JPH06507068A - Ｍｈｃクラスｉｉ遺伝子に変異を有する遺伝的操作を受けたマウス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子に変異を有する遺伝的操作を受けたマウス発明の分野 本発明は免疫学およびトランスジェニックマウスの分野に関するものである。

具体的には、本発明は１またはそれ以上の野性型ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の正常 な表現を欠失しているマウス、この様な欠失についてのへテロ接合的なマウス、 およびこの様な欠失についてヘテロ接合性、ホモ接合性またはキメラ性であるセ ルライン、好ましくは多分化能性または分化全能性セルライン、に関するもので ある。

関連技術についての記述 主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）のクラスＩＩ遺伝子およびその生産物は、 免疫系の展開および機能に主要な役割を演じている（Ｃａｒｂｏｎｅ、　Ｆ、Ｒ ，ら、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第２版、Ｗｉｌｌｉ ａｍｓ　Ｅ、Ｐ、編、Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｔｄ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ｐ ５４１（１９８９）、「主要組織適合複合体によるＴ細胞認識のコントロール」 ：　Ｍｅｎｇｌｅ−Ｇａｙ、　Ｌ、ら、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｉｎ＋ｍｕｎｏ１．　 ３：３６７（１９８５））。

ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子およびその生産物は、多くの現象に於いて極めて重要で ある。即ち、「ヘルパー」または「炎症」タイプ（ＣＤ４　Ｔ細胞）の機能的Ｔ 細胞群の選択をコントロールしており、ＭＨＣクラスＩＩ分子によるＴ細胞の胸 腺選択は、例えば自己寛容をもたらす。クラスＩＩ遺伝子産物は、免疫応答に於 いて、ヘルパーＴ細胞が「抗原提示」を介して外来抗原を認識するための必須の コンジットである（Ｕｎａｎｕｅ、Ｅ、　Ｒ，、ＦｕｎｄａＩＩｌｅｎｔａＬ　 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｌｏｇｙ、第２版、ＷｉｌｌｉａｍＥ　２６編、Ｒａｖｅｎ　 Ｐｒｅｓｓ　Ｌｔｄ、　、Ｎｅｗ　ＹｏｒｋＳｐ９５（１９８９）、「マクロフ ァージ、抗原提示細胞、および抗原処理および抗原提示の現象」）。

ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子は、１つの種内で高度のアレルポリモルフイズム（多重 性）を示す。この多重性は、胸腺選択および抗原提示のレベルでの制限によって 、特定の抗原または病原体に体する応答に関して個体間に差異を生じる。この多 重性はまた、不適合個体間での組織転移に於いて、移植片拒絶や移植片対宿主反 応病の様なアロ（同種）反応現象を起こす。最後に、機序はよくわかっていない が、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子は多くのヒトの病気の原因遺伝子として作用してい る。例えば、多発性硬化症はＨＬＡ−ＤＲ２遺伝子のｅ傷害が関与しており、糖 尿病はＨＬＡ−ＤＲ３，４と関係があることが判明している。

更に詳細に述べると、あらゆる種の免疫応答は、はとんどの細胞によって表現さ れるＭＨＣＩおよびＭＨＣクラスＩＩ（主要組織適合複合体クラスＩおよびＩＩ ）分子による抗原提示に依存している。ＭＨＣＩは大抵の細胞で表現しており、 主として、自己抗原を含む細胞内に実際に存在する抗原を提示する役割を果たし ている。ＭＨＣクラスＩＩは主として細胞外起源の抗原の提示に関与しており、 従って、主に外来抗原を免疫系に提示する役割を担っている。ＭＨＣクラスＩＩ の表現は、基本的には免疫系の細胞、例えばＢ細胞、樹枝状細胞、食細胞などに 限られる。

ＭＨＣＩおよびＭＨＣクラスＩＩは免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、 その分子中に、抗体分子に見られる定常（ｃ）領域に極めて類似した領域を持っ ている。Ｔ細胞レセプター（これはＭＨＣＩおよびＭＨＣクラスＩＩを認識する ）もこのファミリーに属し、抗体に特徴的な可変（Ｖ）領域と定常領域の両方を 持っている。ＣＤ８（ＣＤ８　）に陽性のＴ細胞は、抗原提示ＭＨＣＩ細胞を認 識し、かつ、それによって活性化され得るものであり、ＣＤ４細胞は、抗原提示 ＭＨＣクラスＩＩ細胞を認識し、かつ、それによって活性化され得るものである 。

ＣＤ４分子はＴリンパ球ヘルパー細胞以外の細胞にも存在しており、脳内にも存 在していることが知られているが、１９２８球ヘルパー細胞上に特徴的に存在し ている。ＣＤ４はＨＩＶ感染に於ける重要性の故に、非常によく特性化され、研 究されている。これはＴＣＲと関係しており、ＭＨＣクラスＩＩ（抗原と共に、 あるいは抗原なしで）をｉｌｌ！識し、ＴＣＲとＭＨＣクラスＩＩ分子を極（近 （に固定し、それらの相互作用を促す役割を果たしている。

関連するＴ細胞サブセットが活性化されると、これらのＴ細胞が増殖し、関連す るＢ細胞に信号が送られてこれを増殖させ、抗原に対する抗体が生産される。

侵入してくる生物体は皮脂を生成することがある、即ち、自己抗原またはＭＨＣ クラスＩ　Ｉ／Ｉ分子をまねたり、ＭＨＣ分子に結合しない構造を展開すること により免疫系からのがれ得る抗原を生成することがあるので、防御のために、Ｍ ＨＣ分子は多様化し、多くのアレルを持った多遺伝子ファミリーとなったので、 人類はそれぞれのＭＨＣ分子タイプについていくつものアレルを持っている（Ｎ ａｇｙら、Ｉｎ＋ｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ、（１０：１３２−１３８（１ ９８９））。

ヒトのＭＨＣ分子は、いくつもの異なったクラス、即ちＨＬＡ　Ａ、Ｂ、または Ｃ（クラスエ）、およびＨＬＡ　ＤＰ、ＤＱまたはＤＲ（クラスＩＩ）を形成し ており、それぞれのクラスはそのα鎖またはβ鎖の構造が異なっている。１人の 個人に於いて、α鎖とβ鎖の構造は、２人の両親から受けついだものである。

個体間の違いは、分子のこの部分のみの相違となり得る。その他の領域（膜やレ セプターとの結合領域、ＣＤ４およびＣＤ８など）は個体間で差がなく、種間で のみ異なる。個体間で異なる分子のこれらの部分は抗原をＴ細胞に提示する役割 を果たしている。従って、通常２人の個体は、ある与えられた抗原に対して異な った応答をするものである。

それらは抗原を提示するので、ＭＨＣ分子はまた、どのＴ細胞レセプター（ＴＣ Ｒ，）がそれらと反応するか、およびＴＣＲのαおよびβ鎖の可変領域、■、お よびＶ、、に依存している機能を決定している。外来ＭＭＣを認識しないＴＣＲ 。

には選択圧が存在しないので個人々々には他の個人のＭＨＣの可変領域を認識で きる、あるいは認識するであろう多数の細胞が存在している。

個体の自己ＭＨＣを認識するＴＣＲは、外来遺伝子が抗原提示クレットによって 提示されない限り、認識しない（ＭＨＣ細胞細胞レストラクションＴＣＲはＭＨ Ｃ表面の形を認識する。理由は十分に解明されていないが、外来ＭＨＣは、多数 のＴ細胞により外来抗原を提示している自己ＭＨＣと認識される。

それ故、外来の免疫能細胞の導入に際しては問題が生じ、多数のＴ細胞が活性化 され、増殖し、最終的には移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）に至る。

ＧＶＨＤは、免疫系と関係する、ある血液細胞の著しい増殖、免疫応答と自己寛 容のそう夫、およびその他の病態、例えば胸腺の退化、膵臓の腫脹などを特徴と する。

導入されたＴ細胞は宿主のＭＨＣ分子を、外来抗原を提示している自己ＭＨＣと 認識して反応する。宿主細胞は、なんらかの病原体によって特別の作用を受けな くても、炎症過程を介して、または直接の細胞毒性により攻撃を受ける。この様 な反応は最終的にレシピアント（受入側）を死に至らしめることがある。

１つの未解決の疑問点は、何故ＡＩＤＳの症状が発症することな（、チンパンジ ーにＨＴＶの生産的感染をひき起こすことができるのかという点である。チンパ ンジーのＭＨＣを特性化することにより、チンパンジーのＭＨＣはヒトのＭＨＣ と数個のアミ７′酸が異なっているだけであることが判明したが、それでもチン パンジーは明らかに完全な健康を保ちつづけるのである。この様な、あるいはそ の他の問題は、存在するＭＨＣクラスＩＩがシステム（系）ではなく当業者によ って指示（ディクチイト）された系が利用可能となれば解決されるであろう。

哺乳類の遺伝系を研究する上でマウスは好ましいモデルであり、ネズミのゲノム 地図をつくるために膨大な研究が行なわれて来た。主要組織適合複合体のはじめ ての発見を導いたのはマウスについての研究であった。

はとんどのマウスは、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子によってコードされている２個の タンパク複合体、即ちＡおよびＥ複合体を持っている。それぞれはαおよびβ鎖 からなっている（即ち、ＡαＡβおよびＥαＥβである。Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、　 Ｍ、　Ａ。

ら、Ｆ　ｕｎｄａＩｌｅｎｔａｌ　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第２版、Ｗｉｌｌ ｉａｍ　Ｅ、Ｐ、編、Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｔｄ、、Ｎｅｖ　Ｙｏｒｋ、 ｐ４８９（１９８９）、「主要組織適合複合体抗原および遺伝子」）。しかしな がらＥα遺伝子に於ける遺伝学的傷害のために、機能的なＥ複合体を欠失してい るマウスもいる（例えばＣ５７Ｂ１／６または１２９マウス株。Ｍａｔｈｉｓ　 Ｄ、Ｊ　、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０：２７３ （１９８３）。

従って、ＭＨＣクラスＩＩの役割が明確な形で研究できる生体モデルを確立する ことが極めて重要であると考えられる。

本発明の目的は、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子を欠失しているマウス株を生産するこ とである。この様なマウスは、クラスＩＩ遺伝子の役割をより深く理解するのに 非常に役立つであろうし、トランスジェネシスにより再導入し得る特定の遺伝子 の機能を、内因性のクラスＩＩ遺伝子の干渉を受けることなく直接試験すること を可能にするであろう。

発明の要約 本発明は主要組織適合クラスＩＩＡ複合体の正常な表現を欠失しているマウス、 およびマウスのセルラインを提供するものである。具体的には、本発明は、ＭＨ ＣクラスＩＩＡ部分が修飾を受ける様に遺伝学的な変異を受けたマウスについて 記述している。

本発明は更に、上記欠失についてヘテロ接合体であるマウスおよびセルラインを 提供するものである。

本発明はまた、上に述べたマウスやセルラインを用いる、抗原と結びついたＭＨ ＣクラスＩＩタンパクを同定する方法をも提供するものである。具体的には、抗 原と結びついたＭＨＣのクラスは、まず抗原と、正常なＭＨＣクラスＩＩ遺伝子 表現を行なうセルライン（ａ）とをインキュベートし、次に抗原を、ＭＨＣクラ スＩＩアレルの１個またはそれ以上の正常な表現を欠失しているセルライン（ｂ ）とインキュベートし、最後に、（ａ）によって結合した抗原の量に対する（ｂ ）によって結合した抗原の量をめることによって同定することができる。

図面の簡単な説明 第１Ａ図はＭＨＣクラスＩＩＡβ遺伝子の制限地図を示している。黒い箱は遺伝 子のエクソンに相当している（１、Ｄｌ、Ｄ２、ＴＭＳｃおよび３’ＵＴはそれ ぞれリーダーエクソン、第１ドメインエクンン、第２ドメインエクソン、トラン スメンブレンエクソン、細胞質エクソンおよび非翻訳エクソンを意味する）。第 １Ｂ図は、ＥＳ細胞のエレクトロポレーション用の上記ＤＮＡ構築物を示してい る。図は、１．ＩＫｂネオマイシン耐性マーカーを含んでおり、２個の１．８Ｋ ｂＨ５ＶＴＫ遺伝子にはさまれたゲノムＤＮＡの５．５Ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　−Ｈ ｌｎｄＩ　Ｉ　Ｉフラグメントを示している。ブルースクリプトＳＫ　プラスミ ド配列が構築物上に残されていた。矢印は選択マーカーをコードしている遺伝子 の転写の方向を示している。

第１Ｃおよび第１Ｄ図はゲノムＤＮＡのサザーンプロット分析にょるＥＳ細胞中 のホモローガスな組換えの証明を示している。図はＥｃｏＲＩで消化し、プロー ブ＃２とハイブリダイズした後、野性型Ａ、（Ｃ）またはＡｏ、（Ｄ）がら得ら れたフラグメントを示している。

第１Ｅ図はＥＳ細胞におけるＫＲエベントの同定を示している。正常なりローン （＋／＋）およびＥｃｏＲＩ（プローブ＃２）およびＢｇｌｌＩ（プローブ＃１ ）で消化した、ホモローガス組換えのＡ″、遺伝子（＋１０）を持ったクローン の例が示されている。説明は第１Ｃ図および第１Ｄ図の場合と同じである。

第１Ｆ図はＡ６ｐ特性のメンデル遺伝を示している。２匹のＡ、＋１０動物、元 のキメラマウスからの子孫をつがわせた。それらの子孫のある動物の尾部ＤＮＡ をサザーンプロットにより分析したところ、野性型（＋）または変化した（０） Ａβ遺伝子の分離がみられた。

第２Ａ図（コントロール）および第２Ｂ図（Ａａ”Ｏ）は数個の抗−クラスＩＩ モノクローナル抗体を持っている膵臓およびリンパ腺からのＢリンパ球の細胞蛍 光分析を示す（例えばＢＰ１０７、ＡＴＣＣ受託番号ＴｌＢ１５４、Ｌａｎｄａ ｉｓ　Ｄら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３７＋３００２（１９８６）参照）。

第３Ａ図（コントロール）および第３Ｂ図（Ａ、”’）は、クラスＩＩ特異抗体 を持った胸腺の薄切片の免疫蛍光染色を示す。

第４Ａ図（コントロール）および第４Ｂ図（ＡＪ”’）は正常な同腹の子（第４ ａ図）およびＡＨ””マウス（第４Ｂ図）のリンパ腺中のＣＤ４−およびＣＤ８ −表現細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。

好ましい態様の記述 本発明は、１またはそれ以上のＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の正常な表現を欠失して いるマウス、この様な欠失にヘテロ接合性であるマウス、およびその様な欠失に ついてヘテロ接合性、ホモ接合性またはキメラ性である、好ましくは多分化能あ るいは分化全能性のセルライン、および特に少なくとも１個のＭＨＣ遺伝子、ま たはその正常な表現が存在していないことが望ましい情況におけるそれらの利用 に関するものである。

本発明の１つの目的は、少なくとも主要組織適合クラＸＩ　ＩＡ複合体の正常な 表現を欠失しているマウスを提供するものである。

この様なマウスは、そのマウスが定義の通りの欠失を有しておれば、所望の特性 についてヘテロ接合性であってもホモ接合性であってもよいことは理解されよう 。

本発明の別の目的は、この様な欠失を示さないが該欠失に関してヘテロ接合性で あるマウス、および該欠失に関してヘテロ接合性、ホモ接合性またはキメラ性で ある、好ましくは多分化能性あるいは分化全能性のセルラインを提供するもので ある。

本発明のマウスの基礎となるものとしては、１個のＭＨＣクラスエエ遺伝子産物 を既に欠失しているマウスが好ましいであろうことは理解されるであろうが、適 切なものであればいかなるマウスであってもよい。多くの適切なマウスが知られ ており、また入手可能であるが、例えばＥ複合体の発現を欠失している１２９株 マウスがあげられる。「欠失」とは、正常な表現を欠いている、または実質的に 完全に欠いていることを意味する。遺伝子を欠いている場合は表現が不可能であ ることは理解されよう。しかし、例えば該当する遺伝子が挿入エベントによって 変異している場合に、極めて少量の遺伝子産物が生産されるということがあり得 る。もっとも、その様な産物はそれ自体機能性がなかったり、通常の生理学的作 用を受けなかったりすることがある（例えば細胞表面での表現など）。「正常な 表現」とは、野性型動物で期待される程度の表現レベルを意味する。本発明の動 物では、ある種の産物は表現されるかもしれないが、機能的でなかったり、ある Ｌ）は、正常なＭＨＣクラスＩＩの機能を支えるには不十分な僅かな量しか表現 されない。

１個のＭＨＣクラスＩＩ遺伝子産物の欠失あるいは異常な表現は、該当する複合 体を非機能性にしたり、複合体の完全な形成を阻害し、１個以上の遺伝子に影響 を与えることを不要とする。もつとも本発明は後者をも包含して（＼るが。例え ば一般に、Ａ複合体のいずれかの表現を阻止するためには、Ａ、遺伝子またはＡ 。

遺伝子だけに変異を与えれば十分である。

既に述べた通りＭＨＣクラスＩＩ複合体の表現がないか、または感知し得る程の 表現がないことが極めて望ましい。これは一般に、Ｅ複合体を欠失しているタイ プのマウスを使って達成するのが最もよい（これは存在するかもしれなＬ）が） 。

ＥおよびＡ複合体の両方の表現を除去する様にマウス株を変異させること（ま可 能であるが、生産の容易さの為には、既にＥ複合体を欠失している既知のマウス が出発材料として好ましい。

Ａ複合体またはＢ複合体のいずれかの表現がない好ましいマウスに於Ｌ％て、例 えばＡ、およびＥ、サブユニットからなる）＼イブ１ルｙドＭＨＣ複合体の非常 に限られた一定量の表現があるかもしれないにの様な複合体が観察されたこと（ まなＬ）が）。更に、この様な複合体はＴＣＲと、例え反応したとしても、多分 具なった反応をするであろう。

本発明のマウスは、Ａ複合体の存在に依存する機能が適切に達成され得る程度に 、ＭＨＣＩＩのＡ複合体の表現を欠失している。従って、例えば、ＭＨＣＩＩを 特異的に認識するＣＤ４　Ｔ細胞集団は、Ａ複合体の不存在によって著しＬ１影 響を受けるであろう。これはＡおよびＥ複合体の両者が存在しない時に起こり、 Ａ複合体だけの不存在によって、Ｅ複合体がなんらかのユニークな目的（二役立 つか否か、あるいはＥ複合体はそれ自体で正常なＭＨＣＩＩ機能を支えるのに十 分であるか否かを確立することができる。

ＭＨＣクラスＩＩ産物のいずれかの不存在によってまた、他の手段、例え（ｆ外 来遺伝子を使ったり、医薬または他のへテロローガス産物の導入によってＣＤ４ Ｔ細胞集団を回復させる可能性を調べることができる。

この様な系はまた、免疫ネットワークのＭＨＣクラスＩＩ関連面だけが欠損して いるインビボでの全体系を研究することを可能にし、また、これまでＭＨＣＩＩ の支配的な影響の故にその効果を調べることが出来なかった他の、比較的マイナ ーな要素の重要性を、研究者が確立することも可能にする。

本発明のＭＨＣＩＩ欠失マウスはまた、免疫拒絶が関係している問題を起こすこ とのない外来遺伝子の導入を研究するのにも使用できる。ＧＶＨＤは宿主反応を 惹起するという複雑さを伴うことな（研究することができ、免疫不全病態を予防 的に、症候学的に、あるいは実際の原因物質を存在させることにより研究するこ とができる。この様な研究は、例えばＡＩＤＳの治療の研究に特に重要である。

本発明のマウスは他の遺伝子の表現を欠失していることもあり、これは本発明の もう１つの側面である。この様なマウスは、例えば免疫系の他の要素の研究に用 いることができる。

種々の疾患の治療が複雑な免疫応答およびイエルネのイディオタイプ／抗イデイ オタイプネットワークの存在なしに、調べることができ、受身ワクチンをテスト し、完全に評価することができる。

また、記述した様に、異常なヒトＭＨＣ遺伝子は、種々の疾患に対する素因剤と して作用し得るので、本発明のマウスは、非ヒトの丸ごとの生物体環境に於いて 、ヒトＭＨＣに傷害を導入することの影響を研究するのに用いることができる。

即ち、この様な疾患の症状や形態学を研究できるだけでな（、可能性のある治療 法も分析することができる。これは、本発明の好ましい特徴である。

本発明のマウスは、ホモローガス組換え（ＨＲ）として知られている方法により 得ることができる。この方法は原核生物種において古くから知られていたが、最 近になってマウスについて報告された（総論として、ＴＩＧ５（３）＋７０−７ ６゜１９８９参照）。

ホモローガス組換えは、基本的には、標的遺伝子を単離し、既知の遺伝子工学技 術を使って遺伝子を変異さ也または不能にし、あるいは修飾し、その遺伝子を該 当する生物種に再導入することからなる。これは、通常胚からとった、多分化能 性または分化全能性細胞の培養を調製することにより達成する。これらの細胞の 利点は、分化しない条件化で、何世代にも渡って培養することができるという点 にある。

通常、エレクトロポレーションの技術により、胚幹細胞（ＥＳ）の様な細胞を、 外来ＤＮＡをとり込み得る様にすることができる。次に適当な方法でこれらの細 胞に修飾した遺伝子を導入する。いったん取り込まれると、ホモローガス組換え によるか、挿入によるかして組換えが起こる。

所望の組換えが起った細胞を選択するために、マーカーを使用してもよい。例え ば、ネオマイシンに対する耐性を付与するために、細菌Ｎｅｏ遺伝子を採用した り、その同族体、例えばＧ４１８を採用することはよ（知られている。マーカー 遺伝子は修飾すべき遺伝子に導入することができ、これによって標的遺伝子の機 能を失活させ、マーカーが得られることになる。Ｎｅｏのクローンは組換えを受 けたのである。

ホモローガスな組換え体を更に選択するために、修飾した遺伝子の末端に他のマ ーカー、例えば単純ヘルペスウィルス・チミジンキナーゼ（Ｈ３ＶＴＫ）遺伝子 がぶらさがっていてもよい。ＨＲの段階では、Ｈ３ＶＴＫ遺伝子は組換を受けず 、このマーカーは移転しないであろう。従って、所望の組換え体は、例えばＨ５ ＶＴＫ遺伝子産物が存在する場合に毒性のある代謝産物に変換されるガンシクロ ビル（Ｇ　ａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ）に耐性を有するであろう（非ホモローガス組 換え後）。当業者が必要な遺伝子を単離するのに必要な情報は、例えばＭｃｋｎ ｉｇｈｔ、　Ｓ、Ｌ、によって記載されている（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ 　８：５９４９（１９８０））。

変異させた遺伝子の構造がわかっている場合は、もう少し手間のかめＡるＰＣＲ 法を使って正しいクローンを同定することもできる。しかし、この方法は、基本 的にはもはや使用されない。次に、適切なりローンが同定されたらＥＳ細胞を初 期の胚または胚盤胞に注入し、偽妊娠のメスに再導入する。

通常、その組織の一部が選択したクローンからのものであるキメラ動物が、少な くともこれらの胚の一部から生成する。従って、生殖系列もまた、選択した遺伝 子を含有しているキメラ精子、または卵子となろう。この様な生殖細胞由来の子 孫も遺伝子に関してヘテロ接合性となろう。

ヘテロ接合性の子孫を交雑させ、ホモ接合性の動物を生産することができる。

マウスのアレル構造の確認は、例えばサザーンプロットにより確かめることがで きる。

本発明はまた、本発明のマウスを生産するに適したセルライン、その様なセルラ インやマウスを生産する方法をも包含している。

本発明のマウスを得るために、本発明者らは胚幹細胞（ＥＳ細胞）におけるホモ ローガス組換え技術（ＨＲ）を使用してＡ、遺伝子を破壊したが、この技術はＳ ｍ１ｔｈｉｅｓとＣａｐｐｅｃｃｈｉによって開発されたものである（　Ｓ　ｍ １ｔｈｉｅｓ、○、ら、Ｎａｔｕｒｅ３１７：２３０（１９８５）＋Ｚｉｊｌｓ ｔａ、Ｍ、ら、Ｎａｔｕｒｅ　３４２：４３５（１９８９）：　Ｓ　ｃｈｖａｒ ｔｚｂａｒｇ、　Ｐ　、Ｌ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４６　ニア　９９（１９８ ９）；Ｄｅｃｈｉａｒａ。

Ｔ、Ｍ、ら、Ｎａｔｕｒｅ　３４５　ニア　８（１９９０））。

組換えＤＮＡ技術を使って、変異Ａ１遺伝子を構築した。この遺伝子は、外因性 のＤＮＡ配列を、成熟タンパクの第１ドメインをコードしている領域に挿入する ことにより有効に破壊することができた。これは以降、Ａ６．と呼ぶ。

次いでこのＤＮＡをエレクトロポレーションにより、マウス１２９株由来の分化 全能性の胚幹細胞に導入した。変異ＡＩ遺伝子が、ホモローガス組換えによって 、対応する正常な遺伝子と置換している形質転換細胞のクローンを選択した。

次いでこの細胞を使って、繁殖によってＡｏｚ−含有染色体を次世代のマウスに 古典的遺伝特性として伝えていくことができるキメラマウスを得ることができる 。

Ａ、遺伝子の破壊に使う組換えＤＮＡは２段階で構築した。第１段階は、ネオマ イシン耐性マーカーをコードしている細菌遺伝子をＡ、構造遺伝子に挿入し、そ の遺伝子の機能を物理的に阻害し、一方その構築物をゲノムＤＮＡに安定に取り 込んだ細胞を選択する手段を得ることであった。

構築の次の段階は、黒線ヘルペスウィルス・ナミジンキナーゼ（ＨＳ　Ｖ　Ｔ　 Ｋ）遺伝子を修飾Ａ、遺伝ｔの両端ｉ：：　Ｅ　＜　、ｊ：、　’、）に詮計Ｕ ｆ二、　Ｍａｎｓｏｕ１′□によって最初に記載された通り（Ｍａｎｓｏｕｒ、 　Ｓ、Ｌ　ら、Ｎａｔｕｒｅ　３３６：３４８（１９８８））、この構築物は、 これらの配列がＨＲの際には削除されるが非ホモローガス組換えでは削除されな いので、非ホモローガス組換えに対する選択マーカーとなる。Ｈ５ＶＴＫ遺伝子 産物は、ガンンクロビルの様なヌクレオシド同族体を青性のある代産産物に代え ることによっで、Ｈ５ＶＴＲ断片の欠損の選択を可能にするという役割を果たす 。

次に、ＥＳ細胞をエレクトロポレーションにかけ、Ｈ８ＶＴＫ遺伝子と共に、あ るいは該遺伝子なしに、線状化ＤＮＡに導入し、た。細胞をそのマーカーによっ て選択し、桑実胚に注入した。偽妊娠マウスを受精させ、ヘテロ接合性の子孫を 、ホモ接合性のＡ−〇″マウス得られるまで交雑飼育した。

ＣＤ４　Ｔ細胞集団はＭＨＣクラスＩＩ表現の欠失によって著しい影響を受ける （この集団は、ＭＨＣクラスＩＩ分子とのつながりで”教育“され抗原を認識す る）。従って、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子産物を欠いているＡ、Ｏ１０マウスは、 天然のＭＨＣクラスＩＩ遺伝子産物の存在下では価値のない実験を行なうことを 可能にするのである。例えば、以下のことが可能となろう。Ｔリンパ球のレパー トリ−に対する正常な遺伝子の直接の影響を調べるために、該正常な遺伝子を再 導入すること・　特定の抗原（ペプチド、タンパク、細菌、ウィルス）に対する 応答を観察すること：　および自己免疫を研究することなどである。再導入する クラスＩＩ遺伝子はマウス以外の種（例えばヒト、ウシなど）由来のものとする ことができる。クラスＩＩ遺伝子の機能的分析は、天然の、あるいはインビトロ で生成させたミュータントを使って、その様な系で行なうこともできる。Ａ、Ｏ ／ＩＩマウスは、実質的にヘルパーＴ細胞を欠いているので、極度に免疫不全で あるに違いない。

事実上破壊されたＣＤ４　集団、著しく変化したＣＤ４／ＣＤＳ比、および免疫 不全はＡＩＤＳの運行症状にみられるものに似た表現型である。クラスＩＩ表現 の欠失は、著しい免疫不全がＭＨＣクラスＩＩｒＡ節因子の遺伝的欠損に起因し ているピｈ　Ｓ　ＣＩ　Ｄ患者により深く関係している。従って、Ａ、ＯｉＯマ ウス１ｊ日和見感染および心の様な免疫傷害信１−の治療行為の研究に非常に有 用であろう。

この様に、本発明のマウスは、多くの用途を持っていることが理解されよう。

このマウスは、ＭＨＣクラスＩＩと関連のある免疫系のあらゆる面の研究に、例 えば１、実験が変異ＭＨＣクラスＩＩを使って構造の影響を調べることとなる分 子の性質を調べたり、免疫応答を引き出すために構造はどの様に異なっていなけ ればならないかを確立するのに特に有用である。また、既述した様に、このマウ スは本発明の特に好ましい態様である、薬物または受動ワクチンのモデルとして 使用することもできる。

以下の実施例は、本発明を例示するものであり、いがなる意味に於いても本発明 に制限を加えるものと解釈してはならない。

実施例１ 変異Ａｓ遺伝子を含有するプラスミドの調製Ａ、　Ｎｅｏ含有Ａ、遺伝子の調製 Ａ、遺伝子を破壊するために使用した組換えＤＮＡは２段階で構築した。第１段 階はネオマイシン耐性遺伝子マーカーのＡ、構造遺伝子への挿入であった。

出発材料は、プラスミドｐＥＸＶ−３（Ｒ，Ｇｅｒｍａｉｎ博士（ＮＩＨ）より 入手）に存在する。Ａ、遺伝子の６．３ｋｂフラグメントであった。この断片の 配列は公知である（　Ｌ　ａｒｈａｍｍａｒ、　Ｄ、らのＣｅ１１３４：ｌ７９ （１９８３）参照）。第２エクソンに存在する唯一のＢｓｔＥ　Ｉ　Ｉ制限エン ドヌクレアーゼ認識配列を挿入部位として使用した（第１Ａ図）。

ネオマイシン様薬物に対する耐性を付与する遺伝子を、第２エクソン中の唯一の ＢｓｔＥ　Ｉ　Ｉ部位に導入した。

使用したネオマイシン耐性遺伝子はｐＭｃＩＮｅｏポリＡプラスミド（Ｓ　ｔｒ ａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｅ、）からの１．１．ｋｂＸｂｏｌ　／ＨｉｎｄＩ　Ｉ　 Ｉ　フラクソフトテｔｏッｔ＝。、−（７１）７ラグメントを標準的な組換ＤＮ Ａ技術によりＡｓｈ含有プラスミドのＢｓｔＥ　Ｉ　１部位に導入した。

Ｂ　工し／クトロポ１ノーノヨシプラスミドの調製次に単純ヘルペスウィルス・ チミシ〉キナー廿（トＩ　Ｓ　Ｖ　Ｔ　Ｒ，ＭｃＫｎｉｇｈｔ、上掲）遺伝〒を 修飾したＡ、遺伝子の両末端に挿入した。先づ、５ａｌＩ開裂により調製（−ま た、Ｈ５ＶＴＫ遺伝子の２コピーを持っでいる組換えプラスミドを作成し、ｐＢ 　１ｕｅｓｃｒｉｐｔの５ａｌＩ部位に凶−尾装置でりＯ）、ｊ−、、二の２つ のＨ３ＶＴＫ：）ビー間に新たな５ａｌＩ部位を作成シ、た。この部位に、Ａ、 遺伝子からのＥｃｏＲＩ−１（ｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉフラグメントを、この挿入体 を光んでいるｐＥＸＶ−３プラスミドから開裂させてりａ−〉し１、第１Ｂ図に 示すプラスミドを得た。−害遼声！？ 工し・りｉ・ロボ１．・−２・ジンおよび分化全能性胚＋！＋細ｒＢの選択、ヘ 　ニＩ／クトロボレーノヨン Ｄ３胚幹セルライン（マウス１２９株から誘導）はＲｏｌｆ　Ｋｅｍｗｉｅｒ博 士から提供を受けた（Ｇｏｓｓｌｅｒ、　Ａ　ら、Ｐ　ｒｏｃ　き１ａｔ１．、 、Ａｅａｄ、Ｓｓｉ、ＵＳ、Ａ　８３：９０６３（１，９８６）参照）、７細胞 は、１４継代の凍結ｇ！′＃品であり、１０％子牛皿清（Ｆｅ２）、００６％Ｌ ＝−グルタミン、１０００Ｕ／’ｍｌ白血病阻止因７−（■、ＩＦ″−Ａ　ＭＲ ＡＤ　Ｌｔｄ、　、］、７２７．　Ｃｏｌｔｈａｍ　Ｒｄ、　、Ｋｅｙ、Ｖｉｃ ｔｏｒｉａ　３１０１．オースト→り了から’ＥＳＧＲＯ”の商標名で入手・ｌ ｉＴ能）、および５００μｇ／踏１のゲンタマイ〜く／サルフェートを補充し、 たダルベフコの改良イルグル培地中で保持されていた、細胞は七う千二・化プレ ー！・土、】０％ＣＯ１を通した３７℃のインギュベーター由１こ置き、０２５ ％トリプノン、０．０４％Ｅ　Ｄ　Ｔ　、Ａを補充（７たバンクの平衡塩溶液を 用いｆ：トリブシシ化により継代（、た。

実施例］Ｂで作成したプラスニド（第１Ｂ図）をＮｏｔ　’Ｊで線状化しくｐＢ 　１ｕｅｓｃｒｉｐｔ　ポリリンカー中で開裂）、フェノール、／クロロホルム 抽出およびエタノ−・ル沈澱により精製した。

エレクトロボレーンヨンを行うため、１〜２Ｘ１０’のＤ３細胞を１５％ＦＣ８ 含有ＤＭＥＭ５００μｍに再懸濁し５、線状化１）ＮＡ５μｇの存在下で容量エ クステンダを備えたＢｉｏ　Ｒａｄ　Ｇｅｎｅ　Ｐｕ１ｓｅｒにより、１０００ ｖ／ｃｍおよび１２゜５μＦでノヨノクを与えた。実施列ＩＢの線状プラスミド または実施列］Ａの、：１．．１ｋｂネオマイシン耐性マーカーを含有するゲノ ムＤＮＡの５．５ｋｂ　ＥｃｏＲｌ−−Ｈｌｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉフラグメレトのい ずれかと共に細胞をエレクトロポレーションし１２時間後、培地を替え、１５０ 　μｇ／ｍ）のＧ４１８（ＧｉｂｅｏＢＲＬ、　Ｃｅｎｇｙ　−Ｐｏｎｔｏｉｓ ｅ、フランスから入手可能）および２ｕ＋Ｍのがシンクロビル（Ｂ　ｏｅｈｒｉ ｎｇｅｒ　−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、　Ｄ　−６８００Ｍａｎｈｅｉｍ、　ドイツか ら入手可能）を補充した。１６日間の選択期間中、培地は３日毎にとりかえた。

耐性コロニーをかぎとり、滅菌し、た、ひきのばしたマイクロギヤピラリ−に吸 引することにより収穫し１．４８−ウェルプ１／−ｈ上、繊維芽細胞供給細胞層 の上に移し５た。クロ・−ンを毎日モニターし、連続して２４−ウェルブレート 、次いで直径３．６−１およびｌＱｃｍのべ１・９皿に順次移した、各クローン の１部を凍結し、残りでＤＮＡを調νした。これをＥｃ。

Ｒ］で消化し、プローブ＃２（第１ＣＳＤ図）を使ってホモローガス組換えにつ いてザザンプロットで分析した。

ホモ口・〜ガス組換えが起れば、正常なｆ３　４ｋｂのパン１”が短い４．４ｋ ｂのバンドに置きかわることになる。、−の方法によって成功とみなされたＨＲ を、他のザザー・ブロワｈ（Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉ消（１１、プローブ＃］で探索）で 確認した。分析し、たｊ“７５のクローンの内、４個がＨＲに該当した。

Ａ’Ａ遺伝子で形質転換され、Ｎｅｏ挿入体を含有し７、Ｉ（ＳＶＴＫ遺伝子を 欠失ｉ。

ているクローンはＧ４１８だげで選択した。二重選択実験と比べると、約２倍の 数の耐性クローンが得られた。ザザーンプロットで分析したこの様なりローン４ ２個の内、１個がＨＲに該当した。

第１Ｅ図はＥＳ細胞中のＫＲの同定を示している。正常クローン（＋／＋）およ びＥｃｏＲＩ（プローブ＃２）およびＢｇｌＩＩ（プローブ＃］）による浄化に よるホモローガス組換えの、へ〇ｊ遺伝子（＋１０）の例が示されている。説明 は第１ＣおよびＤ図のものと同じである。

実施列３ 生成した種々のクローンの中から、クローン＃１３８を選択して次の実験を行っ た。クローン＃１３８を含んでいるＥＳセルラインは、ブタベスト条約の規定に 従い、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　（ＰｏｒｔｏｎＤｏｗｎ、　５ａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉ ｌｔｓｈｉｒｅ　Ｓ　Ｐ　４０　Ｊ　Ｇ、イギリス国）に、Ｄ３／Ａ０ａ／１３ ８の名称で寄託され、１９９１年１月９日、受託番号９１０１０９０８号を与え られた。

全ての操作はＥ、Ｊ、　Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎの記載に従って行った（Ｒｏｂｅｒ ｔｓｏｎ、Ｅ、Ｊ、　。

Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏａ＋ａｓ　ａｎｄ　Ｅｍｂｒｉｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ 　Ｃｅ１ｌｓ　：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｅ、Ｊ、　Ｒ ｏｂｅｒｔｓｏｎ編、Ｉ　ＲＬ　Ｐ　ｒｅｓｓ　Ｌ　１ｎｉｔｅｄ、　Ｂ　ｒｉ ｔｉｓｈ　Ｌ　ｉｂｒａｒｙＣａｔａｌｏｇｕｉｎｇ　ｉｎ　Ｐｕｂｌｉｃａｔ ｉｏｎ　Ｄａｔａ　（１９８７））。基本的に、胚盤胞は妊娠３．５日目の過排 卵Ｃ５７Ｂ１／６雌性マウスから得た。成熟胚盤胞は、ミクロキャピラリーに集 め、新しいペトリ皿に移した。桑実胚を集め、３７℃で４時間培養し、胚盤胞を 形成させた。８〜１２ＥＳ細胞（クローン％１３８）を成熟胚盤胞の胞胚腔に注 入した。注入に成功した胚盤胞を３時間培養しく３７℃、５％Ｃｏ２）、再移植 の前の膜修理を行わせた。

Ｂ、トランスジェニックマウス 胚盤胞を、偽妊娠Ｃ５７Ｂ１／６ｘＳＪＬ雌性マウスの子宮に外科的に再移植し た。キメラ子孫を毛皮の色で評価した（黒色のＣ５７Ｂ１／６の毛の上に、１２ ９−由来テンジクネズミの毛がしま状にある）。

キメラ雄マウスとＣ５７Ｂ１／６雌マウスを交雑させ、その子孫を、毛皮の色に 基づき、胚幹細胞遺伝子型の生殖細胞系列への移行について評価した（テンソク ネズミの毛皮の色が生殖細胞系列への移行を示す）。

Ａｚ遺伝子のテンジクネズミ子孫への移行は、プローブ２とハイブリダイズした 尾部バイオプシーから単離したＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡのサザーンプロット分析に より確認した（第１Ｃ，Ｄ図）。ヘテロ接合性の子孫どうしをかけあわせ、Ａ、 。′。

ホモ接合性マウスを生産した。

第１Ｆ図は、Ａ０１特性のメンデル遺伝を示している。もとのキメラマウスがら の子孫である２匹のＡβ゛′。動物をつかわせた。その子孫からの尾部ＤＮＡを サザーンプロットで分析すると、野性型（＋）または変異（０）Ａ＃遺伝子の分 離を示した。

ホモ接合性Ａ、Ｏ／Ｑ動物は非機能性ん遺伝子を両染色体上に持っている。これ を証明するため、リンパ系器官でのＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の発現についてマウ スを試験した。

Ａ、細胞蛍光分析 数種の抗−クラスＩＩモノクローナル抗体を用いて、膵臓およびリンパ腺がらの ８９２３球について細胞蛍光分析を行った（例えばＢＰ１０７．２．２、ＡＴＣ Ｃ寄託番号Ｔ　Ｉ　Ｂ　１５４ＸＬａｎｄａｉｓ、　Ｄら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ 、１３７：３００２（１９８６）参照）。結果を第２図に示す。第２図に示され ている例ではっきりとゎがる様に、Ａ、ｏ′ｏマウスの細胞表面には、検出可能 なＡ、タンパクは存在しない。

Ｂ　免疫蛍光分析 ん０′。およびコントロールマウスのリンパ系器官（胸腺、膵臓、リンパ腺）の クリオスタット切片の免疫蛍光分析によりクラスＴＩ表現を調べた。コントロー ルマウスの胸腺では八−複合体染色が容易に検出できたが、Ａ、マウスの胸腺で は蛍光が観察されなかった。結果を第３図に示す。

Ａ、Ｏｌｏ　（Ａ）、またはＡＪ”’（Ｂ）マウスの胸腺のクリオスタット切片 は、へ〇鎖に特異的なＦＩＴＣ−結合モツクローナル抗体で染色された。スライ ドを蛍光顕微鏡検査で肉眼観察した。正常なマウスの胸腺髄質（ｍ）には強いＭ ＨＣクラスＩＩ染色が観察され、皮質（Ｃ）には僅かな染色がみられた。Ａ　、 　０　／６マウスの切片には染色は観察されなかった。

実施例５ ＣＤ４　Ｔ細胞集団が影響を受けたか否かを調べるために、正常マウスおよびＡ Ｎ”’マウスの両者に蛍光−活性化細胞検索分析を行った。

２Ｘ１０’リンパ腺細胞をＦＩＴＣ−結合抗−ＣＤ８およびフィコエリトリノー 結合抗−ＣＤ４で染色した。染色した細胞をＡＴＣ３０００細胞蛍光分析計で分 析した（第４図）。

ｊｆ！４Ａ図は正常な同腹子のプロフィルを示す。ＣＤ４　およびＣＤ８　集団 の強い染色の予期したパターンが観察された。

第４Ｂ図はＡ、０１０マウスのプロフィルを示す。ＣＤ４　細胞がほとんど存在 しないことがわかる。

予期した様に、コントロールマウスのリンパ腺には、ＣＤ４　Ｔ細胞が主要な亜 集団を形成していた（第４Ａ図）。これに対し、ＡＮ”’動物とは、この亜集団 はほとんど存在しなかった（比較的に言うと、ＣＤ４　の存在には９８％の減少 がみられた）。ＣＤ４対ＣＤＳ比は、通常的２であるが、０．０５に減少した。

ＥＳ　細胞　マウス 細胞数 細胞数 だ ＣＤ４→ ＣＤ４　。

国際調査報告 フロントページの続き （７２）発明者　ベノワーズ、クリストフフランス国６７１５０ウルスタン、リ ュ・ドウ・レテユプ９番 （７２）発明者　マチス、ディアン フランス国６７１５０ウルスタン、リュ・ドウ・レテユプ９番 （７２）発明者　コスグローブ、ドミニツクアメリカ合衆国６８１０５ネブラス カ州、オマハ、ジョーンズ・ストリート３６１旙

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．主要組繊適合クラスＩＩＡ複合体の正常な表現を欠失しているマウス。
2. ２．請求項１に記載の欠失は示さないが該欠失についてヘテロ接合性であるマウ ス。
3. ３．主要組織適合クラスＩＩＡ複合体の表現についてヘテロ接合性、ホモ接合性 またはキメラ性であるセルライン。
4. ４．セルラインが多分化能性セルラインである請求項３のセルライン。
5. ５．セルラインが分化全能性セルラインである請求項３のセルライン。
6. ６．正常なＭＨＣクラスＩＩ遺伝子発現を示すセルライン（ａ）と抗原をインキ ュベートし、 ＭＨＣクラスＩＩアレルの１またはそれ以上の正常な表現を欠失しているセルラ イン（ｂ）と抗原をインキュベートし、（ａ）と結合した抗原量に対する（ｂ） と結合した抗原量を測定する、 工程からなる、抗原と結合したＭＨＣクラスＩＩタンパクを同定する方法。