JPH06506604A

JPH06506604A - 自在なドナー細胞

Info

Publication number: JPH06506604A
Application number: JP5502933A
Authority: JP
Inventors: サイムズ，ピーター　ジェイ．; ボスウェル，アルフレッド　エル．エム．; エリオット，アイリーン　エイ．; フラベル，リチャード　エイ．; マドリ，ジョーゼフ; ロリンズ，スコット; ベル，レオナード; スキント，スティーブン
Original assignee: オクラホマメディカルリサーチファウンデーション; エールユニバーシティ
Priority date: 1991-07-15
Filing date: 1992-07-14
Publication date: 1994-07-28
Also published as: EP0591462B1; EP1041142A3; CA2113089A1; EP1041142A2; DE69233010T2; WO1993002188A1; EP0591462A1; ATE237682T1; CA2113089C; DE69233010D1; JPH1057054A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】８、補体を介する攻撃を阻害する前記タンｉ＜り質が、ＣＤ５９、ＣＤ４６、およびＣＤ５５からなる群から選択される、請求項４または５に記載の細胞。

９、内皮細胞、線維芽細胞、上皮細胞、骨格筋細胞、心筋細胞および平滑筋細胞、肝細胞、膵島細胞、骨髄細胞、星状細胞、ならびにンコウ′アン細胞からなる群から選択される、請求項１．２．３．４または５に記載の細胞。

１０、請求項４に記載の細胞であって、該細胞がヒト以外の起源由来であり、補体を阻害する前記タンパク質がヒトタンパク質であり、そして前記ＭＨＣクラス ■遺伝子群がＩ（ＬＡ　ＤＰ、　ＤＲｌ　およびＤＱと等価である前記細胞種からなる群から選択される、細胞。

１１、請求項６に記載の細胞であって、該細胞がヒト以外の起源由来であり、補体を阻害する前記タンパク質がヒトタンパク質であり、そして前記ＭＨＣクラスＩ遺伝子群がＨＬＡ　Ａ、　Ｂ。

およびＣと等価である前記細胞種からなる群から選択される、細胞。

１２、請求項１．２．３．４、または５に記載の細胞を有するヒト以外のトランスジェニック動物。

１３、ヒト以外のトランスジェニック動物由来の器官であって、請求項１．２．３．４．５．１２または２６に記載の細胞から形成される、器官。

１４、請求項１．　３または４に記載の細胞であって、クラスｎ　ＭＨＣ遺伝子群のインバリアント鎖遺伝子の分裂の結果としてクラスｎ　ＭＨＣタンパク質が発現しない、細胞。

１５、請求項２．３、または５に記載の細胞であって、β２−ミクログロブリン遺伝子の分裂の結果としてクラスＩ　ＭＨＣタンパク質が発現しない、細胞。

１６、請求項１．２．３．４．５．１２．１９．２１．２２．２４．２５または２６に記載の細胞であって、該細胞で発現し、そして選択された化合物の存在下で細胞死を引き起こすタンパク質をコードする、ヌクレオチド分子をさらに含有する、細胞。

１７、前記遺伝分子が細菌のシトシンデアミナーゼを特徴とする請求項１６に記載の細胞。

１８、前記細胞が、ヒト、つ／およびブタ起源の細胞からなる群から選択される、請求項１．２．３．４．５．１９．２１．２２．２４または２５に記載の細胞。

１９、動物またはヒトへの移植用の人工器官であって、別の種の動物または別の個体へ導入されたときに、操作された細胞に対して補体を介する攻撃に対する抵抗性があるか、または、１９７８球を介する攻撃を誘引しない細胞を有する、人工器官。

２０、前記人工器官が血管移植片である、請求項１９に記載の人工器官。

２１、表皮剥脱された血管を再内皮化する方法であって、別の種の動物または別の個体へ導入されたときに、操作された細胞に対して補体を介する攻撃に対する抵抗性があるか、または、１９７２球を介する攻撃を誘引しない、遺伝学的に操作された内皮細胞を、該血管に適用する工程を包含する、方法。

２２、別の種の動物または別の個体へ導入されたときに、操作された細胞に対して補体を介する攻撃に対する抵抗性であるか、または、１９７２球を介する攻撃を誘引しない、遺伝学的に操作された細胞であって、治療剤をコードし、該細胞で発現しそして分泌するヌクレオチド分子をさらに含有し、そして該細胞で、該分子を正常に発現しないか、同じプロモーターから該分子を発現しないか、または複遺伝子座から該分子を発現する、細胞。

２３、前記細胞が微小血管内皮細胞である、請求項２２に記載の細胞。

２４、ヒトまたは動物への治療剤の送達方法であって、遺伝学的に操作された細胞をヒトまたは動物に投与する工程を包含し、別の種の動物または別の個体へ導入されたときに、該操作された細胞に対して補体を介する攻撃に対する抵抗性があるか、または、１９７２球を介する攻撃を誘引せず、そして該細胞が、治療剤をコードし、該細胞で発現しそして分泌するヌクレオチド分子をさらに含有し、そして該細胞で、該分子を正常に発現しないか、同じプロモーターから該分子を発現しないか、または複遺伝子座から該分子を発現する、方法。

２５、ヒトまたは動物への移植用の遺伝学的に操作された哺乳動物細胞であって、該細胞で発現し、そして別の種の動物または別の個体へ導入されたときに、操作された該細胞に対して補体を介する攻撃を阻害するタンパク質であって、ＣＤ５９．ＣＤ５５およびＣＤ４６からなる群から選択されるタンパク質をコードする、ヌクレオチド分子を含有する、細胞。

２６、細胞あたり１０３より多いかまたは等しいＣＤ５９分子、あるいは、原形質膜表面のｌμ１２あたり１分子より多いかまたは等しいＣＤ５９抗原を、その表面上に有する、請求項２５に記載の細胞。

２７、内皮細胞、線維芽細胞、上皮細胞、骨格筋細胞、心筋細胞および平滑筋細胞、肝細胞、膵島細胞、骨髄細胞、星状細胞、ならびにシニヴアン細胞からなる群から選択される、請求項２６に記載の細胞。

２８、造血始原細胞、造血始原細胞後代、および成熟血液細胞からなる群から選択される、請求項２７に記載の細胞。

２９、ヒト以外のトランスジェニック動物であって、別の種の動物または別の個体へ導入されたときに、該トランスジェニック動物由来の細胞に対して補体を介する攻撃を阻害するタンパク質をコードするヌクレオチド分子を発現する、トランスジェニック動物。

３０、　請求項２７に記載の哺乳動物細胞であ、って、前記遺伝子配列が本質的にＣＴＧＣＡＧＴＧＣＴＡＣＡＡＣｒＧＴＣＣｒＡＡＣＣＣＡＡＣＴＧＣｒＧＡＣＴＧＣＡＡＡＡＡＧＴＴＣＴｒＣＴＧＣＴＧＧＴＧＡＣＴＣＣＡｍＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＣσ［ＴＣＡＴＣＣＣＴＡＡＧＴＣからなる、細胞。

３１、請求項２７に記載の哺乳動物細胞であって、前記タンパク質配列が、本質的にＬＱＣＹＮＣＰＮＰＴＡＤＣＫＴ人ＶＮＣ５ＳＤＦＤＡＣＬＩＴＫＡＧＬＱＶＹＮＫＣＷＫＦＥＨＣＮＦＮＤＶＴＴＲＬＲＥＮＥＬＴＹＹＣＣＫＫＤＬＣＮＦＮＥＱＬＥＮＧＧＴＳＬＳＥＫＴＶＬＬＬＶＴＰＦＬＡＡＡＷＳＬＨＰからなる、細胞。

３２、血小板および内皮細胞の補体タンパク質による活性化および細胞溶解の抑制方法であって、阻害される該補体タンパク質と同じ起源である、ＣＤ５９をコードする遺伝子を含有するベクターを、提供する工程、該遺伝子の発現に適切な宿主細胞系に、該ベクターを挿入該遺伝子が発現する条件下で、該細胞を培養する工程、および活性化または溶解から防御される該細胞と共に発現した該タンパク質を提供する工程を包含する、方法。

３３、請求項３２に記載の方法であって、前記細胞が哺乳動物細胞であり、そして前記ベクター配列が防御される該哺乳動物細胞の表面上での前記遺伝子の発現を起こす、方法。

３４、請求項３２に記載の方法であって、前記細胞が非補乳動物細胞であり、非哺乳動物タンパク質から発現した前記タンパク質を分離する工程、および、防御される該細胞と共に発現した該タンパク質を提供する工程をさらに包含する、方法。

３５　請求項３２に記載の方法であって、前記細胞が、ＣＦＵ−５、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ、およびＣＦＵ−Ｌのような造血始原細胞、ＢＦＵ−Ｂ、　ＢＦＵ−Ｍに、およびＣＦＵ−ＧＭのような造血始原細胞後代、ならびに赤血球、血小板、単球、顆粒球、およびリン、＜球を包含する成熟血液細胞からなる群から選択される細胞であり、被検体に該細胞を注入または移植する前に、前記ベクターを該細胞に導入する工程をさらに包含する、方法。

３６、前記細胞が、細胞あたり１０３より多（Ｘかまたは等しＬＮＣＤ５９分子、あるいは、原形質膜表面の１μｍ２あたり１分子より多いかまたは等しいＣＤ５９抗原を、その表面上に有する、請求項３３に記載の方法。

３７、　ＣＤ４６およびＣＤ５５からなる群から選択される分子を提供する工程をさらに包含する、請求項３２に記載の方法。

３８、前記ＣＤ４６またはＣＤ５５分子をコードする遺伝子を前君己細胞内に導入し、そして該分子を該細胞の表面上で発現させる、請求項３７に記載の方法。

３９、前記ＣＤ４６またはＣＤ５５分子が溶液内に存在する、請求項３７に記載の方法。

明ｗｉｔ自在なドナー細胞米国政府が、国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　Ｍａｒｙｌａｎｄにより与えられた承認番号第　、および　に基づき本発明の権利を有する。

背景技術本発明は、遺伝学的に操作された内皮細胞、特に、非自己の宿主中へ導入されたときに、補体による溶解を阻害し、異質の細胞を排除する宿主の免疫機構を回避するように改変された内皮細胞に関する。

内皮細胞は、心臓および血管の内層を形成する特殊化した細胞である。それらは循環する血液と直接接触するため、上記細胞を遺伝学的に操作し、そしてそれらを「インビボ」のドラッグデリバリ−／ステムとして使用するための、多数の提案が、例えばＣｕ１ｌｉｔｏｎ、　Ｂ、　Ｊ、１９８９　ｒドラッグデリバリ− のために設計する細胞Ｊ　５ｃｉｅｎｃｅ　２４６：７４６−７５１；およびｚｖｉｅｂｅｌら、「レトロウィルスベクターによりウサギの内皮細胞中に導入された組み換え遺伝子の高発現Ｊ　５ｃｉｅｎｃｅ　２４３：２２０−２２２（ヒトアデノノンデアミナーゼ遺伝子およびラット成長ホルモン遺伝子のレトロウィルスのベクターを使用する大動脈内皮稲ｎ「ゝＶ〕払ワ一　Ｃよリロ収皿酪ヶ個ハエへの慢性波りしりような細胞からのうｙ）成長ホルモンの分泌の証明）によりなされている。

天然の内皮細胞は、正常な生理に重要な役割を演する。特に、これらの細胞は血液と血管壁との間のインターフェイスおよび体の器官を構成する。このように、内皮細胞は種々の天然の産生物を直接に血流中に分泌し、血管内層の抗血栓性の表面を維持し、白血球が血管壁を透過するのを制限し、平滑筋細胞の種々の生物学的特性を調節し、そして血管壁の緊張をコントロールすることに関与する。それゆえ、内皮細胞の欠損はこれらの正常な生理的過程の欠損を引き起こし、そして結局、冠動脈疾患、臓器移植拒絶および血管炎のような病理学的状態に至る。

したがって、治療上のインビボでの実施のための媒体としてのそれらの使用に加えて、疾病または手術のために失われた天然の内皮細胞に置換する遺伝学的に操作された内皮細胞を供給する必要がある。

過去において、治療の実施または細胞置換のための内皮細胞の使用の提案および／または試みは、一般に、自己の細胞すなわち処置中の生物由来の細胞に限られてきた。被検体は免疫抑制されなければならず、それは費用が高く、被検体を感染しやすい状態に放置することになる。

このアプローチは多数の問題を被った。例えば、処置される個体から十分な量の健常な内皮細胞を採取することは難しい。実行するための手順としては、血管系のセグメントを取り出し、そして血管の壁から内皮細胞を掻き取るまたはさもなければ取り外すことを、必要とする。結果的に、治療の実施または細胞の置換のために膏用であるためには、多数の自己由来の内皮細胞が培地中で増殖されなければならない。実際の使用、特に細胞の置換の場合には、この培養は迅速に行わなければならない。残念ながら、内皮細胞の細胞倍加時間は少なくとも２４〜４８時間のオーダーであり、遺伝子操作または細胞の置換が可能となるに十分な量の内皮細胞が得られるまでに、−週間あるいはそれより多いオーダーの時間がかかる。加えて、正常な生理的条件下では、インビボでの天然の内皮細胞の細胞倍加時間はさらに延長され、内皮細胞の欠損または損傷に引き続き、インビボで天然に存在する細胞の置換の効率が極めて悪くなる。

異質の細胞を宿主中に移植すると、その細胞を破壊し、そしてそれにより宿主を防御するために、宿主の免疫システムが急速に稼働する。異質の細胞に対する免疫システムの攻撃は、移植拒絶と呼ばれる。生物の防御の第１線は、宿主の補体システムの活性化の結果起こるドナー内皮細胞の溶解性破壊、または、前凝血および前血栓特性の活性化であり、一般的に「超急性拒絶反応」または単に「超急性反応」として知られている。

異種の（異なる種由来の）およびアロタイプの（同種の異個体由来の）器官の移植に対する超急性反応は、例えばＰｌａｔｔら、１９９０　ｒ一致しない異種移植片の移植二進付状況のレビュー」Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　Ｔｏｄａ　１１：４５０ −４５６に議論されているように、ドナー内皮の表面での補体システムの抗体依存性の活性化を介することを、い（っかの研究は示している。すなわち、上記補体システムは、移植された器官の血管の内側の内皮細胞を攻撃する。

上記補体システムは、宿主生物の他の免疫システムと同時に、多段階の多タンパク質のカスケード連鎖（ｃａｓｃａｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）に作用する血漿タンパク質と膜補助因子との複雑な相互作用である。古典的補体活性化経路は、第１に抗体の標的細胞上の抗原部位に対する認識と結合とを包含する。この表面に結合した抗体は、引き続き最初の補体成分であるＣＩＱと反応し、Ｃａ２＋、Ｃ１ｒ　％　およびＣ１ｓとタンパク分解活性の０１−抗体複合体を形成する。Ｃ１ｓは、Ｃ２とＣ４を活性成分Ｃ２ａとＣ４ａに分裂させる。Ｃ４ｂ、　２ａ複合体はｃ３変換酵素と呼ばれる活性プロテアーゼで、Ｃ３ニ作用しＣ３ａとＣ３Ｍ、：分裂させる。Ｃ３ｂは、Ｃ４ｂ、　２ａと複合体を形成し、Ｃ５をＣ５ａとＣ５ｂに分裂させるＣ４ｂ、　２ａ、　３ｂを生成する。

Ｃ５ｂはＣ６と複合体を形成し、そしてこの複合体は液相中でＣ７と相互作用し、それによって細胞膜中のＣａｂ、　６．７の３成分複合体を安定化させるＣ５ｂおよびＣ６中の疎水性のドメインが露出する。

そこで、液相中のＣ８はＣ５ｂ、　６．７の３成分複合体に結合し、この複合体は機能膜の損傷の進展に寄与し、細胞溶解を遅延し得る。Ｃ９がｃｓｂ−ａ膜複合体中の０８に結合すると、異質の細胞の溶解が急激に加速する。

１９８９年６月１２日に出願され、許可され、Ｏｋｌａｈｏｍａ　ＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｊｏｎに譲渡された係属中の米国特許出願第０７／３６５．１９９号公報は、その細胞と共に溶液中に供給される時または遺伝学的に操作された細胞中で発現する時に、例えばブタの内皮細胞のようなヒト以外の内皮細胞をヒト補体による攻撃から防御するために、ヒトの補体調節タンパク’ＪｔＣＤ５９が使用され得ることを開示する。Ｚｈａｏら、１９９１　ｒヒト補体の複合体を攻撃する膜に対する防御を与えるＣＤ５９−導入チャイニーズハムスター細胞の増幅された遺伝子発現ＪＪ、Ｂお山−止邸Ｌ　２６６：１３４１８−１３４２２もマタ参照せよ。ＣＤ５９１７）相同補体の阻害活性は、Ｒｏｌｌｉｎｓおよび５１ｍ５．１９９０　ｒＣ５ｂ−９１ＤＩへの０９の結合を阻止する能力に帰するＣＤ５９の補体阻害活性Ｊ　、Ｌ−暉す１１１−１４４３４７８−３４８３にさらに報告されているように、最終の補体成分のＣ８およびＣ９との種特異的な相互作用に帰する。

ＣＤ５９の使用は、補体の攻撃の結果である超急性拒絶の問題をうまく取り扱っているが、それは異質の内皮細胞に対する宿主生物の免疫攻撃全般に対してその細胞を防御しない。

免疫応答を刺激することで、抗原は多（の分子および細胞の変化を誘引する。白血球は抗原が異質であると認識し、存在する抗原に対して細胞および体液の両方の反応を開始する原因となる。Ｂ　ＩＪンバ球細胞は存在する抗原に対して抗体を産生ずることにより抗原と反応し、１９２８球細胞は存在する抗原に対して細胞応答を開始することにより反応する。Ｔ細胞の２つの主要なサブセットは、Ｂ細胞に提供するために抗原を処理することに関与し、ＣＤ４と呼ばれる細胞表面の糖タンパク質の存在により特徴づけられるＴＨ細胞、および、細胞表面上の抗原の認識および異質と認められた細胞の溶解に関与し、ＣＤ８と呼ばれる細胞表面の糖タンパク質の存在により特徴づけられる細胞溶解性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｌｙｔｆｃ　Ｔ　ｌｙ＋＊ｐｈｏｃｙｔｅｓ）　（ＣＴＬｓ）である。Ｔ細胞は主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨｃ）の細胞表面の糖タンパク質の２つの主要なりラスのうちの１つくクラスＩ　（ＭＨＣ−１）またはクラスＩＩ　（Ｍ）Ｉｃ −１１）タンパク質のいずれか）と結合するペプチドフラグメントを認識する：　ＣＤ８＋Ｔ細胞はＭＩ’ＩＣ−１と共に抗原を認識する一方、ＣＤ４＋Ｔ細胞はＭＨＣ−■と共に抗原を認識する。

ＭＢＣは、３つの主要な遺伝子のクラスを包含する。クラスＩ遺伝子群は、ヒトではヒト白血球抗原と呼ばれるＭＭＣ−Ｉ　Ｎタンパク質の主サブユニットをコードし、主要なものはＢＬＡ−Ａ。

Ｂ１　およびＣである。これらは、実質上すべての細胞に存在し、同種移植片を拒絶する主要な役割を演じる。それらは、ウィルスに感染された細胞上にウィルス性の抗原のペプチドフラグメントとの複合体を形成する：　ＣＤ８÷ＣＴＬｓによりその複合体が認識されると、結果的にウィルスに感染された細胞は破壊される。複合体の認識は、ＭＨＯと共に抗原を認識するＴ細胞上の単一のレセプターによる。

クラス■遺伝子群は、ＤＰ、　ＤＱ（サブクラスβ２、Ｃ２、およびβ１α１）およびＤＲ（サブクラスβ１、β２、β３、およびα工）として知られるヒトにおける主要なりラスであるが、抗原提示細胞、主にＢ細胞、マクロファージおよび樹枝状細胞により発現される細胞表面の糖タンパク質をコード化する。抗原のペプチドフラグメントと共に、クラス■のタンパク質はヘルパーＴ細胞により認識されるエピトープ（ＣＤ４つを形成する。クラス■遺伝子群は、細胞を破壊する広範な免疫反応に関与する補体カスケード（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　ｃａｓｃａｄｅ）の少な（とも３つのタンパク質、ならびに組織壊死因子およびリンホトキシンの２つの細胞障害性タンパク質をコードする。

Ｔ細胞を介する免疫反応は３つの連続的な活性化ステ・ノブで組織され得る。第１に、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球（Ｔ細胞）は、非自己のＭＨＣクラス ■およびクラスＩのタン／イタ質の存在を、異質の細胞表面上でそれぞれ認識する。

第２に、Ｔ細胞は、リガンドがＴ細胞レセプターおよび他の補助的な刺激性分子と相互作用をすることにより活性化され、そのため活性化は、細胞表面のタン、ｆり質レセプターにより受容されるサイトカインのような液性シグナルを包含する種々の可変物に依存する。最も大切なことは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上での、リガンド、ＭＨＣの複合体および抗原性ペプチドと抗原特異的Ｔ細胞レセプターとの相互作用である。Ｔ細胞上に存在する他のレセプターもまた、活性化を確実にするため、ＡＰＣ上のそれらのリガンドにより接触されなければならない。

一旦活性化されると、Ｔ細胞はインターロイキン２（！Ｌ−２）および他のサイトカイン類を合成し分泌する。

例えばＰｏｂｅｒら、１９９０　ｒ免疫反応での血管内皮細胞の潜在的な役割Ｊ　Ｈｕｍａｎ　１ｍｍｕｎｏ１．　２８：２５８−４６２にリビューされるように、活性化されたＴ細胞により分泌されたサイトカイン類は、共に細胞溶解を引き起こすリンパ球、単球、および他の白血球の補給および活性化に関与する免疫応答がされるの第３段階の、すなわちエフェクターを導く。

歴史的に、Ｔ細胞の免疫応答を阻害する試みは、一般的に限定的な成功しか納めていない。例えば、Ｔ細胞と異質の細胞が付着するのを阻害するために、抗体および遮断タンパク質を含有する種々のタイプの試薬を使用するいくつかの戦略が試みられた。Ｌｉｄｅｒら、１９８８　ｒ実験的自己免疫脳を髄炎に対するＴ細胞ワクチン接種により引き起こされる抗イデイオタイプ性ネットワークＪ　叙」１岨２３９　：１８１は、Ｔ細胞ワクチンの使用について報告しＨＱｙｈａｓｈｉａｎｄら、１９８８　ｒミニリン基礎タンパク質（ｍｙｅｌｉｎ　ｂａｓｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ）に特異的なラットＴ細胞レセプターに割り当てられたイディオタイプに対するモノクローナル抗体により与えられるアレルギー性脳を髄炎からの防御」ムーｂ１−１抑−１６８：２１５３は、Ｔ細胞レセプター遮断抗体の使用について報告し；　Ｂｒｏｓｔｏｆｆａｎｄら、１９８４　ｒ実験的アレルギー性脳を髄炎：インビボでヘルパーＴ細胞を認識するモノクローナル抗体を用いる効果的処置Ｊ　Ｊ、１ｍｍｕｎｏ１．１３３：１９３Ｂは、ＣＤ４に対する抗体の使用について報告し：そしてＡｄｏｒ　ｉｎ　ｉら、１９ｇ＋１ｒＴ細胞ハイブリドーマの生物学的な応答からの加水分解およびＣａ２＋フラツクス（Ｃａ２＋　ｆｌｕｘｅｓ）の解離」■…■３３４：６２３−６２８は、Ｔ細胞レセプターを占有する遮断ペプチドの使用について報告した。これらの戦略は、一般的に、所望するＴ細胞結合の阻害よりも、試薬に対する免疫応答を引き起こした。

移植細胞に対するＴ細胞を介する反応、確率を、補体を介する攻撃および細胞の溶解と同様に減少し得るならば、明らかに有効である。

それゆえ、異質の宿主中に移植された場合、補体および細胞の攻撃の両方に対して抵抗性の内皮細胞を構築するための改良された方法および組成物を提供することが、本発明の目的である。

本発明のさらなる目的は、異質の宿主細胞中に移植された場合異質であるとして認識されず、そのため免疫システムによる攻撃を回避する遺伝学的に操作された細胞を提供することである。

本発明のなおさらなる目的は、移植後に補体を介する攻撃に抵抗し、そしてリンパ球、特にＣＤ４＋Ｔリンパ球、そして好適にはＣＤ８＋　７９７８球を介する溶解を回避し得る遺伝学的に操作された細胞を提供することである。

本発明のもう１つの目的は、このような遺伝学的操作で作られた細胞を宿主中での存在がもはや望ましくなくなった場合に、選択的に死滅させるためのメカニズムを提供することである。

本発明のさらにもう１つの目的は、治療用産生物の送達のための生物学的な媒体を提供することである。

発明の要旨細胞で発現する、そして通常は細胞中で発現しない補体阻害活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有する遺伝学的に操作された細胞が提供される。これらの細胞は、細胞表面上でヒト細胞中の、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラス■遺伝子群、）ＩＬＡ　ＤＰ、　ＤＱおよびＤＲ遺伝子群、または異なる種の細胞中のこれらに匹敵するものによりコードされる機能タンパク質を発現しないようにも操作され得る。一方、遺伝学的に操作された細胞は、細胞表面上で、ヒト細胞中の、ＭＨＣクラス■遺伝子群、ＩＩＬＡ　Ａ％ＢおよびＣ遺伝子群、または異なる種の細胞中のそれらに匹敵するものによりコードされるタンパク質を発現しないか、あるいはクラス！およびクラス■のＭＨＣ遺伝子群のどちらをも発現しない。いくつかの実施例では、細胞で発現し、そして選択された試薬の存在下で細胞死を引き起こすタンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）配列を、上記細胞は含有する。

補体調節活性を有するタンパク質をコードする遺伝子配列は、補体システムの活性化の結果起こる攻撃と溶解による、超急性拒絶から、上記細胞を防御する。ＭＨＣクラスＩ（例えば、ＨＬＡ　Ａ、　ＢおよびＣ）ならびにクラス■（例えば、ＨＬＡ　ＤＰ、　ＤＱ、およびＤＲ）遺伝子群でコードされる細胞表面タンパク質の除去は、上記細胞がそれぞれ宿主のＣＤ８＋のおよびＣＤ４÷Ｔリンパ球による、実質的な認識をしないようにする。細胞死を引き起こすタンパク賃をコードする遺伝子配列は、宿主から遺伝学的操作で作られた細胞を、その存在がもはや望ましくない場合に、排除するメカニズムを提供する。

その細胞は、標準的なインビトロのトランスフエクンツン技術を使用して培地中で改変されるか、あるいは胚として改変されたトランスジェニック動物から得られ得る。これらの改変された細胞は、宿主に治療剤を投与するための自在な（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）ドナー細胞として、あるいは、損傷しまたは欠損した天然の細胞の代わりとして働き得る。最も好適な実施態様では、上記細胞は離された内皮細胞である。

図の簡単な説明図１は、ヒトＣＤ５９　ｃＤＮＡを含有するプラスミドでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞中でのＣＤ５９抗原の誘導のグラフで、メトトレキセート（μｇ／ｌ）に対する”Ｉ−ＩＦＩ結合（ＣＤ５９分子／細胞Ｘ　１０−’）を示す。チャイニーズノ・ムスターの卵巣細胞を、ｐＦＲＳＶベクターおよびヒトＣＤ５９のｃＤＮＡを含有するプラスミドで、トランスフェクトした。サブクローニングおよび選別の後、メトトレキセートを含有する培地中に上記細胞を保持し、表面の抗原を、モノクローナル抗体１２’Ｉ−ＩＦＩ（１０μｇ／ｌ）のＣＤ５９に対する特異的結合により測定した。すべてのデータを、メトトレキセートの非存在下で増殖されたコントロール（トランスフェクトされていない）ＣＨＯ細胞（原株）１こつ（１て測定された非特異的結合により補正した。データは、異なる日にされた３つの測定の平均上標準誤差を表す。

図２は、ホスファチジルイノシトールに特異的なホスホリパーゼＣ（ＰＩＰＬＣ）による細胞表面のＣＤ５９の除去のグラフで、平均蛍光強度に対する細胞数をプロットしている。１讃ｇ／ｍｌのメトトレキセート中での増殖で増幅され、ＣＤ５９でトランスフェクトされたＣｌｌ０細胞を、ＨＢＳＳ中に２　Ｘ　１０６／ｍｌに懸濁し、モしてＯ（、、、、）または１（−−−’）ユニット／讃ｌのホスファチジルイノシトールに特異的なホスホリパーゼＣと共に、３７℃で１時間インキュベートした。そして、細胞表面のＣＤ５９は、モノクローナル抗体ＩＦＩ（１０μｇ／ｌ）を使用するフローサイトメトリーにより測定され、そしてそれはＦＩＴＣ抗マウスＩｇＧ（６７μｇ／ｍｌ）により検出された。ヒストグラムは、細胞当りの平均蛍光強度を対数スケールで表す。ＩＦｌの非存在下で測定されたノく・ツクグラウンドの細胞蛍光強度も示す（−−−）。

図３は、ヒト血清補体から、ＣＤ５９でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の防御を示すグラフで、ヒト血清（％）に対する色素の放出率（％）を示す。ＣＤ５９でトランスフェクトされたＣＩＯ細胞は、メトトレキセート含有培地中での成長により、種々の量のＣＤ５９抗体；発現したＣＤ５９分子／細胞Ｘ　１０−’ 　：　０．０（黒丸）、１゜９（白丸）、２．８（黒ひし形）、６，８（白三角形）、７．２（黒目角形）、１３．０（白画角形）、および３１．３（黒ひし形）の発現を誘引した。

図４は、実施例２で使用されるレトロライスベクターの構造を示す。このベクターは、欠損モロニーネズミ白血病ウィルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ　ｍｕｒｉｎｅ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｖｉｒｕｓ）力１ら構築された０ＳＶ４０プロモーターは切除され、５Ｒａｌｐｈａプロモーターで１ｍされた。ＣＤ５９のコーディング配列を含有する５００ｂｐのｃＤＮＡフラグメントが、Ｘｈｏｌ中にクローニングされ、そして制限分析により確認された。結果生成したプラスミドは、ｐＲＮＳＲ αＣＤ５９と命名された。外生レトロウィルス（ｅｅｏｔｒｏｐｉｃ　ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）は、Ｐｓｉ−２細胞をポリブレンと共にトランスフェクトする工程、および毒性アミノグリコンドＧ４１８中で選別する工程により生産された。

両種性ウィルス（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ　ｖｉｒｕｓ）の株は、外生ウィルスを両種性パンケージング細胞系（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ　ｐａｃｋａｇｉｎｇｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ）Ｐｓｉ−ＡＭに感染する工程により調製され、ポリブレンの存在下で内皮細胞培養物に直接添加され、トランスフェクトントが４００μｇ／ｍｌの０４１８と共に選別された。

図５は、抗ＣＤ５９抗体で検出され、そしてフローサイトメトリー分析で分析されるブタの大動脈内皮細胞（ＰＡＥＣ）上のヒトＣＤ５９の細胞表面発現のグラフである。実線は、コントロールネオマイシン抵抗性遺伝子だけを保持する図４に示されるレトロウィルスに感染されたＰＡＥＣの蛍光強度を表す。破線、小点線、および大点線は、それぞれ、ＣＤ５９−発現ＰＡＥＣ細胞クローン２．９、および１の蛍光強度を表す。

図６は、合成ＧｏｒｔｅｘＴ″移植片に付着するＣＤ５９−発現ＰＡＥＣの走査電子顕微鏡写真を示す。図６８はコントロールＧｏｒｔｅｘ　で、図６ｂＳｃ、およびｄは、その上にインブラントされたＣＤ５９発現細胞を伴うＧｏｒｔｅｘ ”である。

図７は、ヒト補体による溶解からのヒ１−ＣＤ５９発現ＰＡＥＣの防御を示す棒グラフである。黒塗り棒（ｓｏｌｉｄ　ｂａｒ）は、ヒトＣＤ５９を発現するＰＡＥＣの細胞溶解の百分率を表す。点彩棒（ｓｔｉｐｐｌｅｄ　ｂａｒ）は、コントロールのく感染されていない）ＰＡＥＣの細胞溶解の百分率を表すが、斜線棒（ｃｒｏｓｓ−ｈａｔｃｈｅｄ　ｂａｒ）は、コントロールのネオマイシン抵抗性遺伝子のみを発現したＰＡＥＣの細胞溶解の百分率を表す。

図８Ａは、ｐＢＳ　（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）中にクローン化されたマウスのインバリアント鎖遺伝子（ｉｎｖａｒｉａｎｔ　ｃｈａｉｎ　ｇｅｎｅ）に対する、遺伝子ターゲテイングベクターの制限酵素切断マ・ノブを示す。

ターゲティングベクターはネオマイシン遺伝子（ｎｅｏ）を含有する。図８Ｂは、内生マウスインバリアント鎖遺伝子の部分的制限酵素切断マツプを示し、そして図８０は、相同的組換えにより達成される分割されたイン／くリアント鎖遺伝子の制限酵素切断マツプを示す。矢印は、すべての３つの／イネル中での転写の方向を示す。図９に示されるサザンブロイテイングに使用される放射性標識のされたイン／＜リアント遺伝子プローブに対する認識領域は、図８０の下に黒塗り棒で示されている。

図９は、内生インバリアント鎖遺伝子が相同的組換えにより分割され、その遺伝子の突然変異型と置換された、２つの独立したネオマイシン抵抗性マウス胚幹細胞クローン１こ対する制限酵素切断パターンを示すサザンブロ・ノドであるロ　この２つのクローンは、１１．１０．９３および１１月０．１２８と名づけられるロサイスマーカーは左側に示されている。親細胞のＤｒａｌｌｌｌｌ限パターンは右端のレーンに示され、改変されたインバリアント鎖遺伝子を保持する２つのクローンの制限パターンと明らかに異なる。

（以下余白）発明の詳細な説明 ■、　か゛の補体文よる細胞の溶解には、例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ９１１０５８５５に記載のように、Ｃ３ステージでの補体の活性化を妨害することが不可欠であり得るという先の報告とは異なり、最終の補体成分のみが典型的に要求されることが確定された。

Ｃ５ｂへのＣ６，７，８、および９の連続的な添加により、ターゲット細胞の原形質膜中に挿入されたときに、カルシウムおよび他のイオンの膜透過性を高める細孔様の複合体である膜攻撃性複合体（ＭＡＣ）の形成が引き起こされる。その結果、原形質膜の溶解が続いて起こり、細胞が破壊されるか、あるいは血管の血流遮断に影響する特定の細胞機能の非溶解性の改変が生じる。ヒト血清補体に曝されたヒト内皮細胞の場合、ｃｓｂ−９複合体の膜への付着により、次の例に記載のように、血餅および血栓形成を促進すると考えられる、細胞での種々の前凝血性および前血栓性の変化が始まる。Ｈａｔｔｏｒｉら、１９８９ｒ補体タンパク質Ｃ３ｂ−９は、内皮細胞のフォンビルプラント因子の高分子量マルチマーの分泌および顆粒膜タンパク質ＧＭＰ−１４０の細胞表面への転移を引き起こすＪＪ、Ｂ堕土−に九１−２６４：９０５３−９０６０：　Ｈａ＋ｍ１ｌｔｏｎら、１９９０　ｒヒト内皮細胞での最終補体タンパク質の調節コントロール：　ＣＤ５９の抗体によるＣ３ｂ−９インヒビターの中性化Ｊ　氾旦図７６：２５７２− ２５７７；およびＨａｍｉｌｔｏｎおよびＳｉ＋＊ｓ。

１９９１　ｒ最終補体タンパク質Ｃ３ｂ−９は、高密度リポタンパク質およびそのアポタンパク質Ａ−１，Ａ−１１のヒト内皮細胞への結合を高めるＪ　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　８８：１８３３−１８４０゜これらの反応はターゲット細胞の原形質膜中への０９の挿入に依存していると考えられ、そのためその反応はＣ３ｂ−９？ｊ［合体の組立てを妨げることで阻害し得る。

補体を阻害する膜タンパク質補体カスケードに対して有効な阻害活性を示す特異的な膜タンパク質が、単離され分子クローニングされた。

特に、ヒト補体システムに関しては、Ｃ３ｂ−９複合体の細孔形成作用に対する防御は、ヒト補体調節タンパク質ＣＤ５９をコードするｃＤＮＡを用いるこのような細胞のトランスフェクションにより、霊長類以外の細胞に与えられ得る。

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞でＣＤ５９が安定的に発現する能力により、通常はＣＤ５ＱもＨＲＦもどちらも発現しない哺乳類細胞で選択的にＣＤ５９が発現されるときに与えられるＣ３ｂ−９阻害活性の直接的測定が可能となった。この結果は、ヒト血清補体の膜攻撃性複合体に対するヒト血球の阻害活性が、ＣＤ５９　ｅＤＮＡを用いてトランスフェクションすることで非ヒト哺乳類細胞へ転移し得ることを証明し、そしてこのタン、ｆり質のＣ３ｂ−９阻害機能が、新たに発現された表面ＣＤ５９抗原の量に関係することを証明した。

これらのタンパク質の存在および以下に詳述する研究は、これらの細胞表面成分の欠如または不活性化が、血管血栓症の危険を増大し、そして血小板および血小板が豊富な血漿（ＰＲＰ）の蓄積時間を短縮し、臓器および移植組織を潅流させることを示唆する。したがって、血小板の生存能および止血能、造血幹細胞（例えば、ＣＦＵ−ＳＳＣＦＵ−ＧＥＭＭ、およびＣＦＵ−Ｌ）、およびそれらの子孫細胞（例えば、ＢＦｔｌ−Ｅ、　ＢＦυ−ＭＫ、およびＣＦｔｌ−ＧＭ）、および骨髄移植後これらの幹細胞から生じ得る赤血球、血小板、単球、顆粒球、およびリンパ球を含む成熟血球の生存および機能、および採取され、インビトロで保持される移植用臓器および組織の生存は、Ｃ３ｂ−９インヒビターの貯蔵緩衝液または潅流液への添加により、および／または防御されるべき細胞中のＣＤ５９をコードする遺伝子の導入および発現により、増加され得る。自己免疫不全、および狼癒、リューマチ様関節炎、および他の型の免疫性脈管炎を包含する他の病的状態は、有効な量のインヒビターまたは機能的に活性なそれらのポリペプチドの脈管内投与および／またはトランスフェクションおよび発現により、このような処置を要する被検体のＣ３ｂ−９活性を阻害するよう処置され得る。インヒビターの同様な使用法は、ヒト血液由来の培養培地中での細胞培養に適用し得る。

以下の実施例で示されるデータは、ＣＤ５９の遺伝子でのトランスフェクションが、補体の膜攻撃性複合体に対する防御を、通常はヒ）　Ｃ３ｂ−９タンパク質の活性化を制限しない細胞に付与するために使用され得ることの証拠である。これらのデータは、ヒト赤血球に存在するＣＤ５９抗原に以前は帰されていたＣ３ｂ−９阻害機能をＤＮＡ　）ランスフェクシミンにより確認し、このタンパク質と関連して見出される活性が、ＣＤ５９抗原と共に精製する、補体阻害活性を有する池の膜構成物の存在を反映しているという可能性を排除する。グリコジル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔ　１ｏｎ）の明かな相違に反して、ＣＨＯ細胞で発現される組み換えＣＤ５９について［察されるＣ３ｂ−９阻害機能は、ヒト赤血球膜についておよび精製された赤血球ＣＤ５９抗原について観察されるのと類似するヒ）Ｃ８およびＣ９（Ｃ５ｂ−９の範囲内）についての特異性を示す。ＣＤ５９配列をフードするｃＤＮＡを用いた非ヒト細胞のトランスフェクションによるヒトＣ３ｂ−９タンパク質に対する橿選択的な防御を付与する、この能力は、この１８−２１ｋＤのタンパク質が、ヒト血球上の相同な補体制限因子として機能することを明かに示し、そして発作性夜間血色素尿症候群が赤血球ＣＤ５９の単離した欠損に関係し得るという観察と一致する。

以下の例から説明されるように、組み換えＣＤ５９の補体阻害活性は、表面抗原の発現が１，３　ｘ　１０’分子／Ｃ）１０細胞に等しいかそれ以上に増幅されたときに、飽和することが見い出された。ＣＩＯ細胞の球径が約２５μｍであると仮定すると、これは６００分子のＣＤ５９抗原／（原形質膜表面の１μ１１２）と等しいかそれ以上に相当する。比較すると、ヒト補体による活性化および溶解に対し非常に抵抗性を有する、ヒト赤血球は、ＣＤ５９抗原の約２．５　Ｘ　１０’分子／細胞を発現し、これは約２００分子／（膜表面の１μ１１２）に相当する。このデータから推定すると、ＣＤ５９の１×１０３分子／細胞またはＣＤ５９抗原の１分子量（原形質膜表面のｌμ１１２）に等しいかそれ以上が、補体介在の活性化および溶解を阻害するのに効果的であるはずである。

このデータは、ＣＨＯ細胞中で発現された組み換えＣＤ５９が、Ｎ−結合性グリフシル化における明かな相違に反して、ヒト赤血球中のＣＤ５９のヒトＣ３ｂ− ９特性の種選択的な認識を示すこともまた証明する。これらのデータは、ヒトＣ１ｌ　（Ｃ５ｂ−８の範囲内）およびヒトＣ９（Ｃ５ｂ−９の範囲内）についての認識を包含する、ＣＤ５９により示された種選択性が、その炭水化物とは関係なく、コアタンパク質により与えられること、あるいは関連した炭水化物の構造が、ＣＨＯ細胞中で発現されたときに組み換えタンパク質中に保存されることを示唆する。血小板および臓器の生存の延長、および治療効率の増強または補体を介する障害の抑制のための組成物および方法において本明細書中で使用されるように、「Ｃ３ｂ−９不活性化物質」は、赤血球膜上の１８ｋＤａタンパク質、Ｃ３ｂ−９阻害活性を有するそれらのペプチドフラグメント、好適には膜結合領域を含有し、天然産生物から単離された、あるいは組み換えで処理された配列を含有する如何なるＣＤ５９分子をも示す。この用語は、ＣＤ５９またはそれらの生物学的に機能的な部分の遺伝子で感染またはトランスフェクションされ、そしてそれを発現する細胞、およびネズミに’Ｍ）ＩＣクラスＩプロモーターのようなプロモーターと結合する遺伝子がマイクロインジェクシ嘗ンのような技術を使用して動物の胚中に安定的に導入されたトランスジェニック動物゛の細胞をもまた包含する。すべての分子量は、非還元条件下で５ＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される。

同定され、単独でまたはＣＤ５９と共に使用され得る他の補体インヒビターは、以下を包含する：（１）膜補助因子タンパク質（ＭＣＰ）としても周知なＣＤ４６、Ｐｕｒｅｅｌｌら、１９９０　ｒヒト細胞表面糖タンパク質ＨｕＬｙ−ｍｓ、補体システムの膜補助因子タンパク質（ＭＣＰ）、およびトロホブラスト白血球コモン（ＴＬＸ）抗原は、ＣＤ４６であるＪ　Ｊ、Ｉｉｍｕｎｏｌ、　７０：１５０−１６１；および５ｅｙａおよびＡｔｋｉｎｓｏｎ、　１９８９　ｒ補体の膜補助因子タンパク貫の機能特性Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　２６４＋５８１−５８８、により記載。

このインヒビターは、それによりＣ３ｂを開裂し、Ｃ３ｂの蓄積を防止する不活性フラグメントとする分子を活性化する、補体成分Ｃ３ｂに結合することで、機能しそしてそうすることでＭＡＣの形成に貢献する。Ｗｈｉｔｅら、１９９１　ｒヒト膜補助因子タンパク質（ＭＣＰ）または崩壊促進因子（ＤＡＦ）のトランスフェクションによるヒト補体を介する溶解からの哺乳類細胞の防御Ｊ　Ｉｎｔ、　Ｍ江葺ｍ違■山１１吐租Ｕ且並−：−−−（ヒト補体による溶解からの非霊長類細胞の防御を提供するために示さされた組み換えヒトＣＤ４６）をも参照せよ。

（２）崩壊促進因子（ＤＡＦ）としても周知なＣＤ５５、Ｎ１ｃｈｏｌｓｏｎ４ｅ１１ｅｒ　ラ、１９１１２　ｒ　Ｗａ体システムの０３コンバターゼに対して崩壊促進活性を有するヒト上皮細胞膜糖タンパク質の単離ＪＪ、ｌ。

＊ｗ＋ｕｎｏ１．１２９：１８４；　ＬｕｂｌｉｎおよびＡｔｋｉｎｓｏｎ、　１９８９　ｒ崩壊促進因子：生化学、分子生物学、および機能Ｊ　ｎｎｕ、　Ｒｅｖ、Ｉｍａｕｎｏｌ、　７：３５；　Ｌｕｂｌｉｎら、１９８７　ｒ崩壊促進因子（ＤＡＦ）をコードする遺伝子は、染色体１のロングアームの補体調節座に位置する」↓−ハ旦工１１４１６５　：１７３１　；およびＭｅｄｏｆら、１９８７　ｒヒト補体の崩壊促進因子の完全な配列をコードするｃＤＮＡのクローニングと確認Ｊ　Ｐｒｏｃ、　Ｎ　ｔｌ、ｃａｄ、　Ｓｃ’、　Ｕ　８４：２００７により記載。このインヒビターは、Ｃ３コンバターゼの組立てを妨げる分子量約７０ｋＤの膜結合タンパク質である。組み換えＤＡＦが、ヒト補体による溶解からの非霊長類細胞の防御を提供するという、ｗｈｉｔｅｒａ、１９９１の報告も参照せよ。

Ｒｏｏｎｅｙら、１９９Ｏｒ補体を介する溶解からのヒト羊膜上皮細胞（ＨＥＡＣ）の防御：細胞上での、３つの補体阻害膜タンパク質の発現Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏ１ｏ■７１：３０８−３１１に報告のように、補体を介する溶解からの防御の提供についてのＣＤ４６、ＣＤ５５、およびＣＤ５９の相対的な寄与は、特異的遮断抗体の使用によりヒト羊膜の上皮細胞中で測定されてきた。その結果は、ＣＤ５９が、ＣＤ４６とＣＤ５５とを比較して、補体の攻撃に対し最大の防御を提供することを証明した。さらに、補体の溶解作用に対する赤血球の異常な感受性により引き起こされる希な疾病である発作性夜間血色素尿症の被検体は、Ｙａ−ａｓｉｎａら、１９９Ｏｒ発作性夜間血色素尿症の原因としての２０キロダルトン（ＣＤＳ９）の遺伝された完苓欠損Ｊ　Ｎｅｗ　Ｅｎ　、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３２３：１１８４−１１８９によれば、ｃｏｓ５の欠損を伴わずに、ＣＤ５９の遺伝的欠損を有することが記載された。

Ｄａｎｉｅｌｓ、　Ｇ、　１９８９　ｒ崩壊促進因子でのクロマ−関連（Ｃｒａｎｅｒ−ｒｅｌａｔｅｄ）抗原血液群決定因子Ｊ　顎Ｌ」且Ｌ５６＋２０Ｓ　；　Ｉｌｏｌｇｕｉｎら、１９９２　ｒ崩壊促進因子の単離された欠損を伴う赤血球上での補体の他の経路の活性化の効果の分析ＪＪ．ＩμＬ！！ＩＬＬ　１４ｇ：４９８−５０２に報告されているように、ＣＤ５　９は欠損して（１るが、崩壊促進因子は正常（そして、おそらく他の補体インヒビターも正常）であると報告されたこの被検体について観察された脈管内溶血反応とは異なり、赤血球ＣＤ５Ｓ（崩壊促進因子）に遺伝的な欠乏または欠損を有する個体は、一般的に脈管内溶血反応を示さない。これらの報告は、ＣＤＳ９が、ヒト血漿中の補体の細胞溶解効果からこれらの細胞を防御するのに、必要且つ十分であることを示唆している。

異質の宿主中への移植に適した細胞は、その細胞中（こタンパク質または、例えばＣＤ５９、ｃｏｓｓ、ＣＤ４１ｉ、および／またζよ｛也のＣ８またはＣ９のインヒビターのような、補体を介する溶解を阻害する、タンパク質の組合せをコードするＤＮＡを導入することで、補体を介する溶解から防御される。ＣＤ５９１ｔ好適なインヒビターで、ＣＤＳ９タン／イク質をコードするベクターを用（Ｘるトランスフエクシ９ンまたは感染すること（こより細胞中に導入され、そしてトランスフエクトされた／感染された細胞の表面上で発現される。このインヒビター１よ、その細胞力ｆ移植される宿主と起源が同じ種で有ることが望まし（１。

補体インヒビターをコードする遺伝子（′！、起源力｛異なる種胞が攻撃に抵抗する。あるいはこの遺伝子；ま、起源力τ同一の種の細胞に導入され得、その結果、その細胞の表面ζこ、より多くの量のタンパク質が発現される。例えば、この遺伝子は、この遺伝子の発現を高めるプロモーターの制御下に置かれ得、次に、その遺伝子は相同的組み換えにより宿主細胞の染色体中の、その遺伝子が通常位置するが発現を高めるプロモーターの制御下にある部位に挿入されるか、または染色体の他の遺伝子座に挿入され得る。

ＣＤ４６、ＣＤ５ＳおよびＣＤ５９のＤＮＡ配列情報が、文献中に報告されている。

Ｌｕｂｌｉｎら、１９８８　ｒヒト膜補助因子タンパク質（ＭＣＰ）の分子クローニングと染色体局在化（ｃｈｒｏｗ＋ｏｓｏｍａｌ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）：補体ＩＮ節タンパク質のマルチジーンファミ！ｊ　−　（ｍｕｌｔｉ−ｇｅｎｅ　ｆａｍｉｌｙ）中での細胞含有物（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）の証拠ＪＪ．ｘ．Ｍｅｄ．１６８：１８１｛９４により報告されたＣＤ４　６の配列を以下に示す（配列番号１）。

ＧｅｎＢａｎｋから得られたＨＵＭＣＤ４６　ｃＤＮＡ配列：［ｌＵＭＣＤ４６Ｑ（以下余白）ＧＡＡＴｒＣＧＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＣＧＴＣＴｒＣＣＧＣＧＣＣＧＣＧＣＡＴＧＧＡＧＣＣＴＣＣＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＧＡＧＴＧＴＣＣＣｍ″ＣＣＴｒＣＣＴＧＧＣＧＣｍＣＣＴ（以下余白）ＴｒＧＧＡＧＡＧＡＧＣＡＣＧ人ＴＴＴＡＴｒＧＴＧＧＴＧＡＣＡＡＴｒＣＡＧＴＧＴＧＧＡＧＴＣＧＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＧＡＧＴＧＴＡＡＡＧＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＣＧＡＴｒＴＣＣＡＧＴＡＧＴＣＧＡＡＡＡＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＴＡＴＣＡＧＧＡｍＧＧＡんりｖ詰ＡＴｒＴｒＡＣＴＡＣ＾＾ＡＧＣ＾人Ｃ人ＧＴＴＡＴＧＴｒＴＧＡＡＴＧＣＧＡＴＡＡＧＧＧＴｒｍＡＣＣＴＣＧＡＴＧＧＣＡＧＣＧＡＣＡＣＡＡＴｒＧＴＣＴＧＴＧＡＣＡＧＴＡＡＣＡＧＴ人ＣＴＴＧＧＧＡＴＣＣＣＣＣ人ＧＴＴＣＣＡＡＡＧＴＧτＣＴｒＡ人人ＧＴＧＴＣＧＡＣＴＴＣｒＴＣＣＡＣＴＡＣＡＡＡＡＴＣｒＣＣＡＧＣＧＴＣＣＡＧＴＧＣＣＴＣＡＧＧＴＣＣＴ人〇〇ＣＣＴＡＣＴｒＡＣＡＡＧＣＣＴＣＣＡＧＴＣＴＣ人人ＡＴｒＡＴＣＣＡＧＧＡＴＡＴＣＣＴＡＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＡＧＧＡＡＴＡＣＴｒＧＡＣＡＧＴｒＴＧＧＡＴＧＴＴｒＧＧＧＴＣＡＴＴＧＣＴＧＴＧＡＴｒＧＴＴＡＴｒＧＣＣＡＴＡＧＴｒＧＴｒＧＧＡＧＴｒＧＣＡＧＴＡＡｍＧＴＧＴｒＧτ ＣＣＣＧＴＡＣＡＧＡＴＡＴＣＴＴＣＡＡＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＧＧＣＡＣＡＴＡＣＣＴＡＡＣＴＧＡＴＧ人ＧＡＣＣＣＡＣＡＧＡＧＡＡＧＴ人人ＡＡＴｒＴＡＣＴｒＣＴＣＴＣＴＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＧＡＴＧＡＧＡＧＡＡＡＧＧＴｒｒＧσロゴＴＡ丁ＣＡ丁ＴＡＡＡＡＧＧＡＡＡＧＣＡＧＡＴＧＧＴＧＧＡＧＣｒＧＡＡτＡＴＧＣＣＡＣＴＴＡＣＣＡＧＡＣＴ人人人ＴＣ人ＡＣＣＡＣＴＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＡＧＡＧ人ＧＧＣＴＧ人ＡＴＡＧＡＴｒＣＣＡＣＡＡＣＣＴＧＧＴｒＴＧＣＣＡＧＴｒＣＡＴＣｒＴＴｒＧＡＣｒＣｒＡＴＴＡ　人ＡＡＴＣＴｒＣＡＡＴＡＧＴｒＧＴｒＡＴｒＣ’ｒＧＴ　人ＧＴＴｒＣＡＣｒＣＴＣ人ＴＧＡＧＴＧＣＡＡＣＴＧＴＧＧＣＩＴＡＧＣＴＡＡＴＡＴｒＧＣＡＡＴＧＴＧＧＣＴｒＧＡＡＴＧＴＡＧＧτ＾ＧＣＡＴＣＣＴｒＴＧＡＴＧＣＴｒＣＴｒＴＧＡＡ人ＣＴｒＧＴＡτＧＡＡｍＧＧＧＴＡＴＧＡＡＣＡＧＡＴｒＧＣＣＴＧＣＴｒＴＣＣＣＴｒＡＡＡＴＡＡＣＡＣＴｒＡＧＡＴｒＴＡＴｒＧＧ　人ＣＣ　人ＧＴＣＡＧＣ人ＣＡＧＣＡＴＧＣＣｒＧＧＴＴＧＴ　人ＴｒＡＡＡＧＣＡＧＧＧＡＴＡＴＧＣＴＧＴＡＴｒＴｒ　人ＴＡＡＡＡＴｒＧＧＣ　人ＡＡＡＴＴＡＧＡＧＡＡＡＴ人ＴＡσｒＴＣＡＣＡＡＴＧＡＡＡＴＴＡＴＡＴｒＴｒＣＴｒＴＧＴＡＡＡＧＡＡＡＧＴＧＧＣＴｒＧＡＡＡＴＯ′ＴｒｒＴｒＧＴｒＣＡＡＡＧ　人ＴｒＡＡＴＧＣＣＡＡＣｒＣｒＴＡＡＧ　人Ｔｒ人ＴＴＣＴｒＴＣＡＣＣＡＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＧＴＡＴＩＴｒＡτ人ＴＡτＣＧＴＴＣＡＴＴＧＴＴＧＧＣＴＴＣＴｒＴ人ＡＣＣ人ＡＧ人ＡＴ人ＴｒＡＴｒＧＧ人人人人ｒｒｃｒｃ丁人人人ＡＧＴＡＡＡＧＧＧＴＡＡＡＴｒＣｒＣＴＡＴｒＴＴｒＴＧＴＡＡＴＧＴＧＴｒＣ απＧＡｍＣ＾ＧＡＡＡＧＣｒＡＧＡＡＡＧＴＧＴＡＴＧＴＧＴＧＧＣ　人ＴｒＴＧＴＴｒＴＣ　人ＣＴロπτ人ＡＡ人Ｃ人ＴＣＣＣＴＡＡＣＴＧ人ＴＣＧ人人Ｔ人ＴＡＴＣ人ＧＴＡＡｍＣＡＧＡＡＴＣＡＧＡＴＧＣＡＴＣＣｍ”ＣＡＴＡＡＧＡＡＧＴＧＡＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＡＣＡＧＣＣＡＴＭｅｄｏｆら１９８７、により報告されたＣＤ５５の配列を、以下に示す（配列番号２）。

ＧｅｎＢａｎｋ　ＨＵＭＤＡＦから得られたヒトＤＡＦ　ｅＤＮＡ配列：ＨＵＭＤＡＦＣ１（以下余白）ＴＴＣｒＣｒＣＴＡＣＡＧＴＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＴＡＡＴＣＣＣＡＡＡＧＴＧＧＴＧＴＣＧＴＡＴＧＡＣＧＣＣＧＧＡＧＣＣＣＴＣｒＧＡＣＣＧＣＡＣＣＴＣｒＧＡＣＣＡＣＡＡＣＴＧＴｒＣＴＡＡＣＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＡＴＧＡＣＣＧＴＣＧＣＧＣＧＣＣＧＡＧＣＧＴＣＡＴＡＴｒＡＴｒＴＧＧＴＧＣＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴｒＣＴＣＡＴＧＴＡＡＣＡＣＡＧＧＧＴＡＣＡＡＡＴｒＡｍＧＧＣＴＣＧＡＣＴＴＣＴＡＧｍＴｒＧＴＣＴｒ人ｍＣ人ＧＧＣＡＧＣＴＣＴＧＴＣＣＡＧＴＧＧＡＧＴＧＡＣＣＣＧＴｒＧＣＣＡＧＡＧＴＧＣＡＧＡＧ人ＡＡ　ＴＴＴＡＴｒＧＴＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＡＡＡＴｒＧＡＣＡＡＴＧＧＡＡＴＡＡＴｒＣ人ＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＧＡＣＣ人ＴｒＡＴＧＧＡＴＡＴＡＧＡＣＡＧＴＣＴＧＴＡＡＣＧＴＡＴＧＣＡＴＧＴＡＡＴＡＡＡＧＧＡＴ’ｒＣＡＣＣＡＴＧＡＴｒＧＧＡＧＡＧＣＡＣＴＣｒＡｍＡＴｒＧＴ人ＣｒＧＴＧＡＡＴＡＡτＧ＾ＴＧ入＾ＧＧＡＧＡＧＴＧＧＡＧＴＧＧＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＴＣＡＣＣＡＡＣＴｒＣｒＣＡＧ入ＡＡＡＣＣＡＣＣＡＣＡＡＡＡＡＣＣＡＣＴＧＧ人ＡＣＣ人ＣＴＴＣＡＧＧＴＡＣＴＡＣＣＣＧＴＣＴＴＣＴＡτＣＴＧＧＧＣＡＣＡＣＧ丁ＧＴｒｒＣＡＣＧＴＴＧＡＣＡＧＧＴＴｒＧＣＴＴＧＧＧＡＣＧＣＴＡＧＴＡＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＡＡＧＧＣＡＧＴＣＣＴＧＧＡＡＴＣＡＣＡＴｒＣＴｒＡＧＣＡＣＡＣＣＴＧＣＧＴＡＡＴＡＴｒＴＡＴｒＴＡＴＡＴｒＴＡＴＴｒＡＴＧＡＣＡＧＴＧＡＡＣＡＴｒＣＴＧＡＴｒＴｒＡＣＡＴＧＴＡＡＡＡＣＡＡＧＡＡＡＡＧＴｒＧＡＡＧＡＡＧＡＴＡＴＧＴＧＡＡＧ＾ＡＡＡＡＴＧＴＡＴＴｒＴｒＣＣｒＡＡＡＴＡＧＡＡＡＴＡＡＡＴＧＡＴＣＣＣＡＴＴＴＴＴＴαπ（以下余白）ＢＯＬＤ　ＴＥＸＴ　−ＨＬＩＭＤＡＦＣＩ　（プロモーターオヨヒエキソン１、’ｆ／ム配列の５°末端）ＰＬＡＩＮ　ＴＥＸＴ　ｌＩＨＵＭＤＡＦ　ｃＤＮＡＰｈｉｌｂｒｉｃｋ、ＬＭ、ら、１９９０　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ　、２０．８７−９２により報告されたＣＤ５９のアミノ酸および核酸の配列を以下に示す（配列番号３）。

このタンパク質のアミノ酸配列は：ＬＱＣＹＮＣＰＮＰＴＡＤＣＫＴＡＶＮＣ５ＳＤＳＤＡＣＬＩＴＫＡＧＬＱＶＹＮＫＣＷＫＦＥＨＣＮＦＮＤＶＴＴＲＬＲＥＮＥＬＴＹＹＣＣＫＫＤＬＣＮＦＮＥＱＬＥＮＧＧＴＳＬＳＥＫＴＶＬＬＬＶＴＰＦＬＡＡＡ’ｌ’／５ＬＨＰＣＤ５９タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号４）は：ＣＴＴＣＡＴＣＣＣＴＡＡＧＴＣ適合するオリゴヌクレオチドプライマーは容易に設計され、ヒトｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応の増幅により、これらのタンパク質に対する全鎖長のｃＤＮＡ配列を得るために使用し得る。

好適には、このオリゴヌクレオチドプライマーは、特異的制限酵素部位を宵するよう設計されることが好ましく、その結果、全鎖長のｃＤＮＡ配列がターゲットドナー細胞をトランスフェクト／感染するのに使用するために、ベクター中に容易にサブクローニングされ得る。

補体インヒビターをコードするＤ）ＩＡの内皮細胞への導入？ｆｌｉ体インヒインヒビタードするＤＮＡは、トランスフエフシランを使用して培地中の細胞へ、あるいは補体インヒビターをそれらの細胞表面で発現させるトランスジェニック動物を生産するために胚中へ導入され得る。

培養細胞への導入当該技術分野ですでに周知のように、トランスフエフシランは、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈降法、リボフェクチンベースの処理（Ｉｉｐｏｆｅｅｔｉｎ− ｂａｓｅｄ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）、またはマイクロインジェクションにより、または「遺伝子銃」の使用によりなされ得る。いずれの場合も、ＣＤ５９のような阻害タンパク質のｃＤＮＡは、遺伝学的に操作された細胞中で十分発現するための分子をコードするプラスミドベースのベクター中にサブクローニングされる。このプラスミドベースのベクターは、好適には真核細胞中では細胞毒性アミノグリコシド０４１８を用いての安定なトランスフェクトント（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）の選別のためのネオマイシン遺伝子のようなマーカーおよび細菌中ではプラスミドの選別のためにアンピシリン遺伝子を含有する。

内皮細胞に対して好適である感染は、レトロウィルスベクター中に阻害タンパク質の遺伝子配列を取り込むことで達成される。このような取り込みについては、当該技術分野では種々の方法が知られている。当該技術分野で広（使用されてきたそのような方法の１つは、レトロウィルスをパッケージングする欠陥ネズミレトロウィルスＰｓｉ−２細胞、およびターゲットドナー細胞の感染に使用する感染性両種性ウィルスを準備するための両種性パッケージング細胞系Ｐｓｉ−ＡＭを、Ｋａｈｎら、１９１１７　ｒレトロウィルスを介する遺伝子は哺乳類細胞中へ転移されるＪ　Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅ１ｌｓ　１３：２８５−２９８＋、：記載のように、採用する。

または、欠陥モロニー不ズミレトロウイルスでなく、Ｈａｎｔｚｏｐｏｕ　ｌｏｓ　ラ、１９１１９　ｒレトロウィルスベクターの転写単位外のアデノンンデアミナーゼミニジーンの転移での改善された遺伝子発現Ｊ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６：３５１９−３５２３に記載のように、自己不活性化およびダブルコピータイプのレトロウィルスが、使用され得る。

細胞の表面で補体インヒビターを発現するトランスジェニック動物の生産のための胚への導入移植用に改変された細胞の供給源として使用される細胞群の表面で補体阻害タンパク質を発現するトランスジェニック動物を作るための種々の方法が、当業者に知られている。トランスジエニツクなマウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、およびウシが、標準的な技術を使用して作られたが、特に有用な動物の例は、ウサギおよびブタを包含する。最もよく知られた、トランスジェニ、り動物を作る方法は、ドナーである雌の過剰排卵、卵子の外科的な摘出そして胚の前核への遺伝物質の注入である。このことは、Ｗａｇｎｅｒへの米国特許番号第４．８７３．１９１号に教示されており、その特許の教示は本明細書中に援用する。他の一般的に使用される技術は、後述の実施例２で特に記載のように、胚幹細胞（ＥＳ　ｃａｌｌ）の遺伝子操作を包含する。

ＥＳ細胞は、例えば、Ｔｅ　ａｔｏｃａｒｉｃｉｎｏｍａｓ　ａｎｄ　ｅｍｂｒ　ｏｎｉｃ　ｓｔａｍ　ｃｅ　Ｉｓ：　Ａ　ｒａｃｔｉｃａｌ　ａ　ｒｏａｃｈ　Ｅ、Ｊ、　Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編集、７１−１７１−１１２（Ｏｘｆｏｒｄ４ａｓｈｉｎ、　Ｄ、Ｃ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８７）中のＲｏｂｅｒｔｓｏｎ、　Ｅ、Ｊ、　ｒ胚由来の幹細胞系」に記載のように増殖される。

遺伝物質は、例えば、ＭｃＭａｈｏｎ、　Ａ、Ｐ、およびＢｒａｄｌｅｙ、　Ａ、　Ｃｅ１ｉ　６２．１０７３−１０８５（１９９１）の方法に従い電気穿孔法により胚幹細胞中に導入される。コロニーは、第６日から第９日に選別され、９６または２４ウエルデイツシｘ　（Ｃｏｓｔａｒ）に移され、増殖され、そしてサザンブロッティング分析のためのＤＮＡ単離に使用される。

キメラマウスは、Ｅ、Ｊ、　Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編集のＴｅ　ａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓａｎｄ　ｅｍｂｒ　ｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ：　Ａ　ｒａｃｔｉｃａ　ａ　ｒｏａｅｈ（Ｏｘｆｏｒｄ、　Ｗａｓｈｔｎｇｔｏｎ、　Ｄ、Ｃ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　１９Ｂ？）　ｐＨ３−１５１のＢｒａｄｌｅｙ、　ｒキメラマウスの生産と分析」に記載のように生成される。その教示は本明細書中に援用する。遺伝物質は、胚盤胞に注入される。キメラはそれらのインブラントされた妊娠し得る雌の子孫から選別され、そしてそのキメラは、ドナー動物として使用するため生殖系列キメラを生産するために飼育される。

Ｉｌ、Ｔ　、６５−０Ｍ１抗体または遮断化合物を使用するＴ細胞の免疫を介する応答の阻害のための先の試みとは異なり、細胞の遺伝学的操作が、Ｔ細胞の免疫応答を阻害するために使用される。ドナー内皮細胞が、それらの表面でＭＨＣクラス！分子が発現しないように遺伝学的に操作される。さらに好適には、その細胞は、実質的にすべての細胞表面でクラスＩおよびクラス■のＭＨＣ分子を発現しないように、遺伝学的に操作される。本明細書中で使用されるように、用語「発現しない」は、応答を引き起こすには十分な量が細胞表面上に発現しないこと、あるいは発現されるタンパク質に欠陥があり、そのため応答を引き起こさないことを意味し得る。

本明細書中に使用されるように、ＭＢＣ分子は１（ＬＡ分子、特にクラス■のＨＬＡ　Ａ、　Ｂ、およびＣ１並びにクラス■のＨＬＡ　ＤＰ、　ＤＱ５　およびＤＲｌ並びにそれらのサブクラスを指していう。この用語は、一般的にヒトＭＨＣに特有であると解釈されるが、本明細書ではドナー細胞種由来の同意義のＭＨＣ遺伝子を包含することを意味する。例えばその細胞がブタ由来であれば、ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩのいずれの場合も、用語ＨＬＡは同意義のブタＭＨＣ分子を指す。

クラス■のＭＨＣ分子が除去されるとき、ＣＤ４＋Ｔ細胞Ｃよ遺伝学的に操作された内皮細胞を認識せず；クラス！およびクラス■のＭＨＣ分子の両方が除去されたとき、ＣＤ４＋およびＣＤａ＋細胞のいずれもが改変された細胞を認識しない。

特定の同種移植片の拒絶において、免疫応答を取りもつＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の系統群の相対的重要性（±、実験的（こ研究された。ターゲットとする性質および遺伝子の相同的組み換えによる実験が、いくつかの洞察を提供した。

例えｉｆ、ＡＩＤＳウィルｘ　（ＨＩＶ）は、選択的１：ｃＤ４＋Ｔ細胞を減らすカタ、ＣＤ８＋Ｔ細胞は減らさない、そして実質的に体の免疫防御を破壊する。

さらに、Ｚｉｊｌｓｔｒａら、１９８９　ｒ胚幹細胞（こお（１て、相同的組み換えにより生産される破壊されたβ２ミクログロブリン遺伝子の生殖系列伝達Ｊ　Ｎａｔｕｒｅ　３４２：４３５４３８；およびＫｏｌｌｅｒら、１９９０「β ２Ｍ、　ＭＩＩＩＣクラス■タン／＜り質およびＣＤ８＋Ｔ細胞を欠くマウスの正常な発生Ｊ　５ｃｉｅｎｃｅ　２４８：１２２？−１２３０ｉこ報告のように、マウスでは相同的組み換えおよびβ２ミクログロブ＋７ン遺伝子の破壊が、ＣＤ８＋Ｔ細胞の消失を引き起こす力（、この遺伝子型を引き継ぐマウスは健康を保ち、そしてウィルスのような異質の生物による感染に抵抗し得る。これら２つの観察（ま共に、ＣＤ８＋Ｔ細胞は宿主の防御メカニズムで１．特殊であり、そして本質的でない役割を演じるが、ＣＤ４＋　Ｔ細胞（±一般的に免疫応答で中心的で、そして本質的な役割を演じてｔすることを示唆する。

内皮細胞上になされる好適な遺伝的改変は、１）ＭＨＣクラス■分子の組立ておよび細胞表面への輸送、そして抗原性ペプチドのローディングにおいて機能する内在イン１＜リアント鎖遺伝子を破壊すること、および２）すべてのＭＨＣクラス■分子の細胞表面での発現に必要なタンノくり質をコードする内在β２ミクログロブリン遺伝子（β２Ｍ遺伝子）を破壊すること、を包含する。または、インバリアント鎖遺伝子のみが、破壊される。

インバリアント鎖は、抗原性ペプチドフラグメントをＭＨＣクラス■分子に挿入するために必要であると考えられてｔＡ机　抗原性ペプチドおよびＭ）ＩＣは共に、Ｔ細胞により認識される。抗原性ペプチドの非存在下では、Ｔ細胞の認識は正常に得られず、またＭＩＩＣクラス■分子も正しく組まれなし）。このよう１こ、インバリアント鎖を欠く細胞では、ペプチドの発現（ま止まり、そして微量の細胞表面のＭＨＣが得られるときでさえ、それら＋１ペプチドを欠き、そのため非免疫原性である。

ＺｉＮｓｔｒａら、１９８９：　Ｋｏｌｌｅｒ９．　１９９０；およびインノイ１ノアント鎖遺伝子の破壊を示す以下の実施例２に記載のよう１こ、これらの遺伝子の破壊は、相同的組み換え遺伝子ターゲ・ノテイング技術によりなされる０この技術は、以下のように細胞表面のＭＨＣクラスＩタンノくり質の発現を抑制することに適用される。まず、ターゲ・ノドドナー内皮細胞については完全なβ ２Ｍ遺伝子力量、クローニングされる。例えば、ブタ内皮細胞につ（Ｘてはブタ β２Ｍ遺伝子カイクローニングされる。これは、まず、マウスβ２Ｍ遺伝子のような、相同なβ２Ｍ遺伝子についてのｃＤＮＡを得ることによりなされる。マウスβ２Ｍ　ｃＤＮＡについてのＤＮＡ配列の情報（よ、Ｐａｒｎｅｓら、１９８３　Ｎａｔｕｒｅ　３０２＋４４９−４５２に報告されて０る。適合するオリゴヌクレオチドプライマーは、マウスβ２Ｍ　ＣＤＮＡの５°および３°の末端と完全に対になる相補的塩基により１１イブ１ノダイズするように容易に設計される。そして、これらのオリゴヌクレオチドブライマーは、マウスｃＤＮＡ上でのポリメラーゼ連鎖反応増幅をなすことにより、マウスβ２Ｍタン、＜り質の全鎖長のｅ　ＤＮＡ配列を得るために使用される。この第１ノゴヌクレオチドプライマーは、それらの末端で特異的制限部位をコードするように選択的に設計され、その結果、全鎖長のｃＤＮＡ配Ｗｌがプラスミド中に容易にサブクローニングされる。

その後、全鎖長のマウスβ２Ｍ　ｃＤＮＡが、ターゲ・ノドドナー内皮細胞の供給源から調製されたｃＤＮＡライブラ１ブタをスフ１］−ニングするための放射性標識ノ・イブリダイゼーシ冒ンプローブとして使用され得る。例えば、ブタ内皮細胞（こつ０て、マウスβ２Ｍ　ＣＤＮＡが、λフアージベクター中（こクローニングされた、ブタｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのハイブリダイゼーシヨンプローブとして使用される。陽性の／％イブリダイゼーションクローンが選別され、精製され、プラスミドベクター中にサブクローニングされ、次ζこ、当該技術分野で周知の方法を使用して配列決定される。

未翻訳のヌクレオチド残基および発現されたタンノ（り質をコードする遺伝子の部分を含む、完全なブタβ２Ｍ遺伝子ｉ１、ハイブリダイゼーシ５ンブローブとして放射性標識したブタβ２Ｍ　ｅＤＮＡを用いてλフアージベクター中にクローニングされたブタゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによりクローニングされ得る。陽性のクローンが選別され、精製され、プラスミドベクター中にサブクローニングされ、そして当該技術分野で周知の方法を使用して配列決定される。

ひとたびクローニングされると、β２Ｍ遺伝子は、プラスミドベースのまたは優先的にレトロウィルスベースのベクター（「遺伝子ターゲツティングベクター」）中にサブクローニングされる。例えば、ネオマイシン抵抗性遺伝子（本明細書ではこれ以降「陽性選択遺伝子」と呼ぶ）のような、内皮細胞中で組み換えの陽性選択をさせる短いＤＮＡ配列の挿入により、β２Ｍ遺伝子の読み取り枠が破壊される遺伝子ターゲ・ノテイングベクターは、非相同的組み換えに対する選別、すなわち破壊されたβ２Ｍ遺伝子を有するプラスミドの部分だけではなく、プラスミド全体を細胞の遺伝情報中に取り入れることに対する選別を可能にする破壊されたβ２Ｍ遺伝子領域以外に、追加選択遺伝子（「陰性選択遺伝子」）をもまた有する。陰性選択遺伝子は、例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子であり得る。

その後、遺伝子ターゲットベクターは、上述のように細胞中にトランスフェクション／感染され、そして陽性選択遺伝子を発現するが、陰性選択遺伝子を発現しないクローンのスクリーニングにより、相同的組み換えの事象が選択される。

同じ処理が、実施例３で以下に証明されるように、インバリアント鎖遺伝子の相同的組み換えを達成するために使用される。

（以下余白）ＩＩｌ、　され　される　およびＡ、補体およびＴ細胞を介する溶解から防御するための細胞の遺伝学的操作本明細書中に記載の好適な実施態様では、遺伝学的に操作された細胞が、宿主中に移植され、宿主の免疫システムに抵抗しそしてそれを回避し得る。宿主は、通常ヒトまたは家畜化された動物である。

内皮細胞、特に宿主へのインプランテーシせンまたは注入のために離された内皮細胞に関して記載するが、本明細書中に記載の方法および組成物は、内皮細胞に限定されない。池の細胞のタイプも移植のために同様に改変され得る。他の細胞のタイプの例は、離したまたは組織として使用されていた（すなわち器官）線維芽細胞、上皮細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、肝細胞、膵島細胞、骨髄細胞、星状細胞、ノユヴアン細胞、ならびに他の細胞のタイプを包含する。本明細書中に記載されるように、「内皮細胞」とは、実施例で特別に特定されまたは限定されない限り、これらの他の細胞のタイプの改変を包含するものとして解釈される。

細胞は、種々の起源から得られ得る。そのような細胞を大量におよび低コストで入手し得るので、好適にはこの細胞は非ヒト由来である。例えば、細胞はブタまたはウシ由来であり得る。ヒトを含む霊長類由来の細胞も、好適であれば使用し得る。ヒトの細胞が使用されても、アロタイプ移植の後でさえ補体を介する細胞攻撃が起こり得るので、超急性拒絶反応からの防御が一般的にはまだ必要とされる。

遺伝学的に操作された細胞は、通常、単個クローン、またはいくつかの使用法では個別に選択されたクローンの群がら導かれる。このように、最終的な治療用調製品の特徴は、細胞の全体的な特性および遺伝学的な構成の両方に関して正確にコントロールされ得ることである。このようなコントロールは、特定の治療プロトコルの効果を評価し、そのようなプロトコルに対する規制の認可を得ることに重要である。

上記細胞は、補体阻害タンパク質またはタンパク質類が細胞表面上に発現するように、遺伝学的に操作される。上記細胞は、それらがクラス■、クラスＩ、または好適にはクラス！およびクラス■のＭＨＣ遺伝子によりコードされるタンパク質が、細胞表面上に発現しないようにも、遺伝学的に操作され得る。ヒトの細胞が使用される場合でさえ、細胞が治療される個体以外の個体から得られる場合、その細胞群は一般的に非自己細胞を含有するので、本明細書中に記載のように、細胞を操作することが有益である。

内皮細胞は、例えば、血管または毛細血管のような粗管系の一部の内層から得られ、組織培地または他の適切な生物学的な培地中で、成長されそして保持される。

例えば、ブタの大血管内皮細胞は、雄ブタの胸部大動脈から単離される。

工、大動脈弓および腎動脈口のすぐ上で滅菌クランプを使用してクロスクランピングする滅菌技術を使用して、屠殺された動物から、胸部大動脈を摘出する。

２組織／器官を、１０Ｘのペニシリン、ストレプトマイシンおよびフンギシン（ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）を含有する滅ＩＩ　ＰＢＳ緩衝液中に入れる。これらを、氷上に移す。

３、大動脈を、層流クリーンベンチ中の滅菌フィールドに置いた後、大動脈周辺の脂肪および外膜組織を、大動脈から切除する。補助者に大動脈を押さえさせ、クランプおよび無菌はさみを使用して、血管を長軸に切開し、内皮を露出させる。

次いで、その内皮を無！ＩＰＢＳ／抗生物質含有緩衝液でリンスする。

４、引き続き、上記内皮を、滅菌メスで削り取り、そして採取された内皮を、滅菌ＰＢＳ緩衝液の流勢での剥胱により、細胞を無菌１５ｃｃ円錐遠沈管中に移す。この遠沈管を１２０ＯＲＰＭで遠心分離し、上清を吸引する。

５．５．０ｍｉの滅菌媒地（１０％の熱不活性化ウシ胎児血清）、ペニシリン（１０００／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）、５ｍＭＨｅｐｅｓ。

５ｍＭピルビン酸塩および５ｍＭグルタミンを含有するＤＭＥＭを各遠沈管に加え、そして細胞ベレットを、滅１１１５１１ビベ・ットで溶液を穏やかにピペッティングし、媒地中に再懸濁する。

６、（各大動脈から採取された）細胞の５．０Ｉｌｌアリコートを、Ｃｏｒｎｉｎｇ製Ｔ２５組織培養フラスコ中に入れ、この培養物を５％ＣＯ２，９５％に過湿された空気中で、３７”Ｃでインキユベートする。

７、プレートから上記細胞を取り除くため、および、細胞を分離させるために０．０２％のトリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅ＋ａｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、）０．０１％のＥＤＴＡを含有するＣａ４４およびＭｇ’″′フリーのＰＢＳを使用して、１：３の分割比で、上記細胞を集密継代する。

下記の方法で遺伝学的に処理された後、上記細胞は、特定の被検体の処置に必要とされるまで、通常は、液体窒素タンク中に保存される。ドナー細胞を準備し得ることおよび必要になるまでそれを保存し得ることは、重要な利点である。

その後、細胞は移植のため基質上に接種される。例えば、以下のように分離された内皮細胞が、Ｇｏｒｔｅｘ”の内面への接種に提供される。

１、滅菌Ｇｏｒｔｅｘ”材料を無菌Ｆａｌｃｏｎ”１５ｃｃ円錐ディスポーザブル試験管中に入れる。０．１Ｍ、　ｐＨ９，３の炭酸ナトリウム緩衝液および１００μｇ／ｍｌ酸溶解Ｉ型コラーゲンから成るコーティング溶液を試験管に加える。−晩４℃でのインキニベーシ璽ンに引き続き、Ｇｏｒｔｅｘ”を無菌ＰＢＳでリンスする。Ｉ型コラーゲンは、最も効果的で急速な内皮細胞接着（３０分で７５％が接着、そして１時間で８０％が接着）、および移動を提供するので、コーティングに使用される。Ｍａｄｒ’ｉら、［内皮下層の膠原性成分：構造と機能の相関関係ｊ　Ｌａｂ、ユ旺競Ｌ４３：３０３−３１５（１９８０）を参照せよ。

２、次いで、ＧｏｒｔｅｘＴ″′チェーピングを一方の末端でクロスラビングし、内皮細胞を導入し、そして、他の末端をクロスラビングする。

３、次いでＧｏｒｔｅｘ”″のセグメントを無菌試験管中に入れ、その試験管を培地で満たし、５％ＣＯ２、湿度９５％、３７℃で１時間、５ｒｅｖ／ｗｉｎで回転する。

４゜ＧｏｒｔｅｘＴ″のセグメントを試験管から取り出し、そしてそれらを無菌媒地で洗浄する。

５、ＧｏｒｔｅｘＴ″のセグメントを宿主の血管系に移植する。

Ｂ、補体を介する攻撃を阻害する、ｃｓｂ−ｓ不活性化物質を用いる細胞および被検体の処置択一的に、Ｃ３ｂ−９不活性化物質が、補体を介する攻撃を阻害するために、細胞または被検体に対し溶液で投与され得る。

被検体が血小板または内皮細胞の活性化を遮断するような処置を要する場合の、インヒビター、すなわち、単離された本来の生成するインヒビター、またはインヒビターを発現する（または、より好ましくは分泌する）遺伝学的に操作された細胞から生産される、機能ドメインを表わし、Ｃ３ｂ−９阻害作用を宵するポリペプチドの投与または発現は、Ｃ３ｂ−９を介する凝固促進および血栓促進応答から被検体をその方法により防御し得る。

後天性幹細胞障害の発作性ヘモグロビン尿症被検体から採取された血小板は、静脈血栓の非常に高い危険性により特徴づけられる、液相補体活性化にに対する異常な感受性を示す。

特に、上記インヒビターがそうして内皮細胞の表面に見出されたという発見を考えると、同様の所見が、補体を介する障害の他のタイプにもあてはまり得る。その結果、細胞から精製された、または組換え技術を使用して操作された細胞から発現された、または同様の無視できない活性を有するペプチド部分である上記インヒビタータンパク質の投与は、これらの被検体に障害の強度を緩和するために、投与され得る。

免疫障害、および免疫性血管炎、慢性関節リウマチ、強皮症、汎発性血管向凝固症候群、狼瘉、発作性ヘモグロビン尿症、血栓性血栓崩壊性紫斑病（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｅ　ｔｈｒｏ＋ｔｂｏｌｙｔｉｃ　ｐｕｒｐｕｒａ）、血管閉塞、手術後の再閉塞、冠動脈血栓症、および心筋梗塞のような疾病の被検体の処置は、凝血促進過程を抑制する上記で定義したＣ３ｂ−９不活性化物質を含有する組成物の有効量を投与することで達成される。

輸血された血球、骨髄由来あるいはそれに含有し、移植に使用される始原造血幹細胞、または移植された器官または組織の場合、Ｃ３ｂ−９に対する精製された膜インヒビター、すなわち機能の等しい、ポリペプチドまたは抗体がまず細胞表面上にコーティングされる、すなわち受容体への移植または輸血前に上記の前駆細胞に遺伝子が導入される。上記前駆細胞は、受容体とした器官と同じ種から、または受容体の種のＣＤ５９をコードする遺伝子が、マイクロインジェクションのような当業者に周知の技術を使用して胚中に導入された異種のトランスジェニック動物から導入され得る。このような処置を要する被検体に投与されるべき組成物の量は、特定の障害または疾病および苦痛の程度に依存して変化する。投与量は、処置に対する反応、遺伝的変異性、および同時に投与する薬剤に依存しても変化する。しかしながら、一般的に、本明細書に開示された組成物は、ミリリットルあたりおよそ数ナノグラムの阻害タンパク質またはペプチドの用量、すなわち少なくともｉ　ｘ　ｉｏ３分子／細胞または１分子のＣＤ　５９／μ１２の濃度で表面発現の為に使用される遺伝子発現で、静脈中に投与される。

処置は、組成物の１回の投与形式を取り得、または、必要により、定期的にまたは長期にわたり連続的に投与され得る。

免疫障害または疾病の処置には、Ｃ３ｂ−９不活性化物質は、生理食塩水または生理的に受容可能な緩衝液のような薬学的に受容可能な担体中で、静脈内へ投与される。いくつかの場合では、効果を最大にするため、遺伝学的に操作された細胞と共にＣＤ５９を投与することが有利であり得る。

単離された、Ｃ３ｂ−９を阻害する適切な３次構造を有する機能的に活性のポリペプチドは、止血効果を増大しおよび血液および血小板の！Ｉｉ製物のインビトロでの保存時間を延長する効用を有する。インビトロで保存される血小板の半減時間および治療効果を延長するという大きな要望がある。血小板を含有する溶液、特に血小板リッチ血漿（ＰＲＰ）は、輸血に関する医学上の多大な需要がある。現在の血小板調製物の貯蔵寿命は、約７２時間である。このような調製物の有用な寿命の増加は、本技術分野の大きな進展を意味し、そして切迫したヒトおよび医学上の要望に答える。

移植のためのヒトの器官および組織の場合、Ｃ３ｂ−９不活性化物質は、インビトロでの保存の間、進行する補体活性化から血管内層細胞を防御するために、潅流液または貯蔵培地に添加され得る。さらに、これらの内皮細胞を、膜に固定されるＣ３ｂ−９不活性化物質でコーティングすること、または、以下に、より詳細に記載するＣ３ｂ−９不活性化物質を発現するために、その遺伝子を細胞中に挿入することにより、器官または組織は、移植により開始される補体活性化由来の細胞溶解および血栓性の影響から防御され、それにより補体を介する急性拒絶反応を阻止する。

Ｃ３ｂ−９不活性化物質が単独で投与される、好適な実施態様では、Ｃ３ｂ−９不活性化物質は、血小板中またはＰＲＰ中の濃度が、ナノグラム程度の不活性化物質／ｍｌである、ＡＣＤＳＣＰＤ、ヘパリン、またはシック酸塩のような抗凝固剤と共に投与されるか、または、少なくとも１×１０３コのインヒビター／＋ｘｌの濃度で発現する。同様に、器官の保存の為に、上記Ｃ３ｂ−９不活性化物は、濃度がナノグラム程度の不活性化物／ｍｌになるように、潅流液または貯蔵溶液、または培地と共に投与される。

インビトロで貯蔵される血小板調製物の貯蔵寿命を延長するのに有用な組成物は、Ｃ３ｂ−９を介する血小板活性化を阻害するのに十分な量のＣ３ｂ−９インヒビターを含有する。一般的に、これらの組成物は、調製物中の阻害ポリペプチドの最終濃度が、溶液中で２Ｋｉ（Ｋｉ・最大阻害の半分の濃度）の不活性化物質よりも大きい範囲になるように、血小板リッチ血漿のような血小板調製物に、添加される。ＣＤ５９および膜結合ドメインを取り込まれた他のポリペプチドについては、治療学的に有効な用量は、１μｇ不活性化物／ｍｌより少ないか、またはせいぜい１×１０３分子不活性化物／血小板または他の細胞、である。有用な組成物は、さらにシック酸塩、クエン酸塩、およびへ１＜リンのような付加的な抗凝血剤を含有し得る。組成物を含有する上記Ｃ３ｂ−９インヒビターは、採集された全血、または血液からの血小板濃縮物を単離する処理後、それが血小板調製物に、添加され得る。

上記タンパク質に関するｍＲＮＡ転写物のレベルを増大することにより原形質膜でのこれらの補体インヒビターの表面濃度を増加することで、注入または組織器官移植後上記細胞は、活性化された補体Ｃ３ｂ−９から、防御される。

（以下余白） ■、細Ｉ口１末上記の操作された細胞が、補体系による攻撃を阻止し、ならびにＴ細胞系を回避することから、上記細胞およびそれらの後代は、理論上、本質的に無期限に、宿主生体内で存在し得る。上記宿主から、これらの細胞を除去することが所望される場合も起こり得るので、さらに遺伝子工学技術が好ましく実施され、上記細胞に、内的な「自己破壊」または「自殺」機構が与えられる。

一般的用語として、このような機構は、細胞環境下に通常では存在しない試薬に対して、該細胞の致死感受性を付与する、一般には酵素である、タンパク質を発現させる遺伝子を該細胞内に含有すること、を伴なう。例えば、細菌のシトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）は無毒の薬剤５−フルオロシトシンを５−フルオロウリンルに変換し、これは次いで細胞内で、５−フルオロウリジン−５°−トリホスフェートおよび５−フルオロ−２°−デオキシウリジン−５−モノホスフェートに変換される。これらは、ＲＮＡおよびＤＮＡいずれの合成も阻害し、その結果、細胞死を引き起こす。このことは、Ｍｕｌｌｉｎら、１９９２年、ヒ匹−Ｊ紅上−紅ａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　８９：３３−３７に、　［細菌のシトシンデアミナーゼ遺伝子の哺乳動物細胞への転移は５−フルオロシトシンに対する致死感受性を付与する：負の選抜システム」として報告されている。

従って、ドナー内皮細胞のゲノムに細菌のＣＯＤ遺伝子を挿入することにより、宿主組織に、５−フルオロントシンを単に投与するだけで、任意の所望される時に、細胞死が、果たされ得る。細菌のＣｙＤ遺伝子の配列は公知であり、従って、ドナー内皮細胞内への上記遺伝子の組み込みは、上記ＣＤ５９遺伝子を挿入するのに使用されたのと同様の手法で、予め形成され得る。

現在知られているか、または、続いて同定される、その他の遺伝子であって、選択された物質に対して致死感受性を付与する遺伝子もまた、本目的のために、使用され得る。

■、１床煎１月以上で論じたように、上記操作された細胞は、細胞置換または薬剤投与に使用し得る。

冠動脈疾患の療法例えば、冠動脈疾患は、心臓への酸素および養分の送達を減少させる、血管内側の遮断により発生する。冠動脈遮断（こ対する現行の療法は、血管形成術上のｔ（７レーンを用０て遮断された血管を内側から機械的に広げること、もしくは、／＜イパスで置き換えるかまたは上記遮断の周囲に新たな通路を形成するために、合成の移植片、または伏在静脈の断片、のような代用管を使用すること、のいずれかである。

冠動脈の血管形成術は、脚の血管から冠動脈までの、カテーテルの挿入、および、アテローム性動脈硬化の斑を広げるための、上記カテーテルの先端でのバルーンの膨張を包含する。このバルーン膨張は残念ながら、血管の内層から内皮細胞を剥離するという、望まれていない副作用を有する。

臨床上の実施に関しては、血管形成術後の処置した管の再閉塞、いわゆる再狭窄は、それが上記処置が実施されたうちの３０〜５０％に６力月以内に生じ、そして実際の被検体の罹病率およびヘルスケアのための支出に関連することから、重要な医学上の問題である。上記再狭窄の根本原因は、内皮細胞によって供給される抗血栓性の表層の欠如に基づく急性の血栓の形成、ならびに血行性細胞による、抑制されていない平滑筋細胞の刺激に基づく、およびさらに、上記防御内皮細胞層の欠如に基づく、新生内膜の形成、にある。

心筋の残余を供給する、遮断された血管周囲の血流を迂回させるため、代わりのバイパスを使用する、冠動脈のバイパス移植片外科手術は、冠動脈内の血流の遮断物の除去を伴わない。伏在静脈の一部が上記バイパスを形成するのに使用される場合、内層の内皮細胞は通常、管壁からはぎ取られ、そして血管壁の平滑筋細胞が損傷する。

内皮層の欠如は、血液凝固阻止表面の欠如、重要な平滑筋細胞調節力の欠如および血小板、単球およびリンパ球から平滑筋細胞を保護する防御管壁の被覆の欠如、を包含する、種々の重大な内皮の性質の欠如を引き起こす。上記血管のこの治療上の損傷に続（応答は、二つの部分からなる＝　１）管腔を完全に修復するための、損傷部の端からの内皮細胞の生理学的かつ有益な移動、そして２）上記新生内膜の形成および関与後の閉塞を引き起こす、血管壁の内部から管腔への平滑筋細胞の病態生理学的な移動、である。

末梢の動脈および冠動脈バイパス移植片の閉塞は、頻繁かつ重大な臨床的所見である。伏在静脈の冠動脈／　ＸＩイ１＜ス移植片の３分の２は、深刻に病んでいるか、またはノくイ、ｆス外科手術後６から７年後までに完全に閉塞するかのｌ、Ｎずれかである。末梢の動脈のバイパス移植片は、一般的に２から５年以内に、閉塞を起こす。

合成移植片もまた、高率の閉塞が表れる。初めのうちは、このようなタイプの移植片は内皮生成がされない。このことにより、血栓に基づく早期閉塞が実際に発生する。時が経つにつれ、上記移植片は、近位および遠位の吻合部からの内皮細胞、または多孔性の合成移植片を通って管腔表面上に、内殖する毛状内皮細胞からの移動により、部分的基こ再内皮生成する。しかしながら、内皮細胞移動のプロセスは通ｉｔよ遅く、動脈内皮細胞による上記移植片の全被覆は、可能で番よな（Ａｏさらに、内殖する毛状内皮細胞は、血餅形成を阻害する能力は、動脈の内皮細胞よりも低い。自己由来の内皮細胞とともに周辺の移植片を再移植させる試みは、移植期の移植片の不完全な被覆が移植片閉塞を招く結果となること、そして移植手法の臨床的利点の欠如を立証している。

本明細書に記載の遺伝学的に操作された細胞は、再血管新生上のこれらの臨床的問題に取り組むための重要な機構を提供する。これらの細胞は、被検体の免疫系による重大な拒絶を受けないで、露出した管または移植片が再内皮生成するのに使用され得る。さらに、上記細胞は、外科手術の操作前に多数に増殖し得るので、露出した管またはむき出しの移植片の広範囲の被覆のための、充分な供給量が入手できる。これに関連して、さらに内皮細胞に関した遺伝子工学技術が、同時係属出願第０７７８２０．０１１号、１９９２年１月６日提出、名称「増強された移動およびプラスミノーゲン活性化因子活性を示す遺伝学的に操作された内皮細胞」（この中の教示は本文中に組み入れられてる）に従い、ドナー内皮細胞の移動の比率が増大するよう、そしてより急速に再内皮生成が達成されるように、実施され得る。

被検体の冠動脈内に万能ドナー内皮細胞を移植する、典型的操作は、以下の通りである：１、血管形成術、アテレクトミー（ａｔｈｅｒｅｃｔｏＢ）、レーザー療法、または機械的な他の型の再血管新生術による、冠（または周辺の）動脈疾患の重篤度、位置および影響度を決定するために、被検体へ診断的にカテーテルの挿入を実施すること。

２、工程（１）により、治療掌上の血管形成術が適切であると測定されたときには、通常のバルーン血管形成術操作を実施すること。

３、液体窒素保存から、本明細書中に記載の遺伝学的に操作された内皮細胞を取り出し、３７°Ｃで上記細胞を解凍し、そして滅菌した緩衝培地中へ懸濁することにより、血管形成術操作のための装置にそれらを供する＊＊を行なうこと。

４、一般的なワイヤー交換方法を用い、バルーン血管形成カテーテルを除き、二つのバルーン間に置かれた脱出ポートを有する二つのバルーンカテーテルを上記カテーテルと置き換えること。

５、上記露出した動脈セグメント、すなわち、血管形成操作により内皮層が除去された動脈の部分を跨ぐ上記二つのバルーンカテーテルを用いて、上記二つのバルーンカテーテル先端を血管形成術を施された冠動脈内に配置すること。

６、標準的な環流技術で、遠位の冠動脈循環を支持する間の上記二つのバルーンを緩やかに膨張させること。

７、上記遺伝学的に操作された細胞を、上記二つのバルーンカテーテルの体外末端へ導入すること、そして、血管の露出した部分に接種するため、上記二つのバルーン間の血管の隔離された領域へ、例えば、溶液１０ミリリツトルあたり２〜１０ＸＩＯ６細胞数濃度で、上記細胞を注入すること。

８、およそ２０から３０分後に、上記二つのバルーンカテーテルを収縮させて、正常なアンチク’　ｋ−）’　（ａｎｔｅｇｒａｄｅ）冠動脈環流を復帰させること。

９、上記二つのバルーンカテーテルを除去し、そして標準的なカテーテル挿入後処理を行なうこと。

同様に、合成または自己由来の、血管移植片またはステントは、遺伝学的に操作された内皮細胞で被覆され得、そして以下の操作により被検体に移植され得る：１、自己由来、合成、または他の移植材料を用いて、血管バイパス外科手術による冠（または周辺の）動脈疾患の重篤度、位置および影響度を決定するために、被検体へ診断学的カテーテル挿入を実施すること。

２、合成の移植片またはステント、例えばＤＡＣｌ？ＯＮ　マたハステンレススチール製の、移植片またはステントの場合には、上記移植片またはステントを、ｐＨ９，４炭酸緩衝液中２５１ｇ／■１以上の飽和量の、■型コラーゲンおよびフィブロネクチンにより被覆すること；あるいは自己由来の移植片の場合には、従来の外科的技術を使用し、伏在静脈または他の管を採取すること。

３、上記合成または伏在静脈の移植片の近位末端にカニユーレを挿入し、モして遠位末端を結紮すること。

４、液体窒素保存から、上記遺伝学的に操作された内皮細胞を取り出し、３７° Ｃでそれらを解凍し、そして滅菌した緩衝培地中へ懸濁することによる、移植片移植に供するためにそれらを準備すること。

５、例えば、溶液１０ミリリツトルあたり２〜ｔｏｘ　ｉｏ６細胞数濃度で、上記操作された細胞を、近位のカニユーレ挿入口から上記移植片管腔内へ注入すること、およびおよそ６０分間、上記移植片を回転させて、上記万能ドナー細胞により上記移植片の表面を被覆させること。

６、一般的な繊細な外科技術を使用し、上記接種された移植片を、冠動脈または周囲の動脈へ移植すること。

細胞置換のためのそれらの使用に加えて、遺伝学的に操作されたこの内皮細胞は、細胞移植部位への局部的または全身のいずれについても、治療薬剤の投与のための優れた機構を提供する。これらの細胞はさらに、管または移植片壁の再狭窄を阻害するように、ＰＤＧＦまたはＦＧＦの、アンタゴニスト、血栓溶解剤、またはＦロンビンアンタゴニストも分泌し得る。

万能ドナー内皮細胞を介する全身系の薬剤送達は、容量に比べて相対的に広い表面積を有することを包含する幾多の利点を示す遺伝学的に操作された微細血管の（毛細血管の）内皮細胞の使用により、特に、以下に記載されるような、上記細胞が毛細血管網へ接種される時、および拡散の妨げが何もない治療学的なタンパク質産物の直接分泌時に、さらに効果的に完成され得る。本方法により投与され得る薬剤タイプの例には、血液凝固因子群、凝固溶解因子群、ホルモン類、成長因子群、サイトカイン類、酵素類、およびコレステロール結合または除去タンパク質が包含される。いずれの場合も、移植の前に、適切な遺伝子または遺伝子の組合せが、上記ドナー内皮細胞のゲノム内に、挿入される。

例えば、ブタ起源の、このタイプの細胞の単離の典型的操作は以下の通りである：１、無菌的に雄のブタからまず取り出した副畢丸脂肪褥および／または腎臓からブタ微細血管内皮細胞（ＰＭＥＣ）を単離する。

これを行うために、上記器官または組織を、１４０ｍＭ　ＮａＣｌ、　１０ｍＷ　ＨＥＰＥＳ、　ＬｈＭ　ＫＣｌ、０．１ｍＭ　ＣａＣｌ２、０．２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、ｌ１ｇ／す、トルＮａＨＣＯ３，５，０ｇ／リットルグルコース、１００Ｕ／＋Ｉヘ−１−シＩＪ　７、および１００ＩＪ／ｍｌ　ストレプトマイシンを含有する滅菌ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐ）１７．４）中に入れる。腎臓については、腎周囲の脂肪を切除し、そして腎臓を上記の滅５１）ＩＥＰＥＳ緩衝液に入れる。

２、大きくて目に見える血管は、副畢丸脂肪から切除し、そしてその脂肪は、滅菌ＨＥＰＥＳ緩衝液に入れる。上記脂肪組織は、少量の滅ＩＩＨＥＰＥｓ緩衝液を含有する５ｈｌの滅菌のＦａｌｃｏｎ製「ブルーマックス」チューブに入れ、そしてその脂肪を、３から５分間、はさみで細かく切り刻む。

３、細かく切り刻まれた組織は、５　ｍｇ／ｍｌのフラゲナーゼおよび５　ｍ１ｇ／ｍｌのラン血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する滅菌ＨＥＰＥＳ緩衝液を、同量ずつ含有する複数の５ｏ■ｌ三角フラスコに入れる。上記フラスコを、２０分間、攪拌しながら３７℃でインキュベートする。その後、各フラスコから、２０分毎に少量の部分標本（０，１ｍ１）を取り出し、次いで、毛細血管床のチューブ状の断片の出現を確かめる。上記インキュベーン１ンは、細かく切り刻まれた組織の大部分がチューブ状の断片および単独の細胞を含むようになるまで続ける。

４、上記細胞懸濁液は、１５ｍ１コニカルチユーブ中で７分間、２００Ｘｇで遠心分離する。そして最上部白色脂肪層は、吸引除去し、そしてベレットは、１０％ＢＳＡを含有するＨＥＰＥＳ緩衝液に再溶解し、次いで再遠心分離、再溶解をさらに２回行なう。

５、ｊ！終のペレットは、４５％パーコールに再溶解し、ＳＳ３４固定アングルローター中で４℃、２ｏ分間、１５．ｏｏＯＸｇで遠心分離する。上記ＰＭＥＣの塊は、最上部の最も含脂肪細胞を含有する層の真下であり、より大きな電断片を含有する半透明層の上の、乳状のオフホワイト色層に存在する。上記微細血管の塊および遊離の内皮細胞は、滅菌ピペットで収集し、次いでＨＥＰＥｓ−ＢＳＡ中で、３分間、２００Ｘｇの遠心分離によりベレットにする。上記塊は、培地（２０％熱失活ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、５■Ｍ　ＨＥＰＥＳ、　５■Ｍピルビン酸塩、および５■Ｍグルタミンを含有する、１９９Ｅ培地と、１０％ＦＢＳを含有する同様の培地とをｌ：１で混合し、密集した内皮細胞培養物のインキュベートにより４８時間調製した培地）に再懸濁する。

６、次いで上記細胞を、１．５％ゼラチンを含むＰＢＳで一晩被覆した組織培養フラスコに接種する。

７、次いで上記ＰＭＥＣ培養物を、３７℃で５％ＣＯ２，９５％に過湿された空気でインキュベートする。上記ＰＭＥＣは、定期的に、プレートから細胞を取り除くため、および細胞凝集を分離させるために０．０２％トリプシン、ＥＤＴＡを含むＣａ”、Ｍ　ｇ　２　’フリーのＰＢＳを使用して、集密継代する。

８、トランスフエフシラン／感染に供する細胞を、１から４の分割比で、１．５％ゼラチンを含むリン酸塩緩衝化生理食塩水で一晩被覆した７Ｆ＋＋＋ＩＣｏｒｎｉｎｇ製組織培養フラスコ上にブレーティングする。−晩培養後、上記細胞を、ＣＤ５９について、上に記載したように、トランスフェクション／感染させる。

９、上記遺伝学的に操作された内皮細胞は、必要になるまで液体窒素中で凍結および保存できる。

１０、上記遺伝学的に操作された細胞を細胞ネットワークに接種するため、その操作された細胞を、まず、中和した酸溶解■型コラーゲン（子ウシ真皮から単離された）の５■ｇ／ｍｌ溶液に、４°Ｃで、コラーゲン溶液１．ｍｌあたり３．０Ｘ１０’の濃度に分散させる。この混合物を２４ウ工ル集合ディツシュに各ウェル０．７５１１ずつブレーティングし、そして３７℃、５％ＣＯ２，９５％に過湿された空気条件のインキュベーター内に入れる。上記コラーゲンのゲル化に続いて、培地をそのゲルに導入する。上記細胞を次いで上記のように培養し、上記細胞に毎日、再給餌する。３日後、上記ゲルをディツシュがら、滅菌テフロンＴｈ細胞スクレーパーを使用してかきとり、そしてＢａ１ｌｃｏ”４リツトル浮遊培養管に１週間移しておき、そして必要になるまで液体窒素中で凍結および保存する。

それらの、宿主免疫系に対する多重レベルの防御により、上記操作された内皮細胞は、通常の非自己由来細胞移植に関連する移植片拒絶を防ぎ、したがって、例えば上記で説明したタイプの自己破壊により宿主から除去されるまでの、実質的な期間に、それらにコードされる治療学的な薬剤の投与に使用され得る。

本発明を、以下のこれで限定するものではない実施例によ−リ、さらに詳細に説明する。

実施例１：ヒト補体阻害タンパク質、特にヒトＣＤ５９または機能的に同等のポリペプチド、の哺乳動物細胞での発現方法特にＣＤ５９を引用して記載するが、これらの方法は、等しく、ＣＤ５　ＳおよびＣＤ４６に適用可能である。

Ｌｕ：　ヒト補体タンパク質Ｃ３ｂ６、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９を精製し、Ｗｉｅｄｍｅｒおよび５１ｍ５．　Ｊ、　Ｂｉｏ上Ｃｈｅｗ、　２６０、＋１０１４− ８０１９（１９８５）に記載の方法に従って、機能的活性を解析した。補体タンパク質Ｃ３（Ｃ’Ｄ）ならびにヒト補体タンパク質Ｃ８およびＣ９のヒト血清の欠失は、５ｉＩｌｓ、　Ｐ、　Ｊ、、旺匹鳳肚牡ＬＸ　２３，３２４８−３２６０（１９８４）、およびＣｈｅｎｇ、　Ｋ、ら、Ｊ、１ｍｍｕｎｏ１．１３５，４５９−４６４（１９８５）、に従って調製およびアッセイした。メトトレキセートは、ＬｅｄｅｒｌｅＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｒｏｌｉｎａ、　Ｐｕｅｒｔｏ　Ｒｉｃｏ）から購入した。ＢＣＥＣＦ／ＡＭは、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、　ＯＲ）から購入した。トグリカナーゼは、Ｇｅｎｚｙｍｅ（Ｃａｍｂｒｔｄｇｅ、　ＭＡ）から購入した。他の全ての化学物質は、試薬または分析グレードである。

血液：ハンクスノ平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）は、Ｔｈ１ｔｔａｋｅｒ　Ｍ、Ａ、　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ（ｆａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、　ＭＤ）から購入し、そして１％（ｖ／ｖ）の脂肪酸フリーウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｌａ製）溶液を作成した。

乳体：ＣＤ５９に対するモノクローナル抗体をＤｒ、Ｍｏｔｏｖｏ　Ｔｏｍｉｔａ（昭和大学、東京）から入手した。ヒト赤血球ＣＤ５９に対する単一特異性ウサギ抗体のＦａｂフラグメントは、５ｉＩｌｓ、　Ｐ、Ｊ、、Ｒｏｌｌ　ｉｎｓ。

Ｓ、Ａ、、およびＷｉｅｄｍｅｒ、　Ｔ、（１９８９）が記載したように調製した。

Ｃ６０膜に反応するウサギ血清は、培養ＣＩＯ細胞由来の細胞膜を繰り返し注入することにより調製し、そしてそのＩｇＧ画分（抗Ｃｌ０）は、プロティンＡ− セファロース（Ｓｉｇｍａ製）を使用したアフィニティー精製により調製した。

ウサギ抗ヒト赤血球は、Ｃａｐｐｅｌ（ＣｏｃｈｒａｎｖｉｌｌｅＳＰＡ）から購入した。

Ｃ３ｂ−９を　る　ンパク　ＣＤ５ｇ＝Ｃ５ｂ−９を介する活性および溶解を阻害する、１８ｋＤａのヒト赤血球タンパク質、ＣＤ５９、をＳｕｇｉｔａら（１９８ｇ）が記載した方法の変法により単離した。Ｍｏｎｏ−Ｑ”″のＦＰＬＣ（ファルマシア製）ニよりさらなる精製を行った。阻害活性を有するＣＤ５９ポリペプチドはインヒビター特異的抗体の使用により、さらにアフィニティー精製し得る。α−Ｐ１ｇの様な、　Ｃ３ｂ−９インヒビターポリペプチドに結合する抗体は、当業者に周知の技術により、クロマトグラフマトリックス材料に固定化し、上記１８ｋＤａのタンパク質を含有する材料をそのクロマトグラフマトリックスに通し、非結合物質は洗浄により除去し、そして結合した物質は、高塩濃度溶液またはそれに類似の手法で取り出す。Ｃ３ｂ−９を介する凝血促進反応を阻害する能力を有するポリペプチドは、組み換え手法により生産される。ＣＤ５９をコードする核酸配列またはその活性フラグメントは、ヒトｃＤＮＡライブラリー、または好ましくは、本明細書中に記載のクローンから単離される。例えば、ヒ）　ＤＮＡが単離され、制限酵素で切断されて、適切なサイズであり、既知の市販の発現ベクター（例えばＰｒｏ曽ｅｇａ製ラムダｇｔｌｌベクター系）へ結合するための適切な付着末端が付与される。あるいは、上記単離されたＤＮＡを剪断し、そして適切なリンカ−を得られたフラグメントに結合し、次いで選択した発現ベクターに挿入する。

ヒトＤＮＡを含有するベクターを次に、適切な細菌株、通常は、発現ベクターキットに含まれる大腸菌の菌株に導入し、ＤＮＡ遺伝子バンクまたはライブラリーを形成させる。上記ベクターを含有する上記ライブラリーの細菌を適切な培地にプレートして培養することによって、挿入されたヒトＤＮＡフラグメントの発現が起こる。このコロニ一群を、α−Ｐ１ｇの様な特異抗体を使用して、Ｃ３ｂ− ９阻害タンパク質をコードするＤＮＡの存在およびＣ３ｂ−９阻害タンパク質の発現をスクリーニングする。陽性のコロニーを単離し、そして組み換え操作で生産された阻害タンパク質の大規模な発現に使用する。

この様式で、完全な型の阻害タンパク質およびその改変ポリペプチド、機能的フラグメント、および誘導体が、組み換え操作で作成される。三次構造を有し、モしてＣ３ｂ−９を阻害する能力を宵する機能的ポリペプチドが、上記で説明した方法または当業者に通常知られる他の方法で生産され得る。これらの単離され精製されたポリペプチドは、さらに、薬学的に容認し得る担体とａ合され得、長期の細胞保存あるいは免疫異常症または病気の処置に使用する組成物が形成される。

以下の方法は、ＣＤ５９またはそのフラグメントのｃｓｂ−９阻害活性の検出および定量に有用である。

セインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）と結合させた。ネズミＩｇＧに対する、アフィニティー精製したヤギ抗体の１ｊｉＧ画分（Ｓ　ｉｇ＠ａ製）をＦＩＴＣ抗マウ抗マウス１標Ｇした。色素：タンパク質比の範囲は３から６である。全ての場合において、組み込まれなかった標識物（＋２ＪまたはＦＩＴＣ）は、ゲル濾過、次いで完全な透析により除く。

モノクローナル抗体ＩＦＩは、ｌ０ＤＯＧＥＮ”（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｖｉｃａｌ　Ｃｏ１製）により、６２２１ｃｐｍ／ｎｇの比活性までに放射線標識した。

１ヱニＬ１１度：未標識のタンパク質濃度は、以下の吸光係数（Ｅ　”２ｓｅ）より想定して定めた：ネズミＩＫＧ（１５）、Ｃ３（１５，１）およびＣ９（９，６）。

各ＦＩＴＣ標識タンパク質の濃度は、色素結合アッセイ（ＢｆｏＲａｄ製）により、各々の未標識タンパク質をスタンダードとして、測定した。ＦＩＴＣ濃度は、分子吸光（４９２ｎｍ）を６８．．０００と想定して決めた。

ウェスタンブロッティング精製したヒト赤血球ＣＤ５９（１μｇ）およびＣＤ５９が導入されたＣＨＯ細胞由来の抗原を、非還元条件下で、２％ＳＤＳ中で変性（３分、１００℃）し、Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｕ、に、、Ｎａｔｕｒｅ　２２７，６８０−６８５（１９７０）、の緩衝液系を使用して、１５％均質ゲル中で電気泳動した。ニトロセルロースに転写後、１％ウシ血清アルブミンを含むＴＢＳ（１５０ｍＭ　ＮａＣ１，５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，４）を用いて、モノクローナル抗ＣＤ５９抗体（１０μｇ／ｍｌ）またはウサギ抗ＣＤ５９抗体（１０μｇ／ｍｌ）と、２３℃で一晩のインキュベー７ジンを行なうことにより、イムノブロッティングを実施した。プロットを、アルカシフォスファターゼを結合させた、適切な抗ウサギまたは抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ製）の１：１０００希釈液を用いて、生じさせた。

ｃｕｏｍ胞での、　ＣＤ５９ｃＤＮ＾のトランスフェクシ目ンおよび発現Ｐｈｉ　Ｉｂｒｉｃｋ、　Ａ、　Ｅ、ら、Ｅｕｒ、Ｊ、１ｍｍｕｎｏ１．　２０．　８７−９２（１９９０）、（こ君己載された、上ｇ己ＣＤ５９をコードするＥｃｏＲＩフラグメントを、５ｌａｎｅｔｚＪ、Ｍ、およびＢｏｔｈｖｅｌｌ、Ａｉ、ＭＳＥｕｒ、　Ｊ、１ｍｍｕｎｏ１．２１、　１７９−１８３（１９９１）、に報告されたμＦＲＳＶ発現ベクターのＥｃｏ旧部位にサブクローニングした。

この挿入物によりコードされる、上記タンパク質のアミノ酸配列は以下の通りである：ＬＱＣＹＮＣＰＮＰＴＡＤＣＫＴＡＶＮＣ５ＳＤＦＤＡＣＬＩＴＫＡＧＬＱＶＹＮＫＣＷＫＦＥＨＣＮＦＮＤＶＴＴＲＬＲＥＮＥＬＴＹＹＣＣＫＫＤＬＣＮＦＮＥＱＬＥＮＧＧＴＳＬＳＥＫＴＶＬＬＬＶＴＰＦＬＡＡＡＷＳＬＨＰ上記ＣＤ５９タンパク質をコードするｃＤＮＡ塩基配列は、以下の通りである：ＡＴｒＧＣＡＡｍＣＡＡＣＧＡＣＧＴＣＡＣＡＡＣＣＣＧＣＴｒＧＡＧＧＧＡＡＡＡＴＧＡＧＣＴＡＡＣＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＧＡＣＣＴＧＴＧＴＡＡＣＴＴｒＡＡ上記ＦＲＳＶ、　ＣＤ５９　ベクターを５ａｉｌ　（２０ｔｔ　ｇ）で開環し、モしてエレクトロポレーション（２に／Ｖ、２５マイクロフアラツド）により、１０７個のＣＨＯ細胞に導入した。上記細胞を、１０ｍｇ／ｍｌアデノンン、チミジン、およびデオキシアデノシンを含有するイーグルの最小培地（ＧＩＢＣＯ製）にプレートし、１日〜２日間維持した。その後、上記培地を、デオキシヌクレオシドを欠き、代わリニ０．０９μｇ／＋ａｌのメトトレキセートおよび１０％の透析済みウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ製）を含有するイーグルの最小培地と交換した。

２週間から３週間後、個々のクローンを単離し、増殖させ、そして、メトトレキセートのレベルを上げて選抜した。

そしてメトトレキセートを追加した培地での成長により選抜し、次いで図１に示すように、メトトレキセートの増加濃度範囲を１　ａ＋ｇ／ｅｌまで上げていく連続培養によって、増幅した。

トランスフェクトされたＣＨＯ細胞で発現したＣＤ５９およびヒト赤血球のイムノブロッティングを実施した。イムノプロットをモノクローナル抗体ＩＰＩ（１０μｇ／ｍ　ｌ　）およびウサギ抗ＣＤ５９抗体（１０μｇ／■ｌ）により生じさせた。上記トランスフェクトされたＣＨＯ細胞由来のタンパク質は、天然のタンパク質よりも大きい分子量を有していた。

この抗原に対する放射線標識したモノクローナル抗体の特異結合に基づいて、細胞表面のＣＤ５９を０（トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞コントロール）からおよそ４．２ＸＩＯ’分子／細覧胞まで（それらのＣＤ５９トランスフエクタントは、Ｉ　Ｂ／ｍｌのメトトレキセートで維持されている）に増加させた。

Ｃ５９の１２５■標識したＩＦＩの特異結合をＣＤ５９でトランスフェクトされたＣ［ｌＯ細胞により発現するＣＤ５９抗原のレベルの定量に利用した。上記ＣＩＯ細胞（ＣＤ５９トランスフエクタントおよびコントロール）は、４８ウ工ル組織培養プレートに集密して培養し、ＨＢＳＳで洗浄し、次いで１％パラホルムアルデヒドで固定した（１０分、２３°Ｃ）。固定液を除去するだめの洗浄後、上記細胞を、飽和濃度での抗体、１０μｇ／＋ｌの＋２５Ｉ標識ＩＦ１と、３０分間、２３℃でインキュベートした。次いで、上記細胞を、氷冷ＨＢＳＳで６回洗浄し、そして細胞に結合する抗体を４％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で溶出した。放射活性は、光子計数で計測し、そして２０倍過剰の未標識抗体の存在下での計測で、非特異結合について補正を行なった。ＣＤ５９トランスフエクタントのデータは、トランスフェクトされていないＣ）１０細胞コントロールに比較して表面抗原の増大を示した。

真核生物発現ベクターｐＦＲ３Ｖ中のヒトＣＤ５９ｃＤＮＡのサブクローニング、およびエレクトロボレーシコンによるＣＨＯ細胞のトランスフェクションは、通常はＣＤ５９および１（ＲＦを発現しな０細胞中で、ＣＤ５９が発現し得、そして補体を介する細胞溶解に対する防御を与えることを示す。ｐＦＲｓＶは、メトトレキセート濃度に依存する方法で、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子座に隣接した上記ＤＮＡを、漸増的に増幅させるため選択されたが、他のベクターもまた、ｐＦＲｓＶ−ＳＲαのように使用し得る。

上記ベク９−ｐＦＲｓＶは、メトトレキセートを含有する培地での選抜による遺伝子増幅後の発現増大に効果的に使用されている。上記プラスミドベクターｐＦＲＳＶ−ＳＲαは、導入したｃＤＮＡの発現を駆動する、より強いプロモーターを有する。ｐｃＤＬ−８，−Ｒ（！　２９６（Ｔａｋｅｂｅら、Ｍｏ　ｅｅ、Ｃｅ１ｌ　Ｂ　ｏ　、８：４６６−４７２（１９８８））の５ａ１１−ＥｃｏＲＩフラグメント（８００ｂｐ）を、５１ａｎｅｔＺおよびＢｏｔｈｗｅｌｌ、（１９９１）に記載のｐＦＲｓＶのＨｉｎｄ　ｍ　−ＥｃｏＲ１部位に挿入した。このプラスミドは、上記ｐＦＲｓＶベクターよりも、ＣＤ５９および他の挿入されたｅＤＮＡの発現の基礎レベルがより高い。

哺乳動物細胞における発現は、特に内皮細胞では、レトロウィルスベクターを利用する感染によって、達成され得る。

トロポレーションよりも、さらに穏やかで効果的である。選抜のための異なる薬剤抵抗性マーカー類を有するレトロウィルスは、内皮細胞での発現のために多重なｃＤＮＡを導入する手段を提供する。この目的のために現在開発下にあるレトロウィルスは、選抜マーカーとして、ネオマイシン（ｎｅｏ）、ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｇｙｃ　ｉｎ）およびヒスチジノールの使用を包含する。これらの抵抗性遺伝子の全てがＢａ１１旧フラグメントに利用でき、そして、あるベクターの抵抗性を変えるために、容易にレトロウィルスベクターに挿入され得る。

ＤＩ（ＰＲ遺伝子もまた、レトロウィルスベクターに利用できる。上記ＳＲαプロモーターまたはレトロウィルスＬＴＲ（長末端反復）プロモーターにより駆動されてＣＤ５９を発現するレトロウィルスも利用され得る。

異なる薬剤抵抗性マーカー類を有するレトロウィルスの使用は、ＣＤ５９と、ＤＡＦ（ＣＤ５５）またはＭＣＰ（ＣＤ４６）のいずれかとの共発現を容易にし得る。内皮細胞活性の減少化に、ＣＤ５９との共発現は、ＣＤ５９単独よりも、より効果的である。上記レトロウィルスベクターにとって薬剤抵抗性を有するということは、望ましいことではあるが、本質的なことではない。レトロウィルスは、単独のウィルスからＣＤ５９、およびＣＤ５５またはＣＤ４６の両方を発現するように発達され得る。３種の補体調節タンパク質ＣＤ５９、ＣＤ５５およびＣＤ４６をすべて発現するために異なる薬剤マーカー類を有するベクターの利用もまた可能である。

組み換えＣＤ５９、天然のＣＤ５９および脱糖鎖ＣＤ５９の分子量比較ＣＤ５９でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（１１１８７ｍｌメトトレキセート存在下の培養により増幅された、ＣＤ５９の発現）由来の膜タンパク質を２％トリトンｘ１００．２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　１ｈＭ　ＥＤＴＡ、　５０ｍＭペンザミンン、２００ｍＭ　Ｎ−エチルマレイミド、１ｏＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、ｐＨ７，４で抽出した。１１，０００ｘｇ、５分の遠心分離により、不溶物質を除去した後、この洗浄剤抽出物を１０倍に希釈し、そして、アフイーゲル１０　（Ｂ　１ｏ−Ｒａｄ製）に固定化された抗体を使用するイムノアフィニティークロマトグラフィーにより、ＣＤ５９抗原を精製した。抗原は、１Ｍクリシン、０．２％　）　’Ｊ　）　：／Ｘ−１００，１０＋ｍＭ　ＥＤＴＡ、　５０ｍＭ　ヘ７ズアミジン、２００ｍＭ　Ｎ−エチルマレイミド、ＩＩＩＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、ｐＨ３，０で溶出し；　２００ｍＭ　リン酸ナトリウム、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、　５ｈＭベンズアミジン、２００ｍＭ　Ｎ−エチルマレイミド、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、ｐＨ８，６で透析し；そして２００μｇ／ａｌに濃縮した。還元条件（０，５％ＳＤＳ、　１００１１Ｍβ−メルカプトエタノール；１００℃、３分）下での変性後、イムノアフィニティー精製したＣＤ５９を、３０１ニブ）／ｍｌのＮ−グリカナーゼと、１０ｖＭ　１．１０−フェナントロリンの存在下で、インキュベート（３７℃、２４時間）し、そして、８〜２５％５ＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｐ［ＩＡＳＴシステム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ、）後に、銀染色法により、解析した。

図２に示すように、これらの細胞の表面で発現する組み換えＣＤ５９は、糖脂質アンカーを介する膜への結合と両立する、ホスファチジルイノシトール特異的ホスフォリパーゼＣ消化による除去が可能であった。１．０Ｂ／ｍｌメトトレキセート下で維持された、集密した単層のＣＤ５９でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、Ｔ−２５組織培養フラスコからＶｅｒｓｅｎｅ／ＥＤＴＡ（ｌｉｔｔａｋｅｒ　Ｍ、Ａ、　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いて遊離した。洗浄およびＨＢＳＳ中に２×１０６細胞／冒ｌに懸濁した後、これら細胞を１．Ｏｌｌニラ／ｍｌホスファチジルイノシトール特異的ホスフオリノイーゼＣ（ＩＣＮＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）に、または、コントロールとして酵素を希釈した緩衝液にさらした。３７℃、１時間のインキュベーション後、各細胞懸濁液２５μｍを２５μｌのモノクローナル抗体ＩＦ１（ＦＩＢＳＳ中の最終濃度が１０μｇ　ＩＦＩ／■ｌ）を含有するチューブに添加した。４ ℃で３０分間インキニベー７−Ｊンした後、ＦＩＴＣ抗？　ウスｒｇＧを１０μ ｌ添加しく最終濃度が８７μｇ　ＩｇＧ／ｍｌ）、そして細胞をさらに２３℃、１５分間インキュベートした。

細胞表面のＣＤ５９を、モノクローナル抗体ＩＦＩの特異的結合により定置し、対数増加にセットしたＦＬｌ蛍光チャンネル（５２Ｇｎ■）でのＦＡＣＳＣＡＮ（ＢｅｃｔｏｎＳＤｉｃｋ４ｎｓｏｎ　＆　Ｃｏ、）フローサイトメーターにより測定した。

ウェスタンブロッティングにより、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞で発現したＣＤ５９は、ヒト赤血球に存在するＣＤ５９（見かけの分子質量が１８〜２１ｋＤａ）よりも５ＤＳ−ＰＡＧＥ上の移動の明確な遅延を示したく見かけの分子質量が２１〜２４ｋＤａ）。アスパラギンに結合した炭水化物を除去するためのＮ−グリカナーゼによる消化後、ＣＨＯトランスフェクタントから単離した組み換えＣＤ５９、および、ヒト赤血球から単離したＣＤ５９は、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより、見かけの分子質量１２〜１４ｋＤａに共に移動した。

ヒトＣ３ｂ−９の小孔形成活性に対する、ＣＤ５９でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の防御トランスフェクトされたＣＦＩＯ細胞内で発現する組み換えＣＤ５９の機能的活性を、細胞内蛍光色素措示薬ＢＣＥＣＰ−ｒＡＭを使用する補体を介する色素放出のアッセイにより、評価した。図１に示すように、メトトレキセートの種々の濃度での生長による遺伝子発現を漸増的に増幅する能力を利用して、ＣＤ５９抗原レベルとＣ３ｂ−９阻害活性との相互関係を評価した。

を各メトトレキセートａ度での安定した発現が達成された後、８ＣＥＣＦ／ＡＭ色素放出アッセイを使用して、上記ＣＤ５９でトランスフェクトされた細胞のヒト血清補体に対する感受性を試験した。ＢＣＥＣＦ／ＡＭ（１５μＭ〉とのインキュベーションそして洗浄後、集密した単層を５　ｍｇ／ｍｌのウサギ抗ＣＨＯＩｇＧ、および細胞膜上にＣ３ｂ−６７を沈積させるために２５％Ｃ８Ｄとインキュベートした。

その後、１０璽Ｍ　ＥＤＴＡを含有するヒト血清を、Ｃ８およびＣ９の供給源として添加した。上清への色素の放出は、３７°Ｃで１５分経過した後に、調和させたコントロールで得られる非特異的放出による補正と合わせて（Ｃ８Ｄとのインキュベーンジンでは省略したが）、測定した。

図３に示すように、ＣＤ５９の発現の高い増幅により、ヒト血清補体の免疫活性化により誘導される色素の放出に対するトランスフェクトされたＣ）１０細胞の感受性の目立った低下が生じた。２００μｇ／ｍ　Ｉメトトレキセート存在下で生育させた細胞（１細胞あたりおよそ１．２Ｘ１０６分子のＣＤ５９はどの細胞表面発現の増幅を示す）では、たとえより高濃度の血清（７５％）を供試しても、全く補体を介する色素放出が認められなかった。

補体阻害活性を立証するために、トランスフェクトされたＣｌｌ０細胞のＣＤ５９の発現を５０μｇ／＋＊　Ｉのメトトレキセート存在下で生育させることにより増幅させ：上記細胞をＢＣＥＣＦ／ＡＭとのインキュベーションにより色素で充填し；そして図３に示すように、Ｃ３ｂ−６７を沈積させた。洗浄後、上記細胞を、ＣＤ５９に対グメント）とインキュベートした（４°Ｃ１３０分）。結合していない抗体は除去し、Ｃ３（１μｇ／ｍｌ）および多様な量の０９を添加し、そして３７°Ｃで１５分経過した後に、色素の放出を測定した。

ＣＤ５９発現ＣＨＯ細胞で認められた補体を介する膜損傷に対する抵抗性は、補体小孔についての０９依存的活性を反映し、そしてこの阻害は、ＣＤ５９抗原に対して向けられる機能的な遮断抗体のＦａｂフラグメントと細胞との前インキ二ベーンヨンにより、消失した。ＣＤ５９トランスフエクタントに認められるヒト血清補体に対する防御が、細胞表面でのＣＤ５９発現に関係し、メトトレキセートとの長期の培養により誘導され得る、これら細胞内での他の変化には基づいていないことを、これらのデータは明確に示している。

ＣＤ５９でトランスフェクトされたＣ■０細胞により発現された補体阻害機能のヒト選択性ヒト赤血球、および、ヒト赤血球由来の精＆ｌＣＤ５９抗原で再構築された膜で認められる、溶解に対する橿選択的抵抗性に類似の様式で、ＣＩ）５９でトランスフェクトされたＣＩ（Ｏ細胞は、ヒトＣ３ｂ−９タンパク質の影響から選択的に防御される。これらの研究では、Ｃ３ｂ−９複合体中の０８およびＣ９成分の供給源として、ＥＤＴＡを含有するヒトまたはモルモット血清とのインキュベージコンの前に、抗ＣＨＯＩｇＧおよびヒ）　Ｃ８Ｄを、ＣＨＯ細胞の原形質膜上にヒ）　Ｃ３ｂ−６７複合体を沈積させるため使用した。

トランスフェクトされたＣＨＯ細胞によるＣＤ５９の発現を、種々のメトトレキセート濃度での生育により増幅させ、上記集密した単層をＢＣＥＣＦ／ＡＭで充填し、モしてヒ）　Ｃ３ｂ−６７を上記のように沈積した。洗浄後、１０ｍＭ　ＥＤＴＡの存在下での、１０％（ｖ／ｖ）ヒト血清（黒塗り記号）または１０％（Ｖ／Ｖ）モルモット血清（白抜き記号）とのインキュベーション（１５分、３７°Ｃ）により、上記Ｃ３ｂ６７細胞に、Ｃ３ｂ−９を課した。

トランスフェクトされたＣＩ（Ｏ細胞により発現されたＣＤ５９は、これらの細胞をヒ）Ｃ５ｂ−９による小孔形成から防御したが、この複合体の０８およびＣ９成分をモルモットタンパク質に置ｍした場合は防御しなかった。

ヒトＣａｂ−６７を、抗ヒト赤血球抗血清（１，５％（Ｖ／Ｖ）、１０ｗＭ　ＥＤＴＡを含有する）および６０％（ｖ／ｖ）ヒトＣ８枯渇血清（ＨＢＳＳで希釈）との連続的なインキュベージタンによりに５６２細胞に沈積した。

ＢＣＥＣＦ／ＡＭで充填後、細胞を、ＣＤ５９に対して機能的なＯｍｇ／■ｌまたは１ｍｇ／ｍｌの遮断抗体、とインキュベートした（４℃、３０分）。

結合していない抗体の除去後、１０ｍＭ　ＥＤＴＡを含有する、ヒト（円）またはモルモット（三角）血清とのインキュベーションにより、上記細胞に、Ｃ３ｂ −９を課した。ヒト（モルモットでは起こらない）Ｃ８およびＣ９のＣ３ｂ−９への組み込みにより発生する小孔形成活性を制限するこのような能力はまた、ヒトＸ５６２細胞の表面に本質的に発現するＣＤ５９からも認められ、そしてこれらの研究に使用したＣＤＳ　９のｅＤＮＡは、元来、この細胞からの細胞系から得られた。

ＣＤ５９、および、Ｃ３ｂ−９複合体に対する他のインヒビターの効果的な強さは、原形質膜の単位面積当りに生じるＣ３ｂ−９複合体の数に依存する。したがって、Ｃ３ｂ−９の細胞溶解および細胞刺激活性に関するＣＤ５９の阻害効果は、Ｃ３ｂ−９複合体の集まりに対して要求される活性化補体成分の投入量の増大によって、克服され得る。ＣＤ５９の防御効果は、ＣＤ４６および／またはＣＤ５５と共にＣＤ５９を提供することで増強され得る。本処方では、ＣＤ５９は、各タンパク質の遺伝子を含有するベクターのトランスフェクシ璽ンまたは感染により、ＣＤ４６および／またはＣＤ５５と共に発現される。これらの遺伝子の共同発現は、細胞表面に生じる得るＣ３ｂ−９の量の制限（補体酵素によるＣ５からＣ５ｂへの転換に対するＣＤ４６および／またはＣＤ５５の阻害効果を通じて）、および、ＣＤ４６および／またはＣＤ５５の作用により阻害されない、プラズミンおよび他の酵素によるＣ５から０５ｂへの転換を通じて形成された残余のＣ３ｂ−９の細胞溶解および細胞刺激の影響からの防御に寄与する。

実施例２：ブタ内皮細胞でのと）　ＣＤ５９の発現は、ヒト補体による超急性拒絶反応からそれらを防御する。

本実施例は、ヒトＣＤ５９タンパク質をコードする全鎖長ｃＤＮＡが、安定してブタ大動脈内皮細胞（ＰＡＥＣ）のゲノム内に組み込まれ細胞表面上で発現する場合、インビトロでの、ヒト補体を介する細胞溶解によりアッセイされるような補体を介する攻撃から、これらの細胞を防御することを立証する。

ＰＡＥＣの培養物を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５＋ａＭ　Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭＬ−グルタミン、および各１％のペニシリン、およびストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を含有するＤＭＥＭで培養した。レトロウィルスの感染前に、上記細胞を５０％集密まで成長させた。副次的に集密したＰＡＥＣを両種性ヘルパーフリーのレトロウィルスベクターｐＲＮｓＲａｌｐｈａｃＤ５９＋を使用して感染させた。このレトロウィルスの構成を図４に示す。コントロールとして、　ＰＡＥＣを、薬剤選抜マーカー遺伝子ネオマイシンを含有するコントロールレトロウィルスベクターで感染させたまたは感染させなかった。両種性レトロウィルスのストックを、総容量３１のＴ−２５組織培養フラスコ内で成長させ、副次的に集密した細胞に添加した。ポリブレンを上記フラスコに添加し、そして培養物を３７ ℃で２から５時間インキュベートした。ついで上記細胞培養培地を除去し、単層を５議ｌの培地で２回リンスし、次いで５議ｌの培地を、３７℃、８％ＣＯ２でインキュベートした細胞に添加した。

２４から４８時間のインキュベーション期間の後、上記レトロウィルス構築物の安定した組み込みを選択するために、上記細胞をＧ４１ｇ　（４００μｇ／ｍｌ）にさらした。ネオマイシン抵抗性コロニーのフローサイトメトリー手法（ＦＡＣＳ解析）によりヒトＣＤ５９の細胞表面発現をアッセイした。ブタ内皮細胞でのヒトＣＤ５９の細胞表面発現を評価するため、集密したネオマイシン抵抗性細胞クローンをＴ−７５組織培養フラスコで集密するまで成長させ、そして３７℃ で１０分のＶｅｒｓｅｎｅ−ＥＤＴＡ中のインキュページ賞ンによるＦＡＣＳ解析に供すために、細胞を遊離させた。回収した細胞を遠心分離によりベレットにし、次いでリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、０．２％アジ化ナトリウム、および、２％ＦＢＳを含有する染色緩衝液２ｍｌに再懸濁した。細胞を次いで、血球計算器で計測し、遠心分離によりベレットにし、染色緩衝液で２回リンスし、次いで、ヒトＣＤＳ　９に対する一次抗体と１０μｇ／ｍｌのウサギ抗ＣＤ５９ポリクロ一ナル抗体、または、１μｇ／ｍ　ｌのマウス抗ＣＤ５９モノクローナルＩＦＩ（Ｄｒ、Ｍｏｔｏｖａ　Ｔｏｍｉｔａ、昭和大学、日本から入手した）のいずれかとを、２３℃で３０分間インキュベートした。次いで上記細胞をさらに染色緩衝液で２回リンスし、そして染色緩衝液で１＝５０に希釈した、ＦＩＴＣ結合のヤギの抗ウサギＩｇＧまたは抗マウスＩｇＧと、２３°Ｃで３０分間インキュベートした。上記細胞を、染色緩衝液で２回、ＰＢＳで１回リンスし、次いで１％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳに再懸濁し、モしてＦＡＣ５により解析した。細胞クローン１．２および９についてはみられるがネオマイシン抵抗性遺伝子のみを含有するコントロールで感染させたコントロールＰＡＥＣにはみられない、明確な（Ｘ軸の蛍光強度により測定されるように）ヒトｃＤ５９の細胞表面発現が、図５に示されている。

上記の生物学的性質に関しては、ＣＤ５９で感染させたＰＡＥＣと、非感染ＰＡＥＣまたはフントロールベクターで感染させたＰＡＥＣとは、区別されなかった。例えば、非感染細胞と同様の増殖率が維持され、単層の過剰生育または懸濁液中の増殖はせずに、そして接触が阻止される。加えて、ＣＤ５９で感染させたブタ内皮細胞は、図６に示す走査型電子顕微鏡写真で証明されるように、合成Ｇｏｒｔｅｘ”移植片に付着する能力を有していた。合成Ｇｏｒｔｅχ１″シート２平方センチメートルを蒸気滅菌し、滅菌３５ｍｍｍ１ｌ学的ヘトリデイツシユ内に入れ、そして、１平方センチメートルのウェルを有する滅菌ステンレススチールのフェンスをかぶせた。ＣＤ５９で感染させたＰＡＥＣを、上述の培養培地０．５＋ａｌ容量中１×１０５細胞の密度で、上記フェンスのウェルの中心に移植し、そして３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。

２日後、上記培養物に培地を再補給し、さらに２日後、培地を吸引除去し、そして培養物をＰＢＳで洗浄し、次いで、緩衝化した２％グルタルアルデヒドおよび４％バラホルムアルデヒドで１時間固定した。次いで、上記フェンスを取り除き、そして上記Ｇｏｒｔｅｘｒ″を走査型電子顕微鏡のための処理をした。

図６は、ＰＡＥＣが発現した細胞表面のヒ）ＣＤ５９が、正常内皮細胞と同様に、合成Ｇｏｒｔｅｘ”″移植片にもよく付着することを示している。

上記の生物学的活性に関しては、ＣＤ５９で感染させたＰＡＥＣの、ヒト血清中の補体による細胞融解に対する感受性をアッセイした。これを行うため、ＣＤ５９で感染させたＰＡＥＣ，ベクター単独で感染させたコントロールＰＡＥＣ１および非感染ＰＡＥＣを、１０％ＦＢＳ、　２　ｍＭグルタミンおよびＰ／Ｓを含有するＤＭＥＭ中にｌウェルあたり１．２５　ｘ　１０５細胞の密度で、４８ウ工ル組織培養プレートにブレーティングした。上記培地を除去し、上記細胞をＦＢＳを含有しない培地で、３回洗浄した。次に、ＤＭＥＭで種々の濃度に希釈したヒト血清を培養物に添加し、３７°Ｃで２時間インキユベートした。培養物中に残存する生存細胞の百分率は、０゜１％トリバンブルーでの細胞染色により算定した。図７は、非感染またはコントロール（ベクター単独に感染させた）ＰＡＥＣの８０％以上はヒト血清により死滅したのにひきかえ、ＣＤ５９で感染させたＰＡＥＣは１０％以下しか死滅しなかったことを示している。これらの結果は、ブタ内皮細胞の表面でのヒトＣＤ５９の発現が、抗体およびヒト血清の細胞溶解活性からこれらの細胞を防御するのを示し、インビボでのこれら細胞が補体を介する超急性拒絶反応から防御され得ることを示している。

実施例３：相同的組み換え遺伝子ターゲテイングによるインバリアント鎖遺伝子の破壊本実施例は、マウス胚幹細胞中で、インバリアント鎖遺伝子が、変異し、または機能を有さない形のインバリアント鎖遺伝子と、ゲノム内において、特異的および安定的に、置換することにより、破壊され得ること；ならびに本来のイン７＜リアント鎖遺伝子の、機能を有さない変異体との置換が、変異した遺伝子および本来のインバリアント鎖遺伝子間の相同的組み換え現象を利用する、遺伝子ターゲテイング技術により、供試細胞中で達成され得ることを示している。図８Ｂに、マウスインバリアント鎖遺伝子の一部の制限酵素地図を示す。

制限酵素ＤｒａｍによるマウスゲノムＤＮＡの切断を行ない、このＤＮＡをマウスインバリアント鎖遺伝子特異的な放射標識したプローブを用いたサザンブロノテイングにより調べると、およそ８．７ｋｂのインバリアント鎖遺伝子フラグメントが生じるはずである。上記結果が得られ、そしてそれを図９に示す（親の細胞で同定したのと同じレーン）。

相同的組み換えによりマウスインバリアント鎖遺伝子を破壊するため、ヌクレオチド６６１位および１０６４位の間に、インノイリアント鎖遺伝子の配列をネオマイシン遺伝子と交換するように、遺伝子ターゲテイングベクターを構築した。

遺伝子操作は、翻訳開始コドンＡＴＧを含有するエキソン１の大部分、ならびに、ＺｈｕおよびＪｏｎｅｓ、　１９８９　ｒネズミのイン、＜リアント（Ｉｌ）遺伝子の完全な配列」、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１７：４４７ −４４８、が報告しているインバリアント鎖遺伝子のＴＡＴＡボ・ノクスおよびＣＡＡＴボックス（正確で効率のよい転写に要求される調節エレメントとして機能する）の脱離をもたらす。

上記破壊ストラテジーの一般的実施例として、図８Ａｌこ本遺伝子ターゲテイングベクターを示す。上記イン１　（リアント鎖遺伝子中の本領域の削除により、転写および翻訳を包含する本遺伝子の全ての発現が排除される。従って、クラスＩＩ　ＭＩＣ遺伝子産物の発現が破壊され得る。

天然のインバリアント鎖遺伝子の、変異したイン／ｓｊリアント鎖遺伝子への置換は、マウス胚幹細胞で立証された。胚幹細胞（ＥＳ細胞）は、１５％ＦＢＳおよび０．１ａＭ２−メルカプトエタノールを含むＤＭＥＭ　（高グルコース）を含有するＥＳ生長培地で、定期的に一日おきに継代した。上記ＥＳ細胞を原発性胚繊維芽細胞の集密層上で維持した。上記ＥＳ細胞を、遺伝子ターゲテイングベクターでのトランスフェクンヨンの三日前（こ、上記細胞を培地中で増殖させた。これら細胞をトランスフェクトするために、２５０μＦおよび０．３２ｋＶにセノトシたＢｉｏＲａｄ製エレクトロボレーンヨンにより、ＤＮＡ２５μｇに相当する上記インｔＸＩリアントターゲティングベクターを、ｌＸ１０７個のＥＳ細胞に導入した。次いで、上記ＥＳ細胞をＩＯＸ　１００ｍｍのＮｕｎｃ”″組織培養プレート上ニ移植し、Ｇ４１８（１７０μｇ／ｍｌ）に対するネオマイシン遺伝子により、および／または、上記ターゲテイングベクターに単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ遺伝子が含有される場合のいくつかの実験ではガングンクロヴイル（ｇａｎｇｃｙｃ　ｌｏｖ　ｉｒ）により、染色体組み込みが行われた安定なトランスフエクタントを選抜した。

選抜培地で１４日経過後、独立の不オマオシン抵抗性コロニーを選抜し、集密した胚線維芽細胞の栄養層上で増殖させた。

５５の安定なトランスフエクタントからＤＮＡを単離し、そして制限酵素、ＥｃｏＲＩかＤｒａｍかいずれかで一晩分解した。切断されたＤＮＡは、電気泳動により分割し、ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ＋”ナイロン膜にプロットし、次いでマウスイン／　ｓｌリアント鎖遺伝子に特異的な放射４８ｍＤＮＡプローブでハイブリダイズした。図９に示す、二つの独立したクローン、１１．１０．９３および１１．１０．１２８の、ハイブリダイズしたバンドのパターンは、相同的に組み換えられ、そして置換した内在性のインバリアント鎖遺伝子を有する上記インバリアント鎖遺伝子の変異形（ネオマイシン遺伝子配ｙ１の挿入によりエキソン１は破壊されている）と一致した。観ｉｌｌされた制限酵素の切断パターンを図８０に模式的に示す。組み換えの頻度は５５クローン中２つと決定された。これらのデータは、従って、本ターゲテイングベクターが細胞内の本来のインバリアント鎖遺伝子を破壊し得ることを示している。

本明細書中の開示から、本発明の範囲および意図からはずれない種々の改変は、当業者には明らかである。以下の請求の範囲は、本明細書中に記載の特定の実施態様、および、そのような改変物、変形物、および同等物についても力／　（− す配列表（１）一般的情報：＋１）出１１人：　サイムズ、ピータ−ノエイボスウェル、了ルフレフド　エルエムエリオツド、アイリーン　エイ。

フラベル、リチャード　エイ（目）発明の名称；　自在なドナー細胞（■１）配列数＝　４（１ｖ）連絡住所：（［１）州：　ジ茸−ジア（ｖｌ）現在の出願データ。

（＾）出願番号；ｕＳ＜８）出願日：（Ｃ）分類。

：普パミミ■ミミ＝■些トＨ ″　Ｎ　Ｍ　Ｌ″　Ｑ　ｘ　−ｘ　□ ロ　ｇＩａＩ＋：　コ　り一　−哨　＞−−Ｃ −＜Ｎ−にＱ− ロ　ロ　ロ　ロ　ロ　− 一　へ　ロ　−ロ　− ○　ｌ　１０　１００　１０００メトトレヤじ−１−（戸ｇ／口１）ＦＩＧ、７１ｑ闇九保斥ＦＩＧ、２ＦＩＧ、ＪＦＩＧ、５ＦＬ　１ＦＨＧ、　６ｏＦＩＧ、　６ｂＦＨＧ、　６ｃ　ＦＩＧ、　６ｄ手続補正書平成６年１月１７日

Claims

【特許請求の範囲】

１．ヒトまたは動物への移植用の遺伝学的に操作された哺乳動物細胞であって、該細胞に対してＴリンパ球を介する反応を誘引する主要組織適合性複合体クラスＩＩ遺伝子群によりコードされるタンパク質が、その表面上で発現しない、細胞。
２．ヒトまたは動物への移植用の遺伝学的に操作された哺乳動物細胞であって、該細胞に対してＴリンパ球を介する反応を誘引する主要組織適合性複合体クラスＩ遺伝子群によりコードされるタンパク質が、その表面上で発現しない、細胞。
３．請求項１に記載の細胞であって、該細胞に対してＴリンパ球を介する反応を誘引する主要組織適合性複合体クラスＩ遺伝子群によりコードされるタンパク質が、その表面上で発現しない、細胞。
４．請求項１に記載の細胞であって、該細胞で発現し、そして別の種の動物または別の個体へ導入されたときに、操作された該細胞に対して補体を介する攻撃を阻害するタンパク質をコードする、ヌクレオチド分子をさらに含有する、細胞。
５．請求項２に記載の細胞であって、該細胞で発現し、そして別の種の動物または別の個体への導入されたときに、操作された該細胞に対して補体を介する攻撃を阻害するタンパク質をコードする、ヌクレオチド分子をさらに含有する、細胞。
６．請求項４または５に記載の細胞であって、前記ヌクレオチド分子が該細胞の起源となる種と同じ種内での補体を介する攻撃を阻害するタンパク質をコードし、そして該ヌクレオチド分子が該細胞内で同じ分子をコードする天然に存在する遺伝子より離れた遺伝子座に配座する、細胞。
７．請求項４または５に記載の細胞であって、前記遺伝子を含有する宿主細胞に対して補体を介する攻撃に対するタンパク質インヒビターをコードする該遺伝子のプロモーターが、該宿主細胞内で該遺伝子の発現を増大させるように改変された、細胞。
８．補体を介する攻撃を阻害する前記タンパク質が、ＣＤ５９、ＣＤ４６、およびＣＤ５５からなる群から選択される、請求項４または５に記載の細胞。
９．内皮細胞、線維芽細胞、上皮細胞、骨格筋細胞、心筋細胞および平滑筋細胞、肝細胞、膵島細胞、骨髄細胞、星状細胞、ならびにシュヴァン細胞からなる群から選択される、請求項１、２、３、４または５に記載の細胞。
１０．請求項４に記載の細胞であって、該細胞がヒト以外の起源由来であり、補体を阻害する前記タンパク質がヒトタンパク質であり、そして前記ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子群がＨＬＡＤＰ、ＤＲ、およびＤＱと等価である前記細胞種からなる群から選択される、細胞。
１１．請求項６に記載の細胞であって、該細胞がヒト以外の起源由来であり、補体を阻害する前記タンパク質がヒトタンパク質であり、そして前記ＭＨＣクラスＩ遺伝子群がＨＬＡＡ、Ｂ、およびＣと等価である前記細胞種からなる群から選択される、細胞。
１２．請求項１、２、３、４、または５に記載の細胞を有するヒト以外のトランスジェニック動物。
１３．ヒト以外のトランスジェニック動物由来の器官であって、請求項１、２、３、４、５、１２または２６に記載の細胞から形成される、器官。
１４．請求項１、３または４に記載の細胞であって、クラスＩＩＭＨＣ遺伝子群のインバリアント鎖遺伝子の分裂の結果としてクラスＩＩＭＨＣタンパク質が発現しない、細胞。
１５．請求項２、３、または５に記載の細胞であって、β２−ミクログロブリン遺伝子の分裂の結果としてクラスＩＭＨＣタンパク質が発現しない、細胞。
１６．請求項１、２、３、４、５、１２、１９、２１、２２、２４、２５または２６に記載の細胞であって、該細胞で発現し、そして選択された化合物の存在下で細胞死を引き起こすタンパク質をコードする、ヌクレオチド分子をさらに含有する、細胞。
１７．前記遺伝分子が細菌のシトシンデアミナーゼをコードする、請求項１６に記載の細胞。
１８．前記細胞が、ヒト、ウシおよびブタ起源の細胞からなる群から選択される、請求項１、２、３、４、５、１９、２１、２２、２４または２５に記載の細胞。
１９．動物またはヒトへの移植用の人工器官であって、別の種の動物または別の個体へ導入されたときに、操作された細胞に対して補体を介する攻撃に対する抵抗性があるか、または、Ｔリンパ球を介する攻撃を誘引しない細胞を有する、人工器官。
２０．前記人工器官が血管移植片である、請求項１９に記載の人工器官。
２１．表皮剥脱された血管を再内皮化する方法であって、別の種の動物または別の個体へ導入されたときに、操作された細胞に対して補体を介する攻撃に対する抵抗性があるか、または、Ｔリンパ球を介する攻撃を誘引しない、遺伝学的に操作された内皮細胞を、該血管に適用する工程を包含する、方法。
２２．別の種の動物または別の個体へ導入されたときに、操作された細胞に対して補体を介する攻撃に対する抵抗性であるか、または、Ｔリンパ球を介する攻撃を誘引しない、遺伝学的に操作された細胞であって、治療剤をコードし、該細胞で発現しそして分泌するヌクレオチド分子をさらに含有し、そして該細胞で、該分子を正常に発現しないか、同じプロモーターから該分子を発現しないか、または複遺伝子座から該分子を発現する、細胞。
２３．前記細胞が微小血管内皮細胞である、請求項２２に記載の細胞。
２４．ヒトまたは動物への治療剤の送達方法であって、遺伝学的に操作された細胞をヒトまたは動物に投与する工程を包含し、別の種の動物または別の個体へ導入されたときに、該操作された細胞に対して補体を介する攻撃に対する抵抗性があるか、または、Ｔリンパ球を介する攻撃を誘引せず、そして該細胞が、治療剤をコードし、該細胞で発現しそして分泌するヌクレオチド分子をさらに含有し、そして該細胞で、該分子を正常に発現しないか、同じプロモーターから該分子を発現しないか、または複遺伝子座から該分子を発現する、方法。
２５．ヒトまたは動物への移植用の遺伝学的に操作された哺乳動物細胞であって、該細胞で発現し、そして別の種の動物または別の個体へ導入されたときに、操作された該細胞に対して補体を介する攻撃を阻害するタンパク質であって、ＣＤ５９、ＣＤ５５およびＣＤ４６からなる群から選択されるタンパク質をコードする、ヌクレオチド分子を含有する、細胞。
２６．細胞あたり１０３より多いかまたは等しいＣＤ５９分子、あるいは、原形質膜表面の１μｍ２あたり１分子より多いかまたは等しいＣＤ５９抗原を、その表面上に有する、請求項２５に記載の細胞。
２７．内皮細胞、線維芽細胞、上皮細胞、骨格筋細胞、心筋細胞および平滑筋細胞、肝細胞、膵島細胞、骨髄細胞、星状細胞、ならびにシュヴァン細胞からなる群から選択される、請求項２６に記載の細胞。
２８．造血始原細胞、造血始原細胞後代、および成熟血液細胞からなる群から選択される、請求項２７に記載の細胞。
２９．ヒト以外のトランスジェニック動物であって、別の種の動物または別の個体へ導入されたときに、該トランスジェニック動物由来の細胞に対して補体を介する攻撃を阻害するタンパク質をコードするヌクレオチド分子を発現する、トランスジェニック動物。
３０．請求項２７に記載の哺乳動物細胞であって、前記遺伝子配列が本質的に【配列があります】からなる、細胞。
３１．請求項２７に記載の哺乳動物細胞であって、前記タンパク質配列が、本質的に【配列があります】からなる、細胞。
３２．血小板および内皮細胞の補体タンパク質による活性化および細胞溶解の抑制方法であって、阻害される該補体タンパク質と同じ起源である、ＣＤ５９をコードする遺伝子を含有するベクターを、提供する工程、該遺伝子の発現に適切な宿主細胞系に、該ベクターを挿入する工程、該遺伝子が発現する条件下で、該細胞を培養する工程、および活性化または溶解から防御される該細胞と共に発現した該タンパク質を提供する工程を包含する、方法。
３３．請求項３２に記載の方法であって、前記細胞が哺乳動物細胞であり、そして前記ベクター配列が防御される該哺乳動物細胞の表面上での前記遺伝子の発現を起こす、方法。
３４．請求項３２に記載の方法であって、前記細胞が非哺乳動物細胞であり、非哺乳動物タンパク質から発現した前記タンパク質を分離する工程、および、防御される該細胞と共に発現した該タンパク質を提供する工程をさらに包含する、方法。
３５．請求項３２に記載の方法であって、前記細胞が、ＣＦＵ−Ｓ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ、およびＣＦＵ−Ｌのような造血始原細胞、ＢＦＵ−Ｅ、ＢＦＵ−ＭＫ、およびＣＦＵ−ＧＭのような造血始原細胞後代、ならびに赤血球、血小板、単球、顆粒球、およびリンパ球を包含する成熟血液細胞からなる群から選択される細胞であり、被検体に該細胞を注入または移植する前に、前記ベクターを該細胞に導入する工程をさらに包含する、方法。
３６．前記細胞が、細胞あたり１０３より多いかまたは等しいＣＤ５９分子、あるいは、原形質膜表面の１μｍ２あたり１分子より多いかまたは等しいＣＤ５９抗原を、その表面上に有する、請求項３３に記載の方法。
３７．ＣＤ４６およびＣＤ５５からなる群から選択される分子を提供する工程をさらに包含する、請求項３２に記載の方法。
３８．前記ＣＤ４６またはＣＤ５５分子をコードする遺伝子を前記細胞内に導入し、そして該分子を該細胞の表面上で発現させる、請求項３７に記載の方法。
３９．前記ＣＤ４６またはＣＤ５５分子が溶液内に存在する、請求項３７に記載の方法。