JPH07500969A - 相同組換えによる脊椎動物細胞等のトランスフェクション - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １３、トランスフェクト二次細胞が選択しつるマーカーをコードするＤＮＡを付 加的に含む請求項８ないし１２いずれかのクローン細胞株。

１４、治療目的の産物を発現できる不均一細胞株であって、ａ）治療目的の産物 をコードする外因性ＤＮＡ及びｂ））ランスフエクトー次あるいは二次細胞にお いて該外因性ＤＮＡが発現するのに充分な非レトロウィルス由来のＤＮＡ配列 がそれらのゲノムへ安定して組み込まれた、を推動物（例えば哺乳類）由来のト ランスフェクト−次あるいは二次細胞の不均一細胞株。

１５、（ａ））ランスフエクト線維芽細胞、トランスフェクト角化細胞、トラン スフェクト上皮細胞、トランスフェクト内皮細胞、トランスフェクトダリア細胞 、トランスフェクト神経細胞、トランスフェクト血液細胞成分、トランスフェク ト筋細胞、トランスフェクト肝細胞およびそれらのトランスフェクト前駆体から なる群、あるいは（ｂ）トランスフェクトヒト−次細胞、トランスフェクトダリ ア細胞、トランスフェクトマウス−次細胞、トランスフェクトマウス二次細胞、 トランスフェクトウサギ−次細胞、およびトランスフェクトウサギ二次細胞から なる群、より選択されたトランスフェクト−次又は二次細胞である請求項１４の 不均一細胞株。

１６、（ａ＞　ＤＮＡが酵素、サイトカイン、ホルモン、抗原、抗体、凝固因子 、調節タンパク質、リボザイム、転写タンパク質、レセプター、アンチセンス核 酸配列および新規タンパク質からなる群から選択された治療目的の産物をコード する又は（ｂ）外因性ＤＮＡがトランスフェクトされた一次若しくは二次細胞中 のタンパク質若しくは核酸のキレート化合物形成に充分なりＮＡ配列、細胞性調 節タンパク質と結合するＤＮＡ配列、染色体の二次若しくは三次構造を変化させ るＤＮＡ配列、並びに転写を調節する成分であるＤＮＡ配列からなる群から選択 された、それ自体が治療目的の産物である、請求項１４又は請求項１５の不均一 細胞株。

＋７．選択しつるマーカーをコードするＤＮＡを付加的に含む請求項１４．１５ 並びに１６のうちいずれかの不均一細胞株。

１８、治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡ、該外因性ＤＮＡは細胞中のエ ピソームに存在するもの、を発現することのできるトランスフェクトされた一次 若しくは二次細胞の不均一細胞株。

＋９．　ヒト成長ホルモン、エリスロボエチン、又はグルカゴン様ペプチド１類 縁ペプチドをコードする外因性ＤＮＡである請求項！若しくは請求項４の一次又 は二次細胞。

２０、治療目的の産物がエリスロボエチン、又はグルカゴン様ペプチド１類縁ペ プチドである請求項８ないし１８のうちいずれかの細胞株。

２１、治療目的の産物がヒト成長ホルモンである請求項８ないし＋８のうちいず れかの細胞株。

２２、グルカゴン様ペプチド１類縁ペプチドが、ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬ Ｐ−１（７−３６）　、ＧＬＰ−１（７−ｓ　５）　、ＧＬＰ−１（７−３４） 　、及び切断（ｔｒｕｎｃａｔｅ）されたカルボキシル末端がアミド化されたＧ ＬＰ−１の誘導体、及びアミノ酸置換、欠失、付加若しくは他の改変（例えば、 非アミノ酸成分の付加）を有し、切断（ｔｒｕｎｃａｔｅ）されたＧＬＰ−１の 誘導体と実質的に同等又は高い生物学的な活性若しくは血中安定性をもたらすＧ ＬＰ−１の誘導体からなる群より選択されたグルカゴン様ペプチドｌ誘導体であ る、請求項１９若しくは請求項２０による細胞又は細胞株。

２３、請求項！ないし請求項７若しくは請求項１９若しくは請求項２２の、トラ ンスフェクトされた一次若しくは二次細胞並びに、トランスフェクトされていな い一次若しくは二次細胞から本質的に構成される細胞混合物。

２４゜ ａ）−次細胞を含むを推動物（例えば哺乳類）由来の細胞混合物を生産し、 ｂ）治療目的の産物並びに−次細胞において外因性ＤＮＡが発現するのに充分な 付加的ＤＮＡ配列をコードする外因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物で、（ａ）にお いて生産される一次細胞をトランスフェクトし、それによって治療目的の産物を コードする外因性ＤＮＡの発現が可能なトランスフェクトされた一次細胞を生産 し、Ｃ）治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡの発現が可能なトランスフェ クトされた一次細胞の増殖に適切な条件下で、（ｂ）において生産された治療目 的の産物をコードする外因性ＤＮＡの発現が可能なトランスフェクトされた一次 細胞を培養し、それによってトランスフェクトされた一次細胞からトランスフェ クトされた二次細胞のクローン細胞株を生産する、の工程からなる請求項８ない しＩ３又は請求項２０．２１及び２２のうちいずれかのクローン細胞株の生産方 法。

２５、工程（ｂ）において、（ｉ）外因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を一次細胞 に顕微注入することにより、又は（ｉｉ）リン酸カルシウム沈殿、改変されたリ ン酸カルシウム沈殿、リポソーム融合法、受容体介在送達、マイクロプロジェク タイル銃撃及びポリブレン沈殿により、外因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物で一次 細胞がトランスフェクトされる、請求項２４の方法。

２６、工程（ｂ）において、ＤＮＡ構築物中に存在するＤＮＡ配列及びゲノムＤ ＮＡ間の相同組換えによって外因性ＤＮＡがゲノムＤＮＡに導入される、請求項 ２４の方法。

２７゜ ａ）−次細胞を含むを推動物（例えば哺乳類）由来の細胞混合物を供給し、 ｂ）（ａ）において供給された一次細胞から二次細胞集団を供給し、 Ｃ）治療目的の産物及び二次細胞中で外因性ＤＮＡが発現するのに充分な付加的 ＤＮＡ配列をコードする外因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物で（ｂ）において生産 された二次細胞をトランスフェクトし、これにより治療目的の産物をコードする 外因性ＤＮＡを発現することができるトランスフェクト二次細胞を生産し、並び にｄ）治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡを発現できるトランスフェクト された二次細胞の増殖に適切な条件下で、（Ｃ）で生産された治療目的の産物を コードするＤＮＡを発現できるトランスフェクトされた二次細胞を培養し、 それにより、（ｄ）のトランスフェクト二次細胞からトランスフェクト二次細胞 のクローン細胞株を生産する、 の工程からなる、請求項８ないしＩ３又は請求項２０．２１及び２２のうちいず れかのクローン細胞株を生産する方法。

２８、工程（ｃ）において、（ｉ）外因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を二次細胞 に顕微注入することにより、又は（ｉｉ）リン酸カルシウム沈殿、改変されたリ ン酸カルシウム沈殿、リポソーム融合法、受容体介在送達、マイクロプロジェク タイル銃撃及びポリブレン沈殿により、外因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物で二次 細胞がトランスフェクトされる、請求項２７の方法。

２９、工程（Ｃ）において、ＤＮＡ構築物中に存在するＤＮＡ配列とゲノムＤＮ Ａ間の相同組換えによって外因性ＤＮＡがゲノムＤＮＡ中に導入される請求項２ ７の方法。

３０゜ ａ）−次細胞を含むを推動物（例えば哺乳類）由来の細胞混合物を生産し、 ｂ）治療目的の産物をコードし、トランスフェクトされた二次細胞中で外因性Ｄ ＮＡが発現するのに充分な非レトロウィルス由来のＤＮＡ配列と効果的に結合し た外因性ＤＮＡで（ａ）において生産された一次細胞をトランスフェクトし、そ れにより治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡが発現できるトランスフェク トされた一次細胞を含む一次細胞混合物を生産し、Ｃ）治療目的の産物をコード する外因性ＤＮＡの発現が可能な、トランスフェクトされた一次細胞の増殖に適 切な条件下で（ｂ）の生産物を培養し、 それにより、治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡの発現が可能なを推動物 由来のトランスフェクト−次又は二次細胞の不均一細胞株を生産する、 の工程を含む請求項１４ないし１８又は請求項２２のうちいずれかの不均一細胞 株を生産する方法。

３１、工程（Ｃ）において、−次細胞と治療目的の産物をコードする外因性ＤＮ Ａを含むＤＮＡ構築物を結合し、並びにゲノムＤＮＡ内に安定して組み込まれた 外因性ＤＮＡを有する少なくとも一つの一次又は二次細胞の生産がもたらされる 条件下でその得られる結合体をエレクトロポーレーシコンに付すことにより、治 療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物で一次細胞がトラン スフェクトされる、請求項２４又は請求項２７又は請求項３０の方法。

３２　エレクトロボーレーシコンが２５０と３００ボルトの間のエレクトロボー レーシコンボルト数並びに約９６０マイクロフアラツドのキャパシタンス設定で 行われる請求項２７又は請求項３１の方法。

３３、工程（ｂ）において、（ｉ）外因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を一次細胞 に顕微注入することにより、又は（ｉｉ）リン酸カルシウム沈殿、改変されたリ ン酸カルシウム沈殿、リポソーム融合法、受容体介在送達、マイクロプロジェク タイル銃撃及びポリブレン沈殿により、外因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物で一次 細胞がトランスフェクトされる、請求項３０の方法。

３４、工程（ｂ）において、−次細胞のゲノムＤＮＡと相同組換えを行った構築 物を（ａ）において生産される一次細胞内に導入することによりトランスフェク ト−次細胞が生産され、これによりゲノムＤＮＡ内に該構築物が導入される、請 求項３０の方法。

３５゜ ａ）哺乳類由来の一次線維芽細胞を供給し、ｂ）（ａ）において供給された一次 線維芽細胞から二次線維芽細胞集団を生産し、 ｃ）＠乳類由来の二次線維芽細胞を、 ｉ）線維芽細胞中で発現する治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡ及び ｉｉ）線維芽細胞中て外因性ＤＮＡが発現するのに充分な非レトロウィルス由来 の付加的ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物と結合させ、 ｄ）哺乳類由来の二次線維芽細胞へのベクターのトランスフェクションを生じる 条件下で（Ｃ）において生産された結合体をエレクトロボーレーシコンに対し、 それにより、トランスフェクトされた哺乳類由来の二次線維芽細胞及びトランス フェクトされていない哺乳類由来の二次線維芽細胞の混合物を生産し、ｅ）（ｄ ）で生産されたトランスフェクトされた哺乳類由来の二次線維芽細胞を単離し、 及び ｆ）治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡが発現できる、トランスフェクト された哺乳類由来の二次線維芽細胞から本質的に構成されるクローン集団の生産 に適した条件下で、（ｅ）で単離されたトランスフェクトされた哺乳類由来の二 次線維芽細胞を培養する、の工程からなる、哺乳動物へ導入した際に治療目的の 産物をコードする外因性ＤＮＡを発現させることができる哺乳類由来の二次線維 芽細胞のクローン細胞株の生産方法。

３６゜ ａ）−次細胞を含むを推動物（例えば哺乳類）由来の細胞混合物を供給し、 ｂ）（ａ、）において供給された一次細胞から二次細胞集団を生産、し、 Ｃ）治療目的の産物をコードし、トランスフェクトされた二次細胞中で外因性Ｄ ＮＡが発現するのに充分な非レトロウィルス由来のＤＮＡ配列と効果的に結合し た、外因性ＤＮＡを用いて、（ｂ）において生産された二次細胞をトランスフェ クトし、それにより治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡが発現可能なｌ・ ランスフエクトされた二次細胞を含む二次細胞の混合物を生産し、 ｄ）治療目的の産物をコードする夕）置注ＤＮＡを発現することができるトラン スフェクトされた二次細胞の増殖に適切な条件下で、（Ｃ）における生産物を培 養し、それにより治療目的の産物をコードする外因性ＤＮ八を発現することがで きる、を推動物由来のトランスフェクトされた二次細胞の不均一細胞株を生産す る、 の工程からなる請求項１４ないし１８又は請求項２２のうちいずれかひとつによ る不均一細胞株を生産する方法。

３７、工程（Ｃ）において、−次細胞と治療目的の産物をコードする外因性ＤＮ Ａを含むＤＮＡ構築物を結合し、並びに外因性ＤＮＡがゲノムＤＮＡ内に安定し て組み込まれた少なくとも一つの二次細胞が得られる条件下でその得られる結合 体をエレクトロボーレーシコンに付すことにより、治療目的の産物をコードする 外因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物で、二次細胞がトランスフェクトされる、請求 項３６の方法。

３８、エレクトロボーレーシコンが２５０と３００ボルトの間のエレクトロボー レーシコンボルト数で、および約９６０マイクロフアラツドのキャパシタンス設 定で行われる請求項３７の方法。

３９、工程（ｂ）において、（ｉ）外因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を一次細胞 に顕微注入することにより、又は（ｉｉ）リン酸カルシウム沈殿、改変されたリ ン酸カルシウム沈殿、リポソーム融合法、受容体介在送達、マイクロプロジェク タイル銃撃及びポリブレン沈殿により、外因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物で一次 細胞がトランスフェクトされる、請求項３６の方法。

４０、工程（Ｃ）において、二次細胞のゲノムＤＮＡと相同組換えを行った構築 物を（ｂ）で生産された二次細胞に導入することによりトランスフエクト二次細 胞が生産され、それによりゲノムＤＮＡ内に該構築物が導入される、請求項３６ の方法。

４１゜ ａ）哺乳類由来の一次線維芽細胞を供給し、ｂ）（ａ）において供給された一次 線維芽細胞からの二次線維芽細胞集団を生産し、 Ｃ）哺乳類由来の二次線維芽細胞を、 ｉ）線維芽細胞において発現される治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡ、 及び ｌｉ）線維芽細胞において外因性ＤＮＡが発現するのに充分な非レトロウィルス 由来の付加的ＤＮＡ配列、を含むＤＮＡ構築物と結合させ、 ｄ）ＤＮＡ構築物が哺乳類由来の二次線維芽細胞にトランスフェクションされる ことになる条件下で、（Ｃ）において生産された結合体をエレクトロボーレージ ３ンに付し、それにより哺乳類由来のトランスフェクトされた二次線維芽細胞及 び哺乳類由来のトランスフェクトされていない二次線維芽細胞の混合物を生産し 、 ｅ）（ｄ）において生産された哺乳類由来のトランスフェクトされた二次線維芽 細胞を単離し、 ｆ）１１乳動物へ導入した際に、治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡを発 現させることができる哺乳類由来のトランスフェクトされた二次線維芽細胞から 本質的に構成されるクローン集団の生産に適した条件下で、（ｅ）で単離された トランスフェクトされた哺乳類由来の二次線維芽細胞を培養する、の工程からな る、哺乳動物へ導入した際に、治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡを発現 させることができる哺乳類由来の二次線維芽細胞のクローン細胞株の生産方法。

４２、工程（ｄ）において、エレクトロボーレージ３ンが２５０と３００ボルト の間のエレクトロボーレーシコンボルト数で、および約９６０マイクロフアラツ ドのキャパシタンス設定で行われる請求項４１の方法。

４３、（ｆ）の生産物を充分な時間であって、かつ外因性ＤＮＡを発現すること ができるトランスフェクト二次細胞を少なくとも２０回倍加するのに適した条件 下で維持する工程を特徴とする請求項４１又は請求項４２の方法。

４４、治療目的の産物がエリスロボエチン、又はグルカゴン様ペプチド１類縁ペ プチドである請求項４１．４２及び４３のうちいずれかの方法。

４５、治療目的の産物がヒト成長ホルモンである請求項４１．４２及び４３のう ちいずれかの方法。

４６、グルカゴン様ペプチド１類縁ペプチドが、ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬ Ｐ−１（７−３６）、ＧＬＰ−１（７−３５）　、ＧＬＰ−１（７−３４）　、 及び切断（ｔｒｕｎｃａｔｅ）されたカルボキシル末端がアミド化されたＧＬＰ −１の誘導体、及びアミノ酸置換、欠失、付加若しくは他の改変（例えば、非ア ミノ酸成分の付加）を存し、切断（ｔｒｕｎｃａｔｅ）されたＧＬＰ−１の誘導 体と実質的に同等又は高い生物学的な活性若しくは血中安定性をもたらすＧＬＰ −１の誘導体からなる群より選択されたグルカゴン様ペプチド■誘導体である、 請求項４４による細胞又は細胞株。

４７、請求項！ないし２２のうちいずれかの細胞又は細胞株を培養して、充分な 数の該トランスフェクトされた細胞を供給する、哺乳類に効果的な量の治療目的 の産物を送達することのできるトランスフェクトされた細胞の供給方法。

４８、遺伝子治療に用いる治療目的の産物の製造のための、請求項１ないし２３ のうちいずれかの細胞又は細胞株の使用。

４９、治療、例えば遺伝子治療、に用いるための、請求項１ないし２３のうちい ずれかのトランスフェクトされた細胞又は細胞株。

５０゜ ａ）エリスロポエチンをコードする外因性ＤＮＡが発現できるトランスフェクト された一次細胞、ｂ）エリスロポエチンをコードする外因性ＤＮＡが発現できる トランスフェクトされた二次細胞、Ｃ）又は（ａ）及び（ｂ）の両方、 を含むバリアー装置（ｂａｒｒｉｅｒ　ｄｅｖｉｃｅ）を哺乳類に導入すること からなる、ここで、バリアー装置はエリスロボエチンを哺乳類の血液循環若しく は組織への移動を許し、そして哺乳類による有害な免疫応答を防ぐのに充分な程 度に哺乳類の免疫系と該バリアー装置内に含まれるトランスフェクトされた細胞 との間の接触を妨ぐ材質からなっている、哺乳類に有効な量のエリスロポエチン を供給する方法。

５１、エリスロポエチン及び哺乳類の細胞中でエリスロボエチンが充分発現でき る調節配列をコードする外因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を哺乳類に導入するこ とからなる、ここで該ＤＮＡ構築物は哺乳類の細胞によって取り込まれ、その中 で発現される、哺乳類に有効な量のエリスロボエチンを供給する方法。

５２、筋肉への直接注入によりＤＮＡ構築物が哺乳類へ導入される請求項５１の 方法。

５３、装置が哺乳動物に導入される時に、エリスロボエチンの哺乳動物の循環ま たは組織への移行を可能とし、その哺乳動物による有害な免疫反応を防ぐに十分 な程度に哺乳動物の免疫系とバリアー装置内に含まれるトランスフェクト細胞と の接触を防ぐことができる素材からなるバリアー装置（ｂａｒｒｉｅｒ　ｄｅｖ ｉｃｅ）であって、ａ）エリスロボエチンをコードする外因性ＤＮＡを発現でき るトランスフェクト−次細胞、 ｂ）エリスロボエチンをコードする外因性ＤＮＡを発現できるトランスフェクト 二次細胞、 Ｃ）または（ａ）と（ｂ）の両方 を含むバリアー装置。

５４、哺乳類に効果的な量のエリスロボエチンを供給する治療のために使われる 、エリスロボエチン及び哺乳類の細胞中でエリスロボエチンを発現するのに充分 な調節配列をコードする外因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物。

５５゜ ａ）ヒト成長ホルモンをコードする外因性ＤＮＡが発現できるトランスフェクト された一次細胞、ｂ）ヒト成長ホルモンをコードする外因性ＤＮＡが発現できる トランスフェクトされた二次細胞、Ｃ）又は（ａ）及び（ｂ）の両方、 を含むバリアー装置（ｂａｒｒｉｅｒ　ｄｅｖｉｃｅ）を哺乳類に導入すること からなる、ここで、バリアー装置はヒト成長ホルモンを哺乳類の血液循環若しく は組織への移動を許し、モして哺乳類による有害な免疫応答を防ぐのに充分な程 度に哺乳類の免疫系と該バリアー装置内に含まれるトランスフェクトされた細胞 との間の接触を防ぐ材質からなっている、哺乳類に有効な量のヒト成長ホルモン を供給する方法。

５６、ヒト成長ホルモン及び哺乳類の細胞中でヒト成長ホルモンを発現するのに 充分な調節配列をコードする外因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を哺乳類に導入す ることからなる、該ＤＮＡ構築物は哺乳類の細胞によって取り込まれ、その中で 発現される、哺乳類に効果的な量のヒト成長ホルモンを供給する方法。

５７、筋肉への直接注入によりＤＮＡ構築物が哺乳類へ導入される請求項５６の 方法。

５８、装置が哺乳動物に導入される時に、ヒト成長ホルモンの哺乳動物の循環ま たは組織への移行を可能とし、その哺乳動物による有害な免疫反応を防ぐに十分 な程度に哺乳動物の免疫系とバリアー装置内に含まれるトランスフェクト細胞と の接触を防ぐことができる素材からなるバリアー装置（ｂａｒｒｉｅｒ　ｄｅｖ ｉｃｅ）であって、ａ）ヒト成長ホルモンをコードする外因性ＤＮＡを発現でき るトランスフェクト−次細胞、 ｂ）ヒト成長ホルモンをコードする外因性ＤＮＡを発現できるトランスフェクト 二次細胞、 Ｃ）または（ａ）と（ｂ）の両方 を含むバリアー装置。

５９．１１ｉ乳類に効果的な量のヒト成長ホルモンを供給する治療のために使わ れる、ヒト成長ホルモン及び哺乳類の細胞中でヒト成長ホルモンを発現するのに 充分な調節配列をコードする夕１因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物。

６０゜ ａ）インスリノトロビンをコードする外因性ＤＮＡが発現できるトランスフェク トされた一次細胞、ｂ）インスリノトロピンをコードする外因性ＤＮＡが発現で きるトランスフェクトされた二次細胞、Ｃ）又は（ａ）及び（ｂ）の両方、 を含むバリアー装置（ｂａｒｒｉｅｒ　ｄｅｖｉｃｅ）を哺乳類に導入すること からなる、ここで、バリアー装置はインスリノトロピンの哺乳類の血液循環若し くは組織への移動を許し、そして哺乳類による有害な免疫応答を防ぐのに充分な 程度に哺乳類の免疫系と該バリアー装置内に含まれるトランスフェクトされた細 胞との間の接触を紡ぐ材質からなっている、哺乳類に有効な量のインスリノトロ ビンを供給する方法。

６１、インスリノトロピン及び哺乳類の細胞中でインスリノトロビンを発現する のに充分な調節配列をコードする外因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を哺乳類に導 入することからなる、該ＤＮＡ構築物は哺乳類の細胞によって取り込まれ、その 中で発現される、哺乳類に効果的な量のインスリノトロビンを供給する方法。

６２、筋肉への直接注入によりＤＮＡ構築物が哺乳類へ導入される請求項６１の 方法。

６３、装置が哺乳動物に導入される時に、インスリノトロピンの哺乳動物の循環 または組織への移行を可能とし、その哺乳動物による有害な免疫反応を防ぐに十 分な程度に哺乳動物の免疫系とバリアー装置内に含まれるトランスフェクト細胞 との接触を防ぐことができる素材からなるバリアー装置（ｂａｒｒｉｅｒ　ｄｅ ｖｉｃｅ）であって、ａ）インスリノトロピンをコードする外因性ＤＮＡを発現 できるトランスフェクト−次細胞、 ｂ）インスリノトロビンをコードする外因性ＤＮＡを発現できるトランスフェク ト二次細胞、 Ｃ）または（ａ）と（ｂ）の両方 を含むバリアー装置。

６４、哺乳類に効果的な量のインスリノトロピンを供給する治療のために使われ る、インスリノトロピン及び哺乳類の細胞中でインスリノトロピンを発現するの に充分な調節配列をコードする夕１因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物。

６５゜ ａ）−次若しくは二次細胞のゲノムＤＮＡ配列と相同なりＮＡ配列を含む外因性 ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を用いて一次若しくは二次細胞をトランスフェクトし 、それによりトランスフェクトされた一次若しくは二次細胞を生産し、及び ｂ）ＤＮＡ構築物中のＤＮＡ配列とゲノムＤＮＡ間の相同組換えが起こるのに適 切な条件下で、トランスフェクトされた一次若しくは二次細胞を維持し、それに より相同組換えされた一次あるいは二次細胞を生産する、 の工程からなる、を推動物（例えば哺乳類）由来の一次あるいは二次細胞のゲノ ムＤＮＡのあらかじめ選ばれた部位へ外因性ＤＮＡを導入する方法。

Ｂｅ、（ａ）のＤＮＡ構築物が選択しつるマーカーをコードするＤＮＡを付加的 に含む請求項６５の方法。

６７、相同組換えされた一次あるいは二次細胞の増殖に適した条件下で、相同組 換えされた一次あるいは二次細胞の培養をさらに行ない、それにより相同組換え された二次細胞のクローン株を生産する請求項６５又は請求項６６の方法。

６８、請求項６７の方法によって生産された相同組換えされた二次細胞のクロー ン細胞株。

６９゜ ａ） ｌ）を推動物由来の一次あるいは二次細胞において発現される生産物（例えば治 療目的の産物）をコードする外因性ＤＮＡ。

２）を推動物由来の一次あるいは二次細胞におけるゲノムＤＮＡと相同なりＮＡ 配列、及び ３）少なくともひとつの選択しうるマーカーをコードするＤＮＡ配列、 を含むＤＮＡ構築物を供給し、 ｂ）（ａ）で供給されたＤＮＡ構築物で一次又は二次細胞をトランスフェクトし て（ａ）で供給されたＤＮＡ構築物を含む一次又は二次細胞を生産し、およびＣ ）ゲノムＤＮＡ配列と相同なりＮＡ配列とゲノムＤＮＡ配列間で相同組換えが起 きるのに適した条件下で（ｂ）で生産された一次又は二次細胞を維持する、それ により、−次又は二次細胞のゲノムＤＮＡ内に組み込まれた（ａ）のＤＮＡ構築 物を有するを推動物由来の相同組換えされた一次又は二次細胞を生産する、の工 程よりなる、を推動物（例えば哺乳類）由来の一次又は二次細胞のゲノムＤＮＡ 内へＤＮＡ配列をターゲティングする方法。

７０、−次若しくは二次細胞が、（ａ）線維芽細胞、角化細胞、上皮細胞、内皮 細胞、グリア細胞、神経細胞、血液細胞成分、筋細胞、肝細胞およびそれらの前 駆体からなる群、あるいは（ｂ）ヒトー次細胞、ヒト二次細胞、マウス−次細胞 、マウス二次細胞、ウサギ−次細胞、及びウサギ二次細胞からなる群から選択さ れる、請求項６５ないし６９のうちいずれかの方法。

７１、（ａ）外因性ＤＮＡが酵素、サイトカイン、ホルモン、抗原、抗体、凝固 因子、調節タンパク質、リボザイム、転写タンパク質、レセプター、アンチセン ス核酸配列および新規タンパク質からなる群より選ばれた治療目的の産物をコー ドし、（ｂ）外因性ＤＮＡが細胞中でタンパク質若しくは核酸のキレート形成に 充分なりＮＡ配列、細胞性の調節タンパク質と結合するＤＮＡ配列、染色体の二 次若しくは三次構造を変化させるＤＮＡ配列、並びに転写調節因子であるＤＮＡ 配列からなる群より選ばれたそれ自体が治療目的の産物である、 請求項６５ないし７０のうちいずれかの方法。

７２、請求項６５．６６．６９．７０及び７１のうちいずれかの方法によって生 産された相同組換えされた一次若しくは二次細胞。

７３、外因性ＤＮＡがゲノムＤＮＡに組み込まれた、を推動物（例えば哺乳類） 由来の相同組換えされた一次若しくは二次細胞。

７４、（ａ）線維芽細胞、角化細胞、上皮細胞、内皮細胞、グリア細胞、神経細 胞、血液細胞成分、筋細胞、肝細胞及びそれらの前駆体からなる群、あるいは（ ｂ）ヒトー次細胞、ヒト二次細胞、マウス−次細胞、マウス二次細胞、ウサギ− 次細胞及びウサギ二次細胞からなる群から選択された、請求項７３の相同組換え された一次若しくは二次細胞。

７５、（ａ）外因性ＤＮＡが酵素、サイトカイン、ホルモン、抗原、抗体、凝固 因子、調節タンパク質、リボザイム、転写タンパク質、レセプター、アンチセン ス核酸配列および新規タンパク質からなる群より選ばれた治療目的の産物をコー ドし、あるいは（ｂ）外因性ＤＮＡが細胞中でタンパク質若しくは核酸のキレー ト形成に充分なりＮＡ配列、細胞性の調節タンパク質と結合するＤＮＡ配列、染 色体の二次若しくは三次構造を変化させるＤＮＡ配列、並びに転写調節因子であ るＤＮＡ配列からなる群より選ばれたそれ自体が治療目的の産物である、 請求項７３若しくは請求項７４の相同組換えされた一次若しくは二次細胞。

７６、選択しつるマーカーをコードするＤＮＡをゲノムＤＮＡ内に付加的に組み 込んだ、請求項７３．７４及び７５のうちいずれかの相同組換えされた一次若し くは二次細胞。

７７、該治療目的の産物を哺乳類へ送達して治療に用いるための、請求項６８若 しくは７２〜７６いずれか記載の相同組換えされた細胞。

７８゜ ａ） ａ）−次若しくは二次細胞における内在遺伝子（ｒｅｓｉ−ｄｅｎｔ　ｇｅｎｅ ）を修復、改変、欠失若しくは置換するＤＮＡ配列、 ｂ）取得時の一次若しくは二次細胞において通常発現されない又は−次若しくは 二次細胞において存意なレベルで発現されない産物をコードするＤＮＡ配列、 Ｃ）−次若しくは二次細胞に存在する調節配列を修復、改変、欠失若しくは置換 するＤＮＡ配列、ｄ）取得時の一次若しくは二次細胞において発現される遺伝子 に通常機能的に結合していない調節配列をコードするＤＮＡ配列、並びに ｅ）−次若しくは二次細胞において遺伝子若しくは遺伝子の部分を不活性化若し くは取り去るＤＮＡ配列、 からなる群より選択された外因性ＤＮＡ、２）−次若しくは二次細胞におけるゲ ノムＤＮＡ配列と相同したＤＮＡ配列、並びに ３）少なくともひとつの選択しうるマーカーをコードするＤＮＡ配列、 からなるＤＮＡ構築物を供給し、 ｂ）（ａ）において供給されたＤＮＡ構築物を用いて一次若しくは二次細胞をト ランスフェクトし、これによって（ａ）において供給されたＤＮＡ構築物を含む 一次若しくは二次細胞を生産し、並びに Ｃ）ゲノムＤＮＡ配列と相同するＤＮＡ配列とゲノムＤＮＡ配列間で起こる相同 組換えに適した条件下で、（ｂ）において生産された一次若しくは二次細胞を維 持する、 これにより、−次若しくは二次細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれた（ａ）のＤＮ Ａ構築物を持つを推動物由来の一次若しくは二次細胞を生産する、 の工程からなる、を推動物由来の一次若しくは二次細胞のゲノムＤＮＡ中のあら かじめ選ばれていた部位へ外因性ＤＮＡをターゲティングする方法。

７９、それぞれの末端に一本鎖の突起を有する線状ＤＮＡ構築物を一次若しくは 二次細胞に導入することからなる、（ａ）を推動物（例えば哺乳類）由来の一次 若しくは二次細胞のゲノムＤＮＡ配列と（ｂ）−次若しくは二次細胞のゲノムＤ ＮＡ配列と相同するＤＮＡ構築物に存在する外因性ＤＮＡ配列との間で相同組換 えの効率を向上させる方法。

８０、相同組換えに適した条件下で、調節領域を含むＤＮＡ構築物を細胞に導入 することにより、その調節領域が挿入されるかまたは発現させようとする遺伝子 の調節領域の全てまたは一部と置換して、発現させようとする遺伝子と機能的に 結合され、これにより遺伝子の発現が可能な相同的に組換えられた細胞が生産さ れる、細胞（例えば、哺乳類由来）に存在するが、採取したままの細胞内では発 現されないか、採取したままの細胞内では有意な量は発現されない、発現させよ うとする遺伝子の発現を開始する方法。

８１、該遺伝子が酵素、サイトカイン、ホルモン、抗原、抗体、凝固因子、調節 タンパク質、レセプターおよびタンパク質からなる群から選択されたものである 請求項８ｏの方法。

８２、該遺伝子がヒトのエリスロボエチン、成長ホルモン及びインスリン遺伝子 からなる群から選択されたものである請求項８１の方法。

８３゜ ａ） ｌ）を推動物由来の一次若しくは二次細胞で発現される産物をコードする外因性 ＤＮＡ、 ２）を推動物由来の一次若しくは二次細胞におけるゲノムＤＮＡ配列と相同した ＤＮＡ配列、及び３）少なくともひとつの選択しつるマーカーをコードするＤＮ Ａ配列、 からなるＤＮＡ構築物を供給し、 ｂ）（ａ）において供給されたＤＮＡ構築物を用いて一次若しくは二次細胞をト ランスフェクトし、これによって（ａ）において供給されたＤＮＡ構築物を含む 一次若しくは二次細胞を生産し、並びに Ｃ）ゲノムＤＮＡ配列と相同したＤＮＡ配列とゲノムＤＮＡ配列間で起こる相同 組換えに適した条件下で、（ｂ）において生産された一次若しくは二次細胞を維 持し、これによって−次若しくは二次細胞のゲノムＤＮＡへ組み込まれた（ａ） のＤＮＡ構築物を有する、を推動物由来の相同組換えされた一次若しくは二次細 胞を生産し、 ｄ）（ｃ）において生産された相同組換えされた一次若しくは二次細胞を、ター プティングＤＮＡ構築物中に存在する選択しつるマーカーを選択する選択薬剤に さらし、それによって、選択しうるマーカーが安定して組み込まれていない細胞 は殺され、選択しうるマーカーが安定して組み込まれている細胞は生存可能でコ ロニーを形成でき、並びに ｅ）（ｄ）で生産されたコロニーをスクリーニングして、相同組換えされた一次 若しくは二次細胞株を同定する工程からなる、を推動物（例えば哺乳類）由来の 一次若しくは二次細胞のゲノムＤＮＡへＤＮＡ配列をターゲティングする方法。

８４、ポジティブ選択マーカーがｎｅｏであって、選択薬剤が０４１８である請 求項８３の方法。

８５゜ ａ） ｌ）を推動物由来の一次若しくは二次細胞で発現される産物をコードする外因性 ＤＮＡ、 ２）を推動物由来の一次若しくは二次細胞におけるゲノムＤＮＡ配列と相同した ＤＮＡ配列、及び３）宿主細胞ゲノムにおいてターゲティング配列と相同配列の 間の相同組換えによりポジティブ選択マーカーのターゲットされた組み込みが起 こるが、ネガティブ選択マーカーは組み込まれないようなコンフィグレーション で、少なくともポジティブおよびネガティブの選択マーカをそれぞれひとつコー ドするＤＮＡ配列からなるＤＮＡ構築物 を供給し、 ｂ）（ａ）において供給されたＤＮＡ構築物を用いて一次若しくは二次細胞をト ランスフェクトし、これによって（ａ）において供給されたＤＮＡ構築物を含む 一次若しくは二次細胞を生産し、並びに Ｃ）ゲノムＤＮＡ配列と相同したＤＮＡ配列とゲノムＤＮＡ配列間で起こる相同 組換えに適した条件下で、（ｂ）において生産された一次若しくは二次細胞を維 持し、これによって−次若しくは二次細胞のゲノムＤＮＡへ組み込まれた（ａ） のＤＮＡ構築物を有する、を推動物由来の相同組換えされた一次若しくは二次細 胞を生産し、 ｄ）（ｃ）において生産された一次若しくは二次細胞を、タープティングＤＮＡ 構築物中に存在するポジティブ選択マーカーを選択する選択薬剤にさらし、それ によって、ポジティブ選択マーカーが安定して組み込まれていない細胞は殺され 、ポジティブ選択マーカーが安定して組み込まれている細胞は生存可能でコロニ ーを形成でき、並びに ｅ）さらに、（Ｃ）および（ｄ）において生産された細胞を、タープティングＤ ＮＡ構築物中に存在するネガティブ選択マーカーに対抗して選択する選択薬剤に さらし、それによってネガティブ選択マーカーが安定して組み込まれている細胞 は殺され、（ｄ）と（ｅ）により相同的組換え細胞が選択される結果となるよう な工程からなる、を推動物（例えば哺乳類）由来の一次若しくは二次細胞のゲノ ムＤＮＡへＤＮＡ配列をターゲティングする方法。

８６、細胞が（ａ）線維芽細胞、角化細胞、上皮細胞、内皮細胞、グリア細胞、 神経細胞、血液細胞成分、筋細胞、肝細胞およびそれらの前駆体からなる群、あ るいは（ｂ）ヒトー次細胞、ヒト二次細胞、マウス−次細胞、マウス二次細胞、 ウサギ−次細胞、及びウサギ二次細胞からなる群、から選択されたを推動物（例 えば哺乳類）由来の一次若しくは二次細胞である、請求項７８〜８５いずれかの 方法。

８７、発現させようとする遺伝子または外因性ＤＮＡが、（ａ）酵素、サイトカ イン、ホルモン、抗原、抗体、凝固因子、調節タンパク質、リボザイム、転写タ ンパク、受容体、アンチセンス核酸配列および新規タンパク質からなる群から選 ばれた治療目的の産物をコードし、あるいは（ｂ）それ自体が、細胞においてタ ンパク質若しくは核酸のキレート形成（ｓｅｑｕｅｓ　ｔｒａｔ　１ｏｎ）に十 分なりＮＡ配列、細胞性調節タンパク質と結合するＤＮＡ配列、染色体の二次若 しくは三次構造を変化させるＤＮＡ配列、および転写を調節する成分であるＤＮ Ａ配列からなる群から選択された治療目的の産物である、請求項７８〜８６いず れかの方法。

８８、請求項７８〜８２．８５．８６並びに８７いずれかの方法によって生産さ れた、相同組換えされた一次若しくは二次細胞。

８９、請求項８０．８１．８２．８５．８６並びに８７いずれかの方法によって 生産された、相同組換えされた二次細胞のクローン細胞株。

９０、取得時の該細胞が不死化細胞である請求項８０の方法９１、二つのネガテ ィブ選択マーカーが用いられ、一つのネガティブ選択マーカーがｇｐｔであり、 一つのネガティブ選択マーカーがＨ３Ｖ−ＴＫ遺伝子である請求項８５．８６並 びに８７の方法。

９２、ＤＮＡ構築物が少なくとも一つのポジティブ選択マーカー及び少なくとも 一つのネガティブ選択マーカーを付加的に含む請求項７８〜８２いずれかの方法 。

９３、ポジティブ選択マーカーがｎｅｏであって、ポジティブ選択薬剤が０４１ ８である請求項７８〜８２．８５．８６並びに８７いずれかの方法。

９４、（ａ）ネガティブ選択マーカーがｇｐｔであり、ネガティブ選択薬剤が６ −チオキサンチン（６−ｔｈ　１ｏｘａｎｔｈｉｎｅ）である、若しくは（ｂ） ネガティブ選択マーカーがＨ３Ｖ−ＴＫ遺伝子であり、ネガティブ選択薬剤がガ ンシクロビル（ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ）である、請求項７８〜８２．８５．８ ６．８９並びに９３いずれかの方法。

９５、請求項６８、若しくは請求項７２〜７７、若しくは請求項８８及び８９い ずれか記載の細胞又は細胞株が培養され、充分な数の該トランスフェクトされた 細胞が供給される、存効量の治療目的の産物を哺乳類へ送達することのできるト ランスフェクトされた細胞の供給方法。

９６、遺伝子治療に用いる治療目的の産物の製造のための、請求項６８、若しく は請求項７２〜７７、若しくは請求項８８及び８９いずれか記載の細胞又は細胞 株の使用。

９７、治療、例えば遺伝子治療、に用いるための、請求項６８、若しくは請求項 ７２〜７７、若しくは請求項８８及び８９いずれか記載のトランスフェクトされ た細胞又は細胞株。

９８、治療目的のタンパク質のインビトロにおける製造のための、請求項６８、 若しくは請求項７２〜７６、若しくは請求項７８〜８２、若しくは請求項８５〜 ８７いずれか記載の細胞又は細胞株の使用。

９９、治療目的のタンパク質のインビトロにおける製造のための、請求項９０に 記載の方法による不死化細胞の使用。

相同組換えによるを推動物細胞等のトランスフェクションヒトの遺伝子療法を開 発する試みは、腎臓移植の初期の成功で健常者の細胞を遺伝疾患患者に移植する ことができるかもしれないと考えられるようになった１９５０年代にさかのぼる 。ゴーシュ病およびニーマン−ピック病における酵素欠損の発見からまもなく、 学者らは、まれな遺伝疾患を治療するために臓器移植、骨髄移植、および酵素投 与を検討しはじめた［プラディ−（Ｂｒａｄｙ、　Ｒ，）　、　ＮＥＪＭ　２７ ５：３１２　（１９６６）］。

１９６０年代後期から１９７０年代初期までに、数名の研究者らは、患者自身の 細胞に遺伝子を導入することもできるのではないかと考え、わずか数年後には最 初のヒト遺伝子のクローニングが行なわれ当該分野の研究が強化された。

最近まで、ヒトの遺伝子療法に関する理論的および実験的研究はほとんどいずれ もごくまれな遺伝疾患に注目していて、当該分野の多くの者にとって遺伝子療法 とは遺伝疾患を治療するために患者の遺伝子を変更することを意味するようにな っていた。ところが、遺伝子療法は単なる遺伝疾患治療よりはるかに応用範囲が 広いのである。遺伝子療法は、治療目的のタンパク質の長期投与によって改善さ れるであろう病因を問わないあらゆる状態を治療または治癒させるために、由来 光が治療対象者であるか別の適当なソースである細胞を遺伝的に変更する医学的 介入であると表現するのがより適切であろう。したがって、遺伝子療法はインビ ボのタンパク質産生・送達システムと考えることができ、現在はタンパク質の投 与によって治療されている疾患はほとんどすべてが遺伝子療法を用いる治療の対 象候補となる。

遺伝子療法は、生殖細胞遺伝子療法と体細胞遺伝子療法という２つの分野に分け ることができる。生殖細胞遺伝子療法とは、哨細胞、卵細胞、接合子、または早 期段階の胚に改変を加えることをいう。倫理基準と実用基準のいずれから見ても 、生殖細胞遺伝子療法はヒトに使用するには不適当である。

生殖細胞遺伝子療法とは対照的に、体細胞遺伝子療法は治療を受けている者だけ にしか影響を及ぼさない（体細胞とは完全個体に発育することができない細胞で あり、生殖細胞以外の身体細胞すべてを含む）。したがって、体細胞遺伝子療法 はヒトにおけるある種の障害の治療と治癒への合理的なアプローチである。

体細胞遺伝子療法方式においては、体細胞（たとえば線維芽細胞、肝細胞、また は内皮細胞）を患者から採取し、インビトロで培養し、治療上の興味がもたれる 単数または複数の遺伝子をトランスフェクトし、キャラクタライゼーシコンを行 ない、患者に戻す。これら５段階を実施する手段は、既知の遺伝子療法方式の顕 著な特徴である。

現在利用可能な遺伝子療法へのアプローチは、発現させようとする遺伝物質を含 むレトロウィルスベクターなどの感染性ベクターを利用する。この様なアプロー チは、ベクター製造時に複製応答性ウィルスができてしまう可能性があること、 治療用ウィルスと内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）レトロウィルスゲノムの間に 組換えが起きて、新たな細胞特異性や宿主範囲をもったり病原性や細胞毒性が増 大した感染性物質を生じる可能性があること、多数の細胞に独立的に組み込まれ ることで腫瘍原性挿入事象の危険が増大すること、レトロウィルス中のクローニ ング能力が制限され（治療応用性を制限する）対象産物のインビボ発現が短命で あることなどの限界がある。遺伝子産物、とくに現在利用可能な方法に伴う危険 を回避し長期的製造を可能にする遺伝子産物を提供する、より良いアプローチが あれば有用であろう。治療上の興味がもたれるタンパク質は、該治療作用タンパ ク質をコードする外因性（ｅｘｏｇｅｎ−ｏｕｓ）Ｄ　Ｎ　Ａを適当な細胞に導 入することによって製造されるのが普通である。

発明の概要 本発明は、治療目的の産物（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｐｒｏｄｕｃｔ）をコー ドする外因性ＤＮＡ、それ自体が治療目的の産物である外因性ＤＮＡおよび／ま たはトランスフェクト（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）細胞に対してそれに対応する 非トランスフェクト細胞中で生ずるより高いレベルで遺伝子を発現させる外因性 ＤＮＡをトランスフェクトされたを推動物由来、とりわけ哺乳類由来のトランス フェクト（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）−次および二次体細胞に関する。本発明は さらに、目的の（たとえば治療目的の）産物をコードするかそれ自体が目的の（ たとえば治療目的の）産物である外因性遺伝物質（ＤＮＡ）をトランスフェクト されたを推動物由来、とりわけ哺乳類由来のトランスフェクトされた一次および 二次体細胞、−次および二次細胞にトランスフェクトを受けさせて外因性遺伝物 質を取り込ませる方法、クローン細胞株（ｃｌｏｎａｌ　ｃｅｌｌ　５ｔｒａｉ ｎｓ）または不均一細胞株（ｈｅｔｅｒｏ−ｇｅｎｏｕｓ　ｃｅｌｌ　５ｔｒａ ｉｎｓ）を製造する方法、上記トランスフェクト−次または二次細胞を用いる遺 伝子療法の方法、本発明の方法によって作成されたトランスフェクト−次または 二次細胞を使用することによって治療目的タンパク質を製造する方法、および該 トランスフェクトー次または二次細胞を用いて抗体を製造する方法に関する。

一つの態様においては、本発明は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、エリスロボエ チン（ＥＰＯ）またはインスリノトロピンなど臨床的に有用な産物をコードする 外因性遺伝物質（ＤＮＡまたはＲＮＡ）をトランスフェクトされたを推動物由来 、とりわけ哺乳類由来のトランスフェクト−次および二次体細胞、−次および二 次細胞にトランスフェクトを受けさせてｈＧＨ，ＥＰＯまたはインスリノトロピ ンをコードする外因性遺伝物質を組み込ませる方法、ｈＧＨ，ＥＰＯまたはイン スリノトロピンをコードする外因性遺伝物質を発現するクローン細胞株または不 均一細胞株を製造する方法、本発明のトランスフェクト細胞を使用することによ るかｈＧＨＳＥＰＯまたはインスリノトロピンをコードするＤＮＡを個体に直接 注射することによって、そのものを必要としている個体に対して生理的に有用な 量のｈＧＨ，ＥＰＯまたはインスリノトロピンを提供する方法、および該トラン スフェクトー次または二次細胞を用いて該コード化物に対する抗体を製造する方 法に関する。

別の態様においては、本発明は、を推動物、とりわけ哺乳類由来の細胞中でのジ ーンターゲティング（ｇｅｎｅ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）またはＤＮＡターゲティ ング（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）の方法に関する。

すなわち、本発明は、ＤＮＡの相同組換えまたはターゲティング（ｔａｒｇｅｔ ｉｎｇ）によってを推動物由来の一次または二次細胞にＤＮＡを導入する方法で あって、あらかじめ選択された部位で該−次または二次細胞のゲノムＤ’ＮＡに 導入されることに関する。あらかじめ選択された部位は、使用するターゲティン グ配列を決定する。本発明はさらに、本発明の方法に１よって製造された相同的 に組換えられた一次または二次細胞、相同的に組換えられた（ＨＲ）−次または 二次細胞という、および該ＨＲ−次または二次細胞の用途に関する。

本発明はまた、を推動物由来の一次細胞、二次細胞または不死化（ｉｍｍｏｒｔ ａｌｉｚｅｄ）細胞中に存在する通常は該細胞中では全く発現されないか細胞中 で有意量では発現されない遺伝子を働かせる、すなわち活性化させる方法に関す る。相同組換えまたはターゲティングを用いて、対応する非トランスフェクト（ ｎｏｎｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）細胞中で見られるレベルより高いレベルで遺伝 子を発現させる調節配列を有する遺伝子と関係するのが正常である調節領域を置 換または不活性化する。したがって、本発明は、トランスフェクト−次、二次ま たは不死化細胞中で目的の産物をコードする内因性遺伝子を働かせる、すなわち 活性化させることによってタンパク質を製造する方法に関する。

本明細書で使用する場合、−次細胞という用語は、を推動物組織ソースから単離 した（平板培養する前、すなわち皿やフラスコなどの組織培養容器に付着させる 前に）細胞の懸濁液中に存在する細胞、組織から得た外植片中に存在する細胞両 者とも一次平板培養された前タイプの細胞、およびこれら平板培養された細胞か ら得た細胞懸濁液を包含する。二次細胞または二次細胞株という用語は、培養中 のその後のすべての段階の細胞をいう。すなわち、−次平板細胞を培養容器から 取り出し、再び平板培養（継代）したとき、本明細書中ではこれをその後の継代 におけるすべての細胞とともに二次細胞と呼ぶ。二次細胞は、１回以上継代され た二次細胞より成る細胞株である。細胞株は、Ｉ）１回以上継代され、２）培養 中に有限回数の平均集団倍化を示し、３）接触によって阻害される足場依存性増 殖の性質を示しく足場依存性は懸濁培養で増殖される細胞には適用されない）、 シかも４）不死化されないことを特徴とする二次細胞から成る。［クローン細胞 株」とは、単一の創始細胞に由来する細胞株であると定義する。［不均一細胞株 」とは、２個以上の創始細胞に由来する細胞株であると定義する。

本発明は、ゲノムに安定的に組み込まれているか細胞中でエピソーム的に発現さ れている外因性ＤＮＡでトランスフェクトされた線維芽細胞、ケラチン細胞、上 皮細胞、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、血液細胞成分（ｆｏｒｍｅｄ　ｅｌ ｅｍｅｎｔｓ）、筋肉細胞、その他の培養可能体細胞、及び体細胞前駆体等の一 次および二次体細胞を包含する。生じた細胞は、それぞれトランスフェクト−次 細胞（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｃｅｌｌｓ）およびトランス フェクト細胞細胞と呼ぶ。該外因性ＤＮＡは、１）治療目的の産物である翻訳産 物（例えばタンパク質）や転写産物（例えばリボザイムやアンチセンス核酸配列 ）などの産物をコードし、２）それ自体が治療目的の産物（例えば細胞調節タン パク質に結合するか遺伝子発現を変化させるＤＮＡ）であるか、３）レシピエン ド細胞（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ　ｃｅｌｌｓ）のゲノムＤＮＡとの相同組換えを受 けて内因性遺伝子の発現の変化（増大または低下）をもたらすＤＮＡである。

外因性ＤＮＡがレシピエンド細胞によって発現される翻訳または転写産物をコー ドする態様においては、生じる産物は細胞内に保持され、細胞膜に取り込まれる か細胞から分泌される。本態様においては、治療目的の産物をコードする外因性 ＤＮＡは、トランスフェクト細胞中の外因性ＤＮＡの発現に充分な付加的（ａｄ ｄｉｔｉｏｎａｌ）Ｄ　Ｎ　Ａ配列とともに細胞に導入され、それらの配列に効 果的（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）に結合される。

外因性ＤＮＡが発現されない態様においては、遺伝子産物は存在せず、ＤＮＡ自 体が治療目的の産物となる。本態様においては、外因性ＤＮＡは、たとえば細胞 調節タンパク質に結合するＤＮＡ配列、トランスフェクト−次または二次細胞中 に存在するタンパク質、または核酸のキレート形成（ｓｅ−ｑｕｅｓｔｒａｔｉ ｏｎ）に充分なりＮＡ配列、染色体の二次または三次構造を変化させるＤＮＡ配 列、または転写調節要素であるＤＮＡ配列である。外因性ＤＮＡを発現させるか 利用可能ならしめるために改変された上記−次細胞は、本明細書ではトランスフ ェクト−次細胞と呼び、組織から取り出し、初めて培地上に置かれた細胞を含む 。外因性ＤＮＡを発現させるか利用可能ならしめるために改変された二次細胞は 、本明細書ではトランスフェクト細胞細胞と呼ぶ。

外因性ＤＮＡがトランスフェクト（レシピエンド）細胞のゲノムＤＮＡとの相同 組換えを受ける態様においては、該外因性ＤＮＡを導入すると、内因性（ゲノム 性）配列の全体または一部を置換するか内因性配列を破壊することによって、該 内因性遺伝子の発現を支配する内因性配列が無力化される。

本発明の方法によってトランスフェクトを受けた一次および二次細胞は３つのタ イプまたは範嗜に分れる。すなわち、ｌ）治療目的の産物を産生じたり含有した りしない採取したままの（ａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ）細胞、２）治療目的の産物 を産生ずるか含有するが、正常より少ない量（生理的に正常な下限より少ない量 ）または不完全である細胞、および３）生理的に正常なレベルで治療目的の産物 を産生するがその含有量または産生量を増大または強化すべき細胞である。

外因性ＤＮＡは様々な手法によって一次または二次細胞に導入される。たとえば 、治療目的のタンパク質をコードする外因性ＤＮＡおよびレシピエンド細胞中で の発現に必要な付加的ＤＮＡ配列を含む構築物をエレクトロポレーション、顕微 注入、またはその他の手段（たとえばリン酸カルシウム沈殿法、リン酸カルシウ ム沈殿法変法、ポリプレン沈殿法、リポソーム融合法、受容体介在ＤＮＡ送達法 ）によって−次または二次細胞に導入する。あるいは、外因性ＤＮＡを含むレト ロウィルスベクターなどのベクターを用いることができ、該ベクターに感染させ ることで細胞を遺伝的に改変させることができる。

トランスフェクト−次および二次細胞は、外因性ＤＮＡ以外にも、発現されると 抗生物質抵抗性、細胞毒性物質抵抗性、原栄養性、または表面タンパク質の発現 などの選択可能表現型をレシピエンドに付与する選択（ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ） マーカーをコードするＤＮＡを任意に含有していてもよい。それが存在すること で、外因性ＤＮＡを含有する細胞を同定し選択することが可能になる。ｎｅｏ、 ｇｐｔＳｄｈｆｒ、ａｄａ、ｐａｃ、ｈｙｇ、ｍｄｒ、およびｈｉｓＤなと様々 な選択マーカー遺伝子を用いることができる。

本発明のトランスフェクト細胞は、トランスフェクト−次細胞の集団、トランス フェクトクローン細胞株、トランスフェクト不均一細胞株、および前記３つのト ランスフェクト細胞範嗜の一つに属する少なくとも１個の代表的細胞が存在する 細胞混合物として、また、ｌ）治療目的のタンパク質（たとえば個体中に存在し ないか、個体の生理的要求より産生量が少ないか、欠損しているか、非効率的ま たは不適当に利用されているタンパク質、酵素機能や輸送機能などの新規機能を 存するタンパク質）、または２）治療目的の核酸（たとえば調節タンパク質と結 合、すなわちキレ−１・形成するＤＮＡ、遺伝子発現を阻害するか本質的酵素活 性を有するＲＮＡ）のいずれかである治療目的の産物の送達に反応する異常また は好ましくない状態を有する個体の治療のための送達システムとして有用である 。治療目的のタンパク質または核酸を提供する本発明の方法においては、トラン スフェクト−次細胞、クローン細胞株または不均一細胞株を、異常または好まし くない状態を治療または予防しようとする個体に対し、生理的に意義のあるレベ ルで外因性ＤＮＡを発現または利用可能にするのに充分な量と適当な経路で投与 する。生理的に意義のあるレベルとは、その産物の体内産生レベルに近いか、異 常または好ましくない状態の改善をもたらすレベルである。本方法において投与 される細胞は、治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡ、それ自体が治療目的 の産物である外因性ＤＮＡ、または相同組換えによってゲノムＤＮＡ中のあらか じめ選ばれた部位に導入され、レシピエンド細胞に正常状態ではその細胞中に発 現されない産物を産生させるか、対応する非トランスフェクト細胞中で生じるよ りも高いレベルで該産物を産生させるよう機能する、調節配列などの外因性ＤＮ Ａのトランスフェクトを受けた細胞である。調節配列（たとえばプロモーター） が導入される態様においては、該調節配列は、正常では遺伝子と関連している調 節配列を置換または無力化させ、対応する非トランスフェクト細胞中で生じるレ ベルより高いレベルでの該遺伝子の発現をもたらす。

図面の簡単な説明 ［１１は、マウスメタロチオネインプロモーターの支配下にあるヒト成長ホルモ ン（ｈＧＨ）遺伝子を含むプラスミドｐＸＧＨ５の概略図である。

図２は、プラスミドｐｃＤのＢａｍＨ１部位に挿入したプラスミドｐＳＶ２ｎｅ ｏに由来するｎｅｏコード領域（ＢａｍＨＩ−Ｂｇｌｌｌ断片）、ｐＢＲ３２２ 由来のＡｍｐ−Ｒ配列とｐＢＲ３２２０ｒｉ配列、およびＳＶ４０由来のポリ八 と１６３スプライスジヤンクシヨンと初期プロモーター領域を含むプラスミドｐ ｃＤＮＥｏの概略図である。

図３は、ヒト成長ホルモン遺伝子およびｎｅｏ遺伝子を含むプラスミドｐＸＧＨ ３０１の概略図である。

図４は、本発明の方法の流れ図である。

図５は、プラスミドｐＸＥＰｏ　Ｉの概略図である。黒色実線アークはＩ）ＵＣ １２バックボーンを示し、矢印はアンピシリン抵抗性遺伝子の転写の方向を示す 。点線アークはマウスメタロチオネインプロモーター（ｐｍＭＴｌ）を示す。黒 ボックスによって遮られた白抜きアークはヒトエリスロボエチンＥＰＯ遺伝子を 示す（黒ボックスはエキソンを示し、矢印はｈＥＰｏ転写方向を示す）。制限エ ンドヌクレアーゼ認識部位の相対的位置を示す。

図６は、プラスミドｐＥ３ｎｅｏＥＰｏの概略図である。

ヒトエリスロポエチン遺伝子およびｎｅｏならびにａｍｐ抵抗性遺伝子の位置を 示す。矢印は様々な遺伝子の転写の方向を示す。ｐｍＭＴｌはマウスメタロチオ ネインプロモーター（ｈＥＰｏ発現を促す）を示し、ｐＴＫは単純ヘルペスウィ ルスチミジンキナーゼプロモーター（ｎｅｏ発現を促す）を示す。マツプの点線 部分は、ヒトＨＧＰＲＴ配列の位置を示す。制限エンドヌクレアーゼ認識部位の 相対的位置を示す。

図７は、ｈＥＰｏ遺伝子を転写的に活性化させる方法の図式である。

図８は、ｈＥＰｏ遺伝子を転写的に活性化させる方法の図式である。

図９は、トランスフェクト−次ヒト皮膚線維芽細胞（２系統、ＨＦ９６−１１と ＨＦ９６−２３）による長期インビトｔｆｆｈＧＨ産生の判定結果を示す。

図１Ｏは、トランスフェクト−次つサギ皮膚線維芽細胞によるインビトロでのヒ ト成長ホルモン（ｈＧＨ）発現のグラフ図である。

図１１は、トランスフェクトｈＧＨ発現つサギ線維芽細胞を移植されたマウスに おけるｈＧＨの血清レベルの経時変化を調べるアッセイの結果を示す。

図１２は、腎臓被膜下移植片から回収した細胞におけるヒト成長ホルモン（ｈＧ Ｈ）発現のグラフ図である。

図１３ａは、対照マウスおよびトランスフェクトｈＥＰ。

発現ウサギ線維芽細胞を移植されたマウスにおけるヘマトクリット（ＨＣＴ）値 を示す。

図１３ｂは、トランスフェクトｈＥＰｏ発現つサギ線維芽細胞を移植されたマウ スの血清中のｈＥＰｏを検出するアッセイの結果を示す。

発明の詳細な説明 本発明は、治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡ、それ自体が治療目的の産 物である外因性ＤＮＡ、および／またはトランスフェクト細胞に対してそれに対 応する非トランスフェクト細胞中に存在するレベルより高いレベルで遺伝子を発 現させる外因性ＤＮＡをトランスフェクトされたを推動物由来、とりわけ哺乳類 由来の一次および二次体細胞に関する。

本明細書で説明するように、を推動物、とりわけ哺乳類由来の一次または二次細 胞に治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡをトランスフェクトすると、長期 間にわたりインビトロとインビボのいずれにおいてもコードされた治療目的の産 物を安定的かつ再現的に産生することが示されている。また、核トララスフェク トー次および二次細胞は、生理的に意義のあるレベルでインビボで該コード化産 物を発現し、移植後の回収が可能で、再培養すると増殖し移植前の性質を示すこ とが示されている。この事実は、当該分野に習熟せる者が予想することと全く対 照的である。なぜなら、たとえば、当該分野の専門家でさえも、正常な体細胞の 寿命は育成であること、およびレトロウィルスを用いて細胞を遺伝的に改変させ ないかぎり、遺伝子療法への使用を妨げる適切な移植可能細胞を単離または培養 することができないとみているからである。ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ａ、Ｄ、 ）、　Ｂｌｏｏｄ、　７６：２７１−２７８（１９９０）。

ところが、レトロウィルスで処理した線維芽細胞を移植しても、せいぜい一時的 に代謝が向上するだけであることが示されており、治療方式としては大きな限界 があるとみられている。正常（不死化されていない）線維芽細胞は、「リン酸カ ルシウム沈殿法を用いてトランスフェクトするのが連続細胞株よりはるかに困難 である」という特徴がある。ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ａ、Ｄ、）、　Ｂｌｏｏ ｄ、　７６：２７＋−２７８（１９９０）。さらに、遺伝子療法のためにレトロ ウィルスを使わない方法を検討するにあたり、当該分野の専門家らは次のように 考えるのが普通である。

すなわち、「・・・遺伝子送達の効率は低く、・・・療法に必要な数百万の適切 な変化を保証するためには、医師は不可能な数の細胞を患者から入手しなければ ならないであろう」［ベルｖ　（Ｖｅｒｍａ、　１．Ｍ、）、　５ｃｉｅｎｔ、 　Ａｍｅｒ、、　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　１９９０゜ｐａｇｅｓ　６８−８４　］。

驚くべきことに、本出願人らは、目的の産物（すなわち治療目的のタンパク質ま たはそれに対する抗体が産生される抗原である翻訳産物）をコードする外因性Ｄ ＮＡを含み、該外因性ＤＮＡを安定的に発現するトランスフェクト−次または二 次細胞を製造することに成功している。本明細書で説明する方法を用いれば、そ の他の翻訳産物（天然には産生されない新規タンパク質）や転写産物（たとえば アンチセンスＲＮＡまたはりボザイム）をコードする外因性ＤＮＡまたはそれ自 体が治療目的の産物（たとえば、トランスフェクト細胞中に存在する調節タンパ ク質と結合する外因性ＤＮＡ）である外因性ＤＮＡを含むトランスフェクト−次 または二次細胞を製造することもできる。

本発明の方法は、Ｉ）ｌ−ランスフエクトー次細胞を投与される個体またはその 他のソースから得られた一次細胞の集団を提供し、２）該−次細胞または一次細 胞由来二次細胞に、上記のような外因性ＤＮＡおよび上記のような必要な付加的 ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を導入してトランスフェクト−次または二次細胞 を製造し、３）トランスフェクト−次または二次細胞を増殖に適した条件下で維 持し、４）トランスフェクト−次または二次細胞を同定し、５）増殖に適した培 養条件下で十分な時間にわたり維持することによって（４）で同定したトランス フェクト−次または二次細胞からコロニーを作成することで、（４）で同定した （創始）細胞由来の細胞株を作成するというステップから成るものである。本方 法の一つの態様においては、ＤＮＡ構築物に存在する配列とゲノムＤＮＡに存在 するＤＮＡ配列の間の相同組換えによって外因性ＤＮＡをゲノムＤＮＡに導入す る。

トランスフェクト二次細胞のクローン集団を製造する本発明の方法の一つの態様 においては、−次または二次細胞を含有する細胞懸濁液を、治療目的の産物をコ ードする外因性ＤＮＡおよびｎｅｏ遺伝子などの選択マーカーをコードするＤＮ Ａと混合する。該２つのＤＮＡ配列は、同一のＤＮＡ構築物または２つの異なる ＤＮＡ構築物上に存在する。得られた混合物は、２５０〜３００ボルト、９６０ μフアラツドのキャパシタンスで、細胞がＤＮＡ構築物を取り込むのに適した一 定時間（たとえば１４ないし２０ミリ秒）というのが通常の条件であるエレクト ロボーレーシコンに付す。別の態様においては、ｌ［注射を用いてＤＮＡ構築物 を一次または二次細胞に導入する。いずれの態様においても、外因性ＤＮＡを導 入すると、トランスフェクト−次または二次細胞ができる。

不均一細胞株を製造する本発明の方法においては、単一のトランスフエクト−次 または二次細胞を単離して創始細胞として使わないこと以外はクローン細胞株の 製造について説明したのと同じステップを実施する。異なる点は、複数のトラン スフェクト−次または二次細胞を培養して不均一細胞株を製造することである。

本発明はまた、外因性ＤＮＡによってコードされるタンパク質に対して特異的な 抗体を製造する方法にも関する。該方法においては請求める抗体に対する抗原を 発現するトランスフェクト−次または二次細胞を動物レシピエンド（たとえばウ サギ、マウス、ブタ、イヌ、ネコ、ヤギ、モルモット、ヒツジ、ヒト以外の霊長 類）に導入する。動物レシピエンドは発現される抗原に対する抗体を産生するが 、該抗原は完全タンパク質抗原であってもよいし、完全抗原をコードする無傷の 遺伝子の断片によってコードされるペプチドであってもよい。該動物からポリク ローナル血清を得る。トランスフェクト−次または二次細胞を使用することによ ってモノクローナル抗体を製造することもできる。目的のモノクローナル抗体に 対する抗原を発現するトランスフェクト−次または二次細胞の動物レシピエンド から牌臓細胞を採取する。コブロウスキーら（Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ 、　）　（米国特許第４，１７２，１２４号）の方法やケーラーら（にｏｈｌｅ ｒ　ｅｔ　ａｌ、）　［Ｎａｔｕｒｅ　２５６＋４９５−４９７　（１９７５） 　］の方法など公知の方法を用いて該牌臓細胞を骨髄腫細胞と融合させ、目的の モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞を製造する。得られたポリク ローナル抗血清およびモノクローナル抗体は、その他の方法によって製造された 抗体と同じ目的（たとえば診断、予防、治療の目的）に用いることができる。

本発明は、異常または好ましくない状態の治療において応用範囲が広く、様々な 産物を個体に提供するために用いることができる。たとえば、本発明は、分泌タ ンパク質（主に全身性の作用または主に局所性の作′用があるもの）、膜タンパ ク質（たとえば新たな細胞応答性や強化された細胞応答性を付与したり、毒性産 物の除去を促進したり、細胞を標識化またはターゲティングする目的で）、また は細胞内タンパク質（たとえば遺伝子発現に影響を及ぼしたり自己消化作用を得 る目的で）を提供するために用いることができる。また、本発明は、遺伝子発現 を変化させるアンチセンス（ａｎｔ　１−ｓｅｎｃｅ）アプローチにおいて有用 な操作ＲＮＡを製造するかそれに対して個体中で免疫応答が起きる抗原を提供す る（ワクチン投与のように疾患を予防するため、または既存の状態を抑制するた めに）目的で、細胞タンパク質と結合するかキレート形成するように設計された ＤＮＡを提供するために用いることができる。本発明は、異常または好ましくな い状態の治療において、ｌ）治癒性がある（一つの遺伝子療法治療は患者の寿命 を延長させる可能性がある）、２）精密な投与が可能である（生理的要求に基づ く必要なタンパク質の最適用量を患者の細胞が連続的に決定し送達させるうえに 、安定トランスフェクト細胞株は移植に先立ち詳細にインビトロでキャラクタラ イゼーシコンされて長期インビボ機能を正確に予想することができる）、３）患 者を治療する際に適用が簡単である、４）患者の承諾に関する問題を排除する（ １回の遺伝子療法治療を行なった後で毎日タンパク質を注射する必要がなくなる ）、５）治療費用が減る（治療目的のタンパク質は患者自身の細胞によって合成 されるので、コストのかかるタンパク質製造と精製の投資が不要になる）、およ び６）安全である（本発明は、患者の細胞を遺伝的に操作するためにレトロウィ ルスなどの感染性物質を使用することはないので、他の遺伝子療法方式の妨げと なっている安全性と作動性の問題が解決される）という点でとくに有利である。

本明細書でさらに説明するように、を推動物、とりわけ哺乳類由来の一次または 二次細胞にＥＰＯをコードする外因性ＤＮＡをトランスフェクトすると、長期間 にわたりインビトロとインビボのいずれにおいてもコード化ＥＰＯを再現的に産 生することが示されている。また、トランスフェクト−次および二次細胞は生理 的に意義のあるレベルでインビボでＥＰＯを発現することが示されている。発現 されたＥＰＯはヒト尿から精製されたＥＰＯまたは組換えヒトＥＰＯに特有のグ リコジル化パターンを有することが示されている。

また、本明細書でさらに説明するように、を推動物、とりわけ哺乳類由来の一次 または二次細胞にｈＧＨをコードする外因性ＤＮＡをトランスフェクトすると、 コードされたｈＧＨを長期的にインビトロとインビボのいずれにおいても再現的 に産生ずることが示されている。また、該トランスフェクトー次および二次細胞 は生理的に意義のあるレベルでインビボでｈＧＨを発現することが示されている 。

出願人らはまた、ＥＰＯをコードする外因性ＤＮＡを安定的に発現するトランス フェクト−次または二次細胞、上記トランスフェクト細胞のクローン細胞株およ び不均一細胞株を製造する方法、クローン及び不均一細胞株を製造する方法、お よびＥＰＯを発現するトランスフェクト細胞を用いて該コード産物を生理的に意 義のあるレベルで哺乳類個体に送達する方法を完成した。本明細書で説明する構 築物および方法は、たとえばＥＰＯ産生および／または機能が増大または強化さ れる必要のある［たとえば、低下すなわち正常以下であるか、正常であってもそ の個体が赤血球産生の強化によって少なくとも一時的に利益を受ける場合（たと えば透析前療法または透析療法実施中、ＡＺＴでエイズを治療中、手術後、また は化学療法実施中）］個体（ヒト）を治療するのに作用である。

やはり本明細書で説明するように、を推動物、とりわけ哺乳類由来の一次または 二次細胞に、インスリントロピンをコードする外因性ＤＮＡをトランスフェクト すること、およびそれらを用いて、インスリンの産生、機能および／または感受 性が低下している個体にインスリントロピンを提供することができる。本明細書 で使用する場合、インスリントロピンという用語は、たとえばＧＬＰ　（７−３ ７）、ＧＬＰ　（７−３６）、ＧＬＰ−１（７−３５）　、ＧＬＰ−１（７−３ ４）などのグルカゴン様ペプチドｌ　（ＧＬＰ−１）の誘導体、ならびにインビ ボのアミド化酵素によって生じるそれらのカルボキシ末端アミド化誘導体、トラ ンケートされた（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＧＬＰ−１のそれと実質的に同じ生物活 性または血中安定性か、強化された生物活性または安定性をもたらすアミノ酸変 化またはその他の変化を有する誘導体を含む。

本明細書でさらに説明するように、本出願人らは、ＤＮＡ構築物またはプラスミ ド中で一次または二次を推動物細胞にＤＮＡを導入し、相同組換えによって該ト ランスフェクトー次または二次細胞のゲノムに組み込むことができるということ も明らかにした。すなわち、本出願人らは、−次および二次哺乳類細胞における ジーンターゲティングを証明したのである。本出願人らは、さらに、該外因性Ｄ ＮＡは相同組換え体（ＨＲ）細胞中に目的の機能を有すること、および選択マー カー遺伝子によって付与される検出可能表現型に基づいて正しくターゲティング された細胞を同定することができるということも証明した。

また、本発明は、トランスフェクト−次、二次、または不死化細胞を用いてタン パク質を製造する方法に関する。本方法は、−次細胞、二次細胞、または不死化 細胞に治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡ、または治療目的の産物をコー ドする内因性遺伝子にターゲティングしかつそれを活性化させるのに十分なりＮ Ａをトランスフェクトするものである。

たとえば、実施例１８ｆと１９と２１は、選択された内因性遺伝子のターゲティ ングおよび活性化によるタンパク質製造について説明している。

本出願人らは、選択マーカー遺伝子を含有するプラスミド（プラスミドｐｃＤＮ Ｅｏ）、治療目的の産物をコードする遺伝子を含有するプラスミド（プラスミド ｐＸＧＨ５）　、または両方の遺伝子を含有するプラスミド（ｐＸＧＨ３０１） の構築について説明する（実施例３）。また、ヒトゲノム中の特定の遺伝子座（ ＨＰＲＴ座）へのターゲティングと薬剤抵抗性表現型に基づく選択に有用なプラ スミドの構築についても説明する（実施例１８ａ）。このプラスミドをｐＥ３Ｎ ｅｏと呼び、細胞ゲノムのＨＰＲＴ座へ組み込むと、ｈｐｒｔ−１６−ＴＧ抵抗 性表現型を有しやはり０４１８抵抗性を示す細胞ができる。上記のように、本出 願人らは、樹立細胞に導入されたＤＮＡがＨＰＲＴ遺伝子のエキソン３の位置に あることを証明することによって、樹立ヒト線維芽細胞系におけるジーンターゲ ティングにおいてｐＥ３Ｎｅｏが正しく機能することを明らかにした（実施例１ ８ｂ）。

また、本出願人らは、ｐＥ３Ｎｅｏを用いる一次および二次ヒト皮膚線維芽細胞 におけるジーンターゲティングを証明しく実施例１８　ｃ）　、治療目的の産物 ［ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）］をコードする遺伝子のヒトゲノムへのターゲテ ィング挿入（ｔａｒｇｅｔｅｄ　１ｎｓｅｒｔｉｏｎ）のためのプラスミドの構 築について説明する（実施例１８ｄ）。本願はさらに、ＤＮＡ末端の改変がゲノ ムＤＮＡへのＤＮＡターゲティングを強化すること（実施例１８ｃと実施例１８ ｅ）、および様々なターゲティングブラスミドの構築を強化することを明らかに する。

たとえば、本出願人らは、ヒト細胞中で機能することが知られているネズミプロ モーターの支配下にヒト遺伝子をおくための（実施例１８ｆ、！＝１８ｉ）、遺 伝子をフランキングするアプローチを用いるターゲティングされる二次線維芽細 胞の単離のための（実施例１８ｇ５１８ｈ、１８ｊ、１８ｋ）、コード産物を発 現する相同組換え体−次または二次細胞を製造するために、ヒト以外またはヒト の由来のプロモーターの支配下において、−次または二次細胞中では正常に発現 されないヒト遺伝子をおくための、ターゲティングブラスミド（実施例１８ｆ− １８ｋ）について説明する。

さらに本発明の二つの態様について説明するが（実施例１９）、いずれも、遺伝 子（たとえばヒトＥＰＯ遺伝子）の上流にある正常調節配列を変化させて、非ト ランスフェクト状態では検出可能な量の遺伝子産物を発現しないのが普通である 一次または二次細胞株中での遺伝子産物の発現を可能にするものである。一つの 態様においては、ターゲティング事象（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｅｖｅｎｔｓ）の 産物はキメラ性転写ユニットであり、調節要素および効果的に結合されたエキソ ンが、活性化させようとする目的の内因性遺伝子の上流に位置している。転写、 スプライシング、および翻訳の結果、該外因性ＤＮＡのエキソンＩによってコー ドされるアミノ酸が、内因性遺伝子中のエキソン２と下流エキソンによってコー ドされるアミノ酸と融合されたキメラ性タンパク質ができる。第２の態様におい ては、ターゲティング事象の結果、内因性遺伝子の調節配列とエキラン１配列が 、対応する外生配列で置換される。転写、スプライシング、および翻訳の結果、 上記したものと同様のキメラ性タンパク質ができる。通常、上記タンパク質の分 泌は、膜透過とシグナルペプチドの除去を伴い、その結果、このケースでは、キ メラ性シグナルペプチドを欠く正常なタンパク質ができる。いずれの場合も、キ メラ性タンパク質はこの時点で目的の調節要素の支配下にある。

実施例＋８ｆ−１８ｈおよび１９は、ヒトＥＰＯ遺伝子の上流の正常な調節配列 を変化させて、非トランスフェクト状態では検出可能な量のＥＰＯを発現しない 一次または二次線維芽細胞株におけるｈＥＰｏ発現を可能にする態様について説 明する。一つの態様においては、ターゲティングの結果、正常ＥＰＯタンパク質 は無傷のままであるが、マウスメタロチオネインプロモーターの支配下におかれ る。実施例１８ｉおよび１８３は、類似のターゲティング構築物を用いて一次ま たは二次ヒト線維芽細胞中で内因性成長ホルモン遺伝子を活性化させることを明 らかにする。ヒト線維芽細胞中のＥＰＯ発現の活性化に関するその他の態様にお いては、ターゲティング事象の産物はキメラ性転写ユニットであり、ヒト成長ホ ルモン遺伝子の最初のエキソンはＥＰＯエキソン２−５の上流に位置する。転写 （マウスメタロチオネインプロモーターの支配下にある）、スプライシング、お よび翻訳の産物は、ｈＥＰｏシグナルペプチドのアミノ酸１−４がｈＧＨのアミ ノ酸残基１−３で置換されたタンパク質である。このタンパク質のキメラ部分、 すなわちシグナルペプチドは分泌の前に細胞から除去される。

実施例は、ジーンターゲティングによって内因性遺伝子を活性化する方法であっ て、ｈＥＰｏコード領域とｈＧＨタンパク質コード領域の操作やその他の使用を 必要としない方法を提供するものである。これらの方法により、通常は不活性の 遺伝子を、インビボのタンパク質送達方法（たとえば遺伝子療法）およびインビ トロのタンパク質製造（たとえば薬剤製造）にとって望ましい性質を有する細胞 中で活性化させてもよい。

図７と８は、ｈＥＰｏ遺伝子を転写的に活性化するための２つの方法を説明する ものである。細線はｈＥＰｏ配列を示し、太線はマウスメタロチオネインＩプロ モーター、点線ボックスはｈＧＨの５′未翻訳領域、黒塗りボックスはｈＧＨの エキソン１、ストライブいりボックスはｈＥＰｏのイントロン１に由来する１０ ｂｐのリンカ−１網かけボックスは１１ＥＰＯの５′未翻訳領域、白抜きボック スはｈＥＰｏ配列コード配列、ＨＩＩＩはＨｉｎｄｌ１１部位を示す。

本明細書で説明する当該分野における通常の技術を有する者にとって明白な方法 、ＤＮＡ構築物、またはプラスミド、またはそれらに改変を加えたものを用いれ ば、治療目的の産物（たとえばタンパク質、リボザイム、核酸）をコードする外 因性ＤＮＡをを推動物（たとえば哺乳類、ヒトおよびヒ）・以外の両者）の−次 または二次細胞のゲノム中のあらかじめ選択された部位に挿入することができる 。

本明細書で説明する方法およびＤＮＡ構築物は、様々な目的に用いることができ る。該方法は、レシピエンドの一次または二次細胞中にすでに存在するＤＮＡを 修復、改変、欠失または置換する目的で、あるいは治療目的の産物またはその他 の目的産物をコードするかそれ自体が治療目的の産物またはその他の産物である 遺伝子またはＤＮＡ配列を一次または二次細胞中に（あらかじめ選択された部位 に）導入する目的で、あるいは−次または二次細胞レシピエンド中に存在する調 節配列に対して付加または置換を行なう目的で、あるいは−次または二次細胞中 に存在するある遺伝子の全体または一部をノックアウトまたは除去する目的で、 あるいは普遍的なドナー細胞を製造する目的で、を推動物由来の一次または二次 細胞を変化させるために用いることができる。

トランスフェクト−次または二次細胞は、選択可能表現量を付与する選択マーカ ーをコードするＤＮＡを含むことで、同定と単離をしやすくしてもよい。本出願 人らは、外因性ＤＮＡを安定的に発現するトランスフェクト−次または二次細胞 を製造する方法、上記トランスフェクト細胞のクローン細胞株および不均一細胞 株、該クローン細胞株および不均一細胞株を製造する方法、および本発明のトラ ンスフェクト−次または二次細胞の集団を使用することにより異常または好まし くない状態を治療または予防する方法も完成した。

本発明の方法によってトランスフェクトを受けさせる一次および二次細胞は様々 な組織から得ることができ、培養状態で維持することができるすべての細胞型を 含む。たとえば、本発明の方法によってトランスフェクトを受けさせることがで きる一次および二次細胞としては、線維芽細胞、ケラチン細胞、上皮細胞（たと えば乳房上皮細胞、腸上皮細胞）、内皮細胞、ダリア細胞、神経細胞、血液細胞 成分（たとえば白血球、骨髄細胞）、筋肉細胞、およびこれらの型の体細胞の前 駆体などが挙げられる。−次細胞は、トランスフエフｌ−−次または二次細胞を 投与される個体から得るのが好ましいが、−次細胞は、同種または別種（たとえ ばマウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、トリ、ヒツジ、ヤギ、ウ マ）のドナー（レシピエンド以外）から得てもよい。

トランスフェクト−次および二次細胞は、表現梨の選択の有無にかかわらず、実 施例５〜７で説明するようにして製造されたものであり、たとえばＥＰＯやイン スリノトロビンをはじめとする治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡを発現 することが示されている。

不死化細胞も本発明の方法によってトランスフェクトを受けさせることができ、 遺伝子療法またはタンパク質製造に用いることができる。本発明の方法によるタ ンパク質製造に有用な不死化ヒト細胞系の例としては、ＨＴＩ０８０、ＨｅＬａ 、ＭＣＦ−７乳癌細胞、Ｋ−５６２白血病細胞、Ｋ　Ｂ癌腫細胞、および２７８ ０ＡＤ卵巣癌細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。

外因性ＤＮＡ 本発明の方法によって一次または二次細胞に組み入れられる外因性ＤＮＡは、１ ）既存の状態を治療するかその発生を予防するのに有用な翻訳または転写産物な と一次または二次細胞における発現が望まれる翻訳または転写産物（たとえばＥ ＰＯまたはインスリノトロピン）をコードするＤＮＡ、および２）既存の状態を 治療するかその発生を予防するのに有用なりＮＡなど遺伝子産物はコードしない がそれ自体が有用であるＤＮ、Ａまたは３）レシピエンド細胞のゲノムＤＮＡと 相同組換えを起こして内因性遺伝子の発現の変化（増大または低下）が起きるＤ ＮＡである。

一次または二次細胞にトランスフェクトされたＤＮＡは目的産物全体をコードす ることができるが、該産物のたとえば単数または複数の活性部分または機能性部 分をコードすることもできる。該産物は、たとえばホルモン、サイトカイン、抗 原、抗体、酵素、凝固因子、輸送タンパク質、受容体、調節タンパク質、構造タ ンパク質、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、または天然には存在しないタンパ ク質または核酸（すなわち新規タンパク質または新規核酸）であることができる 。該ＤＮＡは、天然にそれを含むソースから得ることができ、また、遺伝子操作 技術や合成法を用いて製造することもできる。−次または二次細胞にトランスフ ェクトされたＤＮＡは、１つ以上の治療目的の産物をコードすることができる。

−次または二次細胞へのトランスフェクト後、該外因性ＤＮＡをレシピエンド細 胞のゲノムに安定的に組み込み（使用するＤＮＡ構築物中に存在する追加配列と ともに）、そのゲノムから発現されたりその他の機能を示す。あるいは、該外因 性ＤＮＡは、トランスフェクト−次または二次細胞内にエピソーム的に存在して もよい。

目的産物をコードするＤＮＡは、誘導可能プロモーターの支配下で細胞に導入し 、できた細胞またはそれを個体に導入したものは該産物を発現しないがそうなる ように誘導することができるという結果を得ることができる（すなわち、トラン スフェクト細胞が産生された後の移植前または移植後に産生を誘導する）。無油 、目的産物をコードするＤＮＡは、導入の時点で（すなわち誘導なしに）発現さ れるようなやり方で細胞に導入することができる。

選択マーカ一 様々な選択マーカーを一次または二次細胞に組み込むことができる。たとえば、 薬剤抵抗性、原栄養性、細胞毒性物質抵抗性、または表面タンパク質の発現など の選択可能表現型を付与する選択マーカーを用いることができる。用いることの できる選択マーカー遺伝子としては、ｎｅｏ、ｇｐｔ、ｄｈｆｒ、ａｄａ、ｐａ ｃ、ｈｙｇ、およびｈｉｓｄなどが挙げられる。付与された選択可能表現型は、 レシピエンドの一次または二次細胞の同定と単離を可能にする。

選択マーカーは、ポジティブ選択可能なものとネガティブ選択可能なものの２つ の範噴に分けることができる。ポジティブ選択においては、ポジティブ選択マー カーを発現する細胞は選択物質による処理に耐えることができる（ｎｅｏ、ｇｐ ｔＳ　ｄｈｆｒ、ａｄａｌｐａｃｌｈｙｇ、ｍｄｒｌｌおよびｈｉｓＤなど）。

ネガティブ選択においては、ネガティブ選択マーカーを発現する細胞は選択物質 の存在下で破壊される（たとえばｔｋ、ｇｐｔ）。

ＤＮＡ構築物 外因性ＤＮＡおよび必要に応じて選択マーカーをコードするＤＮＡをレシピエン ドの一次または二次細胞中での該外因性ＤＮＡの発現に必要な追加配列とともに 含むＤＮＡ構築物を用いて、該コード産物を製造しようとする一次または二次細 胞にトランスフェクトを受けさせる。該ＤＮＡ構築物は、宿主細胞ＤＮＡとの相 同組換えのためのターゲティング配列を含むこともできる。遺伝子産物をコード しない（および治療目的の産物である）外因性ＤＮＡ配列を含み、さらに必要に 応じて選択マーカーをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を用いて、−次また は二次細胞にトランスフェクトを受けさせることができる。あるいは、レトロウ ィルス、ヘルペス、アデノウィルス、アデノウィルス関連性、オタフクヵゼウィ ルス、ポリオウィルスベクターなどの感染性ベクターをこの目的に用いることが できる。

本発明の一つの態様においては、上記外因性ＤＮＡおよび該外因性ＤＮＡの発現 に必要な配列などの追加配列を含むＤＮＡ構築物を用いることができる（たとえ ばプラスミドｐＸＧＨ５またはプラスミドｐＸＥＰｏ　１）。ＤＮＡ構築物は、 該外因性ＤＮＡの発現を支配する誘導可能プロモーターを含むことで誘導可能発 現を可能にすることができる。任意には、該ＤＮ／ＩＩ築物は、細菌の複製開始 点および細菌中における大規模プラスミド増殖を可能にする細菌の抗生物質抵抗 性マーカーを含んでいてもよい。プロモーター、ポリアデニル化部位、およびス プライスジャンクションなどの追加配列とともに、選択マーカーをコードするＤ ＮＡを含むＤＮＡ構築物を用いて、トランスフェクト−次または二次細胞に選択 可能表現型を付与することができる（たとえばプラスミドｐｃＤＮＥＯ）。該２ つのＤＮＡ構築物は、本明細書で説明する方法を用いて一次または二次細胞に同 時トランスフェクションされる。あるいは、外因性ＤＮＡと選択マーカーと追加 配列（たとえば該外因性ＤＮＡの発現および選択マーカー遺伝子の発現に必要な もの）を含むＤＮＡ構築物を用いることもできる。このようなりＮＡ構築物（た とえばｈＧＨ遺伝子とｎｅｏ遺伝子を含むプラスミドＰＸＧ）（３０１、または ＥＰＯ遺伝子とｎｅｏ遺伝子を含むプラスミドｐＥ３ｎｅｏＥＰ。

：これらのプラスミドについては、それぞれ図３と６で説明する）。インスリノ トロピンをコードする外因性ＤＮＡと追加配列（たとえばインスリノトロピン発 現に必要な配列）を含む類似の構築物を製造することができる（たとえばプラス ミドｐＸＧＬＰ　Ｉ、実施例１１参照）。これらの構築物は、プロモーター、ポ リアデニル化部位、およびスプライスジャンクションなどその他の配列だけでな く、選択マーカーをコードするＤＮＡも含むこともてきる。

ＤＮＡが筋肉への注射などによって個体に直接注射される場合、該ＤＮＡ構築物 は、外因性ＤＮＡ、およびレシピエンド細胞への該ＤＮＡ構築物の進入の際にコ ード産物（たとえばＥＰＯ）の発現に必要かつ十分な調節配列を含む。

本発明のもう一つの態様においては、目的産物をコードする外因性ＤＮＡ、相同 組換えのためのターゲティング配列、および任意には１個以上の選択マーカーを コードするＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を用いて、相同組換えを起こさせる一次ま たは二次細胞にトランスフェクトを受けさせる。本態様においては、外因性ＤＮ Ａの発現に必要なりＮＡ配列も存在するのが普通である。遺伝子産物をコードし ない外因性ＤＮＡ配列を含み（および目的の産物である）、任意には選択マーカ ーをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を用いて、−次および二次細胞にトラ ンスフェクトを受けさせることもできる。

外因性ＤＮＡ、ターゲティング配列および選択マーカーは単一のＤＮＡ構築物上 または複数の構築物上にのせて細胞に導入することができる。ＤＮＡＨ４築物の 全長は成分（外因性ＤＮＡ、ターゲティング配列、選択マーカー遺伝子）の数お よびそれぞれの長さによって異なる。構築物の全長は少なくともヌクレオチド２ ０個以上であるのが普通である。外因性ＤＮＡがゲノムＤＮＡと相同組換えを起 こすのに十分な相同性を存する構築物の場合、該構築物は単一の成分すなわち外 因性ＤＮＡを含む。本態様においては、外因性ＤＮＡは相同性ゆえにゲノムＤＮ Ａ中への組み込みをターゲティングする（ｔａｒｇｅｔ　ｉｎｔｅｇａｔｉｏｎ ）役目も果たし、追加のターゲティング配列は不要である。このような構築物は 、完全遺伝子、遺伝子部分、調節要素またはその一部、または除去されると調節 配列と構造配列を機能的に類似させるＤＮＡ領域などの常在性ＤＮＡ配列のノッ クアウト、置換、または修復に有用である。外因性ＤＮＡが選択マーカーである 場合にも有用である。

第３の態様においては、ＤＮＡ構築物は、外因性ＤＮＡおよび通常は該外因性Ｄ ＮＡの両端に存在する１つ以上の分散したターゲティング配列を含む。ターゲテ ィング配列は、採取したままの細胞ゲノム中の、−次または二次細胞ゲノム中に 存在するのが普通であるＤＮＡ配列である（たとえば必須遺伝子、非必須遺伝子 または非コード性遺伝子、または以前の改変によってゲノム中に存在するもの） 。このような構築物は、ホルモン、サイトカイン、抗原、抗体、酵素、凝固因子 、輸送タンパク質、受容体、調節タンパク質、構造タンパク質、アンチセンスＲ ＮＡ、リボザイム、または天然には存在しないタンパク質または核酸などの治療 目的の産物をコードする外因性ＤＮＡの組み込みに有用である。とくに、外因性 ＤＮＡは以下のもののうちのｌｆｉをコードすることができる。すなわち、因子 Ｖｌ１１、因子■Ｘ、エリスロボエチン、アルファー１型アンチトリプシン、カ ルシトニン、グルコセレプロシダーゼ、成長ホルモン、低密度リポタンパク質（ ＬＤＬ）受容体、アポリポタンパク質Ｅ、ＩＬ−２受容体およびその拮抗剤、イ ンスリン、グロビン、免疫グロブリン、触媒抗体、インターロイキン、インスリ ン様成長因子、スーパーオキシドジスムターゼ、免疫応答物質修飾因子、副甲状 腺ホルモン、インターフェロン、神経成長因子、組織プラスミノーゲンアクチベ ーター、およびコロニー刺激因子である。このような構築物は、トランスフェク ト−次または二次細胞中のタンパク質または核酸のキレート形成に十分なりＮＡ 配列、細胞調節タンパク質に結合するＤＮＡ配列、染色体の二次構造または三次 構造を変化させるＤＮＡ配列、および−次または二次細胞のゲノムＤＮＡ中の転 写調節要素であるＤＮＡ配列などの治療目的の産物である外因性ＤＮＡの組み込 みにも有用である。

第４の態様においては、ＤＮＡ構築物は、外因性ＤＮＡ。

タープティングＤＮＡ配列、および少なくとも１個の選択マーカーをコードする ＤＮＡを含む。この第４の態様においては、構築物成分の順序は、ターゲティン グ配列−外置注ＤＮへ−単数または複数の選択マーカーをコードするＤＮＡ−タ ーゲティング配列であってよい。本態様においては、１個以上の選択マーカーが 構築物に含まれ、これによって選択可能表現型に基づく選択が可能となる。構築 物を安定的に組み込む細胞は選択物質による処理に耐える。安定トランスフェク ト細胞のサブセットはＨＲ細胞となるであろうが、このものはＰＣＲ、サザンハ イプリダイゼーシコン、および表現型スクリーニングをはじめとする様々な手法 によって同定することができる。

第５の態様においては、ＤＮＡ構築物中の成分の順序はターゲティング配列−選 択マーカーｌ−ターゲティング配列−選択マーカー２であってよい。本態様にお いては、選択マーカー２はネガティブ選択性を示す。すなわち、選択マーカー２ の遺伝子産物は、選択マーカー２を発現する細胞を殺す物質（通常は薬物または 代謝類似体）を含有する適当な培地処方における成長に対する阻害を基準として 選択することができる。選択マーカー１をフランキングするターゲティング配列 と宿主細胞ゲノム中の相同配列の組換えは、選択マーカー１のターゲティング組 み込み（ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）をもたらすが、選択マー カー２は組み込まれない。このような組換え事象は、選択マーカー１を安定的に トランスフェクトされているが選択マーカー２は安定的にトランスフェクトされ ていない細胞を生じるが、このような細胞は、選択マーカーｌの成長を許す選択 物質と選択マーカー２の成長を阻害する選択物質を含有する培地における成長を 基準として選択することができる。

ＤＮＡ構築物に関するすべての態様において、外因性ＤＮＡは１個以上の産物を コードすることができ、１個以上の治療目的の産物またはそれぞれの１個以上の ものであることができるので、複数の産物を送達することが可能となる。

本発明の方法を図４に概略的に示す。図に示すように、まず、を推動物の組織を 得るが、これはパンチ生検その他、対象の一次細胞盟の組織ソースを得る外科的 方法などの公知の手順を用いて行なう。たとえば、線維芽細胞またはケラチン細 胞のソースとしてパンチ生検を用いて皮膚を採取する。酵素消化または外片移植 などの公知の方法を用いて一次細胞の混合物を組織から得る。酵素消化を用いる 場合は、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、ジスバーゼ、プロナーゼ、トリプシ ン、エラスターゼ、キモトリプシンなどの酵素を用いることができる。

生じた一次細胞混合物は直接トランスフェクトに付してもよいし、まず培養し、 プレートから移し、再懸濁してからトランスフェクトに付してもよい。−次細胞 または二次細胞は、ゲノムに安定的に組み込ませる外因性ＤＮＡおよび任意には 選択マーカーをコードするＤＮＡと結合させ、トランスフェクトを行なうために 処理する。外因性ＤＮＡと選択マーカーコードＤＮＡはそれぞれ別の構築物（た とえばｐＸＧＨ５およびｐｃＤＮＥｏ、［Ｎ＋と２参照）上、または、単一の構 築物（たとえばｐＸＧＨ３０１およびｐＥ３ｎｅｏＥＰｏ、図３と図６参照）上 にある。適当な量のＤＮＡを用いて、外因性ＤＮＡを含有し正しく発現する少な くとも１個の安定トランスフェクト細胞を産生させる。一般に、Ｏ，１〜５００ μｇのＤＮＡを使用する。

本発明の方法を用いて１個の選択マーカー遺伝子だけを導入すると、原料細胞ｌ Ｏ万個あたり１７０個（エレクトロボーレーシコンによって処理された５８８個 の原料細胞のうち１個、実施例６）ないし２千個（顕微注入によって処理された ４９個の原料細胞のうちの１個、実施例５）の安定トランスフェクト細胞ができ る。本発明の方法を用いて治療目的の遺伝子と選択マーカー遺伝子を導入すると 、原料細胞ｌＯ万個あたり７個（エレクトロポーレーシコンによって処理された １４，７０５個の原料細胞のうち１個、実施例６）ないし９５０個（顕微注入に よって処理された１０５個の原料細胞のうちの１個、実施例５）の安定トランス フェクト細胞ができる。これらの安定トランスフェクト体のうちの４３〜９０％ が治療に遺伝子を発現する。正しく発現する細胞は１個あればよいので、原料細 胞はかなり少なくてよいことが明らかである。逆に、本発明の方法よりかなり効 率の悪いトランスフェクト方法を用いると、原料細胞ソースとして大量の個体組 織を使用しないかぎり、上記細胞は１つも得ることはできないであろう。

トランスフェクト−次または二次細胞を製造する本発明の方法の一つの態様にお いては、実施例で説明するようにエレクトロボーレーシコンによってトランスフ ェクトが促進される。エレクトロボーレーシコンは、単数または複数のＤＮＡ構 築物の一次または二次細胞への進入をもたらすのに適した電圧とキャパシタンス （および対応する一定時間）で行なわれる。エレクトロポーレーシコンは、広い 電圧範囲（たとえば５０〜２０００ボルト）と対応するキャパシタンスで行なう ことができる。本明細書で説明するように、エレクトロボーレーシコンは、２５ ０〜３００ボルトの範囲のエレクトロボーレーシコン電圧、および９６０μフア ラツドのキャパシタンスで行なう場合に非常に効率がよい。通常、合計約０゜１ 〜５００μｇのＤＮＡを使用する。実施例で説明するように、合計６０μｇ（７ ）ＤＮＡ、２５０〜３００ボルトの電圧、９６０μフアラツドのキャパシタンス 、１４〜２０ｍｓ　ｅ　ｃの一定時間という条件を使用すると効率がよいことが 示されている。

本発明の方法のもう一つの態様においては、顕微注入を用いて一次または二次細 胞をトランスフェクトに付す。例えば実施例５参照。あるいは、リン酸カルシウ ム沈殿法、リン酸カルシウム沈殿法変法、ポリブレン沈殿法、リポソーム融合法 、および受容体介在遺伝子送達法などの公知の方法を用いて細胞をトランスフェ クトに付すことができる。安定トランスフェクト二次細胞を増殖させるとともに トランスフェクト二次細胞のクローン細胞株を生じる培養条件下で十分な時間に わたり、ｉｌｌの安定トランスフェクト細胞を単離、培養、継代培養する。ある いは、複数のトランスフェクト細胞を培養、継代培養して、不均一細胞株を作成 する。

トランスフェクト−次または二次細胞は、治療目的の産物（たとえばＥＰＯ）を 効果的な量で個体に提供するのに十分なサイズのクローン細胞株または不均一細 胞株を産生させるのに十分な回数の倍化を起こす。一般に、たとえば０．１Ｃｍ ！の皮膚生検標本を採取すると、１０万個の細胞を含んでいると考えられる。１ 個の細胞を用いてクローン細胞株を作成し、約２７回の倍化を起こすと１億個の トランスフェクト二次細胞ができる。約ｌＯ万個の細胞から成るオリジナルのト ランスフェクト集団から１１１１の不均一細胞株を作成する場合、１億個のトラ ンスフェクト細胞を作成するには１０回の倍化で十分である。

トランスフェクトクローン細胞株または不均一細胞株中の必要な細胞の数は変化 し、様々な要素によって変わるが、その要素としては、トランスフェクト細胞の 使用、トランスフェクト細胞中の外因性ＤＮＡの機能レベル、トランスフェクト 細胞の移植の部位（たとえば、使用可能な細胞の数は移植の解剖学的位置によっ て制限される）、および患者の年齢、体表面積、および臨床状態などが挙げられ るがこれらに限定されない。これらの要素を考慮にいれると、明確な成長ホルモ ン欠損を有する点板外は健常な６０ｋｇの患者に治療作用レベルのヒト成長ホル モンを送達するためには、約１〜５億個のトランスフェクト線維芽細胞が必要で ある。これは、患者の親指の先端に存在する細胞の量にほぼ相当する。

外因性ＤＮＡのエピソーム発現 細胞内部に存在するがゲノムにまだ組み込まれていないＤＮＡ配列をエピソーム という。組換え体エピソームは少なくとも３つの状況において有用となる場合が ある。すなわち、り特定の細胞型が外因性ＤＮＡを安定的に組み込む能力を欠く 場合、２）特定の細胞型がＤＮＡの組み込みによって悪影響を受ける場合、およ び３）特定の細胞型が、組み込まれたＤＮＡではなくエピソームＤＮＡを持って いて向上した治療機能を示す能力がある場合である。

実施例で説明する遺伝子療法のトランスフェクトおよび培養アプローチを用いれ ば、エピソームのかたちの外因性ＤＮＡをを動物物の一次および二次細胞に導入 することができる。

エプスタイン−バールウィルスの複製開始点と該抗原のＤＮＡ配列を追加するこ とによってプラスミドｐＸＧＨ３０１をそのようなエピソームに変換することが できる［イエーツ（Ｙａｔｅｓ、　Ｊ、Ｌ、　）　、　Ｎａｔｕｒｅ　３１９ニ ア８０−７８８３　（１９８５）］　。あるいは、を椎動物の自己複製配列を該 構築物に導入することができる［ウェイドル（Ｗｅｉｄｌｅ、　Ｕ、）１．）　 、　Ｇｅｎｅ　７３（２）：４２７−４３７（１９８８）］。これらおよびその 他のエピソーム的に得られた配列も、選択マーカーを有さないｐＸＣ；８５など のＤＮＡ構築物に含ませることができる。次いで、本願に説明するようにして該 エピソーム外因性ＤＮＡを一次または二次を動物物細胞に導入する（選択マーカ ーがエピソームに含まれている場合、選択剤を用いてトランスフェクト細胞を処 理する）。

トランスフェクト二次細胞のクローン細胞株または不均一細胞株の移植 上記および下記実施例において説明する方法によって製造されたトランスフェク ト細胞は、治療目的の産物を送達しようとする個体に公知の方法を用いて導入さ れる。次いで、クローン細胞株または不均一細胞株を、様々な投与経路を用いて 様々な部位に（たとえば腎臓被膜下、皮下、中枢神経系（靴内（ｉｎｔｒａｔｈ ｅｃａｌ）を含む）、血管内、肝臓内、内臓内、腹腔内（大網内を含む）、また は筋肉内移植）公知の方法を用いて個体に導入する。トランスフェクト細胞は個 体に移植されると、外因性ＤＮＡによってコードされる治療目的の産物を産生ず るか、外因性ＤＮＡ自体によって影響を受ける。たとえば、血液中に正常に見ら れるタンパク質である因子ＩＸの欠損によって引き起こされる出血障害であるＢ 型血友病であると診断された個体は、遺伝子療法治療の対象候補である。

患者は微小皮膚生検を受けるが、これは外来で行なうことができる簡単な手順で ある。マツチの頭程の大きさの皮膚片をたとえば腕の下から採取するが、採取に は約１分かかる。試料を処理すると、患者の細胞（この場合は線維芽細胞）が単 離され、これに遺伝子操作を加えて、失われた因子ＩＸを産生させる。患者の年 齢、体重、および臨床状態に応じて必要数の細胞を大規模培養する。プロセス全 体で４〜６週を要するのが普通であり、終了時にやはり外来で、適当な数の遺伝 子操作細胞を個体に導入する（たとえば患者の皮膚下に注射して戻すことによっ て）。この時点で、患者は自己の因子ＩＸを産生ずる能力を獲得しており、もは や血友病ではなくなっている。

類似のアプローチを用いてその他の状態や疾患を治療することもできる。たとえ ば、ヒト成長ホルモンを発現する一次または二次細胞を移植することでヒト成長 ホルモンを個体に投与することによって小人症を治療することができ、ＥＰＯを 発現する一次または二次細胞を移植することによって貧血を治療することができ る。

上記実施例以外にも、上記のようにして製造されたインスリノトロビンコード性 ＤＮＡを含有するトランスフェクト細胞を、インスリン産生、分泌、機能および ／または感受性が低下している個体に送達する。これらのトランスフェクト細胞 は、公知の方法によって様々な投与部位で（たとえば腎臓、被膜下、皮下、中枢 神経系（靴内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）を含む）、血管内、肝臓内、内臓内、 腹腔内（大網内を含む）、または筋肉内移植）個体に導入される。トランスフェ クト細胞は個体に移植されると、外因性ＤＮＡによってコードされるインスリノ トロピンを産生する。たとえば、インスリン産生、分泌、または感受性が損なわ れている個体は、本明細書で説明するようにして製造されたイラスリノトロビン コード性外因性ＤＮＡ発現トランスフェクト細胞の移植による療法または予防治 療を受けることができる。遺伝子操作を行なう細胞は上記のようにして得、同様 にして十分な数の細胞を産生ずるように処理され、個体に再導入される。

これらの実施例が示唆するように、使用する細胞は患者特有の遺伝子操作細胞で あるのが普通であるが、同種の他の個体または異種から細胞を得ることもできる 。そのような細胞の使用は、移植細胞の拒絶を防ぐために免疫抑制剤の投与、組 織適合性抗原の変更、またはバリヤーデバイスの使用を必要とする。

一つの態様においては、バリヤーデバイス（ｂａｒｒｉｅｒ　ｄｅｖｉｃｅ）を 用いて、レシピエンド以外のソース（例えば別の者、又はウシ、イヌ、ブタ、ヤ ギ、ヒツジ、薩歯類等ヒト以外の哺乳類）から得た移植細胞の拒絶を防止するの に使用される。

本態様においては、外因性ＤＮＡによってコードされる産物がレシピエンドの循 環系または組織を通過することを許すが細胞とレシピエンド免疫系の接触を防止 して、細胞に対するレシピエンドの免疫応答（及び起こりつる拒絶）を防ぐ物質 （例えばアミコンＸＭ−５０などの膜）でできたバリヤーデバイスの中に、本発 明のトランスフェクト細胞は置かれる。

あるいは、ｈＧＨ，ＥＰＯ，又はインスリノトロビンをコードするＤＮＡを例え ば筋肉あるいはその他の適当な部位への直接注射法によって導入することができ る。本態様においては、ＤＮＡｆｌｌ築物は、治療目的の産物（例えばＥＰＯ、 インスリノトロピン）をコードする外因性ＤＮＡ及びレシピエンド細胞における 外因性ＤＮＡの発現に十分な調節配列を含んでいる。個体への注射後、ＤＮＡ構 築物は一部のレシピエンド細胞によって取り込まれる。ＤＮＡは単独で注射する こともできるし、生理的に適合性のある担体（例えば生理学的緩衝液）及び任意 にはＤＮＡ横築物の細胞への進入の効率を高めたり、ＤＮＡを安定化させたり、 ＤＮＡを分解がら守る物質等その他の成分を含む処方として注射することもでき る。

多くの疾患の場合、これは１回きりの治療であるが、他の疾患では頻回の遺伝子 療法治療が必要となろう。

トランスフェクト−次および二次細胞および細胞株の用途本明細書で説明するト ランスフェクト−次または二次細胞または細胞株は、酵素、ホルモン、サイトカ イン、抗原、抗体、凝固因子、アンチセンスＲＮＡ、調節タンパク質、転写タン パク質、受容体、構造タンパク質、リボザイム、新規（天然には存在しない）タ ンパク質および核酸産物、および遺伝子操作ＤＮＡ等の治療目的の産物の媒体ま たは送達システムとしての応用範囲が広い。例えば、トランスフェクト−次また は二次細胞を用いて治療作用タンパク質を提供することができ、そのようなタン パク質としては、ファクターＶ　ＩＩＩ、ファクターＩＸ、エリスロボエチン、 アルファー１型アンチトリプシン、カルシトニン、グルコセレブロシダーゼ、成 長ホルモン、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、アポリポタンパク質Ｅ、受容体 ＩＬ−２受容体およびその拮抗剤、インスリン、グロビン、免疫グロブリン類、 触媒抗体、インターロイキン類、インスリン様成長因子類、スーパーオキシドジ スムターゼ、免疫応答修飾物質、副甲状腺ホルモンおよびインターフェロン、神 経成長因子類、組織プラスミノーゲンアクチベーター類、およびコロニー刺激因 子類などが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、トランスフェクト −次および二次細胞を用いて個体を免疫することができる（すなわちワクチンと して）。

本発明の細胞株の多彩な用途は、以下に示すようにまとめると最も便利であろう 。該細胞株は下記の治療目的の産物を送達する目的に用いることができる。１． 主に全身作用を示す分泌タンパク質。２．主に局所作用を示す分泌タンパク質。

３、新規の、または強化された細胞応答性を付与する膜タンパク質。４．毒性産 物の除去を促進する膜タンパク質。５゜細胞を標識化またはターゲティングする 膜タンパク質。６゜細胞内タンパク質。７．遺伝子発現に直接的に影響する細胞 内タンパク質。８．自己消化作用を示す細胞内タンパク質。

９、調節タンパク質と結合またはキレート形成する遺伝子産物−遺伝子操作ＤＮ Ａ、ＩＯ，リボザイム。１１．遺伝子発現を阻害するためのアンチセンス−遺伝 子操作ＲＮＡ０本発明のトランスフェクト−次または二次細胞は、現在は患者の 協力としばしば医学スタッフの参加を要して静脈内、筋肉内、または皮下投与さ れている治療目的のタンパク質（たとえばホルモン、酵素、凝固因子）を投与す るために用いることができる。トランスフェクト−次または二次細胞を用いる場 合、個体に投与する前に、一般的に単離ポリペプチドを用いるときに必要なポリ ペプチドを高度に精製する必要はない。また、本発明のトランスフェクト−次ま たは二次細胞は正常に産生されるのと同じように治療目的の産物を産生する。

本発明のトランスフェクト−次または二次細胞を使用することの利点の一つは、 個体に導入される細胞の数を調節することによって体内に送達される産物の量を 調節することができることである。また、場合によっては、産物が不要になった ときにトランスフェクト細胞を除去することができる。本発明のトランスフェク ト−次または二次細胞を使用する治療のもう一つの利点は、亜鉛、ステロイド剤 、またはタンパク質産物または核酸産物の翻訳または転写に影響を及ぼすか核酸 産物の安定性に影響を及ぼす物質の投与などによって、治療目的の産物の産生を 調節することができることである。

本発明において説明するインビボのタンパク質製造および送達システムを用いて 治療目的で送達することができるその他の分子としては、グルカゴン様ペプチド Ｉ　（ＧＬＰ−１）およびグルカゴン様ペプチド１誘導体（ＧＬＰ−１誘導体） がある。ＧＬＰ−１誘導体としては、トランケートされた誘導体ＧＬＰ−１（７ −３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）、ＧＬＰ−１（７−３５）、ＧＬＰ−１（７ −３４）、およびその他のトランケートされたカルボキシ末端アミド化誘導体、 ならびにトランケートされたＧＬＰ−１誘導体のものと実質的に同じ生物活性ま たは唾中安定性、または強化された（トランケートされたＧＬＰ−１誘導体のも のより大きい）生物活性または血中安定性をもたらすアミノ酸置換、欠失、付加 、またはその他の変化（たとえば非アミノ酸成分の付加）を有するＧＬＰ−１誘 導体などが挙げられる。本明細書で使用する場合、ＧＬＰ−１誘導体という用語 は上記分子すべてを含む。本明細書で使用する場合、ＧＬＰ−１関連ペプチドと いう用語はＧＬＰ−１とＧＬＰ−１誘導体を含む。ＧＬＰ−１誘導体はインスリ ントロピンまたはインクレチンとも呼ばれ、胃腸管細胞によって正常に循環系に 分泌される。インビボの研究で、これらのペプチドは内分泌膵臓からのインスリ ン分泌を刺激しグルカゴン分泌を阻害するとともに末梢組織中のインスリン感受 性を増大させる機能を果たすことが明らかにａｌ、）　（＋９９２）　Ｎｅｗ　 Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３２６：１３１６−１３２２１　。インスリン非 依存壓糖尿病（ＮＩＤＤＭ）患者は、低下したインスリン感受性を補うために高 レベルのインスリンで治療されることが多い。したがって、ＧＬＰ−１誘導体に よるインスリン放出の刺激とインスリン感受性の増大はＮＩＤＤＭ患者にとって 利益となるであろう。インスリン分泌のインスリントロピン誘導刺激は血糖値に 強く依存するという事実はとくに重要であり、これらのペプチドはインビボにお ける血糖値上昇に反応してインスリン放出を刺激し、最終的には血糖値を下げる 作用を示すことが示唆される。

相同組換えによる遺伝子の調節配列の置換本明細書で説明するように、遺伝子タ ーゲティングを用いて、異なる遺伝子から単離した調節配列、または遺伝子工学 的方法を用いて合成した新規調節配列で遺伝子の既存の調節領域を置換すること ができる。このような調節配列は、プロモーター、エンハンサ−１骨格付着領域 、ネガティブ調節要素、転写開始部位、調節タンパク質結合部位、またはこれら 配列を組み合わせたものから成るものであってよい。（あるいは、産生されるＲ ＮＡまたはタンパク質の構造または安定性に影響を及ぼす配列は、ターゲティン グによって置換、除去、付加、またはその他の改変を加えることができ、そのよ うな配列としては、ポリアデニル化部位、ｍＲＮＡ安定性要素、スプライス部位 、タンパク質の輸送または分泌特性を強化または変化させるためのリーダー配列 、またはタンパク質またはＲＮＡ分子の機能または安定性を変化または向上させ るその他の配列などが挙げられる。） いくつかの態様が可能である。まず、ターゲティング事象は、調節配列の単純挿 入によって遺伝子を新しい調節配列の支配下におくものであってよい（たとえば 新規プロモーターまたはエンハンサ−またはその両者を遺伝子の上流に挿入する ）。次に、ターゲティング事象は、組織特異性ネガティブ調節要素の欠失など調 節要素の単純欠失であってよい。第３に、ターゲティング事象は、既存の要素を 置換するものであってよく、たとえば組織特異性エンハンサ−を天然に存在する 要素より広いか異なる細胞型特異性を有するエンハンサ−で置換することができ る。本懇様においては、天然に存在する配列が失われ、新規配列が付加される。

いずれの場合も、ターゲティングＤＮＡと近接の１個以上の選択マーカー遺伝子 を使用することで外因性ＤＮＡが宿主細胞ゲノムに組み込まれている細胞の選択 を可能にすることによって、ターゲティング事象の判定が促進される。ターゲテ ィングの判定は、ネガティブ選択マーカーが外因性ＤＮＡに連結されるがネガテ ィブ選択マーカーがターゲティング配列をフランキングするような、そして宿主 細胞ゲノム中の配列との正しい相同組換え事象がネガティブ選択マーカーの安定 組み込みをもたらさないような、ネガティブ選択性を示す１個以上のマーカー遺 伝子を使用することによっても促進される。この目的に有用なマーカーとしては 、単純ヘルペスウィルス・チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子または細菌キサンチ ン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子などが挙げら れる。

以下実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定さ れない。

実施例 ヒトの線維芽細胞は、旧り腎臓、肺、皮膚由来の生検試料を含めて、様々な組織 から得ることができる。ここに示されている方法は皮膚のｔｓ維芽細胞を単離す るために最適化されたもので、最小限度の不快感と危険で様々な年齢の個体から 容易に得られる（胚および胎児の線維芽細胞はこの方法を用いて同様に単離でき るかも知れない）、他の組織から線椎芽細胞を単離したいときはこの方法を多少 変更する必要があるかも知れない。

ヒトの皮膚は環状切除あるいはパンチ生検により得られる。その試料は三つの主 要な成分から成っている。それは皮膚そのものの表皮および真皮の層、および真 皮の層に付着した筋膜の層である。線維芽細胞は真皮および筋膜の両方から単離 することが可能である。

ｂ、ヒトの筋膜線維芽細胞の単離 およそ３ｃｍ”の組織をおよそｌｏｍｌの洗浄溶液（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ　 ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎＧ、１００μｇ／ｍｌ　ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ　５ｕｌ ｆａｔｅ、０．５μｇ／ｍＩ　Ｆｕｎｇｉｓｏｎｅを含むＨａｎｋ’ｓ　Ｂａ１ ａｎｃｅｄ　５ａｌｔ溶液）の中へ入れ室温で１０分間、計３回緩やかに攪拌し た。組織を次にＩＯｍ＋の消化溶液（０，１ｕｎｉｔｓ／ｍｌ　ｃｏｌｌａｇｅ ｎａｓｅ　Ａ、２．４ｕｎｉｔｓ／ｍｌ　ｇｒａｄｅ　ＩＩ　Ｄｉｓｐａｓｅを 含んだ洗浄溶液）を入れた１００ｍｍ組織培養皿に移した。

解剖顕微鏡の元に、皮膚を表皮が裏側になるようにする。

筋膜細胞は切り裂く事（ｂｌｕｎｔ　ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）により真皮や表皮 から分離される。筋膜組織は次に小さい断片（１ｍｍ未満）に切断され、回転台 の上で３７°Ｃで３０分間インキュベートされる。酵素／細胞懸濁液は取り除か れ、保存される。モして１Ｏｃｃの消化液を残った組織の断片にさらに加え、そ の組織は３０分間３７°Ｃで再インキュベートされる。酵素／細胞懸濁液はプー ルされ、１５ゲージの針に数回通し、１５０メツシユスクリーンを装備したＣｅ １ｌｅｃｔｏｒ　Ｓｉｅｖｅ（Ｓｉｇｍａ）に通す。細胞懸濁液をＩｌｌｏｏｒ ｐ、１５分間、室温で遠心分離する。上演は吸引され、ばらばらにされた細胞を １０ｍ１の栄養培地（以下を参照）に再懸濁した。線維芽細胞の培養は、細胞培 養処理用フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の上でおよそ４０，０００ｃ　ｅ　Ｉ　］ 　ｓ　／　ｃ　ｍ”の濃度で開始された。

Ｃ１ヒト真皮線維芽細胞の単離 筋膜は上述したように皮膚生検あるいは環状切除試料から遊離される。そして、 皮膚は０．５ｃｍ”未満の小さな断片に切断される。組織を０．２５％トリプシ ンで６０分間、３７℃でインキュベートする（あるいは、組織をトリプシンで１ ８時間、４°Ｃでインキュベートしてもよい）。解剖顕微鏡下で、真皮と表皮を 分離する。真皮の線維芽細胞は、筋膜の線維芽細胞について以前に記述されたよ うに単離される。

ｄ、ウサギの線維芽細胞の単離 方法は基本的に以前に記述されたとおりである。皮膚は、剃って、承認された方 法で外科的に調整された段歯溶液を用いて洗浄された領域から取られるべきであ る。

融合性（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）であるとき、最初のカルチャーは通常の方法でト リプシン処理され、およそ＋０，０００ｃ　ｅ　ｌ　１　ｓ　／　ｃｍ２になる ように蒔かれる。細胞を５％ＣＯｔを含む湿らせた空気のもと３７°Ｃで培養す る。ヒト線維芽細胞栄養培地（ＤＭＥＭ、ｓｏｄｉｕｍ　ｐｙｒｕｖａｔｅを含 む高ｇｌｕｃｏｓｅ、１０−１５％子牛血清、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　Ｇ、 ＩＯμｇ／ｍｌ　ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎｓｕｌｆａｔｅを含んている）は１週 間に２度交換する。

ｂ、　ウサギ線維芽細胞の培養 細胞はトリプシン処理され、ヒト線維芽細胞について記述されているように培養 する。ウサギ線維芽細胞栄養培地は２０％子牛血清を含むＭＣＤＢ　−１１０（ Ｓ　ｉ　ｇｍａ）と調節された培地の１＝１溶液で構成されている。調節された 培地とは基本的に、２−３８集合培養で生育したウサギ線維芽細胞から取り除か れたヒト線維芽細胞栄養培地（１５％子牛血清を含む）である。

実施例３．ヒト成長ホルモンおよびネオマイシン耐性遺伝子を持つプラスミド（ ｐＸＧＨ３０１）の構築ｐＸＧＨ３０１は二段階の方法で構築された。Ｉ）　Ｂ 　Ｒ３２２由来の５ａｌＩ−Ｃｏａｌ断片（ｐＢＲ３２２の２３−６５１の位置 ）が単離され、そして５ａｉｌ−Ｃｌａｌ処理ｐｃＤ　ＮＥＯの中へ挿入され、 その結果ｐｃＤＮＥｏのＳＶ４０初期プロモーター領域の上流にＢａｍＨ１部位 が導入された。このプラスミド、ｐＢＮＥｏをＢａｍＨ［で消化し、５Ｖ４０（ ７）初期プロモーターの支配下にあるｎｅｏ遺伝子を含む２．Ｉｋｂの断片が単 離され、ＢａｍＨＩで処理されたｐＸＧＨ５に挿入された。ｎｅｏとｈＧＨ遺伝 子はお互いに同じ方向に転写される、２．１ｋｂ　ＢａｍＨＩ断片の単一の挿入 を持つプラスミドが単離された。このプラスミドはｐＸＧＨ３０１と命名された （図３）。

実施例４．マウスメタロチオネインプロモーターの支配下にあるヒトエリスロボ エチン遺伝子を含むプラスミド（ｐＸＥＰＯＩ）の構築 発現プラスミドｐＸＥＰＯＩはマウスメタロチオネイン（ｍＭＴ）プロモーター により転写を制御されているｈＥＰ。

遺伝子を持っている。ｐＸＥＰＯＩは次のように構築される。プラスミドｐｔＪ ｃ１９（八Ｔ　ＣＣ＃３７２５４）はＫｐｎ　ＩおよびＢａｍＨＩにより処理さ れ、マウスメタロチオネインプロモーター（Ｈａｍｅｒ、Ｄ、Ｈ，ａｎｄ　Ｗａ ｌｌｉｎｇ。

Ｍ、、Ｊ、　Ｍｏ　１．　Ａｐｐ　１．　Ｇｅ　ｎ、、　ｌ：２７３−２８８（ １９８２）。この断片はまた、シーンバンクにより利用可能なｍ　Ｍ　Ｔの配列 、即ち、ＭＵＳＭＴ　Ｉ、ＭＵＳＭＴ　Ｉ　Ｐ、ＭＵＳＭＴ　ＩＰＲＭの解析か らデザインされたＰＣＲプライマーを用いて、マウスゲノムＤＮＡより単離する ことが可能である。〕を含む０．７ｋｂのＫｐｎ　Ｔ−Ｂｇ　ｌ　Ｔ　Ｉ断片に ライゲーションされた。結果として得られたクローンはｐＸＱＭ２と呼ぶ。

ｈＥＰｏ遺伝子は完全なｈＥＰｏ遺伝子を持ったバクテリオファージλのクロー ンから単離された。このバクテリオファージは、ヒト５ａｕ３Ａ、つまり０．７ ７ｋｂのヒト遺伝子を持つλベクターＬＡＭＢＤＡ　ＤＡＳｔ（の中に横築され た部分的なゲノムＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をスクリーニン グすることにより単離された。この０．７７ｋｂの断片は以下に示されたプライ マーを用いてポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）によりヒトゲノムＤ ＮＡから増幅された。

ヒトＥＰＯＰＣＲプライマー二 オリゴ　ｈＥＰｏ−１：　５’ＧＴＴＴＧＣＴＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＴＴＧ（ ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　１）（シーンバンクのＨＵＭＥＲＰＡ配列の２２１４−２ ２３４の位置）オリゴ　ｈＥＰｏ−２：　５’ＴＣＡＡＧＴＴＣ；ＧＣＣＣＴＧ ＴＧＡＣＡＴ（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　２）（シーンバンクのＨＵＭＥＲＰ八配列 の２へ８６−２９６７の位置）増幅された断片、これはヒトＥＰＯ遺伝子のエキ ソン４および５を含んでいるが、放射標識され、そしてヒトゲノムＤＮＡライブ ラリーをスクリーニングするために用いられた。

完全なヒトＥＰＯ遺伝子を含む５．４ｋｂのＨｉｎｄｌｌｌ−ＢａｍＨＩ断片を 持つファージは、公表されたＤＮＡ配列および制限酵素マツピングデータ（Ｌ　 ｉ　ｎ、Ｆ−に、、ｅ　ｔａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ ＳＡ。

８２・７５８０−７５８４　（１９８５）　）に基づいて完全な遺伝子を含んで いると仮定された。

４．８ｋｂのＢｓ　ｔＥｌ　１−ＢａｍＨＩ断片（ＢｓｔＥ１１部位はシーンバ ンクＨＵＭＥＲＰＡの配列の５８０の位置であり、Ｂａｍ８１部位はこの部位の ４．８ｋｂ３°側の位置にあり、シーフェンスされた領域の外側にある）はバク テリオファージのクローンから単離された。精製された断片は大腸菌ＤＮＡポリ メラーゼのクレノー断片で処理して平滑末端化され、ＨｉｎｃＩＩで処理された ｐＸＱＭ２ヘライゲーションされ、サブクローニングされたｍＭＴプロモーター の３°側に近接したｐＵｃＩ９に由来するポリリンカーに切り込む。取り除かれ たＢｓｔＥ１１部位がｍＭＴプロモーターに隣接している、一つの配向性が制限 酵素地図で同定され、ｐＸＥＰｏ　ｌ（図５）と命名された。

実施例５．顕微注入による一次ヒト線維芽細胞の安定なトラ細胞の核へのＤＮＡ の直接的な注入は、細胞を安定にトランスフェクトするための別の方法である。

−次および二次ヒト包皮線維芽細胞がこの方法により安定にトランスフェクトさ れる可能性については既に報告されている。プラスミドＲＶ６．９ｈ（Ｚｈｅｎ ｇ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．　Ａｃ　ａ　ｄ、Ｓｃ　ｉ、　 ＵＳＡ、　８８：　１８８０６７−８０７１　（１９９１））由来の８ｋｂ　Ｈ ｉｎｄｌｌｌ断片はゲル電気泳動および陰イオン交換カラム（ＱＩＡＧＥＮ　Ｉ ｎｃ、）を通す事により精製された。（１０ｕｇ／ｍｌ）のＤＮＡを外径０．１ 　μｍのガラス針を用いて一次あるいは二次ヒト包皮線維芽細胞に注入した。２ ．０００細胞への注入の後、４１個の０４１８’のクローンが単離された（４９ の出発細胞中１個）。

ｈＧＨ発現クローンもまた、顕微注入によって作成された。

プラスミドｐＸＧＨ３０１はＳｃａ　Ｉ処理（ｐＵＣ１２骨格の中のａｍｐ’遺 伝子に１回切れ込みを入れる）により直線化され、陰イオン交換カラム（ＱＩＡ ＧＥＮ　Ｉｎｃ、）を通すことにより精製され、外径０．１μｍのガラス針を用 いて一次あるいは二次ヒト包皮線維芽細胞に注入された。２．５５−２０ｕ　ｐ ＸＧＨ３０１／ｍ　Ｉの範囲で幾つかのＤＮＡ９度が用いられた。２．１００細 胞へのＩｌｌ注入の後、２０個の０４１８ｉｔ性クローンが単離された（１０５ の出発細胞中１個）。０４１８細胞の両分は、処理された全ての細胞のおよそ１ ％である。解析されたｌＯクローンの内の９個はｈＧＨを発現した。この実験で 単離されたクローンのｈＧＨ発現の平均値は０．６μｇ／１０ｃ　ｅ　ｌ　１　 ｓ　／２４ｈ　ｒであり、３つのクローンはｈＧＨの長期的な発現を研究するた めに拡大された。３つのクローンすへてｈＧＨを安定に発現しており、ｈ　Ｇ　 Ｈは３つの株に対してそれぞれ３３．４４および７３ｍ　ｐ　ｄで常に生産され ている。

上述された方法を用いて、例えばｐＥ３ｎｅｏＥＰｏのような他のＤＮＡ構築物 を持つ一次ヒト線維芽細胞の安定なトランスフェクションが得られるかも知れな い。

対数増殖期あるいは初期定常期の線維芽細胞はトリブシナイズされ、栄養培地を 用いてプラスチック表面から洗い流された。一定量の細胞懸濁液はカウントする ために取り除かれる、そして、残りの細胞は遠心分離される。上演は吸引され、 ペレットは５ｍｌのエレクトロボーレーシコンバッファ−（２０ｍＭ　ＨＥＰＥ Ｓ　ｐＨ７，３，１３７ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＫＣＩ、０．７ｍＭ　Ｎａｚ ＨＰＯ４，６ｍＭ　ｄｅｘｔｒｏｓｅ）に再懸濁される。細胞は再び遠心分離さ れ、上清は吸引され、細胞は１ｍｇ／ｍｌ　アセチル化ウシ血清アルブミンを含 むエレクトロボーレーシコンバツフア−に再懸濁される。最終的な細胞懸濁液は およそ３Ｘ１０’　ｃｅｌｌｓ　／　ｍ　１の細胞を含んでいる。エレクトロボ ーレーシコンは再懸濁後すぐに行われるへきである。

スーパーコイル状のプラスミドＤＮＡは０．４　ａｍ（７）！極のギャップを持 った滅菌したキュベツト（Ｂ　ｉ　ｏ−Ｒａ　ｄ）　ｌ：入れられる。最終ＤＮ Ａ濃度は一般に少なくとも１２０μｇ／ｍ１である。０．５ｍｌの細胞懸濁液（ およそ１．５Ｘ　１０　＠細胞を含んでいる）をその後キュベツトに加え、細胞 懸濁液とＤＮＡ溶液とを緩やかに混合する。エレクトロボーレーシコンはＧｅｎ ｅ−Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて行われる。キャパシタンスお よび電圧はそれぞれ９６０μＦ（Ｐａｒａｄｓ）および２５０−３００　Ｖに設 定される。電圧が上昇すると、細胞の生存数が減少するが、ゲノムの中に導入さ れたＤＮＡが安定に組み込まれている生存細胞のパーセンテージが劇的に上昇す る。これらのパラメーターが与えられると、およそ１４−２０　ｍ　ｓ　ｅ　ｃ のパルス時間が観察されるだろう。

エレクトロボーレーシコンされた細胞はおよそ５分間室温でインキュベートされ 、そしてキュベツトの内容物はその後滅菌されたトランスファーピペットで緩や かに取り除かれる。細胞はｌｏｃｍの皿の中の１０ｍ１のあらかじめ暖められた 栄養培地（上記のように１５％の子牛血清を含んでいる）に直接加えれる。そし て上述のように培養される。その翌日、培地は吸引され、そしてＩＯｍ　］の新 鮮な培地と交換され、さらに＋６−２４時間培養されろ。その翌日、クローニン グ効率および０４１８耐性コロニーを選別するために細胞のサブカルチャーが行 われる。細胞はトリプシン処理され、カウントされ、そして平板培養される。特 に、線維芽細胞はクローニング効率の決定のためには１０３ｃｅｌｌｓ／１０ｃ ｍ　ｄｉｓｈで培養し、Ｇ４１８選択のためには１−２　ｘ　１０’　ｃｅｌｌ ｓ／１０ｃｍ　ｄｉｓｈで培養する。

ヒト線維芽細胞は線維芽細胞栄養培地（１５％子牛血清を含む）の中に３００− ４００　ａ　ｇ　／　ｍ　］のＧ４１．８（およそ５０％の効力を示すＧｅｎｅ ｔｉｃｉｎ、ｄｉｓｕｌｆａｔｅ　５ａｌｔ：Ｇｉｂｃｏ）を含む培地でＧ４！ ８耐性の選択をする。クローニング効率は０４１８の非存在下で確かめられた。

培養された細胞は１２−１４日間インキュベートされる。そしてその時細胞はホ ルマリンで固定され、ｃｒｙｓｔａｌ　ｖｉｏｌｅｔで染色され、カウントされ （クローニング効率プレート）あるいはクローニングシリンダーを用いて単離さ れるＣ　Ｇ　４１Ｂプレート）。ウサギ線維芽細胞のエレクトロボーレーシコン および選択は選択条件を除いてヒト線維芽細胞について記述されたのと基本的に 同じように行われる。ウサギ線維芽細胞は１ｍｇ／ｍｌの０４１８を含む培地で 選択される。

線維芽細胞は新鮮な切除されたヒト包皮から単離された。

カルチャーはＤＭＥＭ＋１０％子牛血清の中にｓｏ、ｏｏｏｃ　ｅ　ｌ　１ｓ　 ／　ｃ　ｍになるように蒔かれた。カルチャーが融合性（ｃｏｎｆ　１ｕｅｎｔ ）になったとき、線維芽細胞はトリプシン処理することにより集められ、エレク トロボーレーシコンによりトランスフェクトされた。トランスフェクト条件はプ ラスミドｐｃＤＮＥＤを用いたトランスフェクションにより評価された。はぼ最 適な条件（エレクトロポレーション電圧が２５０ボルトでキャパシタンスが９６ ０μＦ　（Ｐａｒａｄｓ）でプラスミドｐｃＤＮＥＯが６０μｇ）での典型的な エレクトロボーレーシコン実験の結果、処理細胞５８８個につき６４１８コロニ 一！個（全ての処理細胞のうち０．１７％）、あるいは７１のクローン化可能な 細胞につきＧ４１８コロニ一１個が得られた（１．４％）。

９回の別々のエレクトロボーレーシコン実験が至適条件付近（エレクトロボーレ ーシコン電圧が３００ボルトでキャパシタンスが９６０μＦの設定においてプラ スミドｐｃＤｎｅｏが６０μｇ）で行われ、平均して、１．８９９個の処理細胞 につき一つの０４１８コロニーが観察され（０，０５％）、これは、処理細胞の １／８８２から１／７．５００の範囲であった。これは平均して、３８個のクロ ーン化可能細胞あたり一つのＧ４１８コロニーに相当する（２．６％）。

低いパッセージ（ｌｏｗ　ｐａｓｓａｇｅ）の−次ヒト線維芽細胞をプラスミド ｐｃＤＮＥｏおよびｐＸＧＨ５を用いたコトララスフエクシコンによりｈＧＨ発 現細胞へ変換した。典型的には、二つのプラスミドの等モル数の混合液６０μｇ が至適条件（エレクトロポレーション電圧３００ボルト、キャパシタンス９６０ μ）’ａｒａｄｓ）付近でトランスフェクトされた。このような実験の結果、処 理細胞１４．７０５につきＧ　４１８コロニーは一つであった。

これらおよび同一のトランスフェクション条件で単離された他の細胞についての ｈＧＨ発現データは以下に要約されている。最終的に全０４１８’コロニーの９ ８％が集団培養するために広げることが可能であった。

解析されたＧ４１８’コロニーの数　１５４Ｇ４１８’　／ｈＧＨ発現コロニー の数　６５ｈＧＨ発現の平均レベル　２．３　ｕ　ｇｈＧＨ／　ｉｏ＠ｃｅｌｌ ｓ／　２４ｈｒｈＧＨ発現の最大レベル　２３．０μｇｈＧＨ／　１０＠ＣｅＬ ｌｓ／２４ｈｒ安定なトランスフェクシントはまた、ｎｅｏおよびｈＧＨ遺伝子 が同一のプラスミド分子（実施例３）に存在しているＤＮＡ構築物である、ｐＸ ＧＨ３０１を用いた一次又は二次ヒト線維芽細胞のエレクトロボーレーシコンに より作製されている。例えば、１．５　ＸＩＯ＠細胞が６０μｇのｐＸＧＨ３０ １を用いて３００ボルト、９６０μＦａｒａｄｓでエレクトロボーレーシコンさ れた。０４１８耐性コロニーはトランスフェクトされた二次線維芽細胞から単離 され、その頻度は１．５ＸＩＯ個の処理細胞のうち０４１８耐性コロニーが６５ ２であった（　２２９９処理細胞につき１個）。これらのコロニーのおよそ５９ ％がｈＧＨを発現した。

プラスミドｐＸＧＨ５を用いた一次線維芽細胞の安定なトランスフェクションは 、レシピエンド線維芽細胞が周囲の培地中にヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を分泌 できるようにする。したがつてｈＧＨ（あるいは他の発現蛋白質）に対するラジ オイムノアッセイは、選択マーカーと選択試薬の使用に代わる単純かつ迅速なト ランスフエクタント検索法として用いる事ができる。加えて遺伝子の発現を全く 必要としないＰＣＲのような検索法を用いることにより外来ＤＮＡの安定な組み 込みの真の頻度を決定する事も可能であろう。

以下に述べる実験結果より、コトララスフエクトさせた（Ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃ ｔｅｄ）プラスミドによる選択なしで安定にｈＧＨを発現するトランスフェクシ ントを、実際に分離できることが示された。これらの実験は一次ヒト包皮線維芽 細胞および一次つサギ皮膚線維芽細胞で成功している。安定な発現トランスフェ クシントの頻度は約１０コロニーに−っであった。

１、ヒト包皮組織 新たに組織から分離された約２．０ＸＩＯ＠個の細胞は３００Ｖ、９６０μＦａ ｒａｄｓの条件で６０ｔ１ｇのｐＸＧＨ５を用いてエレクトロボーレートした。

細胞は温めておいた１０ｍ１の培地を含む１００ｍｍ組織培養皿にすばや（蒔き 、加湿した５％ＣＯｘ大気中３７°Ｃで培養した。トランスフェクション２日後 に５Ｘ１０”個の細胞を２４穴クローニングプレート（Ｂｅｌｌｃｏ　Ｇｌａｓ ｓ　Ｃｏ、）で継代培養した。２４穴プレートのそれぞれの穴は１６の、より小 さな穴を含んでいる（３８４穴／プレート）。８日後、大きい２４大中１０穴に ついてラジオイムノアッセイによりｈＧＨの発現を検索した。ｌＯ穴全てが有意 なｈＧＨ発現を示した。培地を吸引し新しい培地に交換し、２４時間後にｈＧＨ を測定した。１０穴ともすべて、ｈＧＨを再び発現していた。この時点で１０穴 それぞれのコロニー数をカウントした。大きな穴あたり平均１１．５コロニーで あった。もし、１穴あたり最低１個の安定なトランスフェクシントがあるとすれ ば、トランスフェクション頻度の最下限はクローニング可能（ｃｌｏｎａｂｌｅ ）細胞の約８〜９％と計算できる。

大きい穴の中の小さな１６穴それぞれの個々のコロニーはトリプシン処理され、 ９６穴プレートの１６穴に移された。

３日後にそれぞれの穴てｈＧＨ発現を測定した。１６大のうちの１つは、ｈＧＨ を発現している細胞を含んでいることが分かった。この穴の細胞を培地に広げた 。これらの細胞、ＨＦ２６−１９Ｍは４２ｍｐｄまで培養後、２６０ｎｇ／　ｌ 　Ｏ”　ｃｅＩＩｓ　／　２４　ｈｒのｈＧＨを生産した。

上記の実験は他の一次ヒト包皮線維芽細胞培養物を用いてくりかえされた。この 実験からｈＧＨを発現する二次クローンが単離された。２４　ｍｐｄまで培養後 、この細胞ＨＦ２４−ＧＨＩは、６０ｎｇｈＧＨ／ｌ　０ｃｅｌｌｓ　／２４ｈ ｒのｈＧＨを生産した。ｈＧＨ生産は細胞が４５ｍｐｄになるまで続け、その時 点で細胞を凍結した。トランスフェクション頻度の下限は最初の実験とほぼ同じ （クローニング可能（ｃｌｏｎａｂｌｅ）細胞の６〜７％）であった。

２、−次つサギ線維芽細胞 一次ウサギ皮膚細胞はｐＸＧＨ５でトランスフェクトされた。エレクトロボーレ ーシコンの条件は上記のヒト組織エレクトロボーレーシヨンに従った。ｌＸｌ０ ”個の細胞を３８４穴プレート中で継代培養した。七日後、大きい２４大中１０ 穴についてｈＧＨの測定を行った。１０穴中９穴でｈＧＨが発現されていた。こ れらのうちの一つを選んでコロニーを単離した。この穴は小さい１６穴に分散し た９コロニーを含んでいた。小さな１６穴それぞれに入っている細胞をトリプシ ン処理し、９６穴プレートの１６穴に移した。引き続いてのｈ　Ｇ　Ｈｆｉｌｌ 定では、１６穴中の１つでｈＧＨが発現していることが示された。このクローン を培地に広げた。ｈＧＨの生産は３５ｍｐｄまで培養後で５８　ｎｇ／　１０　 ｃｅｌｌｓ　／　２４　ｈｒであった。この実験で算出されるトランスフェクト 頻度は総計９コロニー中、ｈＧＨ発現が１コロニーであっｆニー　（１１％）。

線維芽細胞は、新たに切除されたヒト皮膚線維芽細胞から単離し、１０％の仔牛 血清を含むＤＭＥＭ中で培養した。ｐｃＤＮＥｏ及びｐＸＧＨ５の等モル混合物 ６０μｇでエレクトロボーレーシヨン（２５０Ｖ、９６０　ｕ　Ｆ（Ｆａｒａｄ ｓ））を行い、処理された細胞は０４１８を含む（３００，ａｇ／ｍ　Ｉ）培地 中で選択した。コロニーは単離され、常法に従い広げ、得られた一次細胞株は、 培養中の時間の関数としてのｈＧＨ発現の安定性をモニターするため、繰り返し 継代培養した。

そういった２つの種、ＨＦ９６−１１及びＨＦ９６−２３から得られたデータを 図９に示した。細胞は１０％の仔牛血清を含むＤＭＥＭ中、低レベルの０４１８ 　（７５μｇ／ｍｌ）で保持し、接種密度＋００００ｃｅ　Ｉ　ｌ／ｃｍ’て継 代培養した。培養液は細胞の植え継ぎ（ｐａｓｓａｇｉｎｇ）のための採取に先 立つこと２４ｈｒで交換した。植え継ぎ時には培養液の適当量をｈＧＨ測定のた めに除去し、それから細胞を回収し、計数し、再び接種した。培地中のｈＧＨ濃 度は市販されるイムノアッセイを用いて測定した。ｈＧＨレベル（μｇ／１０” ｃｅｌｌｓ／２４ｈｒで示した）は９〜２８代の種々の培養継代数に対してプロ ットした。これらのアッセイの結果は、この長期にわたるｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養 期間（例えば、２つの異なる株から得られたデータは、ＨＦ９６−１１が第２８ 代で６９ｍｐｄに達し、一方でＨＦ９６−２３が第２７代で７６ｍｐｄに達して いることを示している）を通して、ｈＧＨ発現が著しく一定に保持されることを 示している。

線維芽細胞は新たに切除されたウサギ皮膚から単離し、１０％の仔牛血清を含む ＤＭＥＭで培養した。ｐｃＤＮＥｏ及びｐＸＧＨ５の等モル混合物６０μｇでエ レクトロボーレーシコン（２５０Ｖ、９６０μＦ）を行い、処理された細胞はＧ ４１８を含む（Ｉｍｇ／ｍｌ）培地中で選択した。コロニーはクローニングシリ ンダーを用いて単離され常法に従い広げ、得られた一次細胞株は、培養中の時間 の関数としてのｈＧＨ発現の安定性をモニターするため、繰り返し継代培養した 。そのようなうちの一種、ＲＦ４０／ｌ−３から得られたデータを図１Ｏに示し た。ＲＦ４０／１−３細胞は選択不在下でウサギｔｅａｍ芽細胞栄養培地中で保 持され、接種密度１゜０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ”で継代培養した。培養液は細胞 の継代培養のための回収に先立つこと２４ｈｒで交換した。継代時には培養液の 一定量をｈＧＨ測定のために除去し、それから細胞を回収し、計数し、再び接種 した。培地中のｈＧＨ濃度は市販されているイムノアッセイ（Ｎｉｃｈｏｌｓ　 １ｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用いて測定した。ｈＧＨレベル（μｇ／Ｉ　Ｏ’　ｃｅ 　Ｉ　］　ｓ／２４ｈｒで示した）はそれぞれおよそ２８〜８４の培養平均倍加 （ｍｐｄ）レベルにあたる４．８．１Ｏ１１３，１６，１９，２２代の培養継代 数に対してプロットした。これらのアッセイの結果は、この長期にわたるｉｎ　 ｖｉｔｒｏ培養期間を通して、ｈＧＨ発現が著しく一定に保持されており、実質 的に約２０ｍｐｄで観測されるレベル（４７μｇ／ｌ　０″（ｅｌｌｓ／２４ｈ ｒ）に等しい。

実施例１０．マウスにおけるヒト成長ホルモンの長期発現ヌードマウスは、遺伝 子工学的な操作を受けた細胞の組織移植が治療上存益なタンパク質を動物の体循 環に送達する能力を研究するうえで貴重な系をもたらしている。これらの動物は 、他に比べて免疫不能（ｉｍｍｕｎｅ−ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ）であるので ある種の一次及び二次ウサギ線維芽細胞を長期にわたってｉｎ　ｖｉｙ□で生存 させ得ると考えられている。

腎下部皮膜への細胞の移植のためにマウスはＡｖｅｒｔｉｎ（２％ｗ／ｖ　２． ２．２−トリブロモエタノール、２％ｖ　／　ｖ　２−メチル、２−ブタノール の溶液）を０．０１７ｍ１／ｇ体重の割合で腹腔注射される。腎臓（一般には左 腎臓）は肋骨の下約３ｍｍにつくられた８〜１０ｍｍの切開部を通して操作する 。皮膚、腹筋、腹膜及び背側筋膜を腎臓を露出させるために後退（ｒｅｔｒａｃ ｔ）させた。小さな鉗子を用いて腎臓を腹腔から取り出す。２７ゲージの皮下注 射針が腎皮膜に小さな開口部を作るのに用いられる。２０ゲージの１．Ｖ、カテ ーテルを用いて移植されるべき細胞（一般に５〜ｌＯμｍの容積中に３００万個 の細胞）は１ｍｌシリンジに吸い込まれ、腎皮膜の下にゆつ（りと注入される。

細胞がその腎被膜の開口部から遠くへ放出されるように注意する。切開部はステ ーブル一つで筋肉及び皮膚を通して縫合される。軽麻酔がかかるまでメトキシフ ランをいれた大きなビーカーにネズミをいれた後、血を採取した。眼窩腔から血 液を採取するためにバストウールピペットの先端を眼と眼窩周辺部位の間に入れ た。血清のｈＧＨレベルは市販されているキット（Ｎｉｃｈｏｌ’ｓ　Ｉｎ５ｔ ｉｔｕｔｅ）を用いて測定した。

我々の最初の実験では、５００万個のトランスフェクトウサギ線維芽細胞（ＲＦ ２０−１１）をヌードマウスに移植した。このマウスは一年間、その血清中に検 出可能なｈＧＨを示していた。発現の経時変化を以下に示す。

月　１　２　３　４　６　１２ 血清ｈＧＨ（ｎｇ／ｍｌ）　：　０．７　０．７　０．８　０．６　０．．７　 ０．６さらにマウスに９６μｇ／１０ｃｅｌｌｓ／２４ｈｒを発現するウサギ線 維芽細胞株（ＲＦ４０／ｌ−３）を移植したより大規模な実験が行われた。この 実験の結果は図１１に示す。バーは標準誤差を示し、Ｎはそれぞれの時点で採取 されたマウスの数を示している。これらの結果から、平均血清ｈＧＨレベルが１ ４力月以上も比較的一定を保っており、移植以来平均１〜３ｎｇ／ｍｌであるこ とが示される。この期間中に渡って移植細胞に起因するどのようなタイプの副作 用も観測されなかった。

移植細胞の生存能力のストリンジェント（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）テストは、動物 から切除してｉｎ　ｖｉｔｒｏで再培養した際に、生育し、移植前の性質を示す 能力とした。２４．５μｇ／１０’　ｃｅｌｌｓ／２４ｈｒを発現するＲＦ４０ ／１−３細胞（３ｘｌＯ”　ｃｅｌｌｓ／マウス）をヌードマウスの腎下部被膜 の下に移植した。これらの細胞は移植前に培地中で４９ｍｐ　ｄを示していた。

ｉｎ　ｖｉｖｏで５又は１０週間経過後、動物を層殺し腎臓を回収し、移植組織 近傍の細胞（腎臓表面で明白に見える）を顕微切除した。得られた組織をスケー ルダウンした標準的な酵素的細胞分散法（実施例６）にかけ、単一細胞懸濁物（ ｓｉｎｇｌｅ　ｃｅｌｌ　５ｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）を６４１８を含む培地にいれ た。細胞培養のデータは移植後５週のマウス由来の再培養組織５つと移植後１０ 週のマウス由来の再培養組織４つから得られた。回収された細胞は培地中で１９ ｍｐｄまで増殖させ、そしてｈＧＨレベルを、培地に移した倹約ＩＯ日から約５ ０日間の範囲の様々の時点で分析した。これらの実験結果を図１２に示した。図 Ｉ２のそれぞれの点は少なくとも独立した４つの回収（ｒｅｃｏｖｅｒｙ）試験 の平均（標準偏差を含む）を示している。５週および１０週の移植組織の両者の 実験において、ｈＧＨを高レベルで発現するＣ；４１８・細胞が回収され、ｈＧ Ｈ発現はｉｎ　ｖｉｔｒｏでの１９回の回収後の倍加の間に渡って比較的安定で あった。

実施例１２．トランスフェクトされた自己由来細胞を移植したウサギでのヒト成 長ホルモンの発現と高力価の抗ｈＧＨ抗血清の生産 自己移植遺伝子治療実施のためのすべての技術的・論理的要求を探求する実験が ウサギで行われている。最初に皮膚生検資料を８匹の生きているウサギから採取 する。皮膚線維芽細胞を単離して一次培養した。ｉｎ　ｖｉｔｒｏで一継代後、 Ｉ）ＸＧＨ３０１またはｐＸＧＨ５とｐ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ｅ　Ｏでトランスフェク トした。０４１８耐性クローンを単離しｈＧＨ発現について分析した。１０μｇ ／ＩＯ”ｃｅｌｌｓ７日より大を発現するクローンをローラーボトルに広げた。

最終的に各クローンの細胞をローラーボトルから回収し、皮膚生検のドナーとし て用いられた同一のウサギにＳＲＣ細胞移植またはＩＰ注入するために調製した 。

ウサギ皮膚線維芽細胞を単離するため、沈静に達するまでウサギに塩酸ケタミン （５ｏｍｇ／ｋｇ体重）および塩酸キシラジン（５ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇ体重）の 筋肉内注射により麻酔をかける。動物は一部、例えば右骨盤関節上部などを刈り 込み、常法を用いて外科手術の準備をする。卵形のパッチを作るように背部と腹 部でつながる２つの弓形の切開部を約３ｃｍ離して作る。鋸歯状鉗子を用いて表 皮を除去し、小鋏でその下の筋膜を除去する。表皮と筋膜を培地中に移し、切開 部を３−〇ナイロン縫合糸で縫合する。ウサギは回復のため温床上に移す。筋膜 線維芽細胞は、実施例１．２及び４で述べるように、培養、トランスフェクトさ れ、選択される。

腎被膜内へ細胞を移植するため、上記の通りにウサギに麻酔する。動物は右側面 の横臥位に置き、左肋骨下側を露出させる。動物は剃られ、承認された方法に従 って準備をした。

１２番目の肋骨の下約２ｃｍの所の背腹部の６ｃ’ｍの切開部を通して左腎臓に 到達した。切開部を腹筋、腹膜、腎周囲の脂肪・筋膜まで貫通させる。パルフォ ア開創器を用いて腹部切開口を保持し、腎周囲の脂肪と筋膜の切除を行なう。Ｉ Ｉゲージの手術刀を用いて腎臓被膜表面に２〜３ｍｍの切開口を作る。２０ゲー ジの１．Ｖ、カテーテルを用いて移植細胞（一般に１６５〜６６０μｍ中に１〜 ２億個の細胞）を１ｍｌシリンジにいれ、ゆっくりと腎被膜下部に注入する。腎 被膜の開口部から遠位に細胞が放出されるように注意する。腹膜口は３−０回吸 着性クロミック縫合糸（ａｄｓｏｒｂａｂｌｅ　ｃｈｒｏｍｉｃ　ｇｕｔ）を用 いて腹膜および腹筋を縫合して閉じる。皮膚は３−０ナイロン縫合糸と滅菌ガー ゼ絆創膏で縫合し、抗生物質（Ｂａｃｔｒｉｎ）を傷口につける。ウサギは回復 のため暖めたパッド上に移す。全身性抗生物質（Ｔｒｉｂｒｉｓｓｉｎ）を皮膚 生検および移植の後に投与する。腹膜内（ＩＰ）経路で細胞を導入するため、細 胞（３、５〜５　、　５　ｍ　ｌ中に７〜１１億個）を２２ゲージの注射針で注 入する。２２ゲージの注射針を用いて検体動物（ｒｅｓｔｒａｉｎｅｄ　ａｎｉ ｍａｌｓ）の中耳動脈から血液を採取するｈＧＨ発現レベルおよび動物に導入し た細胞数についての関連情報を表１にまとめる。８匹すべての動物で血清ｈＧＨ レベルが容易に検出可能であった。１４日８までにどの動物のｈＧＨも検出され なくなった。これらの動物血清中からの最終的なｈＧＨの消失は予期されていた 、というのはヒト成長ホルモンはウサギにとって抗原となることが知られている からである。したがって血清サンプルは抗ｈＧＨ抗体についてアッセイした（抗 ウサギＩｇＧのＥＬＩＳＡによって定量される）。それぞれの場合において、血 清ｈＧＨレベルの減少は抗ｈＧＨ抗体の増加に一致している。

表　１ ｈＧＨ発現線維芽細胞のウサギへの自己移植これらの結果から、トランスフェク トされた皮膚線維芽細胞を用いたウサギでの自己由来遺伝子治療を行うために技 術的障壁がないであろうことが示された。遺伝子工学的に修飾された自己由来細 胞にょるｈＧＨ供給が８匹の実験動物すべてで成功した。予想されたように、血 清ｈＧＨレベルは、抗ｈＧＨ抗体の増加に従って減少した。高力値（ｌ・４００ ００）はＩＰまたはＳＲＣを移植した動物ではまれではなく、このことは１回の 移植処置による持続的なタンパク質供給が、を動物物の予防接種やタンパク質抗 原に対する高力価抗体の生産のための効率的な手法となり得るという提案と一致 している。

繊維芽細胞は新しく切り出されたヒト皮膚線維芽細胞から分離され、モしてＤＭ ＥＭ　＋　１５％牛血清中で培養された。６０μｇのｐｃＤＮＥＯとｐＸＥＰＯ ｌの等モル混合物とのエレクトロポレーション（２５０ボルト、９６０μフアラ ツド）は！継代細胞で行われ、そして処理された細胞はＧ４１８を含む培地（３ ００μｇ／ｍｌ　Ｇ４１８）で選択された。コロニーは単離され、標準的な方法 を使って広げられた。５６の個々のクローンの分析から由来したデータは表２に 示されている。細胞はＤＭＥＭ　＋　１５％牛血清中の６４１８中（３００μｇ ／ｍｌ　Ｇ４１８　）　ｌ、−保持され、そして１０．０００細胞／ｃｍ”の接 種密度で植えつがれた。培養培地は継代のために細胞が採取される２４時間前に 変えられた。継代の時には、培養培地の部分はｈＥＰＯ分析のために除かれ、そ して細胞はそれから採取され、数えられ、再び植え継がれた。培地中のｈＥＰＯ 濃度は商業的に利用できるＥ　Ｌ　Ｔ　Ｓ　Ａ　（Ｒ＆　Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ） を用いて決定された。ｈＥＰｏ濃度はｍＵ／　１０’ｃｅｌｌｓ／　２４ｈｒと して表され、そして発現レベルは６９から５５．５９１ｍＵ／　ＩＯ＠ｃｅｌｌ ｓ／　２４ｈｒに広がり、全Ｇ４１８耐性コロニーの１９％が検出できる濃度の ｈＥＰＯを発現した。

ｐｃＤｎｅｏとｐＸＥＰ旧を同時にトランスフェクションすることにより分離さ れたヒト線維芽細胞由来のクローンの、分泌されたｈＥＰｏのグリコジル化の状 態の分析がされた。培地がｈＥＰｏ生産細胞からあつめられ、そしてヒトエリス ロボエチンに特異的なマウスモノクローナル抗体（Ｇｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｒｐｏ ｒａｔｉｏｎ）を用いて免疫沈降された。免疫沈降された物質は１２．５％ポリ アクリルアミドゲル上で電気泳動され、そしてＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ） に写された。膜は免疫沈降に用いた同じ抗ｈＥＰｏモノクローナル抗体を用いて 調べられ、次に１（ＲＰ結合ヒツジ抗マウス１ｇＧ抗血清（Ｃａｐｐｅｌ）を用 いて処理され、その後ｈＥＰｏを蛍光産物の生産を通して目に見えるようにする ために発光検出（ＥＣＬ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ｄｅｔｅｃｔｉ ｏｎ　ｋｉｔ、　Ａｍｅｒｓｈａｎ）を行った。

ｐＥＸＰＯＩとｐｃＤＮＥＯを同時にトランスフェクションした正常ヒト線維芽 細胞によって分泌されたｈＥＰＯのウェスタンプロット分析はヒトエリスロボエ チンに特異的な抗体と反応する、およそ３４ｋｄの分子量を持つ分子であること を証明した。これは、本来存在する完全にグリコジル化されたヒトエリスロボエ チンの予想されている大きさである。

トランスフェクションされたヒト線維芽細胞クローンによって生産されたヒトエ リスロポエチンについて、尿から単離される天然ヒトエリスロボエチン又はチャ イニーズハムスター卵巣細胞によって生産された組換えｈＥＰｏのＮ−と〇−結 合グリコシル化の両方の性質を持つかどうか決定するために分析された。ウェス タンプロット分析はｐＸεＰＯ１とｐｃＤＮＥｏを同時にトランスフェクション した正常ヒト線維芽細胞のクローン株からの上演上で行われた。上清のサンプル は、最初にエンドグリコシダーゼ−Ｆ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅ ａｒ）　、ノイラミニダーゼ（Ｇｅｎｚｙｍｅ）あるいは０−グリカナーゼ（Ｇ ｅｎｚｙｍｅ　）を用いて処理された。エンドグリコシダーゼ−Ｆを用いた処理 で分子量が３４ｋｄから約２７ｋｄへのシフトを生じた。ノイラミニダーゼを用 いた処理ではかろうじてバンドの位置のわかるシフトを生じ、一方Ｏ−グリカナ ーゼを用いた処理は免疫反応バンドの大きさが約１８．５ｋｄに下がるという大 きなシフトを生じた。これらの結果より、尿から分離された天然のヒトエリスロ ポエチンあるいはチャイニーズハムスター卵巣細胞によって生産された組換えｈ ＥＰＯと得られたそれらとは区別できない〔ブラウンら、（Ｂｒｏｗｎｅ、　Ｊ 、　Ｋ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＳｙｍｐ、 　Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ、　５１：６９３−７０２（１９８６））。

２、ウサギ線維芽細胞 線維芽細胞は新しく切り出されたウサギ皮膚から分離され、そしテＤＭＩ！Ｍ　 １０％牛血清で培養された。６０　μｇ　ｃ７）　ｐｃＤＮＥＯとｐｘＨＰ旧の 等モル混合物を用いたエレクトロポレーション（２５０ボルト、９６０μフアラ ツド）が行われ、そして処理された細胞はＧ４１８を含むウサギ線維芽細胞成長 培地（ｌ　ｍｇ／ｍｌ　Ｇ４１８　；実施例２）中で選択された。コロニーは分 離され、標準的方法を用いて広められ、そして生じた二次細胞株のｈＥＰＯ発現 を分析された。４９の個々のウサギ線維芽細胞クローンから由来したデータは表 ３に示す。これらのクローンの発現レベルは４３から２．９００．　ＯＯＯｍＵ ／　１０”細胞７２４時間範囲で、全Ｇ４１８耐性クローンの７２％が検出でき る濃度のｈＥＰＯを発現した。

＞　５００．０００　１９ ＨＰＲＴ配列（（Ｇｅｎｂａｎｋ　ｅｎｔｒｙ　ｌ（ｔｌＭＨＰＲＴＢ、エドワ ーズら（Ｅｄｗａｒｄｓ、　Ａ　ａｔ　ａｌ、）、　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、　６： ５９３−６０８（１９９０））内でＨＰＲＴ遺伝子のエキソン２および３を含む １１，９６０から１８．８６９の位置に広がっている６、９ｋｂのＨｉｎｄ［１ １断片がｐＬｌｃ１２の旧ｄｌ１１部位にサブクローニングされる。生じたクロ ーンはＨＰＲＴ遺伝子断片のエキラン３内の唯一のＸｈｏｌの部位で切断され、 そしてｐＭｃＩＮＥ（１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からのｎｅｏ遺伝子を含む１ ．１ｋｂのＳａｌ　１−Ｘｈｏ１断片が挿入され、エキソン３のコーディング配 列を壊す。１方向つまりｎｅｏ転写の方向を持ち）ＩＰＲＴ転写とは反対方向を 持つ物が選ばれ、ｐＥ３Ｎｅｏと名付けられた。ｐＥ３ｎｅｏはＨＰＲＴ配列と ｎｅｏ遺伝子の５°側の結合部位に唯一のＸｈｏ　１部位を持つ。１）Ｅ３ｎｅ ｏはＸｈｏｌで切られ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片を用いて処理 されることにより平滑末端にされる。

ｎｅｏ選択プラスミドｐＥａＮｅｏ内にｈＥＰＯ遺伝子を挿入するためにプラス ミドｐＸＥＰＯ１（実施例３；図５）から５．１ｋｂのＥｃｏＲｌ−Ｈｌｎｄ［ Ｉ［断片が分離された。ＥｃｏＲ［部位はｍＭＴプロモーターの５゛側の隣に位 置しており、Ｈｉｎｄ［ｒ１部位は５．ｌｋｂ離れたｈＥＰＯコーディング領域 の３゛側にある。精製された断片は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片を 用いて処理されることによって平滑末端にされ、上で述べたＸｈｏ　［消化され 、そして平滑末端のされたｐＥ３ｎｅｏ断片につなげられる。大腸菌への形質転 換の後、ｐＥ３ｎｅｏに挿入されたｌコピーのｍＭＴ−ｈＥＰｏ断片を持つプラ スミドは隣接するｎｅｏ遺伝子と同じ方向にｈＥＰｏ遺伝子が転写されることを 制限酵素分析によって確認された。

このプラスミドはｐＥ３ｎｅｏＥＰＯと名付けられた。ｈＥＰＯを発現するＧ４ １８’　クローンの直接選択ができることに加えて、この断片はヒトＨＰＲＴ位 へｈＥＰｏ遺伝子を組み込みさせるためのジーンダーゼティングの際にも用いら れるだろう。

実施例１５．ｈＥＰＯ遺伝子と選択マーカー（ｐＥ３ｎｅｏＥＰＯ）を発現する ヒト線維芽細胞クローンの分離 線維芽細胞は新しく切り出されたヒト皮膚線維芽細胞から分離され、そしてＤＭ ＥＭ　＋　１５％牛血清中で培養された。６０μｇのスーパーコイル化された（ ｓｕｐｅｒｃｏｉｌｅｄ）ｐε３ｎｅｏＥＰＯを用いたエレクトロポレーション （２５０ボルト、９６０μフアラツド）は−継代細胞で行われ、そして処理され た細胞はＧ４１８を含む培地（３００μｓ／ａＩｔ　０４１８）で選択された。

コロニーは分離され、探準的な方法で広げられた。２６の個々のクローンの分析 に由来するデータは表４に示されている。細胞はＤＭＥＭ　＋　１５％牛血清中 の０４１８中（３００μｇ／ｍｌ　Ｇ４１８）で保持され、接種密度１０．００ ０細胞／　ｃ　ｍ　”で植えつがれた。培養培地は継代のために細胞を採集する ２４時間前に変えられた。継代の時、培養培地の一部分はｈＥＰＯ分析のために 取り除かれ、それから細胞は採集され、数を測定され、そして再び植え継がれた 。培地中のｈＥＰＯ濃度は商業的に利用できるＥＬ　Ｉ　５Ａ（Ｒａｎｄ　Ｄ　 ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定された。ｈＥＰＯ濃度はｍｕ　ｈＥＰＯ／　１０ ＠細胞／２４時間としてあられされ、そして発現レベルは２４０から９６１、６ ２０　ｍｕ／　１０’細胞／２４時間の範囲であった。全０４１８耐性クローン の８９％が検出できる濃度のｈＥＰｏを発現した。

表　４ ｈＥＰｏ発現レベル （＋ｏＵ／１０”細胞／２４時間）　クローン数＜１．０００　２ １．０００−１０．０００　２ １０、０００−５０．０００　９ ５０、０００−５００．０００　１２ ＞５００．０００　１ ｈＥＰｏを発現するヒト線維芽細胞クローンは６０μｇの旧ｎｄｌ［１消化した ｐＥ３ｎｅｏＥＰｏを用いたエレクトロポレーションによっても分離される。ｈ ＥＰｏを発現するウサギ線維芽細胞クローンはウサギ線維芽細胞クローンが１　 ｍｇ／ｍｌ　Ｇ４１８を含むウサギ線維芽細胞成長培地（実施例２）で選別され るのを除いて、全く同じトランスフェクションの条件でプラスミドｐＥ３ｎｅｏ ＥＰＯを用いて分離される。

マウスは、動物の一般循環系で治療学的に有用なタンパク質を供給する能力を持 つ、遺伝子学的に修飾された細胞の移植の研究において貴重な系をもたらしてい る。ヌードマウスの相対的な免疫不全は外来の移植が生物学的機能を保持するの を許し、特定の一次及び二次ウサギ線維芽細胞を長期にわたってインビボで生存 させ得るかもしれない。

腎下部皮膜への細胞の移植のためにマウスはアベルチン（Ａｖｅｒｔｉｎ）を０ ．ＯＩ７５ｍｌ／ｇ体重の割合で腹腔注射する。腎１１（一般には左腎臓）は肋 骨の下約３ｍｍにつくられた８〜１０ｍｍの切開部を通して操作する。皮膚、腹 筋、腹膜及び背側筋膜を腎臓を露出させるために萎縮させた。小さな鉗子を用い て腎臓を腹腔から取り出す。２７ゲージの皮下注射針が腎皮膜に小さな開口部を 作るのに用いられる。２０ゲージのＩ、Ｖ、カテーテルを用いて移植されるべき 細胞（一般に５〜１０μｍの容積中に３００万個の細胞）は１ｍｌシリンジに回 収され、腎皮膜の下にゆっくりと注入される。細胞が腎皮膜の開口部から遠く放 出される事に注意が払われる。切開部は一本の繊維（ｓｔａｐｌｅ）で筋組織及 び皮膚を通して縫合される。軽い麻酔がかかるまでメトキシフランをいれた大き なビーカーにネズミをいれた後、血を採取した。眼窩腔から血液を採取するため にパスツールピペットの先端を眼窩周辺部位の間に入れる。血清ｈＥＰｏレベル は商業的に利用可能なキット（Ｒａｎｄ　Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定さ れる。血液の部分もヘマトクリットレベルを決定するためにＥＤＴＡで覆った毛 細管（Ｓ　ｔ　ａ　ｔ　ｓ　ｐ　ｉ　ｎ、Ｎｏ　ｒｗｏｏｄ、ＭＡ）に吸い込ま れる。

ウサギ皮膚線維芽細胞のクローン株は実施例１３で述べられた方法によって分離 された。ＲＦ１１５−Ｄ４と名付けられたあるクローンではヒトＥＰＯ遺伝子が 安定してトランスフェクションされていると決定され、そしておよそ７８６゜０ ００ｍＵ　ｈＥＰｏ／１０＠細胞／２４時間細胞７ロ４つ移植された。およそ４ ００μｍの血液が移植後１日目と７日目に吸い取られ、そしてその後は２１日口 まですべての日に吸い取られた。この期間の低張性ショックを防ぐために採血の 後塩溶液が等量注射された。血液はその後６３日目間で週ごとに吸い取られた。

同じ採血スケジュールが細胞移植していない１０匹のマウスに用いられた。図１ ３ａは一般に赤血球数の指標として用いられている血液へマドクリット（ＨＣＴ ）に対するこれらの処置の作用が示されており、移植及びコントロール動物につ いて測定されている。コントロール動物においてはＨＣＴは７日目までには急激 に落ちて、その後１５日口までに大体普通のレベルに戻る。対してｈＥＰ。

発現細胞の移植を受けた動物は７日目までに高いＨＣＴレベルを示した。ＨＣＴ は６３日目まで高いままで、移植後３５日口（こは１日目のレベルの４５％より も１．４倍高い６４％のピークに達する。図１３ｂに示されているように、免疫 反応性（ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ）ｈ　Ｅ　Ｐ　Ｏは移植された動物の血 液中で簡単に検出できた（キットの製造元によってｈＥＰｏ　ＥＬＩＳＡの感度 性は２ｍＵ／ｍｌであると決められており（Ｒ＆Ｄ　ＳＹｓｔｅｍ）、そしてＥ ＬＩＳＡキットで使われている抗体と内因性のマウスＥＰＯは交差反応を示さな い）。

移植された動物のｈＥＰｏレベルは移植後７日目から６３日目までに２９から９ ｍＵ／ｍｌまで徐々に落ちた。

本実施例は、ｈＥＰｏを発現し分泌するために遺伝的に処理された普通の皮膚線 維芽細胞は、ｌ）インビボで生存して２か月間まで動物の全身循環系にｈＥＰｏ を供給することができ、そして２）生産されたｈＥＰｏは生物学的に機能し、し ばしば採血されるコントロール動物に観察されるヘマトクリット値の低下を防止 するために働き、コントロールの動物では貧血反応を生じる採血スケジュールを 試されたときでさえ、最終的にＨＣＴの増加を生じるという事をはっきりと証明 した。

実施例１７　、０ＬＰ−１（７−３７）発現プラスミドをトランスフェクション した後の二次ヒト皮膚線維芽細胞株からのＧＬＰ−１（７−３７）の発現 ＧＬＰ−１の７から３７のアミノ酸残基の部分（ＧＬＰ−１（７−３７）　；Ｇ ｅｎｅｂａｎｋ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ＨＩＪＭＧＬｔｌＣＧ２において７２１４ から７３０６の塩基対によってコードされている〕はインビボでインスリノトロ ビン活性を持つことが証明された。プラスミドｐＸＧＬＰ１は、ＧＬＰ−１（７ −３７）の部分が、そのＮ末端において、小胞体を通しての運搬を効果的にする ためにヒト成長ホルモン由来の２６アミノ酸のシグナルペプチドと融合するよう に構築される。この融合タンパク質は、分泌前に、分泌産物がＧＬＰ−１の７− ３７残基のみから構成されるように、残基２６のすぐＣ末端側が切断される。シ グナルペプチドの発現：　ＧＬＰ−１（１−３７）融合タンパク質はマウスメタ ロチオネインプロモーターによってコントロールされる。

プラスミドｐＸＧＬＰＩは次のように構築されるニブラスミドＰＸＧＨ５（Ｓｅ ｌｄｅｎ、　Ｒ，Ｆ、、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　６：３１７３− ３１７９（１９８６）〕がＳｍａ　Ｉで消化され、ＢｇｌｌＩ部位を含む２本鎖 のオリゴヌクレオチド（Ｂｇｌｌｒ　ｔｉｎｋｅｒｓ：Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ 　Ｂｉｏｌａｄｓ　）につなげられる。つなげられた産物はＢｇ［［ｒとＥｃｏ Ｒ［で処理され、そしてヒト成長ホルモン遺伝子の３゛側の翻訳されない領域に 相当する０、　３２ｋｂの断片が分離された（Ｇｅｎｂａｎｋ　ｅｎｔｒｙ　） ＩＵＭＧＨＣＳＡの６６９８位のＳｍａ１部位にＢｇｌｒｌ　１ｉｎｋｅｒを持 ツ）　、　ｈＧＨ断片も、Ｇｅｎｂａｎｋ　ｅｎｔｒｙ　ＨＵＭＧＨＣ３Ａの６ ６９８から７３２夏の間を増幅するために設計されたＰＣＲプライマーを用いて ヒトゲノムＤＮＡから既知の方法で分離された。マウスメタロチオネイン（ｏ＋ ＭＴ）プローＶ−−ター（Ｈａｒｍｅｒ、　Ｄ、　Ｈ，ａｎｄ　Ｗａｉｌｉｎｇ 、　Ｍ、　Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎ、、１：２７３−２８８（１９８２））を含む１．４５のＥ ｃｏＲ［−Ｂｇｌｌ［断片が次に分離された。マウスメタロチオネインプロモー ターは、マウスゲノムＤＮＡから、Ｇｅｎｂａｎｋから利用できるｍＭＴ配列（ すなわちＧｅｎｂａｎｋ　ｅｎｔｉｒｅｓ　ＭＬＩＳＭＴｌ、　ＭＩＪＳＭＴ［ Ｐ、　ＭＵＳＭＴＩＰＲＭ）の分析から設計されたＰＣＲプライマーを用いて、 既知の方法テ分離すレタ。プラスミドｐＵｃ１９　（ＡＴＣＣＩＩ３７２５４） がＥｃｏＲｌで切断され、細菌アルカリフォスファターゼを用いて処理された。

処理されたプラスミドは上で述べられたｈＧＨやｍＭＴ断片に繋げられた。生ず るプラスミドは、マウスメタロチオネインプロモーターと、Ｂｇ１部位で繋げら れたｈＧＨの３゛側の翻訳されない領域をそれぞれ−コピー持つ。

１）ＸＩ　と名付けられこのプラスミドはＢｇ［Ｉ＋で処理され、完全な長さの 線状産物がゲル電気泳動によって精製された。■１．１と１１．２のオリゴヌク レオチドは、ＰＣＲによってヒトゲノム［ＩＮＡからＧＬＰ−１の７−３７のア ミノ酸をコードするＤＮＡ配列の増幅のために用いられる。増幅された産物（１ ０４ｂＰ）は精製されｐＸＧ）１５とオリゴヌクレオチド＋１．２．１１．３． １１．４．１１．５１：混合され、ＰＣＨに付す。オリゴヌクレオチド１１．３ と１１．４は相補的でありｈＧＨシグナルペプチドとＧＬＰ−１アミノ酸残基７ の間の所望の連結部（ｊｕｎｃｉｔｏｎ）に相当する。５００塩基対の増幅産物 は、ｈＧＨ（Ｇｅｎｂａｎｋ　ｅｎｔｒｙ　ＨＬＩＩＪＧＨＣＳＡの５１６８か ら５５６２のヌクレオチド）からの５′側の翻訳されない領域やエキフン１１イ ントロンｌ、エキソン２配列の一部を含んでおり、ＧＬＰ−１の７−３７残基を コードする１５の融合されたものがストップコドンの前にある。断片は設計によ って、両末端にＢａｍＨ［部位がフランクしている。

断片はＢａｍＨｒで切断され、上で述べられたｐＸＩのＢｇｌ［Ｉ処理物に連結 される。連結産物は、ＧＬＰ−１残基３７がｍＭＴプロモーターの遠位になるよ うに、１）ＸＩにおいてｍＭＴプロモーターと３゛側の翻訳されないｈＧＨ配列 を分離してＢｇｌｌｒ部位に挿入されているｈＧＨ−ＧＬＰ−１（７−３７）融 合産物の一コピーを用いて分析し同定される。

表　５ （ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　４）　Ｂａｍｆ−１１他の方法として、小さいサイズの シグナルペプチドと必要とされるＧＬＰ−１の一部分で、完全な融合遺伝子が合 成的に調製できる。ＬＤＬレセプターのシグナルペプチド（アミノ酸残基１−２ １）、プレプログルカゴン（アミノ酸残基１−２０）またはヒト成長ホルモン（ アミノ酸残基１−２６）をコードするＤＮＡが知られている方法で合成できると 考えられ、そして同じように合成したＧＬＰ−１の７−３７または７−３６　（ すぐにストップコドンがつづく）のアミノ酸をコードするＤＮＡとｉｎ　ｖｉｔ ｒｏで連結される。これらの分子を設計し、合成するのに必要な配列は、Ｇｅｎ ｂａｎｋ　エントリーのＨＵＭＬＤＬＲＯＩ　（ヒトＬ［ｌＬレセプター）　、 ）（ＵＭＧＬＵＣＧ２　（１：　トＧＬＰ−１とクルカゴン配’Ａ　）　トＨＵ ＩＪＧＨＣＳＡ（ヒト成長ホルモン）において簡単に利用できる。連結産物はヒ ト線維芽細胞に使用されるための適当な哺乳類発現ベクターに挿入することがで きる。プラスミドｐＭＳＧ（ＰｈａｒｍａｃｉａＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）は５゛側と３′側の翻訳されない配 列、スプライス部位、ポリ人付加部位、エンハンサ−とヒト皮膚線維芽細胞で用 いられるプロモーターを持つので、この目的に適当である。別の方法として、連 結産物は適当な５′側の翻訳されない配列を用いて合成され、上で述べえられた プラスミドｐＸＩに挿入することも可能である第二のインスリントロピック（ｉ ｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ）なＧＬＰ−１。

つまりＧＬＰ−１（７−３６）は、上述のオリゴヌクレオチド１１．２をオリゴ ヌクレオチド１１．６で置換することによって発現できる。後のクローニング操 作の全てはｐＸＧＬＰ１構築のために上述した方法に従い、ＧＬＰ−１（７−３ ７）特有のＣ末端のグリシン残基を最終産物が欠くようになる。他に、インスリ ントロピンＧＬＰ−１（７−３６）アミドをつ（るために、ペプチジルグリシン アルファーアミド化酵素の活性によって、インビボでこの末端のグリシン残基を 除いても良い。

プラスミドｐｘｃｔ、ｐ　ｌは、実施例１３でｐＸＥＰＯＩとｐｃＤＮＥＯにつ いて述べたとおりにプラスミドｐｃＤＮＥＯと共に一次ヒト線維芽細胞にコトラ ラスフエクト（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）される。クローンは６４１８を含む 培地で選別され、９６穴プレートに移され、そして細胞上清のＧＬＰ−１（７− ３７）活性または免疫反応性について測定する。ＧＬＰ−１（７−３７）活性は 、細胞上清をラットインスリノーマＲＩＮｍ５Ｆ細胞と一緒に加温放置し、市販 のインスリンラジオイムノアッセイ（Ｃｏａｔ−ａ−Ｃｏｕｎｔ　１ｎｓｕｌｉ ｎ、　ＤＰＣ，Ｌｏｓ　Ａｎｇｅｌｓ、　ＣＡ）を用い、これらの細胞からイン スリン分泌を誘導するだめの上演の能力を測定することによって決定された。Ｇ ＬＰ−１（７−３７）抗原は、市販の抗ＧＬＰ−１抗血清（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ 　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｂｅｌｍｏｎｔ　、　ＣＡ）を用いて測定される。ＧＬＰ −１（７−３７）ポジティブクローンは実施例１６で述べられているようにヌー ドマウスに移植するため広げられ、そして血液サンプルが血清ヒトＧＬＰ−１（ ７−３７）レベルを測定するために採取された。

インビボの活性は絶食動物において、腹膜内にグルコースを注射をしだ後（体重 １ｇあたり１ｍｇのグルコース）、インスリン生成の指数の測定によってモニタ ーされる。一般には、３２匹の移植を受けたマウスのグループと受けていないグ ループは一晩絶食され、２８匹がグルコースを注射された。注射後、２８匹のマ ウスは任意に４匹づつ７つのグループに分けられ、そして血液が（血清グルコー スとインスリンのために）、それぞれのグループについて注射後５．１０．２０ ．３０．４５．６０．９０分に採取され、絶食コントロールとしてグルコース注 射をしないグループとともに行われた。ＧＬＰ−１（７−３７）発現細胞を受け た動物における注射後のインスリン生成の指数（血液中におけるグルコースに対 するインスリンの割合）の移植しない動物をうわまる増加は、発現されたペプチ ドのインビボにおけるインスリントロビック活性を支持するものである。

実施例１８．遺伝子ターゲティングによるトランスフェクトトランスフェクトす るＤＮＡが、相同組み換え事象を通して、染色体ＤＮＡ配列に導入される時、ま たは部分的に置換する時に、ジーンターゲティングが生じる。このような事象は どのようなトランスフェクト実験の途中でも生じる可能性があるが、それらは非 相同又は不正の（ｉｌｌｅｇｉｔｉｍａｔｅ）組み換えによってプラスミドＤＮ Ａが組み込まれるという事象が大過剰に起こることによって、通常マスクされて いる。

ターゲティングの事象を選択する一つの方法は、トランスフェクトするＤＮＡの 組み込みによる遺伝子機能の消失を選択する遺伝子的選択によるものである。ヒ トＨＰＲＴ遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）はヒポキサンチン−ホスホリボシルトランス フェラーゼ酵素をコードしている。ｈｐｒ　を−細胞は、６−チオグアニン（６ −ＴＧ）類似のヌクレオシドを含む培地で増殖することにより選択することがで きる。すなわち、野生型（ＨＰＲＴ”″）対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）を持つ細 胞は、６−ＴＧによって死滅するが、変異体（ｈｐｒｔ−）対立遺伝子を持つ細 胞は生きつづけることができる。従って、ＨＰＲＴ遺伝子機能を破壊する、ター ゲティングされた事象を保持する細胞が６−ＴＯ培地で選択できる。

ＨＰＲＴ遺伝子座に対するターゲティングのためのプラスミドを構築するために 、ＨＰＲＴ配列〔遺伝子バンク（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）名ＨＵＭＨＰＲＴＢ　：　 エドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ、　Ａ、）　ら、江ｎｏｍｉｃｓ　６：５９３−６ ０８（１９９０））の１１，９６０〜１８，８６９位を含みかつ）ＩＰＲＴ遺伝 子のエキソン２と３を含む６．９ｋｂのＨｉｎｄＩ［断片がｐＵｃ１２のＨｉｎ ｄｌｌ［の中にサブクローン化される。得られたクローンはＨＰＲＴ遺伝子断片 のエキソン３の唯一のＸｈｏ１部位で切断され、ｐＭｃＩＮｅｏ　（Ｓｔｒａｔ ａｇｅｎｅ）からのｎｅｏ遺伝子を含む１．１ｋｂの５ａＩＴ−Ｘｈｏｌ断片が 挿入されて、エキソン３をコードする部分が除かれる。ＨＰＲＴ転写の方向と反 対方向のｎｅｏ転写の方向を持った一つのオリエンテーション（ｏｒｉｅｎｔａ ｔｉｏｎ）が選びだされ、ｐＥ３Ｎｅｏと名付けられた。正常なＨＰＲＴエキソ ン３をｎｅｏを欠いた（ｎｅｏ−ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ）型のもので置換すると６ −ＴＧ耐性表現壓のｈｐｒｔ−が得られるであろう。このような細胞は０４１８ 耐性でもある。

ｂ、　確立したヒト線維芽細胞系でのジーンターゲテイング不死化した細胞系に おけるターゲテイングを示すため、そして、ジーンターゲティングにおいてｐＥ ３Ｎｅｏが適切に機能することを確立させるため、ヒト線維肉腫細胞系ＨＴＩｏ ８ｏ　（ＡＴＣＣＣＣＬ　１２＋）がｐＥ３Ｎｅｏによりエレクトロボーレーシ コンを用いてトランスフェクトされたＨＴ　Ｉ　０８０細胞は、エレクトロボー レーシコンに先立って、１５％子牛血１（Ｈｙｃｌｏｎｅ）含有のＨＡＴ　（ヒ ボキサンチン／アミノプテリン／キサンチン）補填のＤＭＥＭ培地で維持された 。エレクトロボーレーシコンの２日前に、細胞をアミノプテリンのない同様の培 地に移し変える。等比級数的に増殖した細胞をトリプシン処理し、ＤＭＥＭ／１ ５％子牛血清で希釈し、遠心分離して、ＰＢＳ　（リン酸緩衝化食塩水）に再懸 濁させて、１ｍｌ当たり１３３０万細胞の最終細胞体積にする。ｐＥ３Ｎｅｏは ＨｉｎｄＩ［で処理され、ｐＵｃ１２骨格から８ｋｂのＨＰＲＴ−ｎｅｏ断片を 分離し、フェノール抽出とエタノール沈殿により精製して、６００μｇ／ｍｌの 濃度で再懸濁させる。５０μｌ　（３０μｇ）を、エレクトロボーレーシコン用 チューブ（ｃｕｖｅｔｔｅ）　（０、４ｃｍｔ極間隔、Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、７５０μｍの細胞懸濁液（細胞数１０００万）と共に 加える。エレクトロボーレーシコンが４５０Ｖ、２５０μＦａｒａｄｓ（Ｂｉｏ −Ｒａｄ　Ｇｅｎｅ　Ｐｕ１ｓｅｒ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ ｓ）で行われた。

チューブの内容物を直ちに、１５％子牛血清含有のＤＭＥＭ培地に加えて、２５ ｍ１の培地当たり、１００万個の細胞になるような細胞懸濁液を作る。この処理 された細胞懸濁液２５ｍ１を１５０ｍｍ径の組織培養皿にまいて、３７℃、５％ 炭酸ガス中で培養する。２４時間後、Ｇ４１８溶液を直接その皿に加えて、６４ １８として８００μｇ／ｍｌの最終濃度のものにする。５日後、培地をＤＭＥＭ ／１５％子牛血清／８００μｇ／ｍｌ　Ｇ４１８の培地に換える。エレクトロボ ーレーシコンの９日後に培地をＤＭＥＭ／１５％子牛血清／８００μｇ／ｍｌ　 ０４１８及び１０μＭＳ−チオグアニン含有のものに換える。０４１８と６−Ｔ Ｇに耐性のコロニーがこの２重選別の開始後１４〜１６日後に、クローニングシ リンダーを用いて採取された。

ＨＴ１０８０細胞における５個の代表的なターゲティング実験の結果を表６に示 す。

トランスフェクション例５では、０４１８’コロニーの全収率決定用のコントロ ール皿によると、３３，７００個のＧ４１８′コロニーが最初ｌＸ１０７個の処 理細胞から発生することが示された。このように、ターゲットされた現象とター ゲットされない現象の比は、６６／３３，７００すなわち１対５１０である。こ の５つの実験を合わせると、ターゲットされた現象は、３．６ＸＩＯ＠の頻度す なわち処理細胞の０．０００３６％という頻度で発生する。

制限酵素と、ｎｅｏとＨＰＲＴ遺伝子から得られたプローブを用いたサザンハイ ブリダイゼーション実験から、ＨＰＲＴ遺伝子座のＨＰＲＴのエキラン３中の予 想された位置にｎｅＯ遺伝子が位置していることが示された。

ｐＥ３ＮｅｏをＨｉｎｄｌ［で切断し、ｐＵｃ１２骨格から８ｋｂのＨＰＲＴ− ｎｅｏ断片を分離し、フェノール抽出とエタノール沈殿により精製する。ＤＮＡ は、２　ｍ　ｇ　／　ｍ　１となるよう再懸濁する。０．５ｍｌの容量中、３０ ０万個の二次ヒト包皮線維芽細胞力（１００ｕｇのＨｉｎｄｕｌｐＥ３Ｎｅｏ（ ５０μｍ）と共に、２５０ボルトと９６０μフアラ・ノドてエレクトロボーレー トされた。３回に分けてトランスフェクションを行い、全部で９００万個の処理 細胞となった。１５０ｍｍ培養皿ごとに、５００，０００個の細胞が０４１８選 択用にまかれた点を除き、実施例６記載のように細胞を処理し、０４１８耐性株 を選択する。選択条件で１０日後に、培養液を４００μｇ／ｍｌの０４１８と１ ０μＭ６−ＴＧを含むヒト線維芽細胞栄養培地に換える。２種の薬剤の組み合わ せで選択することを、さらに１０日継続する。培養皿を顕微鏡で見て、両薬剤に 耐性なヒト線維芽細胞コロニーを検索する。０４１８’　ｔ−ＴＧ’コロニーの 比率は、９００万個の処理細胞当たり４個である。これらのコロニーは、コロニ ーを作り得るすべての細胞のｏ、ｏｏｏｔ％（又は、１００万分の１）となって いる。０４１８’コロニーの全収量を決定するために用いられるコントロール用 培養皿から、最初の９×ｌ〇−個の処理細胞から２８５０個の０４１８’コロニ ーが発生し得ることが示された。このように、ターゲットされない現象に対する ターゲットされたものの比率は４／２゜８５０すなわち１対７１２である。制限 酵素及び、ｎｅｏとＨＰＰＴ遺伝子に由来するプローブを用いたサザンハイプリ ダイゼーシコン実験により、ＨＰＰＴ遺伝子座の）（ＰＲＴエキソン３の中の予 想される部位にｎｅｏ遺伝子が位置し、そしてこれら４個のクローン化された細 胞株中に、ターゲティングが生じていることが示される。両薬剤に耐性なコロニ ーはトランスフェクトされる一次細胞からも単離される（１／３．０ＸＩＯ１） 。

いくつかのｐＥ３Ｎｅｏターゲティング実験の結果は表７にまとめられている。

Ｈｉｎｄｎ［で処理されたｐＥ３Ｎｅ。

は、直接トランスフェクトされるか、又はトランスフェクションに先立って５゛ 端に単鎖の突出部を発生させるため、エキソヌクレアーゼで処理された（実施例 １８ｃ参照）。長さが１７５から９３０塩基対の範囲の単鎖領域を持ったＤＮＡ が試験された。ＨｉｎｄｌｌＩのみで分解したｐＥ３ｎｅｏを用いて、ｌ／７９ ９　０４１８−耐性コロニーが、制限酵素とサザンハイプリダイゼーシコン分析 により、ＨＰＲＴ遺伝子座にターゲティングされた挿入であるｎｅｏ遺伝子があ ることが、同定された（全部で２４個の目的のクローンが単離された）。１７５ 塩基対の突出部を用いた時に、ターゲティングは最大に増強され（約１０倍の増 強）、ｌ／８０　Ｇ４１８・コロニーに、ＨＰＲＴのターゲティングの診断に役 立つ制限断片の存在が示される（全部で９個の目的とするクローンが単離された ）。このように、ここに記載された条件と組み換えＤＮＡ構築物を用いれば、タ ーゲティングは通常のヒト線維芽細胞で容易に観察でき、全体のターゲティング の頻度（ターゲットされたクローンの数を、０４１８耐性株へ安定にトランスフ ェクトされたクローンの数で割ったもの）は、実施例＋８ｅに記載するような方 法で、単鎖の突出尾部を含むターゲティング構築物でトランスフェクトすること で増強され得る。

ヒト線維芽細胞のＨＰＲＴ遺伝子座へのターゲティンググ挿入のための構築物作 製とジーンターゲティングでのその利用 治療に育苗な遺伝子が、ｎｅｏ遺伝子に隣接するかその近くのＨＰＲＴのコーデ ィング領域に挿入されているｐＥ３Ｎｅｏ変異型は、レシピエンド−次又は二次 細胞染色体の特定の位置に、治療に育苗な遺伝子をターゲティングするために使 用することができる。ＨＰＰＴ遺伝子座にｈＧＨ遺伝子をターゲティングするた めに、このようなｐＥ３Ｎｅｏ変異型を構築することができる。

ｐＸＧ）（５はＥｃｏＲｌで処理され、ｈＧＨ遺伝子とそれに結合したマウスメ タロチオネン（ｍＭＴ）プロモーターを含む４．１ｋｂ断片が分離される。Ｅｃ ｏＲＩの突出部はＥ、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼからのクレノー（Ｋｌｅ ｎｏｗ）断片で埋められている。別個にｐＥ３Ｎｅｏはｎｅｏ断片と）ＩＰＲＴ エキソン３の結合（エキソン３に挿入された３′側の結合）を切断するＸｈｏｌ で処理する。直鎖状になったプラスミドのＸｈｏＩ突出端は、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｄ ＮＡポリメラーゼからのクレノー断片で埋め合わされ、得られた断片が４．１ｋ ｂの平滑末端のｈＧＨ−ｍＭＴ断片につながれる。つながれた混合物由来のバク テリアのコロニーは、ｈＧＨ−ｍＭＴｌｆｒ片が単一コピー挿入されているか及 び方向は合っているかが、制限酵素分析によってスクリーニングされ、ｎｅｏ遺 伝子と同じ方向で転写されたｈＧＨ遺伝子が選ばれてｐＥ３Ｎｅ。

／ｈＧＨと名付けられる。ｐＥ３Ｎｅｏ／ｈＧＨｔ−Ｈｉｎｄ■で切断し、ＨＰ ＲＴ、ｎｅｏとｍＭＴ−ｈＧＨ配列を含む１２．１ｋｂの断片を切り離す。切断 したＤＮＡが処理されて、実施例１８ｃに記載する一次又は二次ヒト線維芽細胞 にトランスフェクトされる。Ｇ４１８’　ＴＧ’コロニーが選択され、実施例１ ８ｃに記載するように、ＨＰＲＴ遺伝子中へのｍＭＴ−ｈＧＨとｎｅｏ配列のタ ーゲティング挿入について分析される。個々のコロニーは市販される免疫測定法 （Ｎｉｃｈｏｌｓ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）を用いて、ｈＧＨ（７）発現を測定す る。

二次ヒト線維芽細胞をｐＥ３Ｎｅｏ／ｈＧＨでトランスフェクトし、チオグアニ ン耐性コロニーが、安定なｈ　Ｇ　Ｈの発現についておよび制限酵素とサザンハ イプリダイゼーシコン分析法によって、分析された。１３個のＴＧ’コロニーが 分析され、８個のコロニーが内在性のＨＰＲＴ遺伝子座にｈＧＨ遺伝子が挿入さ れていると同定されている。８個の株はすべて、ｈＧＨの有意な量を安定に発現 しており、２４時間の平均発現レベルは２２７μｇ／ｌｏ”細胞であった。

ｅ、ターゲティングを増強させるためのＤＮＡ末端の修飾いくつかの一連の証拠 から、Ｅ、　ｃｏｌｉ、バクテリオファージ、Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとア フリカッメガエルにおける成る相同性組み換えの過程に、３゛端突出部が関与す ることが示唆されている。アフリカッメガエルの卵母細胞においては、数百個の 塩基対の長さの３′端突出部を持った分子が、制限酵素で消化されて発生する非 常に短い突出部（４ｂｐ）を持った分子よりも、Ｉｎ注入後に非常にすみやかに 同様に処理された分子と組み換えを起こした。酵母においては、数百個の塩基対 の長さを持った３°端突出部の発生が減数分裂的（ｍｅｉｏｔｉｃ）組み換えに おける律速段階であるように見える。ヒト細胞の組み換えにおいて３′端突出部 が関与するとの証拠は報告されておらず、ある踵の修飾ＤＮＡ基質が、どのよう な種においても、ターゲティング（相同性組み換えの一種）を促進するというこ とは示されていない。ヒトの細胞において、ターゲティングに関する３゛端突出 部の効果は、試験されていない。以下の実施例に記載の実験から、５′端突出部 が一次及び二次のヒト線維芽細胞のターゲティングに最も作動であることが示さ れた。

トランスフェクトするＤＮＡ分子の末端を修飾することによって、ターゲティン グを増強させることに関する報告はなされていない。この実施例では分子末端を ２本鎖型から１本鎖型に変換することによる直鎖状ＤＮＡ分子の末端の修飾によ り、−次及び二次のヒト線維芽細胞の染色体へのターゲティングが増強できるこ とを示す。

１１００μｇのプラスミドＩ）Ｅ３Ｎｅｏ　（実施例１８ａ）がＨｆｎｄＩ［で 切断される。このＤＮＡは、フェノール抽出とエタノール沈殿の後に、直接用い ることができる。あるいはＨＰＲＴとｎｅｏ遺伝子のみを含む８ｋｂのＨｉｎｄ ｌ［［断片が、ゲル電気泳動法によってｐＵＣ１２ベクタ一配列と分離すること ができる。ＨｉｎｄＩ［Ｉ切断したＤＮＡのＥｘｏＩ［処理により、両末端に、 各フリーの３°末端で始まり、５゛の突出端を残す広範なエンドヌクレオティッ クな切断が起こる。エンドヌクレオティック反応の程度とその結果としての５゛ 端突出部の長さは、Ｅｘｏｌ［処理反応の時間を変化させることにより、コント ロールできる。ＨｉｎｄｌｌＩ処理されたｐＥ３Ｎｅｏの１００μｇのＥｘｏｌ Ｉ［処理反応が、供給者の推薦する条件に従い、３０秒、１分、１．５分、２分 、２゜５分、３分、３，５分、４分、４．５分と５分の時間で実施された。消化 反応の程度をモニターするため、それぞれの時間の点で、ＥｘｏＩ［Ｉで処理さ れたＤＮＡを１μｇ含むように採取された試料を、マングビーンヌクレアーゼ（ Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて供給者の推薦する条件で処理し、その試料をゲル電気 泳動で分画する。未処理のＨｉｎｄｎ［処理されたｐＥ３ＮｅＯとＥｘｏｌ［と マングビーンヌクレアーゼで処理された同じ分子のサイズの違いを測定する。２ つに分かれたこのサイズの相違から、分子のそれぞれの末端にある５゛端突出部 の平均の長さが出る。上述の時間の点と３０°での処理では、作りだされる５′ 端突出部は１００〜１０００塩基の範囲である。

それぞれの反応時点で採取されたＥｘｏＩ［処理のＤＮＡ　６０８ｇ　（ｐＥ３ Ｎｅｏの全ＨｉｎｄＩ［処理物）が精製され、実施例１８ｃに記載の条件下で一 次及び二次のヒト線維芽細胞へエレクトロボーレーシコンにより導入された。そ れぞれのＥｘｏＩ［Ｉ処理調製物でターゲティングがどの程度増強されたかにつ いては、０４１８’　６−ＴＧ’コロニーの数を計測し、ＥｘｏＩ［で未処理の Ｈｉｎｄｌ［で切断されたｐＥ３ＮｅＯによるターゲティングで得られた数と比 較することによって定量される。

３′端突出部の効果も又、同様の系を用いて定量することができる。この場合、 Ｈｉｎｄｌ［で処理されたｐＥ３Ｎｅ。

を用いて、供給者の推薦する条件で時間間隔を変えてバクテリオファージエフ遺 伝子６エキソヌクレアーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ ａｌｓ）で処理する。処理の程度（末端毎に作りだされた３°端突出部の平均の 長さ）とエレクトロボーレーシコンの条件の決定は、ＥＸＯ■で処理されたＤＮ Ａに関する記載、：準じう。やれ、わ。Ｔ７遺伝工。エキツカ２．アニヤ処理調 製物で、ターゲティングが増強される程度については、０４１８’　６−ＴＧ’ 　：＋ｏ＝−の数を計測し、Ｔ７遺伝子６エキソヌクレ了−ゼ未処理のＨｉｎｄ ｌ［処理ｐＥ３ＮＥ。

によるターゲティングで得られた数と比較することによって定量される。

５′及び３°端突出部を発生させる他の方法も可能である。例えば、相互に部分 的にオーバーラツプしている２つの直鎖状分子を変性させ、アニーリングするこ とで、出発時の直鎖状分子と区別できない再了ニーリングされた断片とともに、 それぞれの分子の両末端に３′端突出部を有する分子、あるいは両末端に５′端 突出部を有する分子の混合物が得られる。突出部の長さは２つのＤＮＡ断片の間 で共通でないＤＮＡの長さから決定される。

ｆ、　−次及び二次ヒト線維芽細胞においてマウスメタロチオネンプロモーター の制御下にヒトエリスロボエチン遺伝子を置くためのターゲティングブラスミド の構築以下に、本件発明の一つの態様を例示する。そこでは、得られたままの状 態では有意な量でＥＰＯを発現しない一次及び二次ヒト線維芽細胞株において、 ヒトエリスロポエチンが発現できるように、ヒトのエリスロボエチン（ＥＰＯ） 遺伝子の上流に位置する正常なポジティブとネガティブの調節配列を変化させる 。

ヒトＥＰＯをコードする領域の上流にのみ存在する領域をＰＣＲで増幅すること ができる。この目的のために用いられる３組のプライマーが、発表されているヒ トＥＰＯの解析からデザインされた（　Ｇｅｎｂａｎｋ名称ＨＵＭＥＰＲＰＡ； 　Ｌｉｎ、　Ｆ−に、、　ｅｔａｔ、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２ニア５８０−７５８４（１９８５）〕。これらブブライ マの組は６０９，６０３又は５９０ｂｐの断片を増幅することができる。

プライマー　（Ｉｌｌｏｏｒｄｉｍｔｅ）　配列　断片ナイスＦｌ　２→２０５ °ＡＧＣＴＴＣＴＧＧＧＣＴＴＣＣＡＧＡＣ（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　９） Ｒ２６１０−＋％　５’　ＧＧＧＧＴＣＣＣＴＣＡＧＣＧＡＣ＃（ＳＥＱ　ＩＤ 　Ｎｏ　１０） Ｆ２　８→２４　５’ＴＧＧＧＣＴＴＣＣＡＧＡＣＣＣＡＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ ｏ　１１） Ｒ２６１０→ゴ１５　５’ＧＧＧＧＴＣＣＣＴＣΔＧＣＧＡＣ饋初Ｆ３　２１− ４４０　５’　ＣＣＡＧＣＴＡＣＴＴＴＧＣＧＧＡＡＣＴＣ（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ ｏ　１２） Ｒ２６］０→！Ｉ５　５’ＧＧＧＧＴＣＣＣＴＣΔＧＣＧＡＣ！ｆｌ障３つの断 片は実質的に重なりあっていて、本件の目的には交換可能なものである。翻訳開 始部位を基準に−６２３〜−１４に広がった（ＨＵＭＥＲＰＡヌクレオチドヌク レアーゼ位）６０９ｂｐ断片の両端にＣ１ａｌリンカ−が結合される。その結果 得られたＣ１ａ■−結合断片をＣ１ａｌで消化し、ｐＢＩｕｅｓｃｒ　１ｐｔＩ ＩｓＫ／＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＣｌａｌ部位に挿入する。その際の配向 性はＨＵＭＥＲＰＡヌクレオチド位置６１０がプラスミドポリリンカーの５ａｌ １部位に隣接するようにする。このプラスミドｐ５°　ＥＰＯをＥＰＯ上流部分 の断片中に唯一あるＦｓｐｌ又は５ｆｉｌ部位で、別々に切断しくＨＵＭＥＲＰ Ａヌクレオチド位置として各々１５０と４０５）、マウスのメタロチオネンプロ モーターに連結させる。典型的には、ｍＭＴ−１遺伝子から得られた１、８ｋｂ のＥｃ　ｏＲＩ−Ｂｇ　Ｉ　Ｍ　（ｍＭＴをコードしない（ＤＮＡ）配列を含む ものとして；　Ｈａｍｅｒ、　Ｄ、Ｈ，ａｎｄ　Ｗａｌｌｉｎｇ　Ｍ、、　Ｊ、 　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎ、１：　２７３２８８（１９８２）；　この断 片はまた、Ｇｅｎｂａｎｋから入手できるｍＭＴ配列、例えばＭＵＳＭＴＩ、Ｍ ＵＳＭＴ　Ｉ　Ｐ、ＭＵＳＭＴ　Ｉ　ＰＲＭの解析からデザインされるＰＣＲプ ライマーを用いてマウスゲノムＤＮＡから公知方法により単離することもできる 〕を公知方法で平滑末端化し、５ｆｉｌで処理した（先端を同様に平滑末端にし た）ｐ５’　ＥＰＯあるいはＦｓｐ　Ｉで処理したｐ５°　ＥＰＯと結合させる 。得られたクローンの配向性が分析され、前のｍＭＴ　ＢｇｌＩ［部位がプラス ミドポリリンカー中の５ａｌ１部位の近くにあるものが、−次及び二次のヒト線 維芽細胞をターゲティングするために用いられる。この配向性は、最終の構築物 の中で、ＨＵＭＥＲＰＡヌクレオチド位置６１０の方向に向かってｍＭＴの転写 を指向させる。得られたプラスミドは、Ｆｓｐｌと５ｆｉＩ部位で、それぞれｍ ＭＴの挿入を行うことから、ｐ５’　ＥＰＯ−ｍＭＴＦ及びｐ５’ＥＰＯ−ｍＭ ＴＳと名付けられている。

さらに上流の配列は、負の調節要素あるいは最初のターゲット配列の上流に存在 するエンハンサ−の修飾、欠失及び／又は置換が望ましい場合に、有用である。

ＥＰＯの場合には、肝臓外の組織と腎臓外組織の中で、ＥＰＯの発現を抑制する 負の調節要素（Ｓｅｍｅｎｘａ、　Ｇ、Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０：　９３０−９３８（１９９０）　）は欠失することがで きる。６ｋｂ断片中に一連の欠失のあるものが調製される。削除された領域は幅 広い宿主細胞活性を有するエンハンサ−で置換されてもよい〔例えば、サイトメ ガロウィルス（ＣＭＶ）からのエンハンサ−〕。

ＨＵＭＥＲＰＡ配列の５′末端の前にＢ　ａ　ｍ　ＨＩ部位（遠位）とＨｉｎｄ ＩＩＩ部位（近位）が位置するので、ｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔｌＩｓＫ／十ベク ター中の６０９ｂｐ５’　ＥＰＯ断片の配向性が選択された。このように、６０ ９ｂｐ断片の上流部分に通常存在する６ｋｂ　ＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄｌ［Ｉ断片 （Ｓｅｍｅｎｚａ、　Ｇ、Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ 、　１０：　９３０−９３８（１９９０）　）は、公知方法を用いて染色体ＤＮ Ａから単離できる。例えばバクテリオファージ、コスミドあるいは酵母の人為染 色体ライブラリー（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　１ｉｂｒａ ｒｙ）を、６０９ｂｐのＰＣＲ増幅断片をプローブとしてスクリーニングするこ とができる。所望のクローンは６ｋｂのＢ　ａｍＨＴ−Ｈ４ｎｄＤＩ断片を有す るであろうし、その同定は公知方法で決定されたヒトＥＰＯ遺伝子の周辺の制限 酵素地図とこの制限酵素地図を比較することによって確認することができる。ま た別の方法として、６０９ｂｐ断片をプローブとして用いて、ＥＰＯ遺伝子上流 部分のヒトゲノムの制限酵素地図を作成することによって、ＨＵＭＥＲＰＡコー ディネート２と６０９に間に起始し、上流ＢａｍＨ１部位を越えて延びる断片を 作る酵素を同定することができる。この断片は、ヒトゲノムＤＮＡの適当に処理 したものからゲル電気泳動法で単離することができ、バクテリアあるいは酵母の クローニングベクターに結合させることができる。正しいクローンは６０９ｂｐ の５’　ＥＰＯプローブにハイブリダイズし、６ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩ ［断片を含有する。単離された６ｋｂ断片は、正しい配向性でｐ５’　ＥＰＯ１ ｐ５’　ＥＰＯ−ｍＭＴＦ又はｐ５°　ＥＰＯ−ｍＭＴＳに挿入（ＨｉｎｄＩ［ ［部位がＨＵＭＥＲＰＡヌクレオチド位置２に隣接するように）される。さらに 、上流の配列を公知方法で単離することができ、それには染色体ウオーキングテ クニックを用いるか、あるいは６０９ｂｐの５’　ＥＰＯプローブにハイブリダ イズする酵母人為染色体の単離によって行うことができる。

以上述べたクローニングのストラテジーは、その後の一次、二次ヒト線維芽細胞 のターゲティングされたトランスフェクションを可能にするためのＥＰＯの上流 配列のインビトロでの修飾を可能にする。このストラテジーでは、負の調節領域 の欠失とともに簡単なｍＭＴプロモーターの挿入、また負の調節領域の欠失と広 範囲の宿主細胞活性を存するエンハンサ−による置換について述べている。

ターゲティングに際し、プラスミドを制限酵素で切断し、プラスミドの骨格（ｂ ａｃｋｂｏｎｅ）から挿入配列を切り離す。ｐ５’　ＥＰＯ−ｍＭＴＳの場合、 Ｉ（ｉｎｄＩ［とＳａｉ！で切断することにより２．４ｋｂのターゲティングフ ラグメントが切り離されるが、このフラグメントは１．８ｋｂのｍＭＴプロモー ターと、該プロモーターの５’　、３’　側にそれぞれ隣接した４０５ｂｐと２ ０４ｂｐの配列よりなる。この隣接配列は、この構築物をＥＰＯ遺伝子の調節領 域にターゲティングするためのＤＮＡである。このＤＮＡ、または２．４ｋｂの ターゲティングフラグメントのみがフェノール抽出およびエタノール沈澱により 精製され、実施例１８ｃに記載された条件下で一次あるいは二次のヒト線維芽細 胞にトランスフェクトされる。トランスフェクトされた細胞は、ヒト線維芽細胞 栄養培養液中、１５０ｍｍディツシュに蒔かれる。

４８時間後、細胞は１０．０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ”の密度〔ｌウェル当たり約 ２０．０００細胞の割合。もし１０’のクローニング可能な（ｃｌｏｎａｂｌｅ ）細胞に対し１回の割合でターゲティングを行うならば、（実施例＋８ｃ）、そ の際単−の発現コロニーを分離するためのアッセイに約５０ウエルが必要であろ う〕で２４ウエルのディツシュに蒔かれる。トランスフェクトする（ｔｒａｎｓ ｆｅｃｔｉｎｇ）ＤＮＡがＥＰＯの上流の相同領域をターゲットする細胞は、ｍ ＭＴプロモーターの制御下でＥＰＯを発現するだろう。１０日後、すべてのウェ ルの上清は、市販の利用可能なイムノアッセイキット（アムジエン）を用いてＥ ＰＯの発現についてアッセイされる。ＥＰＯの合成が認められるウェルからのク ローンが、既知の方法を用いて分離される。代表的には個々のウェルあるいはプ レート中に分離された異なる細胞集団のフラクションをアッセイし、これらのポ ジティブなウェルのフラクションのアッセイを必要に応じて繰り返し、最終的に ｌウェル当たりＩ細胞の割合で蒔かれた９６穴のマイクロタイタープレートをス クリーニングすることによりターゲティングされたコロニーが分離される。プレ ートライセード（ｐｌａｔｅ　１ｙｓａｔｅｓ）全体からのＤＮＡが、ＨＵＭＥ ＲＰＡ核酸部位ｌの核酸部位置するプライマーとｍＭＴに特異的なプライマーを 用いたＰＣＲによりフラグメントを増幅することにより、分析され得る。この一 対のプライマーは、ＤＮＡ配列に基いてその長さが正確に予想されるようなりＮ Ａフラグメントを増幅するはずである。ポジティブなプレートがトリプシン処理 され、次々と低い希釈で蒔きなおし、ターゲットされた細胞を分離するのに必要 なまで、ＤＮＡの調製とＰＣＨのステップが繰り返される。　゛ここで述べられ たターゲティングの手法は、通常の薬物供給（ｐｈａｒｍａｃｏ！ｏｇｉｃ　ｄ ｅｌｉｖｅｒｙ）のためにｈＧＨを産生させる目的で、不死化されたヒトの細胞 （たとえばＨＴ１０８０線維芽細胞、ＨｅＬａ、　ＭＣＰ−７乳癌細胞、Ｋ−５ ６２白血病細胞、ＫＢ癌細胞、あるいは２７８０ＡＤ卵巣癌細胞）においてｈＧ Ｈの発現を活性化することにもおそらく使用されるだろう。

ｈ、ヒトＥＰＯ遺伝子の隣接配列に対するターゲティングと、ターゲティングさ れた一次、二次および不死化されたヒト線維等細胞のポジティブあるいはポジテ ィブ／ネガティブ組み合わせ選択システムによる単離ｐ５’　ＥＰＯ−ｍＭＴＦ 、　ｐ５°ＥＰＯ−ｎ＋ＭＴＳ、および上流に付加的な６ｋｂのＢａｍＨ［−Ｈ ｌｎｄ　Ｉ［［フラグメントを有する誘導体を構築するためのストラテジーは、 ｍＭＴプロモーターに隣接したｎｅｏ遺伝子の挿入という付加的なステップを続 けて行うことができる。加えて、ネガティブな選択マーカー、例えばｇｐｔ［ｐ ＭＳＧ　（ファルマシア）あるいは他の適切な供給源から得られる１はｐＢｌｕ ｅｓｃｒｉｐｔ　［ＩＳＫ／＋ポリリンカー中のＨＵＭＥＲＰＡ配列に隣接して 挿入することができる。前者の場合、Ｇ４１８’コロニーが分離され、ターゲッ トされたコロニーを同定するためにコロニー集団から調製されたＤＮＡのＰＣＲ 増幅、又は制限酵素とサザンハイプリダイゼーシコン分析により、スクリーニン グされる。後者の場合、Ｇ４１８’コロニーは、ｇｐｔ遺伝子の組み込み（ｉｎ ｔｅｇｒａｔｉｏｎ）に対する選択のために、６−ｔｈｉｏｘａｎｔｈｉｎｅを 含む培養液中に蒔かれる〔ベスナード（Ｂｅｓ口ａｒｄ、　Ｃ）ら、Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、７；４１３９−４１４１　（１９８７））　。付言するに 、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子はｇｐｔのような挿入配列とは反対側に配置でき、それに より４００　ｕ　ｇ／ｍｌのＧ４１８．１００μＭの６−を旧ｏｘａｎｔ旧ｎｅ 、２５μｇ／ｍｌ　ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒを含むヒト線維芽細胞栄養培養液中 で細胞を増殖させることにより、ｎｅｏに対するポジティブ選択あるいはｇｐｔ とＴＫ両方に対するネガティブ選択が可能となる。二重のネガティブ選択法は、 真のターゲティングに対する、はぼ完全な選択法となるであろうし、サザンプロ ット分析は最終的な確証を与えるだろう。

ここで述べられたターゲティングの手法は、通常の薬物供給のためにｈＥＰＯを 産生させる目的で、不死化されたヒトの細胞（たとえばＨＴ１０８０線維芽細胞 、ＨｅＬａ、　ＭＣＦ−７乳癌細胞、Ｋ−５６２白血病細胞、ＫＢ癌細胞、ある いは２７８０ＡＤ卵巣癌細胞）においてｈＥＰＯの発現を活性化することにもお そらく使用されるだろう。

ｉ、　−次のヒト線維等細胞において、マウスメタロチオネインプロモーターの 制御下にヒト成長ホルモン遺伝子を配置することを目的とした、ターゲティング ブラスミドの構築 以下の実施例は、−次、二次のヒト線維芽細胞株においてヒト成長ホルモン遺伝 子を発現させるために、該ヒト成長ホルモン遺伝子の上流に位置する通常の調節 配列を変化させる、という本発明の詳細な説明している。

ＥＰＯ遺伝子の調節領域に対するターゲティングに関して実施例１８ｆで述べら れたのと同様のターゲティング分子が、ヒト成長ホルモンＮ遺伝子の５′末に由 来するクローン化されたＤＮＡフラグメントを利用して得られる。　）ＩＵＩＪ ＧＨｃｓＡ（Ｇｅｎｂａｎｋεｎｔｒｙ）ヌクレオチド部位３７８７−５４３２ 　（２つのＥｃｏＮｒ制限酵素部位ではさまれた部分であり、クローニング、あ るいはこのフラグメントを含むサブクローンの診断的切断に対して都合の良いサ イズのフラグメントを提供する）に相当する約１．８ｋｂのフラグメントが、こ の領域におけるＨＵＭＧＨＣＳＡ配列の分析によってデザインされたＰＣＲプラ イマーにより増幅される。この領域は、ｈＧＨ遺伝子Ｎイントロンｌの途中から 翻訳開始部位の５′側より約１．４ｋｂ上流にまで及ぶ。ｐＵｃ１２がＥｃ。

Ｒ１とＢａｍＨＩで切断され、クレノーで処理することにより平滑末端化され、 希釈条件化で再環状化される。その結果、プラスミドはＥｃｏ　Ｒ［とＢａｍ旧 　が欠失されたものとなる。このプラスミドはｐＬＩｃ１２ＸＥＢと命名される 。）ｌｉｎｄｌＩＩリンカ−が、増幅したｈＧｌ（フラグメントにライゲートさ れ、その結果物であるフラグメントはＨｉｎｄ　Ｉ［で切断され、Ｈｉｎｄ　Ｉ ＩＩで切断されたｐＵｃ１２ＸＥＢにライゲートされる。その結果得られたプラ スミド、　ｐＵＣ１２ＸＥＢ−５°ｈＧＨは、ｈＧＨ転写開始部位のすぐ上流に 位置する０、　５ｋｂフラグメントを除去するためにＥｃｏ　Ｒ［とＢａｍＨで 切断される。切断されたＤＮＡは、ｍＭＴ−［遺伝子由来の１．８ｋｂ　Ｅｃｏ ＲＩ−Ｂｇｌ　ＩＩフラグメントにライゲートされる。

（ｍＭＴのコード配列は含んでいない。／１マーとつオリング（Ｈａｍｅｒ、Ｄ 、Ｈ，ａｎｄ　Ｗａｌｌｉｎｇ、Ｍ、）、　Ｊ、Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、Ｇｅｎ、 　１．：２７３−２８８　（１９８２）；フラグメントはＧｅｎｂａｎｋから入 手可能なｍＭＴ配列、たとえばＭＵＳＭＴ　ｒ、ＭＵＳＭＴＩＰ　、　ＭＵＳＭ ＴＩＰＲＭの分析によりデザインされるＰＣＲプライマーを用いてマウスのゲノ ムＤＮＡから既知の方法でも分離され得る。〕このプラスミド　ｐ５゛ｈＧＨ− ｍＭＴは、上流のｈＧ）ｌ配列（ｕｐｓｔｒｅａｍ　ｈＧＨ５ｅｑｕｅｎｃｅｓ ）が両側に隣接するｍＭＴプロモーターを有している。

以上述べたクローニングのストラテジーにより、ｈＧＨの上流の配列がインビト ロで修飾され、引き続いて一次および二次のヒト線維等細胞のターゲット化トラ ンスフェクションがなされる。このストラテジーは、ｍＭＴプロモーターの単純 な挿入を示す。たとえば幅広い宿主細胞特異性を有するエンハンサ−を挿入ｍＭ Ｔ配列の上流に挿入させるといった、他のストラテジーも考え得る。

ターゲティングに際し、プラスミドを制限酵素で切断し、プラスミドの骨格から 挿入物を切り離す。ｐ　５’　ｈＧＨ−ｍＭＴの場合、ＨｉｎｄｌｌＩで切断す ることにより　２．９ｋｂのターゲティングフラグメントが切り離されるが、こ のフラグメントはこの構築物をｈＧＨ遺伝子の調節領域にターゲッッテイングす るためのＤＮＡが、その５゛および３′側に隣接した１、８ｋｂのｍＭＴプロモ ーターからなる。このＤＮＡ　、または２．９ｋｂのターゲティングフラグメン トのみがフェノール抽出およびエタノール沈澱により精製され、実施例６に記載 された条件下で一次あるいは二次のヒト線維等細胞にトランスフェクトされる。

トランスフェクトされた細胞は、ヒト線維芽細胞栄養培養液存在下、１５０ｍｍ ディツシュに蒔かれる。４８時間後、細胞はｔｏ、　ｏｏ。

ｃｅｌｌｓ／ｃｍ”の密度〔１ウエル当たり約２０．０００細胞の割合。もしｌ Ｏ＠のクローニング可能な（ｃｌｏｎａｂｌｅ）細胞に対し１回の割合でターゲ ティングを行うならば（実施例１８ｃ）、その際単−の発現コロニーを分離する ためのアッセイに約５ｏウエルが必要であろう〕で２４ウエルのディツシュに蒔 がれる。トランスフェクトする（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｒ＋ｇ）　ＤＮＡがｈＧ Ｈの上流の相同領域をターゲットした細胞は、ｍＭＴプロモーターの制御下でｈ ＧＨを発現するだろう。１０日後、すべてのウェルの上清か市販の利用可能なイ ムノアッセイキットにコルズ）を用いてｈＧＨの発現についてのアッセイに供さ れる。ｈＧＨの合成が認められるウェルからのクローンが、既知の方法を用いて 分離される。代表的には個々のウェルあるいはプレート中に分離された異なる細 胞集団のフラクションをアッセイし、これらのポジティブなウェルのフラクショ ンのアッセイを必要に応じて繰り返し、最終的に１ウエル当たり１細胞の割合で 蒔かれた９６大のマイクロタイタープレートをスクリーニングすることにより、 ターゲティングされたコロニーが分離される。プレートライセード全体からのＤ ＮＡが、）ＩＵＭＧＨＣ３Ａヌクレオチド部位５．４３２の下流に位置するプラ イマーとｍＭＴに特異的なプライマーを用いたＰＣＨによってフラグメントを増 幅することにより、分析され得る。この一対のプライマーは、ＤＮＡ配列に基い てその長さが正確に予想されるようなりＮＡフラグメントを増幅するはずである 。ポジティブなプレートがトリプシン処理され、次々と低い希釈で蒔きなおし、 ＤＮＡの調製とＰＣＩ’１のステップが、ターゲットされた細胞を分離するのに 必要なまで繰り返される。

ここで述べられたターゲティングの手法は、通常の薬剤供給のためにｈＧＨを産 生させる目的で、不死化されたヒトの細胞（たとえばＨＴ１０８０線維芽細胞、 ＨｅＬａ、　ＭＣＦ−７乳癌細胞、Ｋ−５６２白血病細胞、ＫＢ癌細胞、あるい は２７８０ＡＤ卵巣癌細胞）においてｈ（Ｊの発現を活性化することにもおそら く使用されるだろう。

ｋ、ヒトｈＧＨ遺伝子の隣接配列に対するターゲティングと、ターゲティングさ れた一次、二次および不死化されたヒト線維芽細胞のポジティブあるいはポジテ ィブ／ネガティブ組み合わせ選択システムによる単離ｐ５’　ｈＧＨ−ｍＭＴを 構築するためのストラテジーは、ｍＭＴプロモーターに隣接したｎｅｏ遺伝子の 挿入という付加的なステップを続けて行うことができる。加えて、ネガティブな 選択マーカー、例えばｇｐｔ［ｐＭｓＧ　（ファルマシア）あるいは他の適切な 供給源から得られる１は１）ＵＣＩ２ポリリンカー中のＨＵＭＧＨＣＳＡ配列に 隣接して挿入することができる。前者の場合、０４１８１コロニーが分離され、 ターゲットされたコロニーを同定するためにコロニー集団から調製されたＤＮＡ のＰＣＲ増幅、又は制限酵素とサザンハイプリダイゼーシコン分析によりスクリ ーニングされる。後者の場合、Ｇ４１８’コロニーは、ｇｐｔ遺伝子の組み込み のネガティブ選択のために、ｔｈｉｏｘａｎｔｈｉｎｅを含む培養液中に蒔かれ る〔ベスナード（Ｂｅｓｎａｒｄ、　Ｃ）ら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｆ、　Ｂｉｏｌ 、二４１３９−４１４１（＋９８７）　）　、付言するに、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子 はｇｐｔのような挿入配列とは反対側に配置でき、それにより、４００　μｇ／ ｍｌの６４１８．１００μＭの６−ｔｈｉｏｘａｎｔｈｉｎｅ、　２５μｇ／ｍ ｌ　ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒを含むヒト線維芽細胞栄養培養液中で細胞を増殖さ せることにより、ｎｅｏに対するポジティブ選択あるいはｇｐｔとＴＫ両方に対 するネガティブ選択が可能となる。

二重のネガティブ選択法は、真のターゲティングに対し、はぼ完全な選択法とな るであろう。サザンプロット分析は確認的なものである。

ここで述べられたターゲティングの手法は、通常の薬剤供給のためにｈＧＨを産 生させる目的で、不死化されたヒトの細胞（たとえばＨＴ１０８０線維芽細胞、 ＨｅＬａ、　ＭＣＰ−７乳癌細胞、Ｋ−５６２白血病細胞、ＫＢ癌細胞、あるい は２７８０ＡＤ卵巣癌細胞）においてｈＧｌ（の発現を活性化することにも、お そらく使用されるだろう。

実施例１９．ヒトの成長ホルモンとエリスロボエチンの配列が融合されたキメラ 型転写単位を生じさせるターゲティングプラスミドの構築 以下の実施例は、得られたままのトランスフェクトされていない状態では検出可 能な量のＥＰＯを発現しないような一次あるいは二次の線維芽細胞株において、 ヒトＥＰＯ遺伝子の上流に位置する本来の調節配列をｈＥＰｏの発現が可能なよ うに変化させる、という本発明の２つのさらなる態様を説明している。これらの 態様において、ターゲティングの結果物は、ヒト成長ホルモン遺伝子第１エキソ ンがＥＰＯのエキソン２−５の上流に位置するようなキメラ型転写単位である。

転写、スプライシング、翻訳の産物は、ｈＥＰｏ　のシグナルペプチドのアミノ 酸１−４がｈＧＨのアミノ酸残基１−３に置き変わったようなタンパク質である 。２つの態様は、挿入される外来の調節配列の相対的な位置と、最終的にプロセ ッシングされた転写産物を生産するのに必要であるスプライシングの特異的なパ ターンに関して異なる。

プラスミドｐＸＥＰＯ−１０は、ヒトの第７染色体上に内在的に存在するｈＥＰ Ｏ遺伝子に対するジーンターゲティングにより、ｈＥＰＯのエキソン　ｌをｈＧ Ｈのエクソンｌで置き換えるためにデザインされる。プラスミドｐＸＥＰｏ−１ ０は以下のように構築される。まず、Ｈｉｎｄｌｌ［−Ｂａｍ　ｌ（Ｉで切断さ れたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ［ＩＳＫ＋　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　ＬａＪｏ ｌｌａ、　ＣＡ）中に、ｈＥＰｏのコード領域の上流に存在する６ｋｂのＨｉｎ ｄ　Ｉ［Ｉ−Ｂａｎ　Ｈｌフラグメント（実施例１８ｆ参照）を挿入することに より、中間的なプラスミドｐＴ１６３が構築される。このライゲーションの産物 は、ｐＴＩ６３を構築するために、Ｘｈｏ　Ｉおよび旧ｎｄＩ［で′切断されｐ ＭｃＩｎｅｏＰｏｌｙＡ［Ｔｈｏｍａｓ、　Ｋ、　Ｒ，ａｎｄ　Ｃａｐｅｃｃｈ ｉ、　Ｍ、　Ｒ，Ｃｅ１ｌ　５１：　５０３−５１２　（１９８７）　。Ｓｔｒ ａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、　ＣＡから入手可能１由来の１．１ｋｂ　Ｈ ｉｎｄ　ＩＩＩ−Ｘｈｏｌフラグメントにライゲートされる。オリゴヌクレオチ ド１３．１−１３．４は、融合フラグメント作製のためにポリメラーゼ・チェイ ン・リアクシコンに利用される。融合フラグメントとはマウスメタロチオネイン Ｉ（ｍＭＴ−１）プロモーター−ｈＧＨエキソン１配列が、ｈＥＰＯイントロン １の配列に付加的に融合されたものである。まず、オリゴヌクレオチド１３．１ と１３．２が、ｐＸＧＨ５由来の約０．７３ｋｂのｍＭＴ−［プロモーター　− ｈＧＨエキソン１フラグメントを増幅するために使用される（図１）。次に、オ リゴヌクレオチド１３．３と１３．４が、主としてヒトゲノムＤＮＡ由来のｈＥ Ｐｏイントロン！よりなる約０．５７ｋｂのフラグメントを増幅するために、使 用される。最後に２つの増幅されたフラグメントが混合され、最終的な融合フラ グメント（融合フラグメント３）を作製するために、オリゴヌクレオチド１３． １と１３．４でさらに増幅される。融合フラグメント３は、Ｓａｔ　１部位によ りｍＭＴ−［部分の５゛側に隣接しており、Ｘｈｏ　［部位により　ｈＥＰｏの イントロンｌ配列の３゛側に隣接している。融合フラグメント３はＸｈｏ　［と Ｓａｌ　［で切断され、Ｘｈｏ　［で切断されたｐＴ１６３にライゲートされる 。ライゲーション混合物はＥ、ｃｏｌｉ中にトランスフオームされ（ｔｒａｎｓ ｆｏｒｍｅｄ）、ｈｌＥＰｏイントロン１配列の３′側においてＸｈｏ［部位が 復活している融合フラグメント３挿入物を−っだけ育するクローンが同定され、 ＩＩＸＥＰＯ−１ｏと命名される。

オリゴ１３．　Ｉの大文字でない領域は、５°末端に本来のＫｐｎ　１部位を有 するｍＭＴ−ｔプロモーターに同一である。大文字の部分は、５゛末端をＳａｌ １部位に変換するためのＳａｔ　Ｔ部位のテール（ｔａｉｌ）を意味する。オリ ゴ１３．２と１３．３の太文字領域はｈＧＨ配列を意味し、一方太文字でない領 域はｈＥＰＯ遺伝子由来のイントロンｌ配列である。オリゴ１３．４の太文字で ない領域はｈＥＰｏイントロンｌの最後の２５ベースに同一である。太文字の領 域は、増幅されたフラグメントの３′末端をＸｈｏ　１部位に変換するためのＸ ｈｏ　１部位のテールを含む。

プラスミドｐＸＥＰｏ−１１は、ｍＭＴ−１ブｔｆｆモーターとｈＥＰＯ構造遺 伝子上流に存在するｈＧＨのエキソンｌとプロモーター領域をヒト第７染色体上 の内在的なｈＥＰＯの領域に配置するように、ジーンターゲティングによりデザ インされる。プラスミドｐＸＥＰＯ−１１は以下のように構築される。オリゴヌ クレオチド１３．１と１３．５−１３．７が、融合フラグメントを作製するため にポリメラーゼ・チェイン・リアクシコンにおいて利用される。融合フラグメン トとは、マウスメタロチオネインＩ　（ｍＭＴ−１）プロモーター−ｈＧＨエキ ソンｌ配列が、ｈＥＰＯコード領域に対し−ｌから−６３０に相当するｈＥＰＯ の配列に融合されたものである。最初に、ｐＸＧ８５由来の約０．７３ｋｂのｍ ＭＴ−［プロモーター−ｈＧ）ｌエキソンｌのフラグメントを増幅するために、 オリゴヌクレオチド１３．１と１３．５が使用される（図１）。次にヒトのゲノ ムＤＮＡから、主としてｈＥＰＯのコード領域に対し一■から−６２０に相当す るｈＥｉＰｏの配列よりなる約０．６２ｋｂのフラグメントを増幅するために、 オリゴヌクレオチド１３．６と１３．７が使用される。オリゴ１３．５と１３． ６の両方は、ｈＧＨイントロン１−ｈＥＰＯプロモーター領域に位置する１０ｂ ｐのリンカ−配列を含んでおり、その配列は、天然のｈＥＰｏイントロンｌのス プライス供与部位に相当する。最後に、ｍＭＴ−１部分の５°側のＳａｌ　１部 位とｈＥＰｏプロモーター領域の３゛側のＸｈｏ　１部位により隣接された最終 的な融合フラグメント（融合フラグメント　６）を作製するために、２つの増幅 されたフラグメントは混合され、さらにオリゴヌクレオチド１３．１と１３．７ で増幅される。融合フラグメント６は、ＸｈｏｌとＳａｌ　ｌで切断され、Ｘｈ ｏ　［て切断されたｐＴ１６３に結合される。ライゲーションの混合液はＥ、ｃ ｏｌｉにトランスフオームされ、ｈＥＰＯプロモーター配列の３′側にＸｈｏ　 １部位が復活した融合フラグメント６が一つ挿入されたクローンが同定され、ｐ ＸＥＰｏ−１１と命名される。

１３．５　５’　ＣＣＴＸＧＣＧＧＣＡ　ＡＴＧＧＣＴλＣＡＧ　にＴＧＡ（： ＴＡＣＴＣＭ区＝ＣＴＧＧＨｉｎｄエエエ ＧＣＴＴＣＣＡＧＡＣＣＣＡＧ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　１７）１］、６　５’ 　ＣＴＧＧＧＴＣＴＧＧ　ＡＡＧＣＣＣＡＧＭ　ＧＣＴＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＣ ＣＴＧＴＡＧＨｉｎｄＩＩＩ ＣＣＡＴＴＧＣＣＧＣＴＡＧＧ　（ＳＥＱより　Ｎｏ　１８１１：１．７　５’ 　ＴＴＴＴＣＴＣＧＡＧ　ＣＴＣＣＧＣＧＣＣ’ｌ’　ＧＧＣＣＧＧＧＧＴＣＣ ＣＴＣｆｓＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　１９） オリゴ１３．５と１３６６の太文字の領域はｈＧＨの配列を意味する。イタリッ クの領域はｈＥＰｏイントロンｌの最初のｌＯ塩基対に相当する。残りのオリゴ はｈＥＰ０コード領域に対し−６２０から−５９７のｈＥＰｏの塩基配列に相当 する。オリゴ１３．７の太文字でない領域はｈＥＰＯのコード領域に対し−１か ら−２４の塩基と同一である。太文字の領域は、増幅されたフラグメントの３′ 末端をＸｈｏ　Ｉ部位に変換するためのＸｈｏ　１部位のテールを含んでいる。

プラスミドｐＸＥＰｏ−１０は、ｈＥＰＯの配列を両側に連結したｍＭＴ−１／ ｈＧＨ融合物を含む７．３ｋｂのフラグメントをＢａｍ　Ｈｌ　、！−Ｘｈｏｌ で切断して遊離することにより、ジーンターゲティングのために使用され得る。

このフラグメント（ターゲティングフラグメントｌ）はｈＥＰＯのコード配列を 含んでおらず、ヒトのＥＰＯの遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）にターゲティングを方向 づけするｈＥＰ。

のコード領域の上流−６２０から約−６６２０の配列とｈＥＰｏイントロンｌの 配列のみを有している。ターゲティングフラグメントｌは、実施例１８ｃで述べ られているのと同様の条件を用いて一次あるいは二次の皮膚線維芽細胞にトラン スフェクトされる。０４１８に耐性のコロニーを選んで９６ウエルプレートの各 ウェルに入れ、ＥＬ［ＳＡアッセイ（Ｒ＆　Ｄシステム、ミネアポリスＭＮ）に よりＥＰＯの発現がスクリーニングされる。トランスフェクト（ｔｒａｎｓｆｅ ｃｔｉｎｇ）　ＤＮＡがランダムにヒトゲノム中に組み込まれた（ｉｎｔｅｇｒ ａｔｅｓ）細胞は、ＥＰＯを産生ずることができない。トランスフェクト（ｔｒ ａｎｓｆｅｃｔｉｎｇ）ＤＮＡが、内在的なｈＥＰＯイントロンｌおよびｈＥＰ Ｏ上流配列と相同組み換えをおこした細胞は、ｍＭＴ−［のプロモーター、非転 写配列、ｈＧＨの５°非翻訳配列、ｈＧＨエキソンｌが正常のｈＥＰＯのプロモ ーターとｈＥＰｏエキソンｌに入れ替わったキメラ遺伝子を含んでいる（図７参 照）。ターゲティングフラグメントｌ中の非ｈＥＰＯ配列は、ｈＥＰｏイントロ ンｌの下流のｈＥＰＯ配列に結合している。天然のｈＥＰＯ調節領域のｍ１ＪＴ −１プロモーターによる置換は、本来ならＥＰＯを発現しない線維芽細胞中のＥ ＰＯ遺伝子を活性化する。ｈＥＰｏエキソン！のｈＧＨエキソンｌによる置換に より、ｈＥＰＯシグナルペプチドの最初の４アミノ酸がｈＧＨのアミノ酸１−３ に置換されているタンパク質が得られ、翻訳後のプロセッシングにより成熟した タンパク質から除かれ、発現細胞により分泌される機能的なキメラのシグナルペ プチドが生成される。

プラスミドｐＸＥＰＯ−１１は、ＢａｍＨｌとＸｈｏｌで処理することにより、 両端がｈＥＰｏ配列によりフランクされた（ｆｌａｎｋｅｄ）　ｍＭＴ　−１／ ｈＧＨ融合体を含む？、４ｋｂのフラグメントを得て、ジーンターゲティングに 用いることができる。このフラグメント（ターゲティングフラグメント２）は、 ｈＥＰｏをニードする配列を含んでおらず、ヒトＥＰＯ領域へのターゲティング を指向するため、ｈＥＰｏコード領域の−１からおよそ一６６２０上流にある配 列のみを有する。ターゲティングフラグメント２は実施例１８ｇに記載されたも のと同様の条件を用いて、−次又は二次ヒト皮膚線維芽細胞にトランスフェクト される。０４１Ｂ耐性コロニーは９６穴プレートの各々の穴に分別され、ＥＬＩ ＳＡアッセイ・（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ）により、ＥＰＯ の発現でスクリーニングされる。トランスフェクトしたＤＮＡがヒトゲノムの中 へランダムにとりこまれた細胞はＥＰＯを産生できない。フラグメントしたＤＮ Ａが内在性のｈＥＰｏプロモーター及び上流の配列と相同組み換えを起こした細 胞は、ｍＭＴ−１プロモーターと非転写配列、ｈＧＨ５°非翻訳配列及びｈＧＨ エキソンｌ及び、ｈ　Ｅ　Ｐ　Ｏイントロンｌの最初のｌＯ塩基から成るＩＯ塩 基対リンカ−がｈＥＰＯをコードする領域に対して一６２０位（ｐｏｓｉｔｉｏ 口）に存在するＨｉｎｄＤ１部位に挿入されたキメラ遺伝子を含んでいる（図８ 参照）。通常サイレントであるｈＥＰｏプロモーターの上流にｍＭＴ−１プロモ ーターが存在することにより、（５′から３°への）非翻訳メタロチオネイン及 びｈＧＨ配列、ｈＧＨエキソン１．ｈＥＰｏイントロン１由来の最初の１０塩基 と同一の１０塩基、そして通常のｈＥＰｏプロモーターとｈＥＰｏエキソン１　 （ＥＰＯをコードする配列に対して−６２０から＋１３位）のメツセージ軸ｅｓ ｓａｇｅ）の合成が、−次あるいは二次皮膚線維芽細胞中で導かれるであろう。

ｈＥＰＯイントロンｌのＩＯ塩基対リンカ−配列は、ｈＧＨエキソンｌを続く下 流のｈＥＰｏエキソン２のすぐ上流であるスプライスアクセプタ部位に結合させ るためのスプライスドナ一部位として働く。よってその結果、生じる転写のプロ セシングは、ｈＥＰｏプロモーター、エキソンＩそしてイントロンｌ配列をスプ ライスアウトするであろう。ｈＧＨエキソン１によるｈＥＰｏエキソンｌの置換 により、ｈＥＰｏシグナルペプチドの最初の４アミノ酸が、ｈＧＨのアミノ酸ｌ 〜３で置きかわった蛋白が得られ、成熟蛋白から翻訳後プロセシングによって切 り離され発現細胞から分泌される機能的なキメラシグナルペプチドを作りだすこ とになる。

ｐＸＥＰＯ−１０とｐＸＥＰｏ−１１に関する一連の構築物は、公知方法を用い て構築されるであろう。これらの構築物においては、ｍＭＴ−１プロモーターと ｈＧＨ配列の相対的位置は、ｍＭＴ−１／ｈＧＨ配列がｈＥＰｏ上流配列に挿入 される位置と同様、ジーンターゲティングを促進する別のキメラ転写ユニットを 作るため、融合転写体のより能率的な発現を生じさせるため、又は、他の望まし い性質を付与するため変えることができる。このような構築物は、通常のｈＥＰ Ｏ領域を指向したジーンターゲティングにより、ｈＧＨ−ｈＥＰＯ融合遺伝子が 外来性のプロモーターの支配下にあるという同様の結果を与えるであろう。例え ば、ｈＥＰＯ遺伝子の上流にある６ｋｂのＨｉｎｄＩ［Ｉ−ＢａｍＨＩフラグメ ント（実施例１８ｆ参照）は、ｎｅｏ遺伝子とｍＭＴ−Ｉプロモーター／ｈＧＨ 融合フラグメントの挿入部位に用いつる多くの制限酵素認識部位を有する。この ような部位の１つ、ＨｉｎｄＩ［Ｉ部位のおよそ１．３ｋｂ上流にあるＢｇｌＩ ［部位は、この領域で唯一のものであり、１個又はそれ以上の選択マーカー及び −次、二次あるいは不死化したヒト細胞でのＥＰＯ発現の活性化に寄与する他の 遺伝子の調節領域の挿入に用いつる。

第一に、中間体プラスミドｐＴ１６４は、ｈＥＰｏコード領域の上流にある６ｋ ｂ　ＨｉｎｄＩ［−ＢａｍＨＩフラグメント（実施例１８ｆ）を、ＨｉｎｄＩ［ ［−ＢａｍＨＩで処理されたｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔｌＩ　ＳＫ＋（ストラタジ ーン。

ラジョラ、カリフォルニア（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａｊｏｌｌａ、　ＣＡ ）　）に挿入することにより、構築する。プラスミドｐＭｃＩｎｅ。

Ｐｏ１ｙＡ（トーマス　Ｋ、Ｒ，及びカベツケ　Ｍ、Ｒ，（Ｔｈｏｍａｓ、　Ｋ 、Ｒ，ａｎｄ　Ｃａｐｅｃｃｈｉ、　Ｍ、Ｒ，）　Ｃｅ１ｌ　５１５０３−５１ ２（１９８７）・ストラタジーン、ラジョラ、カリフｔルニア（ＳｔｒａｔａＢ ｎｅ。

Ｌａｊｏｌｌａ、　ＣＡ）より市販）はＢａｍＨＩ及びＸｈｏｌによって処理さ れ、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片処理により、平滑末端 化し、それによって生じる１、１ｋｂのフラグメントが精製される。ｐＴＩ６４ はＢｇｌｌＩで処理され、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片 処理により、平滑末端化される。前記２個の平滑末端断片はつなぎ合わされ、コ ンピテント（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）　Ｅ、　ｃｏｌｉ中にトランスフオームされ る。１．１ｋｂのｎｅｏフラグメントが１個挿入されたクローンを単離し、平滑 なＸｈｏ１部位とＢｇｌＩＩ部位の融合にて再生されたＢｇｌＩＩ部位がプラス ミドｐＴ１６４にある唯一のＨｉｎｄｌｌｒ部位から１．３ｋｂ離れたところに 位置しているものを同定するため、制限酵素分析を行う。その結果得られるプラ スミドｐＴ１６５は、ｎｅｏ転写ユニットの５°側にフランキングした唯一のＢ ｇｌＩ［部位で開裂しつる。

マウスメタロチオネインＩ（ｍＭＴ−１）プロモーター−ｈＧＨエキソンｌ配列 が付加的にスプライスドナ一部位を含む１０塩基対ソラグメントに融合したフラ グメントを作るため、オリゴヌクレオチド１３．８と１３．９がポリメラーゼチ ェインリアクションに用いることができる。より多くのスプライスドナ一部位又 はコンセンサススプライスドナ一部位が使えるかも知れないが、この選ばれたス プライスドナ一部位は天然のｈＥＰｏイントロン１スプライスドナ一部位に対応 する。オリゴヌクレオチド（１３，８及び１３．９）は、ｐＸＧＨ５由来のおよ そ０．７３ｋｂのｍＭＴ−Ｉプロモーター−ｈＧＨエキソン１フラグメント（図 １）を増幅するために用いられる。その増幅されたフラグメント（フラグメント ７）はＢｇｌＩ［で処理され、ＢｇｌＩ［で処理されたｐ’ｒｔ６５につなぎ合 わされる。つなぎ合わされた混合物は、Ｅ。

皿に導入される。ｍＭＴ−１プロモーターのＫｐｎ１部位がｎｅｏ遺伝子の５° 末端の近傍にあり、かつそのｍＭＴ−■プロモーターが唯一のＨｉｎｄｌ［［部 位に向かって転写が起こるように配置されたフラグメント７が１ｍ挿入されたも のを含むクローンが同定され、ｐＸＥＰＯ−１２と命名される１コ、８　５１　 人為上ＪｑｙジｙＬｑ工　９９ユフｋｃｃＴＴＧＧ　ＴＴＴＴ’ｒＡＡＡＡＣＣ ＡＧＣＣＴＧＧＡＧＢｇｌエエ　Ｋｐｎ工 （ＳＥＱより　Ｎｏ　２０） オリゴ１３，８の太字でない部分は、５°境界部位（ｂｏｕｎｄａｒｙ）に天然 のＫｐｎ　１部位を有するｍＭＴ−■プロモーターと同一である。太字タイプは ５′境界部位をＢｇｌＩＩ部位に変えるためのＢｇｌＩ［部位テール部分を表す 。

１１．９　５’　ＴＴＴＴｂＳｌじ口＝ｒ　ＧＡＧＴＡＣＴＣＡＣＣＴＧＴＡＧ ＣＣＡＴ　ＴＧＣＣＧＣＴＡＧＧＢｑｌｌ工 （５ＥＱより　Ｎｏ　２１） オリゴ１３．９の太字部分は、ｈＧＨ配列を表す。

イタリックの部分はｈＥＰｏイントロンｌの最初の１０塩基対に対応する。下線 部のＢｇｌＩＩ部位はプラスミド構築の目的のため加えられた。

プラスミドｐＸＥＰＯ−１２は、ｎｅｏ遺伝子とｈＥＰ。

配列で両側をフランクされたｍＭＴ−Ｔ／ｈＧＨ融合物を含む７．９ｋｂフラグ メントを遊離するようＢａｍＨＩとＨｔｎｄＩ［処理をすることによりジーンタ ーゲティングに用いることができる。このフラグメント（ターゲティングフラグ メント３）は、ｈＥＰｏをコードする配列を含まず、ヒトＥＰＯ領域上流へのタ ーゲティングを指向するためにＥＰＯコーディング領域上流のおよそ−６２０か らおよそ−６６２０の間にある配列のみを有する。ターゲティングフラグメント ３は、実施例１８ｂ及び＋８ｃに記載されたものと同様の条件を用いて、−次、 二次又は不死化ヒト皮膚線維芽細胞にトランスフェクトされる。０４１８−耐性 コロニーは、９６穴プレートの各々の穴に分別され、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆ Ｄシステムス、ミネアポリス、ミネソタ）により、ＥＰＯの発現に対してスクリ ーニングされる。トランスフェクトしたＤＮＡがヒトゲノムの中にランダムにと りこまれた細胞はＥＰＯを生産することができない。トランスフェクトしたＤＮ Ａが内在性のｈＥＰｏプロモーター及び上流の配列と相同組み換えされた細胞は 、ｍＭＴ−１プロモーターと非転写配列、ｈＧＨ５’非翻訳配列及びｈＧＨエキ ソンｌ、及びｈＥＰＯイントロンｌの最初のＩＯ塩基対から成る１０塩基対リン カ−がｈＥＰｏをコードする領域に対しておよそ−１９２０の位置にあるＢｇｌ ＩＩ部位に挿入されているキメラ遺伝子を含んでいる。通常サイレントであるｈ ＥＰｏプロモーターの上流にｍＭＴ−１プロモーターが存在することにより、（ ５′から３′への）非翻訳メタロチオネイン及びｈＧＨの配列、ｈＧＨエキソン １、ｈＥＰｏイントロンｌの最初のｌＯ塩基対と同一のＤＮＡ　１０塩基、及び ｈＥＰｏ上流領域とｈＥＰＯエキソンｌ　（ＥＰＯをコードする配列に対し、お よそ−１９２０から＋１３位）のメツセージの合成が一次、二次あるいは不死化 線維芽細胞（又は他のイト細胞）中で導かれるであろう。ｈＥＰｏイントロン１ 由来の１０塩基対リンカ−配列は、ｈＧＨエキソンＩをｈＥＰｏエキソン２のす ぐ上流にある下流のスプライスアクセプタ一部位に結合させるためのスプライス ドナ一部位として働く。その結果上じる転写のプロセシングは、ｈＥＰｏ上流配 列、プロモーター領域、エキソン１及びイントロンＩ配列をスプライスアウトす るであろう。ｐＸＥＰＯ−１０，−１１及び−１２を用いた場合、メツセージの 転写後のプロセシングは、ｍＭＴ−１プロモーターとｈＥＰｏエキソン１の間の ｈＥＰｏ上流配列にある所望のメツセージを作りだすのに必要な生産的スプライ シングの発生レベルを下げるスプライスアクセプタ一部位を除去するインビトロ 突然変異法を用いることにより、改良されるかもしれない。ｈＧＨエキソンｌに よるｈＥＰｏエキソンｌの置換により、ｈＥＰｏシグナルペプチドの最初の４ア ミノ酸がｈＧＨのアミノ酸１−３で置きかわったタンパク質が得られ、成熟タン パク質から翻訳後プロセッシングにより切り離され、発現細胞から分泌されるキ メラシグナルペプチドが生じる。

乳組織から分離された管断片の消化によりヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ）を得る 。乳組織は脂肪を取り去り、２〜４ｍｍ３の小片に細切する。細切された組織は 、ハンクス基本塩溶液（ＨＢ　Ｓ　Ｓ）で洗い、次にトリプシン化フラスコ〔ベ ル：１．’ｊインラ”、ｔド、ニューシャーシー（Ｂｅｌｌｃｏ、　Ｖｉｎｅｌ ａｎｄ。

ＮＪ）　）中で１０ｇ組織あたりおよそ５０ｍ１の酵素溶液の割合で、酵素溶液 にひだす。酵素溶液はコラゲナーゼＡ（ベーリンガーマンハイム、インディアナ ポリス、インディアナ）１ｍｇ／ｍｌ及びヒアルロンダーゼ（シグマ、セントル イス、モンタナ）１００ユニツト／　ｍ　１を、５％子ウシ血清、１％ペニシリ ン−ストレプトマイシン（ギブコ、グランドアイランド、ニューヨーク）及び１ ０μｇ／ｍｌウシインシュリン（シグマ）を含む乳房上皮細胞基本培地（ＭＥＢ Ｍ、クロネケティクス、サンディエゴ、カリフォルニア）で溶解したものから成 る。消化は、３７°Ｃ１５％ＣＯ２の条件下、オービタル振盪機（１８０ｒｐｍ ）で−晩行われる。消化された組織は、大口径のピペットで繰り返し吸引放出す ることによりさらに分解させる。管断片（ｄｕｃｔａｌ　ｆｒａｇｍｅｎｔ）は 、１５又は５０ｍ１の円錐遠心分離管で１１００Ｏｒｐ、１０分間遠心し、ＨＢ ＳＳ　（１０〜４０ｍ１）で３回洗う。ベレットは、凍結用培地（ＭＥＢＭ＋２ ０％子ウつ血清＋ｌＯ％ＤＭＳＯ）に再度懸濁させ、液体窒素で凍らせておくか 、単一細胞を得るために更に消化を行う。単一細胞を得るために、トリプシン（ ０，０５％トリプシン−ＥＤＴＡ、ギブコ）を管ペレット（０，５ｍｌペレット あたりｔｏｍｔｔ”リブシン）に加え、オービタル振盪機上で３７°Ｃ３０分（ ２００ｒｐｍ）インキュベートする。トリプシン処理は、２ｍｌの子ウシ血清を 加えて終了させ、細胞は１２００ｒｐｍＩＯ分間の遠心で沈殿させる。細胞ベレ ットは増殖用培地に再懸濁させ、数を数えて非コーテイング培養器に１０，０Ｏ Ｏｃｅｌｌｓ／ｃｍ２接種する。ＨＭＥＣは、ウシインシュリン（１０μｇ／ｍ ｌ、シグマ）、上皮細胞成長因子（ｌｏｎｇ／ｍｌ、コラボラティプリサーチ、 ワルサム、マサチューセッツ）、ウシトランスフェリン（５μｇ／ｍｌ、シグマ ）、ハイドロコーチシン（０，１４μＭ、シグマ）及びウシ下垂体抽出物（３５ μｇ／ｍｌ、シグマ）を含むＭＥＢＭからなる血清を含まない成長培地ＭＥＧＭ で通常培養される。

培養初期のサブコンフルエント（ｓｕｂｃｏｎｆ　Ｉｕｅｎｔ）なＨＭＥＣがト リプシン処理され、ＨＢＳＳ＋１５％子ウシ血清に再懸濁され、計数される。細 胞は次にペレットにし、１０ｍ１のエレクトロボーレーシコン緩衝液（Ｅ　Ｐ　 Ｂ）に再懸濁して、もう一度ペレットにする。細胞は３ＸＩＯ’　ｃｅｌｌｓ／ ｍｌの割合でＥＰＢ＋ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマ）に再懸濁させる。

スーパーコイルプラスミドＤＮＡを０．　４ｃｍｔＦｆＡギャップを有する滅菌 キュベツト（バイオラッド。

メルヴイル、ニューヨーク）に加える。０．５ｍｌの細胞懸濁溶液をキュベツト に加え、滅菌トランスファーピペット（コスタ−、ケンブリッジ、マサチューセ ッツ）を用いてＤＮＡと混合する。エレクトロポーレーシコンのため、シーンパ ルサー機器（バイオラッド、メルヴイル、ニューヨーク）は、容量９６０μＦ及 び１５０−４００Ｖにセットする。エレクトロポーレーシコンに続いて、細胞は トランスファーピペットで除かれ、ＭＥＧＭを入れた１５ｍ１ポリプロピレン円 錐遠心管に移される。細胞懸濁液は、選別のため、ｌ、５×１０“ｃｅｌｌ／１ ００ｍｍ　ｄｉｓｈの密度で組織培養皿に加えられる。４８時間後、細胞は５０ μｇ／ｍｌの０４１８（ジエネチシン、ギブコ）を含むＭＥＧＭで再び培養され る。選別皿は、２ｍｍ”又はそれ以上大きな独立したコロニーが認められるまで 、１４〜２８日間インキュベートされる。選別期間中、培養物には１週間ＭＢＧ Ｍ＋５０μｇ／ｍ１０４１８を再添加せず、その後、週２回再添加する。コロニ ーは、クローニングシリンダーで単離され、９６又は２４穴プレートに移される 。

ＨＭＥＣは、電圧域１５０−４００Ｖで、ｐＸＧＨ３０！（１２０μｇ）　、ｐ ｃＤＮＥｏ　（５−６０Ｉｉｇ）でトランスフェクトされるか又はｐＸＧＨ５と ｐｃＤＮＥｏ（各々１００μｇ）でコトララスフエクトされた。２３個のｈＧＨ 発現クローンにおけるｈＧＨ発現の平均は２．２μｇｈＧＨ／１０・ｃｅｌｌ／ ２４時間であった。表９はトランスフェクトされたクローンとトランスフェクト されなかったクローンのサンプルが示した細胞分裂の数を要約したものである。

データが示すように安定にトランスフェクトされたヒト乳房上皮細胞クローンは ２０回以上の細胞分裂を示し、インビボでの蛋白供給や遺伝子治療のための細胞 移植物としても使えるかも知れない。

表　９ ヒト乳房上皮細胞クローンの集団倍化能力域のターゲティングと活性化 ヒト線維芽細胞中で内在性ｈＥＰｏ遺伝子が活性化されつるという仮説を試すた め、ターゲティング構築物ｐＸＥＰ。

−１３が作られた。まず、マウスのメタロチオネイン−１プロモーター（ｍＭＴ −１）に結合したｈＥＰｏ遺伝子の最初のコドンの上流にある６　３ｂｐのゲノ ムｈＥＰｏ配列を含むプラスミドｐＴ２２．Ｉが構築された。ｍＭＴ−１とｈＥ ＰＯ配列を結合させるため、オリゴヌクレオチド２２．１から２２．４がＰＣＲ に用いられた。これらのプライマーの性状は次の通りである。２２．１は、ｍＭ Ｔ−Ｉ　Ｋｐｎ１部位の２８ｂｐ上流から始まるｍＭＴ−１プロモーターの一部 と相同な２１塩基オリゴヌクレオチドである。２２．２と２２．３は、ｈＥＰｏ 遺伝子の最初のコドンの３５塩基上流に始まる２８ｂｐのｈＥＰｏ配列及びオリ ゴヌクレオチド２２゜２の塩基２９から始まるｍＭＴ−１配列を含むようなｈＥ ＰＯ及びｍＭＴ−１配列の結合を定める５８ヌクレオチドの相補的プライマーで あり、天然のｍＭＴ−１のＢｇｌｌＩ部位を有し、ｍＭＴ−１配列を３０塩基延 長させる。２２．４は２１ヌクレオチドの長さでｈＥＰｏ遺伝子の最初のコドン の７２５ｂｐ下流に始まるｈＥＰｏ配列と相同である。これらのプライマーは、 上述のようにｍＭＴ−ＩとｈＥＰｏ配列の融合物を含む１．４ｋｂのＤＮＡ断片 を増幅するのに用いられた。その結果上じるフラグメントは、Ｋｐｎ　Ｉで切断 され（ＰＣＲフラグメントは２つのＫｐｎ　１部位を含む：ｍＭＴ−Ｉプロモー ター領域唯一の天然Ｋｐｎ　Ｉ部位と、ｈＥＰｏ配列中唯一の天然Ｋｐｎ１部位 である）、精製される。プラスミドｐＸＥＰＯ１（図５）は、同様にＫｐｎｌで 切断され、１．４ｋｂフラグメントと６．４ｋｂフラグメントを遊離させた。６ ．４ｋｂフラグメントは精製され、１．４ｋｂのＫｐｎｌ　ＰＣＲ融合フラグメ ントにつながれた。得られた構築物をｐＴ２２．１と呼ぶことにした。２番目の 中間体、ｐＴ２２．２はｈＥＰｏ構造遺伝子の上流にあるおよそ６ｋｂのＨｉｎ ｄＩ［−ＢａｍＨＩフラグメント（実施例１８ｆ参照）をＢａｍＨＩとＨｉｎｄ ｌ［Ｉで切断したｐＢＳＩＩＳＫ＋　（ストラタジーン、ラジョラ、カリフォル ニア）につないで構築した。３番目の中間体ｐＴ２２．３の構築はまず、ネオマ イシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含むｐＭＣＩＮＥＯｐｏｌｙＡ　（ス トラタジーン、ラジョラ、カリフォルニア）から１、ｌｋｂのＸｈｏ　Ｉ／Ｂａ ｍＨＩを切り出した。フラグメントは次にＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片 にューイングランド　バイオラプス）で平滑末端化された。このフラグメントは 、次にｐＢＳＩＩＳＫ十のＨｉｎｃｌＩ部位（同様にしてＤＮＡポリメラーゼＩ で平滑末端化している）につながれて、ｐＴ２２．３が作られた。４番目の中間 体、ｐＴ２２．４はｐＴ２２．２由来のｎｅｏ遺伝子を含む１．１ｋｂのＸｈｏ ｌ／ＨｉｎｄＩ［Ｉフラグメントを精製し、このフラグメントをＸｈｏｌとＨｉ ｎｄＩＩｌ［で切断したｐＴ２２．２につないで作られた。従ってｐＴ２２．４ はｈＥＰｏフラグメント上流のＢａｍＨＩ−ＨｆｎｄＩ［［のＨｉｎｄＩ［部位 に隣接したｎｅｏ遺伝子を有する。最後にｐＸＥＰＯ−１３は、ｐＴ２２、ｌか ら２．８ｋｂ　ＥｃｏＲＩ／ＡｃｃＩフラグメントをまず切り出すことにより作 られた。このフラグメントのＥｃｏＲ１部位は、ｍＭＴ−１プロモーターの５° 境界を定め、一方、このフラグメントのＡｃｃ１部位はｈＥＰｏエキソン５の中 にある。このようにＡｃｃｌ／ＥｃｏＲＩフラグメントは、はとんど完全なｈＥ Ｐｏ発現ユニットを含み、エキソン５の一部と天然のポリアデニル化部位のみを 欠く。この２．８ｋｂ　ＥｃｏＲＩ／Ａｃｃｌフラグメントは精製され、ＤＮＡ ポリメラーゼ■のクレノー断片処理により平滑末端化され、モしてＸｈｏ　Ｉで 処理され、平滑末端化したｐＴ２２．４につなぎ合わされた。

ＨＴ１０８０細胞はＰｖｕ　Ｉ−ＢａｍＨＩで切断されたｐＸＥＰＯ−１３でト ランスフェクトされた。このように切断されたｐＸＥＰＯ−１３は次のような３ つの断片を作る。ａｍｐ遺伝子の一部を含むｌｋｂのベクターフラグメント、残 りのベクター配列の１．７ｋｂフラグメント及びｈＥＰＯ。

ｎｅｏおよびｍＭＴ−１配列を含む８．９ｋｂの断片である。８．９ｋｂのＢａ ｍＨＩ／Ｐｖｕｌフラグメントは、次の配列をＢａｍＨ１部位から順に含んでい た。６．０ｋｂの上流ｈＥＰｏゲノム配列、１．１ｋｂのｎｅｏ転写ユニット、 ０．７ｋｂのｍＭＴ−１プロモーター及びエキラン５内にトランケートされた２ 、８ｋｂのｈＥＰｏコーディング配列である。上記方法で切断された４５μｇの Ｉ）ＥＸＰＯ−１３は、１２００万個の細胞のエレクトロボーレーシコンに用い られた（エレクトロボーレーシコン条件は、実施例１８ｂに記載）。このエレク トロボーレーシコンは合計８回繰り返され、計９６００万細胞に行われた。細胞 はｍｌあたり１００万個の細胞密度になるよう培地と混合され、１ｍｌ量が各々 最少３５ｍ１のＤＭＥＭ／１５％子ウシ血清を含む計９６個の１５０ｍｍ組織培 養プレート（ファルコン）に分注された。

翌日、培地は吸引除去され、０．８ｍｇ／ｍｌの０４１８（ギブコ）を含む新し い培地に交換された。１０日間のインキュベートの後、各プレートの培地はｈＥ ＰｏのＥＬＩＳＡ分析（Ｒ＆Ｄシステムズ）のため、サンプリングされた。９６ プレートのうち６個が少なくともｌＯｍＵ／ｍｌのｈＥＰ。

を含んでいた。これらのプレートの１つ、第１８番がｈＥＰＯ発現コロニーの精 製のために選ばれた。９６の１５０ｍｍプレートの各々がおよそ６００のＧ４１ ８耐性コロニー（全９６プレート上の０４１８耐性コロニーの集計見積もりは５ ７．６００）を含んでいた。１８番プレート上の約６００コロニーは、トリプシ ン処理され、３６４穴プレート（ステアリン）に５０ｃｅｌｌｓ／ｍｌで再接種 された。１週間のインキュベート後３６４穴プレートの大きい穴あたり約１０個 の割合で、単独のコロニーが見えるようになった（このプレートは２４の大きい 穴の各々の中に１６の小さい穴がある）。個々の穴は、この時ｈＥＰｏ発現につ いてスクリーニングされた。２つの大きい穴が少なくとも２０ｍＵ／ｍｌのｈＥ ＰＯを含んでいた。Ａ２号の穴で１６の小さい穴の間に１５のコロニーがあるこ とが認められた。これらの小さい穴の個々の中身はトリプシン処理され、９６穴 プレートの１６の別々の穴に移された。７日間のインキュベートの後、これら各 々の穴から培地がｈＥＰｏのＥＬＩＳＡ分析のためサンプリングされた。番号ｌ Ｏの穴１つだけがｈＥＰｏを含んでいた。この細胞株は、ＨＴ１６５−１８Ａ２ −１０と命名され、定量的ＥＰＯ分析、ＲＮＡ単離、ＤＮＡ単離のため培養に供 された。ｈＥＰｏ生産の定量分析の結果は、２，５００ミリユニット／１００万 細胞／２４時間であった。

ｈＥＰｏエキソン５のＡｃｃ１部位から３゛非翻訳領域のＢｇｌＩＩ部位にのび る０、２ｋｂのＤＮＡプローブが、ＨＴ１６５−１８Ａ２−１０細胞のゲノムＤ ＮＡのプローブに用いられた。エキソン５のＡｃｃ１部位でトランケートされた ターゲティング構築物、ｐＸＥＰｏ−１３は、これらＡｃｃ１／ＢｇｌＩ［配列 を有していないので、ｈＥＰｏ領域のターゲティングのため好適（ｄ　ｉａｇｎ ｏｓ　ｔ　ｉｃ）である。天然ｈＥＰｏ配列が相同的に組み込まれた細胞株だけ がＡｃｃＩ／Ｂｇｌｌ［配列と相同配列を含むｈＥＰＯｍＲＮＡを作るであろう 。ＨＴ１６５１８Ａ２−１０は、３２−ＰでラベルしたＡｃｃｌ／Ｂｇ　Ｉ　Ｉ ［ｈＥＰＯプローブとハイブリダイズする予期された大きさのｍＲＮＡを発現し ているのがノーザンプロットにおいて認められた。制限酵素とサザンプロット分 析により、ｎｅｏ遺伝子とｍＭＴ−ＩプロモーターはＨＴ１６５−１８Ａ２−１ ０細胞の２つのｈＥＰｏアレルのうちの１つに対してターゲットされたことが確 認された。

これらの結果により、相同組み換えは、ヒト線維芽細胞中で通常サイレントであ る遺伝子の調節領域をターゲットし、その遺伝子の機能を活性化させるのに用い うることが示された。

２２．１　５’　ＣＡＣＣＴＡＭＡＴ　ＧＡＴＣＴＣＴＣＴＧ　Ｇ　（ＳＥＱ　 １０　Ｎｏ　２２）２２．２　５’　ＣＧＣＧＣＣにＧＧＴ　ＧＡＣＣＡＣＡＣ ＣＧ　ＧＧＧＧＣＣＣＴＡＧ　ｆｉ、ＴｃＴＧＧＴＧｋＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＡ 　ＣＧＧＡＧＴ品　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＩＪＯ２３）２２．３　５’　ＴＴＡＣＴ ＣＣＧＴＡ　ＧＣＴＣＣＡＧＣＴＴ　ＣＡＣＣＡＧＡＴＣＴ　ＡＧＧＧＣＣＣＣ ＣＧＧＴＧＴＧＧＴＣＡＣＣＣＧＧＣＧＣＧ　（ＳＥＱより　Ｎｏ　２４）２２ ．４　５１　ＧＴＣＴＣＡＣＣ（：Ｔ　ＧＡＴＡ？？ＣＴＣＧ　Ｇ　（ＳＥＱ　 ＩＯＡｏ　２５）均等物 当業者であれば、単に常識的実験手法を用いて、ここに述べた発明の具体的態様 に対する多くの均等物を知りまた確認し得るであろう。これらのおよび他の全て の均等物は下記のクレームの範嗜に含まれるものである。

ｏｃＩ ｌＦＩ輸Ｚ／＋１１１１９０１／’４つ’４５１培養継代数 図１０ 遺伝子治療後の経過時間（日） 遺伝子治療後の経過時間（日） 図　＋３ｂ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成６年５月４日厘・

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．治療目的の産物を発現できる一次あるいは二次細胞であって、 ａ）治療目的の産物をコードする、あるいはそれ自体が治療目的の産物である外 因性ＤＮＡ、およびｂ）トランスフェクト一次あるいは二次細胞において、該外 因性ＤＮＡを発現するのに充分な、非レトロウイルス由来のＤＮＡ配列が そのゲノムへ安定して組み込まれた、脊椎動物（例えば哺乳類）由来のトランス フェクトされた一次あるいは二次細胞。 ２．その中に組み込まれた治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡ、該外因性 ＤＮＡはトランスフェクト一次あるいは二次細胞において、その外因性ＤＮＡを 発現するのに充分なＤＮＡ配列に効果的に結合しているもの、を安定して発現す ることができるトランスフェクトされた脊椎動物（例えば哺乳類）由来の一次あ るいは二次細胞。 ３． ａ） １）取得時の一次あるいは二次細胞において、生産あるいは含有されていない治 療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡ、 ２）取得時の一次あるいは二次細胞において、異常に少量あるいは不完全な形で 生産あるいは含有される治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡ、および３） 取得時の一次あるいは二次細胞において、生理学的に通常の量を生産あるいは含 有する治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡ、 からなる群より選択された治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡ、および、 ｂ）（ａ）の外因性ＤＮＡを発現するのに充分な非レトロウイルス由来のＤＮＡ 配列、ここで（ａ）の該外因性ＤＮＡは（ｂ）のＤＮＡ配列に効果的に結合して いる、がそのゲノムへ安定して組み込まれた、脊椎動物（例えば哺乳類）由来の 一次あるいは二次細胞。 ４．細胞内のエピソーム中に存在する（ａ）および（ｂ）の配列 ａ）治療目的の産物をコードする、若しくはそれ自体が治療目的の産物である外 因性ＤＮＡ、及びｂ）一次あるいは二次細胞において該外因性ＤＮＡが発現する のに充分な非レトロウイルス由来のＤＮＡ配列でトランスフェクトされた脊椎動 物（例えば哺乳類）由来の一次あるいは二次細胞。 ５．（ａ）線維芽細胞、角化細胞、上皮細胞、内皮細胞、ダリア細胞、神経細胞 、血液細胞成分、筋細胞、肝細胞およびそれらの前駆体からなる群、あるいは（ ｂ）ヒト一次細胞、ヒト二次細胞、マウス一次細胞、マウス二次細胞、ウサギ一 次細胞、及びウサギ二次細胞からなる群、から選択された前記の請求項のうちい ずれかの一次あるいは二次細胞。 ６．（ａ）該外因性ＤＮＡが酵素、サイトカイン、ホルモン、抗原、抗体、凝固 因子、調節タンパク質、リボザイム、転写タンパク質、レセプター、アンチセン ス核酸配列およびタンパク質からなる群から選択された治療目的の産物をコード する又は（ｂ）該外因性ＤＮＡがトランスフェクト一次若しくは二次細胞中のタ ンパク質若しくは核酸のキレート化合物形成に充分なＤＮＡ配列、細胞性調節タ ンパク質と結合するＤＮＡ配列、染色体の二次若しくは三次構造を変化させるＤ ＮＡ配列、および転写を調節する成分であるＤＮＡ配列からなる群から選択され た、それ自体が治療目的の産物である前記の請求項のうちいずれかの一次あるい は二次細胞。 ７．選択しうるマーカーをコードするＤＮＡを付加的に含む前記の請求項のうち いずれかの一次あるいは二次細胞。 ８．その中に組み込まれた治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡを発現しう る脊椎動物（例えば哺乳類）由来のトランスフェクト二次細胞のクローン細胞株 。 ９．外因性ＤＮＡがトランスフェクト二次細胞のゲノムＤＮＡに安定して組み込 まれている請求項８のクローン細胞株。 １０．（ａ）該外因性ＤＮＡが、酵素、サイトカイン、ホルモン、抗原、抗体、 凝固因子、調節タンパク質、リボザイム、転写タンパク質、レセプター、アンチ センス核酸配列およびタンパク質からなる群から選択された治療目的の産物をコ ードする又は（ｂ）該外因性ＤＮＡが、トランスフェクト一次若しくは二次細胞 中のタンパク質若しくは核酸のキレート化合物形成に充分なＤＮＡ配列、細胞性 調節タンパク質と結合するＤＮＡ配列、染色体の二次若しくは三次構造を変化さ せるＤＮＡ配列、および転写を調節する成分であるＤＮＡ配列からなる群から選 択された、それ自体が治療目的の産物である、請求項８若しくは請求項９のクロ ーン細胞株。 １１．トランスフェクト二次細胞が、（ａ）トランスフェクト二次線維芽細胞、 トランスフェクト二次角化細胞、トランスフェクト上皮細胞、トランスフェクト 内皮細胞、トランスフェクトグリア細胞、トランスフェクト神経細胞、トランス フェクト血液細胞成分、トランスフェクト筋細胞、トランスフェクト肝細胞、お よびそれらのトランスフェクト前駆体からなる群、あるいは（ｂ）トランスフェ クトヒト二次細胞、トランスフェクトマウス二次細胞、およびトランスフェクト ウサギ二次細胞からなる群から選択されたものである、請求項８若しくは請求項 ９のクローン細胞株。 １２．外因性ＤＮＡが、トランスフェクト二次細胞中のエピソームに存在する請 求項８、１０若しくは１１いずれかのクローン細胞株。 １３．トランスフェクト二次細胞が選択しうるマーカーをコードするＤＮＡを付 加的に含む請求項８ないし１２いずれかのクローン細胞株。 １４．治療目的の産物を発現できる不均一細胞株であって、ａ）治療目的の産物 をコードする外因性ＤＮＡ及びｂ）トランスフェクト一次あるいは二次細胞にお いて該外因性ＤＮＡが発現するのに充分な非レトロウイルス由来のＤＮＡ配列 がそれらのゲノムへ安定して組み込まれた、脊椎動物（例えば哺乳類）由来のト ランスフェクト一次あるいは二次細胞の不均一細胞株。 １５．（ａ）トランスフェクト線維芽細胞、トランスフェクト角化細胞、トラン スフェクト上皮細胞、トランスフェクト内皮細胞、トランスフェクトグリア細胞 、トランスフェクト神経細胞、トランスフェクト血液細胞成分、トランスフェク ト筋細胞、トランスフェクト肝細胞およびそれらのトランスフェクト前駆体から なる群、あるいは（ｂ）トランスフェクトヒト一次細胞、トランスフェクトヒト 二次細胞、トランスフェクトマウス一次細胞、トランスフェクトマウス二次細胞 、トランスフェクトウサギ一次細胞、およびトランスフェクトウサギ二次細胞か らなる群、より選択されたトランスフェクト一次又は二次細胞である請求項１４ の不均一細胞株。 １６．（ａ）ＤＮＡが酵素、サイトカイン、ホルモン、抗原、抗体、凝固因子、 調節タンパク質、リボザイム、転写タンパク質、レセプター、アンチセンス核酸 配列および新規タンパク質からなる群から選択された治療目的の産物をコードす る又は（ｂ）外因性ＤＮＡがトランスフェクトされた一次若しくは二次細胞中の タンパク質若しくは核酸のキレート化合物形成に充分なＤＮＡ配列、細胞性調節 タンパク質と結合するＤＮＡ配列、染色体の二次若しくは三次構造を変化させる ＤＮＡ配列、並びに転写を調節する成分であるＤＮＡ配列からなる群から選択さ れた、それ自体が治療目的の産物である、請求項１４又は請求項１５の不均一細 胞株。 １７．選択しうるマーカーをコードするＤＮＡを付加的に含む請求項１４、１５ 並びに１６のうちいずれかの不均一細胞株。 １８．治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡ、該外因性ＤＮＡは細胞中のエ ピソームに存在するもの、を発現することのできるトランスフェクトされた一次 若しくは二次細胞の不均一細胞株。 １９．ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン、又はグルカゴン様ペプチド１類縁 ペプチドをコードする外因性ＤＮＡである請求項１若しくは請求項４の一次又は 二次細胞。 ２０．治療目的の産物がエリスロポエチン、又はグルカゴン様ペプチド１類縁ペ プチドである請求項８ないし１８のうちいずれかの細胞株。 ２１．治療目的の産物がヒト成長ホルモンである請求項８ないし１８のうちいず れかの細胞株。 ２２．グルカゴン様ペプチド１類縁ペプチドが、ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬ Ｐ−１（７−３６）、ＧＬＰ−１（７−３５）、ＧＬＰ−１（７−３４）、及び 切断（ｔｒｕｎｃａｔｅ）されたカルボキシル末端がアミド化されたＧＬＰ−１ の誘導体、及びアミノ酸置換、欠失、付加若しくは他の改変（例えば、非アミノ 酸成分の付加）を有し、切断（ｔｒｕｎｃａｔｅ）されたＧＬＰ−１の誘導体と 実質的に同等又は高い生物学的な活性若しくは血中安定性をもたらすＧＬＰ−１ の誘導体からなる群より選択されたグルカゴン様ペプチド１誘導体である、請求 項１９若しくは請求項２０による細胞又は細胞株。 ２３．請求項１ないし請求項７若しくは請求項１９若しくは請求項２２の、トラ ンスフェクトされた一次若しくは二次細胞並ひに、トランスフェクトされていな い一次若しくは二次細胞から本質的に構成される細胞混合物。 ２４． ａ）一次細胞を含む脊椎動物（例えば哺乳類）由来の細胞混合物を生産し、 ｂ）治療目的の産物並びに一次細胞において外因性ＤＮＡが発現するのに充分な 付加的ＤＮＡ配列をコードする外因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物で、（ａ）にお いて生産される一次細胞をトランスフェクトし、それによって治療目的の産物を コードする外因性ＤＮＡの発現が可能なトランスフェクトされた一次細胞を生産 し、ｃ）治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡの発現が可能なトランスフェ クトされた一次細胞の増殖に適切な条件下で、（ｂ）において生産された治療目 的の産物をコードする外因性ＤＮＡの発現が可能なトランスフェクトされた一次 細胞を培養し、それによってトランスフェクトされた一次細胞からトランスフェ クトされた二次細胞のクローン細胞株を生産する、の工程からなる請求項８ない し１３又は請求項２０、２１及び２２のうちいずれかのクローン細胞株の生産方 法。 ２５．工程（ｂ）において、（ｉ）外因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を一次細胞 に顕微注入することにより、又は（ｉｉ）リン酸カルシウム沈殿、改変されたリ ン酸カルシウム沈殿、リボソーム融合法、受容体介在送達、マイクロプロジェク タイル銃撃及びポリプレン沈殿により、外因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物で一次 細胞がトランスフェクトされる、請求項２４の方法。 ２６．工程（ｂ）において、ＤＮＡ構築物中に存在するＤＮＡ配列及びゲノムＤ ＮＡ間の相同組換えによって外因性ＤＮＡがゲノムＤＮＡに導入される、請求項 ２４の方法。 ２７． ａ）一次細胞を含む脊椎動物（例えば哺乳類）由来の細胞混合物を供給し、 ｂ）（ａ）において供給された一次細胞から二次細胞集団を供給し、 ｃ）治療目的の産物及び二次細胞中で外因性ＤＮＡが発現するのに充分な付加的 ＤＮＡ配列をコードする外因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物で（ｂ）において生産 された二次細胞をトランスフェクトし、これにより治療目的の産物をコードする 外因性ＤＮＡを発現することができるトランスフェクト二次細胞を生産し、並び にｄ）治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡを発現できるトランスフェクト された二次細胞の増殖に適切な条件下で、（ｃ）で生産された治療目的の産物を コードするＤＮＡを発現できるトランスフェクトされた二次細胞を培養し、 それにより、（ｄ）のトランスフェクト二次細胞からトランスフェクト二次細胞 のクローン細胞株を生産する、 の工程からなる、請求項８ないし１３又は請求項２０、２１及び２２のうちいず れかのクローン細胞株を生産する方法。 ２８．工程（ｃ）において、（ｉ）外因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を二次細胞 に顕微注入することにより、又は（ｉｉ）リン酸カルシウム沈殿、改変されたリ ン酸カルシウム沈殿、リボソーム融合法、受容体介在送達、マイクロプロジエク タイル銃撃及びポリブレン沈殿により、外因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物で二次 細胞がトランスフェクトされる、請求項２７の方法。 ２９．工程（ｃ）において、ＤＮＡ構築物中に存在するＤＮＡ配列とゲノムＤＮ Ａ間の相同組換えによって外因性ＤＮＡがゲノムＤＮＡ中に導入される請求項２ ７の方法。 ３０． ａ）一次細胞を含む脊椎動物（例えば哺乳類）由来の細胞混合物を生産し、 ｂ）治療目的の産物をコードし、トランスフェクトされた二次細胞中で外因性Ｄ ＮＡが発現するのに充分な非レトロウイルス由来のＤＮＡ配列と効果的に結合し た外因性ＤＮＡで（ａ）において生産された一次細胞をトランスフェクトし、そ れにより治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡが発現できるトランスフェク トされた一次細胞を含む一次細胞混合物を生産し、ｃ）治療目的の産物をコード する外因性ＤＮＡの発現が可能な、トランスフェクトされた一次細胞の増殖に適 切な条件下で（ｂ）の生産物を培養し、 それにより、治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡの発現が可能な脊椎動物 由来のトランスフェクト一次又は二次細胞の不均一細胞株を生産する、 の工程を含む請求項１４ないし１８又は請求項２２のうちいずれかの不均一細胞 株を生産する方法。 ３１．工程（ｃ）において、一次細胞と治療目的の産物をコードする外因性ＤＮ Ａを含むＤＮＡ構築物を結合し、並びにゲノムＤＮＡ内に安定して組み込まれた 外因性ＤＮＡを有する少なくとも一つの一次又は二次細胞の生産がもたらされる 条件下でその得られる結合体をエレクトロポーレーションに付すことにより、治 療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物で一次細胞がトラン スフェクトされる、請求項２４又は請求項２７又は請求項３０の方法。 ３２．エレクトロポーレーションが２５０と３００ボルトの間のエレクトロポー レーションボルト数並びに約９６０マイクロファラッドのキャパシタンス設定で 行われる請求項２７又は請求項３１の方法。 ３３．工程（ｂ）において、（ｉ）外因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を一次細胞 に顕微注入することにより、又は（ｉｉ）リン酸カルシウム沈殿、改変されたリ ン酸カルシウム沈殿、リボソーム融合法、受容体介在送達、マイクロプロジエク タイル銃撃及びポリプレン沈殿により、外因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物で一次 細胞がトランスフェクトされる、請求項３０の方法。 ３４．工程（ｂ）において、一次細胞のゲノムＤＮＡと相同組換えを行った構築 物を（ａ）において生産される一次細胞内に導入することによりトランスフェク ト一次細胞が生産され、これによりゲノムＤＮＡ内に該構築物が導入される、請 求項３０の方法。 ３５． ａ）哺乳類由来の一次線維芽細胞を供給し、ｂ）（ａ）において供給された一次 線維芽細胞から二次線維芽細胞集団を生産し、 ｃ）哺乳類由来の二次線維芽細胞を、 ｉ）線維芽細胞中で発現する治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡ及び ｉｉ）線維芽細胞中で外因性ＤＮＡが発現するのに充分な非レトロウイルス由来 の付加的ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物と結合させ、 ｄ）哺乳類由来の二次線維芽細胞へのベクターのトランスフェクションを生じる 条件下で（ｃ）において生産された結合体をエレクトロポーレーションに対し、 それにより、トランスフェクトされた哺乳類由来の二次線維芽細胞及びトランス フェクトされていない哺乳類由来の二次線維芽細胞の混合物を生産し、ｅ）（ｄ ）で生産されたトランスフェクトされた哺乳類由来の二次線維芽細胞を単離し、 及び ｆ）治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡが発現できる、トランスフェクト された哺乳類由来の二次線維芽細胞から本質的に構成されるクローン集団の生産 に適した条件下で、（ｅ）で単離されたトランスフェクトされた哺乳類由来の二 次線維芽細胞を培養する、の工程からなる、哺乳動物へ導入した際に治療目的の 産物をコードする外因性ＤＮＡを発現させることができる哺乳類由来の二次線維 芽細胞のクローン細胞様の生産方法。 ３６． ａ）一次細胞を含む脊椎動物（例えば哺乳類）由来の細胞混合物を供給し、 ｂ）（ａ）において供給された一次細胞から二次細胞集団を生産し、 ｃ）治療目的の産物をコードし、トランスフェクトされた二次細胞中で外因性Ｄ ＮＡが発現するのに充分な非レトロウイルス由来のＤＮＡ配列と効果的に結合し た、外因性ＤＮＡを用いて、（ｂ）において生産された二次細胞をトランスフェ クトし、それにより治療用的の産物をコードする外因性ＤＮＡが発現可能なトラ ンスフェクトされた二次細胞を含む二次細胞の混合物を生産し、 ｄ）治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡを発現することができるトランス フェクトされた二次細胞の増殖に適切な条件下で、（ｃ）における生産物を培養 し、それにより治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡを発現することができ る、脊椎動物由来のトランスフェクトされた二次細胞の不均一細胞株を生産する 、 の工程からなる請求項１４ないし１８又は請求項２２のうちいずれかひとつによ る不均一細胞株を生産する方法。 ３７．工程（ｃ）において、一次細胞と治療目的の産物をコードする外因性ＤＮ Ａを含むＤＮＡ構築物を結合し、並びに外因性ＤＮＡがゲノムＤＮＡ内に安定し て組み込まれた少なくとも一つの二次細胞が得られる条件下でその得られる結合 体をエレクトロポーレーションに付すことにより、治療目的の産物をコードする 外因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物で、二次細胞がトランスフェクトされる、請求 項３６の方法。 ３８．エレクトロポーレーションが２５０と３００ボルトの間のエレクトロポー レーションボルト数で、および約９６０マイクロファラッドのキャパシタンス設 定で行われる請求項３７の方法。 ３９．工程（ｂ）において、（ｉ）外因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を一次細胞 に顕微注入することにより、又は（ｉｉ）リン酸カルシウム沈殿、改変されたリ ン酸カルシウム沈殿、リボソーム融合法、受容体介在送達、マイクロプロジェク タイル銃撃及びポリブレン沈殿により、外因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物で一次 細胞がトランスフェクトされる、請求項３６の方法。 ４０．工程（ｃ）において、二次細胞のゲノムＤＮＡと相同組換えを行った構築 物を（ｂ）で生産された二次細胞に導入することによりトランスフェクト二次細 胞が生産され、それによりゲノムＤＮＡ内に該構築物が導入される、請求項３６ の方法。 ４１． ａ）哺乳類由来の一次線維芽細胞を供給し、ｂ）（ａ）において供給された一次 線維芽細胞からの二次線維芽細胞集団を生産し、 ｃ）哺乳類由来の二次線維芽細胞を、 ｉ）線維芽細胞において発現される治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡ、 及び ｉｉ）線維芽細胞において外因性ＤＮＡが発現するのに充分な非レトロウイルス 由来の付加的ＤＮＡ配列、を含むＤＮＡ構築物と結合させ、 ｄ）ＤＮＡ構築物が哺乳類由来の二次線維芽細胞にトランスフェクションされる ことになる条件下で、（ｃ）において生産された結合体をエレクトロポーレーシ ョンに付し、それにより哺乳類由来のトランスフェクトされた二次線維芽細胞及 び哺乳類由来のトランスフェクトされていない二次線推芽細胞の混合物を生産し 、 ｅ）（ｄ）において生産された哺乳類由来のトランスフェクトされた二次線維芽 細胞を単離し、 ｆ）哺乳動物へ導入した際に、治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡを発現 させることができる哺乳類由来のトランスフェクトされた二次線維芽細胞から本 質的に構成されるクローン集団の生産に適した条件下で、（ｅ）で単離されたト ランスフェクトされた哺乳類由来の二次線維芽細胞を培養する、の工程からなる 、哺乳動物へ導入した際に、治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡを発現さ せることができる哺乳類由来の二次線維芽細胞のクローン細胞株の生産方法。 ４２．工程（ｄ）において、エレクトロポーレーションが２５０と３００ボルト の間のエレクトロポーレーションボルト数で、および約９６０マイクロファラッ ドのキャパシタンス設定で行われる請求項４１の方法。 ４３．（ｆ）の生産物を充分な時間であって、かつ外因性ＤＮＡを発現すること ができるトランスフェクト二次細胞を少なくとも２０回倍加するのに適した条件 下で維持する工程をさらに有する、請求項４１又は請求項４２の方法。 ４４．治療目的の産物がエリスロポエチン、又はグルカゴン様ペプチド１類縁ペ プチドである請求項４１、４２及び４３のうちいずれかの方法。 ４５．治療目的の産物がヒト成長ホルモンである請求項４１、４２及び４３のう ちいずれかの方法。 ４６．グルカゴン様ペプチド１類縁ペプチドが、ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬ Ｐ−１（７−３６）、ＧＬＰ−１（７−３５）、ＧＬＰ−１（７−３４）、及び 切断（ｔｒｕｎｃａｔｅ）されたカルボキシル末端がアミド化されたＧＬＰ−１ の誘導体、及びアミノ酸置換、欠失、付加若しくは他の改変（例えば、非アミノ 酸成分の付加）を有し、切断（ｔｒｕｎｃａｔｅ）されたＧＬＰ−１の誘導体と 実質的に同等又は高い生物学的な活性若しくは血中安定性をもたらすＧＬＰ−１ の誘導体からなる群より選択されたグルカゴン様ペプチド１誘導体である、請求 項４４による細胞又は細胞株。 ４７．請求項１ないし２２のうちいずれかの細胞又は細胞様を培養して、充分な 数の該トランスフェクトされた細胞を供給する、哺乳類に効果的な量の治療目的 の産物を送達することのできるトランスフェクトされた細胞の供給方法。 ４８．遺伝子治療に用いる治療目的の産物の製造のための、請求項１ないし２３ のうちいずれかの細胞又は細胞株の使用。 ４９．治療、例えば遺伝子治療、に用いるための、請求項１ないし２３のうちい ずれかのトランスフェクトされた細胞又は細胞株。 ５０． ａ）エリスロポエチンをコードする外因性ＤＮＡが発現できるトランスフェクト された一次細胞、ｂ）エリスロポエチンをコードする外因性ＤＮＡが発現できる トランスフェクトされた二次細胞、ｃ）又は（ａ）及び（ｂ）の両方、 を含むバリアー装置（ｂａｒｒｉｅｒｄｅｖｉｃｅ）を哺乳類に導入することか らなる、ここで、バリアー装置はエリスロポエチンを哺乳類の血液循環若しくは 組織への移動を許し、そして哺乳類による有害な免疫応答を防ぐのに充分な程度 に哺乳類の免疫系と該バリアー装置内に含まれるトランスフェクトされた細胞と の間の接触を妨ぐ材質からなっている、哺乳類に有効な量のエリスロポエチンを 供給する方法。 ５１．エリスロポエチン及び哺乳類の細胞中でエリスロポエチンが充分発現でき る調節配列をコードする外因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を哺乳類に導入するこ とからなる、ここで該ＤＮＡ構築物は哺乳類の細胞によって取り込まれ、その中 で発現される、哺乳類に有効な量のエリスロポエチンを供給する方法。 ５２．筋肉への直接注入によりＤＮＡ構築物が哺乳類へ導入される請求項５１の 方法。 ５３．装置が哺乳動物に導入される時に、エリスロポエチンの哺乳動物の循環ま たは組織への移行を可能とし、その哺乳動物による有害な免疫反応を防ぐに十分 な程度に哺乳動物の免疫系とバリアー装置内に含まれるトランスフェクト細胞と の接触を防ぐことができる素材からなるバリアー装置（ｂａｒｒｉｅｒｄｅｖｉ ｃｅ）であって、 ａ）エリスロポエチンをコードする外因性ＤＮＡを発現できるトランスフェクト 一次細胞、 ｂ）エリスロポエチンをコードする外因性ＤＮＡを発現できるトランスフェクト 二次細胞、 ｃ）または（ａ）と（ｂ）の両方 を含むバリアー装置。 ５４．哺乳類に効果的な量のエリスロポエチンを供給する治療のために使われる 、エリスロポエチン及び哺乳類の細胞中でエリスロポエチンを発現するのに充分 な調節配列をコードする外因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物。 ５５． ａ）ヒト成長ホルモンをコードする外因性ＤＮＡが発現できるトランスフェクト された一次細胞、ｂ）ヒト成長ホルモンをコードする外因性ＤＮＡが発現できる トランスフェクトされた二次細胞、ｃ）又は（ａ）及び（ｂ）の両方、 を含むバリアー装置（ｂａｒｒｉｅｒｄｅｖｉｃｅ）を哺乳類に導入することか らなる、ここで、バリアー装置はヒト成長ホルモンを哺乳類の血液循環若しくは 組織への移動を許し、そして哺乳類による有害な免疫応答を防ぐのに充分な程度 に哺乳類の免疫系と該バリアー装置内に含まれるトランスフェクトされた細胞と の間の接触を妨ぐ材質からなっている、哺乳類に有効な量のヒト成長ホルモンを 供給する方法。 ５６．ヒト成長ホルモン及び哺乳類の細胞中でヒト成長ホルモンを発現するのに 充分な調節配列をコードする外因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を哺乳類に導入す ることからなる、該ＤＮＡ構築物は哺乳類の細胞によって取り込まれ、その中で 発現される、哺乳類に効果的な量のヒト成長ホルモンを供給する方法。 ５７．筋肉への庭桜注入によりＤＮＡ構築物が哺乳類へ導入される請求項５６の 方法。 ５８．装置が哺乳動物に導入される時に、ヒト成長ホルモンの哺乳動物の循環ま たは組織への移行を可能とし、その哺乳動物による有害な免疫反応を防ぐに十分 な程度に哺乳動物の免疫系とバリアー装置内に含まれるトランスフェクト細胞と の接触を防ぐことができる素材からなるバリアー装置（ｂａｒｒｉｅｒｄｅｖｉ ｃｅ）であって、 ａ）ヒト成長ホルモンをコードする外因性ＤＮＡを発現できるトランスフェクト 一次細胞、 ｂ）ヒト成長ホルモンをコードする外因性ＤＮＡを発現できるトランスフェクト 二次細胞、 ｃ）または（ａ）と（ｂ）の両方 を含むバリアー装置。 ５９．哺乳類に効果的な量のヒト成長ホルモンを供給する治療のために使われる 、ヒト成長ホルモン及び哺乳類の細胞中でヒト成長ホルモンを発現するのに充分 な調節配列をコードする外因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物。 ６０． ａ）インスリノトロピンをコードする外因性ＤＮＡが発現できるトランスフェク トされた一次細胞、ｂ）インスリノトロピンをコードする外因性ＤＮＡが発現で きるトランスフェクトされた二次細胞、ｃ）又は（ａ）及び（ｂ）の両方、 を含むバリアー装置（ｂａｒｒｉｅｒｄｅｖｉｃｅ）を哺乳類に導入することか らなる、ここで、バリアー装置はインスリノトロピンの哺乳類の血液循環若しく は組織への移動を許し、そして哺乳類による有害な免疫応答を防ぐのに充分な程 度に哺乳類の免疫系と該バリアー装置内に含まれるトランスフェクトされた細胞 との間の接触を妨ぐ材質からなっている、哺乳類に有効な量のインスリノトロピ ンを供給する方法。 ６１．インスリノトロピン及び哺乳類の細胞中でインスリノトロピンを発現する のに充分な調節配列をコードする外因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を哺乳類に導 入することからなる、該ＤＮＡ構築物は哺乳類の細胞によって取り込まれ、その 中で発現される、哺乳類に効果的な量のインスリノトロピンを供給する方法。 ６２．筋肉への直接注入によりＤＮＡ構築物が哺乳類へ導入される請求項６１の 方法。 ６３．装置が哺乳動物に導入される時に、インスリノトロピンの哺乳動物の循環 または組織への移行を可能とし、その哺乳動物による有害な免疫反応を防ぐに十 分な程度に哺乳動物の免疫系とバリアー装置内に含まれるトランスフェクト細胞 との接触を防ぐことができる素材からなるバリアー装置（ｂａｒｒｉｅｒｄｅｖ ｉｃｅ）であって、ａ）インスリノトロピンをコードする外因性ＤＮＡを発現で きるトランスフェクト一次細胞、 ｂ）インスリノトロピンをコードする外因性ＤＮＡを発現できるトランスフェク ト二次細胞、 ｃ）または（ａ）と（ｂ）の両方 を含むバリアー装置。 ６４．哺乳類に効果的な量のインスリノトロピンを供給する治療のために使われ る、インスリノトロピン及び哺乳類の細胞中でインスリノトロピンを発現するの に充分な調節配列をコードする外因性ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物。 ６５． ａ）一次若しくは二次細胞のゲノムＤＮＡ配列と相同なＤＮＡ配列を含む外因性 ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を用いて一次若しくは二次細胞をトランスフェクトし 、それによりトランスフェクトされた一次若しくは二次細胞を生産し、及び ｂ）ＤＮＡ構築物中のＤＮＡ配列とゲノムＤＮＡ間の相同組換えが起こるのに適 切な条件下で、トランスフェクトされた一次若しくは二次細胞を維持し、それに より相同組換えされた一次あるいは二次細胞を生産する、 の工程からなる、脊椎動物（例えば哺乳類）由来の一次あるいは二次細胞のゲノ ムＤＮＡのあらかじめ選ばれた部位へ外因性ＤＮＡを導入する方法。 ６６．（ａ）のＤＮＡ構築物が選択しうるマーカーをコードするＤＮＡを付加的 に含む請求項６５の方法。 ６７．相同組換えされた一次あるいは二次細胞の増殖に適した条件下で、相同組 換えされた一次あるいは二次細胞の培養をさらに行ない、それにより相同組換え された二次細胞のクローン株を生産する請求項６５又は請求項６６の方法。 ６８．請求項６７の方法によって生産された相同組換えされた二次細胞のクロー ン細胞株。 ６９． ａ） １）脊椎動物由来の一次あるいは二次細胞において発現される生産物（例えば治 療目的の産物）をコードする外因性ＤＮＡ、 ２）脊椎動物由来の一次あるいは二次細胞におけるゲノムＤＮＡと相同なＤＮＡ 配列、及び ３）少なくともひとつの選択しうるマーカーをコードするＤＮＡ配列、 を含むＤＮＡ構築物を供給し、 ｂ）（ａ）で供給されたＤＮＡ構築物で一次又は二次細胞をトランスフェクトし て（ａ）で供給されたＤＮＡ構築物を含む一次又は二次細胞を生産し、およびｃ ）ゲノムＤＮＡ配列と相同なＤＮＡ配列とゲノムＤＮＡ配列間で相同組換えが起 きるのに適した条件下で（ｂ）で生産された一次又は二次細胞を維持する、それ により、一次又は二次細胞のゲノムＤＮＡ内に組み込まれた（ａ）のＤＮＡ構築 物を有する脊椎動物由来の相同組換えされた一次又は二次細胞を生産する、の工 程よりなる、脊椎動物（例えば哺乳類）由来の一次又は二次細胞のゲノムＤＮＡ 内へＤＮＡ配列をターゲティングする方法。 ７０．一次若しくは二次細胞が、（ａ）線維芽細胞、角化細胞、上皮細胞、内皮 細胞、ダリア細胞、神経細胞、血液細胞成分、筋細胞、肝細胞およびそれらの前 駆体からなる群、あるいは（ｂ）ヒト一次細胞、ヒト二次細胞、マウス一次細胞 、マウス二次細胞、ウサギ一次細胞、及びウサギ二次細胞からなる群から選択さ れる、請求項６５ないし６９のうちいずれかの方法。 ７１．（ａ）外因性ＤＮＡが酵素、サイトカイン、ホルモン、抗原、抗体、凝固 因子、調節タンパク質、リボザイム、転写タンパク質、レセプター、アンチセン ス核酸配列および新規タンパク質からなる群より選ばれた治療目的の産物をコー ドし、（ｂ）外因性ＤＮＡが細胞中でタンパク質若しくは核酸のキレート形成に 充分なＤＮＡ配列、細胞性の調節タンパク質と結合するＤＮＡ配列、染色体の二 次若しくは三次構造を変化させるＤＮＡ配列、並びに転写調節因子であるＤＮＡ 配列からなる群より選ばれたそれ自体が治療目的の産物である、 請求項６５ないし７０のうちいずれかの方法。 ７２．請求項６５、６６、６９、７０及び７１のうちいずれかの方法によって生 産された相同組換えされた一次若しくは二次細胞。 ７３．外因性ＤＮＡがゲノムＤＮＡに組み込まれた、脊椎動物（例えば哺乳類） 由来の相同組換えされた一次若しくは二次細胞。 ７４．（ａ）線維芽細胞、角化細胞、上皮細胞、内皮細胞、ダリア細胞、神経細 胞、血液細胞成分、筋細胞、肝細胞及びそれらの前駆体からなる群、あるいは（ ｂ）ヒト一次細胞、ヒト二次細胞、マウス一次細胞、マウス二次細胞、ウサギ一 次細胞及びウサギ二次細胞からなる群から選択された、請求項７３の相同組換え された一次若しくは二次細胞。 ７５．（ａ）外因性ＤＮＡが酵素、サイトカイン、ホルモン、抗原、抗体、凝固 因子、調節タンパク質、リボザイム、転写タンパク質、レセプター、アンチセン ス核酸配列および新規タンパク質からなる群より選ばれた治療目的の産物をコー ドし、あるいは（ｂ）外因性ＤＮＡが細胞中でタンパク質若しくは核酸のキレー ト形成に充分なＤＮＡ配列、細胞性の調節タンパク質と結合するＤＮＡ配列、染 色体の二次若しくは三次構造を変化させるＤＮＡ配列、並びに転写調節因子であ るＤＮＡ配列からなる群より選ばれたそれ自体が治療目的の産物である、 請求項７３若しくは請求項７４の相同組換えされた一次若しくは二次細胞。 ７６．選択しうるマーカーをコードするＤＮＡをゲノムＤＮＡ内に付加的に組み 込んだ、請求項７３、７４及び７５のうちいずれかの相同組換えされた一次若し くは二次細胞。 ７７．該治療目的の産物を哺乳類へ送達して治療に用いるための、請求項６８若 しくは７２〜７６いずれか記載の相同組換えされた細胞。 ７８． ａ） １） ａ）一次若しくは二次細胞における内在遺伝子（ｒｅｓｉ−ｄｅｎｔｇｅｎｅ） を修復、改変、欠失若しくは置換するＤＮＡ配列、 ｂ）取得時の一次若しくは二次細胞において通常発現されない又は一次若しくは 二次細胞において有意なレベルで発現されない産物をコードするＤＮＡ配列、 ｃ）一次若しくは二次細胞に存在する調節配列を修復、改変、欠失若しくは置換 するＤＮＡ配列、ｄ）取得時の一次若しくは二次細胞において発現される遺伝子 に通常機能的に結合していない調節配列をコードするＤＮＡ配列、並びに ｅ）一次若しくは二次細胞において遺伝子若しくは遺伝子の部分を不活性化若し くは取り去るＤＮＡ配列、 からなる群より選択された外因性ＤＮＡ、２）一次若しくは二次細胞におけるゲ ノムＤＮＡ配列と相同したＤＮＡ配列、並びに ３）少なくともひとつの選択しうるマーカーをコードするＤＮＡ配列、 からなるＤＮＡ構築物を供給し、 ｂ）（ａ）において供給されたＤＮＡ構築物を用いて一次若しくは二次細胞をト ランスフェクトし、これによって（ａ）において供給されたＤＮＡ構築物を含む 一次若しくは二次細胞を生産し、並びに ｃ）ゲノムＤＮＡ配列と相同するＤＮＡ配列とゲノムＤＮＡ配列間で起こる相同 組換えに適した条件下で、（ｂ）において生産された一次若しくは二次細胞を維 持する、 これにより、一次若しくは二次細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれた（ａ）のＤＮ Ａ構築物を持つ脊椎動物由来の一次若しくは二次細胞を生産する、 の工程からなる、脊椎動物由来の一次若しくは二次細胞のゲノムＤＮＡ中のあら かじめ選ばれていた部位へ外因性ＤＮＡをターゲティングする方法。 ７９．それぞれの末端に一本鎖の突起を有する線状ＤＮＡ構築物を一次若しくは 二次細胞に導入することからなる、（ａ）脊椎動物（例えば哺乳類）由来の一次 若しくは二次細胞のゲノムＤＮＡ配列と（ｂ）一次若しくは二次細胞のゲノムＤ ＮＡ配列と相同するＤＮＡ構築物に存在する外因性ＤＮＡ配列との間で相同組換 えの効率を向上させる方法。 ８０．相同組換えに適した条件下で、調節領域を含むＤＮＡ構築物を細胞に導入 することにより、その調節領域が挿入されるかまたは発現させようとする遺伝子 の調節領域の全てまたは一部と置換して、発現させようとする遺伝子と機能的に 結合され、これにより遺伝子の発現が可能な相同的に組換えられた細胞が生産さ れる、細胞（例えば、哺乳類由来）に存在するが、採取したままの細胞内では発 現されないか、採取したままの細胞内では有意な量は発現されない、発現させよ うとする遺伝子の発現を開始する方法。 ８１．該遺伝子が酵素、サイトカイン、ホルモン、抗原、抗体、凝固因子、調節 タンパク質、レセプターおよびタンパク質からなる群から選択されたものである 請求項８０の方法。 ８２．該遺伝子がヒトのエリスロポエチン、成長ホルモン及びインスリン遺伝子 からなる群から選択されたものである請求項８１の方法。 ８３． ａ） １）脊椎動物由来の一次若しくは二次細胞で発現される産物をコードする外因性 ＤＮＡ、 ２）脊椎動物由来の一次若しくは二次細胞におけるゲノムＤＮＡ配列と相同した ＤＮＡ配列、及び３）少なくともひとつの選択しうるマーカーをコードするＤＮ Ａ配列、 からなるＤＮＡ構築物を供給し、 ｂ）（ａ）において供給されたＤＮＡ構築物を用いて一次若しくは二次細胞をト ランスフェクトし、これによって（ａ）において供給されたＤＮＡ構築物を含む 一次若しくは二次細胞を生産し、並びに ｃ）ゲノムＤＮＡ配列と相同したＤＮＡ配列とゲノムＤＮＡ配列間で起こる相同 組換えに適した条件下で、（ｂ）において生産された一次若しくは二次細胞を維 持し、これによって一次若しくは二次細胞のゲノムＤＮＡへ組み込まれた（ａ） のＤＮＡ構築物を有する、脊椎動物由来の相同組換えされた一次若しくは二次細 胞を生産し、 ｄ）（ｃ）において生産された相同組換えされた一次若しくは二次細胞を、ター ゲティングＤＮＡ構築物中に存在する選択しうるマーカーを選択する選択薬剤に さらし、それによって、選択しうるマーカーが安定して組み込まれていない細胞 は殺され、選択しうるマーカーが安定して組み込まれている細胞は生存可能でコ ロニーを形成でき、並びに ｅ）（ｄ）で生産されたコロニーをスクリーニングして、相同組換えされた一次 若しくは二次細胞株を同定する工程からなる、脊椎動物（例えば哺乳類）由来の 一次若しくは二次細胞のゲノムＤＮＡへＤＮＡ配列をターゲティングする方法。 ８４．ポジティブ選択マーカーがｎｅｏであって、選択薬剤がＧ４１８である請 求項８３の方法。 ８５． ａ） １）脊椎動物由来の一次若しくは二次細胞で発現される産物をコードする外因性 ＤＮＡ、 ２）脊椎動物由来の一次若しくは二次細胞におけるゲノムＤＮＡ配列と相同した ＤＮＡ配列、及び３）宿主細胞ゲノムにおいてターゲティング配列と相同配列の 間の相同組換えによりポジティブ選択マーカーのターゲットされた組み込みが起 こるが、ネガティブ選択マーカーは組み込まれないようなコンフィグレーション で、少なくともポジティブおよびネガティブの選択マーカをそれぞれひとつコー ドするＤＮＡ配列からなるＤＮＡ構築物 を供給し、 ｂ）（ａ）において供給されたＤＮＡ構築物を用いて一次若しくは二次細胞をト ランスフェクトし、これによって（ａ）において供給されたＤＮＡ構築物を含む 一次若しくは二次細胞を生産し、並びに ｃ）ゲノムＤＮＡ配列と相同したＤＮＡ配列とゲノムＤＮＡ配列間で起こる相同 組換えに適した条件下で、（ｂ）において生産された一次若しくは二次細胞を維 持し、これによって一次若しくは二次細胞のゲノムＤＮＡへ組み込まれた（ａ） のＤＮＡ構築物を有する、脊椎動物由来の相同組換えされた一次若しくは二次細 胞を生産し、 ｄ）（ｃ）において生産された一次若しくは二次細胞を、ターゲティングＤＮＡ 構築物中に存在するポジティブ選択マーカーを選択する選択薬剤にさらし、それ によって、ポジティブ選択マーカーが安定して組み込まれていない細胞は殺され 、ポジティブ選択マーカーが安定して組み込まれている細胞は生存可能でコロニ ーを形成でき、並びに ｅ）さらに、（ｃ）および（ｄ）において生産された細胞を、ターゲティングＤ ＮＡ構築物中に存在するネガティブ選択マーカーに対抗して選択する選択薬剤に さらし、それによってネガティブ選択マーカーが安定して組み込まれている細胞 は殺され、（ｄ）と（ｅ）により相同的組換え細胞が選択される結果となるよう な工程からなる、脊椎動物（例えば哺乳類）由来の一次若しくは二次細胞のゲノ ムＤＮＡへＤＮＡ配列をターゲティングする方法。 ８６．細胞が（ａ）線維芽細胞、角化細胞、上皮細胞、内皮細胞、グリア細胞、 神経細胞、血液細胞成分、筋細胞、肝細胞およびそれらの前駆体からなる群、あ るいは（ｂ）ヒト一次細胞、ヒト二次細胞、マウス一次細胞、マウス二次細胞、 ウサギ一次細胞、及びウサギ二次細胞からなる群、から選択された脊椎動物（例 えば哺乳類）由来の一次若しくは二次細胞である、請求項７８〜８５いずれかの 方法。 ８７．発現させようとする遺伝子または外因性ＤＮＡが、（ａ）酵素、サイトカ イン、ホルモン、抗原、抗体、凝固因子、調節タンパク質、リボザイム、転写タ ンパク、受容体、アンチセンス核酸配列および新規タンパク質からなる群から選 ばれた治療目的の産物をコードし、あるいは（ｂ）それ自体が、細胞においてタ ンパク質若しくは核酸のキレート形成（ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）に十分な ＤＮＡ配列、細胞性調節タンパク質と結合するＤＮＡ配列、染色体の二次若しく は三次構造を変化させるＤＮＡ配列、および転写を調節する成分であるＤＮＡ配 列からなる群から選択された治療目的の産物である、請求項７８〜８６いずれか の方法。 ８８．請求項７８〜８２、８５、８６並びに８７いずれかの方法によって生産さ れた、相同組換えされた一次若しくは二次細胞。 ８９．請求項８０、８１、８２、８５、８６並びに８７いずれかの方法によって 生産された、相同組換えされた二次細胞のクローン細胞株。 ９０．取得時の該細胞が不死化細胞である請求項８０の方法９１．二つのネガテ ィブ選択マーカーが用いられ、一つのネガティブ選択マーカーがｇｐｔであり、 一つのネガティブ選択マーカーがＨＳＶ−ＴＫ遺伝子である請求項８５、８６並 びに８７の方法。 ９２．ＤＮＡ構築物が少なくとも一つのポジティブ選択マーカー及び少なくとも 一つのネガティブ選択マーカーを付加的に含む請求項７８〜８２いずれかの方法 。 ９３．ポジティブ選択マーカーがｎｅｏであって、ポジティブ選択薬剤がＧ４１ ８である請求項７８〜８２、８５、８６並びに８７いずれかの方法。 ９４．（ａ）ネガティブ選択マーカーがｇｐｔであり、ネガティブ選択薬剤が６ −チオキサンチン（６−ｔｈｉｏｘａｎｔｈｉｎｅ）である、若しくは（ｂ）ネ ガティブ選択マーカーがＨＳＶ−ＴＫ遺伝子であり、ネガティブ選択薬剤がガン シクロピル（ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ）である、請求項７８〜８２、８５、８６ 、８９並びに９３いずれかの方法。 ９５．請求項６８、若しくは請求項７２〜７７、若しくは請求項８８及び８９い ずれか記載の細胞又は細胞株が培養され、充分な数の該トランスフェクトされた 細胞が供給される、有効量の治療目的の産物を哺乳類へ送達することのできるト ランスフェクトされた細胞の供給方法。 ９６．遺伝子治療に用いる治療目的の産物の製造のための、請求項６８、若しく は請求項７２〜７７、若しくは請求項８８及び８９いずれか記載の細胞又は細胞 株の使用。 ９７．治療、例えば遺伝子治療、に用いるための、請求項６８、若しくは請求項 ７２〜７７、若しくは請求項８８及び８９いずれか記載のトランスフェクトされ た細胞又は細胞株。 ９８．治療目的のタンパク質のインビトロにおける製造のための、請求項６８、 若しくは請求項７２〜７６、若しくは請求項７８〜８２、若しくは請求項８５〜 ８７いずれか記載の細胞又は細胞株の使用。 ９９．治療目的のタンパク質のインビトロにおける製造のための、請求項９０に 記載の方法による不死化細胞の使用。 相同組換えによる脊椎動物細胞等のトランスフェクション発明の詳細な説明