CN114585744A - 转基因猪、其制造方法和用途以及制造人免疫系统小鼠的方法 - Google Patents
转基因猪、其制造方法和用途以及制造人免疫系统小鼠的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114585744A CN114585744A CN202180005989.3A CN202180005989A CN114585744A CN 114585744 A CN114585744 A CN 114585744A CN 202180005989 A CN202180005989 A CN 202180005989A CN 114585744 A CN114585744 A CN 114585744A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hla
- cells
- human
- thymus
- sla
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 104
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 title claims abstract description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 72
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 66
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 57
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 54
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 claims description 242
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 178
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 claims description 131
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 110
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 claims description 60
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 claims description 60
- 108010047762 HLA-DQ8 antigen Proteins 0.000 claims description 50
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 43
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 34
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 claims description 25
- 108010062347 HLA-DQ Antigens Proteins 0.000 claims description 14
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 claims description 14
- 101100220044 Homo sapiens CD34 gene Proteins 0.000 claims description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 7
- 102100028976 HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain Human genes 0.000 claims description 5
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 claims description 5
- 108010058607 HLA-B Antigens Proteins 0.000 claims description 5
- 108010010378 HLA-DP Antigens Proteins 0.000 claims description 5
- 102000015789 HLA-DP Antigens Human genes 0.000 claims description 5
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 claims description 5
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 claims description 5
- 101000937544 Homo sapiens Beta-2-microglobulin Proteins 0.000 claims description 5
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 claims description 4
- 102100028971 HLA class I histocompatibility antigen, C alpha chain Human genes 0.000 claims description 4
- 108010052199 HLA-C Antigens Proteins 0.000 claims description 4
- 230000006735 deficit Effects 0.000 claims description 4
- 102000047279 human B2M Human genes 0.000 claims description 4
- 102100028970 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain E Human genes 0.000 claims description 3
- 102100028966 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain F Human genes 0.000 claims description 3
- 102100028967 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain G Human genes 0.000 claims description 3
- 108010086786 HLA-DQA1 antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 108010024164 HLA-G Antigens Proteins 0.000 claims description 3
- 101000986085 Homo sapiens HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain E Proteins 0.000 claims description 3
- 101000986080 Homo sapiens HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain F Proteins 0.000 claims description 3
- 102100036241 HLA class II histocompatibility antigen, DQ beta 1 chain Human genes 0.000 claims description 2
- 108010065026 HLA-DQB1 antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 102100027314 Beta-2-microglobulin Human genes 0.000 claims 1
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 claims 1
- 102100036242 HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Human genes 0.000 claims 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 abstract description 153
- 241000282887 Suidae Species 0.000 abstract description 40
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 69
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 66
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 66
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 62
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 45
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 45
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 37
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 35
- 101000689199 Homo sapiens Src-like-adapter Proteins 0.000 description 34
- 102100024519 Src-like-adapter Human genes 0.000 description 34
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 32
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 30
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 30
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 30
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 29
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 27
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 27
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 27
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 25
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 25
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 25
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 25
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 24
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 24
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 23
- 230000006870 function Effects 0.000 description 22
- 238000010374 somatic cell nuclear transfer Methods 0.000 description 21
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 20
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 20
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 19
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 18
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 18
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 18
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 18
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 18
- 101000578784 Homo sapiens Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Proteins 0.000 description 17
- 102100028389 Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Human genes 0.000 description 17
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 17
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 17
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 17
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 16
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 16
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 16
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 16
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 15
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 15
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 210000003386 epithelial cell of thymus gland Anatomy 0.000 description 14
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 14
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 14
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 14
- 101001094545 Homo sapiens Retrotransposon-like protein 1 Proteins 0.000 description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 13
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 13
- 241000894007 species Species 0.000 description 13
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 12
- 241000194019 Streptococcus mutans Species 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 12
- 238000011161 development Methods 0.000 description 11
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 11
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 10
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 10
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 10
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 10
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 9
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 9
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 9
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 9
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 9
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 9
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 9
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 9
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 8
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 8
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 8
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 8
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 description 8
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 7
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 7
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 7
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 7
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 7
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 244000309715 mini pig Species 0.000 description 7
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 6
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 6
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 6
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 6
- 230000000961 alloantigen Effects 0.000 description 6
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 6
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 6
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 6
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 6
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 6
- 238000002689 xenotransplantation Methods 0.000 description 6
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 5
- 238000010446 CRISPR interference Methods 0.000 description 5
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 5
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 5
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 5
- 102000018682 Interleukin Receptor Common gamma Subunit Human genes 0.000 description 5
- 108010066719 Interleukin Receptor Common gamma Subunit Proteins 0.000 description 5
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 5
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 5
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 5
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 5
- 102100036301 C-C chemokine receptor type 7 Human genes 0.000 description 4
- 108091079001 CRISPR RNA Proteins 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 description 4
- 102000011786 HLA-A Antigens Human genes 0.000 description 4
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 4
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 101000716065 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 7 Proteins 0.000 description 4
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 description 4
- 101000856513 Homo sapiens Inactive N-acetyllactosaminide alpha-1,3-galactosyltransferase Proteins 0.000 description 4
- 102100025509 Inactive N-acetyllactosaminide alpha-1,3-galactosyltransferase Human genes 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 4
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 239000005441 aurora Substances 0.000 description 4
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 6,7-dimethyl-3-[[methyl-[2-[methyl-[[1-[3-(trifluoromethyl)phenyl]indol-3-yl]methyl]amino]ethyl]amino]methyl]chromen-4-one;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C=1OC2=CC(C)=C(C)C=C2C(=O)C=1CN(C)CCN(C)CC(C1=CC=CC=C11)=CN1C1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000266272 Acidithiobacillus Species 0.000 description 3
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 3
- 241001456553 Chanodichthys dabryi Species 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 3
- 241000589601 Francisella Species 0.000 description 3
- 101000924577 Homo sapiens Adenomatous polyposis coli protein Proteins 0.000 description 3
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 3
- 101100396742 Homo sapiens IL3RA gene Proteins 0.000 description 3
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 3
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 3
- 101001033279 Homo sapiens Interleukin-3 Proteins 0.000 description 3
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- 102100027268 Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Human genes 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 102100033493 Interleukin-3 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 3
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 3
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 3
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 241000194020 Streptococcus thermophilus Species 0.000 description 3
- 241000187191 Streptomyces viridochromogenes Species 0.000 description 3
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 3
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 3
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N dinoprostone Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N 0.000 description 3
- 229960002986 dinoprostone Drugs 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 3
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 3
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 3
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 3
- 238000011331 genomic analysis Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 102000055691 human APC Human genes 0.000 description 3
- 102000055276 human IL3 Human genes 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000010212 intracellular staining Methods 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 3
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 3
- XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N prostaglandin E2 Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(=O)C1CC=CCCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- -1 stem cell factor Proteins 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 210000000779 thoracic wall Anatomy 0.000 description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 3
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 3
- PZNPLUBHRSSFHT-RRHRGVEJSA-N 1-hexadecanoyl-2-octadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[C@@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PZNPLUBHRSSFHT-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000640374 Alicyclobacillus acidocaldarius Species 0.000 description 2
- 102100026882 Alpha-synuclein Human genes 0.000 description 2
- 241000620196 Arthrospira maxima Species 0.000 description 2
- 240000002900 Arthrospira platensis Species 0.000 description 2
- 235000016425 Arthrospira platensis Nutrition 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 101100284398 Bos taurus BoLA-DQB gene Proteins 0.000 description 2
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000193163 Clostridioides difficile Species 0.000 description 2
- 102220605874 Cytosolic arginine sensor for mTORC1 subunit 2_D10A_mutation Human genes 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100036243 HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 1 chain Human genes 0.000 description 2
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 2
- 101000834898 Homo sapiens Alpha-synuclein Proteins 0.000 description 2
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 101001105486 Homo sapiens Proteasome subunit alpha type-7 Proteins 0.000 description 2
- 101000652359 Homo sapiens Spermatogenesis-associated protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 101100207408 Homo sapiens TRA gene Proteins 0.000 description 2
- 101000800133 Homo sapiens Thyroglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102000010790 Interleukin-3 Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010038452 Interleukin-3 Receptors Proteins 0.000 description 2
- 241000186869 Lactobacillus salivarius Species 0.000 description 2
- 241000589242 Legionella pneumophila Species 0.000 description 2
- 206010025327 Lymphopenia Diseases 0.000 description 2
- 108700005092 MHC Class II Genes Proteins 0.000 description 2
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 2
- 241000179980 Microcoleus Species 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 2
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 2
- 102100021201 Proteasome subunit alpha type-7 Human genes 0.000 description 2
- 101150102498 SLC25A6 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 229940011019 arthrospira platensis Drugs 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 210000003995 blood forming stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000010001 cellular homeostasis Effects 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 230000011559 double-strand break repair via nonhomologous end joining Effects 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 2
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 2
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 229940115932 legionella pneumophila Drugs 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 231100001023 lymphopenia Toxicity 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 230000005783 single-strand break Effects 0.000 description 2
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 2
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- 102100026397 ADP/ATP translocase 3 Human genes 0.000 description 1
- 241000589220 Acetobacter Species 0.000 description 1
- 241001135190 Acetohalobium Species 0.000 description 1
- 241000604451 Acidaminococcus Species 0.000 description 1
- 241000192542 Anabaena Species 0.000 description 1
- 241000208223 Anacardiaceae Species 0.000 description 1
- 101100018715 Arabidopsis thaliana ILR3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001495180 Arthrospira Species 0.000 description 1
- 241001495183 Arthrospira sp. Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001239 CD8-positive, alpha-beta cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 101100067649 Caenorhabditis elegans gta-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010068051 Chimerism Diseases 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108091028732 Concatemer Proteins 0.000 description 1
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000007064 DNA hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 108700040192 Drosophila pum Proteins 0.000 description 1
- 238000011510 Elispot assay Methods 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 102100020715 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Human genes 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 102100030595 HLA class II histocompatibility antigen gamma chain Human genes 0.000 description 1
- 108010035452 HLA-A1 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 108060003760 HNH nuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000029812 HNH nuclease Human genes 0.000 description 1
- 101710160287 Heterochromatin protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 1
- 108010074870 Histone Demethylases Proteins 0.000 description 1
- 102000008157 Histone Demethylases Human genes 0.000 description 1
- 102000003893 Histone acetyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000246 Histone acetyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 101000932480 Homo sapiens Fms-related tyrosine kinase 3 ligand Proteins 0.000 description 1
- 101000986079 Homo sapiens HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain G Proteins 0.000 description 1
- 101001082627 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen gamma chain Proteins 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 101000716729 Homo sapiens Kit ligand Proteins 0.000 description 1
- 101001050886 Homo sapiens Lysine-specific histone demethylase 1A Proteins 0.000 description 1
- 101000652382 Homo sapiens O-phosphoseryl-tRNA(Sec) selenium transferase Proteins 0.000 description 1
- 101000616974 Homo sapiens Pumilio homolog 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 101150017040 I gene Proteins 0.000 description 1
- 101150106931 IFNG gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 241001501885 Isochrysis Species 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 241001147746 Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis Species 0.000 description 1
- 208000035752 Live birth Diseases 0.000 description 1
- 241001134698 Lyngbya Species 0.000 description 1
- 102100024985 Lysine-specific histone demethylase 1A Human genes 0.000 description 1
- 101710175243 Major antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000192041 Micrococcus Species 0.000 description 1
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 1
- 241000588649 Neisseria lactamica Species 0.000 description 1
- 241000192497 Oscillatoria Species 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 241000282520 Papio Species 0.000 description 1
- 241001504519 Papio ursinus Species 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187693 Rhodococcus rhodochrous Species 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108091006495 SLC25A6 Proteins 0.000 description 1
- 101000794214 Staphylococcus aureus Toxic shock syndrome toxin-1 Proteins 0.000 description 1
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 1
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 1
- 241000194022 Streptococcus sp. Species 0.000 description 1
- 241001518258 Streptomyces pristinaespiralis Species 0.000 description 1
- 101100121731 Sus scrofa GGTA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000993800 Sus scrofa Insulin Proteins 0.000 description 1
- 208000035010 Term birth Diseases 0.000 description 1
- 241000589596 Thermus Species 0.000 description 1
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 description 1
- 108010073062 Transcription Activator-Like Effectors Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 241000589892 Treponema denticola Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 210000005006 adaptive immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003975 animal breeding Methods 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000004970 cd4 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 229940119679 deoxyribonucleases Drugs 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012938 design process Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006718 epigenetic regulation Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 1
- 210000003194 forelimb Anatomy 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 230000007849 functional defect Effects 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 244000144980 herd Species 0.000 description 1
- 102000043353 human PUM1 Human genes 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 108010086646 insulin B (9-23) Proteins 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000007799 mixed lymphocyte reaction assay Methods 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000002747 omentum Anatomy 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 150000004032 porphyrins Chemical class 0.000 description 1
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 description 1
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 210000003314 quadriceps muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000384 rearing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 108010056030 retronectin Proteins 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 102200027048 rs121908259 Human genes 0.000 description 1
- 102200006537 rs121913529 Human genes 0.000 description 1
- 230000009758 senescence Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000003584 silencer Effects 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009126 specific adaptive response Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 208000010648 susceptibility to HIV infection Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 1
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 1
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000024664 tolerance induction Effects 0.000 description 1
- 230000037426 transcriptional repression Effects 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/26—Lymph; Lymph nodes; Thymus; Spleen; Splenocytes; Thymocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/12—Animals modified by administration of exogenous cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
- A01K2217/052—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing gain of function
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/108—Swine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
- A01K2267/025—Animal producing cells or organs for transplantation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
- A01K2267/0387—Animal model for diseases of the immune system
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本公开提供了转基因猪,其包含编码插入到猪基因组的一个或多个天然SLA基因座中的一种或多种HLA I多肽和/或一种或多种HLA II多肽的一个或多个核苷酸序列,提供了制造方法和使用方法。本公开还提供了制造人免疫系统小鼠的改良方法。
Description
与其它申请的交叉引用
本申请要求2019年10月22日提交的美国专利申请序列号62/924,228和2019年10月25日提交的美国专利申请序列号62/925,859的优先权,这两个专利申请特此通过引用整体并入。
政府利益声明
本发明是在由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的AI045897下受政府支持进行的。政府拥有本发明的某些权利。
技术领域
本公开提供了转基因猪,其包含编码插入到猪基因组的一个或多个天然SLA基因座中的一种或多种HLAI多肽和/或一种或多种HLAII多肽的一个或多个核苷酸序列,提供了制造方法和使用方法。
本公开还提供了制造人免疫系统小鼠的改良方法。
背景技术
人免疫系统(HIS)小鼠对于人自身免疫性疾病、移植和感染性疾病的研究具有巨大的潜力。在免疫缺陷小鼠中产生强健的人免疫系统所需的关键组织是人胎胸腺组织,其产生高度功能性的、多样化的人T细胞库。出生后的人胸腺组织缺乏产生大量人T细胞的生长潜力,所述人T细胞可以产生变得比它所处其包膜下的鼠肾更大。尽管一些人T细胞在免疫缺陷小鼠中的天然鼠胸腺中发育,但胸腺功能异常且紊乱,并且仅产生少量未进行适当耐受诱导所需的正常胸腺驯育的人T细胞。因此,认为人胎胸腺组织对于HIS小鼠模型是最佳的。然而,用于研究的人胎组织的可用性并不是必然的。因此,需要一种替代的组织来源。
猪胎胸腺组织可以提供该替代方案。猪胎(SW)胸腺(THY)组织当移植到免疫缺陷小鼠时,具有与人(HU)胎THY组织相似的生长特征,并且支持高水平的强健的人胸腺产生和来自人CD34+细胞的外周免疫重建。然而,SW胸腺上皮细胞(TEC)上HLA分子的缺失限制了常规T细胞的负向选择和识别TEC产生的HLA限制性抗原(TRA)的调节性T细胞的正向选择。它也限制了可以识别个体HLA情况下外来抗原的人T细胞的正向选择。因此,当使用猪胎胸腺组织产生HIS小鼠时,需要改良。另外,将猪胸腺组织用于其它适应症诸如向人异种移植时,需要改良。
本文描述了一种使用猪胎胸腺组织产生人免疫系统小鼠的改良方法。本文还描述了转基因猪。
发明内容
本文提供了转基因猪、产生此类猪的方法以及此类猪的用途。
在一个实施方案中,所述转基因猪包含编码插入到猪基因组的一个或多个天然SLA基因座中的一种或多种HLAI多肽和/或一种或多种HLAII多肽的一个或多个核苷酸序列。
在一些实施方案中,人HLA选自HLAI多肽和HLAII多肽。在一些实施方案中,人HLA1选自HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G。在一些实施方案中,HLAI多肽是HLA-A2。
在一些实施方案中,所述HLAII多肽选自HLA-DP、HLA-DM、HLA-DO、HLA-DQ和HLA-DR。在一些实施方案中,所述HLAII多肽是HLA-DQ8或SLA-DRa。在一些实施方案中,所述HLA-DQ8多肽通过编码HLA-DQ8的双顺反子载体(HLA-DQA1:03:01:01和HLA-DQB1:03:02:01)靶向所述天然SLA-DQα基因座。
在一些实施方案中,所述天然SLA基因座是SLA-1、SLA-2或SLA-3。在一些实施方案中,所述SLA基因座是SLA-DQα或SLA-DR基因座。在一些实施方案中,所述核酸插入或整合到天然SLA启动子后面。在一些实施方案中,编码HLA多肽的核酸插入或整合在天然SLA基因座的内含子1/外显子2接合点处。
在一些实施方案中,使用靶向载体将编码HLA多肽的核酸插入或整合到天然SLA基因座中。在一些实施方案中,所述载体是双顺反子的。在一些实施方案中,所述载体是无启动子的。
在一些实施方案中,所述载体还包含高效IRES元件。
在一些实施方案中,所述载体还包含聚腺苷酸化位点。在一些实施方案中,所述聚腺苷酸化位点是兔β-珠蛋白。
本文还提供了产生转基因猪的方法和转基因猪的用途,包括但不限于向人类受试者异种移植。
本文提供了用于产生人免疫系统小鼠的改良方法。
在一些实施方案中,该方法包括对所述小鼠进行胸腺切除并将猪胎胸腺组织和人CD34+细胞引入到所述小鼠中。在一些实施方案中,人CD34+细胞源自脐带血。
在一些实施方案中,该方法包括对所述小鼠进行胸腺切除并引入来自如本文所述的转基因猪的猪胎胸腺组织。
附图说明
出于说明本发明的目的,在附图中描绘了本发明的某些实施方案。然而,本发明不限于附图中描绘的实施方案的精确布置和手段。
图1.多基因插入到Sachs小型猪GGTA1基因座中。图1A是相同基因组靶向臂区段(蓝色)之间经由CRIPSR辅助的同源重组插入的10.5kbp转基因盒的示意图。该盒含有两个双顺反子单元,通过自剪接2A元件(黄色)连接,两者都由泛表达的CAG启动子驱动。图1B是来自克隆的转基因猪(右侧峰)和非转基因对照(左侧峰)的外周血淋巴细胞的FCM分析结果。
图2.编码人IL3受体的双顺反子盒靶向插入到天然猪ILRa启动子后面。图2A示出了IL3Ra基因下游的基因组区域(顶部)。IL3Ra基因的外显子2到pA位点以蓝色示出。SLC25A6基因的外显子2到pA位点以红色示出。用于添加人IL3Ra和IL3Rb链的靶向载体在底部示出。基因组相同序列(实心蓝色和红色)之间的同源重组引起15.7kbp的天然基因组序列(包括大部分天然IL3Ra基因)被7.1kbp的编码人IL3R链的序列置换,并用GFP CDS(绿色)标记SLC25A6基因的末端(经由T2A元件)。图2B示出了经启动子诱捕载体转染的胎儿成纤维细胞的第二轮流式分选。单独回收低GFP荧光细胞(白色)和高荧光细胞(黄色)。图2C是流式分选群体的靶向分析结果。使用包括载体序列外的一个引物的引物对在基因组DNA的上游末端和下游末端进行PCR,产生的条带指示在低荧光和高荧光级分中上游末端的正确靶向,而下游末端的PCR仅在高荧光群体中产生预期大小的条带。图2D示出了用来自高荧光分选群体的细胞通过SCNT产生的8个39天胎儿的基因组DNA的靶向分析的结果。所有8个胎儿都产生指示上游(US)和下游(DS)末端处正确靶向的条带。图2E是8个转基因胎肝细胞中基因表达的RT-PCR分析结果。正如预期的那样,所有8个胎儿都从重组SLC25A6-GFP基因产生转录本。所有8个也从人IL3Ra-IRES-IL3Rb盒产生正确剪接的转录本。
图3示出了SLA I基因的HLA-A2靶向。顶部示意图是天然基因。底部示意图是无启动子的靶向载体。通过在天然基因座的SLA内含子1/外显子2接合点附近的成对CRISPR/Cas9缺口增强的与无启动子的靶向载体的重组,引起添加了由成熟形式的人B2微球蛋白融合到HLA-A2的成熟编码序列(A*02:01)组成的盒。融合蛋白的前导肽由SLA1外显子1提供,所得转录本终止于兔β-珠蛋白聚腺苷酸化位点处。由于载体的无启动子设计,非常高比例的表达人B2m/HLA-A2融合体的细胞将正确地靶向DQA基因。
图4示出了在用IFN-g培养6天后(右侧曲线)或不用IFN-g的情况下(左侧曲线),用泛单倍型抗猪DR或抗猪DQ抗体染色的细胞的流式细胞分析结果。
图5示出了SLA-DQA基因的HLA-DQ8靶向。顶部示意图是天然基因。底部示意图是无启动子的靶向载体。通过在天然基因座的DRA内含子1/外显子2接合点附近的成对CRISPR/Cas9缺口增强的与无启动子的靶向载体的重组,引起添加了由人DQ8α的成熟形式(DQA*03:01)、IRES元件和DQ8β的前体形式(DQB1*03:02)组成,以兔β-珠蛋白聚腺苷酸化位点终止的盒。由于载体的无启动子设计,非常高比例的表达人DQ8α和DQ8β的细胞将正确靶向DQA基因。
图6示出了显示胸腺与外周APC之间HLA共有对于HIS小鼠中的人T细胞稳态的重要性的研究。图6A是实验设计的示意图。图6B是过继转移10天后每种类型小鼠中增殖性(Ki67+)T细胞的比例图。
图7示出了各种HIS小鼠中人免疫重建的比较。图7A是在转移后指定时间指定小鼠外周血中人CD3+细胞的数目图。图7B是显示移植后第15周来自代表性小鼠的T细胞表型的流式细胞术分析。
图8示出了在HLA-A2+人胸腺中而不是在猪胸腺中MART1 TCR的正向选择。CD34细胞用GFP-MART1 TCR进行慢病毒转导并注入接受指定THY移植物的胸腺切除的NSG小鼠体内。该图示出与HLA-A2+HU THY移植物相比,SW和HLA-A2阴性HU THY移植物中减少的GFP+MART1+TCR+(用MART1四聚体检测的)胸腺细胞数目。
图9示出了HLA限制性TCR的证据,克隆5(对由HLA-DQ8呈递的胰岛素B 9-23有特异性)当引入到人造血干细胞中时,在HIS小鼠的HLA-DQ8人胸腺中被正向选择,但只有当造血干细胞表达HLA-DQ8时才被负向选择。HLA-DQ8 Tg NSG小鼠接受用克隆5TCR转导的HLA-DQ8+人胎胸腺和HLA-DQ8或DQ8胎肝CD34+HSC。图9A示出与DQ8阴性HSC相比,在接受DQ8+的小鼠胸腺中GFP+克隆5CD4/8DP和SP胸腺细胞的绝对数目减少。图9B示出与DQ8-HSC相比,在接受DQ8+的小鼠胸腺中的双阴性胸腺细胞中T细胞谱系定向(CD1a+)克隆5(GFP+)细胞的富集。
具体实施方式
如本文所用,“表达”是指多核苷酸转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA随后翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸源自基因组DNA,则表达可以包括真核细胞中mRNA的剪接。
如本文所用的术语“分离的”是指基本上不含其它物质的分子或生物制品或细胞物质。
如本文所用,术语“功能性”可用于修饰任何分子、生物制品或细胞物质,以意在达到特定的、指定的效果。
如本文所用,术语“核酸序列”和“多核苷酸”可互换使用,是指任何长度的聚合形式的核苷酸,核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。因此,该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂种,或包含嘌呤和嘧啶碱基或其它天然的、经化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生化的核苷酸碱基的聚合物。
术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换使用并且在其最广泛的意义上是指两个或多个亚单位的氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的化合物。这些亚单位可以通过肽键连接。在另一个方面,亚单位可以通过其它键(例如酯、醚等)连接。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸,并且对可构成蛋白质序列或肽序列的氨基酸的最大数目没有限制。如本文所用,术语“氨基酸”是指天然和/或非天然的或合成的氨基酸,包括甘氨酸以及D和L光学异构体、氨基酸类似物和肽模拟物。
如本文所用,“靶”、“靶标”或“靶向”是指多核苷酸共价骨架的部分断裂或不断裂。在一个实施方案中,失活的Cas蛋白(或dCas)在与向导RNA形成DNA结合复合物后靶向核苷酸序列。因为dCas的核酸酶活性完全或部分失活,所以dCas与序列结合而不裂解或不完全裂解该序列。在一些实施方案中,用dCas靶向基因序列或其启动子可以抑制或阻止多核苷酸或基因的转录和/或表达。
术语“Cas9”是指该名称所指的CRISPR相关核酸内切酶。本文提供了非限制性的示例性Cas9,例如UniProtKB G3ECR1中提供的Cas9(CAS9_STRTR)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9,以及无核酸酶活性的Cas9、其各自的直系同源物和生物等效物。直系同源物包括但不限于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9(“spCas9”),来自嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)、嗜肺军团菌(Legionellapneumophilia)、乳糖奈瑟球菌(Neisseria lactamica)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitides)、新弗朗西斯菌(Francisella novicida)的Cas 9;和来自于各种细菌种类(包括氨基酸球菌属的种(Acidaminococcus)和新弗朗西斯菌U112)的Cpf1(其执行类似于Cas9的切割功能)。
如本文所用,术语“CRISPR”是指依赖于成簇规律间隔短回文重复序列路径的序列特异性遗传操纵技术。CRISPR可用于执行基因编辑和/或基因调节,以及简单地将蛋白质靶向特定的基因组位置。基因编辑是指一种类型的基因工程,其中通过向多核苷酸序列中引入缺失、插入或碱基取代来改变目标多核苷酸的核苷酸序列。基因调节是指增加或减少特定基因产物诸如蛋白质或RNA的产生。
如本文所用的术语“gRNA”或“向导RNA”是指采用CRISPR技术用于靶向特定基因进行校正的向导RNA序列。针对靶特异性设计gRNA和供体治疗性多核苷酸的技术是本领域众所周知的例如,Doench等人2014.Nature biotechnology 32(12):1262-7,Mohr等人2016.FEBS杂志3232-38,和Graham等人2015.Genome Biol.16:260。gRNA包含或可替代地基本上由或还进一步由包含CRISPR RNA(crRNA)和反式激活CRIPSPR RNA(tracr RNA)的融合多核苷酸;或包含CRISPR RNA(crRNA)和反式激活CRIPSPR RNA(tracrRNA)的多核苷酸组成。在一些方面,gRNA是合成的(Kelley等人2016.J of Biotechnology 233:74-83)。如本文所用,gRNA的生物等效物包括但不限于可以将Cas9或其等效物导向至特定的核苷酸序列,诸如细胞基因组的特定区域的多核苷酸或靶向分子。
术语“胚胎”是指多细胞生物发育的早期阶段。一般来说,在有性生殖的生物中,胚胎发育是指生命周期中刚在受精后开始并持续到身体结构(诸如组织和器官)形成的部分。每个胚胎以受精卵的形式开始发育,受精卵是配子融合(即雄性精细胞对雌性卵细胞受精)产生的单细胞。在胚胎发育的第一阶段,单细胞受精卵进行许多快速的细胞分裂(称为卵裂),以形成囊胚。
如本文所用的“转基因的”及其语法等同成分包括已经修饰的供体动物基因组,供体动物基因组已经修饰以将来自不同物种的非天然基因引入供体动物基因组的非直系同源、非内源位置,使得该基因的同源、内源型式(如果有的话)整个或部分保留。如本文所用的“转基因”、“转基因的”和语法等同成分不包括如本文所述的重编程基因组、敲除或其它修饰。
如本文所用的“耐受”是指抑制或降低移植物受者例如对供体抗原产生免疫反应的能力,否则这种免疫反应会响应于向受者引入非自身MHC抗原而产生。耐受可牵涉体液反应、细胞反应或体液和细胞反应。耐受的概念包括完全耐受和部分耐受。换句话说,如本文所用,耐受包括对移植物受者例如对供体抗原产生免疫反应的能力的任何程度的抑制。
如本文所用的“造血干细胞”是指能够发育成成熟骨髓细胞和/或淋巴细胞的细胞。优选地,造血干细胞能够长期再增殖骨髓和/或淋巴谱系。源自受者或供体脐带血的干细胞可用于本公开的方法中。
如本文所用的“小型猪”是指完全或部分近交的小型猪。
如本文所用的“移植物”是指身体部位、器官、组织、细胞或其部分。
缩写
SW- 猪
HU- 人
TEC- 胸腺上皮细胞
TMC- 胸腺间充质细胞
WBC- 白细胞
DP- 双阳性细胞(CD4+、CD8+)
SP- 单阳性细胞(CD4+或CD8+)
Treg- 调节性T细胞
LN- 淋巴结
TRA- 组织限制性抗原
HSC- 人造血细胞
NSG- NOD scid常见γ链敲除
SCNT- 体细胞核转移
本公开提供了转基因猪,其包含编码插入到猪基因组SLA基因座中的HLAI或HLAII多肽的核苷酸序列,提供了产生此类转基因猪的方法,以及使用此类转基因猪的方法。
本公开还提供了使用来自转基因猪胎的胸腺产生的人免疫系统(HIS)小鼠,以及使用来自猪胎的胸腺和来自脐带血的CD34+细胞产生的人免疫小鼠,以及产生此类HIS小鼠的方法。
转基因猪
本发明人先前已经证实,在猪胸腺移植物中存在强健的人胸腺产生(Nikolic等人1999;Shimizu等人2008;Kalscheuer等人2014)。然而,与人胎胸腺相比,在猪中产生的外周人T细胞在HLA限制性免疫功能和稳态以及对组织限制性抗原的耐受性方面显示出细微受损。将转基因HLA分子添加到猪胸腺组织中可以克服大多数这些限制。因此,本文公开了几个转基因猪品系,这些品系表达常见HLA等位基因,代替一些猪白细胞抗原(SLA,HLA的猪对应物)分子。这些转基因猪可以作为胸腺组织的来源用于许多目的,包括产生HIS小鼠和作为供体组织。常见HLA分子的转基因表达将会改善HLA限制性人T细胞的正向选择和外周与人抗原呈递细胞(APC)有效相互作用的功能调节性T(Treg)细胞的产生,并且将会改善人TRA反应性T细胞的负向选择,从而降低自身免疫的风险。
接受猪胸腺肾移植物的狒狒已经显示出在猪胸腺移植物中有受者(狒狒)胸腺重新产生的证据,在Elispot和MLR测定中外周出现最近的胸腺迁移和供体特异性无反应,以及非Gal天然抗体的下降。虽然后者可能反映了猪肾的吸收,但在这些异种移植物上检测到了最低限度的IgM结合,没有补体固定或显著的病理。因此,用该模型获得的结果证明了复合胸腺-肾异种移植物在灵长类动物中诱导耐受性的潜力。
在异种猪胸腺中产生人T细胞库的限制包括优先识别猪MHC上的微生物抗原,这对于保护移植物是有用的,但不会优化对感染宿主的微生物病原体的防护,以及不能负向选择常规T细胞和正向选择识别人组织限制性抗原(TRA)的Treg。事实上,对人源化小鼠的研究已经证实,当人T细胞在猪而不是人胸腺移植物中发育时,免疫接种后对人APC呈递的肽的反应降低。
克服这一限制的一种方法牵涉创造“杂交胸腺”,其中将从胸腺切除标本获得的或从干细胞产生的受者胸腺上皮细胞注射到猪胸腺组织中。已经产生了来自出生后胸腺供体的杂交胸腺,其中杂交胸腺促进了人T细胞对人TRA的耐受性。
已经证实猪胸腺移植物会支持正常的、多种鼠或人T细胞库的发育,并且这些T细胞对异种猪供体具有特别耐受。然而,识别外周受者HLA分子呈递的外来抗原是次优的。因此,免疫功能可能达不到最佳状态。如先前在共有申请PCT/US2019/0051865中所示,这可以通过在猪-人杂交胸腺移植物中提供受者TEC来克服,因为这些TEC将参与正向选择,产生可以更容易地识别外周受者HLA分子呈递的外源抗原的T细胞。对于猪胸腺移植物,在外周找不到其“正向选择”配体的T细胞的存活、稳态和功能是次优的。正向选择配体是TEC上的MHC/肽复合物,当胸腺细胞具有识别该复合物的低亲和力T细胞受体时,该复合物挽救胸腺细胞免于程序性细胞死亡。在猪-人杂交胸腺中提供受者TEC允许对将在外周的受者细胞上找到相同配体的T细胞的正向选择,从而赋予正常的存活、稳态和功能。这样使用杂交胸腺代替简单的猪胸腺可以改善猪胸腺中产生的人T细胞库的功能和自身耐受性,同时允许猪发展耐受性。由此断定,使用转基因猪胸腺也可以改善猪胸腺中产生的人T细胞库的功能和自身耐受性。因此,这里公开的转基因猪也可以用作供体胸腺组织的来源。
Sachs小型猪群是由David Sachs博士在20世纪70年代从两只种动物建立的。这些动物的MHC(猪白细胞抗原,SLA)由Sachs博士在血清学上限定,并且已经保留了3个SLA纯合的部分近交系,以及许多SLA内重组体。这些猪可以是本文公开的转基因猪的来源动物(美国专利号6,469,229(Sachs)、美国专利号7,141,716(Sachs),其中每个公开通过引用并入本文)。通过所描述的方法创造此类猪,和/或在创造后利用此类猪和后代,可以用于本发明的实践,包括但不限于利用源自此类猪的器官、组织和/或细胞。
在一些实施方案中,来自所述猪的细胞是原材料。在一些实施方案中,所述细胞是成纤维细胞。在一些实施方案中,所述细胞来自GTA1无效、SLA单倍型h纯合Sachs小型猪(SLA-1*02:01、SLA-1*07:01、SLA-2*02:01、SLA-3无效、SLA-DRA*01:01:02、SLA-DRB*02:01、SLA-DQA*02:02:01、SLADQB*04:01:01)。由于这些动物的部分近交性质,子代将具有高度的遗传相似性。
在一些实施方案中,先前已经通过将编码HLA多肽的核酸序列插入或整合到天然SLA基因座中而修饰的细胞是原材料。
在人中,主要组织相容性复合体(MHC)分子称为HLA,是人白细胞抗原的首字母缩写,并且是由位于染色体6p21.3的HLA区域编码的。HLA区段分为三个区域(从着丝粒到端粒),II类、III类和I类。这些细胞表面蛋白负责调节人的免疫系统。HLA基因是高度多态性的,这意味着它们具有许多不同的等位基因,允许它们微调适应性免疫系统。由某些基因编码的蛋白质也称为抗原,这是它们作为器官移植因子的历史性发现的结果。不同的类别具有不同的功能。
对应于MHC I类(A、B和C)的HLA(全部是HLA1类)从细胞内部呈递肽。一般来说,这些特定肽是长度为约9个氨基酸的小聚合物。由MHC I类呈递的外来抗原吸引破坏细胞的杀伤T细胞(也称为CD8阳性或细胞毒性T细胞)。MHC I类蛋白与β2-微球蛋白缔合,与15号染色体上的基因编码的HLA蛋白不同。
对应于MHC II类(DP、DM、DO、DQ和DR)的HLA将抗原从细胞外呈递至T淋巴细胞。这些特定抗原刺激T辅助细胞(也称为CD4阳性T细胞)的倍增,进而刺激产生抗体的B细胞产生针对该特定抗原的抗体。自身抗原受调节性T细胞阻抑。已知受影响的基因编码4种不同的调节因子,控制MHC II类基因的转录。
对应于MHC III类的HLA编码补体系统的组分。
除了编码6种主要抗原呈递蛋白的基因外,还有大量牵涉免疫功能的其它基因位于HLA复合体上。
人类群体中HLA的多样性是疾病防御的一个方面,因此,两个不相关的个体在所有基因座上具有相同HLA分子的几率极低。HLA基因在历史上已被鉴定为是能够在HLA相似个体之间成功移植器官的结果。
每个人细胞表达六个MHC I类等位基因(每个亲本一个HLA-A、HLA-B和HLA-C等位基因)和六至八个MHC II类等位基因(每个亲本一个HLA-DP和HLA-DQ,及一个或两个HLA-DR,以及这些的组合)。人类群体中的MHC变异很高,HLA-A基因至少有350个等位基因,HLA-B有620个等位基因,DR有400个等位基因且DQ有90个等位基因。在人类中,MHC II类分子由三个不同的基因座编码,HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP,这三个基因座展示出彼此约.70%的相似性。多态性是MHC II类基因的显著特征。这种遗传多样性在异种移植期间呈现出问题,在异种移植中受者的免疫反应是决定植入结果和移植后的存活率的最重要的因素。
在一些实施方案中,本公开包括通过将编码一个或多个人HLA多肽的核酸插入或整合到猪的一个或多个天然SLA基因座中来修饰猪。
在一些实施方案中,人HLA选自HLA1多肽和HLAII多肽。在一些实施方案中,人HLA1选自HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G。在一些实施方案中,HLAI多肽是HLA-A2。在一些实施方案中,所述HLAII多肽选自HLA-DP、HLA-DM、HLA-DO、HLA-DQ和HLA-DR。在一些实施方案中,HLAII多肽是HLA-DQ8。
在一些实施方案中,人HLA是已知的HLA多肽。此类HLA序列例如在IPD-IMGT/HLA数据库(在ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/可获得)和国际ImMunoGeneTics信息系统.RTM.(在imgt.org可获得)中可获得。例如,HLA-A1、B8、DR17是高加索人中最常见的HLA单倍型,频率为5%。因此,可以使用已知的HLA序列信息与本文所述的方法组合来执行所公开的方法。
在一些实施方案中,编码人HLA多肽的核酸源自特定人类个体。在一些实施方案中,使用源自特定人类个体的编码人HLA多肽的核酸产生转基因猪,并且来自该转基因猪的胸腺组织或其它细胞、组织或器官将引入到相同的特定人类个体中。在这些实施方案中,来自将会接受来自转基因猪的异种移植的特定人类个体的人白细胞抗原(HLA)基因经鉴定和测序。应当理解,可以通过本领域已知的方法对特定HLA等位基因进行鉴定和测序。
可以将已知的人HLA序列或来自特定人类个体的经鉴定和测序的HLA序列引入到受SLA启动子控制的载体中,例如与HLA序列具有90%、95%、98%、99%或100%的序列同源性。
在一些实施方案中,编码HLA多肽的核酸可以优化为具有HLA多肽的序列或模拟受者哺乳动物的HLA等位基因。
在一些实施方案中,HLA多肽与另一种蛋白质融合。在一些实施方案中,所述蛋白质是人β-2微球蛋白(B2M)。在一些实施方案中,HLA-A2与B2M融合。。将HLA-A2和人B2m以融合蛋白的形式引入将确保HLA-A2和猪B2m之间的异型相互作用不会干扰HLA-A2表面表达。
在一些实施方案中,天然SLA基因座是SLAI。在一些实施方案中,天然SLA基因座是SLA-1或SLA-2。在一些实施方案中,SLA基因座是SLA-DQα基因座。在一些实施方案中,所述核酸插入或整合到天然SLA启动子后面。在一些实施方案中,编码HLA多肽的核酸插入或整合在天然SLA基因座的内含子1/外显子2处。
在一些实施方案中,使用靶向载体将编码HLA多肽的核酸插入或整合到天然SLA基因座中。在一些实施方案中,所述载体是双顺反子的。在一些实施方案中,所述载体是无启动子的。载体的无启动子设计的使用确保非常高比例的表达人B2m/HLA-A2融合体的细胞将正确地靶向DQA基因。
在一些实施方案中,所述载体还包含高效IRES元件。
在一些实施方案中,所述载体还包含聚腺苷酸化位点。在一些实施方案中,所述聚腺苷酸化位点是兔β-珠蛋白。
通过整合或插入编码HLA多肽的核酸来修饰SLA基因座的方法包括使用如下所述的位点特异性核酸酶。
因此本文提供了产生转基因猪的方法。一方面,对特定人类个体受者的HLA基因进行测序并用于构建靶向载体以引入到猪细胞中。另一方面,来自WHO数据库的已知人HLA基因型可构建靶向载体以引入到猪细胞中。使用编码HLA多肽的核酸构建如本文所述的靶向载体。可以制备CRISPR-Cas9质粒。鉴定猪细胞中SLA/MHC基因座处的CRISPR裂解位点,并且设计靶向裂解位点的gRNA序列并克隆到一个或多个CRISPR-Cas9质粒中。然后将CRISPR-Cas9质粒连同靶向载体一起施用到猪细胞中。
一旦修饰完成,就使用本领域已知的方法筛选细胞进行所需修饰。带有所需修饰的细胞可用作体细胞核转移(SCNT)供体细胞,用于核转移/胚胎转移和转基因猪胎和猪崽的产生,这也通过本领域已知的方法进行。
转基因猪胎在大约40周时收获。将分析这些胎中所需HLA基因的表达和正确整合。将发现具有正确整合的胎儿用作SCNT克隆的细胞系来源,用于产生另外的胎儿和猪崽。在大约56-70周收获胎儿用于胸腺分离。
所述胎儿也将用于产生转基因种公猪。
来自转基因猪胎的胸腺组织具有许多用途,包括但不限于产生如下所述的改良人免疫系统(HIS)小鼠。
来自转基因猪胎的细胞、组织和/或器官,包括胸腺组织,也可用于受试者中异种移植以及恢复或复原胸腺功能损伤和重建T细胞。在一些实施方案中,受试者是哺乳动物。在一些实施方案中,受试者是人。
与源自野生型猪的细胞、组织和器官相比,源自转基因猪的用于异种移植目的的细胞、组织和器官的排斥将会减少。
本公开还涵盖在第一物种的受者哺乳动物中进行异种移植的方法,该方法包括将胸腺组织引到入受者哺乳动物中,其中所述胸腺组织来自本文所述的转基因猪。
本公开还提供了在第一物种的受者哺乳动物中复原或诱导免疫能力的方法,该方法包括将胸腺组织引入到受者哺乳动物中的步骤,其中所述胸腺组织来自本文所述的转基因猪。
本公开还提供了在第一物种的受者哺乳动物中复原或促进T细胞祖细胞发育成成熟功能性T细胞的胸腺依赖性能力的方法,该方法包括将胸腺组织引入到第一物种的受者哺乳动物中,其中所述胸腺组织来自本文所述的转基因猪。
在一个实施方案中,在引入胸腺组织之前,受者哺乳动物中胸腺功能基本上不存在。在另一个实施方案中,在引入胸腺组织之前,受者哺乳动物被切除胸腺。在再另一个实施方案中,受者哺乳动物患有免疫病症。
第二物种可以是猪,诸如转基因猪。
第一物种可以是灵长类动物,诸如非人灵长类动物或人。
在一个实施方案中,受者哺乳动物是人且供体哺乳动物是本文所述的转基因猪。在一些实施方案中,受者人是编码HLA多肽的核酸的来源,该核酸被引入到猪中以产生转基因猪。在一些实施方案中,编码HLA多肽的核酸是本领域已知的核酸。
在一个实施方案中,胸腺组织被植入受者哺乳动物体内。例如,胸腺组织可以作为主要血管化的胸腺叶或复合胸腺-肾移植物植入。胸腺组织可以在受者中进行肌内移植。胸腺组织可以单独移植到受者的四头肌中或者与另外移植部位(诸如肾包膜和网膜)一起移植。
CRISPR/Cas和其它核酸内切酶
任何合适的核酸酶都可以用于本发明的方法中以产生转基因猪。核酸酶是水解核酸的酶。核酸酶可分为核酸内切酶或核酸外切酶。核酸内切酶是催化DNA或RNA分子内部核酸之间的键水解的一组酶中的任何一种。核酸外切酶是催化DNA或RNA链末端的单核苷酸水解的一组酶中的任何一种。核酸酶也可以基于它们是特异性消化DNA还是RNA来分类。特异性催化DNA水解的核酸酶可称为脱氧核糖核酸酶或DNA酶,而特异性催化RNA水解的核酸酶可称为核糖核酸酶或RNA酶。一些核酸酶对单链或双链核酸序列有特异性。一些酶具有核酸外切酶和核酸内切酶两种特性。另外,一些酶能够消化DNA和RNA两种序列。
核酸内切酶的非限制性实例包括锌指核酸酶(ZFN)、ZFN二聚体、ZFNickase、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)或RNA导向的DNA核酸内切酶(例如,CRISPR/Cas)。大范围核酸酶是特征在于其能够识别和切割大的DNA序列(12个碱基对或更大)的核酸内切酶。在本发明方法中可以使用任何合适的大范围核酸酶在宿主基因组中创造双链断裂,包括LAGLIDADG和PI-Sce家族中的核酸内切酶。
本公开的一个方面提供了RNA导向的核酸内切酶。RNA导向的核酸内切酶也包含至少一个核酸酶结构域和至少一个与向导RNA相互作用的结构域。RNA导向的核酸内切酶受向导RNA引导至特定核酸序列(或靶位点)。向导RNA与RNA导向的核酸内切酶以及靶位点相互作用,使得一旦被引导至靶位点,RNA导向的核酸内切酶就能够向靶位点核酸序列中引入双链断裂。因为向导RNA提供了靶向裂解的特异性,所以RNA导向的核酸内切酶的核酸内切酶是通用的并且可以与不同的向导RNA一起用于裂解不同的靶核酸序列。
可与本文所述的方法和组合物一起使用的RNA导向的序列特异性核酸酶系统的一个实例包括CRISPR系统(Wiedenheft等人2012Nature 482:331-338;Jinek等人2012Science 337:816-821;Mali等人2013Science 339:823-826;Cong等人2013.Science339:819-823)。CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列)系统利用RNA导向的DNA结合和靶DNA的序列特异性裂解。向导RNA/Cas组合赋予核酸酶位点特异性。单个向导RNA(sgRNA)含有约20个核苷酸,其与基因组PAM(前间区序列邻近基序)位点(例如NGG)上游的靶基因组DNA序列和恒定RNA支架区互补。Cas(CRISPR相关)蛋白与sgRNA和sgRNA所结合的靶DNA结合,并在PAM位点上游的限定位置引入双链断裂。Cas9隐匿两个与HNH和RuvC核酸内切酶同源的独立核酸酶结构域,并且通过使所述两个结构域中的任一个突变,Cas9蛋白可以转化为引入单链断裂的切口酶(Cong等人2013Science 339:819-823)。具体考虑到本公开的方法和组合物可以与单链或双链诱导型式的Cas9,以及其它RNA导向的DNA核酸酶,诸如其它细菌Cas9样系统一起使用。本文所述的本发明方法和组合物的序列特异性核酸酶可以是工程化的、嵌合的或从生物体中分离的。核酸酶可以呈DNA、mRNA和蛋白质的形式引入细胞中。
本领域技术人员认识到到,可以针对靶特异性产生gRNA,以靶向特定基因,任选与疾病、病症或病状相关的基因。因此,与Cas9组合,向导RNA促进CRISPR/Cas9系统的靶特异性。其它方面,诸如启动子选择,可以提供实现靶特异性的其它机制,例如,选择编码促进在特定器官或组织中表达的多核苷酸的向导RNA的启动子。因此,本文考虑了针对特定疾病、病症或病状选择合适的gRNA。在一个实施方案中,gRNA与包含单核苷酸多态性(SNP)的基因或等位基因杂交。
合适的CRISPR/Cas蛋白的非限制性实例包括Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(或CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas10d、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1(或CasA)、Cse2(或CasB)、Cse3(或CasE)、Cse4(或CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csz1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cu1966。
在一个实施方案中,RNA导向的核酸内切酶源自II型CRISPR/Cas系统。在特定实施方案中,RNA导向的核酸内切酶源自Cas9蛋白。Cas9蛋白可以来自酿脓链球菌、嗜热链球菌、链球菌属(Streptococcus sp.)、达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)、始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)、绿产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)、绿产色链霉菌、玫瑰链孢囊菌(Streptosporangium roseum)、玫瑰链孢囊菌、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、假丝状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)、还原硒酸盐芽孢杆菌(Bacillus selenitireducens)、西伯利亚微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)、德氏乳酸杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)、唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius)、海洋微颤菌(Microscillamarina)、伯克氏菌目细菌(Burkholderiales bacterium)、食萘极单胞菌(Polaromonasnaphthalenivorans)、极单胞菌属(Polaromonas sp.)、瓦氏鳄球藻(Crocosphaerawatsonii)、蓝丝菌属(Cyanothece sp.)、铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、聚球藻属(Synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋盐杆菌(Acetohalobium arabaticum)、丹氏制氨菌(Ammonifex degensii)、热解纤维素菌(Caldicelulosiruptor becscii)、辐射合成细菌(Candidatus Desulforudis)、肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)、艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、嗜热盐碱厌氧菌(Natranaerobius thermophilus)、喜温发酵菌(Pelotomaculum thermopropionicum)、喜温嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans)、酒色异着色菌(Allochromatium vinosum)、海杆菌属(Marinobactersp.)、嗜盐亚硝化球菌(Nitrosococcus halophilus)、海洋亚硝化球菌(Nitrosococcuswatsoni)、游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)、消旋纤线杆菌(Ktedonobacter racemifer)、伊夫氏甲烷盐菌(Methanohalobium evestigatum)、多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)、泡沫节球藻(Nodularia spumigena)、念珠藻属(Nostocsp.)、极大节旋藻(Arthrospira maxima)、钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)、节旋藻属(Arthrospira sp.)、鞘丝藻属(Lyngbya sp.)、喜泥微鞘藻(Microcoleuschthonoplastes)、颤藻属(Oscillatoria sp.)、移动石孢菌(Petrotoga mobilis)、非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)或海洋单细胞蓝藻菌(Acaryochloris marina)。
在一些实施方案中,编码Cas(例如,Cas9)核酸酶的核苷酸序列经修饰以改变蛋白质的活性。在一些实施方案中,Cas(例如,Cas9)核酸酶是无催化活性的Cas(例如,Cas9)(或催化失活的/有缺陷的Cas9或dCas9)。在一个实施方案中,dCas(例如,dCas9)是由于野生型Cas(例如,Cas9)的一个或两个核酸内切酶催化位点(RuvC和HNH)的点突变而缺乏核酸内切酶活性的Cas蛋白(例如,Cas9)。例如,dCas9含有催化活性残基(D10和H840)的突变并且不具有核酸酶活性。在一些情况下,dCas裂解靶DNA的互补链和非互补链的能力降低。在一些情况下,dCas9隐匿酿脓链球菌Cas9氨基酸序列的D10A和H840A两个突变。在一些实施方案中,当dCas9具有降低的或缺陷有的催化活性时(例如,当Cas9蛋白具有D10、G12、G17、E762、H840、N854、N863、H982、H983、A984、D986和/或A987突变,例如D10A、G12A、G17A、E762A、H840A、N854A、N863A、H982A、H983A、A984A和/或D986A时),Cas蛋白仍然可以以位点特异性方式与靶DNA结合,因为它仍然被受试多核苷酸(例如,gRNA)的DNA靶向序列导向至靶多核苷酸序列,只要它保持与受试多核苷酸(例如,gRNA)的Cas结合序列相互作用的能力。
Cas核酸内切酶活性的失活可以创造催化失活的Cas(dCas,例如dCas9)。dCas可以结合但不能裂解DNA,从而通过对转录因子的作用创造物理屏障来阻止靶基因的转录。CRISPR的这种再现以可逆方式在转录水平起作用。这种策略已经被称为CRISPR干扰,或CRISPRi。在CRISPR干扰(CRISPRi)中,dCas融合蛋白(例如,与另一种蛋白或其部分融合的dCas)可用于当前公开的方法中。在一些实施方案中,dCas与(转录)阻遏结构域或转录沉默子融合。转录阻遏结构域的非限制性实例包括Krüppel相关盒(KRAB)结构域、ERF阻遏结构域(ERD)、mSin3A相互作用结构域(SID)结构域、SID多联体(例如SID4X)或其同源物。转录沉默子的非限制性实例包括异染色质蛋白1(HP1)。可以通过使Cas(例如,dCas)与Kruppel相关盒阻遏结构域(KRAB)融合来改变CRISPRi,从而增强Cas的阻遏作用。Gilbert等人2013.Cell154(2):442–51。
第二代CRISPRi经由PUF-KRAB阻遏子强烈阻遏。已知PUF蛋白(以果蝇(DrosophilaPumilio)和秀丽隐杆线虫(C.elegans)fern-3结合因子命名)会牵涉介导mRNA的稳定性和翻译。这些蛋白质含有独特的RNA结合结构域,称为PUF结构域。结合RNA的PUF结构域,诸如人Pumilio 1蛋白(这里也称为PUM)的结构域,含有8个重复序列(每个重复序列称为PUF基序或PUF重复序列),所述重复序列以反平行的方式结合连续碱基,每个重复序列识别一个碱基,即PUF重复序列R1至R8分别识别核苷酸N8至N1。例如,PUM由八个串联重复序列组成,每个重复序列由34个氨基酸组成,所述氨基酸折叠成由α螺旋组成的紧密堆积的结构域。PUF及其衍生物或功能变体是可编程的RNA结合结构域,可用于本发明的方法和系统中,作为PUF结构域融合的一部分,该部分将任何效应结构域带到受试多核苷酸(例如,gRNA)上的特定PUF结合序列。
本发明方法可以使用CRISPR缺失(CRISPRd)。CRISPRd利用DNA修复策略默认NHEJ的趋势,并且不需要供体模板即可修复裂解的链。相反,Cas首先在隐匿突变的基因中创造DSB,然后进行NHEJ,并且引入破坏序列的插入和/或缺失(INDEL),从而阻止基因表达或发生正确的蛋白质折叠。这种策略可能特别适用于显性条件,在这种情况下,敲除突变的显性等位基因并保持野生型等位基因完好可能足以将表型复原为野生型。
在某些实施方案中,Cas酶可以是催化缺陷型Cas(例如,Cas9)或dCas,或者Cas切口酶或切口酶。
Cas酶(例如,Cas9)可以经修饰以起到切口酶的作用,这样命名是因为它通过诱导单链断裂而不是DSB来对DNA产生“切口”。如本文所用,术语“Cas切口酶”或“切口酶”是指仅能够裂解双联式核酸分子(例如,双联式DNA分子)的一条链的Cas蛋白。在一些实施方案中,Cas切口酶可以是美国专利号10,167,457中公开的任何切口酶,该专利的内容通过引用整体并入本文。在一个实施方案中,Cas(例如,Cas9)切口酶具有活性HNH核酸酶结构域,并且能够裂解DNA的非靶向链,即gRNA结合的链。在一个实施方案中,Cas(例如,Cas9)切口酶具有无活性的RuvC核酸酶结构域,并且不能裂解DNA的靶向链,即需要碱基编辑的链。在一些实施方案中,Cas切口酶裂解双联式核酸分子的靶链,这意味着Cas切口酶裂解与和Cas结合的gRNA(例如,sgRNA)碱基配对(互补)的链。在一些实施方案中,Cas切口酶裂解双联式核酸分子的非靶、非碱基编辑的链,这意味着Cas切口酶裂解未与和Cas结合的gRNA(例如,sgRNA)碱基配对的链。基于本公开和本领域的认识,其它合适的Cas9切口酶对本领域技术人员来说将是显而易见的,并且在本公开的范围内。
在CRISPR激活(CRISPRa)中,dCas可以与激活结构域,诸如VP64或VPR融合。此类dCas融合蛋白可与本文所述的构建体一起用于基因激活。在一些实施方案中,dCas与表观遗传调节结构域,诸如组蛋白脱甲基酶结构域或组蛋白乙酰转移酶结构域融合。在一些实施方案中,dCas与LSD1或p300或其部分融合。在一些实施方案中,dCas融合物用于基于CRISPR的表观遗传调节。在一些实施方案中,dCas或Cas与Fok1核酸酶结构域融合。在一些实施方案中,与Fok1核酸酶结构域融合的Cas或dCas用于基因组编辑。在一些实施方案中,Cas或dCas与荧光蛋白(例如,GFP、RFP、mCherry等)融合。在一些实施方案中,与荧光蛋白融合的Cas/dCas蛋白用于基因组基因座的标记和/或可视化或用于鉴定表达Cas核酸内切酶的细胞。一般来说,CRISPR/Cas蛋白包含至少一个RNA识别结构域和/或RNA结合结构域。RNA识别结构域和/或RNA结合结构域与向导RNA相互作用。CRISPR/Cas蛋白还可以包含核酸酶结构域(即,DNA酶或RNA酶结构域)、DNA结合结构域、解旋酶结构域、RNA酶结构域、蛋白-蛋白相互作用结构域、二聚化结构域以及其它结构域。
除了充分表征的CRISPR-Cas系统外,一种新的CRISPR酶,称为Cpf1(PreFran亚型的Cas蛋白1)可以用于本发明的方法和系统中(Zetsche等人2015.Cell)。Cpf1是单RNA导向的核酸内切酶,缺乏tracrRNA,并利用富含T的前间区序列邻近基序。作者证明Cpf1介导强DNA干扰,其特征不同于Cas9。因此,在本发明的一个实施方案中,CRISPR-Cpf1系统可用于裂解靶向基因内的所需区域。
在另一实施方案中,核酸酶是转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)。TALEN含有与特定核苷酸序列结合的TAL效应结构域和催化靶位点处的双链断裂的核酸内切酶结构域(PCT专利公开号WO2011072246;Miller等人,2011Nat.Biotechnol.29:143-148;Cermak等人,2011Nucleic Acid Res.39:e82)。序列特异性核酸内切酶本质上可以是模块化的,且DNA结合特异性通过排列一个或多个模块而获得。Bibikova等人,2001Mol.Cell.Biol.21:289-297;Boch等人,2009Science 326:1509-1512。
ZFN可以含有两个或多个(例如,2-8个、3-6个、6-8个或更多个)序列特异性DNA结合结构域(例如,锌指结构域),所述结构域与效应核酸内切酶结构域(例如,FokI核酸内切酶)融合。Porteus等人,2005Nat.Biotechnol.23:967-973;Kim等人,2007Proceedings ofthe National Academy of Sciences of USA,93:1156–1160;美国专利号6,824,978;PCT公开号WO1995/09233和WO1994018313。
在一个实施方案中,核酸酶是由以下组成的组或选自由以下组成的组的位点特异性核酸酶:ω、锌指、TALEN和CRISPR/Cas。
这里描述的方法和组合物的序列特异性核酸内切酶可以是工程化的、嵌合的或从生物体中分离的。可以通过例如诱变来工程改造核酸内切酶以识别特定的DNA序列。Seligman等人2002Nucleic Acids Research 30:3870–3879。组合装配是其中来自不同酶的蛋白质亚基可以缔合或融合的方法。Arnould等人2006Journal of MolecularBiology355:443–458。在某些实施方案中,诱变和组合装配这两种方法可以组合以产生具有所需DNA识别序列的工程化核酸内切酶。
序列特异性核酸酶可以呈蛋白质的形式或呈编码序列特异性核酸酶的核酸(诸如mRNA或cDNA)的形式引入细胞中。核酸可以作为较大构建体(诸如质粒或病毒载体)的一部分递送,或直接递送,例如通过电穿孔、脂囊泡、病毒转运蛋白、显微注射和基因枪法(biolistics)直接递送。类似地,含有一个或多个转基因的构建体可以通过适于将核酸引入细胞中的任何方法来递送。
本公开方法中使用的向导RNA可以设计成使得它们指导Cas-gRNA复合体与基因组中预定的裂解位点结合。在一个实施方案中,可以选择裂解位点以便释放含有移码突变区域的片段或序列。在另一实施方案中,可以选择裂解位点以便释放含有额外染色体的片段或序列。
为了使Cas家族的酶(诸如Cas9)成功地与DNA结合,基因组DNA中的靶序列可以与gRNA序列互补并且可以紧接着是正确的前间区序列邻近基序或“PAM”序列。“互补性”是指核酸通过传统的沃森-克里克(Watson-Crick)或其他非传统类型与另一核酸序列形成氢键的能力。百分比互补性指示核酸分子中可与第二核酸序列形成氢键(例如沃森-克里克碱基配对)的残基的百分比。不一定需要完全互补,只要有足够的互补性引起杂交且促进CRISPR复合体形成即可。靶序列可以包含任何多核苷酸,诸如DNA或RNA多核苷酸。Cas9蛋白可以耐受PAM远端的错配。PAM序列因Cas9来源的细菌种类而异。最广泛使用的CRISPR系统源自酿脓链球菌且PAM序列是紧接位于sgRNA识别序列3’末端的NGG。来自示例性细菌种类的CRISPR系统的PAM序列包括:酿脓链球菌(NGG)、脑膜炎奈瑟球菌(NNNNGATT)、嗜热链球菌(NNAGAA)和齿垢密螺旋体(NAAAAC)。
本公开中使用的gRNA可以是约5至100个核苷酸长或更长(例如,长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个核苷酸或更长)。在一个实施方案中,gRNA的长度可以在约15至约30个核苷酸之间(例如,长度为约15-29、15-26、15-25;16-30、16-29、16-26、16-25;或约18-30、18-29、18-26或18-25个核苷酸)。
为了促进gRNA设计,已经开发了许多计算工具(参见Prykhozhij等人2015PLoSONE 10(3):;Zhu等人2014PLoS ONE 9(9);Xiao等人2014Bioinformatics.1月21日(2014年));Heigwer等人2014Nat Methods 11(2):122–123)。用于向导RNA设计的方法和工具由Zhu2015Frontiers in Biology 10(4):289-296进行了讨论,其通过引用并入本文。另外,还有公开可用的软件工具,可用于促进gRNA的设计(http://www.genscript.com/gRNA-design-tool.html)。
人免疫系统(HIS)小鼠
缺乏鼠T细胞、B细胞和NK细胞的高度免疫缺陷型、NOD-scid常见γ链缺陷型(NSG)小鼠的可用性已经大大增强了产生人免疫系统(HIS)小鼠的能力。产生具有最佳免疫功能的HIS小鼠的关键要求之一是人胸腺组织的可用性。人胎胸腺组织支持从注射的胎或成人CD34+细胞的强健的人胸腺产生,这些细胞维持T细胞祖细胞向胸腺的稳定供给,并在骨髓中产生B细胞、DC和单核细胞,这些细胞分布在外周并充当在人胎胸腺移植物中发育的T细胞的抗原呈递细胞(APC)(Lan等人2004;Lan等人2006;Melkus等人2006)。在人胸腺移植物中重新发育的T细胞对鼠类宿主是耐受的,这可能是由于在这些移植物中可检测到的鼠类APC的缺失(Kalscheuer等人1999)。虽然天然鼠类胸腺能够产生低水平的人T细胞,但鼠类胸腺的异常结构导致正常负向选择的失败(Khosravi Maharlooei等人2019)。这与缓慢的外周T细胞重建和因此高水平的淋巴细胞减少诱导的增殖(LIP)相结合,导致严重的自身免疫综合征,该综合征可以通过天然小鼠胸腺切除术来预防(Khosravi Maharlooei等人2019)。相比之下,在接受CD34+造血干细胞/祖细胞(HSPC)的HIS小鼠中植入人胎胸腺组织产生具有正常结构的人胸腺,包括容易辨别的皮质、髓质和赫氏小体(Hassal’scorpuscle)。与针对在天然NSG小鼠胸腺中发育的T细胞观察到的相比,这种人胸腺在外周实现相对快速的原初人T细胞重建,LIP显著减少且自身免疫较低。
考虑到人胎组织的可用性和用途的问题,期望鉴定出功能类似于来自人类胎的胸腺组织的另一种胸腺组织来源。本发明人先前已经证实,在接受人HSPC的免疫缺陷小鼠中植入的猪胸腺移植物中存在强健的人胸腺产生(Nikolic等人1999;Shimizu等人2008;Kalscheuer等人2014)。猪胎胸腺组织的使用提供了人胎胸腺组织的替代物,其产生正常的、功能性人T细胞,包括Treg,具有不同的TCR库。然而,猪胸腺上皮细胞(TEC)上HLA分子的缺失可限制外周介导最佳HLA限制性免疫功能的人T细胞的选择,正如对免疫接种的反应和所展示的猪胸腺未能正向选择表达HLA限制性转基因TCR20的胸腺细胞所指示的那样(图6和图8)。此外,猪胸腺可在正向选择识别由TEC产生的人组织限制性抗原(TRA)的HLA限制性Treg的能力方面,以及在识别这些TRA/HLA复合体的效应T细胞的负向选择方面受到限制。与人胎胸腺相比,在猪中产生的外周人T细胞在HLA限制性免疫功能和稳态以及对组织限制性抗原的耐受性方面显示出细微受损(Kalscheuer等人2012)。将转基因HLA分子添加到猪胸腺组织中可以克服大多数这些限制。
本文示出两种获得HIS小鼠的改良方法,所述方法不依赖于人胎组织的使用。
在一个实施方案中,HIS小鼠通过将源自猪和人CD34+细胞的胎胸腺组织引入到小鼠中产生。在一些实施方案中,人CD34+细胞源自脐带血。在一些实施方案中,人CD34+细胞源自成人组织。在一些实施方案中,成人组织是骨髓。在一些实施方案中,CD34+细胞源自动员的外周血造血干细胞。
在另一个实施方案中,HIS小鼠通过引入源自本文所述的转基因猪的胎胸腺组织而产生。
在一些实施方案中,小鼠在引入胸腺组织之前进行胸腺切除,如最近所述(Khosravi Maharlooei等人2019)。在一些实施方法中,小鼠还经辐照。在一些实施方案中,小鼠是NOD scid常见γ链敲除(NSG)小鼠。
猪胎胸腺可植入小鼠的肾包膜下。如果小鼠注射人脐带血来源的CD34+细胞,则可以在胸腺植入之前、之后或同时注射。
HIS小鼠模型可广泛应用于T细胞发挥重要作用的研究领域。这些领域包括但不限于:
·HIV感染和其它感染。该模型已用于证明与人胎胸腺组织相比,猪胸腺赋予对HIV感染的抗性(Hongo等人2007)。
·Treg生物学,包括胸腺的发育、运输和外周组织的稳态。该模型已用于证明当在猪胸腺中产生时具有良好的Treg发育和功能,但是由于外周稳态改变而具有细微的表型差异,预计这通过向胸腺组织中添加HLA分子得以校正。另外,该模型可用于研究Treg疗法,因为它允许确定离体扩增的Treg在输注后的分布、存活和活性(例如,阻抑移植排斥)。
·移植免疫学。已经证实用人或猪胎胸腺组织和人胎或成人CD34+细胞构建的HIS小鼠能够排斥人和猪的皮肤和胰岛同种异体移植物和异种移植物(Lan等人2004;Shimizu等人2008;Zhao等人1997;Zhao等人1998),而用猪胎胸腺组织产生的那些则特异性地接受共有胸腺供体SLA的皮肤移植物(Kalscheuer等人,2014)。如本文所述产生的小鼠可用于排斥同种异体人皮肤移植物。这些数据指示,该模型对于调查诱导对同种异体移植物和异种移植物的耐受性的方法的移植免疫学和临床前研究将是有价值的。该模型还将优化目前正在探索的混合嵌合体和获得异种移植耐受性的猪胸腺移植方法。
·自身免疫。通过用识别胰岛自身抗原的TCR转导CD34+细胞,该模型将利于研究胸腺中自身反应性T细胞的发育以及胸腺和外周如何调节对自身抗原的耐受性。在这个定义明确的模型中,用高度可重现的胸腺HLA基因型可以很容易地研究对其它自身抗原有特异性的TCR。
·感染诸如COVID-19。迫切需要包括人免疫系统的模型来检查它们对COVID-19病理学的影响。人胎组织的不可用性给此类研究呈现出重大挑战。该挑战可以通过使用HLA转基因的猪胎胸腺组织代替人胎胸腺得以解决。
使用转基因猪产生HIS小鼠可以产生比使用人胎胸腺产生的HIS小鼠更好的模型,因为对于每个供体而言背景MHC(SLA)和HLA转基因是相同的,并且猪总体上是完全近交的。使用人胎组织的大挑战之一是供体与供体之间HLA和整个遗传背景不同,并且这引入了阻碍HIS小鼠研究的可重现性的变量。
实施例
从下面的实验细节将更好地理解本发明。然而,本领域技术人员将容易认识到,所讨论的具体方法和结果仅仅是对本发明的说明,如在随后的权利要求中更全面地描述的那样。
实施例1-使用CRISPR辅助的同源重组在猪中进行基因修饰
进行猪的两个基因修饰,以说明CRISPR辅助的同源重组在与针对正确靶向的细胞的适当选择策略组合时能够在猪中进行基因修饰。
在第一修饰中,使用CRISP辅助的同源重组将4个人类基因的编码序列引入到Sachs小型猪的GGTA1基因座中(图1)。在这种情况下,靶向GGTA1基因座中为转基因的表达提供了“安全港”,因为该基因组区域不受严格的时间或谱系依赖性转录阻抑。使用2A自剪接元件,这四个转基因在两组中由普遍存在的CAG启动子表达。正确靶向的细胞的非克隆选择在这种情况下是直接的,因为转基因的表达可以用作阳性标志并且因为载体被转染到无效GGTA1等位基因杂合的细胞中,失去GGTA1表达。快速的、基于群体的细胞选择产生了在克隆胎和猪崽生产中有效的体细胞核转移(SCNT)供体群体。
第二修饰连续引入来自携带第一修饰的克隆胎的成纤维细胞中并且复杂得多。在这种情况下,引入受天然IL-3受体α链启动子控制的人IL-3受体的两条链的编码序列,以便实现人IL3R表达的适当谱系和时间特异性。在这种情况下,靶向细胞选择的主要障碍是SCNT克隆所需的成纤维细胞中缺乏IL3R表达。另外,经由indel世代的靶向整合引起的内源性ILR3表达的破坏性损失预计如果不是致命事件,也是非常有害的,对天然ILRa基因座的1个等位基因的基因修饰将受到限制。从克隆的角度来看,期望在尽可能少的群体倍增中获得正确靶向的细胞充分富集的非克隆供体细胞群体。
这项研究的策略和结果示于图2。
期望以最小倍增获得高度富集的SCNT供体细胞群体指示,可以利用没有选择标志启动子的载体。由于IL3Ra在成纤维细胞中不表达,因此决定了解附近基因(SLC25A6,一种线粒体核苷酸转运蛋白)的普遍表达是否可以用作正确靶向的标志。尽管使用经由2A自我裂解肽连接的GFP编码序列标记SLC25A6转录单位提供了一种可靠的选择策略,但尚不清楚是否能以足够的效率进行此类复杂修饰(用>7kbp的载体序列取代>15kbp的基因组序列)用于供体细胞选择。
选择预计会裂解先前修饰的胎细胞中的IL3Ra基因的1个等位基因的CRISPR向导RNA并连同所示载体一起测试。在初步转染中,发现成对的向导RNA与Cas9的“切口酶”形式组合使用产生了包括相当离散的高和低GFP亚群的群体。用1个此类组合产生的群体的流动分析示于图2B中。PCR分析指示,分选的高GFP亚群中的细胞含有载体两个末端正确整合的细胞(图2C)。该群体中的细胞在大约24次倍增时(远在32次倍增时的平均克隆衰老之前)用于SCNT,导致从3头胚胎受者小母猪产生8个活胎。基因组和RT-PCR分析显示,所有8个胎都携带预期的基因修饰(图2D和图2E)。使用该供体细胞群体的其它妊娠持续至足月,并获得表达相关转基因的活产。
总之,这里描述的修饰证明可以使用非克隆供体细胞选择策略向猪中连续引入多顺反子靶向修饰,以快速产生携带多个基因修饰的猪。
实施例2–HLA-A2转基因:d40转基因猪胎的产生和基因型/表型评价
原材料
来自GGTA1无效、SLA单倍型h纯合Sachs小型猪(SLA-1*02:01、SLA-2*02:01、SLA-3无效、SLA-DRA*01:01:02、SLA-DRB*02:01、SLA-DQA*02:02:01、SLADQB*04:01:01)的成纤维细胞用作基因修饰的原材料。来自该系的细胞已经在先前的转基因项目中良好克隆,并且CCTI维持了大的育种群体用于异种移植研究,促进了HLA转基因的扩增,为研究团体供给胸腺组织。由于这些动物的部分近交性质,子代将具有高度的遗传相似性。
总体策略
所有的转基因修饰都是通过在天然SLA启动子后面靶向插入来进行的。这将确保适当的谱系和时间表达模式。这也避免了与发育期间胎盘HLA表达不当相关的潜在问题。转基因分子的两条链同时引入。在胎儿阶段采用连续修饰来快速产生第一种HLA-A2转基因胸腺材料,然后产生HLA-A2/HLA-DQ8转基因胸腺材料。
使用无启动子的基因靶向载体引入HLA修饰,允许在用于体细胞核转移(SCNT)之前选择高度富集细胞分裂数最少的正确靶向细胞的非克隆细胞群体。虽然这与实施例1中使用的用IL3受体链进行启动子靶向修饰的方法相似,但载体设计过程大大简化,因为I类和II类分子在SCNT克隆所需的成纤维细胞中正常表达或可诱导地表达。
d40克隆转基因胎的产生
将HLA-A2的编码序列引入到SLA-1或SLA-2I类启动子后面。就预期的修饰而言,这些基因座是可互换的,其中一个基因座的选择将通过两者的内含子1测序和对最佳CRISPR向导RNA位点的评价来确定。
HLA-A2表达为人β-2微球蛋白(B2M)与HLA-A2α链的融合物。此类融合物的转基因表达先前已经在小鼠中有描述(Kotsiou等人2011;Pascolo等人1997)并且它在这里的使用确保HLA-A2和猪B2m之间的异型相互作用不会干扰HLA-A2表面表达。
CRISPR/Cas9辅助的同源重组用于靶向融合盒。HLA-A2靶向限于SLAI基因的一个等位基因,并且可能致使另一个等位基因无效;第二等位基因的突变在猪中没有免疫后果,并且可通过内源性I类α链的表达降低来增加HLA-A2表达。
用于整合HLA-A2的载体构建
用于整合HLA-A2的靶向载体如图3所示。与天然基因(白色和蓝色片段)序列相同的载体同源臂之间的同源重组导致在内含子1/外显子2接合点处引入人B2M-HLA-A2盒。这里引入了人B2M的成熟形式,有外显子1提供的信号肽;由于信号肽在距剪接位点1bp处结束,因此融合蛋白的制备没有改变B2M蛋白序列。在内含子1末端和外显子2起点附近的适当序列位点选择成对的CRISPR向导RNA,并且并入到表达Cas9切口酶活性的质粒中。
用于SCNT的经修饰的成纤维细胞的选择
将靶向质粒和CRISPR/Cas9向导质粒核转染到成纤维细胞中,并在3-5天后进行第一轮选择。通过流式分选用HLA-A2特异性抗体染色的细胞(克隆BB7.2,Biolegend)来进行选择。基于HLA-A2表达,用所选导向对进行初步的单一分选分析,以确定产生最高靶向率的所述对。对于SCNT供体细胞选择,采用两轮类似的选择来最大程度地富集表达细胞。然后对该群体进行基因组和RT-PCR分析,以确认转基因基因座的预期结构和RNA水平表达,并确定第二SLA基因座在该过程中是否已经改变。
d40转基因胎的产生和鉴定
选择的SCNT供体细胞用于核转移/胚胎转移,在大约40天妊娠时收获所产生的胎儿。在所有的猪工程项目中都采用两阶段克隆方法。妊娠40天时收获允许在交付用于进一步克隆生产的系之前,在克隆水平上确认基因结构,并且通常确认转基因表达。另外,来自早期胎儿的最低限度培养的细胞往往具有比那些经过长期体外选择过程的细胞高得多的克隆率。最后,就体外寿命而言它允许系的“更新”,这对于另外的基因修饰(例如,连续引入HLADQ8)是必需的。
为了表征HLA-A2转基因胎,使用基因组PCR确认预期的整合位点结构,使用RT-PCR确认正确的RNA表达,并且使用流式细胞分析确认细胞表面表达。
实施例3–HLA-A2/HLA-DQ8转基因:d40转基因猪胎的产生和基因型/表型评价
转基因猪(HLA-A2,/HLA-DQ8)是使用类似的总体策略并且用无启动子的载体将表达靶向至天然启动子,用实施例2描述的基于HLA-DQ8表达的细胞选择而产生的。与SLA I类不同,SLA II类通常在成纤维细胞上不表达。为了确定是否可以用干扰素γ在胎成纤维细胞中诱导II类表达,如在人和小鼠成纤维细胞中所观察到的那样,将原代胎成纤维细胞暴露于猪IFN-g(80ng/ml),然后通过流式细胞术观察猪DR和DQ泛等位基因的表面表达。发现在用IFN-g处理6天后,几乎所有细胞中都强烈诱导了DR和DQ的表面表达(图4),其中大多数细胞在诱导3天后强烈表达两者。重要的是,此类处理似乎对这些细胞的形态或生长没有影响。因此,诱导II类表达是选择SCNT克隆所需的细胞中转基因HLA-DQ8的天然II类启动子表达的可行手段。
正确的II类表达依赖于辅助分子的功能,包括CD74和人类中的HLA-DM。HLA-DQ8在转基因小鼠中的表达使得猪也具有HLA-DQ8表达的所有适当活性(Cheng等人1996)。鼠类研究指示,内源性MHC-II分子的表达可能通过竞争限制外源性MHC-II的表达。HLA-DQ8表达靶向天然SLA-DQA基因座。靶向事件本身将导致一个SLA-DQA等位基因的功能丧失。由于CRISPR介导的修饰的性质,将在非靶向等位基因处以及在大部分细胞中发生indel相关的功能丧失。
载体构建
用于整合HLA-DQ8的靶向载体如图5所示。
至于HLA-A2转基因,α链和β链两者在单个转基因步骤中引入。对于DQ8,两条链的编码序列与高效IRES元件连接,所述元件已在其它双顺反子表达载体中得以成功利用。这里IRES连接比自剪接元件优选,因为向HLA-DQα链添加氨基酸的功能后果是未知的。也像添加HLA-A2一样,天然基因座的外显子1用于供给HLA-DQ8的前导序列,导致N端添加单个氨基酸。
用于SCNT的经修饰的成纤维细胞的选择
实施例2中产生的HLA-A2转基因d40胎细胞是引入HLA-DQ8修饰的原材料。如实施例2所述进行初步的SCNT供体细胞转染。许多抗泛单倍型人DQ抗体是可商购获得的。首先在IFN-g诱导的猪成纤维细胞上筛选候选物,以鉴定不结合猪DQ二聚体的候选物。然后使用IFNg诱导的猪成纤维细胞对这些候选物进行第二次筛选,所述猪成纤维细胞单独用HLA-DQA*03:01和HLADQB1*03:02的表达构建体转染,以消除识别跨物种二聚体的任何抗体。如实施例2中所述,用满足这些标准的候选物进行细胞选择。对流式分选的群体进行基因组和RT-PCR分析,以确认转基因基因座的预期结构和RNA表达,也如同实施例2中一样。
d40转基因胎的产生和表征:
将如实施例2中对HLA-A2修饰所述那样进行基因组和RNA分析。
实施例4-表达HLA-A2和HLA-A2/HLA-DQ8的d56-70胸腺组织的产生
将由实施例2和实施例3产生的基因型和表型确认的早期胎细胞系从胚胎转移及胎儿和猪崽分娩开始送至有用于细胞培养、卵母细胞成熟和胚胎重建的实验室的机构,以及外科手术机构。进行SCNT克隆以产生第56-70天的胎儿。在对胎儿进行构象基因分型和表型分型后,通过本领域已知的方法进行胸腺分离。
实施例5-HLA-A2/HLA-DQ8转基因种公猪的育种
获得种公猪的SCNT利用实施例2和实施例3中产生的确认基因型/表型的d40胎细胞。将转基因猪崽饲养到运输年龄(8-16周)并送到最先进的农业机构进行大型动物育种、饲养和进一步畜牧的程序。
实施例6–胸腺和外周APC之间HLA共有对于HIS小鼠中的人T细胞稳态的重要性
方法
从杰克逊实验室购得的6-8周龄雌性NOD scid常见γ链敲除(NSG)小鼠如先前所述进行胸腺切除(Khosravi Maharlooei等人2019)。两周后,这些小鼠接受亚致死全身辐照(1Gy),然后在肾包膜下手术植入1mm3猪胎或人胸腺组织片段。
然后通过将两组无HLA共有的同种异体CD34+细胞(#1和#2)和来自供体#1的自体胎胸腺移植至胸腺切除的NSG小鼠而产生混合嵌合供体HIS小鼠。通过向胸腺切除的NSG小鼠(无胸腺)注射CD34+细胞#1或#2,产生两组过继受者(AR)小鼠。移植后20周,将来自混合嵌合体的T细胞静脉注射至AR1和AR2小鼠。参见图6A。
结果
在过继转移后第10天,在APC与选择T细胞的供体胸腺HLA自体同源的AR1小鼠中,增殖(Ki67+)T细胞的比例显著高于仅携带同种异体HLA的AR2小鼠。参见图6B。
这些研究证明,外周APC上的胸腺HLA是支持外周人T细胞的最大淋巴细胞减少驱动的扩增所需的,强调了在猪胸腺中提供人胸腺上皮细胞或HLA分子以实现正常免疫稳态的研究的重要性。
实施例7-HIS小鼠中人免疫重建的比较
方法
如实施例6中所述,通过将猪胎胸腺植入胸腺切除的经辐照的NOD scid常见γ链敲除(NSG)小鼠的肾包膜下,产生人源化小鼠。
然后为这些小鼠注射人脐带血来源的CD34+细胞。使用相同的猪胎胸腺和不同的脐带血CD34+细胞产生两批人源化小鼠。将通过使用人CD34微珠试剂盒(MiltenyiBiotech)分离CD34+细胞。每周一次腹膜内注射抗CD2mAb LoCD2b(400μg/只小鼠),持续2周(第0、7和14天),以消耗CD34+细胞接种物中的残留T细胞和从人胎胸腺组织释放的残留胸腺细胞,以防止猪胸腺组织和/或注射的同种异体人脐带血CD34+细胞受预先存在的来自移植物的人胸腺细胞排斥。
在不同的实验中用人胎胸腺组织和自体胎肝来源的CD34+细胞产生的人源化小鼠的重建包括在内,用于比较。
从第4周开始,获得小鼠的外周血并测量人CD3细胞的血液浓度。
在第15周,进行外周血的流式细胞术分析,以确定T细胞、B细胞和骨髓细胞群体的数目,包括CD4和CD8 T细胞、原初和记忆CD4和CD8 T细胞、调节性T细胞(Treg)和T滤泡辅助(Tfh)细胞;B细胞亚群、单核细胞和树突细胞(DC),包括经典DC(cDC1和cDC2)和浆细胞样DC(pDC)。
结果
如图7A所示,基于小鼠外周血中的人细胞,在用猪胎胸腺和人CD34+细胞产生的两批小鼠中,人T细胞重建与用人胎胸腺产生的小鼠相当。
如图7B所示,在CD4和CD8亚群中检测到高百分比的原初T细胞。还证明了CD4+CD25高CD127低调节性T细胞的产生。
实施例8-HIS小鼠的持续监测和分析
如下进一步监测实施例7中产生的小鼠。
移植后每4周通过ELISA监测和比较血浆免疫球蛋白水平(IgM和IgG)。
移植后14-16周,当预计HIS小鼠完全由人类细胞重建时,对每组中的一半动物实施安乐死并比较所有组的外周血、淋巴结、脾脏和胸腺中的大小、结构、细胞性和细胞群体。用于研究免疫细胞群体的流式细胞分析小组是表1所示那些。使用每种淋巴组织(包括脾脏、淋巴结和胸腺)的一小片进行组织学研究以比较这些组织的结构。通过ELISA测量所有HIS小鼠中的血清免疫球蛋白水平(IgM和IgG)。另外,使用响应于泛TCR刺激(抗-CD3/CD28珠粒)、同种抗原刺激、异种抗原刺激和破伤风类毒素新抗原刺激的增殖、细胞因子产生和细胞毒性的体外测定,比较每组小鼠外周人T细胞的功能。通过CFSE细胞染料稀释来确定增殖。细胞因子(包括IL-2和IFN-γ)的产生通过细胞内染色测定。对于同种抗原和异种抗原刺激,将同种异体人PBMC和第三方猪PBMC用作刺激物。用CFSE标记从HIS小鼠分离的脾T细胞,并与经过辐照的刺激物以1:1的比率共培养6天。人CD4和CD8 T细胞的CFSE稀释度通过流式细胞术确定。对于破伤风类毒素新抗原刺激,使用用于产生HIS小鼠的脐带血或胎肝来源的CD34+细胞产生DC。将CD34+细胞与人细胞因子(包括干细胞因子、GM-CSF和IL-4)一起培养13天,以分化成树突细胞。CD34来源的DC用破伤风类毒素新抗原脉冲,然后用TNF-α和PGE2使其成熟,接着与CFSE标记的分离的脾T细胞共培养7天。通过流式细胞术确定增殖的T细胞。将用LPS刺激单核细胞并且通过ELISA确定上清液中TNF-α、IL-6和IL-10的产生。
对剩余HIS小鼠进行长达30周的监测,以观察每个谱系重建的持久性并观察移植物抗宿主/自身免疫性疾病的出现。每4周给小鼠放血以确定人细胞移植。从移植后20周开始,使用如下所示的评分系统,每周两次对小鼠的移植物抗宿主疾病/自身免疫进行评分,直到第30周。所有分析将与上述那些相同。
评分系统:
失重(%):<10%,0;<10-15%,1;<15-20%,2;>20%,3
姿势:正常,0;休息时轻度驼背,1;中度驼背,能正常走动,2;严重驼背,妨碍运动和步态,3
毛皮:正常,0;轻度起皱,1;中度起皱,2;严重起皱,面部或前肢卟啉染色,3
活动:正常,0;轻度至中度下降,1;只有吃、喝或受刺激时才活动,2;起身困难,受刺激时无法移动,3
每天监测具有任何GVHD迹象(得分大于2)的动物,每隔一天检查一次体重。每天对总分为6或更高的动物进行监测和称重。总分为9或更高或任何一个类别中得分为3分的动物实施安乐死。
这些研究比较了移植猪胎胸腺和脐带血来源的CD34+细胞后的人类重建与用人胎胸腺和胎CD34+细胞实现的人类重建。结果显示,用猪胎胸腺和脐带血来源的CD34+细胞产生的HIS小鼠与用人胎胸腺和胎CD34+细胞产生的HIS小鼠具有相似的人类重建。一旦在外周血中确认人细胞重建(移植后约4个月),就开始通过确定对人同种异体皮肤移植物有明确限制和排斥的转基因人T细胞受体(TCR)的胸腺选择来调查这些小鼠的体内免疫功能的研究,如下所述。
表1-研究T、B和DC亚群的抗体小组
T细胞小组B细胞小组DC小组
实施例9-HIS小鼠中HLA-A2限制性TCR选择的比较
比较了在SLA限定的胎胸腺组织中与在胸腺切除的NSG小鼠中从脐带血CD34+细胞重建的HLA-A2+人胎胸腺组织中的HLA-A2限制性TCR的选择。在HU/HU小鼠中使用人CD34+细胞的慢病毒转导,已经确定人HLA-A2限制性TCR MART1在HLA-A2+人胸腺中经正向选择,但在SLAkm猪胸腺中未经正向选择(图8)。该研究显示,该TCR在纯合SLAhh猪胎胸腺中也未能正向选择,因为这是用于在实施例2和实施例3的转基因猪中引入HLA转基因的猪SLA。
使用猪胎胸腺(SLAhh)或人胎胸腺和MART-1-TCR转导的胎肝或脐带血来源的CD34+细胞(表2)产生三组小鼠,如实施例7中总体描述的。对于CD34+细胞的转导,在包被有纤维连接蛋白(retronectin)的平板中通过在Stemline II培养基中分别用10μg/mL硫酸鱼精蛋白和60ng/mL、150ng/mL和300ng/mL重组人IL-3、Flt3配体和干细胞因子孵育3小时,预刺激人胎肝或脐带血CD34+细胞。将细胞以30的感染复数转导过夜,然后收获并准备用于鞘内注射。将少量经过转导的CD34+细胞在不含硫酸鱼精蛋白的干细胞培养基中培养4天,然后通过流式细胞术评估转导效率。使用HLAA2+胎肝或脐带血CD34+细胞产生HIS小鼠,因为外周HLA-A2+APC的存在可能是HLA-A2选择的人T细胞的最佳稳态所需的。对于HLA分型,在从这些组织中分离CD34+细胞后,使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen)从CD34阴性胎肝或脐带血细胞中分离DNA。进行Sanger等位基因水平的HLA分型以确定组织的HLA类型。当将组织进行分型时,将人胎和脐带血CD34+细胞冷冻。
移植后14-16周,当HIS小鼠完全由人类细胞重建时,将它们实施安乐死用于分析。确定双阴性(CD1a+)(包括CD7+早期胸腺细胞)、双阳性、CD4单阳性和CD8单阳性亚群中的MART-1+胸腺细胞的百分比和绝对数目,以及选择标志(CD69、PD1、CCR7)。观察到猪胎胸腺中HLA I类限制性TCR MART1的正向选择失败。
使用荧光染料标记的MART1四聚体鉴定转基因T细胞并且GFP作为经过转导的HSPC来源的标志。胸腺发育每个阶段的GFP+和GFP-胸腺细胞提供了每个个体小鼠中转基因和非转基因T细胞选择水平的内部对照比较。在产生转基因猪时进行的这些研究(实施例3和实施例4)提供了确定猪胎胸腺中HLA-A2转基因对猪胸腺中HLA-A2限制性人T细胞选择的影响的基线。详细的小组如下表3所示。将在Aurora光谱流式细胞仪中进行分析。
表2-用人胎和非人胎(猪)胸腺组织制造的HIS小鼠
表3-用于研究胸腺中的MART-1+T细胞选择的小组
实施例10-HIS小鼠中HLA-DQ8限制性胰岛自身抗原特异性TCR选择的比较
接下来,在SLA限定的胎胸腺组织中与胸腺切除的NSG小鼠中从HLA-DQ8+脐带血CD34+细胞重建的人胎胸腺组织(携带每个TCR的相关HLA等位基因)中比较HLA-DQ8限制性胰岛自身抗原特异性TCR(克隆5)的选择。使用人胎胸腺组织,已经证实克隆5TCR+T细胞在HLADQ8人胎胸腺中正向选择,而如果HSPC表达HLA-DQ8则反向选择(图9)。使用猪胎胸腺(SLAhh)或人胎胸腺和克隆5TCR转导的胎肝或脐带血来源的HLA-DQ8+CD34+细胞产生三组HIS小鼠(表4),如实施例7中总体描述的。
对于HLA分型,在从这些组织中分离CD34+细胞后,使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen)从CD34阴性胎肝或脐带血细胞中分离DNA。进行Sanger等位基因水平的HLA分型以确定组织的HLA类型。当将组织进行分型时,将人胎和脐带血CD34+细胞冷冻。
移植后14-16周,当HIS小鼠完全由人类细胞重建时,将它们实施安乐死用于分析。确定双阴性(CD1a+)(包括CD7+早期胸腺细胞)、CD69+和CD69-双阳性、CD4单阳性和CD8单阳性亚群中的克隆5+胸腺细胞的百分比和绝对数目,以及负向选择标志(PD1、CCR7)。Treg的标志(CD25和CD127)也包括在分析中,以便检测在HLA-DQ8+胸腺中具有这种TCR的胸腺细胞的Treg谱系分化。详细的小组如下表5所示。用Aurora光谱流式细胞仪进行分析。
由于预计这种TCR识别的胰岛素肽由髓质TEC(mTEC)产生,这种TCR的正向选择依赖于胸腺上皮的HLA-DQ8表达。因此,观察到猪胎胸腺中HLA II类限制性TCR克隆5的正向选择失败。
然而,在一些情况下,SLAhh猪胸腺中产生的交叉反应决定簇将能够正向选择该TCR。在这种情况下,确定在用HLA-DQ8+CD34+细胞重建的猪胸腺中是否发生具有该TCR的胸腺细胞的负向选择。
HLA-DQ8+人胸腺中的初步数据表明,在CD34细胞来源的APC上需要HLA-DQ8,以便负向选择该TCR(参见图8)。这仍然可能发生在含有人HLA-DQ8+APC的猪胸腺中,因为在猪和人胰岛素分子中胰岛素B(9-23)肽是相同的,并且可能被猪胸腺移植物中的人APC挑取和呈递。使用荧光染料标记的克隆5Vβ特异性mAb(Vβ21.3)鉴定转基因T细胞并且GFP将作为经过转导的HSPC来源的标志。胸腺发育每个阶段的GFP+和GFP-胸腺细胞提供了每个个体小鼠中Tg和非Tg T细胞选择水平的内部对照比较。在产生转基因猪时进行的这些研究(实施例3和实施例4)提供了确定猪胎胸腺中HLA-DQ8转基因对猪胸腺中HLA DQ8限制性人T细胞选择的影响的基线。
表4-用人胎和非人胎(猪)胸腺组织制造的HIS小鼠
表5-用于研究胸腺中的克隆5+T细胞选择的小组
实施例11-HIS小鼠同种异体人皮肤移植物排斥的比较
为了调查在用不同胸腺和CD34+细胞产生的HIS小鼠中的人免疫系统功能,比较了它们排斥同种异体皮肤移植物的能力。为此,通过植入猪胎胸腺或人胎胸腺和CB或胎肝来源的CD34+细胞(表6)产生HIS小鼠,如实施例7中总体描述的。
移植后14-16周,将来自同种异体人类供体的分裂厚度(2.3mm)皮肤样品移植到侧胸壁上。从第7天开始到4周每天对皮肤移植物进行评价,之后每三天检查至少一次。当少于10%的移植物保持活力时,将移植物定义为受排斥。用两种类型的胸腺和CD34+细胞构建的HIS小鼠能够排斥同种异体皮肤移植物。
表6-用人胎和非人胎(猪)胸腺组织制造的HIS小鼠
用于确定它们排斥同种异体人皮肤移植物的能力
实施例12-用非转基因猪胸腺与HLA-A2转基因猪胸腺进行的人类细胞重建的比较
如实施例7所示,与用胎胸腺和自体胎肝来源的CD34+细胞产生的HIS小鼠相比,用猪胎胸腺和脐带血来源的CD34+细胞产生的HIS小鼠在T细胞中具有较小的功能缺陷,诸如降低的HLA限制性抗原反应和TCR转导的T细胞的胸腺选择。主要原因是猪白细胞抗原(SLA)而不是HLA分子在猪胸腺中介导胸腺细胞正向选择,并且选择的这些T细胞中只有一个小亚群将与人HLA充分交叉反应以识别由CD34细胞供体来源的DC的HLA呈递的肽抗原。该模型通过使用表达常见HLA分子(包括HLA-A2和HLA-DQ8)的转基因(Tg)猪胎胸腺进行优化。
使用实施例3的HLA-A2转基因猪胎胸腺,比较用非转基因与HLA-A2转基因猪胎胸腺产生的HIS小鼠中的免疫重建和免疫功能。
使用胸腺切除的NSG小鼠,使用转基因和非转基因猪胎胸腺加上CB CD34+细胞,如表7所述和如实施例7总体所述,产生两种类型的HIS小鼠。
在这些HIS小鼠产生之后,如下监测小鼠。
通过确定T细胞、B细胞和骨髓细胞群体的再增殖率和外周血浓度,监测和比较两种类型HIS小鼠中的人免疫细胞重建,所述细胞群体包括CD4和CD8 T细胞、原初和记忆CD4和CD8 T细胞、调节性T细胞(Treg)和T滤泡辅助(Tfh)细胞;B细胞亚群、单核细胞和DC,包括经典DC(cDC1和cDC2)和浆细胞样DC(pDC)。移植后每4周,从HIS小鼠获得外周血并且用ACK缓冲液溶解红细胞。进行外周血的流式细胞分析以确定每个群体的百分比和绝对数目。使用计数珠粒计算每个群体的绝对数目。还确定每组HIS小鼠中实现重建的小鼠的百分比。用于研究免疫细胞群体的小组如表1所示。
在三种类型的HIS小鼠中移植后每4周通过ELISA监测和比较血浆免疫球蛋白水平(IgM和IgG)。
移植后14-16周,当预计HIS小鼠完全由人类细胞重建时,对每组中的一半动物实施安乐死并比较所有组的外周血、淋巴结、脾脏和胸腺中的大小、结构、细胞性和细胞群体。用于研究免疫细胞群体的流式细胞分析小组与表1所示相同。使用每种淋巴组织(包括脾脏、淋巴结和胸腺)的一小片进行组织学研究以比较这些组织的结构。通过ELISA测量所有HIS小鼠中的血清免疫球蛋白水平(IgM和IgG)。另外,使用响应于泛TCR刺激(抗-CD3/CD28珠粒)、同种抗原刺激、异种抗原刺激和破伤风类毒素新抗原刺激的增殖、细胞因子产生和细胞毒性的体外测定,比较每组小鼠外周人T细胞的功能。通过CFSE细胞染料稀释来确定增殖。细胞因子(包括IL-2和IFN-γ)的产生通过细胞内染色测定。对于同种抗原和异种抗原刺激,将同种异体人PBMC和第三方猪PBMC用作刺激物。用CFSE标记从HIS小鼠分离的脾T细胞,并与经过辐照的刺激物以1:1的比率共培养6天。人CD4和CD8 T细胞的CFSE稀释度通过流式细胞术确定。对于破伤风类毒素新抗原刺激,使用用于产生HIS小鼠的CB CD34+细胞产生DC。将CD34+细胞与人细胞因子(包括干细胞因子、GM-CSF和IL-4)一起培养13天,以分化成树突细胞。CD34来源的DC用破伤风类毒素新抗原脉冲,然后用TNF-α和PGE2使其成熟,接着与CFSE标记的分离的脾T细胞共培养7天。通过流式细胞术确定增殖的T细胞。用LPS刺激单核细胞并且通过ELISA确定上清液中TNF-α、IL-6和IL-10的产生。
对剩余HIS小鼠进行长达30周的监测,以观察每个谱系重建的持久性并观察移植物抗宿主/自身免疫性疾病的出现。每4周给小鼠放血以确定人细胞移植。从移植后20周开始,使用实施例6所示的评分系统,每周两次对小鼠的移植物抗宿主疾病进行评分,直到第30周。在该时间点进行的所有分析都与第14-16周的分析相同。
在两组之间发现相似的骨髓重建。HLA转基因猪胸腺受者中的免疫重建和功能可增强。
表7-用HLA-A2转基因和非转基因猪胎胸腺制造的HIS小鼠
组织
实施例13-比较在HLA-A2转基因猪胎胸腺中发育的人T细胞对HLA-A2分子的耐受性
预计在用HLA-A2转基因猪胎胸腺产生的HIS中发育的人T细胞的一个主要特征是对HLA-A2的耐受性,因为HLA-A2反应性T细胞将通过表达HLA-A2的胸腺上皮细胞的负向选择而清除和/或受表达HLA-A2的TEC选择的Treg阻抑。为此,比较了在HLA-A2-Tg与非Tg猪胎胸腺中发育的T细胞对人Tg HLA分子的耐受性。HIS小鼠是使用HLA-A2-CB CD34+细胞产生的,以消除由CD34+细胞来源的APC对HLA-A2反应性T细胞的负向选择。产生的多组HIS小鼠如表8所示。移植后14-16周,分离脾和成熟胸腺T细胞并使用源自供体猪的DC,在体外测试对HLA-A2的耐受性,我们预计会仅在HLA-A2-Tg猪胎胸腺的受者中观察到耐受性。DC由猪胎肝白细胞产生,将在收获胎胸腺时收获并冷冻直至使用。将胎肝白细胞在猪干细胞因子、GM-CSF和IL-4中培养13天以使它们分化为DC。这些研究包括Treg消耗,以确定HLA-A2转基因表达对Treg阻抑HLA-A2反应的影响
表8-用HLA-A2-Tg和非Tg猪胎胸腺组织制造的HIS小鼠
用于比较人类T细胞对HLA-A2分子的耐受性
实施例14-比较在用对照与HLA-A2-Tg猪胎胸腺产生的HIS小鼠中的HLA-A2限制性TCR的选择
在用非Tg对照与HLA-A2-Tg猪胎胸腺产生的HIS小鼠中比较HLA-A2限制性TCRMART1的选择。经亚致死剂量辐照的胸腺切除的NSG小鼠注射MART-1转导的HLA-A2+CB CD34+细胞,然后植入非Tg对照或HLA-A2-Tg猪胎胸腺(表9)。
表9-用非Tg对照或HLA-A2-Tg猪胎胸腺组织制造的HIS小鼠
用于研究MART-1TCR阳性T细胞胸腺选择
移植后14-16周,当HIS小鼠完全由人类细胞重建时,将它们实施安乐死用于分析。确定双阴性(CD1a+)(包括CD7+早期胸腺细胞)、双阳性、CD4单阳性和CD8单阳性亚群中的MART-1+胸腺细胞的百分比和绝对数目,以及负向选择的其它标志(CD69、PD1、CCR7)。预计在HLA-A2+Tg猪胎胸腺中会看到增强的HLA I类限制性TCR MART1的正向选择。使用荧光染料标记的MART1四聚体鉴定Tg T细胞并且GFP作为经过转导的HSPC来源的标志。胸腺发育每个阶段的GFP+和GFP-胸腺细胞提供了每个个体小鼠中Tg和非Tg T细胞选择水平的内部对照比较。详细的小组如上表4所示。将用Aurora光谱流式细胞仪进行分析
计数每只小鼠外周(血液、脾淋巴结)中的MART1+和阴性CD8+T细胞,假设引起猪胸腺中正向选择增加的HLA-A2,将引起更多数目的MART1+T细胞输出到外周。通过用细胞增殖染料eFluor 450标记外周MART1+细胞,将它们与自体DC和添加的分级量的MART1肽一起孵育,测量GFP+T细胞的增殖和其它活化标志来检查外周MART1+细胞的功能。
实施例15-用HLA-A2-Tg猪胎胸腺产生的HIS小鼠对同种异体皮肤移植物排斥的比较
为了调查在用HLA-A2-Tg胸腺和CD34+细胞产生的HIS小鼠中的免疫系统功能,比较了HIS小鼠排斥同种异体皮肤移植物的能力。为此,通过将HLA-A2-Tg或非Tg对照猪胎胸腺和CB CD34+细胞移植到经亚致死剂量辐照的胸腺切除的NSG小鼠来产生HIS小鼠(表10)。移植后14-16周将来自同种异体人类供体的分裂厚度(2.3mm)皮肤样品移植到胸壁上。从第7天开始到4周每天对皮肤移植物进行评价,之后每三天检查至少一次。当少于10%的移植物保持活力时,将移植物定义为受排斥。当胸腺和外周的人APC共有HLA分子时,外周T细胞功能更强健,导致HLA-A2-Tg受者中的移植物排斥比对照猪胸腺移植物更快。
表10-用HLA-A2-Tg和非Tg猪胎胸腺组织制造的HIS小鼠
用于确定它们排斥同种异体人皮肤移植物的能力
实施例16-用非Tg与HLA-A2/DQ8-Tg猪胸腺进行的人类细胞重建的比较
当HLA-A2/DQ8-Tg猪胎胸腺可用时,比较用非Tg猪胎胸腺与HLA-A2/DQ8-Tg猪胎胸腺产生的HIS小鼠中的免疫重建和免疫功能。使用胸腺切除的NSG小鼠,使用HLA-A2-Tg和HLA-A2/DQ8-Tg猪胎胸腺加上HLA-DQ8+CB CD34+细胞产生两种类型的HIS小鼠,如表11中所述。使用HLA-DQ8+CB CD34+细胞产生HIS小鼠,因为外周HLA-DQ8+APC的存在是HLA-DQ8选择的人T细胞的最佳稳态所需的。使用HLA-A2+DQ8+CD34+细胞是为了通过胸腺和外周APC共有I类和II类HLA等位基因来优化免疫功能。
表11-用HLA-A2/DQ8-Tg和非Tg猪胎胸腺组织制造的HIS小鼠
用于比较人类细胞重建
在这些HIS小鼠产生之后,如下监测小鼠:
通过确定T细胞、B细胞和骨髓细胞群体的再增殖率和外周血浓度,监测和比较两种类型HIS小鼠中的人免疫细胞重建,所述细胞群体包括CD4和CD8 T细胞、原初和记忆CD4和CD8 T细胞、调节性T细胞(Treg)和T滤泡辅助(Tfh)细胞;B细胞亚群、单核细胞和DC,包括经典DC(cDC1和cDC2)和浆细胞样DC(pDC)。每4个细胞用ACK缓冲液溶解。进行外周血的流式细胞分析以确定每个群体的百分比和绝对数目。使用计数珠粒计算每个群体的绝对数目。还将确定每组HIS小鼠中实现重建的小鼠的百分比。用于研究免疫细胞群体的小组如表2所示。
在三种类型的HIS小鼠中移植后每4周通过ELISA监测和比较血浆免疫球蛋白水平(IgM和IgG)。
移植后14-16周,当预计HIS小鼠完全由人类细胞重建时,对每组中的一半动物实施安乐死并比较所有组的外周血、淋巴结、脾脏和胸腺中的大小、结构、细胞性和细胞群体。用于研究免疫细胞群体的流式细胞分析小组与表2所示相同。使用每种淋巴组织(包括脾脏、淋巴结和胸腺)的一小片进行组织学研究以比较这些组织的结构。通过ELISA测量所有HIS小鼠中的血清免疫球蛋白水平(IgM和IgG)。另外,使用响应于泛TCR刺激(抗-CD3/CD28珠粒)、同种抗原刺激、异种抗原刺激和破伤风类毒素新抗原刺激的增殖、细胞因子产生和细胞毒性的体外测定,比较每组小鼠外周人T细胞的功能。通过CFSE细胞染料稀释来确定增殖。细胞因子(包括IL-2和IFN-γ)的产生通过细胞内染色测定。对于同种抗原和异种抗原刺激,将同种异体人PBMC和第三方猪PBMC用作刺激物。用CFSE标记从HIS小鼠分离的脾T细胞,并与经过辐照的刺激物以1:1的比率共培养6天。人CD4和CD8 T细胞的CFSE稀释度通过流式细胞术确定。对于破伤风类毒素新抗原刺激,使用用于产生HIS小鼠的CB CD34+细胞产生DC。将CD34+细胞与人细胞因子(包括干细胞因子、GM-CSF和IL-4)一起培养13天,以分化成树突细胞。CD34来源的DC用破伤风类毒素新抗原脉冲,然后用TNF-α和PGE2使其成熟,接着与CFSE标记的分离的脾T细胞共培养7天。将通过流式细胞术确定增殖的T细胞。用LPS刺激单核细胞并且通过ELISA确定上清液中TNF-α、IL-6和IL-10的产生。
对剩余HIS小鼠进行长达30周的监测,以观察每个谱系重建的持久性并观察移植物抗宿主/自身免疫性疾病的出现。每4周给小鼠放血以确定人细胞移植。从移植后20周开始,使用实施例8所示的评分系统,每周两次对小鼠的移植物抗宿主疾病进行评分,直到第30周。在该时间点进行的所有分析都将与第14-16周的分析相同。
实施例17-在HLA-A2/DQ8-Tg与HLA-A2-Tg猪胎胸腺中发育的人T细胞对HLA-DQ8的耐受性的比较
比较了在HLA-A2/DQ8-Tg与非Tg猪胎胸腺中发育的T细胞对人Tg HLA-DQ8分子的耐受性。HIS小鼠是使用HLA-DQ8-CB CD34+细胞产生的,以消除由CD34+细胞来源的APC对HLA-DQ8反应性T细胞的负向选择。为该任务产生的多组HIS小鼠如表12所示。移植后14-16周,分离脾和成熟胸腺T细胞并使用源自供体猪的DC,在体外测试对HLA-DQ8的耐受性,预计会仅在HLA-A2/DQ8-Tg猪胎胸腺的受者中观察到耐受性。DC由猪胎肝白细胞产生,将在收获胎胸腺时收获并冷冻直至使用。将胎肝白细胞在猪干细胞因子、GM-CSF和IL-4中培养13天以使它们分化为DC。这些研究包括Treg消耗,因为TEC上HLADQ8的存在可能容许正向选择具有这些特异性的Treg。
表12-用HLA-A2/DQ8-Tg和HLA-A2-Tg猪胎胸腺组织制造的HIS小鼠用于比较人类T细胞对HLA-DQ8分子的耐受性
实施例18-比较在用对照与HLA-A2/DQ8-Tg猪胎胸腺产生的HIS小鼠中的HLA-DQ8限制性TCR的选择
在用非Tg对照与HLA-A2/DQ8-Tg猪胎胸腺产生的HIS小鼠中比较HLA-DQ8限制性TCR(克隆5)的选择。经亚致死剂量辐照的胸腺切除的NSG小鼠注射克隆5转导的CB CD34+细胞,然后植入非Tg对照或HLA-A2/DQ8-Tg猪胎胸腺(表13)。
表13-用非Tg对照或HLA-A2/DQ8-Tg猪胎胸腺组织制造的HIS小鼠用于研究MART-1TCR阳性T细胞的胸腺选择
移植后14-16周,当HIS小鼠完全由人类细胞重建时,将HIS小鼠实施安乐死用于分析。确定双阴性(CD1a+)(包括CD7+早期胸腺细胞)、CD69+和CD69-双阳性、CD4单阳性和CD8单阳性亚群中的克隆5+胸腺细胞的百分比和绝对数目,以及负向选择标志(PD1、CCR7)。还评价了Treg的标志(CD25和CD127),以便检测在HLA-DQ8+胸腺中具有这种TCR的胸腺细胞的Treg谱系分化。详细的小组如上表5所示。将用Aurora光谱流式细胞仪进行分析。由于预计这种TCR识别的胰岛素肽由髓质TEC(mTEC)产生,所以预计这种TCR的正向选择依赖于胸腺上皮的HLA-DQ8表达。预计在HLA-A2/DQ8-Tg猪胎胸腺中,与非Tg猪胸腺相比,会看到增强的HLA II类限制性TCR克隆5的正向选择。HLA-DQ8+人胸腺中的初步数据表明,除了TEC上的表达外,在CD34细胞来源的APC上也需要HLA-DQ8,以便负向选择该TCR(参见图9)。因此,使用HLA-DQ8+CB CD34+细胞产生HIS小鼠也将允许研究克隆5+T细胞的负向选择。使用荧光染料标记的克隆5Vβ特异性mAb(Vβ21.3)鉴定Tg T细胞并且GFP作为经过转导的HSPC来源的标志。胸腺发育每个阶段的GFP+和GFP-胸腺细胞提供了每个个体小鼠中Tg和非Tg T细胞选择水平的内部对照比较。
实施例19-比较用HLA-A2/DQ8 Tg猪胎胸腺产生的HIS小鼠对同种异体皮肤移植物的排斥
为了调查在用HLA-A2/DQ8-Tg胸腺和CD34+细胞产生的HIS小鼠中的免疫系统功能,比较了它们排斥同种异体皮肤移植物的能力。为此,通过植入HLA-A2/DQ8-Tg或非Tg对照猪胎胸腺和CB CD34+细胞来产生HIS小鼠(表10)。移植后14-16周将来自同种异体人类供体的,分裂厚度(2.3mm)皮肤样品移植到侧胸壁上。从第7天开始到4周每天对皮肤移植物进行评价,之后每三天检查至少一次。当少于10%的移植物保持活力时,将移植物定义为受排斥。
表14-用HLA-A2/DQ8-Tg和非Tg猪胎胸腺组织制造的HIS小鼠
用于确定它们排斥同种异体人皮肤移植物的能力
参考文献
Cheng,et al.Expression and function of HLA-DQ8(DQA1*0301/DQB1*0302)genes in transgenic mice.Eur J Immunogenet.1996;23(1):15-20.
Hongo,et al.Porcine thymic grafts protect human thymocytes from HIV-1-induced destruction.J Infect Dis.2007;196(6):900-910.
Kalscheuer,et al.A model for personalized in vivo analysis of humanimmune responsiveness.Science Translational Medicine.2012;4(125):125-130.
Kalscheuer,et al.Xenograft tolerance and immune function of human Tcell developing in pig thymus xenografts.Journal of Immunology.2014;192(7):3442-3450.
Khosravi Maharlooei,et al.Rapid thymectomy of NSG mice to analyze therole of native and grafted thymi in humanized mice European J.of Immunology2019;50(1):138-141.
Kotsiou,et al.Properties and applications of single-chain majorhistocompatibility complex class I molecules.Antioxid Redox Signal.2011;15(3):645-655.
Lan,et al.Induction of human T cell tolerance to porciue xenoantigensthrough mixed hematopoietic chimerism.Blood.2004;103:3964-3969.
Lan,et al.Reconstitution of a functional human immune system inimmunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+celltransplantation.Blood.2006;108(2):487-492.
Melkus,et al.Humanized mice mount specific adaptive and innate immuneresponses to EBV and TSST-1.Nat Med.2006;12(11):1316-1322.
Nikolic,et al.Normal development in porcine thymus grafts andspecific tolerance of human T cells to porcine donor MHC.J.Immunol.1999;162:3402-3407.
Pascolo,et al.HLA-A2.1-restricted education and cytolytic activity ofCD8(+)T lymphocytes from beta2 microglobulin(beta2m)HLAA2.1monochaintransgenic H-2Db beta2m double knockout mice.J Exp Med.1997;185(12):2043-2051.
Shimizu,et al.Comparison of human T cell repertoire generated inxenogeneic porcine and human thymus grafts.Transplantation.2008;86(4):601-610.
Zhao,et al.Positive and negative selection of functional mouse CD4cells by porcine MHC in pig thymus grafts.J.Immunol.1997;159:2100-2107.
Zhao,et al.Pig MHC mediates positive selection of mouse CD4+T cellswith a mouse MHC-restricted TCR in pig thymus grafts.J.Immunol.1998;161:1320-1326.
Claims (25)
1.一种转基因猪,其包含编码插入到猪基因组的一个或多个天然SLA基因座中的一种或多种HLA I多肽和/或一种或多种HLA II多肽的一个或多个核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的转基因猪,其中所述一个或多个核苷酸序列编码插入到天然SLA I基因座中的HLA I多肽。
3.根据权利要求2所述的转基因猪,其中所述SLA I基因座选自SLA-1和SLA-2。
4.根据权利要求2所述的转基因猪,其中所述HLA I多肽包含与人β-2微球蛋白(B2M)融合的HLA-A2。
5.根据权利要求2至4所述的转基因猪,其中所述一个或多个核苷酸序列插入到天然SLA I启动子后面。
6.根据权利要求2至4所述的转基因猪,其中所述一个或多个核苷酸序列插入所述SLAI基因座的内含子1/外显子2接合点处。
7.根据权利要求2至6所述的转基因猪,其中所述一个或多个核苷酸序列还编码插入到天然SLA-DQα基因座中的HLA II多肽。
8.根据权利要求1所述的转基因猪,其中所述一个或多个核苷酸序列编码插入到所述天然SLA-DQα基因座中的HLA II多肽。
9.根据权利要求7至8所述的转基因猪,其中所述HLA II多肽包括HLA-DQ8多肽。
10.根据权利要求10所述的转基因猪,其中所述HLA-DQ8多肽通过编码HLA-DQ8的双顺反子载体(HLA-DQA1:03:01:01和HLA-DQB1:03:02:01)靶向所述天然SLA-DQα基因座。
11.根据权利要求10所述的转基因猪,其中所述双顺反子载体还包含高效IRES元件。
12.根据权利要求7至11所述的转基因猪,其中编码所述HLA II多肽的所述一个或多个核苷酸序列插入到所述天然SLA DQα启动子后面。
13.根据权利要求7至11所述的转基因猪,其中编码所述HLA II多肽的所述一个或多个核苷酸序列插入所述SLA DQα基因座的内含子1/外显子2接合点处。
14.根据权利要求1所述的转基因猪,其中所述HLAI多肽选自HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G,并且其中所述HLA II多肽选自HLA-DP、HLA-DM、HLA-DO、HLA-DQ和HLA-DR。
15.一种将胸腺组织异种移植到有需要的受试者中的方法,其包括将来自根据权利要求1-14中任一项所述的转基因猪的胸腺组织引入所述受试者中。
16.一种恢复或复原有需要的受试者的胸腺功能损伤的方法,其包括将来自根据权利要求1-14中任一项所述的转基因猪的胸腺组织引入所述受试者中。
17.一种重建有需要的受试者中的T细胞的方法,其包括将来自根据权利要求1-13中任一项所述的转基因猪的胸腺组织引入所述受试者中。
18.根据权利要求15-17所述的方法,其中所述受试者是人。
19.根据权利要求15-18所述的方法,其中所述转基因猪包含源自所述受试者的HLA多肽。
20.一种产生根据权利要求1-14中任一项所述的转基因猪的方法,其包括将至少一种靶向载体和至少一种CRISPR-Cas9质粒施用到猪细胞中,其中所述靶向载体包含编码一种或多种HLA I多肽和/或一种或多种HLA II多肽的一个或多个核苷酸序列。
21.根据权利要求20所述的方法,其中所述编码一种或多种HLA I多肽和/或一种或多种HLA II多肽的一个或多个核苷酸序列源自特定个体受试者。
22.一种产生人免疫系统(HIS)小鼠的方法,其包括对所述小鼠进行胸腺切除并将猪胎胸腺组织和人CD34+细胞引入到所述小鼠中。
23.根据权利要求22所述的方法,其中所述人CD34+细胞是胎的或成人的。
24.根据权利要求22所述的方法,其中所述人CD34+细胞源自脐带血。
25.一种产生人免疫系统(HIS)小鼠的方法,其包括对所述小鼠进行胸腺切除并引入猪胎胸腺组织,其中所述胎胸腺组织源自根据权利要求1-14所述的转基因猪。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201962924228P | 2019-10-22 | 2019-10-22 | |
US62/924,228 | 2019-10-22 | ||
US201962925859P | 2019-10-25 | 2019-10-25 | |
US62/925,859 | 2019-10-25 | ||
PCT/US2020/056771 WO2021081156A1 (en) | 2019-10-22 | 2020-10-22 | Transgenic swine, methods of making and uses thereof, and methods of making human immune system mice |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114585744A true CN114585744A (zh) | 2022-06-03 |
Family
ID=75620265
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202180005989.3A Pending CN114585744A (zh) | 2019-10-22 | 2020-10-22 | 转基因猪、其制造方法和用途以及制造人免疫系统小鼠的方法 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20220279767A1 (zh) |
EP (1) | EP4048802A4 (zh) |
JP (1) | JP2022553328A (zh) |
KR (1) | KR20220084296A (zh) |
CN (1) | CN114585744A (zh) |
AU (1) | AU2020370254A1 (zh) |
CA (1) | CA3155234A1 (zh) |
IL (1) | IL292406A (zh) |
WO (1) | WO2021081156A1 (zh) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6639122B1 (en) * | 2000-09-19 | 2003-10-28 | Animal Technology Institute Taiwan | Transgenic swine having HLA-D gene, swine cells thereof and xenografts therefrom |
WO2016210280A1 (en) * | 2015-06-26 | 2016-12-29 | Indiana University Research & Technology Corporation | Transgenic pigs with genetic modifications of sla |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2822117A1 (en) * | 2010-12-31 | 2012-07-05 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Generation of autologous t-cells in mice |
EP2699593B2 (en) * | 2011-04-20 | 2020-11-04 | University of Washington Through Its Center for Commercialization | Beta-2 microglobulin-deficient cells |
EP4052572A1 (en) * | 2011-10-28 | 2022-09-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified mice expressing chimeric major histocompatibility complex (mhc) ii molecules |
ES2874501T3 (es) * | 2013-10-18 | 2021-11-05 | Taiho Pharmaceutical Co Ltd | Animal no humano que expresa HLA de clase I |
CA2969847A1 (en) * | 2014-12-10 | 2016-06-16 | Regents Of The University Of Minnesota | Genetically modified cells, tissues, and organs for treating disease |
-
2020
- 2020-10-22 CN CN202180005989.3A patent/CN114585744A/zh active Pending
- 2020-10-22 AU AU2020370254A patent/AU2020370254A1/en active Pending
- 2020-10-22 EP EP20880160.5A patent/EP4048802A4/en active Pending
- 2020-10-22 WO PCT/US2020/056771 patent/WO2021081156A1/en unknown
- 2020-10-22 JP JP2022523593A patent/JP2022553328A/ja active Pending
- 2020-10-22 IL IL292406A patent/IL292406A/en unknown
- 2020-10-22 KR KR1020227012957A patent/KR20220084296A/ko unknown
- 2020-10-22 CA CA3155234A patent/CA3155234A1/en active Pending
-
2022
- 2022-04-18 US US17/722,697 patent/US20220279767A1/en active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6639122B1 (en) * | 2000-09-19 | 2003-10-28 | Animal Technology Institute Taiwan | Transgenic swine having HLA-D gene, swine cells thereof and xenografts therefrom |
WO2016210280A1 (en) * | 2015-06-26 | 2016-12-29 | Indiana University Research & Technology Corporation | Transgenic pigs with genetic modifications of sla |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2022553328A (ja) | 2022-12-22 |
CA3155234A1 (en) | 2021-04-29 |
AU2020370254A1 (en) | 2022-04-14 |
EP4048802A4 (en) | 2023-11-22 |
KR20220084296A (ko) | 2022-06-21 |
WO2021081156A1 (en) | 2021-04-29 |
US20220279767A1 (en) | 2022-09-08 |
IL292406A (en) | 2022-06-01 |
EP4048802A1 (en) | 2022-08-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106536721B (zh) | 核酸酶介导的编辑编码hla的基因所产生的免疫相容性细胞 | |
US5583278A (en) | Recombination activating gene deficient mouse | |
US20070033668A1 (en) | Inbred miniature swine and uses thereof | |
JP2019517803A (ja) | 疾患を処置するための遺伝子改変された細胞、組織、および臓器 | |
EP1878798A1 (en) | Method of producing a multichimeric mouse and applications to study the immunopathogenesis of human tissue-specific pathologies | |
JP2022539453A (ja) | 抗原特異的人工免疫制御性T(airT)細胞 | |
CN114207137A (zh) | 调节性t细胞中受控的转基因表达 | |
JP2020519282A (ja) | Mhcクラスiおよびmhcクラスiiを欠損しているnsgマウス | |
EP2414523B1 (en) | Dendritic cell-boosted humanized immune system mice | |
WO1992009688A1 (en) | MICE HAVING β2 MICROGLOBULIN GENE DISRUPTION | |
JPH06507068A (ja) | Mhcクラスii遺伝子に変異を有する遺伝的操作を受けたマウス | |
US20220279767A1 (en) | Transgenic swine, methods of making and uses thereof, and methods of making human immune system mice | |
CN116033910A (zh) | 编辑b细胞中b2m基因座的方法和组合物 | |
Chen et al. | Humanized transgenic mice expressing HLA DR4‐DQ3 haplotype: reconstitution of phenotype and HLA‐restricted T‐cell responses | |
JP2019532620A (ja) | 遺伝子改変免疫不全非ヒト動物における改良されたヒト赤血球生存に関連する方法および組成物 | |
Fukui et al. | T-cell repertoire in a strain of transgenic C57BL/6 mice with the HLA-DRA gene on the X-chromosome | |
WO2021172583A1 (ja) | 遺伝子改変巨核球、改変血小板及びそれらの製造方法 | |
KR20230037044A (ko) | 인간 hla-a201 제한 유전자를 발현하는 트랜스제닉 마우스 모델 | |
Sper et al. | Allogeneic and xenogeneic lymphoid reconstitution in a RAG2−/− IL2RGy/− severe combined immunodeficient pig: A preclinical model for intrauterine hematopoietic transplantation | |
Osborn et al. | Cellular engineering and disease modeling with gene-editing nucleases | |
WO2022140354A1 (en) | Artificial antigen-specific immunoregulatory t (airt) cells | |
Regev | Rapid CLIP dissociation from MHC II promotes an unusual antigen presentation pathway in autoimmunity | |
McCarrick III | Generation of a CD4-deficient mouse line using a novel diphtheria toxin A-chain gene construct and assessment of the immune response to SV40 large T antigen | |
Yunis et al. | Stem cells in aging: Influence of ontogenic, genetic and environmental factors |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |