JPH10500570A

JPH10500570A - 相同組換えに効果的なｄｎａ構築物及びその利用

Info

Publication number: JPH10500570A
Application number: JP7529826A
Authority: JP
Inventors: エイ．トレコ，ダグラス; ダブリュウ．ハートレイン，ミカエル; エフ．セルデン，リチャード
Original assignee: トランスカリオティックセラピーズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1994-05-13
Filing date: 1995-05-11
Publication date: 1998-01-20
Also published as: EP0759082A1; UA34493C2; HU9603144D0; NO964802L; CZ295115B6; HUT76844A; CA2190289A1; BR9507874A; KR970703429A; FI964536A0; IL113708A0; RU2267533C2; NO964802D0; AU2550495A; CZ325896A3; KR100379356B1; US5641670A; ZA953879B; SK146196A3; WO1995031560A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ａ）ターゲティング配列、ｂ）調節配列、ｃ）エキソン、及びｄ）対になっていないスプライス供与部位を含有してなる構築物に関する。本発明はさらに、細胞内での、上記に記載のような構築物の相同組み換えを含むイン・ビトロ又はイン・ビボにおけるタンパク質の生産方法に関する。次いで、相同組み換え細胞は転写及び翻訳が可能な条件下に維持され、そしてタンパク質が発現する。本発明はさらに、脊椎動物の一次、二次又は不死化細胞等の相同組み換え細胞、かかる細胞の作成方法、融合遺伝子の生産のための相同組み換えの方法、細胞内での遺伝子発現に変化を与える方法、及び本発明の構築物を用いての、細胞内でのタンパク質の生産方法、に関する。

Description

【発明の詳細な説明】相同組換えに効果的なＤＮＡ構築物及びその利用発明の背景治療目的のタンパク質（therapeutic proteins）の投与による疾患治療を目的として現在行なわれているアプローチとしては、従来の医薬品送達法（たとえば静脈内、皮下、または筋肉内注射）で投与される治療目的のタンパク質をイン・ビトロで製造することなどがあり、さらに新しいものとして遺伝子治療などが挙げられる。治療上の興味がもたれるタンパク質は、そのタンパク質をコードする外因性（ exogenous）ＤＮＡを適当な細胞に導入することによって製造されるのが普通である。例えば、所望の治療目的のタンパク質をコードする外因性ＤＮＡを、プラスミド等のベクターで不死化細胞等の細胞に導入し、そのものからコードされたタンパク質が発現される。さらに、内因性の細胞性遺伝子及びそれらの発現は、ジーンターゲティングにより調節されることが示されている。例えば、U.S.特許 5272071号、WO 91/06666号、WO 91/06667号、WO 90/11354号を参照。現在利用可能な遺伝子治療的アプローチは、発現させようとする遺伝物質を含むレトロウイルスベクターなどの感染性ベクターを利用するものである。この様なアプローチは、ベクター作成時に複製能のある（replication-competent）ウイルスができてしまう可能性があること、治療用ウイルスと内因性（endogenous ）レトロウイルスゲノムの間に組換えが起きて、新たな細胞特異性や宿主範囲をもったり病原性や細胞毒性が増大した感染体を生じる可能性があること、多数の細胞に独立的に組み込まれることで腫瘍原性挿入事象の危険が増大すること、レトロウイルス中のクローニング能力が制限される（治療応用性を制限する）こと、および対象産物のイン・ビボ発現が短命であることなどの限界がある。遺伝子産物、とくに現在利用可能な方法に伴う限界や危険を回避する遺伝子産物を提供する、より良いアプローチがあれば有用であろう。発明の要旨本発明は、治療目的のタンパク質のイン・ビトロでの製造、および遺伝子治療による治療目的タンパク質の体内での産生と送達のための改良方法に関する。本方法において、細胞内での所望の被ターゲティング遺伝子（targeted gene）の発現（即ち、所望の内因性細胞性遺伝子）は、細胞内ゲノムの予め選ばれた部位への相同組換えによる、少なくとも調節配列、エキソン及びスプライス供与部位を含有してなるＤＮＡの導入により変化が起こる。これらの構成物は、実際に新規の転写単位（その中で、ＤＮＡ構築物に存在する調節配列、エキソン及びスプライス供与部位が作用できるように内因性遺伝子に結合される）が産生するような結果となるような手法により、染色体（ゲノム）ＤＮＡへ導入される。これらの構成物の染色体ＤＮＡへの導入の結果として、所望の内因性遺伝子の発現に変化が起こる。本明細書で用いられる、変化された遺伝子発現とは、得られた細胞中では通常ではサイレントな（発現しない）遺伝子を活性化する（又は発現を引き起こす）こと、得られた細胞中では生理学的に有意なレベルで発現しない遺伝子の発現を増加させること、得られた細胞中で起こるものと異なる調節又は誘導のパターンを変化させること、そして得られた細胞中で発現される遺伝子の発現を低減する（排除することを含む）ことを包含する。本発明はさらに、ターゲット遺伝子の発現を変化させる方法に有用なＤＮＡ構築物に関する。このＤＮＡ構築物は、(a)ターゲティング配列、(b)調節配列、(c )エキソン、及び(d)対になっていないスプライス供与部位を含有してなる。ＤＮＡ構築物中のターゲティング配列は、成分(b)−(d)が作用できるように内因性のターゲット遺伝子配列に結合されるように、細胞中のターゲット遺伝子に成分(a )−(d)の組み込みを指示する。他の態様においては、ＤＮＡ構築物は、(a)ターゲティング配列、(b)調節配列、(c)エキソン、(d)スプライス供与部位、(e)イントロン、及び(f)スプライス受容部位を含有してなるものであって、成分(b)−(f )が作用できるように内因性の遺伝子配列に結合されるように、成分(a)−(f)の組み込みを指示する。ターゲティング配列は、相同組換えが起こる、細胞内の染色体ＤＮＡ中の予め選ばれた部位と相同である。この構築物中では、エキソンは一般的に調節配列の３’側であり、スプライス供与部位はエキソンの３’側である。以下に、本発明の二態様を説明する。ここでは、ヒトエリトロポエチンh(EPO) の遺伝子の上流配列を変化させ、採取したままの、トランスフェクトされていない状態において検出可能な量のEPOを発現しない一次細胞、二次細胞、又は不死化細胞で、hEPOを発現させる。態様１において、ターゲティング構築物は二つのターゲティング配列を含有してなる。第一のターゲティング配列は、第二のターゲティング配列の５’側の配列と相同であり、そして両配列はhEPOのコード領域の上流に位置する。ターゲティング構築物は調節配列（mMT-1プロモーター）、エキソン（ヒト成長ホルモン（hGH））エキソン１）、及び対になっていないスプライス供与部位も含有する。このターゲティング構築物を用いての相同組換えの産物を図１に示す。態様２においても、ターゲティング構築物は二つのターゲティング配列を含有してなる。第一のターゲティング配列は、内因性hEPO調節配列の中の配列と相同であり、第二のターゲティング配列はhEPOイントロン１と相同である。該ターゲティング構築物は、調節配列（mMT-1 プロモーター）、エキソン（hGH エキソン１）、及び対になっていないスプライス供与部位も含む。このターゲティング構築物を用いての相同組換えの産物を図２に示す。これらの二つの態様において、ターゲティング事象の産物は、hGH遺伝子の第一のエキソンが、hEPOエキソン２−５の上流に位置する成熟ｍＲＮＡを創りだすキメラ転写単位である。転写され、スプライシングされ、そして翻訳された産物は、hEPOのシグナルペプチドのアミノ酸１−４がhGHのアミノ酸残基１−３で置換されたタンパク質である。二つの態様は、挿入されたターゲティング構築物の調節配列の相対位置、及び最終的なプロセシングされた転写物の産生のために起こる必要があるスプライシングの特異的なパターンの両者に関して異なっている。さらに本発明は、上記構築物を、相同組換えにより宿主細胞染色体ＤＮＡへ導入して、相同組換え細胞を生産することによる、イン・ビトロ又はイン・ビボでのタンパク質を生産する方法に関する。相同組換え細胞はその後、転写され得る、翻訳され得る、そして分泌され得る条件下に維持され、有用なタンパク質が生産される。本発明は、タンパク質、とくに治療目的のタンパク質の製造に有用な、トランスフェクト一次または二次細胞（即ち非不死化細胞）、およびトランスフェクト不死化細胞等のトランスフェクト細胞（transfected cells）、該細胞の作成方法、該細胞を使用してイン・ビトロでタンパク質を製造する方法、および遺伝子治療の方法に関する。本発明の細胞は、脊椎動物由来、とくに哺乳類由来、とりわけヒト由来のものである。本発明の方法によって作成される細胞は、治療目的の産物をコードするＤＮＡ、それ自体が治療目的の産物であるＤＮＡおよび／または該トランスフェクトされた細胞に、対応する非トランスフェクト（nontransfected）細胞中で生じるより高いレベルで、または異なる調節または誘導のパターンでもって遺伝子を発現させるＤＮＡを含有する。本発明はまた、一次、二次、および不死化細胞にトランスフェクトを受けさせて外因性遺伝物質を取り込ませる方法、クローン細胞株（clonal cell strains ）または不均質細胞株（heterogenous cell strains）を作成する方法、および上記トランスフェクト一次、二次、または不死化細胞を用いて動物を免疫化するか免疫動物の体内で抗体を作成する方法に関する。本発明はとくに、菌類、植物又は動物、例えば脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒト起源の細胞といった真核細胞中でのジーンターゲティング（ gene targeting）、即ち相同組換えの方法に関する。すなわち、本発明は、相同組換えによって脊椎動物由来の一次、二次、または不死化細胞にＤＮＡを導入する方法であって、あらかじめ選択された部位で該一次、二次、または不死化細胞のゲノムＤＮＡに該ＤＮＡを導入することに関する。使用するターゲティング配列は、ターゲティングＤＮＡ構築物中のＤＮＡが挿入される部位との関連で選択される。本発明はさらに、本発明の方法によって作成された相同的に組換えられた一次、二次、または不死化細胞（以下、ＨＲ一次、二次、または不死化細胞という）、および該ＨＲ一次、二次、または不死化細胞の用途に関する。本発明の一の態様においては、遺伝子の発現が変化を受け、その遺伝子が活性化される。即ち、脊椎動物起源の一次細胞、二次細胞、又は不死化細胞に存在し、採取したままの細胞では通常発現しない遺伝子が活性化され、そしてその結果、コードされたタンパク質が発現する。本態様では、相同組み換えを用いて、調節配列の挿入を通じて通常採取されたままの細胞における遺伝子に関連する調節領域を置換、無能化、又は破壊し、対応する非トランスフェクト細胞よりも明らかに高レベルの遺伝子発現を起こす。一つの態様においては、該活性化遺伝子は、適当な選択可能薬剤の存在下で細胞を培養することによって選択マーカー（selectable marker）遺伝子増幅コピー含有細胞を選択することができるような性質を有する、増幅能を有する選択マーカー遺伝子を導入することによってさらに増幅させることができる。活性化内因性遺伝子は、増幅能を有する選択マーカー遺伝子と互いにつながり合って増幅される。活性化内因性遺伝子の多くのコピーを含有する細胞はイン・ビトロでのタンパク質製造と遺伝子治療に有用である。本発明において開示するジーンターゲティングおよび増幅は、単離と発現が困難であるほど大型の転写ユニットを形成する遺伝子の発現の活性化や、タンパク質コード領域全体の利用ができないかクローン化されていない遺伝子の活性化において特に有用である。また別の態様において、採取されたままの細胞で発現する遺伝子の発現は高められるか又は引き起こされ、対応する非トランスフェクト細胞とは明白に異なる調節又は導入パターンを現す。別の態様では、採取されたままの細胞で発現する遺伝子の発現は低下する（即ち、減少するか又は消失する）。本発明はまた、相同組換えを用いて遺伝子をイントロンのないｃＤＮＡコピーに変換し、酵母または細菌に導入してイン・ビトロでタンパク質を製造する方法も記述する。本発明のトランスフェクト細胞は、ヒトおよび動物における多くの用途に有用である。一つの態様においては、該細胞は、ヒトまたは動物の体内におけるタンパク質送達を目的としてヒトまたは動物に移植することができる。たとえば、ｈＧＨ、ｈＥＰＯ、ヒトインスリノトロピン、およびその他のタンパク質を治療目的でヒトに全身的または局所的に送達させることができる。さらに、成長ホルモン、エリスロポエチン、インスリノトロピン、及び非ヒト起源の他のタンパク質を生産する、非トランスフェクト細胞が生産できる。治療目的の産物を発現するトランスフェクト細胞を含有するとともにそれから該治療目的の産物の自由な浸透を可能とする遮蔽装置（barrier devices）を用いて、イン・ビボで細胞を固定位置に保持したり、細胞を宿主免疫系から保護、隔離することができる。遮蔽装置はとくに有用であり、トランスフェクト不死化細胞、トランスフェクト異種細胞（xenogeneic cells）、またはトランスフェクト同種細胞（allogeneic cells）をヒトまたは動物の疾患状態の治療や農業用途（乳製品の製造用のウシ成長ホルモン）のために移植することができる。遮蔽装置は、何らかの理由で治療計画を変更しなければならないときに、除去しようとする細胞へのアクセスを容易にすることによって便利な短期的（一時的）治療を可能にする。また、トランスフェクト異種および同種細胞は、遮蔽装置がない場合において、該細胞が宿主免疫系によって拒絶されるまで該細胞によって産生される遺伝子産物がイン・ビボで送達されるような短期遺伝子治療に使用することができる。本発明のトランスフェクト細胞はまた、抗体産生の誘導や病原体に対するヒトおよび動物の免疫化に有用である。移植トランスフェクト細胞を用いて、宿主の細胞性および液性免疫応答の刺激をもたらす免疫抗原を送達することができる。これらの免疫応答は、進行中の感染に対抗する疾患対抗能力を刺激および強化するか、治療目的または診断目的に有用でありうるトランスフェクト細胞によってイン・ビボで産生される抗原に対する抗体を作成するために、将来の感染源から宿主を保護する（すなわちワクチン接種）ことを目的として設計することができる。そのような細胞を含有する、除去可能な遮蔽装置を用いると、抗原曝露を簡単に終了させることができる。また、抗原産生は細胞が拒絶されると停止するので、最終的に拒絶される細胞（異種または同種トランスフェクト細胞）を使用して抗原曝露を制限することができる。本発明の方法は、ホルモン、サイトカイン、抗原、抗体、酵素、凝固因子、輸送タンパク質、受容体、調節タンパク質、構造タンパク質、転写因子、リボザイム、またはアンチセンスＲＮＡなど（これらに限定されない）治療目的に有用な様々な産物を産生する一次、二次、または不死化細胞を作成するのに使用することができる。また、本発明の方法は、治療目的の産物のイン・ビトロでの製造や遺伝子治療に有用な天然に存在しないリボザイム、タンパク質、または核酸を産生する細胞を作成するためにも使用することができる。図面の簡単な説明図１は、ｈＥＰＯ遺伝子の転写を活性化するためのストラテジーの概略図である。太線はマウスメタロチオネインＩプロモーターを、スティップルドボックス（stippled box）はｈＧＨの５’非翻訳領域を、ソリッドボックスはｈＧＨエキソン１を、ストライプドボックスはｈＥＰＯイントロン１からの１０塩基対スプライス供与配列を、交差線ボックスはｈＥＰＯの５’ 非翻訳領域を、番号付き白ボックスはｈＥＰＯをコードする配列を、斜線ボックスはｈＥＰＯの３’非翻訳配列を、ＨIIIはＨｉｎｄIII部位を示す。図２は、ｈＥＰＯ遺伝子の転写を活性化するためのストラテジーの概略図である。太線はマウスメタロチオネインＩプロモーターを、スティップルドボックス（stippled box）はｈＧＨの５’非翻訳領域を、ソリッドボックスはｈＧＨエキソン１を、番号付き白ボックスはｈＥＰＯをコードする配列を、斜線ボックスはｈＥＰＯの３’非翻訳配列を、ＨIIIはＨｉｎｄIII部位を示す。図３は、マウスメタロチオネインプロモーターの支配下にあるｈＧＨ遺伝子を含むプラスミドｐＸＧＨ５の概略図である。図４は、プラスミドｐＥ３ｎｅｏＥＰＯの概略図である。ヒトエリスロポエチン遺伝子およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ）ならびにアンピシリン（ａｍｐ）耐性遺伝子の位置を示す。矢印は様々な遺伝子の転写の方向を示す。ｐｍＭＴ１はマウスメタロチオネインプロモーター（ｈＥＰＯ発現を促す）を示し、ｐＴＫは単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター（ｎｅｏ発現を促す）を示す。マップの点線部分は、ヒトヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）座由来の配列の位置を示す。制限エンドヌクレアーゼ認識部位の相対的位置を示す。図５は、プラスミドｐｃＤのＢａｍＨＩ部位に挿入したプラスミドｐＳＶ２ｎｅｏに由来するｎｅｏコード領域（ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ断片）、ｐＢＲ３２２由来のＡｍｐ−Ｒ配列とｐＢＲ３２２Ｏｒｉ配列、およびＳＶ４０由来のポリＡと１６Ｓスプライスジャンクションと初期プロモーター領域を含むプラスミドｐｃＤＮＥＯの概略図である。図６は、プラスミドｐＲＥＰＯ４の概略図である。図７は、０．０２、０．０５、０．１、０．２および０．４μＭのメトトレキセート中で段階的選択に付された、被ターゲティングヒト細胞系中でのエリスロポエチン発現の概略図である。図８は、プラスミドpREPO15の概略図である。ゲノムhEPO配列由来の断片を黒塗り（filled）ボックスで示す。BamHI(3537)とBIII'/HindIII’間の領域はゲンバンク登録（Genbank entry）HUMERPALUの1-4008位の配列に相当する。BgIII'/H indIII'（11463）間の領域はゲンバンク登録HUMERPALUの4009-5169位のＤＮＡ配列に相当する。HindIII（11463）とXhoI(624)間の領域はゲンバンク登録HUMERPA の7-624位に相当する配列を含有する。CMVプロモーター配列は白ボックスで示され、ゲンバンク配列HS5MIEPの546-2105のヌクレオチド由来の配列を含む。neo遺伝子は白の矢印のボックスで示される。neo遺伝子を制御するチミジンキナーゼ( tk)プロモーターは斜線(hatched)ボックスで示される。amp遺伝子を含むpBSIISK +配列は細線で示される。図９Ａは、内因性hEPO遺伝子の消化（上）、及びpREPO15からのターゲティング断片を用いての相同組換え後の活性化hEPO遺伝子の消化（下）で見られる産物の、制限酵素地図及び概略図を示す。図９Ｂは、未処理（ＨＦ）及び被ターゲティング（Ｔ１）ヒト線維芽細胞クローンHF342-15の、制限酵素消化及びサザンハイブリダイゼーション分析の結果を示す（実施例７参照）。図１０はプラスミドpREPO18の概略図である。ゲノムhEPO配列由来の断片は黒塗りボックスで示されている。BamHI(3537)とClaI(7554)との間の領域はゲンバンク登録HUMERPALUの1-4008位の配列に相当する。ATG(12246)とHindIII(13426) との間の領域はゲンバンク登録HUMERPLAUの4009-5169位のＤＮＡ配列に相当する。HindIII(13426)とXhoI(624)との間の領域はゲンバンク登録HUMERPAの7-624位に相当する配列を含む。CMVプロモーター配列は白ボックスで示され、ゲンバンク配列HS5MIEPの546-2015位のヌクレオチド由来の配列を含む。ジヒドロ葉酸レダクターゼ(dhfr)転写単位は点付きボックス矢印として示されている。neo遺伝子は白ボックス矢印で示されている。neo遺伝子を制御するtkプロモーターは斜線ボックスで示されている。amp遺伝子を含むpBSIISK+配列は細線で示されている。図１１は、イントロンがない遺伝子であるα−インターフェロン遺伝子の活性化と増幅のための、本発明の構築物の概略図である。図中、この構築物は第一のターゲティング配列（１）、増幅可能なマーカー遺伝子（ＡＭ）、選択マーカー遺伝子（ＳＭ）、調節配列、ＣＡＰ部位、スプライス供与部位（ＳＤ）、イントロン（細線）、スプライス受容部位（ＳＡ）、及び第二のターゲティング配列（２）を含む。黒塗りボックスはコーディングＤＮＡを示し、点付きボックスは非翻訳配列を示す。図１２は、内因性遺伝子を活性化し増幅させるための、本発明の構築物の概略図である。図中、第一のエキソンはシグナルペプチドヒトGM-CSF遺伝子を付与し、この構築物は第一のターゲティング配列（１）、増幅可能なマーカー遺伝子（ＡＭ）、選択マーカー遺伝子（ＳＭ）、調節配列、ＣＡＰ部位、スプライス供与部位（ＳＤ）、及び第二のターゲティング配列（２）を含む。黒塗りボックスはコーディングＤＮＡを示し、点付きボックスは非翻訳配列を示す。図１３は、内因性遺伝子を活性化し増幅させるための、本発明の構築物の概略図である。図中、第一のエキソンはシグナルペプチドヒトG-CSF遺伝子を付与し、この構築物は第一のターゲティング配列（１）、増幅可能なマーカー遺伝子（ＡＭ）、選択マーカー遺伝子（ＳＭ）、調節配列、ＣＡＰ部位、スプライス供与部位（ＳＤ）、及び第二のターゲティング配列（２）を含む。黒塗りボックスはコーディングＤＮＡを示し、点付きボックスは非翻訳配列を示す。図１４は、内因性遺伝子を活性化し増幅させるための、本発明の構築物の概略図である。図中、第一のエキソンはノンコーディングヒトFSHβ遺伝子であり、この構築物は第一のターゲティング配列（１）、増幅可能なマーカー遺伝子（ＡＭ）、選択マーカー遺伝子（ＳＭ）、調節配列、ＣＡＰ部位、スプライス供与部位（ＳＤ）、及び第二のターゲティング配列（２）を含む。黒塗りボックスはコーディングＤＮＡを示し、点付きボックスは非翻訳配列を示す。発明の詳細な説明本発明は、(a)ターゲティング配列、(b)調節配列、(c)エキソン、及び(d)対になっていないスプライス供与部位を含むものであって、そのターゲティング配列は、成分(b)−(d)が内因性遺伝子と効果的に結合するように成分(a)−(d)の組み込みを指示するようなＤＮＡ構築物を、相同組換えによって細胞ゲノムの予め選ばれた部位に挿入することにより、興味を持たれている、細胞内の内因性遺伝子の調節又は活性化を変えることができる、という発見に基づくものである。もう一つの態様においては、ＤＮＡ構築物は、(a)ターゲティング配列、(b) 調節配列、(c)エキソン、(d)スプライス供与部位、(e)イントロン、及び(f)スプライス受容部位を含むものであって、ターゲティング配列は成分(b)−(f)が内因性の遺伝子の第一のエキソンと効果的に結合するように、成分(a)−(f)の組み込みを指示する。使用されるターゲティング配列は、ＤＮＡが挿入される部位に関して選択される。両態様において、ターゲティング事象は、新規の転写単位を創りだすために用いられ、それは、ターゲティングＤＮＡ構築物により導入される配列と内因性細胞内遺伝子の融合産物である。ここでは、例えば、新規の転写単位の形成は、本発明のＤＮＡ構築物を宿主細胞のゲノムＤＮＡへ導入することにより、転写がサイレントな遺伝子（トランスフェクトの前には発現しない遺伝子）を宿主細胞内で活性化させることについて述べる。また、採取された細胞内で発現する内因性遺伝子の発現を、増加させたり、減少させたり、消失させたりというように変化させること、又は、その方法や本発明のＤＮＡ構築物の使用により調節又は導入のパターンを変化させることについて述べる。上記の本発明は、真菌、植物、又は動物、例えば脊椎動物、とりわけ哺乳類、特にはヒト起源といった真核生物由来の細胞における遺伝子又はＤＮＡのターゲティングの方法に関する。即ち、本発明は相同組み換え又はＤＮＡのターゲティングによって、脊椎動物起源の一次細胞、二次細胞又は不死化細胞等の細胞へＤＮＡを導入する方法に関するものであり、それは細胞中のゲノムＤＮＡの予め選ばれた部位に導入される。とりわけ、内因性遺伝子の産物の転写及び／又は翻訳は、ターゲティング配列、調節配列、エキソン及びスプライス供与部位を含有してなるＤＮＡ構築物を用いて修飾される。本発明はさらに、本発明の方法により得られる相同組み換え細胞、及びその相同組み換え細胞の使用に関する。本発明はまた、脊椎動物起源の一次細胞、二次細胞又は不死化細胞に存在し、細胞中では通常発現しない遺伝子の活性を高める方法に関する。相同組み換え又はターゲティングは、受容細胞にて遺伝子の発現を引き起こす配列を、細胞のゲノムに導入するために用いられる。さらなる態様としては、ＤＮＡ構築物の導入を通して、細胞中の遺伝子の発現が高められるか、又は遺伝子の調節パターン又は誘導パターンが変化を受ける。その結果として、コード化産物は、対応する非トランスフェクト細胞よりも明らかに高レベルで発現される。本発明の方法及びＤＮＡ構築物は、トランスフェクト細胞における所望の産物の発現が、対応する非トランスフェクト細胞よりも少ないような細胞の生産にも有用である。即ち、トランスフェクト細胞においては、タンパク質（タンパク質でないものを含む）の生産は、得られたままの細胞より少量である。別の態様においては、所望の産物をコードする通常サイレントな遺伝子が、トランスフェクト一次細胞、二次細胞、又は不死化細胞中で活性化され、増幅される。この態様は、ゲノムＤＮＡとの相同組換えによって、通常は内因性遺伝子と機能的に無関係であって、かつ（１）該内因性遺伝子の位置またはその付近で宿主ゲノムに挿入されると、該内因性遺伝子の発現を変化（たとえば活性化）させる働きをするとともに、（２）該活性化内因性遺伝子の増幅の場となる細胞の選択を可能ならしめるＤＮＡ配列を導入する方法である。さらには、得られたままの細胞で通常発現される遺伝子の発現が高められ、その遺伝子が増幅される。以下、本発明のＤＮＡ構築物、それらを用いてのトランスフェクト細胞の生産方法、トランスフェクト細胞及びそれらの細胞の使用について説明する。ＤＮＡ構築物本発明のＤＮＡ構築物は少なくとも下記の成分を含むものである。すなわち、ターゲティング配列、調節配列、エキソン、および対になっていないスプライス供与部位を含む。本発明の構築物においては、エキソンは調節配列の３’側にあり、対になっていないスプライス供与部位はエキソンの３’側にある。また、対になっていないスプライス供与部位によってフランキングされているエキソンの前（５’側）に複数のエキソンおよび／またはイントロンが存在する場合もある。本明細書で説明するように、選択マーカーや増幅マーカーなどの構築物成分がさらに含まれることが多い。本発明の構築物におけるＤＮＡは外因性という。本明細書で使用する場合、「外因性」という用語は、たとえば本発明のＤＮＡ構築物を用いるなどして本発明の方法によって細胞に導入されるＤＮＡをいう。外因性ＤＮＡはトランスフェクト前の細胞内に存在する内因性ＤＮＡと同じ配列である場合もあれば、異なる場合もある。ターゲティング配列（単数または複数）ターゲティング配列は、対象遺伝子を含有する選ばれた細胞のゲノムへの正統相同組換えを可能ならしめるＤＮＡ配列である。一般に、ターゲティング配列は、得られる細胞のゲノム内に通常存在するＤＮＡ配列に対して相同性を示す（すなわち細胞ＤＮＡと同一であるか、ターゲティング配列と細胞ＤＮＡが相同組み換えを受けられるのに十分な程度に類似している）ＤＮＡ配列である（たとえば転写開始部位の上流側、対象遺伝子の転写停止部位の内部または下流側に位置するコード化ＤＮＡまたは非コード化ＤＮＡ、または修正前のゲノム内に存在する配列）。本発明で使用する１つまたは２つ以上のターゲティング配列は、本発明のＤＮＡ構築物におけるＤＮＡが挿入される部位を基準に選択される。１つまたは２つ以上のターゲティング配列を使用することができる。たとえば、環状のプラスミドまたはＤＮＡ断片は単一のターゲティング配列を用いるのが好ましい。直鎖状のプラスミドまたはＤＮＡ断片は２つのターゲティング配列を用いるのが好ましい。一つまたは２つ以上のターゲティング配列はそれぞれ独立して対象遺伝子内に存在していてよく（エキソンおよび／またはイントロンの配列など）、対象遺伝子に直接隣接していてもよく（すなわちターゲティング配列と対象遺伝子のコード化領域の間にさらに別のヌクレオチドが存在しない）、対象遺伝子の上流側に存在していてもよく（上流非コード化領域の配列や内因性プロモーター配列など）、遺伝子から距離を隔てて上流側に存在していてもよい（内因性プロモーターの上流側配列など）。１つまたは２つ以上のターゲティング配列は、公知または配列決定済みの被ターゲティング遺伝子の領域、および／または構造は未決定であるが制限酵素を用いるマッピングが可能であって当該分野に熟練せる者であれば配列決定可能なさらに上流側の領域を含んでいてもよい。本明細書で説明するように、異なる遺伝子から単離された調節配列、をジーンターゲティングを利用して挿入することができる。異なる細胞ソースおよび／またはウイルスソースから単離された成分を組み合わせた調節配列、又は遺伝子工学技術によって新規調節配列として合成された調節配列を、内因性細胞遺伝子の中に挿入したり、直接隣接する位置に挿入したり、上流側に挿入したり、実質的に距離を隔てて挿入することができる。そのような挿入に代えるか付け加えるかたちで、産生ＲＮＡまたはタンパク質の構造や安定性に影響を及ぼす配列をターゲティングによって置換、除去、付加、その他の方法で修正させることができる。たとえば、ＲＮＡ分子のＲＮＡ安定性要素、スプライス部位、および／またはリーダー配列に変化を加えて、ＲＮＡ分子の機能、安定性、および／または翻訳性を向上または変化させることができる。タンパク質の輸送性、分泌性、または機能性を強化または変化させるために、シグナル配列、プロペプチド配列、活性部位、および／または構造配列などのタンパク質配列を変化させることもできる。本発明の方法によれば、外因性ＤＮＡを導入することで、遺伝子の通常発現特性および／またはタンパク質またはＲＮＡの構造特性が変化する。調節配列本発明のＤＮＡ構築物の調節配列は、１つまたは２つ以上のプロモーター（構成性プロモーターや誘導プロモーターなど）、エンハンサー、骨格付着領域(sca ffold-attachment regions)またはマトリックス付着部位、負の調節要素、転写因子結合部位、またはこれらの配列を組み合わせたものから成っていてよい。調節配列は誘導プロモーターを含有していてもよく、その結果、生じた細胞または個体に導入された細胞はそのままでは産物を発現しないが、産物発現を誘導できる（すなわち、トランスフェクトされた細胞が生じた後から発現が誘導されるが、それは移植の前または後である）ものであってよい。当然ながら、目的の産物をコードするＤＮＡは、導入（構成性プロモーターの支配下で）されたときに発現されるように細胞に導入することができる。調節配列は細胞ゲノムまたはウイルスゲノムから単離することができる（そのような調節配列としては、ＳＶ４０早期遺伝子や後期遺伝子、アデノウイルス主要後期遺伝子、マウスメタロチオネイン−Ｉ遺伝子、伸張因子−１α遺伝子、サイトメガロウイルス遺伝子、コラーゲン遺伝子、アクチン遺伝子、免疫グロブリン遺伝子、またはＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子の発現を調節するものなどが挙げられる）。調節配列は、ＴＡＴＡボックス結合部位、ＣＣＡＡＴボックス結合部位、ＡＰ１結合部位、Ｓｐ１結合部位、またはＮＦ−κＢ結合部位などの転写因子結合部位を含有していることが好ましい。その他のＤＮＡ構築物要素本発明のＤＮＡ構築物はさらに１つまたは２つ以上のエキソンを含むものである。本明細書で使用する場合、エキソンという用語は、ＲＮＡにコピーされて成熟ｍＲＮＡ分子中に存在するＤＮＡ配列をいう。エキソンは、１つまたは２つ以上のアミノ酸をコードするか１つのアミノ酸の一部（すなわちコドンの１つまたは２つの塩基）をコードするか両者をコードするＤＮＡを含むものであってよい。あるいは、エキソンは、５’非コード化領域に対応するＤＮＡを含むこともある。１つまたは２つ以上の外因性エキソンが１つまたは２つ以上のアミノ酸および／または１つのアミノ酸の一部をコードする場合、本発明のＤＮＡ構築物は、転写とスプライシングを受けたときに読み取り枠が被ターゲティング遺伝子（ta rgeted gene）の第二のエキソンまたはコード化領域とイン・フレーム（in-fram e）であるように設計される。本明細書で使用する場合、イン・フレームという用語は、第一のエキソンおよび第二のエキソンのコード化配列を融合させたとき、第二のエキソンに由来するｍＲＮＡの部分の正しい読み取り枠を変化させないように互いのヌクレオチドが連結されることをいう。ターゲット遺伝子の第一のエキソンが翻訳開始配列ＡＴＧを含んでいる場合、本発明の構築物の外因性エキソンは、被ターゲティング遺伝子の２番目以後のエキソンを含むｍＲＮＡの生成コード化領域がイン・フレームであるように、ＡＴＧおよび必要に応じて１つまたは２つ以上のヌクレオチドを含有することが好ましい。第一のエキソンがＡＴＧを含む上記被ターゲティング遺伝子の具体例としては、ｈＥＰＯ、ｈＧＨ、ヒトコロニー刺激因子−顆粒球／マクロファージ（ｈＧＭ−ＣＳＦ）、およびヒトコロニー刺激因子−顆粒球（ｈＧ−ＣＳＦ）などが挙げられる。スプライス供与部位は１つのエキソンから別のエキソンへのスプライシングを指示する配列である。通常、第一のエキソンは第二のエキソンの５’に存在し、第一のエキソンの３’側にオーバーラップしてフランキングしているスプライス供与部位が、第二のエキソンの５’側で第二のエキソンをフランキングしているスプライス受容部位を認識する。スプライス供与部位は、式（Ａ／Ｃ）ＡＧＧＵＲＡＧＵ（式中、Ｒはプリンヌクレオチドを表す）で示される特有のコンセンサス配列を有し、第４位と５位にＧＵが必要である［ジャクソン（Jackson，I.J ．）、Nucleic Acids Research 19:3715-3798(1991)］。スプライス供与コンセンサス部位の最初の３つの塩基は、エキソンの最後の３つの塩基である。スプライス供与部位は、ｍＲＮＡスプライシング経路内で正しい反応を進める能力によってその機能が決まる。本明細書で使用する場合、対になっていない（unpaired）スプライス供与部位という用語は、ターゲティング構築物内に存在するが構築物内の対になっていないスプライス供与部位の３’側にスプライス受容部位を伴わないスプライス供与部位をいう。対になっていないスプライス供与部位があると、内因性スプライス受容部位へのスプライシングが起きる。スプライス供与部位と同様にスプライス受容部位も１つのエキソンから別のエキソンへのスプライシングを指示する配列である。スプライシング装置(apparat us)はスプライス供与部位と協力的に作用して、スプライス受容部位を利用してイントロンの除去を進める。スプライス受容部位は式ＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹ−ＮＹＡＧ（式中、Ｙはピリミジンを表し、Ｎは任意のヌクレオチドを表す）で示される特有の配列を有する［ジャクソン（Jackson，I.J．）、Nucleic Acids Rese arch 19:3715-3798(1991)］。「イントロン」という用語は、２つのエキソンの間に存在する、ｍＲＮＡ分子の形成に際しスプライシングによって前駆体ＲＮＡ分子から除去される１つまたは２つ以上のヌクレオチドの配列をいう。たとえば、調節配列は翻訳開始コドンＡＴＧに効果的に（operatively）連結される。また、ＣＡＰ部位（調節配列と関連があって調節配列によって利用される特異的ｍＲＮＡ開始部位）を調節配列とＡＴＧ開始コドンに効果的に連結させてもよい。あるいは、調節配列と関連があって調節配列によって利用されるＣＡＰ部位をターゲティング構築物に含ませずに、転写装置で新規ＣＡＰ部位を決定する場合もある。ほとんどの遺伝子では、ＣＡＰ部位はＴＡＴＡボックスの３’ 側約２５ヌクレオチドの位置に存在するのが普通である。１つの態様においては、スプライス供与部位はたとえば、外因性エキソンが被ターゲティング遺伝子の第二のエキソンとイン・フレームとなるのに１つまたは２つ以上のヌクレオチドの存在が不要な場合、ＡＴＧに直接隣接する位置に置かれる。被ターゲティング遺伝子のコード化配列とイン・フレームである１つまたは２つ以上のアミノ酸または１つのアミノ酸の一部をコードするＤＮＡは、３ ’側でＡＴＧに直接隣接する位置に置かれることが好ましい。上記態様においては、スプライス供与部位はコード化ＤＮＡに直接隣接する３’側の位置に置かれる。効果的に連結される、または機能的に配置される、という用語は、ＣＡＰ部位（ターゲティング構築物に含まれていてよい）で始まる一次ＲＮＡ転写物であってターゲティング構築物のエキソンとスプライス供与部位に対応する配列、内因性遺伝子の調節領域の上流側にあるＤＮＡ（存在する場合に限る）、内因性遺伝子の調節領域（存在する場合に限る）、内因性遺伝子の５’非転写領域（存在する場合に限る）、および内因性遺伝子のエキソンとイントロン（存在する場合に限る）などによって例示される一次ＲＮＡ転写物の生成が調節要素によって進められるような、外因性調節配列、エキソン、スプライス供与部位、および必要に応じて配列およびスプライス受容部位が内因性遺伝子に対して正しい位置にターゲティングされる配置をいう。効果的に連結された配置においては、ターゲティング構築物のスプライス供与部位が完全にスプライスされた成熟転写物から目的タンパク質が生成できるようなスプライシング事象を、内因性遺伝子のエキソンのうちの１つをフランキングするスプライス受容部位に対して引き起こす。１つの態様においては、スプライス受容部位は、スプライシング事象がたとえば内因性遺伝子の内因性エキソンに対して進められるような内因性のものである。スプライス受容部位がターゲティング構築物に含まれている別の態様においては、ターゲティング構築物によって導入されたイントロンはスプライシング事象で除去される。本発明で使用するコード化ＤＮＡ（たとえばターゲティング構築物の第一エキソン内にあるもの）は、内因性タンパク質のものと同じ１つまたは２つ以上のアミノ酸および／または１つのアミノ酸の一部をコードしてもよい。本発明で使用するコード化ＤＮＡ配列はたとえば対象遺伝子の第一エキソンに対応するものであってよい。コード化ＤＮＡはまた、対象タンパク質の第一エキソンとは異なる１つまたは２つ以上のアミノ酸または１つのアミノ酸の一部をコードするものであってよい。上記態様は、対象タンパク質の第一エキソンのアミノ酸がそのタンパク質の１つまたは２つ以上の活性にとって重要でない場合に、とくに興味深い。たとえば、内因性ｈＥＰＯ遺伝子への融合体を構築する場合、ｈＧＨの第一エキソンをコードする配列を使用することができる。この例では、ｈＧＨ第一エキソンからｈＥＰＯ第二エキソンへの融合によって、機能性ハイブリッドシグナルペプチドが生成する。関連構築物においては、コードされたアミノ酸がハイブリッドシグナルペプチドの機能を阻害しないようなヒトまたはヒト以外の動物のエキソンを使用することができる。関連する態様においては、この手法を用いてターゲット遺伝子内に見つかった突然変異を修復することもできる。目的の産物がターゲティング構築物中の内因性タンパク質とコード化配列の融合タンパク質である場合、本発明の方法によって細胞に組み込まれる外因性コード化ＤＮＡとしては、１つまたは２つ以上のエキソンをコードするＤＮＡ、または内因性被ターゲティング遺伝子の産物に融合させる翻訳産物または転写産物に対応するｃＤＮＡの配列をコードするＤＮＡなどが挙げられる。この態様においては、ターゲティングを利用して、２つまたは３つ以上のタンパク質に由来する構造特性、酵素特性、またはリガンドまたは受容体結合特性を合わせ持つキメラタンパク質または多機能タンパク質を１つのポリペプチドとして作成する。たとえば、外因性ＤＮＡは、被ターゲティングタンパク質の膜アンカー、または細胞分泌性、リーダー配列、酵素領域、貫膜ドメイン領域、コファクター結合領域、その他の機能性領域を付与または改善するシグナルペプチドをコードすることができる。通常は分泌されないがシグナルタンパク質と融合させることで分泌を引き起こすことが可能なタンパク質の例としては、ドーパーデカルボキシラーゼ、転写調節タンパク質、α− ガラクトシダーゼ、およびチロシンヒドロキシラーゼなどが挙げられる。被ターゲティング遺伝子の第一エキソンが非コード化領域（たとえばろ胞刺激ホルモンベータ（ＦＳＨβ）遺伝子の第一エキソン、である場合、外因性ＡＴＧは不要であり、これを除去することが好ましい。本発明の構築物のＤＮＡはそのＤＮＡを天然に含有するソースから得ることができるが、遺伝子工学技術や合成プロセスを用いて製造することもできる。被ターゲティング遺伝子とその産物本発明のＤＮＡ構築物を一次細胞、二次細胞、または不死化細胞などの細胞にトランスフェクトさせると、たとえばタンパク質またはＲＮＡの活性部分や機能性部分などの目的産物の発現を制御することができる。目的産物の例としては、ホルモン、サイトカイン、抗原、抗体、酵素、凝固因子、輸送タンパク質、受容体、調節タンパク質、構造タンパク質、転写因子、アンチセンスＲＮＡ、またはリボザイムなどが挙げられる。さらに、該産物は天然に存在しないタンパク質や核酸（すなわち融合タンパク質や融合核酸）であってもよい。本明細書で説明する方法は、エリスロポエチン、カルシトニン、成長ホルモン、インスリン、インスリノトロピン、インスリン様成長因子類、副甲状腺ホルモン、インターフェロンβ、及びインターフェロンβ、神経成長因子類、ＦＳＨβ 、ＴＧＦ−β、腫瘍壊死因子、グルカゴン、骨成長因子２、骨成長因子７、ＴＳＨ−β、インターロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン６、インターロイキン１１、インターロイキン１２、ＣＳＦ−顆粒球、ＣＳＦ−マクロファージ、ＣＳＦ−顆粒球／マクロファージ、免疫グロブリン類、触媒性抗体類、プロテインキナーゼＣ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ウロキナーゼ、アンチトロンビンＩＩＩ、ＤＮアーゼ、α−ガラクトシダーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、血液凝固因子Ｖ、血液凝固因子ＶＩＩ、血液凝固因子ＶＩＩＩ、血液凝固因子ＩＸ、血液凝固因子Ｘ、血液凝固因子ＸＩＩＩ、アポリポプロテインＥまたはアポリポプロテインＡ−Ｉ、グロビン類、低密度リポプロテイン受容体、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−２アンタゴニスト類、アルファ−１アンチトリプシン、免疫応答修飾因子類、および可溶性ＣＤ４などから選ばれた１つまたは２つ以上の治療目的産物を製造することができる。選択マーカー及び増幅ターゲティング事象は、一以上の選択マーカー遺伝子を用いることにより容易に確認できる。これらのマーカーは、ターゲティング構築物に含有させたり、別の構築物上に存在させることができる。選択マーカーは、ポジティブ選択可能なものとネガティブ選択可能なもの（換言すれば、ポジティブ選択のためのマーカーまたはネガティブ選択のためのマーカー）の２つの範疇に分けることができる。ポジティブ選択においては、ポジティブ選択マーカーを発現する細胞は選択物質（ｎｅｏ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、ｄｈｆｒ、アデノシンデアミナーゼ（ａｄａ）、ピューロマイシン（ｐａｃ）、ハイグロマイシン（ｈｙｇ）、カルバモイルリン酸シンターゼ、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、及びジヒドロオロターゼをコードするＣＡＤ、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、マルチドラッグレジスタンス１（ｍｄｒ１）、及びヒスチジンＤ（ｈｉｓＤ）など）による処理に耐えることができ、そして宿主細胞ゲノムに組み込まれたターゲッティング構築物が内部にある細胞の選択が行われる。ネガティブ選択においては、ネガティブ選択マーカーを発現する細胞は選択物質の存在下で破壊される。ターゲティング事象は、ネガティブ選択の性質を示す一以上の選択マーカー遺伝子を用いることにより容易に確認でき、ネガティブ選択可能なマーカーは外因性ＤＮＡと結合しているが、ネガティブ選択可能なマーカーがターゲティング配列と隣接するように、かつ宿主細胞ゲノム内の配列との正しい相同組み換え事象によって、がネガティブ選択可能なマーカーが安定して組み込まれないように形成される（マンサー（Mansour）S.L.ら、Natur e 336、348-352(1988)）。この目的に有用なマーカーとしては、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（TK）遺伝子又は細菌のgpt遺伝子が挙げられる。様々な選択マーカーを一次、二次、または不死化細胞に組み込むことができる。たとえば、薬剤耐性、原栄養性、細胞毒性物質耐性、または表面タンパク質の発現などの選択可能表現型を付与する選択マーカーを用いることができる。用いることのできる選択マーカー遺伝子としては、ｎｅｏ、ｇｐｔ、ｄｈｆｒ−ａｄａ−ｐａｃ、ｈｙｇ、ＣＡＤ、ＧＳ、ｍｄｒｌ、およびｈｉｓＤなどが挙げられる。付与された選択可能表現型は、レシピエントの細胞の同定と単離を可能にする。選択マーカー（例えば、ａｄａ、ＧＳ、ｄｈｆｒおよび多機能的ＣＡＤ遺伝子）をコードする増幅可能な遺伝子は、ゲノム中に挿入された選択マーカーの増幅されたコピーを含有する細胞の選択を可能にするというもう一つの特徴を有する。この特徴は、増幅が望まれる隣接の遺伝子または連結している遺伝子のコピー数を顕著に増やすための機構を提供する。これらの配列の選択性が改善された変異型や、他の増幅可能な配列も使用できる。ＤＮＡ構築物中の成分の順序は変更することができる。該構築物が環状プラスミドの場合、得られる構築物中の成分の順序は、ターゲティング配列−プラスミドＤＮＡ（微生物又は他の適当な宿主中のターゲティングプラスミドの選択及び／又は複製に用いられる配列を含有してなる）−単数又は複数の選択マーカー− 調節配列、エキソン−スプライス供与部位、である。好ましくは、受容細胞への導入の前に、ターゲティング配列及び外因性ＤＮＡ成分を含有するプラスミドを、そのターゲティング配列内を一回又は二回以上切断する制限酵素で切断し、本明細書に記載されているようにフリーのＤＮＡ末端が所望の相同組み換え事象の頻度を高めるような、直鎖状又は切れ目のある（gapped）分子を創りだす。さらに、そのフリーのＤＮＡ末端はエキソヌクレアーゼで処理され、５’又は３’が突出した一本鎖ＤＮＡ末端を創り出し、所望の相同組み換え事象の頻度を高める。本態様においては、ターゲティング配列と細胞の標的間の相同組み換えは、導入されたプラスミド内に含まれる成分にとなり合った、ターゲティング配列の複製物を二つ生じさせる。構築物が直鎖状である場合、その順序は、例えば、第一のターゲティング配列 −選択マーカー−調節配列−エキソン−スプライス供与部位−第二のターゲティング配列、又はその代替物としての第一のターゲティング配列−調節配列−エキソン−スプライス供与部位−選択マーカーコードＤＮＡ−第二のターゲティング配列、である。その構築物が安定的に組み込まれた細胞は、選択薬剤処理によっても生存し、安定したトランスフェクト細胞の部分集合（subset）は相同組み換え細胞であろう。相同組み換え細胞は、ＰＣＲ、サザンハイブリダイゼーション、表現型によるスクリーニングといった種々の方法により確認することができる。また別の態様としては、その構築物の順序は、第一のターゲティング配列−選択マーカー−調節配列−エキソン−スプライス供与部位−イントロン−スプライス受容部位−第二のターゲティング配列である。さらに、ＤＮＡ構築物中の成分の順序は、例えば、第一のターゲティング配列 −選択マーカー１−調節配列−エキソン−スプライス供与部位−第二のターゲティング配列−選択マーカー２、又はその代替物として第一のターゲティング配列 −調節配列−エキソン−スプライス供与部位−選択マーカー１−第二のターゲティング配列− 選択マーカー２、である。本態様においては、選択マーカ−２はネガティブ選択性を示す。すなわち、選択マーカー２の遺伝子産物は、選択マーカー２を発現する細胞を殺す物質（通常は薬物または代謝類似体）を含有する適当な培地処方における成長に対して選択することができる。選択マーカー１をフランキングするターゲティング配列と宿主細胞ゲノム中の相同配列の組換えは、選択マーカー１のターゲティング組み込み(targeted integration)をもたらすが、選択マーカー２は組み込まれない。このような組換え事象は、選択マーカー１を安定的にトランスフェクトされているが選択マーカー２は安定的にトランスフェクトされていない細胞を生じるが、このような細胞は、選択マーカー１の選択を許す選択物質と選択マーカー２の選択を阻害する選択物質を含有する培地における成長を基準として選択することができる。ＤＮＡ構築物はポジティブ選択マーカーをも含むことができる。これにより、当該マーカーの増幅されたコピーを含む細胞の選択が可能となる。このようなマーカーを増幅させると、フランキングＤＮＡ配列の同時増幅が達成される。本態様において、構築物成分の順序は、例えば第一のターゲティング配列−増幅可能なポジティブ選択マーカー−第二の選択マーカー（任意的）−調節配列−エキソン−スプライス供与部位−第二のターゲティングＤＮＡ配列である。本態様においては、適当な選択薬剤の存在下で細胞を培養することによって選択マーカー遺伝子増幅コピー含有細胞を選択することができるような性質を有する選択マーカー遺伝子を含有させることによって、該活性化遺伝子をさらに増幅させることができる。活性化内因性遺伝子は、増幅された選択マーカー遺伝子と互いにつながりあう。活性化内因性遺伝子のコピーを多く含有する細胞は、所望のタンパク質を高レベルで産生することができ、イン・ビトロでのタンパク質製造と遺伝子治療に有用である。いずれの態様においても、選択マーカー遺伝子及び増幅性マーカー遺伝子は、互いに直接隣接して存在する必要はない。また、該ＤＮＡ構築物は、細菌の複製開始点および細菌の抗生物質耐性マーカー又は他の選択マーカーを含んでいてもよく、かかるマーカーは細菌中における大規模プラスミド増殖又は他の好ましいクローニング／宿主系を可能にするものである。プロモーターおよびスプライスジャンクションなどの追加配列とともに、選択マーカーをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を用いて、トランスフェクト細胞に選択可能表現型を付与することができる（たとえばプラスミドｐｃＤＮＥＯ、図４に概略図を示す）。このようなＤＮＡ構築物は、本明細書で説明する方法を用いてターゲティングＤＮＡ配列と共に一次または二次細胞に同時トランスフェクションすることができる。トランスフェクション及び相同組み換え本発明の方法によれば、構築物は、単一のＤＮＡ構築物として、又は染色体又は核ＤＮＡに組み込まれるようになる、分離したＤＮＡ配列として、一次細胞、二次細胞又は不死化細胞等の細胞に導入される。ターゲティング配列、調節配列、エキソン、スプライス供与部位及び単数又は複数の選択マーカー遺伝子を含む、単一のＤＮＡ構築物上の、又は分離した構築物上のターゲティングＤＮＡ構築物は、細胞に導入することができる。ＤＮＡ構築物全体の長さは、成分（例えば、ターゲティング配列、調節配列、エキソン、選択マーカー遺伝子、及び他の成分）の数とそれぞれの長さにより変わる。構築物の全長は、一般的には、少なくとも約２００ヌクレオチドであろう。さらに、ＤＮＡは、直鎖状、二本鎖（末端の片方又は両方が一本鎖領域である、又はない）、一本鎖、又は環状で導入することができる。本発明で開示されたいずれの構築物のタイプも、それから細胞に導入され、トランスフェクト細胞を得る。トランスフェクト細胞は、公知の方法（カペッチ（ Capecchi）、M.R.、Science 244、1288-1292(1989)）のように、相同組み換えが起こる条件下で維持される。ＤＮＡの転写に十分適した条件下で相同組み換え細胞が維持される場合、プロモーターとして、ターゲット構築物により導入された調節配列は転写を活性化させる。ＤＮＡ構築物は、種々の物理的又は化学的な方法により細胞に導入することができる。例えば、エレクトロポーレーション法、マイクロインジェクション法、マイクロプロジェクタイル衝撃法、リン酸カルシウム共沈殿法、及びリポソーム −、ポリブレン−又はＤＥＡＥデキストラン−媒介トランスフェクション法等が挙げられる。また、レトロウイルスベクター、ヘルペルベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルス関連ベクター、おたふくかぜベクター、及びポリオウイルスベクター等の感染性ベクターは、ＤＮＡの導入に使用することができる。所望により、２以上の分離したＤＮＡ断片の状態で、ターゲティングＤＮＡを細胞内に導入することができる。二つの断片を用いた場合、その二断片は、一方は第一のターゲティング配列を、他方は第二のターゲティング配列を有し、一方の断片の３’末端、及び他方の５’末端においてＤＮＡ配列の相同性（重なり）を共有する。細胞への導入の際、この二断片に相同組み換えが起こり、第一のターゲティング配列と第二のターゲティング配列が二つの元々の断片間にある重なり領域に隣接する、単一の断片が形成される。産物である断片は次いで、細胞内の標的配列を用いての相同組み換えに適した形にされる。二以上の断片を用いることが可能であり、上記に記載のように、それらが互いに相同組み換えを経て、細胞内の標的配列を持ち手の相同組み換えに適した産物を最終的に形成するように設計される。相同組み換え細胞ターゲティング事象の結果、ターゲティング構築物の調節配列の挿入が生じ、（例えば、プロモーター又はエンハンサーのいずれかが又は両方が、内因性遺伝子又は調節領域の上流に挿入されることにより）内因性遺伝子がそれらのコントロール下に置かれる。所望により、ターゲティング事象は、組織−特異的ネガティブ調節成分の欠失等の内因性の調節成分の欠失を同時に生じさせる。ターゲティング事象は、実際に存在する成分を置換することができる。例えば、組織−特異的エンハンサーを、細胞の型の特異性が自然の成分よりも広い又は異なるエンハンサーと、又は対応する非トランスフェクト細胞とは調節のパターン又は誘導のパターンが異なるエンハンサーと置換することができる。本態様においては、自然の配列は欠失し、新たな配列が付加される。また、ターゲティング事象により内因性調節成分は除去又は置換されないか、外因性配列を内因性の調節成分内にターゲティングすることにより、分裂させられたり無能力化される。公知の方法（カペッチ（Capecchi）、M.R.、Science 244、1288-1292(1989)）のように、ＤＮＡが細胞に導入された後、ゲノムＤＮＡと導入されたＤＮＡの一部の間で起こる相同組み換えに適した条件下でその細胞は維持される。ゲノムＤＮＡと導入されたＤＮＡとの間での相同組み換えにより、真菌、植物又は動物、そして特にヒト又は他の哺乳類の一次細胞、二次細胞又は不死化細胞等の相同組み換え細胞が生じる。該細胞中では、産物をコードする、発現による新規の転写単位を創りだす、及び／又は内因性遺伝子のポテンシャル(potential )と異なるポテンシャルをコードする内因性遺伝子の発現に変化を与える配列が内因性遺伝子と効果的に結合している。特に本発明では、相同組み換え細胞は調節配列及びエキソンを含有してなるものであり、それらはスプライス供与部位に隣接されている。そしてそれらはターゲティングＤＮＡ構築物により、予め決定された部位に導入され、内因性遺伝子の第二エキソンと効果的に結合している。所望により、内因性遺伝子のいかなるエキソンと効果的に結合している、多数の外因性エキソン（コードしているもの又はしていないもの）及びイントロンも挙げられる。生成する相同組み換え細胞は、もし適当であれば、増幅可能なマーカーと新規の転写単位をコードするＤＮＡの増幅用に選ばれた条件下で培養される。増幅の有無にかかわらず、この方法により得られる細胞を、タンパク質の発現に適した、当該分野で公知の条件下で培養することができる。それにより、イン・ビトロでのタンパク質、又は細胞の生産を、治療目的のタンパク質のイン・ビボでの送達（即ち、遺伝子治療）に用いることができる。本明細書で使用する場合、一次細胞という用語は、脊椎動物組織ソースから単離した（平板培養する前、すなわち皿やフラスコなどの組織培養容器に付着させる前に）細胞の懸濁液中に存在する細胞、組織から得た外植片中に存在する細胞、両者の一次平板培養された前タイプの細胞、およびこれら平板培養された細胞から得た細胞懸濁液を包含する。二次細胞または二次細胞株という用語は、培養中のその後のすべての段階の細胞をいう。すなわち、最初に一次平板細胞を培養容器から取り出し、再び平板培養（継代）したとき、本明細書中ではこれをその後の継代におけるすべての細胞とともに二次細胞と呼ぶ。二次細胞は、１回以上継代された二次細胞より成る細胞株である。細胞株は、１）１回以上継代され、２）培養中に有限回数の平均集団二倍化を示し、３）接触によって阻害される足場依存性増殖の性質を示し（足場依存性は懸濁培養で増殖される細胞には適用されない）、しかも４）不死化されない二次細胞から成る。不死化細胞は細胞系（一次細胞及び二次細胞のための用語である「株」を付した細胞株という用語に対する）であり、その決定的な特徴は、培養の際に明らかに寿命の制限がないことである。本発明の方法によって選択される細胞は４つのタイプまたは範疇に分けることができる。すなわち、１）タンパク質又は産物（その細胞内では通常発現しないタンパク質又は天然には通常見られない融合タンパク質など）を産生したり含有したりしない、採取したままの（as obtained）細胞、２）タンパク質又は産物を産生するか含有するが、その量が所望量ではない量（採取したままでは生理的に正常な下限より少ない量など）である細胞、３）採取したままでは、生理的に正常なレベルでタンパク質又は産物を産生するがその含有量または産生量を増大または強化すべき細胞、および４）タンパク質をコードする遺伝子の制御または誘導のパターンを変えることが望まれる細胞である。本発明の方法によってトランスフェクトを受けさせる一次細胞、二次細胞及び不死化細胞は様々な組織から得ることができ、培養状態で維持することができるすべての細胞型を含む。たとえば、本発明の方法によってトランスフェクトを受けさせることができる一次および二次細胞としては、線維芽細胞、ケラチン細胞、上皮細胞（たとえば乳房上皮細胞、腸上皮細胞）、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、血液細胞成分（たとえばリンパ球、骨髄細胞）、筋肉細胞、およびこれらの型の体細胞の前駆体などが挙げられる。相同組み換え細胞を遺伝子治療に用いる場合、一次細胞はトランスフェクト一次または二次細胞を投与される個体から得るのが好ましいが、一次細胞は、同種のドナー（レシピエント以外）から得てもよい。相同組み換え不死化細胞も本発明の方法によって得ることができ、タンパク質製造または遺伝子治療に用いることができる。本発明の方法によるタンパク質製造または遺伝子治療に有用な不死化ヒト細胞系の例としては、ＨＴ１０８０細胞 (ATCC CCL 121)、ＨｅＬａ細胞及びその派生細胞(ATCC CCL 2,2.1及び2.2)、ＭＣＦ−７乳癌細胞(ATCC BTH 22)、Ｋ−５６２白血病細胞(ATCC CCL 243)、ＫＢ癌腫細胞(ATCC CCL 17)、２７８０ＡＤ卵巣癌細胞（ファンデルブリック(Van de r Blick,A.M.)ら、Cancer Res,48:5927-5932(1988)）、Ｒａｊｉ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ８６）、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣＴＩＢ１５２）、Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１４３２）、ＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ２４０）、Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ２１３）、ＲＰＭＩ８２２６細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１５５）、U-937細胞(ATCCCRL 1593)、ボウズメラノーマ(Bowe s Melanoma)細胞(ATCC CRL 9607)、WI-38VA13 サブライン2R4 細胞(ATCC CLL 75 .1)、およびＭＯＬＴ−４細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８２）などが挙げられるが、これらに限定されない。さらには、ヒト細胞と他の種の細胞の融合により得られるヘテロハイブリドーマ細胞も挙げられる。WI-38(ATCC CCL 75)及びMRC- 5(ATCC CCL 171)等のヒト線維芽二次細胞株も用いることができる。さらに、ヒトの一次細胞、二次細胞又は不死化細胞は、イン・ビトロで遺伝子増幅の性質を示す他の種由来の一次細胞、二次細胞又は不死化細胞と同様、イン・ビトロのタンパク質製造または遺伝子治療に使用することができる。遺伝子をｃＤＮＡコピーに変換する方法本発明はまた、相同組み換えを利用して遺伝子をｃＤＮＡコピー（イントロン欠損遺伝子コピー）に変換する方法に関する。ｃＤＮＡコピーは、イン・ビトロにおけるタンパク質製造のための酵母または細菌に導入することができる。また、ｃＤＮＡコピーは、イン・ビトロまたはイン・ビボにおけるタンパク質製造のための哺乳類細胞に挿入することもできる。ｃＤＮＡを微生物細胞に導入しようとする場合、ターゲティング配列を含有する２つのＤＮＡ構築物の一方を治療目的タンパク質をコードするヒト遺伝子の上流側に、他方を下流側に相同組み換えによって導入する。たとえば、上流側に導入される配列としては、成熟プロセシング済みタンパク質の第一位アミノ酸をコードするＤＮＡの位置またはその下流側にあるゲノムＤＮＡ配列に対して相同なＤＮＡ配列、レトロウイルス長期リピート配列（ＬＴＲ）、微生物細胞内の選択用マーカーをコードする配列、微生物細胞内で機能する調節要素、およびスプライス供与部位を有する微生物細胞からの分泌を促進するリーダーペプチドをコードするＤＮＡなどが挙げられる。上流側に導入される配列は、成熟プロセシング済み治療目的タンパク質の第一位アミノ酸をコードするゲノムＤＮＡの付近の上流側に導入される。下流側に導入される配列としては、成熟プロセシング済みタンパク質の最終位アミノ酸をコードするＤＮＡの位置またはその下流側にあるゲノムＤＮＡ配列に対して相同なＤＮＡ配列、微生物転写終止配列、微生物細胞におけるＤＮＡ複製を引き起こす能力を有する配列、およびレトロウイルスＬＴＲなどが挙げられる。下流側に導入される配列は、成熟プロセシング済み治療目的タンパク質の終止コドンをコードするＤＮＡと隣接する下流側に導入される。上記２つのＤＮＡ構築物を細胞に導入した後、得られた細胞を導入ＤＮＡとゲノムＤＮＡの間の相同組み換えに適した条件下に保つことで、相同組み換え細胞を製造する。また、上記ＤＮＡ構築物の一方または両方がＤＮＡ構築物含有細胞の正または負の選択のための１つまたは２つ以上のマーカーをコードするものであってよく、上記ＤＮＡ構築物の一方または両方が細胞に導入された後で本発明の方法にさらに選択工程を加えることができる。あるいは、微生物細胞内の選択用マーカーをコードする配列、および微生物細胞におけるＤＮＡ複製を引き起こす能力を有する配列の両者が上流側または下流側ターゲティング構築物の中に存在していてもよいし、微生物細胞内の選択用マーカーが下流側ターゲティング構築物の中に存在して、微生物細胞内でＤＮＡ複製を引き起こす能力を有する配列が上流側ターゲティング構築物の中に存在していてもよい。次いで、相同組み換え細胞を、治療目的タンパク質をコードする遺伝子のＲＮＡ産物のＬＴＲ指向性（directed）転写、プロセシング、および逆転写に適した条件下で培養する。逆転写産物は、治療目的タンパク質をコードするイントロンレスＤＮＡコピーから成るＤＮＡ構築物であって、上記２つの外因性ＤＮＡ構築物から成るＤＮＡ配列が効果的に連結したものである。次いで、本発明の方法によって製造されたイントロンレスＤＮＡ構築物を微生物細胞に導入する。次いで、その微生物細胞を治療目的タンパク質の発現と分泌に適した条件下で培養する。イン・ビボにおけるタンパク質の製造本発明の相同組み換え細胞は、相同組み換え細胞系の集団、相同組み換え一次または二次細胞の集団、相同組み換えクローン細胞株若しくは系、相同組み換え不均一細胞株若しくは系、および上記４つの相同組み換え細胞の範疇のうちの１つのもののに属する少なくとも１つの代表的細胞を含む細胞混合物として有用である。上記細胞は、１）治療目的のタンパク質（たとえば個体内に存在しないか、個体の生理的要求度より産生量が少ないか、不完全であるか、利用が不十分または不適当であるタンパク質や酵素機能や輸送機能などの新規機能を有するタンパク質）または２）治療目的の核酸（たとえば遺伝子発現を阻害したり、それ自体が酵素活性を有するＲＮＡ）のいずれかである治療目的産物の送達に反応する異常状態または好ましくない状態を有する個体を治療するための送達系に用いることができる。治療目的のタンパク質または核酸を提供する本発明の方法においては、相同組み換え一次細胞、クローン細胞株または不均一細胞株を、異常状態または好ましくない状態を治療または予防しようとする個体に対して、該タンパク質または外因性ＤＮＡを生理的に有効なレベルで発現させるか利用可能ならしめるのに十分な量とそれに適した経路で投与する。生理的に有効なレベルとは、産物の生体内の正常産生レベルに近いか、異常状態または好ましくない状態の改善をもたらすレベルをいう。本発明の１つの態様によれば、投与する相同組み換え不死化細胞系は、１つまたは２つ以上の半透性関門デバイス(barrier devices)に封入することができる。該デバイスの透過性は、動物に移植された細胞がデバイスから離脱するのを防止するとともに、治療目的産物が自由に透過できて関門デバイスを離脱してインプラント周囲の局所空間に入るか全身循環に入ることができる程度のものである。たとえば、ｈＧＨ、ｈＥＰＯ、ヒトインスリノトロピン、ｈＧＭ−ＣＳＦ、ｈＧ−ＣＳＦ、ヒトα−インターフェロン、またはヒトＦＳＨβを治療効果を得る目的でヒトに全身送達させることができる。関門デバイスはとくに有用であり、相同組み換え不死化細胞、別種由来の相同組み換え細胞（相同組み換え異種細胞）、または組織適合性不一致ドナー由来の細胞（相同組み換え同種異系細胞）をヒトまたは動物の状態を治療する目的または農業用途（すなわち食肉および乳製品の製造）のために移植することを可能ならしめる。関門デバイスは、何らかの理由により治療方式を変更しなければならないときに除去すべき細胞へのアクセスを容易にすることによって簡便な短期的（すなわち一時的）治療法をも可能にする。この目的のためには、複数の合成、半合成、または天然の濾過膜を使用することができ、具体的にはセルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ポリスルホン、ポリビニリデンジフルオリド、ポリ塩化ビニルポリマー、およびポリ塩化ビニル誘導体のポリマーなどが例示されるが、これらに限定されない。関門デバイスは、別種由来の一次、二次、または不死化細胞のヒトの遺伝子治療への使用を可能にする目的にも利用できる。イン・ビトロにおけるタンパク質の製造本発明のヒトまたはヒト以外の種に由来する相同組み換え細胞は、イン・ビトロにおけるタンパク質の製造にも使用することができる。該細胞を、目的タンパク質の発現をもたらす当該分野において公知の条件下に保つ。目的のタンパク質を精製するためには、上記方法を用いて発現させたタンパク質を細胞溶解物または細胞上清から精製すればよい。本発明の方法によって製造されるタンパク質としては、当該分野において公知の従来の医薬品投与経路（たとえば経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、または皮下投与）によってヒトまたはヒト以外の動物に送達することができる治療目的タンパク質などが挙げられる。かかるタンパク質としては、ｈＧＨ、ｈＥＰＯ、及びヒトインスリノトロピン、ｈＧＭ−ＣＳＦ、ｈＧ−ＣＳＦ、ＦＳＨβ、又はα−インターフェロン等が挙げられる。これらの細胞は不死化細胞であってもよいし、一次細胞であってもよいし、二次細胞であってもよい。ヒト以外のタンパク質の方が治療上または商業上有用であるタンパク質製造目的にとってヒト以外の細胞が有利である場合には、他種細胞の使用が望ましく、たとえばサケカルシトニンの製造目的にはサケの細胞、ブタインスリンの製造目的にはブタの細胞、ウシ成長ホルモンの製造目的にはウシの細胞を使用するのがよい。利点本発明の方法、ＤＮＡ構築物、細胞、および生成タンパク質は応用範囲が広く、現在ジーンターゲティングの分野で使われている方法より多くの点で優れている。対象遺伝子に直接隣接する位置（正常遺伝子の転写領域に直接融合されている）から、内因性遺伝子の転写領域から３０キロベースペア以上上流側までの様々な位置に存在していたり、内因性遺伝子のイントロン内に存在していたりする外因性調節配列の位置を決定することによって内因性遺伝子を活性化させることができれば、細胞内の遺伝子発現に有利である。たとえば、通常は遺伝子に対してサイレント化または負の調節を行なっている領域の上流または下流側にある調節要素の位置を決定する目的にこれを利用することができる。上記領域の上流または下流側にある調節要素の位置決定は、通常は転写を阻害するような優性の負の作用を凌駕しうる。また、通常は転写を阻害したり特定の遺伝子の発現に対して別の方法で悪影響を及ぼすＤＮＡ領域を、本明細書で説明するようにターゲティング構築物を利用して欠失させることができる。さらに、プロモーター機能は局所環境依存度が大きいことが知られているので、機能にとっての至適局所環境を見つけるために広範囲の位置を探索すればよい。ところが、哺乳類のＤＮＡにはＡＴＧ開始コドンが含まれていることが多いため（４８塩基対あたり約１回の頻度）、転写が遺伝子の上流側の位置で単純に開始されず、正しいＡＴＧ開始コドンの前にある長いリーダー配列を含む転写物が産生され、そのようなリーダー配列に高頻度でＡＴＧコドンが出現すると、正しい遺伝子産物の翻訳が阻害されメッセージが無意味になってしまう。したがって、調節領域から成るターゲティング構築物に外因性エキソン、スプライス供与部位、および必要に応じてイントロンとスプライス受容部位を組み込むと、ｍＲＮＡ中の不適当なＡＴＧ開始コドンの生成を防止する必要性に伴う制限を受けることなく、調節領域機能にとっての至適部位を決定することによって遺伝子発現の最適化を図ることができる。これにより、構築物の位置選択の融通性が大幅に高まり、広範囲の遺伝子を活性化することができるようになる。本発明のＤＮＡ構築物は、たとえば組み換えすなわち外因性の配列と内因性配列によってコードされる融合タンパク質の製造プロセスにおいても有用である。以上開示したジーンターゲティングと増幅は、単離と発現が困難なほどの大きさをもった転写単位を形成する遺伝子の発現を変化させる目的、またはタンパク質コード化領域全体の利用が不可能であるかクローン化されていない遺伝子を働かせる目的にとくに有用である。したがって、上記ＤＮＡ構築物は、転写単位を正確に決定し、最終的に外因性調節要素と内因性遺伝子の相対的位置決定の融通性を高め、治療効果を有する遺伝子の取得と発現調節のための高度制御系を実現するように外因性調節要素を内因性遺伝子に効果的に連結する上で有用である。実施例の説明本明細書で説明したとおり、本出願人らは、ＤＮＡを一次、二次、または不死化脊椎動物細胞に導入し、相同組換えにより該トランスフェクト細胞のゲノムに組み込ませることができることを明らかにした。さらに、外因性ＤＮＡは相同的に組換えられた（ＨＲ）細胞中で目的の機能を発揮すること、および正しくターゲティングされた細胞は、適切なターゲティングを受けたＤＮＡによって付与される検出可能な表現型に基づき同定することができることを明らかにした。本出願人らは、ヒトゲノム中の特定遺伝子座（ＨＰＲＴ座）へのターゲティングおよび薬剤耐性表現型に基づく選択に有用なプラスミドの構築について説明する（実施例１ａ）。ｐＥ３Ｎｅｏと呼ぶこのプラスミドを細胞ゲノムのＨＰＲＴ座に組み込むと、ｈｐｒｔ^-の６−ＴＧ耐性表現型を有するとともにＧ４１８耐性も示す細胞が得られる。すでに述べたとおり、本出願人らは、樹立細胞に導入されたＤＮＡがＨＰＲＴ遺伝子のエキソン３内に局在していることを明らかにすることで、ｐＥ３Ｎｅｏが該樹立ヒト細胞系でのジーンターゲティングにおいて適切に機能することを示した（実施例１ｂ）。また、本出願人らは、ｐＥ３Ｎｅｏを用いて一次及び二次細胞ヒト皮膚線維芽細胞においてジーンターゲティングが可能であることを明らかにする（実施例１ｃ）。本出願ではさらに、ＤＮＡ末端を改変するとゲノムＤＮＡへのＤＮＡのターゲティングが促進されることを明らかにする（実施例１ｃおよび１ｅ）。本出願人らは、ジーンターゲティングによって一次、二次、または不死化細胞等の細胞のゲノム中のあらかじめ選択された部位に遺伝子を導入することができる方法についても説明する（実施例１ｄ）。また、本発明はトランスフェクト細胞を用いるタンパク質製造方法に関する。本発明の方法は、治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡ、または治療目的の産物をコードする内因性遺伝子をターゲティングするのに充分なＤＮＡを用いて、一次、二次、または不死化細胞等の細胞をトランスフェクトするものである。たとえば、実施例１ｇ、１ｈ、１ｊ、１ｋ、２、３、４及び６〜９では、内因性遺伝子の発現に変化を与えるＤＮＡ配列成分を用いて、選択された内因性遺伝子のターゲティングによるタンパク質製造について説明する。本出願人らはさらに、ＤＮＡ構築物について、及びジーンターゲティングによって活性化された内因性細胞遺伝子を増幅するための方法（実施例３、６、８及び９）についても説明する。実施例１ｆ〜１ｈおよび実施例２、４及び６は、ヒトＥＰＯ遺伝子の上流にある正常な調節配列を変化させて、トランスフェクトされていない状態では検出可能量のＥＰＯを発現しない一次または二次線維芽細胞株におけるｈＥＰＯの発現を可能ならしめる態様を説明するものである。１つの態様においては、ターゲティングの産物は正常なＥＰＯタンパク質を無傷のままではあるがマウスメタロチオネインプロモーターの制御下に置く。実施例１ｉおよび１ｊは、同様のターゲティング構築物を用いて、一次または二次ヒト線維芽細胞中で内因性成長ホルモン遺伝子を活性化させることについて説明する。ヒト線維芽細胞中のＥＰＯ発現の活性化について説明するその他の態様においては、ターゲティング事象の産物はキメラ性転写ユニットであり、そのものの中ではヒト成長ホルモン遺伝子の第一エキソンがＥＰＯエキソン２−５の上流に位置する。転写（マウスメタロチオネインプロモーターの制御下にある）、スプライシング、および翻訳の産物は、ｈＥＰＯシグナルペプチドのアミノ酸１−４がｈＧＨのアミノ酸残基１−３で置換されたタンパク質である。このタンパク質のキメラ部分、すなわちシグナルペプチドは、細胞からの分泌に先立ち除去される。実施例５では、遺伝子（イントロンを有する）を該遺伝子の発現可能ｃＤＮＡコピー（イントロンを欠く）に変換する細胞を作成するターゲティング構築物と方法、ならびに微生物（たとえば酵母や細菌）細胞中での上記発現可能ｃＤＮＡ分子の回収について説明する。実施例６では、ｐＲＥＰＯ４という２重選択（dual selection）用ターゲティングベクターの構築とｄｈｆｒ遺伝子を増幅させる場となる細胞の選択について説明する。相同組換えにより内因性ｈＥＰＯ遺伝子を活性化させた後、プラスミドｐＲＥＰＯ４を用いてＨＴ１０８０細胞（不死化ヒト細胞系）中のヒトＥＰＯ（ｈＥＰＯ）座を増幅させておく。すでに述べたとおり、メトトレキセート含有培地で段階的選択を行なったところ、０．４μＭのメトトレキセートに耐性を示す細胞中でのｈＥＰＯ産生が７０倍増大した。実施例７及び８は、通常のＥＰＯプロモーターの上流にある調節配列の挿入方法、及びかかる構築物を用いるＥＰＯの生産方法を記載する。さらに、実施例８は、実施例７の方法により得られる被ターゲットＥＰＯ遺伝子の増幅について記載する。実施例９は、ヒトα−インターフェロン遺伝子、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子、及びＦＳＨβ遺伝子をターゲティングし、タンパク質生産に有用な細胞を創る方法を記載する。これらの実施例は、ターゲット遺伝子のタンパク質コード領域の操作などの処理を必要としないでジーンターゲティングにより内因性遺伝子の活性化または活性化と増幅を行なう方法を提供するものである。本明細書で示される方法、及びＤＮＡ構築物又はプラスミドを用いることにより、又は当該分野における通常の技術を有する者にとって自明であるそれらの改変物を用いることにより、イン・ビトロでのタンパク質製造法（たとえば医薬品）やイン・ビボでのタンパク質送達法（たとえば遺伝子治療）に望ましい性質を有する細胞中で遺伝子の発現を変化させることができる。図５および図６では、ｈＥＰＯ遺伝子の転写を活性化させる２つの手法について説明する。本明細書に開示する方法およびＤＮＡ構築物またはプラスミドまたは当該分野における通常の技術を有する者にとって自明であるそれらの改変物を用いると、治療目的の産物（たとえばタンパク質、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ）をコードする外因性ＤＮＡを、脊椎動物（たとえばヒトおよびヒト以外の哺乳類）の一次または二次細胞のゲノム中のあらかじめ選択された部位に挿入することができる。以下実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されない。実施例実施例１．ジーンターゲティングによるトランスフェクト細胞株の作成トランスフェクトするＤＮＡが、相同組み換え事象を通して、染色体ＤＮＡ配列に導入される時、または部分的に置換する時に、ジーンターゲティングが生じる。このような事象はどのようなトランスフェクト実験の途中でも生じる可能性があるが、それらは非相同又は不正の(illegitimate)組み換えによってプラスミドＤＮＡが組み込まれるという事象が大過剰に起こることによって、通常マスクされている。ａ．ヒト細胞中のジーンターゲティング事象の選択に有用な構築物の作成ターゲティングの事象を選択する一つの方法は、トランスフェクトするＤＮＡの組み込みによる遺伝子機能の消失を選択する遺伝子的選択によるものである。ヒトＨＰＲＴ遺伝子座(locus)はヒポキサンチン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素をコードしている。ｈｐｒｔ^-細胞は、ヌクレオシドアナログである６−チオグアニン（６−ＴＧ）を含む培地で増殖することにより選択することができる。すなわち、野生型（ＨＰＲＴ⁺）対立遺伝子(allele)を持つ細胞は、６ −ＴＧによって死滅するが、変異体（ｈｐｒｔ^-）対立遺伝子を持つ細胞は生きつづけることができる。従って、ＨＰＲＴ遺伝子機能を破壊する、ターゲティングされた事象を保持する細胞が６−ＴＧ培地で選択できる。ＨＰＲＴ遺伝子座に対するターゲティングのためのプラスミドを構築するために、ＨＰＲＴ配列〔遺伝子バンク(Genebank)名ＨＵＭＨＰＲＴＢ：エドワーズ(Edwards，A.)ら，Genomics 6:593-608(1990)]の１１，９６０〜１８，８６９位を含みかつＨＰＲＴ遺伝子のエキソン２と３を含む６．９ｋｂのＨｉｎｄIII断片がｐＵＣ１２のＨｉｎｄIII部位にサブクローン化される。得られたクローンはＨＰＲＴ遺伝子断片のエキソン３の唯一のＸｈｏＩ部位で切断され、ｐＭＣ１Ｎｅｏ(Stratagene)からのｎｅｏ遺伝子を含む１．１ｋｂのＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片が挿入されて、エキソン３をコードする部分が破壊される。ＨＰＲＴ転写の方向と反対方向のｎｅｏ転写の方向を持った一つのオリエンテーション(orientation)が選びだされ、ｐＥ３Ｎｅｏと名付けられた。正常なＨＰＲＴエキソン３をｎｅｏが破壊された（neo-disrupted）型のもので置換すると６−ＴＧ耐性表現型のｈｐｒｔ^-が得られるであろう。このような細胞はＧ４１８耐性でもある。ｂ．樹立ヒト線維芽細胞系でのジーンターゲティング不死化した細胞系におけるターゲティングを示すため、そして、ジーンターゲティングにおいてｐＥ３Ｎｅｏが適切に機能することを確立させるため、ヒト線維肉腫細胞系ＨＴ１０８０（ＡＴＣＣＣＣＬ１２１）をｐＥ３Ｎｅｏでエレクトロポーレーションを用いてトランスフェクトした。ＨＴ１０８０細胞は、エレクトロポーレーションに先立って、１５％子牛血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）含有のＨＡＴ（ヒポキサンチン／アミノプテリン／キサンチン）補填のＤＭＥＭ培地で維持された。エレクトロポーレーションの２日前に、細胞をアミノプテリンのない同様の培地に移し変える。等比級数的に増殖した細胞をトリプシン処理し、ＤＭＥＭ／１５％子牛血清で希釈し、遠心分離して、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝液）に再懸濁させて、１ｍｌ当たり１３３０万細胞の最終細胞体積にする。ｐＥ３ＮｅｏをＨｉｎｄIIIで処理し、ｐＵＣ１２骨格から８ｋｂのＨＰＲＴ−ｎｅｏ断片を分離し、フェノール抽出とエタノール沈殿により精製して、６００μｇ／ｍｌの濃度で再懸濁させる。５０μｌ（３０μｇ）を、エレクトロポーレーション用チューブ(cuvette)（０．４ｃｍ電極間隔、バイオラッドラボラトリーズ）に、７５０μｌの細胞懸濁液（細胞数１０００万）と共に加えた。エレクトロポーレーションは４５０Ｖ、２５０μＦ（Ｂｉｏ−ＲａｄＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ；バイオラッドラボラトリーズ）で行われた。チューブの内容物を直ちに、１５％子牛血清含有のＤＭＥＭ培地に加えて、２５ｍｌの培地当たり、１００万個の細胞になるような細胞懸濁液を作る。この処理された細胞懸濁液２５ｍｌを１５０ｍｍ径の組織培養皿にまいて、３７℃、５％炭酸ガス中で培養した。２４時間後、Ｇ４１８溶液を直接その皿に加えて、Ｇ４１８として８００μｇ／ｍｌの最終濃度のものとした。５日後、培地をＤＭＥＭ／１５％子牛血清／８００μｇ／ｍｌＧ４１８の培地に換えた。エレクトロポーレーションの９日後に培地をＤＭＥＭ／１５％子牛血清／８００μｇ／ｍｌＧ４１８及び１０μＭの６−チオグアニン含有のものに換えた。Ｇ４１８と６−ＴＧに耐性のコロニーがこの２重選別の開始後１４〜１６日後に、クローニングシリンダーを用いて採取された。ＨＴ１０８０細胞における５個の代表的なターゲティング実験の結果を表１に示す。トランスフェクション例５では、Ｇ４１８^rコロニーの一貫収率決定用のコントロール皿によると、３３，７００個のＧ４１８^rコロニーが最初１×１０⁷個の処理細胞から発生するはずであることが示された。このように、ターゲットされた事象とターゲットされない事象の比は、６６／３３，７００すなわち１対５１０である。この５つの実験を合わせると、ターゲットされた事象は、３．６×１０⁶の頻度すなわち処理細胞の０．０００３６％という頻度で発生する。制限酵素と、ｎｅｏとＨＰＲＴ遺伝子から得られたプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション実験から、ＨＰＲＴ遺伝子座のＨＰＲＴのエキソン３中の予想された位置にｎｅｏ遺伝子が位置していることが示された。ｃ．一次及び二次のヒト皮膚線維芽細胞でのジーンターゲティングｐＥ３ＮｅｏをＨｉｎｄIIIで切断し、ｐＵＣ１２骨格から８ｋｂのＨＰＲＴ −ｎｅｏ断片を分離し、フェノール抽出とエタノール沈殿により精製する。ＤＮＡは、２ｍｇ／ｍｌとなるよう再懸濁した。０．５ｍｌの容量中、３００万個の二次ヒト包皮線維芽細胞が１００μｇのＨｉｎｄIIIｐＥ３Ｎｅｏ（５０μｌ）と共に、２５０ボルトと９６０μファラッドでエレクトロポーレートされた。３回に分けてトランスフェクションを行い、全部で９００万個の処理細胞となった。細胞を処理し、Ｇ４１８耐性を指標に選択した。１５０ｍｍ培養皿ごとに、５００，０００個の細胞がＧ４１８選択用にまかれた。選択条件で１０日後に、培養液を４００μｇ／ｍｌのＧ４１８と１０μＭの６−ＴＧを含むヒト線維芽細胞栄養培地に換える。２種の薬剤の組み合わせでの選択を、さらに１０日間継続する。培養皿を顕微鏡で見て、両薬剤に耐性なヒト線維芽細胞コロニーを検索する。Ｇ４１８^rｔ−ＴＧ^rコロニーの比率は、９００万個の処理細胞当たり４個である。これらのコロニーは、コロニーを作り得るすべての細胞の０．０００１％（すなわち、１００万分の１）となっている。Ｇ４１８^rコロニーの一貫収率を決定するために用いられるコントロール用培養皿から、最初の９×１０⁶個の処理細胞から２８５０個のＧ４１８^rコロニーが発生し得ることが示された。このように、ターゲットされない事象に対するターゲットされた事象の比率は４／２，８５０すなわち１対７１２である。制限酵素及び、ｎｅｏとＨＰＲＴ遺伝子に由来するプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション実験により、ＨＰＲＴ遺伝子座のＨＰＲＴエキソン３の中の予想される部位にｎｅｏ遺伝子が位置し、そしてこれら４個のクローン化された細胞株中に、ターゲティングが生じていることが示された。両薬剤に耐性なコロニーは一次細胞をトランスフェクトすることによっても単離された（１／３．０×１０⁷）。いくつかのｐＥ３Ｎｅｏターゲティング実験の結果は表２にまとめられている。ＨｉｎｄIIIで処理されたｐＥ３Ｎｅｏは、直接トランスフェクトされるか、又はトランスフェクションに先立って５’端に単鎖の突出部を発生させるため、エキソヌクレアーゼIIIで処理された（実施例１ｃ参照）。長さが１７５から９３０塩基対の範囲の単鎖領域を持つＤＮＡ調製物が試験された。ＨｉｎｄIIIのみで消化したｐＥ３ｎｅｏを用いて、Ｇ４１８−耐性コロニーの１／７９９が、制限酵素とサザンハイブリダイゼーション分析により、ＨＰＲＴ遺伝子座にｎｅｏ遺伝子のターゲティング挿入があることが、同定された（全部で２４個の目的のクローンが単離された）。１７５塩基対の突出部を用いた時に、ターゲティングは最大に増強され（約１０倍の増強）、Ｇ４１８^rコロニーの１／８０に、ＨＰＲＴにおけるターゲティングの特徴である制限断片の存在が示された（全部で９個の目的とするクローンが単離された）。このように、ここに記載された条件と組み換えＤＮＡ構築物を用いれば、ターゲティングは通常のヒト線維芽細胞で容易に観察でき、ターゲティングの一貫頻度（ターゲットされたクローンの数を、Ｇ４１８耐性株へ安定にトランスフェクトされたクローンの数で割ったもの）は、実施例１ｅに記載するような方法で、単鎖の突出尾部を含むターゲティング構築物でトランスフェクトすることで増強され得る。ｄ．ヒトのゲノムへの治療に有益な遺伝子のターゲティング挿入のための構築物作成とジーンターゲティングでのその利用治療に有益な遺伝子がｎｅｏ遺伝子に隣接するかその近くのＨＰＲＴのコード領域内に挿入されているｐＥ３Ｎｅｏ変異型は、一次又は二次のレシピエント細胞ゲノムの特定の位置に、治療に有益な遺伝子をターゲティングするために使用することができる。ＨＰＲＴ遺伝子座にｈＧＨ遺伝子をターゲティングするために、このようなｐＥ３Ｎｅｏ変異型を構築することができる。ｐＸＧＨ５（図３に概略図を示す。）を、ＥｃｏＲＩで処理し、ｈＧＨ遺伝子とそれに結合したマウスメタロチオネン（ｍＭＴ）プロモーターを含む４．１ｋｂ断片を分離する。ＥｃｏＲＩの突出部をＥ．coli ＤＮＡポリメラーゼからのクレノー断片で埋める。別個にｐＥ３Ｎｅｏはｎｅｏ断片とＨＰＲＴエキソン３の結合（エキソン３への挿入物の３’側の結合）を切断するＸｈｏＩで処理する。直鎖状になったプラスミドのＸｈｏＩ突出端を、Ｅ．coli ＤＮＡポリメラーゼからのクレノー断片で埋め、得られた断片を４．１ｋｂの平滑末端のｈＧＨ−ｍＭＴ断片につなぐ。ライゲーション混合物由来のバクテリアのコロニーは、ｈＧＨ−ｍＭＴ断片が単一コピー挿入されているか及び一方向性か、すなわちｈＧＨ遺伝子がｎｅｏ遺伝子と同じ方向で転写されるかが、制限酵素分析によってスクリーニングされ、選択され、ｐＥ３Ｎｅｏ／ｈＧＨと名付けられる。ｐＥ３Ｎｅｏ／ｈＧＨをＨｉｎｄIIIで消化し、ＨＰＲＴ，ｎｅｏとｍＭＴ −ｈＧＨ配列を含む１２．１ｋｂの断片を切り離す。消化したＤＮＡを処理し、実施例１ｃに記載した一次又は二次ヒト線維芽細胞にトランスフェクトする。Ｇ４１８^rＴＧ^rコロニーを選択し、実施例１ｃに記載したように、ＨＰＲＴ遺伝子中へのｍＭＴ−ｈＧＨとｎｅｏ配列のターゲティング挿入について分析する。個々のコロニーは市販の免疫測定法(Nichols Institute)を用いて、ｈＧＨの発現を測定する。二次ヒト線維芽細胞をｐＥ３Ｎｅｏ／ｈＧＨでトランスフェクトし、チオグアニン耐性コロニーの安定なｈＧＨの発現について、制限酵素とサザンハイブリダイゼーション分析法により分析した。分析した１３個のＴＧ^rコロニーのうち８個のコロニーが、内在性のＨＰＲＴ遺伝子座にｈＧＨ遺伝子が挿入されていると同定された。８個の株はすべて、ｈＧＨの有意な量を安定に発現しており、２４時間の平均発現レベルは２２．７μｇ／１０⁶細胞であった。また、プラスミドｐＥ３ｎｅｏＥＰＯ、図４、を、ヒトＨＰＲＴ遺伝子座にＥＰＯをターゲティングする目的で使用してもよい。細胞のゲノムＤＮＡの特定の位置に治療上有益な遺伝子をターゲティングする目的で行う相同組み換えの利用は、ある遺伝子を挿入することにより、治療目的（例えば薬物投与（pharmaceutics）や遺伝子治療）の産物の産生を拡大でき、またその有用性を一層高めることができる。上記の遺伝子の増幅コピーを含有する細胞は、適当な薬物選択法に付されることにより選択可能となる。例えば、ｐＥ３ｎｅｏ／ｈＧＨ（実施例１ｄ）は、ｐＥ３ｎｅｏ／ｈＧＨ中のｈＧＨ又はｎｅｏ遺伝子に直接隣接する位置にｄｈｆｒ、ａｄａ、又はＣＡＤ遺伝子を挿入することにより改変することができる。一次、二次、又は不死化細胞をこのようなプラスミドでトランスフェクトし、そして正確にターゲティングされた事象を固定する。これらの細胞を、増幅された遺伝子を含む細胞を選択するのに適した薬物で漸増する濃度でさらに処理する（ｄｈｆｒの場合の選択剤はメトトレキセートであり、ＣＡＤの場合の選択剤はＮ− （ホスホノアセチル）−Ｌ−アスパルテート（ＰＡＬＡ）であり、ａｄａの場合の選択剤はアデニンヌクレオシド（例えばアラノシン（alanosine））である）。この方法においては、治療上有益な遺伝子の組み込み体は選択される増幅コピー遺伝子と共に同時増幅を受けるであろう。こうして、治療用の遺伝子を産生させるための細胞の遺伝子工学は、ターゲティング構築物が組み込まれる位置及び増幅された細胞中で増幅されたコピーが存在する位置を予め選択することにより、容易に制御することができる。ｅ．ターゲティングを増強させるためのＤＮＡ末端の修飾いくつかの一連の証拠から、Ｅ．coli、バクテリオファージ、Ｓ．cerevisiae とアフリカツメガエルにおける或る相同性組み換えの過程に、３’端突出部が関与することが示唆されている。アフリカツメガエルの卵母細胞においては、数百個の塩基対の長さの３’端突出部を持つ分子が、制限酵素で消化されて発生する非常に短い突出部（４ｂｐ）を持つ分子よりも、顕微注入後に非常にすみやかに同様に処理された分子と組み換えを起こした。酵母においては、数百個の塩基対の長さを持つ３’端突出部の発生が減数分裂的(melotic)組み換えにおける律速段階であるように見える。ヒト細胞の組み換えにおいては３’端突出部が関与するとの証拠は報告されておらず、どのような種においても、修飾ＤＮＡ基質がターゲティング（相同性組み換えの一種）を促進するということは示されていない。以下の実施例に記載の実験および実施例１ｃから、５’端突出部が一次、二次および不死化ヒト線維芽細胞のターゲティングの促進に有効であることが示唆される。トランスフェクトするＤＮＡ分子の末端を修飾することによって、ターゲティングを増強させることに関する報告はなされていない。この実施例では分子末端を２本鎖型から１本鎖型に変換することによる直鎖状ＤＮＡ分子の末端の修飾により、一次及び二次のヒト線維芽細胞の染色体へのターゲティングが増強できることを示す。１１００μｇのプラスミドｐＥ３Ｎｅｏ（実施例１ａ）をＨｉｎｄIIIで消化する。このＤＮＡは、フェノール抽出とエタノール沈殿の後に、直接用いることができる。あるいはＨＰＲＴとｎｅｏ遺伝子のみを含む８ｋｂのＨｉｎｄIII断片が、ゲル電気泳動法によってｐＵＣ１２ベクター配列と分離することができる。ＨｉｎｄIII消化ＤＮＡのＥｘｏIII処理により、両末端に、各フリーの３’末端で始まり、５’の突出端を残す広範なエクソヌクレオティックな消化が起こる。エクソヌクレオティック反応の程度とその結果としての５’端突出部の長さは、ＥｘｏIII処理反応の時間を変化させることにより、コントロールできる。ＨｉｎｄIII処理されたｐＥ３Ｎｅｏの１００μｇのＥｘｏIII消化は、供給者の推薦する条件に従い、３０秒、１分、１．５分、２分、２．５分、３分、３．５分、４分、４．５分と５分の時間で実施される。消化の程度をモニターするため、それぞれの時間の点で、ＥｘｏIII で処理されたＤＮＡを１μｇ含むように採取された試料を、マングビーンヌクレアーゼ(Promega)を用いて供給者の推薦する条件で処理し、その試料をゲル電気泳動で分画する。ＥｘｏIII等未処理でかつＨｉｎｄIII処理されたｐＥ３ＮｅｏとそれをさらにＥｘｏIIIとマングビーンヌクレアーゼで処理した同じ分子のサイズの違いを測定する。２つに分かれたこのサイズの相違から、分子のそれぞれの末端にある５’端突出部の平均の長さが出る。上述の時間の点と３０°での処理では、作りだされる５’端突出部は１００〜１０００塩基の範囲である。それぞれの反応時点で採取されたＥｘｏIII処理のＤＮＡ６０μｇ（ｐＥ３Ｎｅｏの全ＨｉｎｄIII処理物）を精製し、実施例１ｃに記載の条件下で一次、二次または不死化ヒト線維芽細胞へエレクトロポーレーションにより導入する。それぞれのＥｘｏIII処理調製物でターゲティングがどの程度増強されたかについては、Ｇ４１８^r６−ＴＧ^rコロニーの数を計測し、これらの数をＥｘｏIII未処理のＨｉｎｄIII消化ｐＥ３Ｎｅｏによるターゲティングで得られた数と比較することによって定量される。３’端突出部の効果も又、同様の系を用いて定量することができる。この場合、ＨｉｎｄIII消化ｐＥ３Ｎｅｏを用い、供給者の推薦する条件下で時間間隔を変えてバクテリオファージＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼ(United States Bio chemicals)で処理する。消化の程度（末端毎に作りだされた３’端突出部の平均の長さ）とエレクトロポーレーションの条件の決定は、ＥｘｏIIIで処理されたＤＮＡに関する記載に準じる。それぞれのＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼ処理調製物で、ターゲティングが増強される程度については、Ｇ４１８^r６−ＴＧ^rコロニーの数を計測し、これらの数をＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼ未処理のＨｉｎｄIII消化ｐＥ３ＮＥＯによるターゲティングで得られた数と比較することによって定量される。５’及び３’端突出部を発生させる他の方法も可能である。例えば、相互に部分的にオーバーラップしている２つの直鎖状分子を変性させ、アニーリングすることで、出発時の直鎖状分子と区別できない再アニーリングされた断片とともに、それぞれの分子の両末端に３’端突出部を有する分子、あるいは両末端に５’ 端突出部を有する分子の混合物が得られる。突出部の長さは２つのＤＮＡ断片の間で共通でないＤＮＡの長さから決定される。ｆ．一次、二次及び不死化ヒト線維芽細胞においてマウスメタロチオネンプロモーターの制御下にヒトエリスロポエチン遺伝子を置くためのターゲティングプラスミドの構築以下に、本件発明の一つの態様を例示する。そこでは、得られたままの状態では有意な量でｈＥＰＯを発現しない一次、二次及び不死化ヒト線維芽細胞において、ヒトエリスロポエチンが発現できるように、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）遺伝子の上流に位置する正常なポジティブとネガティブの調節配列を変化させる。ヒトＥＰＯをコードする領域の上流にのみ存在する領域をＰＣＲで増幅することができる。この目的のために用いられる３組のプライマーを、発表されているヒトＥＰＯ配列の解析からデザインした〔Genbank 名称 HUMERPA; リン（Lin，F -K．）ら、Proc ．Natl．Ac ad ．Sci.,USA 82:7580-7584(1985)〕。これらプライマーの組は６０９、６０３又は５９０ｂｐの断片を増幅することができる。３つの断片は実質的に重なりあっていて、本発明の目的には交換可能なものである。翻訳開始部位を基準に−６２３〜−１４に延びた（ＨＵＭＥＲＰＡヌクレオチドの２〜６１０位）６０９ｂｐ断片の両端にＣｌａＩリンカーを結合する。その結果得られたＣｌａＩ−結合断片をＣｌａＩで消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ／＋(Stratagene)のＣｌａＩ部位に挿入する。その際の配向性はＨＵＭＥＲＰＡヌクレオチド位置６１０がプラスミドポリリンカーのＳａｌＩ部位に隣接するようにする。このプラスミドｐ５’ＥＰＯをヒトＥＰＯ上流部分の断片中に唯一あるＦｓｐＩ又はＳｆｉＩ部位で、別々に切断し（ＨＵＭＥＲＰＡヌクレオチド位置として各々１５０と４０５）、マウスのメタロチオネンプロモーターに連結させる。典型的には、ｍＭＴ−Ｉ遺伝子から得られた１．８ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌII〔ｍＭＴをコードしない配列を含むものとして；ハマーとウォーリング（Hamer，D.H．and Walling M.），J ．Mol．Appl．Gen.1: 273288(1982 ); この断片はまた、Ｇｅｎｂａｎｋから入手できるｍＭＴ配列、例えばＭＵＳＭＴＩ、ＭＵＳＭＴＩＰ、ＭＵＳＭＴＩＰＲＭの解析からデザインされるＰＣＲプライマーを用いてマウスゲノムＤＮＡから公知方法により単離することもできる〕を既知の方法で平滑末端化し、ＳｆｉＩで消化した（先端を同様に平滑末端にした）ｐ５’ＥＰＯあるいはＦｓｐＩで消化したｐ５’ＥＰＯと結合させる。得られたクローンの配向性を分析し、前者のｍＭＴのＢｇｌII部位がプラスミドポリリンカー中のＳａｌＩ部位の近くにあるものが、一次及び二次のヒト線維芽細胞をターゲティングするために用いられる。この配向性は、最終の構築物の中で、ＨＵＭＥＲＰＡヌクレオチド位置６１０の方向に向かってｍＭＴの転写を指向させる。得られたプラスミドは、ＦｓｐＩとＳｆｉＩ部位で、それぞれｍＭＴの挿入があることから、ｐ５’ＥＰＯ−ｍＭＴＦ及びｐ５’ＥＰＯ−ｍＭＴＳと名付けられている。さらに上流の配列は、第一のターゲット配列の上流に存在する負の調節要素あるいはエンハンサーの修飾、欠失及び／又は置換が望ましい場合に、有用である。ＥＰＯの場合には、肝臓外の組織と腎臓外組織の中で、ＥＰＯの発現を抑制する負の調節要素〔セメンザ（Semenza，G.L．）ら、Mol ．Cell.Biol．10: 930-93 8(1990)〕は欠失させることができる。６ｋｂ断片中に一連の欠失のあるものが調製される。削除された領域は幅広い宿主細胞活性を有するエンハンサーで置換することができる〔例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）からのエンハンサー〕。ＨＵＭＥＲＰＡ配列の５’末端の前にＢａｍＨＩ部位（遠位）とＨｉｎｄIII 部位（近位）が位置するので、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ／＋ベクター中の６０９ｂｐの５’ＥＰＯ断片の配向性が選択された。このように、６０９ｂｐ断片の上流部分に通常存在する６ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII断片〔セメンザ（Semenza，G.L.）ら、Mol ．Cell Biol．10: 930-938(1990)〕は、公知方法を用いて染色体ＤＮＡから単離できる。例えばバクテリオファージ、コスミドあるいは酵母の人為染色体ライブラリー（artificial chromosome library）を、６０９ｂｐのＰＣＲ増幅断片をプローブとしてスクリーニングすることができるであろう。所望のクローンは６ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII断片を有するであろうし、その同定は公知方法で決定されたヒトＥＰＯ遺伝子の周辺の制限酵素地図とこの制限酵素地図を比較することによって確認することができる。また別の方法として、６０９ｂｐ断片をプローブとして用いて、ＥＰＯ遺伝子上流部分のヒトゲノムの制限酵素地図を作成することによって、ＨＵＭＥＲＰＡコーディネート２と６０９の間に起点を有し、上流ＢａｍＨＩ部位を越えて延びる断片を作る酵素を同定することができる。この断片は、ヒトゲノムＤＮＡの適当な消化物からゲル電気泳動法で単離することができ、バクテリアあるいは酵母のクローニングベクターに連結させることができる。正しいクローンは６０９ｂｐの５’ＥＰＯプローブにハイブリダイズし、６ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII断片を含有するであろう。単離された６ｋｂ断片は、正しい配向性でｐ５’ＥＰＯ、ｐ５’ＥＰＯ−ｍＭＴＦ又はｐ５’ＥＰＯ−ｍＭＴＳに挿入（ＨｉｎｄIII部位がＨＵＭＥＲＰＡヌクレオチド位置２に隣接するように）される。さらに上流の配列は公知方法で単離することができ、それには染色体ウォーキングテクニックを用いるか、あるいは６０９ｂｐの５’ＥＰＯプローブにハイブリダイズする酵母人為染色体の単離によって行うことができる。以上述べたクローニングのストラテジーは、その後の一次、二次または不死化ヒト線維芽細胞のターゲティングトランスフェクションのためＥＰＯの上流配列のインビトロでの修飾を可能にする。このストラテジーでは、負の調節領域の欠失とともにｍＭＴプロモーターの単純な挿入、また負の調節領域の欠失と広範囲の宿主細胞活性を有するエンハンサーによる置換について述べている。ｇ．ヒトＥＰＯ遺伝子の活性化及び被ターゲティング一次、二次および不死化ヒト線維芽細胞のスクリーニングによる単離ターゲティングに際し、プラスミドをプラスミドの骨格（backbone）から挿入物を切り離す制限酵素で切断する。p5’EPO-mMTSの場合、HindIIIとSaIIでの消化により2.4ｋｂのターゲティング断片が切り離されるが、この断片は４０５ｂｐと２０４ｂｐの配列がそれぞれ５’、３’側に隣接した1.8 ｋｂのmMTプロモーターよりなる。この隣接配列は、この構築物をヒトEPO遺伝子の調節領域にターゲティングするためのＤＮＡである。このＤＮＡ、すなわち2.4ｋｂのターゲティング断片のみがフェノール抽出およびエタノール沈殿により精製され、実施例１ｃに記載された条件下で一次あるいは二次のヒト線維芽細胞にトランスフェクトされる。トランスフェクトされた細胞は、ヒト線維芽細胞栄養培養液中、150mmディッシュに蒔かれる。48時間後、細胞は10,000細胞/cm²の密度〔１ウエル当たり約20,000細胞の割合。もし10⁶のクローニング可能な(clonable)細胞に対し１事象の割合でターゲティングが起こるならば、（実施例１ｃ）、その際１個の発現コロニーを分離するためのアッセイに約50ウエルが必要であろう〕で24ウエルのディッシュに蒔かれる。トランスフェクトする(transfecting)ＤＮＡがヒトEPO遺伝子の上流の相同領域をターゲットした細胞では、mMT プロモーターの制御下でhEPOを発現するであろう。10日後、すべてのウエルの上清について、市販の利用可能なイムノアッセイキット（アムジェン）を用いてEPOの発現につきアッセイする。hEPOの合成が認められるウエルからのクローンを、既知の方法を用いて分離する。代表的には個々のウェルあるいはプレート中に分離された異なる細胞集団のフラクションをアッセイし、これらのポジティブなウェルのフラクションのアッセイを必要に応じて繰り返し、最終的に１ウエル当たり１細胞の割合で蒔かれた96穴のマイクロタイタープレートをスクリーニングすることによりターゲティングされたコロニーを分離する。プレートライセート(plate lysates)全体からのＤＮＡを、HUMERPAヌクレオチド部位１の上流に位置するプライマーとmMTに特異的なプライマーとの組み合わせを用いたPCRによる断片の増幅により、分析することができる。この一対のプライマーは、ＤＮＡ配列に基いて正確に予想されるサイズのＤＮＡ断片を増幅するはずである。ポジティブなプレートをトリプシン処理し、次々と低い希釈で蒔きなおし、ターゲットされた細胞を分離するのに必要なだけ、ＤＮＡの調製とPCRのステップを繰り返す。ここで述べられたターゲティングの手法は、通常の薬物送達(pharmacologic d elivery)のためにhGHを産生させる目的で、不死化されたヒトの細胞（たとえばH T1080細胞(ATCC CCL121)、HeLa細胞及びその派生細胞(ATCC CCL2，2.1及び2.2) 、MCF-７乳癌細胞（ATCC HBT22）、K-562白血病細胞(ATCC CCL232)、KB癌細胞（ ATCC CCL17）、2780AD卵巣癌細胞〔ファンデルブリック（Van der Blick,A.M.）ら、Cancer Res．48:5927-5932(1988)〕、ラジ(Raji)細胞(ATCC CCL 86)、ジャーカト(Jurkat)細胞(ATCC TIB 152)、ナマルワ（Namalwa）細胞(ATCC CRL 1432) 、HL-60 細胞(ATCC CCL 240)、ダウジ（Daudi）細胞(ATCC CCL 213)、RPMI 8226 細胞(ATCC CCL 155)、U-937細胞(ATCC CRL 1593)、ボウズメラノーマ(Bowes Mel anoma)細胞(ATCC CRL 9607)、WI-38VA13サブライン2R4 細胞(ATCC CLL 75.1)、M OLT-4細胞(ATCC CRL 1582)、及び種々のヘテロハイブリドーマ細胞）においてhG Hの発現を活性化することにも使用することができる。ｈ．ヒトEPO遺伝子の活性化、及び被ターゲティング一次、二次および不死化ヒト線維芽細胞のポジティブあるいはポジティブ／ネガティブ組み合わせ選択システムによる単離 p5’EPO-mMTF、p5’EPO-mMTS、および上流に付加的な６ｋｂのB amHI-Hind III断片を有するそれらの誘導体を構築するためのストラテジーには、続けてmMTプロモーターに隣接したneo遺伝子の挿入という付加的なステップを行うことができる。加えて、ネガティブな選択マーカー、例えばgpt[pMSG（ファルマシア）あるいは他の適切な供給源から得られる］はpBluescriptIISK/ ＋ポリリンカー中のHUMERPA配列に隣接して挿入することができる。前者の場合、G41 8^rコロニーが分離され、ターゲットされたコロニーを同定するためにコロニー集団から調製されたＤＮＡのPCR増幅、又は制限酵素とサザンハイブリダイゼーション分析により、スクリーニングされる。後者の場合、G418^rコロニーは、gpt遺伝子の組み込み(integration)に対する選択のために、６-thioxanthineを含む培養液中に蒔かれる〔ベスナード(Besnard，C)ら、Mol.Cell.Biol. 7:4139-4141( 1987)〕。付言するに、HSV-TK遺伝子はgptのような挿入配列とは反対側に配置でき、それにより400μg/mlのG418、100μMの6-thioxanthine、25μg/mlのgancycl ovirを含むヒト線維芽細胞栄養培養液中で細胞を増殖させることにより、neoに対するポジティブ選択あるいはgptとTK両方に対するネガティブ選択が可能となる。二重のネガティブ選択法は、真のターゲティングに対する、ほぼ完全な選択法となるであろうし、サザンブロット分析は最終的な確証を与えるだろう。ここで述べられたターゲティングの手法は、通常の薬物送達のためにhEPOを産生させる目的で、不死化されたヒトの細胞（たとえばHT1080細胞(ATCC CCL121) 、HeLa細胞及びその派生細胞(ATCC CCL2，2.1及び2.2)、MCF-7乳癌細胞（ATCC H BT22）、K-562白血病細胞(ATCC CCL232)、KB癌細胞（ATCC CCL17）、2780AD卵巣癌細胞〔ファンデルブリック（Van der Blick,A.M.）ら、Cancer Res．48:5 927-5932(1988)〕、ラジ(Raji)細胞(ATCC CCL 86)、ジャーカト(Jurkat)細胞(AT CC TIB 152)、ナマルワ（Namalwa）細胞(ATCC CRL 1432)、HL-60細胞(ATCC CCL 240)、ダウジ（Daudi）細胞(ATCC CCL 213)、RPMI 8226細胞(ATCC CCL 155)、U- 937細胞(ATCC CRL 1593)、ボウズメラノーマ(Bowes Melanoma)細胞(ATCC CRL 96 07)、WI-38VA13サブライン2R4細胞(ATCC CLL 75.1)、MOLT-4細胞(ATCC CRL 1582 )、及び種々のヘテロハイブリドーマ細胞）においてhEPOの発現を活性化することにも使用することができる。ｉ．一次、二次または不死化されたヒト線維芽細胞において、マウスメタロチオネインプロモーターの制御下にヒト成長ホルモン遺伝子を配置することを目的とした、ターゲティングプラスミドの構築以下の実施例は、一次、二次または不死化されたヒト線維芽細胞においてヒト成長ホルモンを発現させるために、該ヒト成長ホルモン遺伝子の上流に位置する通常の調節配列を変化させる、という本発明の一態様を例示する。ＥＰＯ遺伝子の調節領域に対するターゲティングに関して実施例１ｆで述べられたのと同様のターゲティング分子が、ヒト成長ホルモンN遺伝子の5’末端に由来するクローン化されたＤＮＡ断片を利用して得られる。HUMGHCSA(Genbank Ent ry)ヌクレオチド部位3787-5432（2つのEcoNI制限酵素部位ではさまれた部分であり、この酵素はクローニング、あるいはこの断片を含むサブクローンの診断的切断に都合の良いサイズの断片を作り出す）に相当する約1.8ｋｂの断片が、この領域におけるHUMGHCSA配列の分析によってデザインされたPCRプライマーにより増幅される。この領域は、hGH遺伝子Ｎイントロン１の途中から翻訳開始部位の5’側より約1.4ｋｂ上流にまで及ぶ。pUC12がEco RIとBamHIで切断され、クレノーで処理することにより平滑末端化され、希釈条件化で再環状化される。その結果、プラスミドはEco RIとBam HI が欠失されたものとなる。このプラスミドはpUC12XEBと命名される。HindIIIリンカーを、増幅したhGH断片にライゲートし、その結果物である断片をHind III で消化し、Hind IIIで消化したpUC12XEBにライゲートする。その結果得られたプラスミド、pUC12XEB- 5’hGHを、hGH転写開始部位のすぐ上流に位置する0.5ｋｂ断片を除去するためにEco RIとBam HIで消化する。消化したＤＮＡを、mMT-I遺伝子由来の1.8ｋｂ EcoRI-Bgl II断片にライゲートする。〔mMTのコード配列は含んでいない。ハマーとウォリング(Hamer，D.H．and Walling，M.)，J ．Mol．A ppl．Gen. 1.:273-288(1982);この断片は、Genbankから入手可能なmMT配列、たとえばMUSMTI、MUSMTIP、MUSMTIPRMの分析によりデザインされるPCRプライマーを用いてマウスのゲノムＤＮＡから既知の方法でも分離し得る〕。このプラスミドｐ5’hGH-mMTは、上流のhGH配列(upstream hGH sequences)が両側に隣接するm MTプロモーターを有している。以上述べたクローニングのストラテジーにより、hGHの上流の配列がインビトロで修飾され、引き続いて一次、二次および不死化ヒト線維芽細胞のターゲティングトランスフェクションがなされる。このストラテジーは、mMTプロモーターの単純な挿入を示す。他のストラテジー、たとえば幅広い宿主細胞特異性を有するエンハンサーを挿入mMT配列の上流に挿入させるといったものも考え得る。ｊ．ヒトhGH遺伝子の活性化、及び被ターゲティング一次、二次および不死化ヒト線維芽細胞のスクリーニングによる単離ターゲティングに際し、プラスミドをプラスミドの骨格から挿入物を切り離す制限酵素で切断する。ｐ5’hGH-mMTの場合、HindIII消化により2.9ｋｂのターゲティング断片が切り離されるが、この断片は、この構築物をhGH遺伝子の調節領域にターゲッッティングするためのＤＮＡがその5’および3’側に隣接した、1. 8ｋｂのmMTプロモーターからなる。このＤＮＡ、すなわち2.9ｋｂのターゲティング断片のみがフェノール抽出およびエタノール沈殿により精製され、実施例１１に記載された条件下で一次あるいは二次のヒト線維芽細胞にトランスフェクトされる。トランスフェクトされた細胞は、ヒト線維芽細胞栄養培養液存在下、15 0mmディッシュに蒔かれる。48時間後、細胞は10,000細胞／cm²の密度〔１ウエル当たり約20,000細胞の割合。もし10⁶のクローニング可能な(clonable)細胞に対し１個の割合でターゲティングが起こるならば（実施例１ｃ）、そのときは１個の発現コロニーを分離するためのアッセイに約50ウエルが必要であろう〕で24ウエルのディッシュに蒔かれる。トランスフェクトする(transfecting)ＤＮＡがhG Hの上流の相同領域をターゲットした細胞では、mMTプロモーターの制御下でhGH が発現するであろう。10日後、すべてのウエルの上清について、市販のイムノアッセイキット（ニコルズ）を用いてhGHの発現をアッセイする。hGHの合成が認められるウエルのクローンを、既知の方法を用いて分離する。代表的には個々のウェルあるいはプレート中で分離された異なる細胞集団のフラクションをアッセイし、これらのポジティブなウェルのフラクションのアッセイを必要に応じて繰り返し、最終的に１ウエル当たり１細胞の割合で蒔かれた96穴のマイクロタイタープレートをスクリーニングすることにより、ターゲティングされたコロニーを分離する。プレートライセート全体からのＤＮＡも、HU MGHCSAヌクレオチド部位5,432の下流に位置するプライマーとmMTに特異的なプライマーの組み合わせを用いたPCRによって断片を増幅することにより、分析され得る。この一対のプライマーは、ＤＮＡ配列に基いて正確に予想されるサイズのＤＮＡ断片を増幅するはずである。ポジティブなプレートをトリプシン処理し、次々と低い希釈で蒔きなおし、ＤＮＡの調製とPCRのステップを、ターゲットされた細胞を分離するのに必要なまで繰り返す。ここで述べられたターゲティングの手法は、通常の薬物送達のためにhGHを産生させる目的で、不死化されたヒトの細胞（たとえばHT1080細胞(ATCC CCL121) 、HeLa細胞及びその派生細胞(ATCC CCL2，2.1及び2.2)、MCF-７乳癌細胞（ATCCH BT22）、K-562白血病細胞(ATCC CCL232)、KB癌細胞（ATCC CCL17）、2780AD卵巣癌細胞〔ファンデルブリック（Van der Blick,A.M.）ら、Cancer Res．48:5927- 5932(1988)〕、ラジ(Raji)細胞(ATCC CCL 86)、ジャーカト(Jurkat)細胞(ATCC T IB 152)、ナマルワ（Namalwa）細胞(ATCC CRL 1432)、HL-60細胞(ATCC CCL 240) 、ダウジ（Daudi）細胞(ATCC CCL 213)、RPMI 8226細胞(ATCC CCL 155)、U-937 細胞(ATCC CRL 1593)、ボウズメラノーマ(Bowes Melanoma)細胞(ATCC CRL 9607) 、WI-38VA13サブライン2R4細胞(ATCC CLL 75.1)、MOLT-4細胞(ATCC CRL 1582)、及び種々のヘテロハイブリドーマ細胞）においてhGHの発現を活性化することにも使用できる。ｋ．ヒトhGH遺伝子の活性化、及び被ターゲティング一次、二次および不死化ヒト線維芽細胞のポジティブあるいはポジティブ／ネガティブ組み合わせ選択システムによる単離 p5’hGH-mMTを構築するためのストラテジーのあとに、mMTプロモーターに隣接したneo遺伝子の挿入という付加的なステップを続けて行うことができる。加えて、ネガティブな選択マーカー、例えばgpt[pMSG（ファルマシア）あるいは他の適切な供給源から得られる]は、pUC12ポリリンカー中のHUMGHCSA配列に隣接して挿入することができる。前者の場合、G418^rコロニーを単離し、そしてターゲットされたコロニーを同定するためにこれらのコロニーのプールから調製されたＤＮＡについてPCR増幅又は制限酵素とサザンハイブリダイゼーション分析によりスクリーニングする。後者の場合、gpt遺伝子の組み込みのネガティブ選択のために、G418^rコロニーをthioxanthineを含む培地中に蒔く〔ベスナード(Besnard ，C)ら、Mol ．Cell．Biol. 7:4139-4141(1987)〕。付言するに、HSV-TK遺伝子は、gptのような挿入物の反対側に配置でき、それにより、400 μg/mlのG418、1 00μMの6-チオキサンチン及び25μg/ml gancyclovirを含むヒト線維芽細胞栄養培地中で細胞を増殖させることにより、neoに対するポジティブ選択及びgptとTK 両方に対するネガティブ選択が可能となる。二重のネガティブ選択法は、真のターゲティング事象に対し、ほぼ完全な選択法となるであろう。サザンハイブリダイゼーション分析は確認的なものである。ここで述べられたターゲティングの手法は、通常の薬物送達のためにｈＧＨを産生させる目的で、不死化されたヒトの細胞（たとえばHT1080細胞(ATCC CCL121 )、HeLa細胞及びその派生細胞(ATCC CCL2，2.1及び2.2)、MCF-7乳癌細胞（ATCC HBT22）、K-562白血病細胞(ATCC CCL232)、KB癌細胞（ATCC CCL17）、2780AD卵巣癌細胞〔ファンデルブリック（Van der Blick,A.M.）ら、Cancer Res．48:592 7-5932(1988)〕、ラジ(Raji)細胞(ATCC CCL 86)、ジャーカト (Jurkat)細胞(ATCC TIB 152)、ナマルワ(Namalwa)細胞(ATCC CRL 1432)、HL-60 細胞(ATCC CCL 240)、ダウジ(Daudl)細胞(ATCC CCL 213)、RPMI 8226細胞(ATCC CCL 155)、U-937細胞(ATCC CRL 1593)、ボウズメラノーマ(Bowes Melanoma)細胞 (ATCC CRL 9607)、WI-38VA13サブライン2R4細胞(ATCC CLL 75.1)、MOLT-4細胞(A TCC CRL 1582)、及び種々のヘテロハイブリドーマ細胞）においてｈＧＨの発現を活性化することにも使用される。実施例１ｆと１ｉに記載され、そして実施例１ｇ、１ｈ、１ｊおよび１ｋにおいて用いられたターゲティング構築物を修飾することによって、活性化された内因性遺伝子及び増幅能を有する選択マーカーが増幅される細胞の選択に有用な増幅能を有する選択マーカー（例えばａｄａ、ｄｈｆｒ又はＣＡＤ）を含ませることが可能である。治療目的の産物をコードする内因性遺伝子を発現または発現可能なこのような細胞は、通常の薬物送達のための、又は遺伝子治療のためのタンパク質（例えばｈＧＨ及びｈＥＰＯ）を生産するのに利用可能である。１．エレクトロポレーションによる外因性ＤＮＡおよび選択マーカー遺伝子での一次および二次線維芽細胞のトランスフェクション対数増殖期あるいは初期定常期の線維芽細胞をトリプシン消化し、栄養培地を用いてプラスチック表面から洗い流す。一定量の細胞懸濁液をカウントするために採取し、そして、残りを細胞を遠心分離する。上清を吸引し、ペレットは５ｍｌのエレクトロポーレーションバッファー（20ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ 7.3，13 7ｍＭＮａＣｌ，５ｍＭＫＣｌ，0.7ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄，６ｍＭデキストロース）に再懸濁する。細胞を再び遠心分離し、上清を吸引し、得られる細胞を１ｍｇ／ｍｌのアセチル化ウシ血清アルブミンを含むエレクトロポーレーションバッファーに再懸濁する。最終的な細胞懸濁液はおよそ３×１０⁶細胞／ｍｌの細胞を含んでいる。エレクトロポーレーションは再懸濁後すぐに行われるべきである。スーパーコイル状のプラスミドＤＮＡを、0.4ｃｍの電極のギャップを持った滅菌したキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に入れる。最終ＤＮＡ濃度は一般に少なくとも120 μｇ／ｍｌである。0.5ｍｌの細胞懸濁液（およそ1.5×１０⁶細胞を含んでいる）をその後キュベットに加え、細胞懸濁液とＤＮＡ溶液とを緩やかに混合する。エレクトロポーレーションはＧｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ− Ｒａｄ）を用いて行う。キャパシタンスおよび電圧はそれぞれ960μＦおよび250 -300Ｖに設定する。電圧が上昇すると、細胞の生存数が減少するが、ゲノムの中に導入されたＤＮＡが安定に組み込まれている生存細胞のパーセンテージが劇的に上昇する。これらのパラメーターが与えられると、およそ１４〜２０ミリ秒のパルス時間が観察されるだろう。エレクトロポーレーションされた細胞はおよそ５分間室温に保持され、次いでキュベットの内容物を滅菌されたトランスファーピペットで緩やかに採取する。この細胞を１０ｃｍの皿の中の１０ｍｌのあらかじめ暖められた栄養培地（上記のように15％の子牛血清を含んでいる）に直接加える。そして上述のようにインキュベートする。その翌日、培地を吸引し、10ｍｌの新鮮な培地と交換し、さらに16-24時間インキュベートする。その翌日、クローニング効率およびＧ418耐性コロニーを選別するために細胞のサブカルチャーが行われる。細胞をトリプシン処理し、カウントし、そして平板培養する。典型例では、線維芽細胞は、クローニング効率の決定のためには、10³細胞／10ｃｍディッシュで平板培養し、G418選択のためには１〜２×１０⁴細胞／1 0ｃｍディッシュで平板培養する。ヒト線維芽細胞は線維芽細胞栄養培地（15％子牛血清を含む）の中に300-400 μｇ／ｍｌのＧ418（Geneticin、およそ50％の効力を示す二硫酸塩；Ｇｉｂｃｏ）を含む培地でＧ418耐性のものを選択をする。クローニング効率はＧ418の非存在下で決定された。平板培養された細胞を12−14日間インキュベートし、その時期のコロニーをホルマリンで固定し、クリスタルバイオレットで染色して、カウントする（プレートクローニング効率）かあるいはクローニングシリンダーを用いて単離する（Ｇ418プレート）。ウサギ線維芽細胞のエレクトロポーレーションおよび選択を、選択条件を除きヒト線維芽細胞について記述されたのと基本的に同じように行う。ウサギ線維芽細胞を１ｇｍ／ｍｌのＧ418を含む培地で選択する。線維芽細胞は新鮮な切除されたヒト包皮から単離された。カルチャーはＤＭＥＭ＋10％子牛血清の中に50,000細胞／ｃｍになるように蒔かれた。カルチャーが全面を覆った(confluent)とき、線維芽細胞をトリプシン処理することにより集め、エレクトロポーレーションによりトランスフェクトした。エレクトロポーレーションの条件はプラスミドｐｃＤＮＥＯ（図５）を用いたトランスフェクションにより評価された。ほぼ最適な条件（エレクトロポーレーション電圧が250ボルト、キャパシタンスの設定が960μＦで、プラスミドｐｃＤＮＥＯが60μｇ）での典型的なエレクトロポーレーション実験の結果、処理細胞588個につきＧ418 コロニー１個（全ての処理細胞のうち0.17％）、あるいは71のクローン化可能な細胞につきＧ418コロニー１個が得られた(1.4％)。９回の別々のエレクトロポーレーション実験が至適条件付近（エレクトロポーレーション電圧が300ボルトでキャパシタンスが960μＦの設定においてプラスミドｐｃＤＮＥＯが60μｇ）で行われ、平均して、1,899個の処理細胞につき一つのＧ418コロニーが観察され（0.05％）、これは、処理細胞の1/882から1/7,500 の範囲であった。これは平均して、38個のクローン化可能細胞あたり平均一つのＧ418コロニーに相当する(2.6％)。低いパッセージ(low passage)の一次ヒト線維芽細胞をプラスミドｐｃＤＮＥＯおよびｐＸＧＨ５を用いた同時トランスフェクションによりｈＧＨ発現細胞へ変換した。典型的には、二つのプラスミドの等モル混合物60ftｇを至適条件（エレクトロポレーション電圧300ボルト、キャパシタンス960 μＦ）付近でトランスフェクトした。このような実験の結果、処理細胞14,705につきＧ418コロニーは一つであった。これらおよび同一のトランスフェクション条件下で単離された他の細胞についてのｈＧＨ発現データは以下に要約されている。最終的に全Ｇ４１８^rコロニーの98％が大量培養するために拡大培養することが可能であった。分析されたＧ４１８^rクローンの数 154 Ｇ４１８^r／ｈＧＨ発現クローンの数 65 ｈＧＨ発現の平均レベル 2.3 μg hGH／10⁶細胞／24hr hGH発現の最大レベル 23.0μg hGH／10⁶細胞／24hr 安定なトランスフェクタントはまた、ｎｅｏおよびｈＧＨ遺伝子が同一のプラスミド分子に存在しているＤＮＡ構築物である、ｐＸＧＨ301を用いた一次又は二次ヒト線維芽細胞のエレクトロポーレーションにより作成された。ｐＸＧＨ301は二段階操作により構築された。ｐＢＲ３２２由来のＳａＩＩ−ＣｌａＩ断片（ｐＢＲ３２２中の２３−６５１位）を単離し、ＳａＩＩ−ＣｌａＩ消化ｐｃＤＮＥＯに挿入した。こうしてｐｃＤＮＥＯのＳＶ４０初期プロモーター領域の上流にＢａｍＨＩ部位を導入した。このプラスミドすなわちｐＢＮＥ０をＢａｍＨＩで消化し、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下にあるｎｅｏ遺伝子を含む２．１ｋｂ断片を単離し、そしてＢａｍＨＩで消化したｐＸＧＨ５中に挿入した。２．１ｋｂのＢａｍＨＩ断片を１個挿入されたプラスミドを単離した。この中には、相互に同方向に転写されるｎｅｏとｈＧＨとがある。このプラスミドをｐＸＧＨ301と名付けた。例えば、1.5×10⁶細胞を60μｇのｐＸＧＨ301を用いて300ボルト、960μＦでエレクトロポーレーションした。Ｇ4 18耐性コロニーをトランスフェクトされた二次線維芽細胞から単離し、その頻度は1.5×10個の処理細胞のうちＧ418耐性コロニーが652であった（2299処理細胞につき１個）。これらのコロニーのおよそ59％がｈＧＨを発現した。実施例２．ヒトの成長ホルモンとエリスロポエチンの配列が融合されたキメラ型転写単位を生じさせるターゲティングプラスミドの構築以下、得られたままのトランスフェクトされていない状態では検出可能な量のｈＥＰＯを発現しないような一次あるいは二次の線維芽細胞株において、ヒトＥＰＯ遺伝子の上流に位置する本来の調節配列をｈＥＰＯの発現が可能なように変化させる、という本発明の二つのさらなる態様を説明する。これらの態様において、ターゲティング事象の結果物は、ヒト成長ホルモン遺伝子第一エキソンがｈＥＰＯのエキソン２−５の上流に位置するようなキメラ型転写単位である。転写、スプライシングおよび翻訳の産物は、ｈＥＰＯのシグナルペプチドのアミノ酸１−４がｈＧＨのアミノ酸残基１−３に置き変わったタンパク質である。２つの態様は、挿入される外来の調節配列の相対的な位置と、プロセッシングされた最終転写産物を生産するのに必要なスプライシングの特異的なパターンは、両者に関して異なる。プラスミドpXEPO-10は、ヒトの第7染色体上の内因性ｈＥＰＯ遺伝子へのジーンターゲティングにより、hEPOのエキソン 1をhGHのエクンン 1で置き換えるためにデザインされる。プラスミドpXEPO-10は以下のように構築される。まず、Hi ndIII-Bam HIで消化されたpBluescriptII SK＋(Stratagene,LaJolla，CA)中に、 hEPOのコード領域の上流に存在する６ｋｂのHind III-Bam HI断片（実施例１ｆ参照）を挿入することにより、中間的なプラスミドpT163を構築する。このライゲーションの産物をXholおよびHindIIIで消化し、pMClneoPolyA［トーマスとカペッチ（Thomas，K．R．and Capecchi，M．R．）Cell51: 503-512（1987）。Str ategene,LaJolla，CAから入手可能］由来の1.1ｋｂ Hind III-XhoI断片にライゲートしpT163を構築する。マウスメタロチオネイン１（mMT-I）プロモーター−hG Hエキソン１配列が、hEPOイントロン１の配列に付加的に融合されている融合断片作成のために、オリゴヌクレオチド13.1-13.4をポリメラーゼ・チェイン・リアクションに利用する。まず、オリゴヌクレオチド13.1と13.3を用いて、pXGH5 （図５）由来の約0.73ｋｂのmMT-Iプロモーター−hGHエキソン１断片を増幅する。次に、オリゴヌクレオチド13.2と13.4を用いて、主としてヒトゲノムＤＮＡ由来のhEPOイントロン１よりなる約0.57ｋｂの断片を増幅する。最後に２つの増幅された断片を混合し、オリゴヌクレオチド13.1と13.4でさらに増幅して最終的な融合断片（融合断片３）を作成する。融合断片３は、mMT-I部分の５’側のSalＩ部位と、hEPOのイントロン１配列の３’側のXhoＩ部位により隣接されている。融合断片3をXho IとSal Ｉで消化し、Xho Ｉで消化したｐT163にライゲートする。ライゲーション混合物でE.coliを形質転換し、hEPOイントロン１配列の３’側においてXhoI部位が再生している融合断片３挿入物を一つだけ有するクローンを同定し、pXEPO-10と命名する。オリゴ13.1の太文字でない領域は、５’末端に本来のKpnＩ部位を有するmMT-Iプロモーターに同一である。太文字の活字は、５’末端をSalＩ部位に変換するためのSalＩ部位のテール(tail)を意味する。オリゴ13.2と13.3の太文字領域はhGH配列を意味し、一方太文字でない領域はhEPO遺伝子由来のイントロン１配列である。オリゴ13.4の太文字でない領域はhEPOイントロン１の最後の25塩基に同一である。太文字の領域は、増幅された断片の３’末端をXhoＩ部位に変換するためのXhoＩ部位のテールを含む。プラスミドpXEPO-11は、ヒト第７染色体上の内因性のhEPO座にあるhEPOの構造遺伝子およびプロモーター領域の上流に、mMT-ＩプロモーターとhGHのエキソン１を配置するように、ジーンターゲティングによりデザインされる。プラスミド pXEPO-11は以下のように構築される。オリゴヌクレオチド13.1と13.5-13.7をポリメラーゼ・チェイン・リアクションに用いて融合断片を作成する。この融合断片においては、マウスメタロチオネインＩ(mMT-I)プロモーター−hGHエキソン１配列が、hEPOコード領域の-1から-630に相当するhEPOの配列に付加的に融合されている。まず、オリゴヌクレオチド13.1と13.6を使用して、pXGH5（図５）由来の約0.75ｋｂのmMT-Iプロモーター−hGHエキソン１の断片を増幅する。次にオリゴヌクレオチド13.5と13.7を使用して、ヒトのゲノムＤＮＡから、主としてhEPO のコード領域の-1から-620に相当するhEPOの配列よりなる約0.65ｋｂの断片を増幅する。オリゴ13.5と13.6は両方共、hGHイントロン１−hEPOプロモーター領域に位置する10bpのリンカー配列を含んでおり、これは、天然のhEPOイントロン１のスプライス供与部位に相当する。最後に、２つの増幅された断片を混合し、さらにオリゴヌクレオチド13.1と13.7で増幅して、mMT-I部分の５’側のSal I部位とhEPOプロモーター領域の３’側のXhol部位により隣接された最終的な融合断片（融合断片６）を作成する。融合断片６を、XholとSalＩで消化し、XhoＩで消化したpT163に結合する。ライゲーションの混合液でE.coliを形質転換し、hEPOプロモーター配列の３’側にXhoＩ部位が再生した融合断片６が一つ挿入されたクローンを同定し、pXEPO-11と命名する。オリゴ13.5と13.6の太文字の領域はhGHの配列を意味する。イタリックの領域はhEPOイントロン１の最初の10塩基対に相当する。残りのオリゴはhEPO コード領域に関し、-620から-597のhEPOの配列に相当する。オリゴ13.7の太文字でない領域はhEPOのコード領域に関し、-1から-24の塩基と同一である。太文字の領域は、増幅された断片の３’末端をXhoＩ部位に変換するためのXhoＩ部位のテールを含んでいる。プラスミドpXEPO-10は、hEPOの配列を両側に連結したmMT-I/hGH融合物を含む7 .3ｋｂの断片をBam HIとXhoIで消化することにより、ジーンターゲティングに使用し得る。この断片（ターゲティング断片１）はhEPOのコード配列を含んでおらず、ヒトのEPOの遺伝子座へのターゲティングを方向づけるための、hEPOのコード領域の上流-620から約-6620の間にある配列とhEPOイントロン１の配列のみを有している。ターゲティング断片１を、実施例１ｃで述べられているのと同様の条件を用いて一次あるいは二次のヒト皮膚線維芽細胞にトランスフェクトする。 G418に耐性のコロニーを選んで96ウエルプレートの各ウエルに入れ、ELISAアッセイ（R & Dシステム、ミネアポリスMN）によりEPOの発現をスクリーニングする。トランスフェクトする(transfecting)ＤＮＡがランダムにヒトゲノム中に組み込まれた細胞は、EPOを産生することができない。トランスフェクトするＤＮＡが、内因性のhEPOイントロン１およびhEPO上流配列と相同組み換えをおこした細胞は、mMT-Iのプロモーター及び非転写配列、並びにhGHの５’非翻訳配列及びhG Hエキソン１が正常のhEPOのプロモーター及びhEPOエキソン１と置換したキメラ遺伝子を含んでいる（図１参照）。ターゲティング断片１中の非hEPO配列は、 hEPOイントロン１の下流のhEPO配列に結合している。天然のhEPO調節領域のmMT- Iプロモーターによる置換は、本来ならhEPOを発現しない線維芽細胞中のEPO遺伝子を活性化するであろう。hEPOエキソン１のhGHエキソン１による置換により、h EPOシグナルペプチドの最初の４アミノ酸がhGHのアミノ酸1-3で置換されているタンパク質が得られる。そしてこの置換は、翻訳後のプロセッシングにより成熟したタンパク質から除かれ、発現細胞から分泌される機能的なキメラのシグナルペプチドを形成する。プラスミドｐＸＥＰＯ−１１は、ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化し、両端がｈＥＰＯ配列に隣接しているｍＭＴ−Ｉ／ｈＧＨ融合体を含む７．４ｋｂの断片を遊離させることにより、ジーンターゲティングに用いることができる。この断片（ターゲティング断片２）は、ｈＥＰＯをコードする配列を含んでおらず、ヒトＥＰＯ座へのターゲティングを方向づける、ｈＥＰＯコード領域の上流−１とおよそ−６６２０の間にある配列のみを有する。ターゲティング断片２は、実施例１ｇに記載されたものと同様の条件を用いて、一次又は二次ヒト皮膚線維芽細胞にトランスフェクトされる。Ｇ４１８耐性コロニーを９６穴プレートの各々の穴に接種し、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄシステムズ，ミネアポリス，ミネソタ）により、ＥＰＯの発現をスクリーニングする。トランスフェクトするＤＮＡがヒトゲノムの中へランダムに組み込まれた細胞はＥＰＯを産生できない。トランスフェクトＤＮＡが内因性のｈＥＰＯプロモーター及びその上流の配列と相同組み換えを起こした細胞は、ｍＭＴ−Ｉプロモーターとその非転写配列、ｈＧＨの５’ 非翻訳配列及びｈＧｈエキソン１、及び、ｈＥＰＯイントロン１の最初の１０塩基から成る１０塩基対リンカーが、ｈＥＰＯをコードする領域の−６２０位に存在するＨｉｎｄIII部位に挿入されたキメラ遺伝子を含んでいる（図２参照）。通常サイレントであるｈＥＰＯプロモーターの上流にｍＭＴ−Ｉプロモーターが存在することにより、（５’から３’への）非翻訳メタロチオネイン及びｈＧＨ配列、ｈＧＨエキソン１、ｈＥＰＯイントロン１の最初の１０塩基対と同一のＤＮＡ１０塩基、そして通常のｈＥＰＯプロモーターとｈＥＰＯエキソン１（ｈＥＰＯをコードする配列の−６２０から＋１３位）の読み取りメッセージ(message)の合成が、一次あるいは二次皮膚線維芽細胞中で指示される（ｄｉｒｅｃｔ）であろう。ｈＥＰＯイントロン１の１０塩基対リンカー配列は、ｈＧＨエキソン１を続く下流のそしてｈＥＰＯエキソン２のすぐ上流にあるスプライス受容部位に融合させるためのスプライス供与部位として働く。よってその結果生じる転写物のプロセシングは、ｈＥＰＯプロモーター、エキソン１およびイントロン１配列を切除するであろう。ｈＧＨエキソン１によるｈＥＰＯエキソン１の置換により、ｈＥＰＯシグナルペプチドの最初の４アミノ酸がｈＧＨのアミノ酸１〜３で置きかわったタンパク質が得られ、この置換は成熟タンパク質から翻訳後プロセシングによって切り離され発現細胞から分泌される機能的なキメラシグナルペプチドを作りだすことになる。ｐＸＥＰＯ−１０とｐＸＥＰＯ−１１に関する一連の構築物は、公知方法を用いて構築することができる。これらの構築物においては、ｍＭＴ−ＩプロモーターとｈＧＨ配列の相対的位置は、ｍＭＴ−Ｉ／ｈＧＨ配列がｈＥＰＯ上流配列に挿入される位置と同様、ジーンターゲティングを容易にする別のキメラ転写ユニットを作るために変更され、その結果融合転写体のより能率的な発現を可能とし、また他の望ましい性質を付与できる。このような構築物は、通常のｈＥＰＯ座へのジーンターゲティングにより、ｈＧＨ−ｈＥＰＯ融合遺伝子が外来性のプロモーターの支配下に置かれるという同様の結果を与えるであろう。例えば、ｈＥＰＯ遺伝子の上流にある６ｋｂのＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ断片（実施例１ｆ参照）は、ｎｅｏ遺伝子とｍＭＴ−Ｉプロモーター／ｈＧＨ融合断片の挿入部位に用いうる多くの制限酵素認識部位を有する。このような部位の１つ、ＨｉｎｄII I部位のおよそ１．３ｋｂ上流にあるＢｇｌII部位はこの領域で唯一のものであり、１個又はそれ以上の選択マーカー、及び一次、二次あるいは不死化したヒト細胞でのｈＥＰＯ発現の活性化に寄与する他の遺伝子由来の調節領域の挿入に用いうる。第一に、中間体プラスミドｐＴ１６４は、ｈＥＰＯコード領域の上流にある６ｋｂのＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ断片（実施例１ｆ）を、ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩで処理されたpBluescript II ＳＫ＋〔ストラタジーン，ラジョラ，カリフォルニア(Stratagene，Lajolla，CA）〕に挿入することにより構築される。プラスミドpMClneoPolyA〔トーマスとカペッケ(Thomas，K.R．and Capecchi，M.R.)Cel l 51:503-512(1987); ストラタジーン，ラジョラ，カリフォルニア(Stratagene ，Lajolla，CA)より市販〕をＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩによって消化し、Ｅ．coli ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片処理により平滑末端化し、それによって生じる１．１ｋｂの断片を精製する。ｐＴ１６４をＢｇｌIIで処理し、Ｅ．coli ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片処理により、平滑末端化される。前記２個の平滑末端断片は互いにつなぎ合わされ、コンピテント(competent)Ｅ．coli中にトランスフォームされる。１．１ｋｂのｎｅｏ断片が１個挿入されたクローンを単離し、制限酵素分析を行い、平滑なＸｈｏＩ部位とＢｇｌII部位の融合にて再生されたＢｇｌII部位がプラスミドｐＴ１６４にある唯一のＨｉｎｄIII部位から１．３ｋｂ離れたところに位置しているものを同定する。その結果得られるプラスミドｐＴ１６５は、ｎｅｏ転写ユニットの５’側に隣接した唯一のＢｇｌII部位で開裂しうる。マウスメタロチオネインＩ（ｍＭＴ−Ｉ）プロモーター−ｈＧＨエキソン１配列が、スプライス供与部位を含む１０塩基対断片に付加的に融合した断片を作るため、オリゴヌクレオチド１３．８と１３．９を用いてポリメラーゼチェインリアクションを行う。より多くのスプライス供与部位又はコンセンサススプライス供与部位が使えるかも知れないが、この選ばれたスプライス供与部位は天然のｈＥＰＯイントロン１スプライス供与部位に対応する。オリゴヌクレオチド（１３．８及び１３．９）は、ｐＸＧＨ５（図５）由来のおよそ０．７３ｋｂのｍＭＴ −Ｉプロモーター−ｈＧＨエキソン１断片を増幅するために用いられる。その増幅された断片（断片７）をＢｇｌIIで処理し、ＢｇｌIIで処理されたｐＴ１６５につなぎ合わす。つなぎ合わされた混合物を、Ｅ．coliに導入する。ｍＭＴ−ＩプロモーターのＫｐｎＩ部位がｎｅｏ遺伝子の５’末端の近傍にあり、かつそのｍＭＴ−Ｉプロモーターが唯一のＨｉｎｄIII部位に向かって転写が起こるように配置された断片７が１個挿入されたものを含むクローンを同定し、ｐＸＥＰＯ −１２と命名する。オリゴ１３.８の太字でない部分は、５’境界部位に天然のＫｐｎＩ部位を有するｍＭＴ−Ｉプロモーターと同一である。太字の活字は５’境界部位をＢｇｌII部位に変えるためのＢｇｌII部位テール部分を表す。オリゴ１３.９の太字部分は、ｈＧＨ配列を表す。イタリックの部分はｈＥＰＯイントロン１の最初の１０塩基対に対応する。下線部のＢｇｌII部位はプラスミド構築の目的のため加えられる。プラスミドｐＸＥＰＯ−１２は、ｎｅｏ遺伝子と、ｈＥＰＯ配列が両側に隣接したｍＭＴ−Ｉ／ｈＧＨ融合物とを含む７．９ｋｂ断片を遊離するようＢａｍＨＩとＨｉｎｄIII消化により、ジーンターゲティングに用いることができる。この断片（ターゲティング断片３）は、ｈＥＰＯをコードする配列を含まず、ヒトＥＰＯ座上流へのターゲティングを方向づける、ｈＥＰＯコード領域上流のおよそ−６２０からおよそ−６６２０の間にある配列のみを有する。ターゲティング断片３は、実施例１ｂ及び１ｃに記載されたものと同様の条件を用いて、一次、二次又は不死化ヒト皮膚線維芽細胞にトランスフェクトされる。Ｇ４１８−耐性コロニーは、９６穴プレートの各々の穴に接種し、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄシステムス，ミネアポリス，ミネソタ）により、ＥＰＯの発現についてスクリーニングする。トランスフェクトしたＤＮＡがヒトゲノムの中にランダムにとりこまれた細胞はｈＥＰＯを生産することができない。トランスフェクトしたＤＮＡが内因性のｈＥＰＯプロモーター及び上流の配列と相同組み換えされた細胞は、ｍＭＴ−Ｉプロモーターと非転写配列、ｈＧＨ５’非翻訳配列及びｈＧＨエキソン１、及びｈＥＰＯイントロン１の最初の１０塩基から成る１０塩基対リンカーが、ｈＥＰＯコード領域のおよそ−１９２０の位置にあるＢｇｌII部位に挿入されているキメラ遺伝子を含んでいる。通常サイレントであるｈＥＰＯプロモーターの上流にｍＭＴ−Ｉプロモーターが存在することにより、（５’から３’への）非翻訳メタロチオネイン及びｈＧＨの配列、ｈＧＨエキソン１、ｈＥＰＯイントロン１の最初の１０塩基対と同一のＤＮＡ１０塩基、及びｈＥＰＯ上流領域とｈＥＰＯエキソン１（ＥＰＯをコードする配列のおよそ−１９２０から＋１３位）の読み取りメッセージの合成が一次、二次あるいは不死化ヒト線維芽細胞（又は他のヒト細胞）中で指示されるであろう。ｈＥＰＯイントロン１由来の１０塩基対リンカー配列は、ｈＥＰＯエキソン２のすぐ上流にある下流のスプライス受容部位にｈＧＨエキソン１を融合させるためのスプライス供与部位として働く。それゆえに、その結果生じる転写物は、プロセシングにより、ｈＥＰＯ上流配列、プロモーター領域、エキソン１及びイントロン１配列を切除されるであろう。ｐＸＥＰＯ−１０，−１１及び−１２を用いた場合、メッセージの転写後のプロセシングは、ｍＭＴ−ＩプロモーターとｈＥＰＯエキソン１の間のｈＥＰＯ上流配列に存在する、所望のメッセージを作りだすのに必要な生産的スプライシング事象のレベルを下げるスプライス受容部位を除去するインビトロ突然変異法を用いることにより、改良することができる。ｈＧＨエキソン１によるｈＥＰＯエキソン１の置換により、ｈＥＰＯシグナルペプチドの最初の４アミノ酸がｈＧＨのアミノ酸１−３で置きかわったタンパク質が得られ、成熟タンパク質から翻訳後プロセッシングにより切り離され、発現細胞から分泌される、機能性キメラシグナルペプチドが生じる。実施例３：ターゲティングによる上流配列の改変とターゲティングされた遺伝子の増幅ターゲティングプラスミドが遺伝子増幅現象によって高濃度細胞毒性物質への耐性を付与しうるマーカー遺伝子を含んでいる場合、上述の方法によってｈＥＰＯ遺伝子が活性化されたヒト細胞を誘導することで、ｎｅｏ／ｍＭＴ−１／ＥＰＯ転写ユニットを増幅させることができる。遺伝子のなかでも、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ、選択試薬はメトトレキセートである）、多機能ＣＡＤ遺伝子［カルバミルホスフェートシンターゼ、アスパルテートトランスカルバミラーゼ、およびジヒドロオロターゼをコードする；選択試薬はＮ−（ホスホノアセチル）−Ｌ−アスパルテート（ＰＡＬＡ）である］、グルタミンシンテターゼ；選択試薬はメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）、およびアデノシンデアミナーゼ（ａｄａ；選択試薬はアデニンヌクレオシドである）などの選択マーカー遺伝子がとくに不死化ヒト細胞系中で増幅可能であるとされている［ライトら（Wrig ht，J.A．et al．）、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 87:1791-1795（1990）；コケット(Cockett,M.I.)ら、Bio/Technology 8:662-667(1990)］。これらの研究では、遺伝子増幅は複数の不死化ヒト細胞系中で起きるとされている。他の細胞のなかで、ＨＴ１０８０、ＨｅＬａ、ＭＣＦ−７乳癌細胞、Ｋ−５６２白血病細胞、ＫＢ癌細胞、または２７８０ＡＤ卵巣癌細胞は適当な選択条件下で増幅を示す。正常または変異ｄｈｆｒ遺伝子をプラスミドｐＸＥＰＯ−１０やｐＸＥＰＯ− １１の唯一のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入することによって、これらのプラスミドを改変することができる。適当なＤＮＡでＨＴ１０８０細胞をトランスフェクトし、Ｇ４１８耐性（ｎｅｏ遺伝子によって付与される）を示す細胞の選択を行ない、ｎｅｏ、ｄｈｆｒ、およびｍＭＴ−１配列をｈＥＰＯ遺伝子の上流の正しい位置にジーンターゲティングすることによってｈＥＰＯ遺伝子が活性化された細胞を同定した後、これらの細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）中の段階的選択に付して、ｄｈｆｒの増幅および連結されたｎｅｏ、ｍＭＴ−１、およびｈＥＰＯ配列の共増幅を示す細胞の選択を行なうことができる［カウフマン（Kaufman，R .J．）、Technique 2:221-236(1990)］。まず細胞を低レベルのＭＴＸ（０．０１〜０．０８μＭ）で処理した後、２５０μＭまたはそれ以上までＭＴＸ濃度を段階的に上昇させる段階的選択スキームを使用する。比較的緩やかに濃度を上げる方法も有効であるが、ＭＴＸ濃度を０．０４μＭから０．０８μＭへと直線的に上昇させ、続いて２倍づつ濃度を上げて行くと、増幅トランスフェクト細胞系の選択に有効である。増幅は、ｄｈｆｒ遺伝子コピー数の増加によってモニターされ、イン・ビトロでのｈＥＰＯ発現の測定によって確認される。この方式により、完全にｈＥＰＯコード領域の外にある配列のターゲティング改変によって、ｈＥＰＯのかなりの過剰発現を達成することができる。非コード配列へのジーンターゲティングとその後の増幅によってｈＧＨ遺伝子を過剰発現する細胞を得る目的で、ヒト細胞におけるｈＧＨ発現を活性化させるための上記（実施例１ｆ、１ｈ、１ｉ、１ｋ、２及び７）の構築物と類似の構築物をさらに改変させて、ｄｈｆｒ遺伝子を組み込むこともできる。実施例４．不死化ヒト線維芽細胞系におけるヒトＥＰＯ座のターゲティングと活性化ヒト線維芽細胞中で内在性ｈＥＰＯ遺伝子が活性化されうるという仮説を試すため、ターゲティング構築物ｐＸＥＰＯ−１３が作られた。まず、マウスのメタロチオネイン−１プロモーター（ｍＭＴ−Ｉ）に融合したｈＥＰＯ遺伝子の最初のコドンの上流にある６３ｂｐのゲノムｈＥＰＯ配列を含むプラスミドｐＴ２２．１が構築された。ｍＭＴ−ＩとｈＥＰＯ配列を融合させるため、オリゴヌクレオチド２２．１から２２．４がＰＣＲに用いられた。これらのプライマーの性状は次の通りである。２２．１は、ｍＭＴ−ＩのＫｐｎＩ部位の２８ｂｐ上流から始まるｍＭＴ−Ｉプロモーターの一部と相同な２１塩基オリゴヌクレオチドである。２２．２と２２．３は、５８ヌクレオチドの相補的プライマーである。これらは、融合物がｈＥＰＯ遺伝子の最初のコドンの３５塩基上流に始まる２８ｂｐのｈＥＰＯ配列、及びオリゴヌクレオチド２２．２の塩基２９から始まるｍＭＴ −Ｉ配列であって、ｍＭＴ−Ｉの天然のＢｇｌII部位を有し、ｍＭＴ−Ｉ配列中へ３０塩基まで延びた配列、を含むようにｈＥＰＯ及びｍＭＴ−Ｉ配列の融合物を定めている。２２．４は、２１ヌクレオチドの長さでｈＥＰＯ遺伝子の最初のコドンの７２５ｂｐ下流に始まるｈＥＰＯ配列と相同である。これらのプライマーは、上述のようにｍＭＴ−ＩとｈＥＰＯ配列の融合物を含む１．４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するのに用いられた。その結果生じる断片は、ＫｐｎＩで消化し（ＰＣＲ断片は２つのＫｐｎＩ部位を含む：ｍＭＴ−Ｉプロモーター領域唯一の天然ＫｐｎＩ部位と、ｈＥＰＯ配列中唯一の天然ＫｐｎＩ部位である）、精製した。プラスミドｐＸＥＰＯ１も同様にＫｐｎＩで消化し、１．４ｋｂ断片と６．４ｋｂ断片を遊離させた。６．４ｋｂ断片を精製し、１．４ｋｂのＫｐｎＩのＰＣＲ融合断片に連結した。得られた構築物をｐＴ２２．１と呼ぶ。２番目の中間体、ｐＴ２２．２はｈＥＰＯ構造遺伝子の上流にあるおよそ６ｋｂのＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ断片（実施例１ｆ参照）をＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIで消化したｐＢＳＩＩＳＫ＋（ストラタジーン，ラジョラ，カリフォルニア）につないで構築した。３番目の中間体ｐＴ２２．３は、まずネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含むｐＭＣＩＮＥＯpolyＡ（ストラタジーン，ラジョラ，カリフォルニア）から１．１ｋｂのＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片を切り出すことにより構築した。この断片は次にＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片（ニューイングランドバイオラブス）で平滑末端化した。この断片は、次にｐＢＳＩＩＳＫ＋のＨｉｎｃII部位（同様にしてＤＮＡポリメラーゼＩで平滑末端化したもの）につないで、ｐＴ２２．３を作成した。４番目の中間体、ｐＴ２２．４は、ｐＴ２２．３からｎｅｏ遺伝子を含む１．１ｋｂのＸｈｏＩ／ＨｉｎｄIII断片を精製し、この断片をＸｈｏＩとＨｉｎｄIIIで消化したｐＴ２２．２につないで作成した。従ってｐＴ２２．４はｈＥＰＯ断片上流のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄII IのＨｉｎｄIII部位に隣接したｎｅｏ遺伝子を有する。最後にｐＸＥＰＯ−１３は、ｐＴ２２．１から２．０ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＡｃｃＩ断片をまず切り出すことにより作成した。この断片のＥｃｏＲＩ部位は、ｍＭＴ−Ｉプロモーターの５’境界を定め、一方、この断片のＡｃｃＩ部位はｈＥＰＯエキソン５の中にある。このようにＡｃｃＩ／ＥｃｏＲＩ断片は、ほとんど完全なｈＥＰＯ発現ユニットを含み、エキソン５の一部と天然のポリアデニル化部位のみを欠く。この２．０ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＡｃｃＩ断片を精製し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片処理により平滑末端化し、そして、ＸｈｏＩで消化し、平滑末端化したｐＴ２２．４につなぎ合わせた。ＨＴ１０８０細胞を、ＰｖｕＩ−ＢａｍＨＩで消化したｐＸＥＰＯ−１３でトランスフェクトした。このように消化したｐＸＥＰＯ−１３からは次のような３つの断片が生ずる。ａｍｐ遺伝子の一部を含む１ｋｂのベクター断片、残りのベクター配列の１．７ｋｂ断片、及びｈＥＰＯ、ｎｅｏおよびｍＭＴ−Ｉ配列を含む約９ｋｂの断片である。この約９ｋｂのＢａｍＨＩ／ＰｖｕＩ断片は、次の配列をＢａｍＨＩ部位から順に含んでいた。約５．２ｋｂの上流側ｈＥＰＯゲノム配列、１．１ｋｂのｎｅｏ転写ユニット、０．７ｋｂのｍＭＴ−Ｉプロモーター、及びエキソン５内で切断されている、ｈＥＰＯコード配列を含む２．０ｋｂの断片である。上記方法で消化した４５μｇのｐＥＸＰＯ−１３を、１２００万個の細胞のエレクトロポーレーションに用いた（エレクトロポーレーション条件は、実施例１ｂに記載した）。このエレクトロポーレーションは合計８回繰り返し、計９６００万細胞について行った。細胞はｍｌあたり１００万個の細胞密度になるよう培地と混合し、１ｍｌ量を、各々最少３５ｍｌのＤＭＥＭ／１５％子ウシ血清を含む計９６個の１５０ｍｍ組織培養プレート（ファルコン）に分注した。翌日、培地を吸引除去し、０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（ギブコ）を含む新しい培地と交換した。１０日間のインキュベートの後、各プレートの培地をｈＥＰＯのＥＬＩＳＡ分析（Ｒ＆Ｄシステムズ）のため、サンプリングした。９６プレートのうち６個が少なくとも１０ｍＵ／ｍｌのｈＥＰＯを含んでいた。これらのプレートの１つ、第１８番をｈＥＰＯ発現コロニーの精製のために選択した。９６の１５０ｍｍプレートの各々がおよそ６００のＧ４１８耐性コロニー（全９６プレート上のＧ４１８耐性コロニーの集計見積もりは５７，６００）を含んでいた。１８番プレート上の約６００コロニーを、トリプシン処理し、３６４穴プレート（ステアリン）に５０細胞／ｍｌで再接種した。１週間のインキュベート後、３６４穴プレートの大きい穴あたり約１０個の割合で、単独のコロニーが見えるようになった（このプレートは２４の大きい穴の各々の中に１６の小さい穴がある）。個々の穴につき、この時点でｈＥＰＯ発現についてスクリーニングした。２つの大きい穴が少なくとも２０ｍＵ／ｍｌのｈＥＰＯを含んでいた。Ａ２番の穴で１６の小さい穴の間に１５のコロニーがあることが認められた。これらの小さい穴の個々の中身をトリプシン処理し、９６穴プレートの１６の別々の穴に移された。７日間のインキュベートの後、これら各々の穴の培地をｈＥＰＯのＥＬＩＳＡ分析のためサンプリングした。番号１０の穴１つだけがｈＥＰＯを含んでいた。この細胞株を、ＨＴ１６５−１８Ａ２−１０と命名し、定量的ｈＥＰＯ分析、ＲＮＡ単離、ＤＮＡ単離のため培養で増殖させた。ｈＥＰＯ生産の定量分析の結果は、２，５００ミリユニット／１００万細胞／２４時間であった。ｈＥＰＯエキソン５のＡｃｃＩ部位から３’非翻訳領域のＢｇｌII部位にのびる０．２ｋｂのＤＮＡプローブが、ＨＴ１６５−１８Ａ２−１０細胞から単離されたＲＮＡのプローブに用いられた。エキソン５のＡｃｃＩ部位で切断されたターゲティング構築物、ｐＸＥＰＯ−１３は、これらＡｃｃＩ／ＢｇｌII配列を有していないので、ｈＥＰＯ座のターゲティングには好適(diagnostic)である。天然ｈＥＰＯ配列が相同的に組み込まれた細胞株だけがＡｃｃＩ／ＢｇｌII配列と相同配列を含むｈＥＰＯｍＲＮＡを作るであろう。ＨＴ１６５−１８Ａ２−１０は、３２−ＰでラベルしたＡｃｃＩ／ＢｇｌIIｈＥＰＯプローブとハイブリダイズする、予期された大きさのｍＲＮＡを発現しているのがノーザンブロットにおいて認められた。制限酵素とサザンブロット分析により、ｎｅｏ遺伝子とｍＭＴ−ＩプロモーターはＨＴ１６５−１８Ａ２−１０細胞の２つのｈＥＰＯ対立遺伝子のうちの１つに対してターゲットされたことが確認された。これらの結果により、相同組み換えは、ヒト線維芽細胞中で通常サイレントである遺伝子へ調節領域をターゲットし、その遺伝子の機能を活性化させるのに用いることができることが示される。実施例５．イントロンレス遺伝子の作成ジーンターゲティングを利用して、遺伝子発現やイン・ビトロでのタンパク質製造に使用する酵母または細菌に導入する、イントロンが除かれた、プロセッシングを受けた遺伝子を作成することもできる。たとえば、以下に説明するアプローチにより酵母中でｈＧＨを製造することができる。２種類のターゲティング構築物を作成する。ターゲティング構築物１（ＴＣ１）は、たとえばモロニーネズミ白血病ウイルス（Moloney Murine Leukemia Viru s）（ＭｏＭＬＶ）由来ＬＴＲなどのレトロウイルスＬＴＲ配列、ヒト細胞中での選択のためのマーカー（たとえばＴｎ５由来ｎｅｏ遺伝子）、酵母中での選択のためのマーカー（たとえば酵母ＵＲＡ３遺伝子）、酵母中で遺伝子発現を指示する能力を有する調節領域（たとえばＧＡＬ４プロモーター）、および任意には、ｈＧＨ遺伝子と融合させると酵母細胞からのｈＧＨ分泌を可能にする配列（リーダー配列）を含む。このベクターは、ヒト細胞中でのレトロウイルスパッケージング（retroviral packaging）を可能ならしめるＤＮＡ配列も含んでいてよい。この構築物は、ゲノムｈＧＨ遺伝子Ｎ配列との相同組換えが起きるとｈＧＨ遺伝子Ｎコドン１（成熟したプロセシング済みのタンパク質のアミノ酸１位に対応）のすぐ上流のＴＣＩに上記外因性配列を取り込むｈＧＨゲノム配列が上記外因性配列の両側に隣接するように構成されている。取り込みの際のＤＮＡ配列の順序は、ｈＧＨ上流および調節配列、ｎｅｏ遺伝子、ＬＴＲ、ＵＲＡ３遺伝子、ＧＡＬ４プロモーター、酵母リーダー配列、成熟タンパク質のアミノ酸１とその下流のｈＧＨ配列である。ターゲティング構築物２（ＴＣ２）は、酵母中におけるプラスミド複製に充分な配列（たとえば２ミクロンのサークルまたはＡＲＳ配列）、酵母転写終止配列、ウイルスＬＴＲ、およびヒト細胞における選択のためのマーカー遺伝子（たとえば細菌ｇｐｔ遺伝子）を含む。この構築物は、ゲノムｈＧＨ遺伝子Ｎ配列との相同組換えが起きるとｈＧＨ遺伝子Ｎ終止コドンのすぐ下流のＴＣ２に上記外因性配列を取り込むｈＧＨゲノム配列がそれらの配列の両側に隣接するように構成されている。取り込みの際のＤＮＡ配列の順序は、ｈＧＨエキソン５配列、酵母転写終止配列、酵母プラスミド複製配列、ＬＴＲ、ｇｐｔ遺伝子、ｈＧＨ３’非翻訳配列である。ＴＣ１およびＴＣ２に由来する線状断片を、ｈＧＨ遺伝子に隣接するそれぞれの位置に連続的にターゲティングさせる。これらの細胞にヘルパーレトロウイルスを重複感染(superinfection)させた後、この領域全体のＬＴＲ特異的転写を行なうと、両端にＬＴＲ配列を有するＲＮＡができる。このＲＮＡをスプライシングすると、正常なｈＧＨイントロンが除去された分子が得られる。このプロセシング済み転写物の逆転写を行なうと、プロセシング済みｈＧＨ融合遺伝子の２本鎖ＤＮＡコピーが蓄積される。上記２重ターゲティング化レトロウイルス感染細胞からＤＮＡを単離し、ＬＴＲ内で転写ユニットを１回切断する酵素でこれを消化する。得られた消化物を、環状化促進条件下で連結し、酵母細胞に導入し、ついでＵＲＡ３遺伝子を指標に細胞を選択する。ＵＲＡ３遺伝子（ＴＣ１およびＴＣ２によって導入された配列とプロセシン愚済みｈＧＨ遺伝子に連結）を取り込んだ細胞だけが生育できる。これらの細胞は、ガラクトース誘導でｈＧＨタンパク質を発現するとともに、成熟した生物学的に活性なｈＧＨ分子を生成するために分泌時に切断される融合酵母リーダーペプチド配列によって細胞からｈＧＨタンパク質を分泌させるプラスミドを含んでいる。細菌細胞中での発現は、ＴＣ１およびＴＣ２中で、ｐＢＲ３２２由来アンピシリン耐性遺伝子を酵母ＵＲＡ３遺伝子と、ｔａｃプロモーター［デボエル（deBo er）ら、Proc ．Natl．Acad．Sci．80:21-25(1983)］を酵母ＧＡＬ４プロモーターと、細菌リーダー配列を酵母リーダー配列と、ｐＢＲ３２２複製起点を２ミクロンサークルまたはＡＲＳ配列と、および細菌転写終止配列［たとえばｔｒｐＡ転写終止配列；クリスティー（Christie，G.E.）ら、Proc ．Natl．Acad．Sci．7 8: 4180-4184(1981)］を酵母転写終止配列と置換するだけで達成される。同様に、ｈＥＰＯは、酵母または細菌リーダー配列がｈＥＰＯコドン１（成熟したプロセシング済みタンパク質のアミノ酸１位に対応）のすぐ上流に位置するようにｈＧＨターゲティング配列をｈＥＰＯターゲティング配列で置換するだけで、酵母及び細菌中での発現が可能になる。実施例６：不死化ヒト細胞系におけるＥＰＯ遺伝子の活性化と増幅ｄｈｆｒ発現ユニットをｐＸＥＰＯ−１３の唯一のＨｉｎｄＩＩＩ部位に組み込むと（実施例４参照）、二重選択能力を有する新規ターゲティングベクターが得られるとともに、ｄｈｆｒ遺伝子が増幅される場となる細胞の選択が可能となる。ｐＸＥＰＯ−１３に一つ存在するＨｉｎｄＩＩＩ部位が、ｎｅｏ遺伝子と通常はヒトＥＰＯ遺伝子の上流に存在するゲノム配列との結合部位を決定する。この部位にｄｈｆｒ遺伝子を挿入すると、ｎｅｏ遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子が天然ｈＥＰＯ座由来ＤＮＡ配列に囲まれた構築物が得られる。ｐＸＥＰＯ−１３と同様に、ｄｈｆｒ遺伝子が挿入された派生物は相同組換えによるｈＥＰＯ座へのターゲティングに有用である。ｐＲＥＰＯ４と呼ばれる上記構築物を図６に示す。このプラスミドは、ヒトＥＰＯ遺伝子のエキソン１−４およびエキソン５の一部、ならびにｈＥＰＯコード領域の上流に存在するＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を含んでいる。ｐＳＶｅ、ｐＴＫ、およびｐｍＭＴ−Ｉは、それぞれＳＶ４０早期領域、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、およびマウスメタロチオネイン−Ｉ遺伝子に由来するプロモーターに対応する。これは次のようにして作成した。ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＸＥＰＯ−１３を精製し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で平滑末端化した。ｄｈｆｒ発現ユニットを得るために、プラスミド構築物ｐＦ８ＣＩＳ９０８０［イートン（Eaton）ら、Biochemistry 25:8343-8347（1986）］をＥｃｏＲＩとＳａｌＩで消化した。この消化物からｄｈｆｒ発現ユニットを含有する２Ｋｂの断片を精製し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で平滑末端化した。次いで、このｄｈｆｒ含有断片をｐＸＥＰＯ−１３の平滑末端化ＨｉｎｄＩＩＩ部位につないだ。この連結物の一定量を大腸菌に形質転換させ、アンピシリン選択プレート上に移植した。３７℃で１晩インキュベーションした後、各細菌コロニーを観察、採取、培養した。これらの培養物からミニプラスミド調製物（miniplasmid preparations）を得、次いで、得られたＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩとＳｆｉＩで消化し、挿入ｄｈｆｒ断片の方向を求めた。これらの調製物のうち１つに由来するプラスミドＤＮＡは上記２Ｋｂのｄｈｆｒ挿入断片を含んでいることがわかった。このプラスミド中のｄｈｆｒ発現ユニットの転写方向は隣接するｎｅｏ遺伝子のものとは逆であることがわかった。この構築物をｐＲＥＰＯ４と命名する。プラスミドｐＲＥＰＯ４を用い、相同組換えによる内因性ｈＥＰＯ遺伝子の活性化を行なった後の細胞中でｈＥＰＯ座を増幅させた。この構築物による遺伝子活性化を行なうと、薬物メトトレキセート（ＭＴＸ）の使用によるＤＨＦＲ発現の増大を選択することが可能となる。通常、ＤＨＦＲ発現の増大は、ＤＮＡ増幅によるコピー数の増加によって起きる。その結果として、活性化ｈＥＰＯ遺伝子とｄｈｆｒ配列の共増幅が起きる。活性化されたＥＰＯ座が共増幅されると、ＥＰＯ発現が増大するはずである。ｐＲＥＰＯ４を保持するＨＴ１０８０細胞におけるターゲティング実験を行なった。ｈＥＰＯ発現細胞系株ＨＴＲＥＰＯ−５２を単離した。この細胞系のＥＰＯ産生を定量するとともに、サザンブロットおよびノーザンブロット分析を行なった。この株はｄｈｆｒ／ｎｅｏ／ｍＭＴ−１配列の１個のコピーでターゲティングされることがわかった。０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８存在下での選択で得られた発現レベルは細胞１００万個あたり約１３００ｍＵ／日であった。ターゲティングされたＥＰＯ座はｄｈｆｒ発現ユニットを有していたので、抗葉酸薬ＭＴＸを用いてＤＨＦＲ発現増大細胞を選択することが可能であった。そこで、この株について、ＭＴＸ濃度を０．０２、０．０５、０．１、０．２、および０．４ μＭと上昇させる段階的選択を行なった。この株の最初の選択の結果を表４と図７に示す。ＭＴＸ濃度上昇による選択は、ＨＴＲＥＰＯ−５２細胞系におけるｈＥＰＯ発現の増大に好結果をもたらし、０．４μＭのＭＴＸに耐性を示す細胞系においてＥＰＯ産生が７０倍増大した。ｈＥＰＯ座が増幅されたことの確認は、ＭＴＸ耐性細胞系におけるサザンブロット分析によって行ない、親の（未ターゲティング）ｈＥＰＯ対立遺伝子と比べて、活性化ｈＥＰＯ座のコピー数が約１０倍増加したことがわかった。実施例７：ゲノムｈＥＰＯコード化領域の１．８ＫＢ上流側の位置へのＣＭＶプロモーターの挿入によるｈＥＰＯ融合遺伝子の作成ターゲティングプラスミドｐＲＥＰＯ１５の構築まずＰＣＲ増幅でＣＭＶプロモーターをｈＧＨ第一エキソンに融合させることによってｐＲＥＰＯ１５を構築した。オリゴヌクレオチド２０と３５を用い、ゲンバンク（Genbank）配列ＨＵＭＧＨＣＳＡの５２２５位ヌクレオチドで始まり７３２２位ヌクレオチドで終わるｈＧＨ配列に融合させたゲンバンク配列ＨＳ５ＭＩＥＰの５４６位ヌクレオチドで始まり２１０５位ヌクレオチドで終わるＣＭＶプロモーター領域を有するｈＧＨ発現構築物ｐＸＧＨ３０８から、１．６ｋｂの断片を増幅した。オリゴ２０（３５ｂｐ）配列番号１８）はキャップ部位（ゲンバンク配列ＨＥＨＣＭＶＰ１の中に存在する）に対して−６１４の位置でＣＭＶプロモーターにハイブリダイズしたが、このものは５’末端にＳａｌＩ部位を含んでいた。オリゴ３５（４２ｂｐ、配列番号１９）は＋９６６の位置のＣＭＶプロモーターおよび隣接するｈＧＨエキソン１にアニールしたが、このものはｈＥＰＯイントロン１（スプライス供与部位の一部を含む）の最初の１０個の塩基対と５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を含んでいた。生じたＰＣＲ断片をＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで消化し、ゲル精製に付した。プラスミドｐＴ１６３（実施例２）をＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｎｅｏ発現ユニットを含む約１．１ｋｂの断片をゲル精製に付した。１．６ｋｂのＣＭＶプロモーター／ｈＧＨエキソン１／スプライス供与部位断片と１．２ｋｂのｎｅｏ断片を連結し、ｐＢＳＩＩＳＫ＋（Stratagene，Inc.）のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。生じた中間プラスミド（ｐＢＮＣＨＳと命名）は、ＣＭＶプロモーター／ｈＧＨエキソン１／スプライス供与部位断片の転写方向と逆の方向にｎｅｏ発現ユニットを含んでいた）。次いで、まずｐＲＥＰＯ５をＨｉｎｄＩＩＩで消化することによって第二の中間体ｐＲＥＰＯ５ΔＨｉｎｄＩＩＩを構築した。このものは１．９ｋｂと８．７ｋｂの２つの断片を遊離させたが、このＥＰＯターゲティング配列含有８．７ｋｂ断片をゲル精製に付し、セルフライゲーションによって環状化させた。生じたプラスミドｐＲＥＰＯ５ΔＨｉｎｄＩＩＩは、通常はｈＥＰＯ遺伝子の上流側に存在する非コード化ゲノムＤＮＡ配列のみを含んでいた。このものはＥＰＯエキソン１に対して−５７８６から−１の位置にある配列を含んでいた。ｎｅｏ、ＣＭＶプロモーター、ｈＧＨエキソン１、およびスプライス供与部位を含む２．８ｋｂの断片をＨｉｎｄＩＩＩでｐＢＮＣＨＳから切り出し、ゲル精製に付した。この断片をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片（New England Biolabs，Inc．）で平滑末端化させ、ＢｇｌＩＩ消化し平滑末端化させておいたｐＲＥＰＯ５ΔＨｉｎｄＩＩＩに連結した。ＢｇｌＩＩはｐＲＥＰＯ５ΔＨｉｎｄＩＩＩ中のｈＥＰＯエキソン１の上流側−１７７９ｂｐの位置で切断を行なう。生じた構築物ｐＲＥＰＯ１５（図８）は、ｈＥＰＯコード化領域に対して−５７８６から−１７７９の位置にあるＥＰＯ上流配列、ｎｅｏ発現ユニット、ＣＭＶプロモーター、ｈＧＨエキソン１、スプライス供与部位、およびｈＥＰＯコード化領域の上流側−１７７８から−１ｂｐの位置にある配列を含んでいたが、これらの要素はｈＥＰＯ上流領域のヌクレオチド配列に対して５’ から３’に向かう順序で組み込まれていた。ヒト細胞のトランスフェクトを行なうために、ｐＲＥＰＯ１５をＮｏｔＩとＰｖｕＩで消化して、８．６ｋｂのターゲティング断片を遊離させた。このターゲティング断片はそれぞれ４．０ｋｂと１．８ｋｂの第一および第二のターゲティング断片を含んでおり、ｈＥＰＯ遺伝子の上流側ＤＮＡに対して相同であった。ＥＰＯ発現被ターゲティングクローンの細胞培養、トランスフェクト、および同定すべての細胞を１０％仔ウシ血清含有ＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ／１０、HyClone La boratories）中、３７℃、５％ＣＯ₂、９８％湿度の条件に保った。ＰＢＳ（GIB CO）中、１２×１０⁶個の細胞を１００μｇのＤＮＡとともに２５０ボルト、９６０ｐＦにおけるエレクトロポーレーションに付すことによって、ヒト包皮線維芽細胞の二次細胞のトランスフェクトを行なった。処理した細胞を１５０ｍｍプレート１枚あたり１×１０⁶個の細胞密度でまいた。翌日、培地を０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（GIBCO）を含むＤＭＥＭ／１０と交換した。１４日間にわたり選択を続けた時点で、培地試料を採取してＥＰＯ産生を調べた。ＥＰＯＥＬＩＳＡ（Genzyme Inc.）による測定で有意な（＞５ｍＵ／ｍｌ）ｈＥＰＯレベルを示したプレート上のすべてのコロニーをクローニング用無菌ガラスシリンダー（Bellco）を用いて単離し、９６穴プレートの各ウエルに移した。１〜２日間保温した後、これらのウエルにおけるｈＥＰＯ産生をＥＬＩＳＡで調べた。得られたｈＥＰＯ産生細胞株を培養し、凍結、核酸単離、およびＥＰＯ産生量測定に付した。ＰＢＳ（GIBCO）中、１２×１０⁶個の細胞を４５μｇのＤＮＡとともに４５０ボルト、２５０μＦで処理することによって、ＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１２１）のトランスフェクトを行なった。上記のヒト包皮線維芽細胞の二次細胞の場合と同様にクローンの培養と同定を行なった。ｈＥＰＯ産生クローン細胞系の単離は限界希釈法によって行なった。すなわち、まず２４穴プレートのウエル１個あたり１０〜１５個のコロニーをプールした状態の一次選択プレートから集めたコロニーを移すことにより行った。ｈＥＰＯ産生プールを、次いで、ウエル１個あたり１個未満のコロニー数となる細胞密度で９６穴プレートに移した。上記のヒト包皮線維芽細胞の場合と同様に各クローンを培養してさらに分析した。ＥＰＯ発現クローンのキャラクタライゼーションｐＲＥＰＯ１５はｈＥＰＯコード化配列を欠いている。ｈＥＰＯエキソン１の上流側にあるｎｅｏ／ＣＭＶプロモーター／ｈＧＨエキソン１／スプライス供与断片をターゲティングすると、ＣＭＶプロモーターからの転写開始によってｈＥＰＯ発現が起き、ＣＭＶ配列、ｈＧＨエキソン１およびスプライス供与部位、１．８ｋｂの上流ｈＥＰＯ配列、および正常ｈＥＰＯエキソン、イントロン、および３’非翻訳配列を含む一次転写物が生成する。この転写物のスプライシングは、ｈＧＨエキソン１に隣接するスプライス供与部位から、ｈＥＰＯエキソン２に隣接する位置にある次の下流側スプライス受容部位にかけて起きる。その結果、ｈＥＰＯ遺伝子の上流側にあるゲノム配列、正常ｈＥＰＯプロモーター、ｈＥＰＯエキソン１、およびｈＥＰＯイントロン１から成る新規イントロンが効果的に生成する。この成熟転写物中では、ｈＧＨエキソン１がｈＥＰＯエキソン１に置換する。ｈＥＰＯエキソン１は、２６個のアミノ酸から成るシグナルペプチドの最初の４つと３分の１のアミノ酸だけをコードするものであり、そのシグナルペプチドは細胞から分泌される前に前駆体タンパク質から切断される。ｈＧＨエキソン１は、やはり細胞から分泌される前に前駆体タンパク質から切断されるｈＧＨシグナルペプチドの、最初の３つと３分の１のアミノ酸をコードする。したがって、ｈＧＨエキソン１がｈＥＰＯエキソン１に置換するメッセージが翻訳されると、シグナルペプチドがｈＧＨ配列とｈＥＰＯ配列のキメラであるタンパク質が生成する。通常の翻訳後切断事象によってシグナルペプチドが除去されると、一次配列が正常産物と区別できない成熟ｈＥＰＯ分子ができる。ｐＲＥＰＯ１５をヒト線維芽細胞にトランスフェクトしたところ、これらの細胞によるＥＰＯ発現が起きた。表５に、ヒト線維芽細胞およびＨＴ１０８０細胞におけるｐＲＥＰＯ１５によるターゲティング実験の結果を示す。正常ヒト線維芽細胞におけるターゲティング頻度はＧ４１８^rコロニー２６４個あたり１回であることがわかり、ＨＴ１０８０細胞の場合のターゲティング頻度はＧ４１８^rコロニー４５０個あたり１回であることがわかった。これらの細胞株のそれぞれからのｈＥＰＯ産生レベルを測定した。ヒト線維芽細胞のトランスフェクトで得られたｈＥＰＯ産生細胞(producer)は７，６７９ｍＵ／１０⁶細胞／日を分泌することがわかった（表５）。ＨＴ１０８０細胞由来の活性化ｈＥＰＯ細胞系は１２，５８２ｍＵ／１０⁶細胞／日を産生していることがわかった（表５）。これらの結果は、ｈＥＰＯ座位の活性化が効果的に起き、そして比較的高レベルのｈＥＰＯの産生を構造的に引き起こしたことを示すものであった。制限酵素分析とサザンハイブリダイゼーション分析を利用して、ＥＰＯ座位でターゲティング事象が起きたことを確認した。ｐＲＥＰＯ１５でターゲティングを行なった、ヒト線維芽細胞クローンとＨＴ１０８０クローンのサザンブロット分析を行なった。図９Ａは元のｈＥＰＯ座位とターゲティング後のｈＥＰＯ座位の制限酵素地図を示し、図９Ｂはターゲティング後のヒト線維芽細胞クローンの制限酵素分析とサザンハイブリダイゼーション分析の結果を示したものである。Ｂｇ１ＩＩ／ＥｃｏＲＩ消化物とＢａｍＨＩ消化物は、ｈＥＰＯ座位におけるターゲティング事象の結果、それぞれ５．９ｋｂと６．６ｋｂの断片になった（レーンＴ１）。これらの断片はどちらも、ｎｅｏ遺伝子およびＣＭＶプロモーター配列を含む２．７ｋｂのＤＮＡの挿入によって生じたものである。２つのｈＥＰＯ対立遺伝子のうちの一方だけがターゲティングされたので、変化を受けなかったｈＥＰＯ座位を反映する４．３ｋｂ（ＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩ）の断片または１０．６ｋｂ（ＢａｍＨＩ）の断片がこれらの細胞株および元のＤＮＡの中に見られた（レーンＨＦ）。これらの結果は、ｈＥＰＯ座位で相同組み換え事象が起きた結果、ヒトエリスロポエチンの産生を引き起こす新規転写ユニットの生成がもたらされたことを確認するものである。ａ二つのプレートのコロニーを数え、その結果を平均し、そして全プレートについて推定することにより評価を行ったｂ G418^rコロニーを有するプレートの培地からサンプルを採取し、EPO ELISAS 分析に付した。そして5mU/mlより多いレベルのhEPOを示すコロニーをEPO活性化事象として数えたｃ hEPOの産生量は、ヒト線維芽細胞株HF342-15又はHT1080細胞系HTREPO15-1-1 -6から求めた実施例８：ゲノムｈＥＰＯコード化領域の１．８ｋｂ上流側の位置へのＣＭＶプロモーターの挿入によるｈＥＰＯ融合遺伝子の作成と増幅ターゲティングプラスミドｐＲＥＰＯ１８の構築ｐＲＥＰＯ１５のｎｅｏ遺伝子の５’末端に位置するＣｌａＩ部位にｄｈｆｒ発現ユニットを挿入することによって、ｐＲＥＰＯ１８（図１０）を構築した。ｄｈｆｒ発現ユニットを得るために、プラスミド構築物ｐＦ８ＣＩＳ９０８０［イートンら（Eaton et al.）、Biochemistry 25:8343-8347(1986)］をＥｃｏＲＩとＳａｌＩで消化した。ｄｈｆｒ発現ユニットを含む２ｋｂの断片をこの消化物から精製し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で処理することによって平滑末端化させた。次いで、ＣｌａＩリンカー（New England Biolabs）をこの平滑末端化ｄｈｆｒ断片に連結した。次いで、このライゲーションの産物をＣｌａＩで消化し、ＣｌａＩ消化ｐＲＥＰＯ１５に連結した。この連結物の一定量を大腸菌に形質転換させ、アンピシリン選択プレート上で平板培養した。細菌コロニーを制限酵素消化によって分析して、挿入ｄｈｆｒ断片の方向を決定した。ｎｅｏ遺伝子の転写方向と逆の方向のｄｈｆｒを有する１つのプラスミドをｐＲＥＰＯ１８（−）と命名した。ｎｅｏ遺伝子の転写方向と同じ方向のｄｈｆｒを有する第二のプラスミドをｐＲＥＰＯ１８（＋）と命名した。ＥＰＯ発現被ターゲティングクローンの細胞培養、トランスフェクト、および同定すべての細胞を１０％仔ウシ血清含有ＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ／１０、HyClone La boratories）中、３７℃、５％ＣＯ₂、９８％湿度の条件に保った。ＰＢＳ（GIB CO）中、１２×１０⁶個の細胞を４５μｇのＤＮＡとともに４５０ボルト、２５０μＦで処理することによって、ＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ１２１）のトランスフェクトを行なった。処理した細胞を１５０ｍｍプレート１枚あたり１×１０⁶個の細胞密度でまいた。翌日、培地を０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（G IBCO）を含むＤＭＥＭ／１０と交換した。１４日間にわたり選択を続けた時点で、培地試料を採取してｈＥＰＯ産生を調べた。ｈＥＰＯＥＬＩＳＡ（Genzyme Inc.）による測定で有意な（＞５ｍＵ／ｍｌ）ｈＥＰＯ産生レベルを示したプレートをトリプシン処理し、細胞を再び平板培養してクローンを単離した。ｈＥＰＯ産生クローン細胞系の単離は限界希釈法によって行なった。即ち、まずウエル１個あたり１０〜１５個のコロニーをプールした状態で２４穴プレートにクローンを置き、次いで、ｈＥＰＯ産生プール由来の細胞を、ウエル１個あたり１個未満のコロニー数となる細胞密度で９６穴プレートに移した。各クローンを培養し、凍結、核酸単離、およびｈＥＰＯ産生量測定に付した。メトトレキセート選択による増幅ｄｈｆｒ配列含有細胞の単離ｐＲＥＰＯ１８によるトランスフェクトを受けた後のｈＥＰＯ産生被ターゲティングＧ４１８^r細胞系を様々な細胞密度で平板培養し、メトトレキセート（ＭＴＸ）中の選択を行なった。１つのＭＴＸ濃度における選択後に新規クローンが出現したので、ｈＥＰＯ産生測定に付し、より高いＭＴＸ濃度（通常は前濃度の２倍）で様々な細胞密度で再び平板培養を行なった。目的のｈＥＰＯ産生レベルに到達するまでこのプロセスを繰り返した。ＭＴＸ抵抗性の各段階において、ＤＮＡとＲＮＡを単離し、それぞれサザンブロット分析とノーザンブロット分析に付した。ＥＰＯ発現クローンのキャラクタライゼーションｄｈｆｒ方向が２通りに異なるｐＲＥＰＯ１８をＨＴ１０８０細胞にトランスフェクトさせた。トランスフェクトに先立ち、ｐＲＥＰ０１８（＋）とｐＲＥＰＯ１８（−）をＸｂａＩで消化し、ｈＥＰＯエキソン１の上流側のゲノムＤＮＡの２．１ｋｂの領域（ｈＥＰＯＡＴＧ開始コドンに対して−３８９１から−１７７９）、ｄｈｆｒ遺伝子を含む２ｋｂの領域、ｎｅｏ遺伝子を含む１．１ｋｂの領域、ｈＧＨエキソン１に融合させたＣＭＶプロモーターを含む１．５ｋｂの領域、ｈＥＰＯイントロン１（スプライス供与部位を含む）の１０ｂｐ、およびｈＥＰＯエキソン１の上流側のゲノムＤＮＡの１．１ｋｂの領域（ＥＰＯＡＴＧ開始コドンに対して−１７７８から−６７８）をこの順序で含む７．９ｋｂのターゲティング断片を得た。２つの実験で見られたトランスフェクト頻度とターゲティング頻度を表６に示す。これらの実験で、５つの一次Ｇ４１８^rクローンが単離された。これらを培養し、ｈＥＰＯ発現の定量分析を行なった（表７）。ｐＲＥＰＯ１８はｄｈｆｒ遺伝子を含んでいたので、実施例６と同様にＭＴＸを用いてターゲティング構築物の増幅コピーを含む細胞を選択することができる。制限酵素分析とサザンハイブリダイゼーション分析によってｈＥＰＯ座位におけるターゲティングが確認されたＧ４１８^rクローンを上記と同様にＭＴＸの段階的選択に付した。実施例９：不死化ヒト細胞における内因性α−インターフェロン遺伝子、ＧＭ− ＣＳＦ遺伝子、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子、およびＦＳＨβ遺伝子の活性化と増幅本発明の方法とＤＮＡ構築物を用いて様々な内因性細胞遺伝子を活性化させ、増幅することができる。以下、ヒトα−インターフェロン（白血球インターフェロン）遺伝子、ＧＭ−ＣＳＦ（コロニー刺激因子−顆粒球／マクロファージ）遺伝子、Ｇ−ＣＳＦ（コロニー刺激因子−顆粒球）遺伝子、およびＦＳＨβ（ろ胞刺激ホルモンベータサブユニット）遺伝子を活性化させ増幅する一般的な方法について説明する。α−インターフェロンヒトα−インターフェロン遺伝子（ゲンバンク配列ＨＵＭＩＦＮＡＡ）は、２３個のアミノ酸から成るシグナルペプチドを含む１８８個のアミノ酸から成る前駆体タンパク質をコードする。この遺伝子はイントロンを含んでいない。図１１は、α−インターフェロン遺伝子を活性化する１つの方法の概要を示したものである。ターゲティング構築物は、遺伝子の上流側の配列に対して相同な第一のターゲティング配列、増幅マーカー遺伝子、選択マーカー遺伝子、調節領域、ＣＡＰ部位、スプライス供与部位、イントロン、スプライス受容部位、および第一のターゲティング配列の下流側の配列に対応する第二のターゲティング配列を含んでいる。不要なＡＴＧ開始コドンの生成を防止するために、第二のターゲティング配列は正常開始コドンに対して−１０７の位置より上流側に伸びてはならない。この方法では、第一と第二のターゲティング配列は正常ターゲット遺伝子中で互いに直接隣接しているが、これは必要条件ではない（以下参照）。以下、選択に適した増幅マーカー遺伝子と選択マーカー遺伝子について説明する。増幅マーカー遺伝子と選択マーカー遺伝子は同じ遺伝子であってよく、それらの位置は逆であってもよく、一方または両方がターゲティング構築物のイントロン中に位置していてもよい。選択マーカー遺伝子は任意に使用され、増幅マーカー遺伝子は増幅を行なおうとするときに限って必要である。特定のＣＡＰ部位を組み込んでもよい。また、別の遺伝子に由来するエキソン配列をターゲティング構築物中のスプライス受容部位の３’側、および第二のターゲティング配列の５’側に組み込むこともできる。ヒト伸張因子−１α（ＥＦ−１α；ゲンバンク配列ＨＵＭＥＦ１Ａ）遺伝子またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ；ゲンバンク配列ＨＥＨＣＭＶＰ１）直接早期(immediate early)領域から、調節領域、ＣＡＰ部位、スプライス供与部位、イントロン、およびスプライス受容部位を１つの完全ユニットとして単離することができるが、異なる遺伝子から単離した適当な成分からこれらの成分を構築してもよい。ターゲティング配列として使用するためのα−インターフェロン遺伝子の上流側領域に対応するゲノムＤＮＡ、およびターゲティング構築物の構築は、当該分野に熟練せる者にとって公知の組み換えＤＮＡ技術を用いて実施することができる。本明細書で説明するように、複数の選択マーカーおよび増幅マーカーをターゲティング構築物中に使用することができ、その活性化と増幅は多数の細胞型において実施可能である。一次、二次、または不死化ヒト細胞のトランスフェクト、およびα−インターフェロン発現相同組み換え細胞の単離は、ヒトα−インターフェロン用ＥＬＩＳＡ測定（Biosourc e International，Camarillo，CA）を用いて実施例４の方法によって実施することができる。あるいは、実施例１ｇおよび１ｊと同様にＰＣＲスクリーニングによって相同組み換え細胞を同定してもよい。増幅マーカー遺伝子の増幅コピーと活性化α−インターフェロン座位を含む細胞の単離は、実施例６の方法に従い実施される。上記相同組み換え細胞中では、外因性エキソン、スプライス供与部位、イントロン、スプライス受容部位、第二のターゲティング配列、およびヒトα−インターフェロンコード化領域ならびに３’非翻訳配列を含むｍＲＮＡ前駆体が産生される（図１１）。このメッセージがスプライシングされると、ヒトα−インターフェロンを産生するように翻訳されうる機能性ｍＲＮＡが生成する。イントロンのサイズ、したがって遺伝子のコード化領域に対する調節領域の相対的位置を変えて、調節領域の機能の最適化を図ることができる。複数のエキソンがターゲティング構築物中に存在してもよい。また、正常遺伝子の正常上流側領域の一部が相同組み換えによって欠失されるような、その遺伝子中の第一のターゲティング配列に、第二のターゲティング配列が、直接隣接していたりその付近に存在している必要はない。ＧＭ−ＣＳＦヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子（ゲンバンク配列ＨＵＭＧＭＣＳＦＧ）は、１７個のアミノ酸から成るシグナルペプチドを含む１４４個のアミノ酸から成る前駆体タンパク質をコードする。この遺伝子は４つのエキソンと３つのイントロンを含み、前駆体のＮ末端の５０個のアミノ酸は第一のエキソン中でコードされている。図１２は、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を活性化する方法の概要を示したものである。この方法においては、ターゲティング構築物は、遺伝子の上流側の配列に対して相同な第一のターゲティング配列、増幅マーカー遺伝子、選択マーカー遺伝子、調節領域、ＣＡＰ部位、ＧＭ−ＣＳＦの最初の５０個のアミノ酸の配列と同一または機能的に同等なアミノ酸配列をコードするエキソン、スプライス供与部位、および第一のターゲティング配列の下流側の配列に対応する第二のターゲティング配列を含むように設計される。この方法により、相同組み換え細胞は、外因性エキソンとスプライス供与部位、第二のターゲティング配列、第二のターゲティング配列とＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の開始コドンの間にあるすべての配列、およびＧＭ −ＣＳＦ遺伝子のエキソン、イントロン、および３’非翻訳領域に対応するｍＲＮＡ前駆体を産生する（図１１）。このメッセージがスプライシングされると、翻訳されるとＧＭ−ＣＳＦを産生する内因性ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子のエキソン２に外因性エキソンが融合される。この方法では、第一と第二のターゲティング配列は正常ターゲット遺伝子中で直接隣接しているが、これは必要条件ではない（以下参照）。以下、選択に適した増幅マーカー遺伝子と選択マーカー遺伝子について説明する。増幅マーカー遺伝子と選択マーカー遺伝子は同じ遺伝子であってもよく、それらの位置は逆であってもよい。選択マーカー遺伝子は任意に使用され、増幅マーカー遺伝子は増幅を行なおうとするときに限って必要である。選択マーカーおよび／または増幅マーカーはターゲティング構築物中のスプライス供与部位と第二のターゲティング配列の間に置くことができる。特定のＣＡＰ部位を組み込んでもよい。ヒト伸張因子−１α（ＥＦ−１α；ゲンバンク配列ＨＵＭＥＦ１Ａ）遺伝子またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ；ゲンバンク配列ＨＥＨＣＭＶＰ１）直接早期領域から、調節領域、ＣＡＰ部位、およびスプライス供与部位を１つの完全ユニットとして単離することができるが、異なる遺伝子から単離した適当な成分（ｍＭＴ−１プロモーターとＣＡＰ部位、およびｈＧＨまたはｈＥＰＯ遺伝子由来のエキソン１とスプライス供与部位などからこれらの成分を構築してもよい。他のアプローチを用いることも可能であり、たとえば第一と第二のターゲティング配列をＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の第一のイントロン中の配列に対応させることができる。あるいは、α−インターフェロンの場合に説明したターゲティング構築物と同様の構築物を使用することができ、この場合、ターゲティング構築物は、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の上流側の配列に対して相同な第一のターゲティング配列、増幅マーカー遺伝子、選択マーカー遺伝子、調節領域、ＣＡＰ部位、スプライス供与部位、イントロン、スプライス受容部位、および第一のターゲティング配列の下流側の配列に対応する第二のターゲティング配列を含むように設計される。いずれにせよ、正常遺伝子の正常上流側領域の一部が相同組み換えによって欠失されるような、その遺伝子中の第一のターゲティング配列に、第二のターゲティング配列が直接隣接していたりその付近に存在している必要はない。また、複数の非コード化エキソンまたはコード化エキソンがターゲティング構築物中に存在してもよい。ターゲティング配列として使用するためのヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の上流側またはイントロン領域に対応するゲノムＤＮＡおよびターゲティング構築物の構築は、当該分野に熟練せる者にとって公知の組み換えＤＮＡ技術を用いて実施することができる。本明細書で説明するように、複数の選択マーカーおよび増幅マーカーをターゲティング構築物中に使用することができ、その活性化は多数の細胞型において実施可能である。一次、二次、または不死化ヒト細胞のトランスフェクト、およびＧＭ−ＣＳＦ発現相同組み換え細胞の単離は、ヒトＧＭ−ＣＳＦ用ＥＬＩＳＡ測定（R&D Systems，Minneapolis，MN）を用いて実施例４の方法によって実施することができる。あるいは、上記と同様にＰＣＲスクリーニングによって相同組み換え細胞を同定してもよい。増幅マーカー遺伝子の増幅コピーと活性化ＧＭ−ＣＳＦ座位を含む細胞の単離は、上記方法に従い実施される。Ｇ−ＣＳＦヒトＧ−ＣＳＦ遺伝子（ゲンバンク配列ＨＵＭＧＣＳＦＧ）は、３０個のアミノ酸から成るシグナルペプチドを含む２０４〜２０７個のアミノ酸から成る前駆体タンパク質をコードする。この遺伝子は５つのエキソンと４つのイントロンを含む。第一のエキソンはシグナルペプチドの１３個のアミノ酸をコードしている。図１３は、Ｇ−ＣＳＦ遺伝子を活性化する方法の概要を示したものである。ターゲティング構築物は、遺伝子の上流側の配列に対して相同な第一のターゲティング配列、増幅マーカー遺伝子、選択マーカー遺伝子、調節領域、ＣＡＰ部位、Ｇ−ＣＳＦシグナルペプチドの最初の１３個のアミノ酸の配列と同一または機能的に同等なアミノ酸配列をコードするエキソン、スプライス供与部位、および第一のターゲティング配列の下流側の配列に対応する第二のターゲティング配列を含むように設計される。この方法により、相同組み換え細胞は、外因性エキソンとスプライス供与部位、第二のターゲティング配列、第二のターゲティング配列とＧ−ＣＳＦ遺伝子の開始コドンの間にあるすべての配列、およびＧ−ＣＳＦ遺伝子のエキソン、イントロン、および３’非翻訳領域に対応するｍＲＮＡ前駆体を産生する（図１３）。このメッセージがスプライシングされると、翻訳されるとＧ−ＣＳＦを産生するようになる内因性Ｇ−ＣＳＦ遺伝子のエキソン２に外因性エキソンが融合される。正常Ｇ−ＣＳＦシグナルペプチドの最初の１３個のアミノ酸を外因性エキソン中に存在するアミノ酸と機能的に置換することができれば、シグナルペプチドを修飾することができ、したがって産生されるタンパク質の分泌性を変化させることができる。この方法では、第一と第二のターゲティング配列は正常ターゲット遺伝子中で直接隣接しているが、これは必要条件ではない。正常遺伝子の正常上流側領域の一部が相同組み換えによって欠失されるような、その遺伝子中の第一のターゲティング配列に、第二のターゲティング配列が直接隣接していたりその付近に存在している必要はない。増幅マーカー遺伝子と選択マーカー遺伝子は同じ遺伝子であってもよく、それらの位置は逆であってもよい。選択マーカー遺伝子は任意に使用され、増幅マーカー遺伝子は増幅を行なおうとするときに限って必要である。選択マーカーおよび／または増幅マーカーはターゲティング構築物中のスプライス供与部位と第二のターゲティング配列の間に置くことができる。特定のＣＡＰ部位を組み込んでもよい。ヒト伸張因子−１α（ＥＦ−１α；ゲンバンク配列ＨＵＭＥＦ１Ａ）遺伝子またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ；ゲンバンク配列ＨＥＨＣＭＶＰ１）直接早期領域から、調節領域、ＣＡＰ部位、およびスプライス供与部位を１つの完全ユニットとして単離することができるが、異なる遺伝子から単離した適当な成分（ｍＭＴ−１プロモーターとＣＡＰ部位、およびｈＧＨまたはＥＰＯ遺伝子由来のエキソン１とスプライス供与部位など）からこれらの成分を構築してもよい。スプライシングを受けると成熟タンパク質と同じ枠内に入るＡＴＧ開始コドンがエキソンの１つに含まれていれば、複数のコード化または非コード化外因性エキソンをターゲティング構築物中に使用することができる。他のアプローチを用いることも可能であり、たとえば第一と第二のターゲティング配列をＧ−ＣＳＦ遺伝子の第一のイントロン中の配列に対応させることもできる。あるいは、α−インターフェロンの場合に説明したターゲティング構築物と同様の構築物を使用することができ、この場合、ターゲティング構築物は、Ｇ −ＣＳＦ遺伝子の上流側の配列に対して相同な第一のターゲティング配列、増幅マーカー遺伝子、選択マーカー遺伝子、調節領域、ＣＡＰ部位、スプライス供与部位、イントロン、スプライス受容部位、および第一のターゲティング配列の下流側の配列に対応する第二のターゲティング配列を含むように設計される。ターゲティング配列として使用するためのヒトＧ−ＣＳＦ遺伝子の上流側またはイントロン領域に対応するゲノムＤＮＡおよびターゲティング構築物の構築は、当該分野に熟練せる者にとって公知の組み換えＤＮＡ技術を用いて実施することができる。本明細書で説明するように、複数の選択マーカーおよび増幅マーカーをターゲティング構築物中に使用することができ、その活性化は多数の細胞型において実施可能である。一次、二次、または不死化ヒト細胞のトランスフェクト、およびＧ−ＣＳＦ発現相同組み換え細胞の単離は、ヒトＧ−ＣＳＦ用ＥＬＩＳＡ測定（R&D Systems，Minneapolis，MN）を用いて実施例４の方法によって実施することができる。あるいは、上記と同様にＰＣＲスクリーニングによって相同組み換え細胞を同定してもよい。増幅マーカー遺伝子の増幅コピーと活性化α −インターフェロン座位を含む細胞の単離は、上記方法に従い実施される。ＦＳＨβ ヒトＦＳＨβ遺伝子（ゲンバンク配列ＨＵＭＦＳＨ１）は、１６個のアミノ酸から成るシグナルペプチドを含む１２９個のアミノ酸から成る前駆体タンパク質をコードする。この遺伝子は３つのエキソンと２つのイントロンを含み、第一のエキソンは非コード化エキソンである。ＦＳＨβの活性化はいくつかの方法によって実施できる。１つの方法を図１４に示す。この方法では、ターゲティング構築物は、遺伝子の上流側の配列に対して相同な第一のターゲティング配列、増幅マーカー遺伝子、選択マーカー遺伝子、調節領域、ＣＡＰ部位、エキソン、スプライス供与部位、および第一のターゲティング配列の下流側の配列に対応する第二のターゲティング配列を含むように設計される。この方法により、相同組み換え細胞は、外因性エキソンとスプライス供与部位、第二のターゲティング配列、第二のターゲティング配列とＦＳＨβ遺伝子の開始コドンの間にあるすべての配列、およびＦＳＨβ遺伝子のエキソン、イントロン、および３’非翻訳領域に対応するｍＲＮＡ前駆体を産生する（図１４）。このメッセージがスプライシングされると、翻訳されたときにＦＳＨβを産生しうる内因性ＦＳＨβ遺伝子のエキソン２に外因性エキソンが融合される。この方法では、第一と第二のターゲティング配列は正常ターゲット遺伝子中で直接隣接しているが、これは必要条件ではない（以下参照）。他のアプローチを用いることも可能であり、たとえば第一と第二のターゲティング配列をＦＳＨβ遺伝子の第一のイントロン中の配列に対応させることができる。あるいは、α−インターフェロンの場合に説明したターゲティング構築物と同様の構築物を使用することができる。この方法においては、ターゲティング構築物は、ＦＳＨβ遺伝子の上流側の配列に対して相同な第一のターゲティング配列、増幅マーカー遺伝子、選択マーカー遺伝子、調節領域、ＣＡＰ部位、スプライス供与部位、イントロン、スブライス受容部位、および第一のターゲティング配列の下流側の配列に対応する第二のターゲティング配列を含むように設計される。不要なＡＴＧ開始コドンの生成を防止するために、第二のターゲティング配列は正常ＦＳＨβ転写開始部位に対して−４０の位置より上流側に伸びてはならない。上記相同組み換え細胞中では、外因性エキソン、スプライス供与部位、イントロン、スプライス受容部位、第二のターゲティング配列、およびヒトＦＳＨβコード化エキソン、イントロン、および３’非翻訳配列を含むｍＲＮＡ前駆体が産生される。このメッセージがスプライシングされると、ヒトＦＳＨβを産生するよう翻訳されうる機能性ｍＲＮＡが生成する。イントロンのサイズ、したがって遺伝子のコード化領域に対する調節領域の相対的位置を変えて、調節領域の機能の最適化を図ることができる。いずれの活性化方法においても、相同組み換えによって正常遺伝子の正常上流側領域の一部が欠失されるような、その遺伝子中の第一のターゲティング配列に、第二のターゲティング配列が直接隣接していたりその付近に存在している必要はない。さらに、１つのターゲティング配列が遺伝子の上流側に存在し、もう１つがＦＳＨβ遺伝子のエキソンまたはイントロンの中にあってもよい。増幅マーカー遺伝子と選択マーカー遺伝子は同じ遺伝子であってもよく、それらの位置は逆であってもよく、一方または両方がターゲティング構築物のイントロン中に置かれていてもよい。以下、選択に適した増幅マーカー遺伝子と選択マーカー遺伝子について説明する。選択マーカー遺伝子は任意に使用され、増幅マーカー遺伝子は増幅を行なおうとするときに限って必要である。特定のＣＡＰ部位を組み込んでもよい。また、別の遺伝子に由来するエキソン配列をターゲティング構築物中のスプライス受容部位の３’側、および第二のターゲティング配列の５’側に組み込むこともできる。ヒト伸張因子−１ α（ＥＦ−１α；ゲンバンク配列ＨＵＭＥＦ１Ａ）遺伝子またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ；ゲンバンク配列ＨＥＨＣＭＶＰ１）直接早期領域から、調節領域、ＣＡＰ部位、エキソン、スプライス供与部位、イントロン、およびスプライス受容部位を１つの完全ユニットとして単離することができるが、異なる遺伝子から単離した適当な成分からこれらの成分を構築してもよい。いずれにせよ、外因性エキソンは正常ＦＳＨβ遺伝子の第一のエキソンと同じでものであっても異なるものであってもよく、複数のエキソンがターゲティング配列中に存在していてもよい。ターゲティング配列として使用するためのＦＳＨβ遺伝子の上流側領域に対応するゲノムＤＮＡおよびターゲティング構築物の構築は、当該分野に熟練せる者にとって公知の組み換えＤＮＡ技術を用いて実施することができる。本明細書で説明するように、複数の選択マーカーおよび増幅マーカーをターゲティング構築物中に使用することができ、その活性化は多数の細胞型において実施可能である。所望により、活性化ＦＳＨβ遺伝子の産物を、ＦＳＨβ遺伝子の産物とヘテロダイマーを形成する産物を生じるヒト糖タンパク質α−サブユニットを発現する細胞型の中で産生させてもよい。この細胞型は天然の細胞株または細胞系であってよい。あるいは、ヒト糖タンパク質α−サブユニット遺伝子（ゲンバンク配列ＨＵＭＧＬＹＣＡ１）をＦＳＨβ遺伝子の産物と共発現させてもよく、その場合、ヒト糖タンパク質α−サブユニット遺伝子またはｃＤＮＡを適当なプロモーターの支配下で発現させるか、ヒト糖タンパク質α−サブユニット遺伝子を本明細書で説明する方法で活性化させることによって共発現を実施することができる。一次、二次、または不死化ヒト細胞のトランスフェクト、およびＦＳＨβ発現相同組み換え細胞の単離は、ヒトＦＳＨβ用ＥＬＩＳＡ測定（Accurate Chemical and Scientific，Westbury ，NY）を用いて上記方法によって実施することができる。あるいは、上記と同様にＰＣＲスクリーニングによって相同組み換え細胞を同定してもよい。増幅マーカー遺伝子の増幅コピーと活性化α−インターフェロン座位を含む細胞の単離は、上記方法に従い実施される。均等物当該技術分野における熟練せる者は、定型的実験に過ぎないものを用いて、本明細書において具体的に記載された本発明の具体的態様に対する多くの均等物を認識し、確認することができるであろう。このような均等物は以下の請求の範囲に包含されるべきものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/00 ＣＣ１２Ｐ 21/00 9455−4ＣＡ６１Ｋ 39/395 Ａ // Ａ６１Ｋ 38/00 9735−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ 38/21 9735−4ＢＣ 38/22 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/465 38/27 9051−4Ｃ 37/24 38/28 9051−4Ｃ 37/36 38/43 9051−4Ｃ 37/02 39/395 9051−4Ｃ 37/66 Ｚ (Ｃ１２Ｐ 21/00 9051−4Ｃ 37/26 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ハートレイン，ミカエルダブリュウ. アメリカ合衆国マサチューセッツ 01719 ボックスボロー，リードファームロード 167 (72)発明者セルデン，リチャードエフ. アメリカ合衆国マサチューセッツ 02181 ウェルズレイ，ブリストルロード 106

Claims

【特許請求の範囲】１．細胞の染色体ＤＮＡへ挿入した場合に、ターゲット遺伝子の発現を変化させ得るＤＮＡ構築物であって、（ａ）ターゲティング配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エキソン、及び（ｄ）対になっていない（unpaired）スプライス供与部位、を含有してなるＤＮＡ構築物。２．エキソンがキャップ（ＣＡＰ）部位を含有してなる請求項１記載のＤＮＡ構築物。３．エキソンがヌクレオチド配列ＡＴＧをさらに含有してなる請求項２記載のＤＮＡ構築物。４．エキソンがターゲット遺伝子とイン・フレーム（in-frame）であるコード化ＤＮＡをさらに含有してなる請求項３記載のＤＮＡ構築物。５．エキソンのコード化ＤＮＡが、ターゲット遺伝子の第１エキソンのコード化ＤＮＡと同一である請求項４記載のＤＮＡ構築物。６．エキソンのコード化ＤＮＡが、ターゲット遺伝子の第１エキソンのコード化ＤＮＡと異なる請求項４記載のＤＮＡ構築物。７．ターゲティング配列が、ターゲット遺伝子内の配列と相同性を有する請求項４記載のＤＮＡ構築物。８．ターゲティング配列が、ターゲット遺伝子のコード領域の上流配列と相同性を有する請求項４記載のＤＮＡ構築物。９．ターゲティング配列が、ターゲット遺伝子の内因性調節配列の上流配列と相同性を有する請求項４記載のＤＮＡ構築物。１０．構築物が、ターゲット遺伝子内の配列と相同性を有する第二のターゲティング配列をさらに含有してなる請求項４記載のＤＮＡ構築物。１１．構築物が、ターゲット遺伝子のコード領域の上流配列と相同性を有する第二のターゲティング配列をさらに含有してなる請求項４記載のＤＮＡ構築物。１２．構築物が、ターゲット遺伝子の内因性調節配列の上流配列と相同性を有する第二のターゲティング配列をさらに含有してなる請求項４記載のＤＮＡ構築物。１３．ターゲット遺伝子が治療目的の（therapeutic）タンパク質をコードする請求項４記載のＤＮＡ構築物。１４．ターゲット遺伝子が、ホルモン、サイトカイン、抗原、抗体、酵素、凝固因子、輸送タンパク質、受容体、調節タンパク質、構造タンパク質、又は転写因子をコードする請求項４記載のＤＮＡ構築物。１５．ターゲット遺伝子が、エリスロポエチン、カルシトニン、成長ホルモン、インスリン、インスリノトロピン、インスリン様増殖因子類、副甲状腺ホルモン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、神経成長因子類、ＦＳＨβ、ＴＧＦ−β、腫瘍壊死因子、グルカゴン、骨成長因子−２、骨成長因子−７、ＴＳＨ−β、インターロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン６、インターロイキン１１、インターロイキン１２、ＣＳＦ−顆粒球、ＣＳＦ−マクロファージ、ＣＳＦ−顆粒球／マクロファージ、免疫グロブリン類、触媒性抗体類、プロテインキナーゼＣ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ウロキナーゼ、抗トロンビンIII、ＤＮアーゼ、α−ガラクトシダーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、血液凝固因子V、血液凝固因子VII、血液凝固因子VIII、血液凝固因子 IX、血液凝固因子X、血液凝固因子XIII、アポリポプロテインＥ又はアポリポプロテインA-I、グロビン類、低密度リポプロテイン受容体、IL-2受容体、IL-2アンタゴニスト類、アルファ−１抗トリプシン、免疫応答修飾因子類、及び可溶性ＣＤ４からなる群より選ばれるタンパク質をコードする、請求項４記載のＤＮＡ構築物。１６．ターゲット遺伝子が、成長ホルモン、ＦＳＨβ、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦをコードする請求項１５記載のＤＮＡ構築物。１７．ターゲット遺伝子がエリスロポエチンをコードする請求項１５記載のＤＮＡ構築物。１８．エキソンのコード化ＤＮＡが、エリスロポエチンの第１エキソンのコード化ＤＮＡと同一である請求項１７記載のＤＮＡ構築物。１９．エキソンのコード化ＤＮＡが、エリスロポエチンの第１エキソンのコード化ＤＮＡと異なる請求項１７記載のＤＮＡ構築物。２０．エキソンのコード化ＤＮＡが、ヒト成長ホルモンの第１エキソンのコード化ＤＮＡと同一である請求項１９記載のＤＮＡ構築物。２１．調節配列が、プロモーター、エンハンサー、スカホールド付着領域（a sc affold-attachment region）又は転写因子結合部位である請求項１記載のＤＮＡ構築物。２２．調節配列がプロモーターである請求項２１記載のＤＮＡ構築物。２３．付加的な調節配列をさらに含有してなる請求項２２記載のＤＮＡ構築物。２４．構築物がエンハンサーをさらに含有してなる請求項２２記載のＤＮＡ構築物。２５．一以上の選択マーカーをさらに含有してなる請求項２４記載のＤＮＡ構築物。２６．増幅可能なマーカー遺伝子をさらに含有してなる請求項２５記載のＤＮＡ構築物。２７．調節配列が、マウスメタロチオネイン−Ｉ遺伝子の調節配列、ＳＶ−４０遺伝子の調節配列、サイトメガロウイルス遺伝子の調節配列、コラーゲン遺伝子の調節配列、アクチン遺伝子の調節配列、免疫グロブリン遺伝子の調節配列、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子の調節配列、又はＥＦ−１α遺伝子の調節配列である、請求項２１記載のＤＮＡ構築物。２８．相同組換え細胞を作製する方法であって、下記の工程を含有してなる、ターゲット遺伝子の発現が変化を受けた方法、（ａ）ＤＮＡ構築物で細胞をトランスフェクトし、ＤＮＡ構築物は、（ｉ）ターゲティング配列、（ii）調節配列、（iii）エキソン、及び（iv）対になっていないスプライス供与部位、を含有してなり、それによりトランスフェクト細胞を生産する工程、そして、（ｂ）相同組換えに適した条件下でトランスフェクト細胞を維持する工程。２９．エキソンがキャップ部位を含有してなる請求項２８記載の方法。３０．エキソンがヌクレオチド配列ＡＴＧを含有してなる請求項２９記載の方法。３１．エキソンがターゲット遺伝子とイン・フレームであるコード化ＤＮＡをさらに含有してなる請求項３０記載の方法。３２．エキソンのコード化ＤＮＡが、エリスロポエチンの第１エキソンのコード化ＤＮＡと同一である請求項３１記載の方法。３３．エキソンのコード化ＤＮＡが、エリスロポエチンの第１エキソンのコード化ＤＮＡと異なる請求項３１記載の方法。３４．ターゲティング配列がターゲット遺伝子内の配列と相同性を有する請求項３１記載の方法。３５．ターゲティング配列が、ターゲット遺伝子のコード領域の上流配列と相同性を有する請求項３１記載の方法。３６．ターゲティング配列が、ターゲット遺伝子の内因性調節配列の上流配列と相同性を有する請求項３１記載の方法。３７．構築物が、ターゲット遺伝子内の配列と相同性を有する第二のターゲティング配列をさらに含有してなる請求項３１記載の方法。３８．構築物が、ターゲット遺伝子のコード領域の上流配列と相同性を有する第二のターゲティング配列をさらに含有してなる請求項３１記載の方法。３９．構築物が、ターゲット遺伝子の内因性調節配列の上流配列と相同性を有する第二のターゲティング配列をさらに含有してなる請求項３１記載の方法。４０．細胞がヒトの細胞である請求項３１記載の方法。４１．ターゲット遺伝子がエリスロポエチンをコードする請求項２８記載の方法。４２．コード化ＤＮＡが、エリスロポエチンの第１エキソンのコード化ＤＮＡと同一である請求項３１記載の方法。４３．コード化ＤＮＡが、エリスロポエチンの第１エキソンのコード化ＤＮＡと異なる請求項３１記載の方法。４４．エキソンのコード化ＤＮＡが、ヒト成長ホルモンの第１エキソンのコード化ＤＮＡと同一である請求項３１記載の方法。４５．（ｃ）タンパク質の生産に適した条件下で、工程（ｂ）からの相同組換え細胞を維持する工程、をさらに含有してなる請求項２８記載の方法。４６．発現が変化を受けている遺伝子が、エリスロポエチン遺伝子である請求項４５記載の方法。４７．請求項４５記載の方法で生産されるエリスロポエチン。４８．請求項４５の方法により生産される、ＤＮＡ構築物由来のエキソンにコードされたアミノ酸及び内因性遺伝子にコードされたアミノ酸を含有してなる融合タンパク質。４９．内因性遺伝子がエリスロポエチンである請求項４８記載の融合タンパク質。５０．ヒト成長ホルモンのアミノ酸１〜３位と、ヒトエリスロポエチンのアミノ酸６〜１６５位を含有してなる請求項４９記載の融合タンパク質。５１．請求項２８記載の方法により生産される相同組換え細胞。５２．請求項２９記載の方法により生産される相同組換え細胞。５３．請求項３０記載の方法により生産される相同組換え細胞。５４．請求項３１記載の方法により生産される相同組換え細胞。５５．請求項３２記載の方法により生産される相同組換え細胞。５６．請求項３３記載の方法により生産される相同組換え細胞。５７．請求項４０記載の方法により生産される相同組換え細胞。５８．請求項４１記載の方法により生産される相同組換え細胞。５９．請求項４２記載の方法により生産される相同組換え細胞。６０．請求項４４記載の方法により生産される相同組換え細胞。６１．内因性遺伝子の第２エキソンと効果的に結合した、外因性調節配列、外因性エキソン及びスプライス供与部位を含有してなる相同組換え細胞。６２．外因性エキソンがキャッブ（ＣＡＰ）部位を含有してなる請求項６１記載の相同組換え細胞。６３．外因性エキソンがヌクレオチド配列ＡＴＧをさらに含有してなる請求項６２記載の相同組換え細胞。６４．外因性エキソンが、内因性のターゲット遺伝子とイン・フレームであるコード化ＤＮＡをさらに含有してなる請求項６３記載の相同組換え細胞。６５．コード化ＤＮＡが、ターゲット遺伝子の第１エキソンのコード化ＤＮＡと同一である請求項６４記載の相同組換え細胞。６６．コード化ＤＮＡが、ターゲット遺伝子の第１エキソンのコード化ＤＮＡと異なる請求項６４記載の相同組換え細胞。６７．外因性調節配列、外因性エキソン及びスプライス供与部位が、ターゲット遺伝子のコード領域の上流にある請求項６４記載の相同組換え細胞。６８．外因性調節配列、外因性エキソン及びスプライス供与部位が、ターゲット遺伝子の内因性調節配列の上流にある請求項６７記載の相同組換え細胞。６９．内因性調節配列が欠失している請求項６１記載の相同組換え細胞。７０．内因性の第１エキソンが欠失している請求項６９記載の相同組換え細胞。７１．ターゲット遺伝子が、ホルモン、サイトカイン、抗原、抗体、酵素、凝固因子、輸送タンパク質、受容体、調節タンパク質、構造タンパク質、又は転写因子をコードする請求項６４記載の相同組換え細胞。７２．ターゲット遺伝子が、エリスロポエチン、カルシトニン、成長ホルモン、インスリン、インスリノトロピン、インスリン様増殖因子類、副甲状腺ホルモン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、神経成長因子類、ＦＳＨβ、ＴＧＦ−β、腫瘍壊死因子、グルカゴン、骨成長因子−２、骨成長因子−７、ＴＳＨ−β、インターロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン６、インターロイキン１１、インターロイキン１２、ＣＳＦ−顆粒球、ＣＳＦ−マクロファージ、ＣＳＦ−顆粒球／マクロファージ、免疫グロブリン類、触媒性抗体類、プロテインキナーゼＣ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ウロキナーゼ、抗トロンビンIII、ＤＮアーゼ、α−ガラクトシダーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、血液凝固因子V、血液凝固因子VII、血液凝固因子VIII、血液凝固因子 IX、血液凝固因子X、血液凝固因子XIII、アポリポプロテインＥ又はアポリポプロテインA-I、グロビン類、低密度リポプロテイン受容体、IL-2受容体、IL-2アンタゴニスト類、アルファ−１抗トリプシン、免疫応答修飾因子類、及び可溶性ＣＤ４からなる群より選ばれるタンパク質をコードする、請求項６４記載の相同組換え細胞。７３．細胞が真核生物のものである請求項６１記載の相同組換え細胞。７４．細胞が、真菌、植物又は動物起源である請求項７３記載の相同組換え細胞。７５．細胞が脊椎動物起源である請求項７４記載の相同組換え細胞。７６．細胞が哺乳類の一次細胞又は二次細胞である請求項７５記載の相同組換え細胞。７７．細胞がヒトの一次細胞又は二次細胞である請求項７５記載の相同組換え細胞。７８．細胞が哺乳類の不死化細胞である請求項７５記載の相同組換え細胞。７９．細胞がヒトの不死化細胞である請求項７５記載の相同組換え細胞。８０．細胞が、HT1080細胞、HeLa細胞、及びHeLa細胞の派生物、MCF-7乳ガン細胞、K-562白血病細胞、KBガン細胞、2780AD卵巣ガン細胞、Raji細胞、Jurkat細胞、Namalwa細胞、HL-60細胞、Daudi細胞、RPMI 8226細胞、U-937細胞、Bowesメラノーマ細胞、WI-38VA13サブライン（subline）2R4細胞、及びMOLT-4細胞からなる群より選ばれる請求項７５記載の相同組換え細胞。８１．ターゲテット遺伝子が、エリスロポエチンをコードする請求項８０記載の相同組換え細胞。８２．エリスロポエチンの発現能を有する請求項８１記載の相同組換え細胞。８３．コード化ＤＮＡがエリスロポエチンの第１エキソンのコード化ＤＮＡと同一である請求項８２記載の相同組換え細胞。８４．コード化ＤＮＡがエリスロポエチンの第１エキソンのコード化ＤＮＡと異なる請求項８１記載の相同組換え細胞。８５．コード化ＤＮＡがヒト成長ホルモンの第１エキソンのコード化ＤＮＡと同一である請求項８４記載の相同組換え細胞。８６．外因性エキソンにコードされたアミノ酸と、内因性遺伝子にコードされたアミノ酸を含有してなる融合タンパク質を発現し得る請求項６１記載の相同組換え細胞。８７．内因性遺伝子がエリスロポエチンである請求項８６記載の融合タンパク質。８８．ヒト成長ホルモンのアミノ酸１〜３位と、ヒトエリスロポエチンのアミノ酸６〜１６５位を含有してなる請求項８７記載の融合タンパク質。８９．調節配列が、プロモーター、エンハンサー、スカホールド付着領域又は転写因子結合部位である請求項６６記載の相同組換え細胞。９０．外因性調節配列がプロモーターである請求項８９記載の相同組換え細胞。９１．外因性調節配列が、マウスメタロチオネイン−Ｉ遺伝子の調節配列、ＳＶ −４０遺伝子の調節配列、サイトメガロウイルス遺伝子の調節配列、コラーゲン遺伝子の調節配列、アクチン遺伝子の調節配列、免疫グロブリン遺伝子の調節配列、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子の調節配列、又はＥＦ−１α遺伝子の調節配列である、請求項８９記載の相同組換え細胞。９２．細胞内の遺伝子の発現を変化させる方法であって、下記工程を含有してなる方法、（ａ）ＤＮＡ構築物で細胞をトランスフェクトし、ＤＮＡ構築物は、（ｉ）ターゲティング配列、（ii）調節配列、（iii）エキソン、及び（iv）対になっていないスプライス供与部位、を含有してなり、それによりトランスフェクト細胞を生産する工程、（ｂ）相同組換えに適した条件下でトランスフェクト細胞を維持し、それにより相同組換え細胞を生産する工程、そして、（ｃ）相同組換え細胞を、遺伝子の発現に適した条件下で維持する工程。９３．エキソンがヌクレオチド配列ＡＴＧを含有してなる請求項９２記載の方法。９４．エキソンがキャップ部位をさらに含有してなる請求項９２記載の方法。９５．エキソンが、ターゲット遺伝子とイン・フレームであるコード化ＤＮＡをさらに含有してなる請求項９４記載の方法。９６．コード化ＤＮＡが、ターゲット遺伝子の第１エキソンのコード化ＤＮＡと同一である請求項９５記載の方法。９７．ターゲット遺伝子がエリスロポエチン遺伝子である請求項９６記載の方法。９８．コード化ＤＮＡが、ターゲット遺伝子の第１エキソンのコード化ＤＮＡと異なる請求項９６記載の方法。９９．ターゲット遺伝子がエリスロポエチン遺伝子である請求項９８記載の方法。１００．ターゲティング配列がターゲット遺伝子内の配列と相同性を有する請求項９８記載の方法。１０１．ターゲティング配列が、ターゲット遺伝子のコード領域の上流配列と相同性を有する請求項９８記載の方法。１０２．ターゲティング配列が、ターゲット遺伝子の内因性調節配列の上流配列と相同性を有する請求項９８記載の方法。１０３．構築物が、ターゲット遺伝子内の配列と相同性を有する第二のターゲティング配列をさらに含有してなる請求項９８記載の方法。１０４．構築物が、ターゲット遺伝子のコード領域の上流配列と相同性を有する第二のターゲティング配列をさらに含有してなる請求項９８記載の方法。１０５．構築物が、ターゲット遺伝子の内因性調節配列の上流配列と相同性を有する第二のターゲティング配列をさらに含有してなる請求項９８記載の方法。１０６．下記工程をさらに含有してなる、請求項９２記載の方法、（ｃ）相同組換え細胞を、タンパク質の生産に適した条件下で維持する工程。１０７．発現が変化を受ける遺伝子がエリスロポエチン遺伝子である請求項１０６記載の方法。１０８．請求項１０７記載の方法により生産されるエリスロポエチン。１０９．請求項１０６記載の方法により生産される融合タンパク質。１１０．内因性遺伝子がエリスロポエチンである請求項１０９記載の融合タンパク質。１１１．ヒト成長ホルモンのアミノ酸１〜３位と、ヒトエリスロポエチンのアミノ酸６〜１６５位を含有してなる請求項１１０記載の融合タンパク質。１１２．細胞内の遺伝子の発現を変化させてタンパク質を得る方法であって、下記工程を含有してなる方法、（ａ）ＤＮＡ構築物で細胞をトランスフェクトし、ＤＮＡ構築物は、（ｉ）ターゲティング配列、（ii）調節配列、（iii）エキソン、及び（iv）対になっていないスプライス供与部位、を含有してなり、それによりトランスフェクト細胞を生産する工程、（ｂ）相同組換えに適した条件下でトランスフェクト細胞を維持し、それにより相同組換え細胞を生産する工程、そして、（ｃ）相同組換え細胞を、タンパク質の生産に適した条件下で維持する工程。１１３．エキソンがキャップ部位を含有してなる請求項１１２記載の方法。１１４．エキソンがヌクレオチド配列ＡＴＧを含有してなる請求項１１３記載の方法。１１５．エキソンが、内因性のターゲット遺伝子とイン・フレームであるコード化ＤＮＡをさらに含有してなる請求項１１４記載の方法。１１６．コード化ＤＮＡが、ターゲット遺伝子の第１エキソンのコード化ＤＮＡと同一である請求項１１５記載の方法。１１７．コード化ＤＮＡが、ターゲット遺伝子の第１エキソンのコード化ＤＮＡと異なる請求項１１６記載の方法。１１８．ターゲティング配列がターゲット遺伝子内の配列と相同性を有する請求項１１７記載の方法。１１９．ターゲティング配列が、ターゲット遺伝子のコード領域の上流配列と相同性を有する請求項１１７記載の方法。１２０．ターゲティング配列が、ターゲット遺伝子の内因性調節配列の上流配列と相同性を有する請求項１１７記載の方法。１２１．構築物が、ターゲット遺伝子内の配列と相同性を有する第二のターゲティング配列をさらに含有してなる請求項１１７記載の方法。１２２．構築物が、ターゲット遺伝子のコード領域の上流配列と相同性を有する第二のターゲティング配列をさらに含有してなる請求項１１７記載の方法。１２３．構築物が、ターゲット遺伝子の内因性調節配列の上流配列と相同性を有する第二のターゲティング配列をさらに含有してなる請求項１１７記載の方法。１２４．請求項１１２記載の方法により生産されるエリスロポエチン。１２５．細胞がヒト起源である請求項１２４記載のエリスロポエチン。１２６．請求項１１２記載の方法により生産されるタンパク質。１２７．融合タンパク質である請求項１２６記載のタンパク質。１２８．内因性遺伝子がエリスロポエチン遺伝子である請求項１２７記載の融合タンパク質。１２９．ヒト成長ホルモンのアミノ酸１〜３位と、ヒトエリスロポエチンのアミノ酸６〜１６５位を含有してなる請求項１２８記載の融合タンパク質。１３０．ＤＮＡプラスミドpREPO18。１３１．細胞の染色体ＤＮＡへ挿入した場合に、ターゲット遺伝子の発現を変化させ得るＤＮＡ構築物であって、（ａ）ターゲティング配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エキソン、（ｄ）スプライス供与部位、（ｅ）イントロン、及び（ｆ）スプライス受容部位、を含有してなるＤＮＡ構築物。１３２．ターゲティング配列がターゲット遺伝子内の配列と相同性を有する請求項１３１記載のＤＮＡ構築物。１３３．ターゲティング配列が、ターゲット遺伝子のコード領域の上流配列と相同性を有する請求項１３１記載のＤＮＡ構築物。１３４．ターゲティング配列が、ターゲット遺伝子の内因性調節配列の上流配列と相同性を有する請求項１３１記載のＤＮＡ構築物。１３５．構築物が、ターゲット遺伝子内の配列と相同性を有する第二のターゲティング配列をさらに含有してなる請求項１３１記載のＤＮＡ構築物。１３６．構築物が、ターゲット遺伝子のコード領域の上流配列と相同性を有する第二のターゲティング配列をさらに含有してなる請求項１３１記載のＤＮＡ構築物。１３７．構築物が、ターゲット遺伝子の内因性調節配列の上流配列と相同性を有する第二のターゲティング配列をさらに含有してなる請求項１３１記載のＤＮＡ構築物。１３８．相同組換えによりターゲット遺伝子のコード領域の上流に導入された、調節配列、エキソン、スプライス供与部位、イントロン、及びスプライス受容部位を含有してなる相同組換え細胞。１３９．ターゲット遺伝子がα−インターフェロン遺伝子である請求項１３８記載の相同組換え細胞。１４０．ターゲット遺伝子がエリスロポエチン遺伝子である請求項１３８記載の相同組換え細胞。１４１．内因性のエリスロポエチン調節領域の上流の位置にターゲットされたｄｈｆｒ遺伝子、ｎｅｏ遺伝子、ＣＭＶプロモーター、ｈＧＨエクソン１及び対になっていないスプライス供与部位を含有してなる相同組換え細胞。１４２．pREPO18からのＤＮＡの組込みにより生産される請求項１４１記載の相同組換え細胞。１４３．相同組換え細胞を作製する方法であって、ターゲット遺伝子の発現が変化し、下記の工程を含有してなる方法、（ａ）ＤＮＡ構築物で細胞をトランスフェクトし、構築物が、（ｉ）ターゲティング配列、（ii）調節配列、（iii）エキソン、（iv）スプライス供与部位、（ｖ）イントロン、及び（vi）スプライス受容部位、を含有してなり、ターゲティング配列はターゲット遺伝子の第１エキソンと効果的に結合するように上流に成分（ｂ）〜（ｆ）の組込みを指示する工程、そして、（ｂ）相同組換えに適した条件下でトランスフェクト細胞を維持する工程。１４４．請求項１４３記載の方法により生産される相同組換え細胞。１４５．細胞の遺伝子の発現を変化させる方法であって、下記の工程を含有してなる方法、（ａ）ＤＮＡ構築物で細胞をトランスフェクトし、構築物が、（ｉ）ターゲティング配列、（ii）調節配列、（iii）エキソン、（iv）スプライス供与部位、（ｖ）イントロン、及び（vi）スプライス受容部位、を含有してなり、ターゲティング配列はターゲット遺伝子の第１エキソンと効果的に結合するように上流に成分（ｂ）〜（ｆ）の組込みを指示する工程、（ｂ）相同組換えに適した条件下でトランスフェクト細胞を維持する工程、そして、（ｃ）遺伝子の発現に適した条件下で、相同組換え細胞を維持する工程。１４６．細胞の遺伝子の発現を変化させることによりタンパク質を作成する方法であって、下記の工程を含有してなる方法、（ａ）ＤＮＡ構築物で細胞をトランスフェクトし、構築物が、（ｉ）ターゲティング配列、（ii）調節配列、（iii）エキソン、（iv）スプライス供与部位、（ｖ）イントロン、及び（vi）スプライス受容部位、を含有してなり、ターゲティング配列はターゲット遺伝子の第１エキソンと効果的に結合するように上流に成分（ｂ）〜（ｆ）の組込みを指示する工程、（ｂ）相同組換えに適した条件下でトランスフェクト細胞を維持する工程、そして、（ｃ）タンパク質の発現に適した条件下で、相同組換え細胞を維持する工程。１４７．ターゲット遺伝子が、α−インターフェロン遺伝子又はエリスロポエチン遺伝子である請求項１４６記載の方法。１４８．エリスロポエチン遺伝子のＡＴＧの上流の約５キロベースと３０キロベースの間に位置するＤＮＡ配列。１４９．エリスロポエチン遺伝子のＡＴＧ配列の上流の配列と相同性を示すＤＮＡ配列を含有してなる構築物を用いて細胞をトランスフェクトすることからなる、哺乳類細胞でエリスロポエチン遺伝子をターゲティングするための方法。１５０．エリスロポエチン遺伝子のＡＴＧの上流の約５キロベースと３０キロベースの間に位置する配列と相同性を有するＤＮＡ配列を含有してなる請求項１４９記載の方法。１５１．哺乳類細胞がヒトの細胞である請求項１５０記載の方法。１５２．エリスロポエチン遺伝子内の配列と相同性を有するＤＮＡ配列を含有してなる構築物を用いて細胞をトランスフェクトすることからなる、哺乳類細胞でエリスロポエチン遺伝子をターゲティングするための方法。１５３．哺乳類細胞がヒトの細胞である請求項１５２記載の方法。