreende domínios transmembranares e citoplasmáticos de um polipéptido a do MHC II de roedor endógeno. Numa forma de realização, a sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido a do MHC II humano/de roedor quimérico é expressa sob controlo regulador de elementos reguladores e promotores a do MHC II de roedor endógeno. Numa forma de realização, a porção humana do polipéptido quimérico é derivada de uma proteína do HLA de classe II humana selecionada a partir de um grupo que consiste em HLAâDR, HLAâDQ e HLAâDP, por exemplo, a porção humana é derivada de proteína de HLAâDR4. 0 roedor pode ser um ratinho. Num aspeto, o roedor que compreende uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido a do MHC II humano/de roedor quimérico num locus de gene a do MHC II endógeno contém, ainda, uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido β do MHC II humano/de roedor quimérico num locus de gene β do MHC II endógeno. Também é fornecido no presente documento um método para produzir um roedor geneticamente modificado que contém uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido a do MHC II humano/de roedor quimérico num locus de gene a do MHC II endógeno. Tal método pode incluir substituir uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido a do MHC II de roedor endógeno por uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido a do MHC II humano/de roedor quimérico num locus de gene « do MHC II endógeno.

Também é fornecido no presente documento um roedor que contém uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido β do MHC II humano/de roedor quimérico num locus de gene β do MHC II endógeno. Numa forma de realização, uma porção humana de tal polipéptido β do MHC II humano/de roedor quimérico contém um domínio extracelular β do MHC II humano, em que o domínio extracelular β do MHC II humano no animal contém domínios βΐ e β2 do MHC II humano. 0 roedor expressa um complexo do MHC II funcional numa superfície de uma célula do animal. Numa forma de realização, uma porção de roedor do polipéptido β do MHC II humano/de roedor quimérico contém domínios transmembranares e citoplasmáticos de um polipéptido β do MHC II de roedor endógeno. Numa forma de realização, a sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido β do MHC II humano/de roedor quimérico é expressa sob controlo regulador de elementos reguladores e promotores β do MHC II de roedor endógeno. Numa forma de realização, a porção humana do polipéptido quimérico é derivada de uma proteína do HLA de classe II humana selecionada a partir do grupo que consiste em HLAâDR, HLAâ DQ e HLAâDP, por exemplo, a porção humana é derivada de proteína de HLAâDR4. 0 roedor pode ser um ratinho. Num aspeto, o animal roedor que contém uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido β do MHC II humano/de roedor quimérico num locus de gene β do MHC II endógeno contém, ainda, uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido a do MHC II humano/de roedor quimérico num locus de gene a do MHC II endógeno. Também é fornecido no presente documento um método para produzir um roedor geneticamente modificado que contém uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido β do MHC II humano/de roedor quimérico num locus de gene β do MHC II endógeno. Tal método pode incluir substituir uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido β do MHC II de roedor endógeno por uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido β do MHC II humano/de roedor quimérico num locus de gene β do MHC II endógeno.

Num aspeto, e fornecido um roedor que contém uma primeira sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido α do MHC II humano/de roedor quimérico e uma segunda sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido β do MHC II humano/de roedor quimérico num locus de gene do MHC II endógeno, em que uma porção humana do polipéptido α do MHC II humano/de roedor quimérico contém um domínio extracelular a. do MHC II humano e uma porção humana do polipéptido β do MHC II humano/de roedor quimérico contém um domínio extracelular β do MHC II humano, em que o domínio extracelular a. do MHC II humano contém domínios al e a2 humanos do MHC II humano e o domínio extracelular β do MHC II humano contém domínios βΐ e β2 humanos do MHC II humano. Os polipéptidos α e β do MHC II humano/de roedor quiméricos formam um complexo do MHC II quimérico funcional (por exemplo, complexo do MHC II humano/de roedor) numa superfície de uma célula. Em vários aspetos, a primeira sequência de nucleótidos é expressa sob controlo regulador de elementos reguladores e promotores a do MHC II de roedor endógeno. Em vários aspetos, a segunda sequência de nucleótidos é expressa sob controlo regulador de elementos reguladores e promotores β do MHC II de roedor endógeno. Em algumas formas de realização, uma porção de roedor do polipéptido a do MHC II humano/de roedor quimérico compreende domínios transmembranares e citoplasmãticos de um polipéptido a do MHC II de roedor endógeno. Em algumas formas de realização, uma porção de roedor do polipéptido β do MHC II humano/de roedor quimérico contém domínios transmembranares e citoplasmãticos de um polipéptido β do MHC II de roedor endógeno.

Na invenção, o animal não humano é um roedor, e as porções humanas dos polipéptidos α e β do MHC II humano/de roedor quiméricos contêm sequências humanas derivadas da proteína do H LA de classe II selecionada a partir do grupo que consiste em HLAâDR, HLAâDQ e HLAâDP. Em algumas formas de realização da invenção, as porções humanas das sequências a e β do MHC II humano/de roedor quiméricas são derivadas de uma sequência de HLAâDR4 humano; assim, a sequência de nucleótidos que codifica o domínio extracelular α do MHC II é derivada de uma sequência de um gene HLAâDRa*01, e a sequência de nucleótidos que codifica o domínio extracelular β do MHC II é derivada de uma sequência que codifica um gene Η11Α§ΟΕβ1*04.

Em várias formas de realização da invenção, a primeira e a segunda sequências de nucleótidos estão localizadas no mesmo cromossoma. Em alguns aspetos, o animal compreende duas cópias do locus do MHC II que contém a primeira e a segunda sequências de nucleótidos, enquanto noutros aspetos, o animal compreende uma cópia do locus do MHC II que contém a primeira e a segunda sequências de nucleótidos. Assim, o animal pode ser homozigótico ou heterozigótico para o locus do MHC II que contém a primeira e a segunda sequências de nucleótidos.

Em alguns aspetos, o polipéptido a do MHC II quimérico e/ou o polipéptido β do MHC II quimérico são ligados de modo operacional a uma sequência líder não humana.

Numa forma de realização, o roedor é selecionado a partir do grupo que consiste num ratinho e um rato. Assim, em algumas formas de realização, sequências não humanas dos genes α e β do MHC II quimérico são derivados das sequências de nucleótidos que codificam a proteína do MHC II de ratinho, por exemplo, uma proteína Hâ2E de ratinho. Numa forma de realização, o roedor (por exemplo, o ratinho ou o rato) da invenção não expressa polipéptidos do MHC II endógeno funcionais dos seus loci endógenos. Numa forma de realização, em que o roedor é um ratinho, o ratinho não expressa polipéptidos de Hâ2E e Hâ2A endógenos funcionais dos seus loci endógenos.

Assim, em algumas formas de realização, é fornecido um ratinho que contém uma primeira sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido a do MHC II humano/de ratinho quimérico e uma segunda sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido β do MHC II humano/de ratinho quimérico num locus do MHC II de ratinho endógeno, em que uma porção humana do polipéptido a do MHC II quimérico contém um domínio extracelular derivado de um polipéptido α de uma proteína de HLAâDR4 humano e uma porção humana do polipéptido β do MHC II humano/de ratinho quimérico contém um domínio extracelular derivado de um polipéptido β de uma proteína de HLAâDR4 humano, em que uma porção de ratinho do polipéptido a do MHC II quimérico contém domínios transmembranares e citoplasmáticos de uma cadeia α de Hâ2E de ratinho e uma porção de ratinho do polipéptido β do MHC II quimérico contém domínios transmembranares e citoplasmáticos de uma cadeia β de Hâ2E de ratinho, e em que o ratinho expressa um complexo do MHC II de HLAâDR4/Hâ 2E quimérico funcional. Em alguns aspetos, o domínio extracelular do polipéptido a do MHC II quimérico compreende domínios al e a2 humanos; em alguns aspetos, o domínio extracelular do polipéptido β do MHC II quimérico compreende domínios βΐ e β2 humanos. Em algumas formas de realização, uma primeira sequência de nucleótidos é expressa sob controlo regulador de elementos reguladores e promotores a do MHC II de ratinho endógeno, e a segunda sequência de nucleótidos é expressa sob controlo regulador de elementos reguladores e promotores β do MHC II de ratinho endógeno. Em várias formas de realização, o ratinho não expressa polipéptidos do MHC II endógeno funcionais, por exemplo, polipéptidos de Hâ2E e Hâ2A, dos seus loci endógenos. Em alguns aspetos, o ratinho contém duas cópias do locus do MHC II que contém a primeira e a segunda sequências de nucleótidos, enquanto noutros aspetos, o ratinho contém uma cópia do locus do MHC II que contém a primeira e a segunda sequências de nucleótidos.

Os métodos para produzir roedores geneticamente manipulados, por exemplo, ratinhos ou ratos, conforme descrito no presente documento, também são fornecidos. Em várias formas de realização, os roedores, por exemplo, ratinhos ou ratos da invenção são produzidos ao substituir as sequências do MHC II endógeno por sequências de nucleótidos que codificam polipéptidos a e β do MHC II humano/de roedor quimérico (por exemplo, humano/de ratinho). Numa forma de realização, a invenção fornece um método para modificar um locus do MHC II de um roedor (por exemplo, um ratinho ou um rato) para expressar um complexo do MHC II humano/de roedor quimérico que inclui substituir uma sequência de nucleótidos que codifica um complexo do MHC II de roedor por uma sequência de nucleótidos que codifica um complexo do MHC II humano/de roedor quimérico no locus do MHC II de ratinho endógeno. Num aspeto do método, a sequência de nucleótidos que codifica o complexo do MHC II humano/de roedor quimérico contém uma primeira sequência de nucleótidos que codifica um domínio extracelular de uma cadeia a do MHC II humano e domínios transmembranares e citoplasmáticos de uma cadeia α do MHC II de roedor e uma segunda sequência de nucleótidos que codifica um domínio extracelular de uma cadeia β do MHC II humano e domínios transmembranares e citoplasmáticos de uma cadeia β do MHC II de roedor. Em alguns aspetos, uma porção de roedor do complexo do MHC II quimérico é derivada de uma proteína Hâ2E de ratinho, e uma porção humana é derivada de uma proteína de HLAâDR4 humano. Em algumas formas de realização, a substituição do loci do MHC II endógeno descrita no presente documento é realizada numa célula ES única, e a célula ES única é introduzida num embrião de roedor (por exemplo, ratinho ou rato) para produzir um roedor geneticamente modificado (por exemplo, ratinho ou rato).

Também são descritas no presente documento células, por exemplo, células que apresentam antigénio isoladas, derivadas dos roedores, por exemplo, ratinhos ou ratos, descritos no presente documento. Os tecidos e embriões derivados dos roedores também são descritos.

Qualquer uma das formas de realização e aspetos descritos no presente documento podem ser utilizados em conjunto uns com os outros, a menos que indicado de outra forma ou evidente a partir do contexto. Outras formas de realização tornarâseâão evidentes para o perito na especialidade a partir de uma análise da descrição detalhada subsequente. A descrição detalhada a seguir inclui representações exemplificativas de várias formas de realização da invenção, que não são restritivas da invenção conforme reivindicada. As Figuras anexas constituem uma parte desta especificação e, em conjunto com a descrição, servem apenas para ilustrar as formas de realização e não para limitar a invenção.

Breve descrição dos desenhos A Figura 1 é um desenho esquemático da molécula do MHC de classe II expressa na superfície de uma célula que apresenta antigénio (APC), que contém quatro domínios: al, a2, βΐ e β2. 0 círculo cinza representa um péptido ligado à fenda de ligação peptídica. A Figura 2 é uma representação esquemática (não à escala) da estrutura genómica relativa do HLA humano, que mostra genes de classes I, II e III. A Figura 3 é uma representação esquemática (não à escala) da estrutura genómica relativa do MHC de ratinho, que mostra genes de classes I, II e III.

As Figuras 4 (A a D) são uma ilustração esquemática (não à escala) da estratégia para gerar um vetor direcionado que contém IâE β e lâE α humanizados (isto é, quimera de Hã 2Ep/HLAâDRpl*04 e Hâ2Ea/HLAâDRa*01, respetivamente). Na Figura 4C, a sequência do MHC II humanizado final da Figura 4B é ligada entre sítios de restrição de PlâScel e lâCeul do construto final da Figura 4A, para gerar um construto que compreende MHC II humanizado e exâo 1 de lâEa do BALB/c. Pg = pseudogene; BHR = recombinação homóloga bacteriana; CM = cloranfenicol; spec = espectinomicina; hyg = higromicina; neo = neomicina; EP = eletroporação. Os triH ngulos representam exões, os triS ngulos preeniflos representam exões de ratinho do ratinho C57BL/6 (com a exceção dos triS ngulos com riscas, que representamo exão 1 de IâEa do ratinho BALB/c) e triB ngulos abertos que representam exões humanos. A Figura 5 mostra uma ilustração esquemática, não à escala, de genes IâE e IâA do MHC de classe II, que mostram o knockout do locus de ratinho com a utilização de uma cassete de higromicina, seguido pela introdução de um vetor que compreende um IâE β e IâE α humanizados (isto é, quimera de Hâ2Eβ/HLAâDRβl*04 e Hâ2 Ea / HLAâDRoí* 01, respetivamente) . Os triE3 ngulos vazios representam goes humanos; os triS ngulos preenchidos representam exõe de ratinho. As sondas utilizadas para genotipagem têm um círculo à volta. A Figura 6 mostra uma ilustração esquemática, não à escala, de remoção mediada por Cre da cassete de neomicina da Figura 5. Os triângulos vazios representam exões humanos; os triângulos preenchidos representam exões de ratinho. Os dois filamentos superiores representam os loci do MHC II em ratinho heterozigótico de MHC II humanizado que abrigam uma cassete de seleção de neomicina, e os dois filamentos inferiores representam os loci do MHC II em ratinho heterozigótico de MHC II humanizado com a cassete de neomicina removida. A Figura 7 mostra uma ilustração comparativa esquemática, não à escala, de loci de classe II de ratinho e humanos. Os genes de classe II são representados por caixas, e as caixas vazias representam pseudogenes. Os tamanhos relativos (kb) de vários fragmentos de ácido nucleico estão incluídos. A Figura 8, no painel esquerdo, é uma ilustração esquemática (não à escala) da estratégia de humanização para a cadeia a do MHC II; em particular, a Figura mostra uma substituição de domínios al e a2, codificados por exões 2 e 3 do gene a do MHC II, enquanto retém sequências de caudas transmembranares e citoplasmãticas de ratinho. No locus humanizado, a sequência líder a do MHC II é derivada da estirpe de ratinho BALB/c. 0 painel direito ilustra a humanização da cadeia β do MHC II; em particular, a Figura mostra uma substituição de domínios [31 e β2, codificados por exões 2 e 3 do gene β do MHC II, enquanto retém as sequências líderes de ratinho e de caudas transmembranares e citoplasmãticas de ratinho. A fileira superior é toda de sequências humanas; a fileira intermediária é toda de sequências de ratinho; a fileira inferior é toda de sequências humanizadas com os exões 2 e 3 derivados dos genes do HLAâDR humano. A Figura 9 mostra análise de FACS com o anticorpo antiâ HLAâDR de células B a partir de um heterozigoto de ratinho para um HLAâDR4 quimérico (cassete de neo removida) na presença (1681HET + poli(I:C)) ou ausência (1681HET) de poli (I:C), e um ratinho do tipo selvagem (ratinho WT) .

Descrição detalhada da invenção Definições A presente invenção fornece roedores geneticamente modificados (por exemplo, ratinhos, ratos, coelhos, etc.) que expressam o polipéptido do MHC II humano ou humanizado; assim como métodos para produzir os mesmos; a menos que definido de outra forma, todos os termos e frases utilizados no presente documento incluem os significados que os termos e as frases adquiriram na técnica, a menos que o contrário esteja claramente indicado ou claramente evidente a partir do contexto no qual o termo ou a frase é utilizado. 0 termo "conservador", quando utilizado para descrever uma substituição de aminoácido conservadora, inclui a substituição de um resíduo de aminoácido por outro resíduo de aminoácido que tem um grupo R de cadeia lateral com propriedades químicas semelhantes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade) . As substituições de aminoácido conservadoras podem ser alcançadas ao modificar uma sequência de nucleótidos de modo a introduzir uma alteração de nucleótido que codificará a substituição conservadora. Em geral, uma substituição de aminoácido conservadora não alterará substancialmente as propriedades funcionais de interesse de uma proteína, por exemplo, a capacidade de o MHC II apresentar um péptido de interesse. Exemplos de grupos de aminácidos que têm cadeias laterais com propriedades químicas semelhantes incluem cadeias laterais alifáticas, tais como glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; cadeias laterais de hidroxilo alifático, tais como serina e treonina; cadeias laterais que contêm amida, tais como asparagina e glutamina; cadeias laterais aromáticas, tais como fenilalanina, tirosina e triptofano; cadeias laterais básicas, tais como lisina, arginina e histidina; cadeias laterais ácidas, tais como ácido aspártico e ácido glutâmico; e cadeias laterais que contêm enxofre, tais como cisteína e metionina. Grupos de substituição de aminoácido conservadora incluem, por exemplo, valina/leucina/isoleucina, fenilalanina/tirosina, lisina/arginina, alanina/valina, glutamato/aspartato e asparagina/glutamina. Em algumas formas de realização, uma substituição de aminoácido conservativa pode ser uma substituição de qualquer resíduo nativo numa proteína por alanina, conforme utilizado, por exemplo, em mutagénese de varrimento por alanina. Em algumas formas de realização, é realizada uma substituição conservadora que tem um valor positivo na matriz de verosimilhança logarítmica de PAM250 apresentada em Gonnet et al. ( (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443 a 1445). Em algumas formas de realização, a substituição é uma substituição moderadamente conservadora, em que a substituição tem um valor não negativo na matriz de verosimilhança logarítmica de ΡΆΜ250.

Assim, também é abrangido pela invenção um roedor geneticamente modificado cujo genoma contém uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido do MHC II humano ou humanizado, em que o polipéptido contém substituições de aminoácido conservadoras na sequência de aminoácidos descrita no presente documento. 0 perito na especialidade compreenderia que além dos resíduos de ácido nucleico que codificam um polipéptido do MHC II humano ou humanizado descritos no presente documento, devido à degeneração do código genético, outros ácidos nucleicos podem codificar o polipéptido da divulgação. Portanto, além de um roedor geneticamente modificado que contém uma sequência de nucleótidos que codifica o polipéptido do MHC II com substituições de aminoácido conservadoras no seu genoma, também é fornecido um roedor cujo genoma contém uma sequência de nucleótidos que difere daquela descrita no presente documento devido à degeneração do código genético. 0 termo ®identidade®, quando utilizado em conjunto com a sequência, inclui a identidade conforme determinada por vários algoritmos diferentes conhecidos na técnica que podem ser utilizados para medir a identidade de sequência de nucleótidos e/ou de aminoácidos. Em algumas formas de realização descritas no presente documento, as identidades são determinadas com a utilização de um alinhamento ClustalW v. 1.83 (lento) que emprega uma penalidade por lacuna aberta de 10,0, uma penalidade por extensão de lacuna de 0,1, e com a utilização de uma matriz de similaridade de Gonnet (MacVector™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008). O comprimento das sequências comparado em relação à identidade de sequências dependerá das sequências particulares. Em várias formas de realização, a identidade é determinada ao comparar a sequência de uma proteína madura do seu Nâterminal ao seu Câ terminal. Em várias formas de realização, ao comparar uma sequência humana/de roedor quimérica com uma sequência humana, a porção humana da sequência humana/de roedor quimérica (mas não a porção não humana) é utilizada na realização de uma comparação, com o propósito de verificar um nível de identidade entre uma sequência humana e uma porção humana de uma sequência humana/de roedor quimérica (por exemplo, ao comparar um ectodomínio humano de uma proteína humana/de ratinho quimérica com um ectodomínio humano de uma proteína humana).

Os termos ®homologia® ou ®homólogo® em referência às sequências, por exemplo, sequências de nucleótidos ou de aminoácidos, significam duas sequências que, mediante o alinhamento ideal e a comparação, são idênticas em pelo menos cerca de 7 5% de nucleótidos ou aminãcidos, pelo menos cerca de 80% de nucleótidos ou aminãcidos, pelo menos cerca de 90 a 95% de nucleótidos ou aminãcidos, por exemplo, mais que 97% de nucleótidos ou aminãcidos. Um perito na especialidade compreenderia que, para direcionamento de gene ideal, o construto de direcionamento deve conter braços homólogos às sequências de ADN endógenas (isto é, ®braços de homologia®); assim, a recombinação homóloga pode ocorrer entre o construto de direcionamento e a sequência endógena alvo. 0 termo ®ligado de modo operacional® refereâse a uma justaposição em que os componentes assim descritos estão numa relação que permite que os mesmos funcionem da sua maneira pretendida. Sendo assim, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína pode ser ligada de modo operacional às sequências reguladoras (por exemplo, sequência promotora, acentuadora, silenciadora, etc.) de modo a reter a regulação transcricional apropriada. Além disso, várias porções da proteína quimérica ou humanizada podem ser ligadas de modo operacional para reter a flexão, o processamento, o direcionamento, a expressão e outras propriedades funcionais apropriadas da proteína na célula. A menos que indicado de outra forma, vários domínios da proteína quimérica ou humanizada descrita no presente documento estão ligados de modo operacional entre si.

Os termos ®complexo do MHC II®, ®proteína do MHC II® ou semelhantes, conforme utilizados no presente documento, incluem o complexo entre um polipéptido a do MHC II e um polipéptido β do MHC II. 0 termo ®polipéptido a do MHC II® ou ®polipéptido β do MHC II® (ou semelhantes), conforme utilizado no presente documento, inclui o polipéptido a do MHC II sozinho ou polipéptido β do MHC II sozinho, respetivamente. De modo semelhante, os termos ®complexo de HLAâDR4®, ®proteína de HLAâDR4®, ®complexo de Hâ2E®, ®proteína de Hâ2E® ou semelhantes, referemâse ao complexo entre os polipéptidos α e β. Tipicamente, os termos ®MHC humano® e ®HLA® são utilizados de forma intercambiável. 0 termo ®substituição®, em referência à substituição de gene, refereâse à colocação de material genético exógeno num locus genético endógeno, substituindo, assim, toda ou uma porção do gene endógeno por uma sequência de ácidos nucleicos ortóloga ou homóloga. Conforme demonstrado nos Exemplos abaixo, a sequência de ácidos nucleicos de locus do MHC II endógeno foi substituída por uma sequência de nucleótidos que compreende sequências que codificam porções de polipéptidos cx e β do MHC II humano; especificamente, que codificam as porções extracelulares dos polipéptidos a e β do MHC II. ®Funcional®, conforme utilizado no presente documento, por exemplo, em referência a um polipéptido funcional, refereâ se a um polipéptido que retém pelo menos uma atividade biológica normalmente associada à proteína nativa. Por exemplo, em algumas formas de realização da invenção, uma substituição num locus endógeno (por exemplo, a substituição num locus do MHC II não humano endógeno) resulta num locus que falha em expressar um polipéptido endógeno funcional.

Animais com MHC II geneticamente modificado Em vários aspetos, a invenção fornece geralmente roedores geneticamente modificados que contêm uma sequência de nucleótidos que codifica um complexo do MHC II humano ou humanizado no seu genoma; assim, os animais expressam um complexo do MHC II humano ou humanizado (por exemplo, polipéptidos α e β do MHC II).

Os genes do MHC são categorizados em três classes: classe I, classe II e classe III, todas as quais são codificadas no cromossoma humano 6 ou no cromossoma de ratinho 17. Um esquema da organização relativa das classes de MHC humano ou de ratinho é apresentado nas Figuras 2 e 3, respetivamente. A maior parte dos genes do MHC é polimórfica, de facto, os mesmos são os genes mais polimórficos dos genomas de ratinho e humanos. Presumeâse que os polimorfismos do MHC sejam importantes para proporcionar uma vantagem evolutiva; alterações na sequência podem resultar em diferenças na ligação peptídica que permitem uma melhor apresentação de antigénio. Uma exceção é a cadeia do HLAâDRa humano e seu homólogo de ratinho, Ea (isto é, Hâ2Ea), que são monomórficos. 0 complexo do MHC de classe II compreende dois domínios com ligação não covalente: uma cadeia α e uma cadeia β, também denominadas no presente documento como um polipéptido α e um polipéptido β (Figura 1). A proteína abrange a membrana plasmática,· assim, a mesma contém um domínio extracelular, um domínio transmembranar e um domínio citoplasmático. A porção extracelular da cadeia α inclui domínios al e «2, e a porção extracelular da cadeia β inclui domínios βΐ e β2. Os domínios al e βΐ formam uma fenda de ligação peptídica na superfície de célula. Devido à confirmação tridimensional da fenda de ligação peptídica do complexo do MHC II, não há, teoricamente, nenhum limite superior no comprimento do antigénio ligado, mas, tipicamente, os péptidos apresentados por MHC II têm entre 13 e 17 aminãcidos de comprimento.

Além da sua interação com os péptidos antigénicos, a fenda de ligação peptídica da molécula de MHC II interage com a cadeia invariante (li) durante os processos de formação de complexo do MHC II e aquisição de péptido. Os dímeros do MHC II α/β formamâse no retículo endoplasmático e associamâ se à cadeia li, que é responsável pelo controlo da ligação peptídica e direcionamento do MHC II na via endocítica. No endossoma, li sofre proteólise, e um pequeno fragmento de li, péptido de cadeia invariante associado à Classe II (CLIP), permanece na fenda de ligação peptídica. No endossoma, sob o controlo de HLAâDM (em seres humanos), o CLIP é permutado por péptidos antigénicos. 0 MHC II interage com o coârecetor de célula T CD4 na fissura hidrofóbica na junção entre os domínios «2 e β2. Wang e Reinherz (2002), Structural Basis of T Cell Recognition of Peptides Bound to MHC Molecules, Molecular Immunology, 38:103 9 a 1049. Quando CD4 e o recetor de célula T se ligam à mesma molécula de MHC II complexada com um péptido, a sensibilidade de uma célula T ao antigénio é aumentada, e exige 100 vezes menos antigénio para a ativação. Consulte, Janeway's Immunobiology, 7o edição, Murphy et al. eds., Garland Science, 2008.

Inúmeras funções foram propostas para domínios transmembranares e citoplasmáticos de MHC II. No caso de domínio citoplasmático, o mesmo mostrouâse importante para a sinalização intracelular, o tráfego para a membrana plasmática e, finalmente, a apresentação de antigénio. Por exemplo, foi demonstrado que os hibridomas de célula T respondem fracamente às células que apresentam antigénio (APCs) transfetadas com cadeias β do MHC II truncadas no domínio citoplasmático, e a indução de diferenciação de célula B é dificultada. Consulte, por exemplo, Smiley et al. (1996) Truncation of the class II β§ο1ΐ3Ϊη cytoplasmic domain influences the level of class Il/invariant chainâ derived peptide complexes, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 93:241 a 244. 0 truncamento de moléculas de classe II parece prejudicar a produção de cAMP. Postulouâse que a deleção da cauda citoplasmática de MHC II afeta o tráfego intracelular, impedindo, assim, que o complexo se encontre com antigénios relevantes na via endocítica. Smiley et al. {supra) demonstraram que o truncamento de moléculas de classe II no domínio citoplasmático reduz a quantidade de complexos de CLIP/Classe II, postulando que isso afeta a capacidade do CLIP para regular de modo eficaz a apresentação de antigénio.

Admitiuâse como hipótese que, visto que o agrupamento de MHC II é importante para o desencadeamento de recetor de célula T (TCR) , caso as moléculas do MHC II truncadas no domínio citoplasmático tenham sido impedidas de se ligarem ao citoesqueleto e, assim, de se agregarem, a apresentação de antigénio às células T seria afetada. OstrandâRosenberg et al. (1991) Abrogation of Tumorigenicity by MHC Class II Antigen Expression Requires the Cytoplasmic Domain of the Class II Molecule, J. Immunol. 147:2419 a 2422. De facto, foi recentemente mostrado que o HLAâDR truncado no domínio citoplasmático falhou em associarâse ao citoesqueleto após a oligomerização. EI Fakhy et al. (2004) Delineation of the HLAâDR Region and the Residues Involved in the Association with the Cytoskeleton, J. Biol. Chem. 279:18472 a 18480.

Importantemente, o citoesqueleto de actina é um sítio de atividade de transdução de sinal localizada, que pode causar a apresentação de antigénio. Além da associação com o citoesqueleto, estudos recentes também mostraram que até 20% de todas as moléculas de HLAâDR residem constitutivamente nas balsas lipídicas de APCs, que são microdomínios ricos em colesterol e glicoesfingolípidos, e que tal localização é importante para a apresentação de antigénio, formação de sinapse imunitária e sinalização mediada por MHC II. Consulte, por exemplo, Dolan et al. (2004) Invariant Chain and the MHC II Cytoplasmic Domains Regulate Localization of MHC Class II Molecules to Lipid Rafts in Tumor CellâBased Vaccines, J. Immunol. 172:907 a 914. Dolan et al. sugeriram que o truncamento de domínio citoplasmático de MHC II reduz a localização constitutiva de MHC II para balsas lipídicas.

Além disso, o domínio citoplasmático de MHC II, em particular, a cadeia β, contém um resíduo de leucina que é submetido à ubiquitinação por ubiquitina ligase, RINGâCH I associado à membrana (MARCH I) , que controla o tráfego endocítico, a internalização e a degradação de MHC II; e foi mostrado que a ubiquitinação mediada por MARCH cessa mediante a maturação de célula dendrítica que resulta no aumento de níveis de MHC II na membrana plasmática. Shin et al. (2006) Surface expression of MHC class II in dendritic

cells is controlled by regulated ubiquitination. Nature 444:115 a 118; De Gassart et al. (2008) MHC class II stabilization at the surface of human dendritic cells is the result of maturationâdependent MARCH I downâregulation, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 105:3491 a 3496.

Os domínios transmembranares de cadeias a e β de MHC II interagem entre si e essa interação é importante para a montagem apropriada de complexo do MHC de classe II. Cosson e Bonifacino (1992), Role of Transmembrane Domain Interactions in the Assembly of Class II MHC Molecules, Nature 258:659 a 662. De facto, as moléculas do MHC II em que os domínios transmembranares das cadeias a e β foram substituídos pela cadeia α de recetor de ILâ2 foram retidas no ER e foram dificilmente detetáveis na superfície de célula. Id. Através de estudos de mutagénese, verificouâse que os resíduos de Gly conservados nos domínios transmembranares são responsáveis pela montagem de MHC II na superfície de célula. Id. Assim, os domínios tanto transmembranares quanto citoplasmáticos são cruciais para o funcionamento apropriado do complexo do MHC II.

Em várias formas de realização, a invenção fornece um roedor geneticamente modificado (por exemplo, ratinho, rato, etc.) que contém uma sequência de nucleótidos que codifica um complexo do MHC II humano ou humanizado no seu genoma, por exemplo, um polipéptido (ou polipéptidos) α e/ou β do MHC II humano ou humanizado. 0 roedor pode conter uma sequência de nucleótidos que codifica um complexo do MHC II que é parcialmente humano e parcialmente de roedor no seu genoma, por exemplo, um roedor que expressa um complexo do MHC II humano/de roedor quimérico (por exemplo, um roedor que expressa polipéptidos α e β do MHC II humano/de roedor quiméricos). Num aspeto, o roedor expressa apenas o complexo do MHC II humano ou humanizado, por exemplo, um complexo do MHC II humano/de roedor quimérico, e não expressa um complexo do MHC II não humano endógeno de um locus do MHC II endógeno. Em algumas formas de realização, o animal é incapaz de expressar qualquer complexo do MHC II de roedor endógeno de um locus do MHC II endógeno, mas expressa apenas o complexo do MHC II humano ou humanizado. Em várias formas de realização, o roedor geneticamente modificado (por exemplo, ratinho, rato, etc.) contém uma sequência de nucleótidos que codifica um complexo do MHC II humano ou humanizado na sua linha germinal, por exemplo, um polipéptido (ou polipéptidos) α e/ou β do MHC II humano ou humanizado.

Num aspeto, um complexo do MHC II humano/de roedor quimérico é descrito no presente documento. Num exemplo, o complexo do MHC II humano/de roedor quimérico contém um polipéptido a do MHC II humano/de roedor quimérico e um polipéptido β do MHC II humano/de roedor quimérico. Num aspeto, uma porção humana do polipéptido a do MHC II quimérico e/ou uma porção humana do polipéptido β do MHC II quimérico contêm um domínio de ligação peptídica de um polipéptido a do MHC II humano e/ou polipéptido β do MHC II humano, respetivamente. Num aspeto, uma porção humana do polipéptido α e/ou β do MHC II quimérico contém um domínio extracelular de um polipéptido α e/ou β do MHC II humano, respetivamente. Num exemplo, uma porção humana do polipéptido a do MHC II quimérico contém o domínio al de um polipéptido a do MHC II humano; num outro exemplo, uma porção humana do polipéptido a do MHC II quimérico contém domínios al e a2 de um polipéptido a do MHC II humano. Num exemplo adicional, uma porção humana do polipéptido β do MHC II quimérico contém o domínio βΐ de um polipéptido β do MHC II humano; num outro exemplo, uma porção humana do polipéptido β do MHC II quimérico contém domínios βΐ e β2 de um polipéptido β do MHC II humano. A porção humana dos polipéptidos α e β do MHC II descritos no presente documento pode ser codificada por qualquer um dos loci de HLAâDP, HLAâDQ e HLAâDR. Uma lista de antigénios e alelos de HLA comummente utilizados é descrita em Shankarkumar et al. ((2004) The Human Leukocyte Antigen (HLA) System, Int. J. Hum. Genet. 4(2) :91 a 103) . Shankarkumar et al. também apresentam uma breve explicação da nomenclatura de HLA utilizada na técnica. Informações adicionais referentes à nomenclatura de HLA e vários alelos de HLA podem ser encontradas tanto em Holdsworth et al. (2009) The HLA dictionary 2008: a summary of HLAâA, âB, âC, âDRBl/3/4/5, and DQB1 alleles and their association with serologically defined HLAâA, âB, âC, âDR, and -DQ antigens, Tissue Antigens 73:95 a 170, quanto numa atualização recente por Marsh et al. (2010), Nomenclature for factors of the HLA system, 2010, Tissue Antigens 75:291 a 455. Assim, o polipéptido do MHC II humano ou humanizado pode ser derivado de quaisquer moléculas do HLA humano funcionais descritas nos mesmos.

Num aspeto específico, as porções humanas do complexo do MHC II humanizado descrito no presente documento são derivadas de HLAâDR humano, por exemplo, HLAâDR4. Tipicamente, as cadeias α de HLAâDR são monomórficas, por exemplo, a cadeia α de complexo de HLAâDR é codificada pelo gene HLAâDRA (por exemplo, gene HLAâDRa*01). Por outro lado, a cadeia β de HLAâDR é polimórfica. Assim, HLAâDR4 contém uma cadeia α codificada pelo gene HLAâDRA e uma cadeia β codificada pelo gene HLAâDRBl (por exemplo, gene HLAâDRβl*04). Conforme descrito no presente documento abaixo, o HLAâDR4 é conhecido por estar associado à incidência de várias doenças autoimunes, por exemplo, artrite reumatoide, diabetes tipo I, esclerose múltipla, etc. Num exemplo, o alelo de HLAâDRA é o alelo de HLAâDRa*01, por exemplo, HLAâDRa*01:01:01:01. Noutro exemplo, o alelo de HLAâDRB é Ηυ^ϋΝβ1*04, por exemplo, HLAâDRβl*04:01:01. Embora os presentes Exemplos descrevam essas sequências de HLA particulares; quaisquer sequências de HLAâDR adequadas são abrangidas no presente documento, por exemplo, variantes polimórficas exibidas na população humana, sequências com uma ou mais modificações de aminoácidos conservativas ou não conservativas, sequências de ácidos nucleicos que diferem das sequências descritas no presente documento devido à degeneração de código genético, etc.

As porções humanas do complexo do MHC II humanizado podem ser codificadas pelas sequências de nucleótidos de alelos de HLA conhecidos por estarem associados às doenças humanas comuns. Tais alelos de HLA incluem, mas sem limitação, HLAâ DRB1*0401, âDRBl*0301, âDQAl*0501, âDQBl*0201, DRB1*1501, â DRB1*1502, âDQBl*0602, âDQAl*0102, âDQAl*0201, âDQBl*0202, âDQAl*0501 e combinações dos mesmos. Para um resumo de associações de alelo de HLA/doença, vejaâse Bakker et al. (2006) A highâresolution HLA and SNP haplotype map for disease association studies in the extended human MHC, Nature Genetics 38:1166 a 1172 e Informações Suplementares.

Num aspeto, uma porção de roedor do complexo do MHC II humano/de roedor quimérico compreende domínios transmembranares e/ou citoplasmáticos de um complexo do MHC II de roedor endógeno, por exemplo, ratinho, rato, etc. Assim, uma porção de roedor do polipéptido α do MHC II humano/de roedor quimérico pode compreender domínios transmembranares e/ou citoplasmáticos de um polipéptido a do MHC II não humano endógeno. Uma porção de roedor do polipéptido β do MHC II humano/de roedor quimérico pode compreender domínios transmembranares e/ou citoplasmáticos de um polipéptido β do MHC II de roedor endógeno. Num aspeto, o animal é um ratinho, e porções não humanas dos polipéptidos a e β quiméricos são derivadas de uma proteína Hâ2E de ratinho. Assim, porções não humanas dos polipéptidos α e β quiméricos podem compreender domínios transmembranares e citoplasmáticos derivados de uma proteína Hâ2E de ratinho. Embora sequências de Hâ2E específicas sejam contempladas nos Exemplos, quaisquer sequências adequadas, por exemplo, variantes polimórficas, substituições de aminoácido conservadoras/não conservadoras, etc., são abrangidas no presente documento.

Em vários aspetos da invenção, a sequência (ou sequências) que codifica um complexo do MHC II humano/de roedor quimérico está localizada num locus do MHC II de roedor endógeno (por exemplo, locus de Hâ2A e/ou Hâ2E de ratinho). Numa forma de realização, isso resulta numa substituição de um gene (ou genes) do MHC II endógeno ou uma porção do mesmo por uma sequência (ou sequências) de nucleótidos que codifica uma proteína do MHC II humana ou humanizada, por exemplo, um gene quimérico que codifica uma proteína de MHC II humana/de roedor quimérica descrita no presente documento. Visto que as sequências de nucleótidos que codificam polipéptidos a e β do MHC II estão localizadas próximas entre si no cromossoma, uma substituição pode ser projetada para focalizar os dois genes independentemente ou em conjunto; ambas as possibilidades são abrangidas no presente documento. Numa forma de realização, a substituição compreende uma substituição de uma sequência de nucleótidos endógena que codifica polipéptidos a: e β do MHC II por uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido a do MHC humano/de roedor quimérico e um polipéptido β do MHC humano/de roedor quimérico. Num aspeto, a substituição compreende substituir sequências de nucleótidos que representam um ou mais (por exemplo, dois) genes do MHC II endógenos. Assim, o roedor contém uma sequência de nucleótidos humana/de roedor quimérica num locus do MHC II endógeno e expressa uma proteína de MHC II humana/de roedor quimérica do locus de roedor endógeno,

Assim, é fornecido no presente documento um roedor que contém uma primeira sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido a do MHC II humano/de roedor quimérico e uma segunda sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido β do MHC II humano/de roedor quimérico num locus de gene do MHC II endógeno, em que uma porção humana do polipéptido a. do MHC II humano/de roedor quimérico contém um domínio extracelular a do MHC II humano e uma porção humana do polipéptido β do MHC II humano/não humano quimérico contém um domínio extracelular β do MHC II humano, e em que os polipéptidos a do MHC II e β do MHC II humanos/não humanos quiméricos formam um complexo do MHC II funcional numa superfície de uma célula.

Um polipéptido humano/não humano quimérico pode ser tal que contenha uma sequência líder (sinalizadora) humana ou não humana. Numa forma de realização, o polipéptido a do MHC II quimérico compreende uma sequência líder de roedor de um polipéptido a do MHC II endógeno. Numa forma de realização, o polipéptido β do MHC II quimérico compreende uma sequência líder de roedor de um polipéptido β do MHC II endógeno. Numa forma de realização alternativa, o polipéptido a do MHC II e/ou β do MHC II quimérico contém uma sequência líder de roedor de polipéptido a do MHC II e/ou β do MHC II, respetivamente, de outro roedor ou outra estirpe de ratinho. Assim, a sequência de nucleótidos que codifica o polipéptido a do MHC II e/ou β do MHC II quimérico pode ser ligada de modo operacional a uma sequência de nucleótidos que codifica uma sequência líder de a do MHC II e/ou β do MHC II de roedor, respetivamente. Ainda noutra forma de realização, o polipéptido a do MHC II e/ou β do MHC II quimérico contém uma sequencia líder humana de polipêptido a: do MHC II humano e/ou β do MHC II humano, respetivamente (por exemplo, uma sequência líder de HLAâDRA humano e/ou HLAâDR31*04 humano, respetivamente).

Um polipêptido a do MHC II e/ou β do MHC II humano/de roedor quimérico pode conter um domínio extracelular completo ou substancialmente completo de um polipêptido α do MHC II humano e/ou β do MHC II humano, respetivamente, na sua porção humana. Assim, uma porção humana pode conter pelo menos 80%, de preferência pelo menos 85%, e mais preferencialmente pelo menos 90%, por exemplo, 95% ou mais dos aminácidos que codificam um domínio extracelular de um polipêptido a do MHC II humano e/ou β do MHC II humano (por exemplo, HLAâDRA humano e/ou ΗΚΑ§ϋΗβ1*04 humano). Num exemplo, um domínio extracelular substancialmente completo do polipêptido a do MHC II humano e/ou β do MHC II humano carece de uma sequência líder humana. Noutro exemplo, o polipêptido a do MHC II humano/de roedor quimérico e/ou β do MHC II humano/de roedor quimérico compreende uma sequência líder humana.

Além disso, o polipêptido a do MHC II e/ou β do MHC II quimérico pode ser expresso sob o controlo de elementos reguladores e promotores de roedor endógeno, por exemplo, elementos reguladores a do MHC II e/ou β do MHC II de ratinho, respetivamente. Tal disposição facilitará a expressão apropriada dos polipéptidos do MHC II quiméricos no roedor, por exemplo, durante a resposta imunitária no roedor.

Um animal não humano geneticamente modificado pode ser um ratinho, um rato, um coelho, um porco, um bovino (por exemplo, vaca, touro, búfalo), um veado, uma ovelha, uma cabra, uma galinha, um gato, um cão, um furão, um primata (por exemplo, sagui, macacoârhesus). Para os roedores em que as células ES geneticamente modificáveis adequadas não estão prontamente disponíveis, outros métodos são empregues para produzir um roedor que contenha a modificação genética. Tais métodos incluem, por exemplo, modificar um genoma de célula não ES (por exemplo, um fibroblasto ou uma célula muitipotencial induzida) e empregar a transferência nuclear para transferir o genoma modificado para uma célula adequada, por exemplo, um oócito, e gestar a célula modificada (por exemplo, o oócito modificado) num roedor sob condições adequadas para formar um embrião.

Num aspeto, o não roedor é da superfamília Dipodoidea ou Muroidea. Numa forma de realização, o roedor é selecionado de entre um ratinho, um rato e um hámster. Numa forma de realização, o roedor é selecionado da superfamília Muroidea. Numa forma de realização, o animal geneticamente modificado é de uma família selecionada de entre Calomyscidae (por exemplo, hãmsteres semelhantes a ratinho), Cricetidae (por exemplo, hámsters, ratos e ratinhos do Novo Mundo, lirão), Muridae (ratinhos e ratos verdadeiros, gerbos, ratinhos espinhosos, ratos com crista), Nesomyidae (ratinhos escaladores, ratinhos de rocha, ratos de cauda branca, ratos e ratinhos malgaxe), Platacanthomyidae (por exemplo, arganazes espinhosos) e Spalacidae (por exemplo, ratosâtoupeira, ratos de bambu e zokors). Numa forma de realização específica, o roedor geneticamente modificado é selecionado de entre um ratinho ou rato verdadeiro (família Muridae), um gerbo, um ratinho espinhoso e um rato de crista. Numa forma de realização, o ratinho geneticamente modificado é de um membro da família Muridae. Numa forma de realização, o animal é um roedor. Numa forma de realização específica, o roedor ê selecionado de entre um ratinho e um rato. Numa forma de realização, o roedor é um ratinho.

Numa forma de realização específica, o roedor é um ratinho de uma estirpe C57BL selecionada dentre C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C5 7BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/5NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr e C57BL/01a. Noutra forma de realização, o ratinho é uma estirpe 129 selecionada a partir do grupo que consiste numa estirpe que é 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (por exemplo, 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 12959/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (consulte, por exemplo, Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian genoma 10:836, vejaâse também, Auerbach et al (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEvâ and C57BL/6âDerived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). Numa forma de realização específica, o ratinho geneticamente modificado é uma mistura de uma estirpe 129 supracitada e uma estirpe C57BL/6 supracitada. Noutra forma de realização específica, o ratinho é uma mistura de estirpes 129 supracitadas, ou uma misturada de estirpes BL/6 supracitadas. Numa forma de realização específica, a estirpe 129 da mistura é uma estirpe 129S6 (129/SvEvTac). Noutra forma de realização, o ratinho é uma estirpe BALB, por exemplo, estirpe BALB/c. Ainda noutra forma de realização, o ratinho é uma mistura de uma estirpe BALB e outra estirpe supracitada.

Numa forma de realização, o roedor é um rato. Numa forma de realização, o rato é selecionado de entre um rato Wistar, uma estirpe LEA, uma estirpe Sprague Dawley, uma estirpe Fischer, F344, F6 e Dark Agouti. Numa forma de realização, a estirpe de rato é uma mistura de duas ou mais estirpes selecionadas a partir do grupo que consiste em Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 e Dark Agouti.

Assim, numa forma de realização, a invenção refereâse a um ratinho geneticamente modificado que compreende uma sequência de nucleótidos que codifica um complexo do MHC II humano/de ratinho quimérico no seu genoma, por exemplo, polipéptidos oí e β do MHC II humano/de ratinho quiméricos. Numa forma de realização, uma porção humana do polipéptido α do MHC II humano/de ratinho quimérico contém um domínio extracelular ou ligação peptídica a do MHC II humano e uma porção humana do polipéptido β do MHC II humano/de ratinho quimérico contém um domínio extracelular ou ligação peptídica β do MHC II humano. Em algumas formas de realização, o ratinho não expressa uma ligação peptídica ou um domínio extracelular de polipéptido α e/ou β de ratinho endógeno de um locus endógeno de ratinho (por exemplo, locus de Hâ2A e/ou Hâ2E) . Em algumas formas de realização, o ratinho contém um genoma que carece de um gene que codifique uma molécula de MHC de classe II funcional que contém um Hâ 2Abl, Hâ2Aa, Hâ2Ebl, Hâ2Eb2, Hâ2Ea e uma combinação dos mesmos. 0 domínio de ligação peptídica do polipéptido α do MHC II humano pode conter o domínio al e o domínio de ligação peptídica do polipéptido β do MHC II humano pode conter um domínio βΐ; assim, o domínio de ligação peptídica do complexo do MHC II quimérico pode conter domínios al e βΐ humanos. 0 domínio extracelular do polipéptido a do MHC II humano pode conter domínios al e a2 e o domínio extracelular do polipéptido β do MHC II humano pode conter domínios βΐ e β2; assim, o domínio extracelular do complexo do MHC II quimérico pode conter domínios al, a2, βΐ e β2 humanos. Numa forma de realização, a porção de ratinho do complexo do MHC II quimérico contém domínios transmembranares e citosólicos de MHC II de ratinho, por exemplo, Hâ2E de ratinho (por exemplo, domínios transmembranares e citosólicos de cadeias α e β de Hâ2E de ratinho).

Portanto, numa forma de realização, é fornecido um ratinho geneticamente modificado, em que o ratinho contém uma primeira sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido a do MHC II humano/de ratinho quimérico e uma segunda sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido β do MHC II humano/de ratinho quimérico num locus do MHC II de ratinho endógeno, em que uma porção humana do polipéptido a do MHC II quimérico contém um domínio extracelular derivado de um polipéptido α de uma proteína de HLAâDR4 humano e a porção humana do polipéptido β do MHC II quimérico contém um domínio extracelular derivado de um polipéptido β de uma proteína de HLAâDR4 humano, em que uma porção de ratinho do polipéptido α do MHC II quimérico contém domínios transmembranares e citoplasmáticos de uma cadeia α de Hâ2E de ratinho e uma porção de ratinho do polipéptido β do MHC II quimérico contém domínios transmembranares e citoplasmáticos de uma cadeia β de Hâ2E de ratinho, e em que o ratinho expressa um complexo do MHC II de HLAâDR4/Hâ2E quimérico funcional. Numa forma de realização, o complexo do MHC II de HLAâ DR4/Hâ2E quimérico contém uma cadeia a do MHC II que inclui domínios extracelulares (por exemplo, domínios «1 e a2) derivados de proteína de HLAâDR4 (domínios al e σ:2 de HLAâ DRA) e domínios transmembranares e citoplasmáticos de uma cadeia α de Hâ2E de ratinho, assim como uma cadeia β do MHC II que inclui domínios extracelulares (por exemplo, domínios βΐ e β2) derivados de HLAâDR4 (domínios βΐ e β2 de ΗΙΑ§ΟΗβ1*04) e domínios transmembranares e citoplasmáticos de cadeia β de Hâ2E de ratinho. Num aspeto, o ratinho não expressa polipéptidos de Hâ2A e Hâ2E endógenos funcionais de seus loci de ratinho endógenos (por exemplo, o ratinho não expressa polipéptidos de Hâ2Abl, Hâ2Aa, Hâ2Ebl, Hâ2Eb2 e Hâ2Ea). Em várias formas de realização, a expressão da primeira e segunda sequências de nucleótidos está sob o controlo dos respetivos elementos reguladores e promotores de ratinho endógenos. Em várias formas de realização da invenção, a primeira e a segunda sequências de nucleótidos estão localizadas no mesmo cromossoma. Em alguns aspetos, o ratinho contém duas cópias do locus do MHC II quimérico que contém a primeira e a segunda sequências de nucleótidos, enquanto noutros aspetos, o ratinho contém uma cópia do locus do MHC II que contém a primeira e a segunda sequências de nucleótidos. Assim, o ratinho pode ser homozigótico ou heterozigótico para o locus do MHC II quimérico que contém a primeira e a segunda sequências de nucleótidos. Em várias formas de realização, a primeira e a segunda sequências de nucleótidos estão contidas na linha germinal do ratinho.

Em algumas formas de realização descritas no presente documento, é fornecido um ratinho que contém um locus do MHC II quimérico num locus do MHC II de ratinho endógeno, por exemplo, por meio de substituição de genes Hâ2A e Hâ2E de ratinho endógenos. Em alguns aspetos, o locus quimérico contém uma sequência de nucleótidos que codifica um domínio extracelular de um HLAâDRA humano e domínios transmembranares e citoplasmáticos de uma cadeia α de Hâ2E de ratinho, assim como um domínio extracelular de um HLAâ DRpl*04 humano e domínios transmembranares e citoplasmáticos de uma cadeia β de Hâ2E de ratinho. Os vários domínios do locus quimérico são ligados de forma que o locus expresse um complexo do MHC II humano/de ratinho quimérico funcional.

Em varias formas de realização, um roedor, por exemplo, um ratinho ou um rato, que expressa uma proteína do MHC II quimérica funcional de um locus do MHC II quimérico, conforme descrito no presente documento, exibe a proteína quimérica numa superfície de célula. Numa forma de realização, o roedor expressa a proteína do MHC II quimérica numa superfície de célula numa distribuição celular que é a mesma observada num ser humano. Num aspeto, a célula exibe um fragmento de péptido (fragmento de antigénio) ligado a uma porção extracelular (por exemplo, porção extracelular de HLAâDR4 humano) da proteína do MHC II quimérica.

Em várias formas de realização, uma célula que exibe a proteína do MHC II quimérica, por exemplo, proteína de HLAâ DR4/Hâ2E, é uma célula que apresenta antigénio (APC), por exemplo, um macrõfago, uma célula dendrítica ou uma célula B. Em algumas formas de realização, o fragmento de péptido apresentado pela proteína quimérica é derivado de um tumor. Noutras formas de realização, o fragmento de péptido apresentado pela proteína do MHC II quimérica é derivado de um patogénio, por exemplo, uma bactéria, um vírus ou um parasita. A proteína do MHC II quimérica descrita no presente documento pode interagir com outras proteínas na superfície da mesma célula ou de uma segunda célula. Em algumas formas de realização, a proteína do MHC II quimérica interage com proteínas não humanas endógenas na superfície da referida célula. A proteína do MHC II quimérica também pode interagir com proteínas humanas ou humanizadas na superfície da mesma célula ou de uma segunda célula. Em alguns exemplos, a segunda célula é uma célula T, e a proteína do MHC II quimérica interage com o recetor de célula T (TCR) e seu coârecetor CD4. Em alguns exemplos, a célula T é uma célula T de ratinho endógena. Noutros exemplos, a célula T é uma célula T humana. Em alguns exemplos, o TCR é um TCR humano ou humanizado. Em exemplos adicionais, o CD4 é um CD4 humano ou humanizado. Noutro exemplo, um ou tanto o TCR quanto o CD4 são não humanos, por exemplo, de ratinho ou rato.

Em uma forma de realização, é fornecido um roedor geneticamente modificado, conforme descrito no presente documento, que não desenvolve tumores a uma taxa mais alta do que um animal do tipo selvagem que carece de um gene do MHC II quimérico. Em algumas formas de realização, o animal não desenvolve neoplasias malignas hematológicas, por exemplo, vários linfomas de célula T e B, leucemias, linfomas compósitos (por exemplo, linfoma de Hodgkin), a uma taxa mais alta do que o animal do tipo selvagem.

Além de um roedor geneticamente manipulado, um embrião de roedor (por exemplo, um embrião de ratinho ou de um rato) também é descrito no presente documento, em que o embrião compreende uma célula ES doadora que é derivada de um roedor, por exemplo, um ratinho ou um rato, conforme descrito no presente documento. Num aspeto, o embrião contém uma célula doadora ES que contém o gene do MHC II quimérico e células de embrião hospedeiras.

Também é descrito no presente documento um tecido, em que o tecido é derivado de um roedor, por exemplo, um ratinho ou um rato, conforme descrito no presente documento, e expressa a proteína do MHC II quimérica (por exemplo, a proteína de HLAâDR4/Hâ2E).

Além disso, é revelada uma célula de roedor isolada de um roedor, conforme descrito no presente documento. Num exemplo, a célula é uma célula ES. Num exemplo, a célula é uma célula que apresenta antigénio, por exemplo, célula dendrítica, macrófago, célula B. Num exemplo, a célula é uma célula imunitária. Num exemplo, a célula imunitária é um linfócito.

Também é revelado no presente documento uma célula de roedor que contém um cromossoma ou fragmento do mesmo de um roedor, conforme descrito no presente documento. Num exemplo, a célula de roedor contém um núcleo de um roedor, conforme descrito no presente documento. Num exemplo, a célula de roedor contém o cromossoma ou fragmento do mesmo como o resultado de uma transferência nuclear.

Num aspeto, é revelada uma célula multipotencial induzida de roedor que contém o gene que codifica uma proteína do MHC II quimérica (por exemplo, proteína de HLAâDR4/Hâ2E), conforme descrito no presente documento. Num exemplo, a célula multipotencial induzida é derivada de um roedor, conforme descrito no presente documento.

Num aspeto, é fornecido um hibridoma ou quadroma derivado de uma célula de um roedor, conforme descrito no presente documento. Num exemplo, o roedor é um ratinho ou um rato.

Num aspeto, é descrita uma preparação in vitro no presente documento que inclui uma primeira célula que contém uma proteína de superfície do MHC II humana/de roedor quimérica que contém um péptido ligado para formar um complexo do MHC II/péptido humano/de roedor quimérico, e uma segunda célula que se liga ao complexo do MHC II/péptido humano/de roedor quimérico. Num exemplo, a segunda célula contém um recetor de célula T humano ou humanizado e, em uma forma de realização, contém, ainda, um CD4 humano ou humanizado. Num exemplo, a segunda célula é uma célula de roedor (por exemplo, ratinho ou rato) que contém um recetor de célula T humano ou humanizado e uma proteína de CD4 humano ou humanizado. Num exemplo, a segunda célula é uma célula humana.

Também é fornecido um método para produzir um roedor geneticamente manipulado, por exemplo, um ratinho ou rato descrito no presente documento. 0 método para produzir um roedor geneticamente manipulado resulta no animal cujo genoma contém uma sequência de nucleótidos que codifica uma proteína do MHC II quimérica (por exemplo, polipéptidos α e β do MHC II quiméricos) . Numa forma de realização, o método resulta num ratinho geneticamente manipulado cujo genoma contém uma sequência de nucleótidos que codifica uma proteína do MHC II humana/de ratinho quimérica num locus do MHC II endógeno, em que uma porção humana da proteína do MHC II quimérica contém um domínio extracelular de um HLAâDR4 humano e uma porção de ratinho contém domínios transmembranares e citoplasmãticos de um Hâ2E de ratinho. Em algumas formas de realização, o método faz uso de um construto de direcionamento realizado com a utilização de tecnologia VELOCIGENE®, que introduz o construto em células ES, e que introduz clones de célula ES direcionados num embrião de ratinho com a utilização de tecnologia VELOCIMOUSE®, conforme descrito nos Exemplos. Numa forma de realização, as células ES são uma mistura de estirpes de ratinho 129 e C57BL/6; numa forma de realização, as células ES são uma mistura de estirpes de ratinho BALB/c e 129.

Também é revelado no presente documento um construto de nucleótidos utilizado para gerar os roedores geneticamente manipulados. Num aspeto, o construto de nucleótidos contém: braços de homo log ia não humanos 5' e 3' , um fragmento de ADN que contém sequências de cadeias α e β de HLAâDR humano e uma cassete de seleção flanqueada por sítios de recombinação. Num exemplo, as sequências de cadeias α e β de HLAâDR humano são sequências genómicas que contêm intrões e exões de genes de cadeia α e β de HLAâDR humano. Num exemplo, os braços de homologia não humanos são homólogos à sequência genõmica do MHC II não humano.

Num exemplo, a sequência de cadeia α do HLAâDR humano contém uma sequência de codificação de domínios al e a2 . Num exemplo específico, a mesma contém, de 5' a 3': exão al (exão 2) , intrão al/a2 (intrão 2) e exão a2 (exão 3) .

Num exemplo, a sequência de cadeia β do HLAâDR humano contém uma sequência de codificação de domínios βΐ e β2. Num exemplo específico, a mesma contém, de 5' a 3': exão βΐ (exão 2), intrão β1/β2 (intrão 2) e exão β2 (exão 3) .

Uma cassete de seleção é uma sequência de nucleótidos inserida num construto de direcionamento para facilitar a seleção de células (por exemplo, células ES) que têm o construto de interesse integrado. Várias cassetes de seleção adequadas são conhecidas na técnica. Comummente, uma cassete de seleção possibilita a seleção positiva na presença de um antibiótico particular (por exemplo, Neo, Hyg, Pur, CM, SPEC, etc.). Além disso, uma cassete de seleção pode ser flanqueada por sítios de recombinação, que permitem a deleção da cassete de seleção mediante o tratamento com enzimas recombinase. Sítios de recombinação comummente utilizados são loxP e Frt, reconhecidos pelas enzimas Cre e Flp, respetivamente, mas outros são conhecidos na técnica. Uma cassete de seleção pode estar localizada em qualquer lugar no construto fora da região de codificação. Num exemplo, a cassete de seleção está localizada no intrão de cadeia β, por exemplo, intrão de domínio p2/'transmembranar (intrão 3) .

Num exemplo, braços de homologia 5' e 3' contêm a sequência genómica em localizações 5' e 3' do locus do MHC II não humano endógeno. Num exemplo, o braço de homologia 5' compreende a sequência genómica a montante do gene Hâ2Abl de ratinho e o braço de homologia 3' compreende a sequência genómica a jusante do gene Hâ2Ea de ratinho. Nesse exemplo, o construto permite a substituição tanto do gene Hâ2E quanto do gene Hâ2A de ratinho.

Assim, num aspeto, é descrito um construto de nucleótidos no presente documento que compreende, de 5' a 3': um braço de homologia 5' que contém a sequência genómica de ratinho a montante do gene Hâ2Abl de ratinho, uma primeira sequência de nucleótidos que compreende uma sequência que codifica uma cadeia β do MHC II humano/de ratinho quimérico, uma segunda sequência de nucleótidos que compreende uma sequência que codifica uma cadeia α do MHC II humano/de ratinho quimérico e um braço de homologia 3' que contém a sequência genómica de ratinho a jusante do gene Hâ2Ea de ratinho. Num exemplo específico, a primeira sequência de nucleótidos que compreende uma sequência que codifica uma cadeia β do MHC II humano/de ratinho quimérico compreende exão βΐ humano, intrão β1/β2, exão β2, uma cassete de seleção flanqueada por sítios de recombinação inseridos na região intrónica entre a sequência de exões β2 humanos e a sequência de um exão de domínio transmembranar de ratinho. Num exemplo específico, a segunda sequência de nucleótidos que compreende uma sequência que codifica uma cadeia a do MHC II humano/de ratinho quimérico compreende exão al humano, intrão al/a2 e exão oí2 humano. Um construto exemplif icativo é representado na Figura 5 (MAID 1680) .

Mediante a conclusão de direcionamento de gene, as células ES ou os roedores geneticamente modificados são rastreados para confirmar a incorporação bemâsucedida da sequência de nucleótidos exógena de interesse ou a expressão de polipéptido exógeno. Inúmeras técnicas são conhecidas pelos peritos na especialidade e incluem (mas sem limitação) Southern blotting, PCR longo, PCT quantitativo (por exemplo, PCR em tempo real com a utilização de TAQMAN®), hibridização in situ de fluorescência, Northern blotting, citometria de fluxo, análise de Western, imunocitoquímica, imunoâ histoquímica, etc. Num exemplo, os roedores (por exemplo, ratinhos) que contêm a modificação genética de interesse podem ser identificados ao rastrear por perda de alelo de ratinho e/ou ganho de alelo humano com a utilização de uma modificação do ensaio de alelo descrita em Valenzuela et al. (2003) Highãthroughput engineering of the mouse genome coupled with highâresolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6) :652 a 659. Outros ensaios que identificam uma sequência de nucleótidos ou de aminoácidos específica nos animais geneticamente modificados são conhecidos pelos peritos na especialidade. A divulgação também fornece um método para modificar um locus do MHC II de um roedor para expressar um complexo do MHC II humano/de roedor quimérico descrito no presente documento. Numa forma de realização, a invenção fornece um método para modificar um locus do MHC II de um ratinho para expressar um complexo do MHC II humano/de ratinho quimérico que inclui substituir uma sequência de nucleótidos que codifica um complexo do MHC II de ratinho por uma sequência de nucleótidos que codifica um complexo do MHC II humano/de ratinho quimérico no locus do MHC II de ratinho endógeno. Num aspeto específico, a sequência de nucleótidos que codifica o complexo do MHC II humano/de ratinho quimérico contém uma primeira sequência de nucleótidos que codifica um domínio extracelular de uma cadeia a do MHC II humano (por exemplo, cadeia a de HLAâDR4) e domínios transmembranares e citoplasmáticos de uma cadeia o: do MHC II de ratinho (por exemplo, cadeia α de Hâ2E) e uma segunda sequência de nucleótidos que codifica um domínio extracelular de uma cadeia β do MHC II humano (por exemplo, cadeia β de HLAâDR4) e domínios transmembranares e citoplasmáticos de uma cadeia β do MHC II de ratinho (por exemplo, cadeia β de Hâ2E, por exemplo, cadeia de Hâ2Ebl). Em algumas formas de realização, o locus do MHC II de ratinho modificado expressa uma proteína de HLAâDR4/Hâ2E quimérica.

Num aspeto, é descrito um método para produzir uma molécula do HLA de classe II humano/MHC de classe II de roedor quimérica no presente documento que inclui expressar uma proteína de HLAâDR4/Hâ2E quimérica de um construto de nucleótidos numa única célula, conforme descrito no presente documento. Num exemplo, o construto de nucleótidos é um vetor virai; num exemplo específico, o vetor virai é um vetor lentiviral. Num exemplo, a célula é selecionada de entre uma CHO, COS, 2 93, HeLa e uma célula retiniana que expressa uma sequência de ácidos nucleicos virais (por exemplo, uma célula PERC.6™),

Num aspeto, uma célula que expressa uma proteína de HLAâ DR4/Hâ2E quimérica é revelada no presente documento. Num exemplo, a célula contém um vetor de expressão que contém uma sequência do MHC de classe II quimérico, conforme descrito no presente documento. Num exemplo, a célula é selecionada de entre CHO, COS, 2 93, HeLa e uma célula retiniana que expressa uma sequência de ácidos nucleicos virais (por exemplo, uma célula PERC.6™).

Uma molécula do MHC de classe II quimérica produzida por um roedor, conforme descrito no presente documento, também é descrita no presente documento, em que a molécula do MHC de classe II quimérica contém domínios αΐ, α2, βΐ e β2 de uma proteína do MHC II humana, por exemplo, a proteína de HLAâDR4, e domínios transmembranares e citoplasmáticos de uma proteína do MHC II de roedor, por exemplo, a proteína Hâ2E de ratinho. 0 complexo do MHC II quimérico que compreende um domínio extracelular de HLAâDR4 descrito no presente documento pode ser detetado por anticorpos antiâ HLAâDR. Assim, uma célula que exibe o polipéptido do MHC II humano/de roedor quimérico pode ser detetada e/ou selecionada com a utilização de anticorpo antiâHLAâDR.

Embora os Exemplos a seguir descrevam um animal geneticamente manipulado cujo genoma contém uma substituição de uma sequência de nucleótidos que codifica proteínas de Hâ2A e Hâ2E de ratinho por uma sequência de nucleótidos que codifica uma proteína de HLAâDR4/Hâ2E humana/de ratinho quimérica, um perito na especialidade compreenderia que uma estratégia semelhante pode ser utilizada para introduzir quimeras que contêm, outros genes do MHC II humano (HLAâDP e HLAâDQ) . Assim, uma forma de realização adicional da invenção é direcionada a um animal geneticamente manipulado cujo genoma contém uma sequência de nucleótidos que codifica uma proteína de HLAâDQ/Hâ2A quimérica. Numa forma de realização, a sequência de nucleótidos codifica uma proteína de HLAâDQ2.5/Hâ2A quimérica. Noutra forma de realização, a sequência de nucleótidos codifica uma proteína de HLAâDQ8/Hâ2A quimérica. Além disso, a introdução de múltiplas moléculas do MHC II humanizadas (por exemplo, HLAâDR/Hâ2E e HLAâDQ/Hâ 2A quiméricas) também é contemplada.

Utilização de animais geneticamente modificados Os roedores geneticamente modificados descritos no presente documento produzem APCs com MHC II humano ou humanizado na superfície de célula e, como resultado, apresentam péptidos derivados de proteínas citosõlicas como epítopos para células T de uma maneira humana, visto que substancialmente todos os componentes do complexo são humanos ou humanizados. Os roedores geneticamente modificados da invenção podem ser utilizados para estudar o funcionamento de um sistema imunitário humano no animal humanizado; para a identificação de antigénios e epítopos de antigénio que provocam a resposta imunitária (por exemplo, epítopos de célula T, por exemplo, epítopos de cancro humanos exclusivos), por exemplo, para utilização no desenvolvimento de vacinas; para avaliação de candidatos para vacina e outras estratégias de vacina; para estudo de autoimunidade humana; para estudo de doenças infecciosas humanas; e, de outra forma, para elaborar melhores estratégias terapêuticas com base na expressão do MHC humano. 0 complexo do MHC II ligaâse a péptidos derivados de proteínas extracelulares, por exemplo, bactéria extracelular, células vizinhas ou polipéptidos ligados por recetores de célula B e internalizados numa célula B. Assim que as proteínas extracelulares entram na via endocítica, as mesmas são degradadas em péptidos, e os péptidos são ligados e apresentados por MHC II. Assim que um péptido apresentado por MHC II é reconhecido pelas células T CD4+, as células T são ativadas, proliferam, diferenciamâse em vários subtipos auxiliares T (por exemplo, TH1, TH2) e levam a vários eventos, incluindo a ativação de leliminação de patogénio mediado por macrófago, proliferação de célula B e produção de anticorpo. Devido ao papel do MHC II na resposta imunitária, a compreensão da apresentação de péptido do MHC II é importante no desenvolvimento de tratamento para patologias humanas. No entanto, a apresentação de antigénios no contexto de MHC II de ratinho é apenas um pouco relevante para doença humana, visto que complexos do MHC humano e de ratinho reconhecem antigénios de modo diferente, por exemplo, um MHC II de ratinho pode não reconhecer os mesmos antigénios ou pode apresentar epítopos diferentes de um MHC II humano. Assim, os dados mais relevantes para patologias humanas são obtidos através do estudo da apresentação de epítopos e antigénio por MHC II humano.

Assim, os animais geneticamente manipulados da presente invenção são úteis, entre outras coisas, para avaliar a capacidade de um antigénio iniciar uma resposta imunitária num ser humano, e para gerar uma diversidade de antigénios e identificar um antigénio específico que pode ser utilizado no desenvolvimento de vacina humana.

Num aspeto, é descrito um método para determinar a antigenicidade num ser humano de uma sequência de péptidos no presente documento que inclui expor um roedor geneticamente modificado, conforme descrito no presente documento, a uma molécula que contém a sequência de péptidos, o que permite que o animal roedor ative uma resposta imunitária, e detetar uma célula no roedor que se liga a uma sequência do péptido apresentado por um complexo do MHC II humanizado descrito no presente documento.

Num aspeto, é revelado um método para determinar se um péptido provocará uma resposta imunitária num ser humano no presente documento que inclui expor um roedor geneticamente modificado, conforme descrito no presente documento, ao péptido, o que permite que o roedor ative uma resposta imunitária, e detetar uma célula no roedor que se liga a uma sequência do péptido por uma molécula do MHC de classe II humano/não humano quimérico, conforme descrito no presente documento. Num exemplo, após a exposição, o animal não humano contém uma célula T CD4 + restringida por MHC de classe II que se liga ao péptido.

Num aspeto, é revelado um método para identificar um epítopo de célula T CD4+ humana no presente documento que inclui expor um roedor, conforme descrito no presente documento, a um antigénio que contém um epítopo de célula T putativo, o que permite que o roedor ative uma resposta imunitária, e identificar o epítopo ligado pela célula T CD4+ restringida por MHC de classe II.

Num aspeto, é revelado um método no presente documento para identificar um antigénio que gera uma resposta de célula T CD4+ num ser humano que incluir expor um antigénio putativo a um ratinho, conforme descrito no presente documento, o que permite que o ratinho gere uma resposta imunitária, e detetar uma resposta de célula T CD4+ que é específica para o antigénio no contexto de uma molécula do MHC II humana (por exemplo, uma molécula de HLAâDR) e identificar o antigénio ligado pela molécula restringida por MHC II humano (por exemplo, molécula restringida por HLAâDR humano).

Num exemplo, o antigénio contém uma proteína bacteriana. Num exemplo, o antigénio contém um antigénio de célula de tumor humano. Num exemplo, o antigénio contém uma vacina putativa para utilização num ser humano, ou outro biofarmacêutico. Num exemplo, o antigénio contém um epítopo humano que gera anticorpos num ser humano. Ainda noutro exemplo, um antigénio inclui um antigénio de célula fúngica ou de levedura. Ainda noutro exemplo, um antigénio é derivado de um parasita humano.

Num aspeto, é descrito um método no presente documento para determinar se um antigénio putativo contém um epítopo que, mediante exposição a um sistema imunitário humano, vai gerar uma resposta imunitária restringida por HLAâDR (por exemplo, resposta restringida por HLAâDR4), que inclui expor um ratinho, conforme descrito no presente documento, ao antigénio putativo e medida uma resposta imunitária restringida por HLAâDR de antigénio específico (por exemplo, restringido por HLAâDR4) no ratinho. Noutro aspeto, é descrito um método no presente documento para identificar se um antigénio putativo contém um epítopo que, mediante exposição a um sistema imunitário humano, via gerar uma resposta restringida por HLAâDQ.

Também é descrito no presente documento um método para gerar anticorpos para um antigénio, por exemplo, um antigénio derivado de bactéria, parasita, etc., apresentado no contexto de um complexo do MHC II humano, que inclui expor um ratinho descrito no presente documento a um antigénio, o que permite que um ratinho ative uma resposta imunitária, em que a resposta imunitária compreende a produção de anticorpos, e isolar um anticorpo que reconhece o antigénio apresentado no contexto de complexo do MHC II humano. Num exemplo, a fim de gerar anticorpos para o MHC II de péptido, o ratinho humanizado do MHC II é imunizado com um imunogénio do MHC II de péptido.

Num aspeto, é descrito um método para identificar um domínio variável de recetor de célula T que reconhece um antigénio apresentado no contexto de MHC II (por exemplo, antigênio de tumor humano, uma vacina, etc.) no presente documento que inclui expor um ratinho que contém um complexo do MHC II humanizado descrito no presente documento ao antigênio, o que permite que o ratinho gere uma resposta imunitária, e isolar uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um domínio variável de um recetor de célula T que se liga ao antigênio restringido por MHC II do ratinho. Num exemplo, o antigênio é apresentado no contexto de um MHC II humanizado (por exemplo, ectodomínio do HLA II humano/domínio transmembranar e/ou citoplasmático do MHC II de ratinho). A consequência da interação entre uma célula T e uma APC que exibe um péptido no contexto de MHC II (por exemplo, ectodomínio do HLA II humano/domínio transmembranar e/ou citoplasmático do MHC II de ratinho) pode ser medida por várias técnicas conhecidas na técnica, por exemplo, ensaios de proliferação de célula T, ensaios de libertação de citocina, etc.

Além da capacidade para identificar antigénios e os seus epítopos de célula T de patogénios ou neoplasmos, os animais geneticamente modificados da invenção podem ser utilizados para identificar autoantigénios de relevância para doença autoimune humana e, de outra forma, estudar a progressão de doença autoimune humana. SabeS se que os polimorfismos dentro dos loci de HLA desempenham um papel na predisposição à doença autoimune humana. De facto, foram identificados polimorfismos específicos em loci de HLA0 DR e HLA0 DQ que se correlacionam com o desenvolvimento d artrite reumatoide, diabetes tipo I, tiroidite de

Hashimoto, esclerose múltipla, miastenia grave, doença de Graves, lúpus eritematoso sistémico, doença celíaca, doença de Crohn, colite ulcerosa e outros distúrbios autoimunes.

Consulte, por exemplo, Wong e Wen (2004) What can the HLA transgenic mouse tell us about autoimmune diabetes?, Diabetologia 47:1476 a 1487; Taneja e David (1998), HLA Transgenic Mice as Humanized Mouse Models of Disease and Immunity, J. Clin. Invest. 101:921 a 926; Bakker et al. (2006), supra; e International MHC and Autoimmunity Genetics Network (2009) Mapping of multiple susceptibility variants within the MHC region for 7 immune® mediatd. diseases, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 106:18680 a 18685.

Assim, os métodos para produzir animais de complexo do MHC II humanizado descritos no presente documento podem ser utilizados para introduzir moléculas do MHC II que se pensa estarem associadas a doenças autoimunes humanas específicas, e a progressão de doença autoimune humana pode ser estudada. Além disso, os roedores descritos no presente documento podem ser utilizados para desenvolver modelos animais de doença autoimune humana. Os ratinhos de acordo com a invenção que transportam as proteínas do MHC II humanizadas descritas no presente documento podem ser utilizados para identificar autoantigénios potenciais para mapear epítopos envolvidos na progressão de doença e para projetar estratégias para modulação de doença autoimune.

Além disso, os animais geneticamente modificados descritos no presente documento podem ser utilizados no estudo de resposta alérgica humana. Visto que a resposta alérgica parece estar associada aos alelos de MHC II, os animais geneticamente modificados descritos no presente documento podem ser utilizados para determinar a restrição de HLA da resposta de célula T específica de alergénio e para desenvolver estratégias para combater a resposta alérgica.

Exemplos A invenção será ilustrada, ainda, pelos exemplos não limitant.es a seguir. Esses Exemplos são apresentados para auxiliar na compreensão da invenção, mas não se destinam, e não devem ser interpretados, a limitar o seu âmbito de forma alguma. Os Exemplos não incluem descrições detalhadas dos métodos convencionais que seriam bem conhecidos pelos peritos na especialidade (técnicas de clonagem molecular, etc.) . A menos que indicado de outra forma, as partes são partes em peso, o peso molecular é o peso molecular médio, a temperatura é indicada em Celsius e a pressão é ou está próxima da atmosférica.

Exemplo 1. Deleção dos loci de HEI 2A e HE3 2E do MHCedclasse II endógeno 0 vetor de direcionamento para introduzir uma deleção dos genes HEI 2Abl, EM 2Aa, EM 2Ebl, HE3 2Eb2 e HEI 2Ea dodMHClasse II endógenos foi produzido com a utilização de tecnologia de manipulação genética VELOCIGENE® (vejaEi se, por exeplo, a Patente US n° 6.586.251 e Valenzuela et al., supra). 0 ADN de Cromossoma Artificial Bacteriano (BAG) RP230 45822 (Invitrogen) foi modificado para deletar os genes do MHC de classe II endógenos EM 2Abl, HK 2Aa, HEI 2Ebl, HS 2EbS0e2Ea.

Resumidamente, os braços de homologia a montante e a jusante foram derivados por PCR de ADN de BAC de ratinho de localizações 5' do gene H0 2Abl e 3' do gene HEI 2Ea, respetivamente. Conforme representado na Figura 5, esses braços de homologia foram utilizados para produzir uma cassete que deletou ~79 kb de RP23EI 458Ϊ22 que compeende os genes HE! 2Abl, HEI 2Aa, HEI 2Ebl, H0 2Eb2 e H0 2Ea dosldouMHC de classe II por recombinação homóloga bacteriana (BHR). Essa região foi substituída por uma cassete de higromicina flanqueada por sítios lox66 e lox71. 0 vetor de direcionamento final de 5' a 3' incluiu um braço de homologia de 34 kb que contém a sequência genomica de ratinho 5' para o gene Hâ2Abl do locus do MHC de classe II endógeno, um sítio lox66 5', uma cassete de higromicina, um sítio lox71 3' e um braço de homologia de 53 kb que contém a sequência genómica de ratinho 3' para o gene Hã2Ea do locus do MHC de classe II endógeno (MAID 5111, vejaâse a Figura 5) . 0 vetor de direcionamento de ADN de BAC (descrito acima) foi utilizado para eletroporar células ES de ratinho para criar células ES modificadas que contêm uma deleção do locus do MHC de classe II endógeno. As células ES positivas que contêm um locus do MHC de classe II endógeno deletado foram identificadas pelo ensaio de PCR quantitativo com a utilização de sondas TAQMAN™ (Lie e Petropoulos (1998) Curr. Opin. Biotechnology 9:43 a 48). A região a montante do locus deletado foi confirmada por PCR com a utilização de iniciadores 5111U F (CAGAACGCCAGGCTGTAAC; SEQ ID N0:1) e 5111U R (GGAGAGCAGGGTCAGTCAAC; SEQ ID NO:2) e de sonda 5111U P (CACCGCCACTCACAGCTCCTTACA; SEQ ID NO:3), enquanto que a região a jusante do locus deletado foi confirmada com a utilização de iniciadores 5111D F (GTGGGCACCATCTTCATCATTC; SEQ ID NO:4) e 5111D R (CTTCCTTTCCAGGGTGTGACTC; SEQ ID NO: 5) e de sonda 5111D P (AGGCCTGCGATCAGGTGGCACCT; SEQ ID NO: 6) . A presença da cassete de higromicina do vetor de direcionamento foi confirmada com a utilização de iniciadores HYGF (TGCGGCCGATCTTAGCC; SEQ ID NO:7) e HYGR (TTGACCGATTCCTTGCGG; SEQ ID NO:8) e de sonda HYGP (ACGAGCGGGTTCGGCCCATTC; SEQ ID NO:9). A sequência de nucleõtidos ao longo do ponto de deleção a montante (SEQ ID NO:10) incluiu o seguinte, que indica a sequência de ratinho endógeno a montante do ponto de deleção (contido dentro dos parênteses abaixo) ligada de modo contíguo à sequência de cassete presente no ponto de deleção: (TTTGTAAACA AAGTCTACCC AGAGACAGAT GACAGACTTC AGCTCCAATG CTGATTGGTT CCTCACTTGG GACCAACCCT) CTCGAGTACC GTTCGTATAA TGTATGCTAT ACGAAGTTAT ATGCATCCGG GTAGGGGAGG. A sequência de nucleótidos ao longo do ponto de deleção a jusante (SEQ ID NO:11) incluiu o seguinte, que indica a sequência de cassete contígua à sequência de ratinho endógeno a jusante do ponto de deleção (contido dentro dos parênteses abaixo): CCTCGACCTG CAGCCCTAGG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAC GGTAGAGCTC (CACAGGCATT TGGGTGGGCA GGGATGGACG GTGACTGGGA CAATCGGGAT GGAAGAGCAT AGAATGGGAG TTAGGGAAGA). Clones de célula ES positiva foram, então, utilizados para implantar ratinhos fêmeas com a utilização do método VELOCIMOUSE® (descrito abaixo) para gerar uma ninhada de filhotes que contém uma deleção do locus do MHC de classe II endógeno.

As células ES alvo descritas acima foram utilizadas como células ES doadoras e introduzidas num embrião de ratinho de estágio de 8 células pelo método VELOCIMOUSE® (consulte, por exemplo, a Patente US n° 7.294.754 e Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor geneâtargeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses. Nature Biotech. 25(1):91 a 99) . Os ratinhos que contêm uma deleção de gene Hâ2Abl, Hâ 2Aa, Hâ2Ebl, Hâ2Eb2 e Hâ2Eas no locus do MHC de classe II endógeno foram identificados por genotipagem com a utilização de uma modificação do ensaio de alelo (Valenzuela et al., supra) que detetou a presença da cassete de higromicina e confirmou a ausência de sequências do MHC de classe II endógenas.

Os ratinhos que contêm uma deleção de gene Hâ2Abl, Hâ2Aa, Hâ2Ebl, Hâ2Eb2 e Hâ2Eas no locus do MHC de classe II endogeno podem ser criados para uma estirpe de ratinho deletora Cre (consulte, por exemplo, a Publicação de Pedido de Patente Internacional n° WO 2009/114400) a fim de remover qualquer cassete de higromicina loxed introduzido pelo vetor de direcionamento que não é removido, por exemplo, no estágio de célula ES ou no embrião. Opcionalmente, a cassete de higromicina é retida nos ratinhos.

Exemplo 2. Geração de vetor de direcionamento grande (LTVEC) que compreende genes Hâ2Ebl e Hâ2Eas humanizados Um vetor de direcionamento para introduzir sequências do MHC II humanizado foi projetado conforme representado na Figura 4. Com a utilização de tecnologia de manipulação genética VELOCIGENE®, o ADN de Cromossoma Artificial Bacteriano (BAC) RP23â458i22 foi modificado em várias etapas para: (1) criar um vetor que contém um exão α de IâE funcional 1 de gene BALB/c Hâ2Ea (Figura 4A) ; (2) criar um vetor que contém a substituição de exões 2 e 3 do gene β de IâE de ratinho por aqueles de ϋΒβ1*04 humano e a substituição de exões 2 e 3 do gene α de IâE de ratinho por aqueles de DRal*01 humano (Figuras 4B); (3) criar um vetor que transporta exões 2 e 3 de DRal*04 humano entre exões β de IâE de ratinho restantes, e exões 2 e 3 de ϋΒβ1*01 humano entre exões α de IâE de ratinho restantes, incluindo um exão α de IâE funcional 1 do ratinho BALB/c (etapa (1) (Figura 4C) ; e (4) remover um sítio de emenda (splice) críptico no vetor gerado em (3) (Figura 4D).

Especificamente, visto que nos ratinhos C57B1/6 o gene a de IâE é um pseudogene devido à presença de um exão não funcional 1, primeiro, foi criado um vetor que contém um exão α de IâE funcional 1 de gene BALB/c Hâ2Ea (Figura 4A) . 0 BAC de RP23â458i22 foi modificado por recombinação homóloga bacteriana (l.BHR) para substituir o gene de resistência a cloranfenicol por aquele de espectromicina. 0 vetor resultante foi modificado, ainda, por BHR para substituir toda a região de codificação de IâA e IâE por uma cassete de neomicina flanqueada por sítios de recombinação (2.BHR). Outra rodada de BHR (3. BHR) com o construto que contém um exão que codifica o BALB/c IâEa líder (exão 1) e o gene de cloranf enicol flanqueado por sítios de restrição de PlâScel e IâCeul resultou num vetor que contém um exão de BALB/c Hâ2Ea funcional 1.

Independentemente, a fim de gerar um vetor que contém a substituição de exões 2 e 3 de gene β de IâE de ratinho por aqueles de ϋΗβ1*04 humano e a substituição de exões 2 e 3 do gene α de IâE de ratinho por aqueles de DRal*01 humano, o BAC de RP23â458i22 foi modificado por meio de diversas etapas homólogas de recombinação, 4. BHR â 8. BHR (Figura 4B) . A sequência de ácidos nucleicos resultante foi flanqueada por sítios de restrição de PlâScel/IâCeul para permitir a ligação ao construto que transporta o exão de BALB/c IâEa 1 mencionado acima (Figura 4C). A sequência do construto final representada na Figura 4C continha um sítio de emenda críptico na extremidade 3' do intrão de BALB/c. Diversas etapas de BHR (11. BHR - 12. BHR) seguidas por uma etapa de deleção foram realizadas para obter o vetor de direcionamento final (MAID 1680) que foi utilizado para eletroporar em células ES (Figura 4D).

Em detalhes, o vetor de direcionamento final (MAID 1680), de 5' a 3', era composto por um braço de homologia de ratinho 5' que consiste em ~26 kb de sequência genómica de ratinho que termina exatamente a montante do gene Hâ2Abl do locus do MHC de classe II endógeno; um inserto de ~59 kb que contém o gene de cadeia β do MHC II humanizado (gene Hâ2Ebl humanizado) e o gene de cadeia a do MHC II humanizado (gene Hâ2Ea humanizado) e uma cassete de neomicina floxed; e um braço de homologia de ratinho 3' que consiste em ~57 kb de sequência genómica de ratinho que começa exatamente a jusante do gene Hâ2Ea do locus do MHC de classe II endógeno. A sequência de nucleõtidos através da junção entre o braço 5' e o inserto (SEQ ID NO:12) incluiu o seguinte: (TGCTGATTGG TTCCTCACTT GGGACCAACC C) TAAGCTTTA TCTATGTCGG GTGCGGAGAA AGAGGTAATG AAATGGCACA AGGAGAT CAC ACACCCAAAC CAAACTCGCC, em que a sequência em itálico é um sítio de PlâScel exclusivo e a sequência genómica de ratinho no braço de homologia 5' está entre parênteses. A sequência de nucleótidos através da junção entre o inserto e o braço 3' (SEQ ID NO: 13) incluiu o seguinte: CACATCAGTG AGGCTAGAAT AAATTAAAAT CGCTAATATG AAAATGGGG (ATTTGTACCT CTGAGTGTGA AGGCTGGGAA GACTGCTTTC AAGGGAC), em que a sequência genómica de ratinho no braço de homologia 3' está entre parênteses.

Dentro do inserto de ~59 kb, o gene Hâ2Ebl foi modificado da seguinte forma: uma região de 5.136 bp de Hâ2Ebl, incluindo os últimos 153 bp de intrão 1, exão 2, intrão 2, exão 3, e os primeiros 122 bp de intrão 3, foi substituída pela região homóloga de 3.111 bp de HLAâDRB1*04 humano, incluindo os últimos 148 bp de intrão 1, exão 2, intrão 2, exão 3 e os primeiros 132 bp de intrão 3. Na junção entre as sequências humanas e de ratinho de intrão 3, foi inserida uma cassete que consiste num sítio de lox2372 5', um promotor de UbC, um gene de resistência à neomicina e um sítio delox2372 3'. 0 gene resultante codificou uma proteína de HLAâDRB1*04/Hâ2Ebl quimérica composta por Hâ 2Ebl líder de ratinho, os domínios βΐ e β2 humanos de DRB1* 04 e o domínio t ransmembranar e a cauda citoplasmática de ratinho. A sequência de nucleótidos

através da junção de ratinho/humana em intrão 1 (SEQ ID NO :14) incluiu o seguinte: (TCCATCACTT CACTGGGTAG CACAGCTGTA ACTGTCCAGC CTG) GGTACCGAGC TCGGATCCAC TAGTAACGGC CGCCAGTGTG CTGGAATTC GCCCTTGATC GAGCTCCCTG GGCTGCAGGT GGTGGGCGTT GCGGGTGGGG CCGGTTAA, em que a sequência em itálico é um sítio de múltiplas clonagens introduzida durante as etapas de clonagem e as sequências de intrão 1 de ratinho estão entre parênteses. A sequência de nucleótidos através da junção entre o intrão 3 humano e a cassete de neomicina (SEQ ID NO:15) incluiu o seguinte: (ATCTCCATCA GAAGGGCACC GGT) ATAACTT CGTATAAGGT ATCCTATACG AAGTTATATG CATGGCCTCC GCGCCGGGTT, em que O sítio de lox23 72 5' está em itálico e a sequência de intrão 3 humano está entre parênteses. A sequência de nucleótidos através da junção entre a cassete de neomicina e o intrão 3 de ratinho (SEQ ID NO:16) incluiu o seguinte: ATAACTTCGT ATAAGGTATC CTATACGAAG TTÃTCTCGAG (TGGCTTACAG GTAGGTGCGT GAAGCTTCTA CAAGCACAGT TGCCCCCTGG), em que o sítio de lox23 72 3' está em itálico e a sequência de intrão 3 de ratinho está entre parênteses.

Além disso, dentro do inserto de ~59 kb, o gene H0 Ea foi modificado da seguinte forma: uma região de 1185 bp de Hâ 2Ea, incluindo os últimos 101 bp de intrão 1, exão 2, intrão 2, exão 3, e os primeiros 66 bp de intrão 3, foi substituída pela região homóloga de 1189 bp de HLAâDRAl*01 humano, incluindo os últimos 104 bp de intrão 1, exão 2, intrão 2, exão 3 e os primeiros 66 bp de intrão 3. Conforme descrito acima, visto que o exão 1 do alelo C57BL/6 de Hã 2Ea contém uma delação que torna o gene não funcional, o exão 1 de Hâ2Ea e o restante de intrão 1 foram substituídos pela região de 2.616 bp equivalente do alelo BALB/c de Hâ 2Ea, a qual é funcional. 0 gene resultante codificou uma proteína de HE3 2Ea/HLA0 DRA1*01 quimérica composta jbe HS 2Ea líder de ratinho de BALB/c, os domínios al e «2 humanos de DRA1*01 e o domínio transmembranar e a cauda citoplasmática de ratinho. A sequência de nucleótidos através da junção de ratinho/humana em intrão 1 (SEQ ID NO:17) incluiu o seguinte: (CTGTTTCTTC CCTAACTCCC ATTCTATGCT CTTCCATCCC GA) CCGCGGCCCA ATCTCTCTCC ACTACTTCCT GCCTACATGT ATGTAGGT, em que a sequência em itálico é um sítio de enzima de restrição introduzido durante as etapas de clonagem e as sequências de intrão 1 de BALB/c estão entre parênteses. A sequência de nucleótidos através da junção humana/de ratinho em intrão 3 (SEQ ID NO:18) incluiu o seguinte: CAAGGTTTCC TCCTATGATG CTTGTGTGAA ACTCGGGGCC GGCC (AGCATTTAAC AGTACAGGGA TGGGAGCACA GCTCAC), em que a sequência em itálico é um sítio de enzima de restrição introduzido durante as etapas de clonagem e as sequências de intrão 3 de ratinho estão entre parênteses. A sequência de nucleótidos através da junção de C57BL/6âBALB/c 5' de exão 1 (SEQ ID NO:19) incluiu o seguinte: (GAAAGCAGTC TTCCCAGCCT TCACACTCAG AGGTACAAAT) CCCCATTTTC ATATTAGCGA TTTTAATTTA TTCTAGCCTC, em que as sequências de C57BL/6 específico estão entre parênteses. A sequência de nucleótidos através da junção de BALB/câC57BL/6 3' de exão 1 (SEQ ID NO :20) incluiu o seguinte: TCTTCCCTAA CTCCCATTCT ATGCTCTTCC ATCCCGA CCG CGG (CCCAATC TCTCTCCACT ACTTCCTGCC TACATGTATG) , em que o sítio de restrição de SacII está em itálico e as sequências de C57BL/6 estão entre parênteses.

Exemplo 3. Geração de ratinhos de MHC II humanizado Diagramas simplificados da estratégia para gerar ratinhos de MHC II humanizado com a utilização do vetor do Exemplo 2 são apresentados nas Figuras 5 e 8.

Especificamente, o ADN de BAC de MAID1680 (descrito acima) foi utilizado para eletroporar células ES de MAID5111 para criar células ES modificadas que incluem uma substituição dos loci de IâA e IâE de ratinho endógeno por um fragmento genómico que contém um locus de DR4 humano/IâE de ratinho quimérico. As células ES positivas que contêm loci de IâA e IâE endógenos deletados substituídos por um fragmento genómico que contém um locus de DR4 humano/IâE de ratinho quimérico foram identificadas por um ensaio de PCR quantitativo com a utilização de sondas TAQMAN™ (Lie e Petropoulos, supra). A inserção das sequências de DRa humanas foi confirmada por PCR com a utilização de iniciadores hDRAlF (CTGGCGGCTTGAAGAATTTGG; SEQ ID NO:21), hDRAIR (CATGATTTCCAGGTTGGCTTTGTC; SEQ ID NO:22) e de sonda hDRAlP (CGATTTGCCAGCTTTGAGGCTCAAGG; SEQ ID NO:23). A inserção das sequências de ϋΕβ humanas foi confirmada por PCR com a utilização de iniciadores hDRBIF (AGGCTTGGGTGCTCCACTTG; SEQ ID NO :24), hDRBIR (GACCCTGGTGATGCTGGAAAC; SEQ ID NO:2 5) e de sonda hDRBIP (CAGGTGTAAACCTCTCCACTCCGAGGA; SEQ ID NO:26). A perda da cassete de higromicina a partir do vetor de direcionamento foi confirmada com iniciadores HYGF (TGCGGCCGATCTTAGCC; SEQ ID NO: 7) e HYGR (TTGACCGATTCCTTGCGG; SEQ ID NO: 8) e sonda HYGP (ACGAGCGGGTTCGGCCCATTC; SEQ ID NO:9).

Os clones de célula ES positiva foram, então, utilizados para implantar ratinhos fêmeas com a utilização do método VELOCIMOUSE® {supra) para gerar uma ninhada de filhotes que contém uma substituição dos loci de IâA e IâE endógenos por um locus de DR4 humano/IâE de ratinho quimérico. As células ES alvo descritas acima foram utilizadas como células ES doadoras e introduzidas num embrião de ratinho de estágio de 8 células pelo método de VELOCIMOUSE®. Os ratinhos que portam um locus de DR4 humano/IâE de ratinho quimérico foram identificados por genotipagem com a utilização de uma modificação do ensaio de alelo (Valenzuela et al., supra) que detetou a presença de um locus de DR4 humano/iSE de ratinho quimérico.

Os ratinhos que contêm um locus de DR4 humano/10 E é ratinho quimérico podem ser criados para uma estirpe de ratinho deletora Cre (vejaâse, por exemplo, a Publicação de Pedido de Patente Internacional n° WO 2009/114400) a fim de remover qualquer cassete de neomicina loxed introduzida pelo vetor de direcionamento que não é removido, por exemplo, no estágio de célula ES ou no embrião (consulte a Figura 6).

Exemplo 4. Expressão do HLAâDR4 quimérico em ratinhos geneticamente modificados

Baços de WT ou ratinhos de HLAâDR4 humanizado heterozigõticos ("1681 HET") foram perfundidos com Colagenase D (Roche Bioscience) e os eritroeitos foram lisados com tampão de lise ACK. splenócitos foram cultivados durante dois dias com 25 microgramas/ml de poli (I :C) para estimular a expressão de genes do MHCâII. A expressão de superfície de célula de HLAâDR4 humano foi analisada por FACS com a utilização de antiâCD3 (17A2), antiâCD19 (1D3), antiâCDllc (N418), antiâF480 (BM8), antiâlâA/IâE (M15) e antiâHLADR (L243) conjugados com fluorocromo. A citometria de fluxo foi realizada com a utilização de BDâLSRII. A expressão de HLAãDR4 humano foi claramente detetável na superfície de células B CD19+ e foi significativamente regulada de modo ascendente mediante o estímulo por agonista de recetor semelhante a toll poli(I:C) (consulte a Figura 9) .

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

<12Ο> RATINHOS DE COMPLEXO PRINCIPAL DE ΗISTOCOMPATIBILIDADE PRINCIPAL MODIFICADOS GENETICAMENTE

<13 0 > 121OAâWO <140> A ser atribuído <141> Depositado juntamente <150> 61/552.584 <151> 28âl0â2011 <160> 26 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0

<210 > 1 <2U> 19 <212 > ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 Ο > <223> Sintética < 4 Ο Ο > 1 cagaacgcca ggctgtaac 19

< 210 > 2 <211> 20 <212 > ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 Ο > <223> Sintética < 4 Ο Ο > 2 ggagagcagg gtcagtcaac 20 < 210 > 3 <211> 24

<212 > ADN <213> Sequência Artificial <22 Ο > <223> Sintética <4 Ο Ο > 3 caccgccact cacagctcct taca 24

< 210 > 4 <211> 22 <212 > ADN <213> Sequência Artificial <22 O > <223> Sintética <4 O O > 4 gtgggcacca tcttcatcat tc 22

< 210 > 5 <211> 22 <212 > ADN <213> Sequência Artificial <22 0 > <223> Sintética <400> 5 cttcctttcc agggtgtgac tc 22

< 210 > 6 <211> 23 <212 > ADN <213> Sequência Artificial <22 0 > <223> Sintética <400> 6 aggcctgcga tcaggtggca cct 23

<210> 7 <211> 17 <212 > ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Sintética < 4 0 0 > 7 tgcggccgat cttagcc 17

<210> 8 <211> 18 <212 > ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Sintética <400 > 8 ttgaccgatt ccttgcgg 18

<210> 9 < 211> 21 <212 > ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Sintética <400 > 9 acgagcgggt tcggcccatt c 21

< 210 > 10 <211> 140 <212 > ADN <213> Sequência Artificial <22 Ο > <223> Sintética <4 Ο Ο > 10 tttgtaaaca aagtctaccc agagacagat gacagacttc agctccaatg ctgattggtt 60 cctcacttgg gaccaaccct ctcgagtacc gttcgtataa tgtatgctat acgaagttat 120 atgcatccgg gtaggggagg 140 <210 > 11

< 211> 140 <212 > ADN <213> Sequência Artificial <22 0 > <223> Sintética < 4 0 0 > 11 cctcgacctg cagccctagg ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaac ggtagagctc 60 cacaggcatt tgggtgggca gggatggacg gtgactggga caatcgggat ggaagagcat 120 agaatgggag ttagggaaga 140

< 210 > 12 <211> 110 <212 > ADN <213> Sequência Artificial <22 0 > <223> Sintética < 4 0 0 > 12 tgctgattgg ttcctcactt gggaccaacc ctaagcttta tctatgtcgg gtgcggagaa 60 agaggtaatg aaatggca.ca aggagatcac acacccaaac caaactcgcc 110 <210 > 13

< 211> 96 <212 > ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Sintética <400 > 13 cacatcagtg aggctagaat aaattaaaat cgctaatatg aaaatgggga tttgtacctc 60 tgagtgtgaa ggctgggaag actgctttca agggac 96

< 210 > 14 <211> 150 <212 > ADN <213> Sequência Artificial <22 0 > <223> Sintética < 4 0 0 > 14 tccatcactt cactgggtag cacagctgta actgtccagc ctgggtaccg agctcggatc 60 cactagtaac ggccgccagt gtgctggaat tcgcccttga tcgagctccc tgggctgcag 120 gtggtgggcg ttgcgggtgg ggccggttaa 150 < 210 > 15 <211> 80

<212 > ADN <213> Sequência Artificial <22 Ο > <223> Sintética <4 Ο Ο > 15 atctccatca gaagggcacc ggtataactt cgtataaggt atcctatacg aagttatatg 60 catggcctcc gcgccgggtt 80

< 210 > 16 <211> 90 <212 > ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Sintética < 4 0 0 > 16 ataacttcgt ataaggtatc ctatacgaag ttatctcgag tggcttacag gtaggtgcgt 60 gaagcttcta caagcacagt tgccccctgg 90

<210 > 17 <211> 90 <212 > ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Sintética < 4 0 0 > 17 ctgtttcttc cctaactccc attctatgct cttccatccc gaccgcggcc caatctctct 60 ccactacttc ctgcctacat gtatgtaggt 90

<210 > 18 <211> 80 <212 > ADN <213> Sequência Artificial <22 0 > <223> Sintética <4 Ο Ο > 18 caaggtttcc tcctatgatg cttgtgtgaa actcggggcc ggccagcatt taacagtaca 60 gggatgggag cacagctcac 80

<210 > 19 < 211> 8 0 <212 > ADN <213> Sequência Artificial <22 0 > <223> Sintética <4 0 0 > 19 gaaagcagtc ttcccagcct tcacactcag aggtacaaat ccccattttc atattagcga 60 ttttaattta ttctagcctc 80 < 210 > 2 0 <211> 80

<212 > ADN <213> Sequência Artificial <22 Ο > <223> Sintética <4 Ο Ο > 20 tcttccctaa ctcccattct atgctcttcc atcccgaccg cggcccaatc tctctccact 60 acttcctgcc tacatgtatg 80

<210> 21 < 211> 21 <212 > ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Sintética < 4 0 0 > 21 ctggcggctt gaagaatttg g 21

<210> 22 <211> 24 <212 > ADN <213> Sequência Artificial <22 Ο > <223> Sintética <4 Ο Ο > 22 catgatttcc aggttggctt tgtc 24

<210> 23 <211> 26 <212 > ADN <213> Sequência Artificial <22 Ο > <223> Sintética <4 Ο Ο > 23 cgatttgcca gctttgaggc tcaagg 26

<210> 24 <211> 20 <212 > ADN <213> Sequência Artificial <22 0 > <223> Sintética <400> 24 aggcttgggt gctccacttg 20

<210> 25 < 211> 21 <212 > ADN <213> Sequência Artificial <22 0 > <223> Sintética <4 Ο Ο > 25 gaccctggtg atgctggaaa c 21

<210> 26 <211> 27 <212 > ADN <213> Sequência Artificial <22 O > <223> Sintética <4 O O > 2 6 caggtgtaaa cctctccact ccgagga 27

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Um roedor que contém uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido a do MHC II humano/de roedor quimérico num locus de gene a do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC II) endógeno e/ou que compreende uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido β do MHC II humano/de roedor quimérico num locus de gene β do MHC II endógeno, em que uma porção humana do polipéptido a do MHC II humano/de roedor quimérico contém domínios al e a2 do MHC II humano e/ou uma porção humana do polipéptido β do MHC II humano/de roedor quimérico contém domínios βΐ e β2 do MHC II humano, e em que o roedor expressa um complexo do MHC II quimérico funcional numa superfície de uma célula do roedor.
2. Roedor, de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido α do MHC II humano/de roedor quimérico é expressa sob controlo regulador de elementos reguladores e promotores a do MHC II de roedor endógeno e/ou a sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido β do MHC II humano/de roedor quimérico é expressa sob controlo regulador de elementos reguladores e promotores β do MHC II de roedor endógeno.
3. Roedor, de acordo com a reivindicação 1, em que uma porção de roedor do polipéptido a do MHC II humano/de roedor quimérico contém domínios transmembranares e citoplasmáticos de um polipéptido a do MHC II de roedor endógeno e/ou uma porção de roedor do polipéptido β do MHC II humano/de roedor quimérico contém domínios transmembranares e citoplasmãticos de um polipéptido β do MHC II de roedor endógeno.
4. Roedor, de acordo com a reivindicação 1, em que a porção humana do polipéptido a do MHC II humano/de roedor quimérico é codificada por um gene de cadeia a do HLA de classe II selecionado a partir do grupo que consiste num gene de cadeia oí do HLAâDR, um gene de cadeia α do HLAâDQ e um gene de cadeia oí do HLAâDP, e/ou uma porção humana do polipéptido β do MHC II humano/de roedor quimérico é codificada por um gene de cadeia oí do HLA de classe II humano selecionado a partir do grupo que consiste num gene de cadeia β do HLAâDR, um gene de cadeia β do HLAâDQ e um gene de cadeia β do HLAâDP.
5. Roedor, de acordo com a reivindicação 4, em que a porção humana do polipéptido a do MHC II humano/de roedor quimérico é codificada por um gene de cadeia α do HLAâDR4 humano e/ou a porção humana do polipéptido β do MHC II humano/de roedor quimérico é codificada por um gene de cadeia β do HLAâDR4 humano.
6. Roedor, de acordo com a reivindicação 1, em que o roedor é um ratinho.
7. Roedor, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que contém uma primeira sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido a do MHC II humano/de roedor quimérico e uma segunda sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido β do MHC II humano/de roedor quimérico num locus de gene do MHC II endógeno, em que uma porção humana do polipéptido a do MHC II humano/de roedor quimérico contém os domínios oil e o;2 do MHC II humano e uma porção humana do polipéptido β do MHC II humano/de roedor quimérico contém os domínios βΐ e β2 do MHC II humano, e em que os polipéptidos a do MHC II e β do MHC II humanos/de roedor quiméricos formam um complexo do MHC II funcional numa superfície de uma célula do roedor.
8. Roedor, de acordo com a reivindicação 7, em que o roedor é um ratinho e as porções de roedor dos polipéptidos α e β do MHC II quiméricos são codificados por genes α e β de Hâ2E de ratinho.
9. Roedor, de acordo com a reivindicação 7, em que o roedor não expressa polipéptidos do MHC II endógeno funcionais numa superfície de célula a partir de seus loci de MHC II de roedor endógeno.
10. Roedor, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o roedor é um ratinho que contém uma primeira sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido a do MHC II humano/de ratinho quimérico e uma segunda sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido β do MHC II humano/de ratinho quimérico num locus do MHC II de ratinho endógeno, em que uma porção humana do polipéptido a do MHC II quimérico contém os domínios al e a2 codificados por um gene de cadeia α do HLAâDR4 humano e a porção humana do polipéptido β do MHC II quimérico contém os domínios βΐ e β2 codificados por um gene de cadeia β do HLAâDR4 humano, em que uma porção de ratinho do polipéptido a do MHC II quimérico contém domínios transmembranares e citoplasmãticos de uma cadeia α de Hâ2E de ratinho e uma porção de ratinho do polipéptido β do MHC II quimérico contém domínios transmembranares e citoplasmãticos de uma cadeia β de Hâ2E de ratinho, e em que o ratinho expressa um complexo do MHC II de HLAâDR4/Hâ2E quimérico funcional numa superfície de uma célula do ratinho.
11. Método para modificar um locus do MHC II de um ratinho para expressar um complexo do MHC II humano/de ratinho quimérico que inclui substituir uma sequência de nucleótidos que codifica um complexo do MHC II de ratinho por uma sequência de nucleótidos que codifica um complexo do MHC II humano/de ratinho quimérico no locus do MHC II de ratinho endógeno, em que a sequência de nucleótidos que codifica o complexo do MHC II humano/de ratinho quimérico contém uma primeira sequência de nucleótidos que codifica domínios al e a.2 de um polipéptido a do MHC II humano e domínios transmembranares e citoplasmáticos de um polipéptido oí do MHC II de ratinho e uma segunda sequência de nucleótidos que codifica domínios βΐ e β2 de um polipéptido β do MHC II humano e domínios transmembranares e citoplasmáticos de um polipéptido β do MHC II de ratinho.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que os polipéptidos a e β do MHC II humano são codificados, respetivamente, por genes de cadeia α e β do HLA de classe II humano selecionados a partir do grupo que consiste em genes de cadeia α e β de HLAâDR, genes de cadeia α e β de HLAâDQ e genes de cadeia α e β de HLAâDP.
13. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que os polipéptidos α e β do MHC de ratinho são codificados, respetivamente, por genes α e β de Hâ2E de ratinho, e uma porção humana do complexo do MHC II quimérico é codificada por genes a e β do HLAãDR4 humano.
14. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que a substituição e realizada numa célula ES unica, e a célula ES única é introduzida num embrião de ratinho para produzir um ratinho.