CN109415427A - 用于纯化聚乙二醇化的促红细胞生成素的方法 - Google Patents

用于纯化聚乙二醇化的促红细胞生成素的方法 Download PDF

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Abstract

本文报道了通过阳离子交换色谱法从反应副产物或未反应的原料中纯化包含促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基的蛋白质的方法。已经发现，通过应用阳离子交换SP‑650色谱材料和应用第二洗涤步骤，所述第二洗涤步骤与第一洗涤步骤相比具有增加的pH值，可以在单个步骤中以高纯度和收率以及用于大规模应用的适合性获得促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基的融合蛋白质。

Description

用于纯化聚乙二醇化的促红细胞生成素的方法
本文报道了使用阳离子交换色谱材料的单一柱方法来纯化聚乙二醇化的促红细胞生成素的方法。
发明背景
蛋白质在当今的医疗产品中具有重要作用。对于人应用而言，每种治疗性蛋白质必须符合独特的标准。为了确保生物药物活性剂对人类的安全性，特别必须除去生产过程中累积的副产物。为了满足管理规范，在生产过程之后必须进行一个或多个纯化步骤。其中，纯度、处理量和收率在确定适宜的纯化方法中起重要作用。
已经报道了下述治疗性蛋白质的缀合物：例如，聚乙二醇(PEG)和白介素-6(EP 0442 724)，PEG和促红细胞生成素(WO 01/02017)，包含内皮生长抑素和免疫球蛋白的嵌合分子(US 2005/008649)，基于分泌型抗体的融合蛋白质(US 2002/147311)，包含白蛋白的融合多肽(US 2005/0100991；人血清白蛋白US 5,876,969)，聚乙二醇化的多肽(US 2005/0114037)和促红细胞生成素融合物。
Necina,R.等人(Biotechnol.Bioeng.60(1998)689-698)报道了用表现出高电荷密度的离子交换介质从细胞培养物上清液中直接捕获人单克隆抗体。在WO 89/05157中，报道了通过对细胞培养基直接进行阳离子交换处理来纯化免疫球蛋白产物的方法。Danielsson,A.等人，J.Immun.Meth.115(1988)79-88描述了从小鼠腹水中一步纯化单克隆IgG抗体。在WO 2004/024866中报道了通过离子交换色谱法来纯化多肽的方法，其中使用梯度洗涤将目标多肽与一种或多种污染物拆分开。在EP 0 530 447中，报道了通过三个色谱步骤的组合来纯化IgG单克隆抗体的方法。Yu,G.等人,Process Biotechnol.42(2007)971-977报道了单聚乙二醇化的白介素-1受体拮抗剂的容易的纯化。Wang,H.等人，Peptides 26(2005)1213-1218报道了通过两步阳离子交换色谱法来纯化在大肠杆菌(E.coli)中表达的hTFF3。Yun,Q.等人(Yun,Q.等人,J.Biotechnol.118(2005)67-74)报道了通过两个连续的离子交换色谱步骤来纯化聚乙二醇化的rhG-CSF。
在WO 2012/035037中报道了在SP Sephacryl S 500HR柱中纯化聚乙二醇化的促红细胞生成素的方法。
WO 1999/057134报道了通过离子交换色谱法进行蛋白质纯化。
在WO 2009/010270中报道了用于纯化单聚乙二醇化的促红细胞生成素的方法，该方法包括两个阳离子交换色谱步骤，其中在阳离子交换色谱步骤中使用了相同类型的阳离子交换材料。
发明概述
本文报道了通过阳离子交换色谱法从反应副产物或未反应的原料中纯化包含促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基的蛋白质缀合物的方法。
已经发现，通过应用具有增加的pH的洗涤溶液的洗涤步骤，可以通过采用阳离子交换色谱材料例如SP-650，在单个步骤中以高纯度和收率、以改进的和简化的方式获得包含促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基的缀合蛋白质。
已经发现，与包含促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基的蛋白质缀合物的纯化方法相比，其采用两个顺序阳离子交换色谱步骤，产率和质量至少相当或更好。一个柱处理允许获得相同的质量，同时增加处理的稳健性。它还降低了制造成本和生产时间。可以增加最终产率而不损失单聚乙二醇化的促红细胞生成素的质量。
因此，本文报道了用于获得/纯化/产生包含促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基的蛋白质的方法，该方法包括以下步骤：
a)将溶液应用于包含SP-650作为色谱材料的柱，所述溶液包含促红细胞生成素以及促红细胞生成素与聚(乙二醇)的缀合物的混合物，在所述缀合物中每个促红细胞生成素分子具有一个或多个聚(乙二醇)残基，所述柱已经应用了具有约2.4至约2.7的pH的第一溶液，
b)应用相对于第一溶液具有增加的pH值的第二溶液(pH为约2.4至约2.7)，
c)将具有增加了或逐渐增加的电导率的溶液应用于柱，从而回收包含促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基的蛋白质。
作为一个方面，本文报道了获得/纯化/产生包含促红细胞生成素和单一聚(乙二醇)残基的蛋白质的方法，该方法包括以下步骤：
a)将溶液应用于包含色谱材料的柱，所述色谱材料具有带有磺丙基作为官能团的甲基丙烯酸酯基质，所述溶液包含促红细胞生成素以及促红细胞生成素与聚(乙二醇)的缀合物的混合物，在所述缀合物中每个促红细胞生成素分子具有一个或多个聚(乙二醇)残基，所述柱已经应用了具有约2.4至约2.7的pH的第一溶液，
b)应用相对于第一溶液(pH为约2.4至约2.7)具有增加的pH值的第二溶液，
c)将具有增加了或逐渐增加的电导率的溶液应用于柱，从而回收包含促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基的蛋白质。
在一个实施方案中，该方法还包括在步骤b)之后和步骤c)之前再应用pH为约2.4至约2.7的第一溶液的步骤。因此，在一个实施方案中报道了获得/纯化/产生包含促红细胞生成素和单一聚(乙二醇)残基的蛋白质的方法，该方法包括以下步骤：
a)将溶液应用于包含Toyopearl SP-650色谱材料的柱，所述溶液包含促红细胞生成素以及促红细胞生成素与聚(乙二醇)的缀合物的混合物，在所述缀合物中每个促红细胞生成素分子具有一个或多个聚(乙二醇)残基，所述柱已经应用了具有约2.4至约2.7的pH的第一溶液，
b)应用相对于具有pH值为约2.4至约2.7的第一溶液具有增加的pH值的第二溶液，
b1)再应用pH值为约2.4至约2.7的第一溶液，
c)将具有增加了或逐渐增加的电导率的溶液应用于柱，从而回收包含促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基的蛋白质。
在一个实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液是具有pH为约2.7至约3.2、优选pH为约2.7至3.0的溶液。
在一个实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液是具有恒定电导率值的溶液。
在一个实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液和具有pH为约2.4至约2.7的第一溶液具有基本上相同、恒定的电导率值。
在一个实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液和/或具有pH为约2.4至约2.7的第一溶液具有19mS/cm的恒定电导率值，优选约17mS/cm至约19mS/cm电导率值。
在一个实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液具有pH为约2.7至约3.2，并且具有约19mS/cm的电导率值。
在一个实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液是磷酸盐缓冲溶液。
在一个实施方案中，不将溶液调节至约19mS/cm的电导率值，所述溶液包含促红细胞生成素以及促红细胞生成素与聚(乙二醇)的缀合物的混合物，在所述缀合物中每个促红细胞生成素分子具有一个或多个聚(乙二醇)残基。
在一个实施方案中，具有增加了或逐渐增加的电导率的溶液是具有增加了或逐渐增加的氯化钠浓度的溶液。在一个实施方案中，具有增加了或逐渐增加的电导率的溶液具有pH 2.3至pH 3.5的pH值。
在一个实施方案中，具有增加了或逐渐增加的电导率的溶液具有逐步或线性增加的电导率。
在一个实施方案中，该方法用于大规模蛋白质制备，其中步骤a)的色谱柱具有至少30cm的直径。
在一个实施方案中，促红细胞生成素是人促红细胞生成素。在一个实施方案中，人促红细胞生成素具有SEQ ID NO：01或SEQ ID NO：02的氨基酸序列。
在一个实施方案中，单个聚(乙二醇)残基具有20kDa至40kDa的分子量。
在一个方面本文报道了获得包含促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基的蛋白质的方法，该方法包括下列步骤：
a)将溶液应用于包含SP-650作为色谱材料的柱，所述溶液包含促红细胞生成素以及促红细胞生成素与聚(乙二醇)的缀合物的混合物，在所述缀合物中每个促红细胞生成素分子具有一个或多个聚(乙二醇)残基，所述柱已经应用了具有约2.4至约2.7的pH的第一溶液，
a1)再应用具有pH为约2.4至约2.7的第一溶液，
b)应用相对于具有pH为约2.4至约2.7的第一溶液具有增加的pH值的第二溶液，
c)将具有增加了或逐渐增加的电导率的溶液应用于柱，从而回收包含促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基的蛋白质。
发明描述
本文报道了使用梯度洗脱方法来纯化包含一个促红细胞生成素分子和一个聚(乙二醇)残基的蛋白质的方法，其中所述梯度洗脱方法是在阳离子交换色谱柱，例如包含SP-650的柱上进行，其中阳离子交换色谱/SP-650柱已经用两种洗涤溶液洗涤，然后开始回收/洗脱包含一个促红细胞生成素分子和一个聚(乙二醇)残基的蛋白质。本文中，第二洗涤溶液相对于第一洗涤溶液具有增加的pH值。
本领域技术人员已知通用色谱方法和它们的应用。参见例如：Heftmann,E.,(编辑),Chromatography,第5版,Part A:Fundamentals and Techniques,Elsevier SciencePublishing Company,New York(1992)；Deyl,Z.,(编辑),Advanced Chromatographic andElectromigration Methods in Biosciences,Elsevier Science BV,Amsterdam,TheNetherlands(1998)；Poole,C.F.和Poole,S.K.,Chromatography Today,ElsevierScience Publishing Company,New York(1991)；Scopes,Protein Purification:Principles and Practice,Springer Verlag(1982)；Sambrook,J.等人(编辑),MolecularCloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,(1989)；或Ausubel,F.M.等人(编辑),Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York(1987-1994)。
术语“应用于”表示纯化方法的部分步骤，其中使溶液与色谱材料接触。这表示：a)将溶液加入至含有色谱材料的色谱装置中，或b)将色谱材料加入至溶液中。在a)的情况下，溶液通过装置，使色谱材料与溶液中含有的物质相互作用。取决于条件例如pH、电导率、盐浓度、温度和/或流速，溶液中的一些物质与色谱材料结合，从而可以在进一步的步骤中从色谱材料回收。保留在溶液中的物质可以在穿流液(flow-through)中找到。“穿流液”表示穿过装置后获得的溶液，其可以是应用的溶液或缓冲溶液，其用于洗涤柱或者用于造成与色谱材料结合的物质的洗脱。在一个实施方案中，装置是柱或盒。在b)的情况下，可以将色谱材料(例如作为固体)加入例如含有要纯化的目标物质的溶液中，从而允许色谱材料和溶液中的物质之间的相互作用。在相互作用后，通过例如过滤来除去色谱材料，并且也随之从溶液中除去与色谱材料结合的物质，而未与色谱材料结合的物质保留在溶液中。
术语“结合和洗脱模式”表示色谱步骤的操作模式，其中将含有要纯化的目标物质的溶液应用于色谱材料上，从而使目标物质与色谱材料结合。因此，目标物质保留在色谱材料上，而非目标物质则与穿流液或上清液除去。然后在第二步中，用洗脱溶液从色谱材料回收目标物质。在一个实施方案中，在本文中报道的方法以结合和洗脱模式操作。
用于本文报道的方法中的溶液是粗制溶液或缓冲溶液。术语“缓冲溶液”表示这样的溶液：其中由酸性或碱性物质的添加或释放引起的pH变化会被溶解的缓冲物质拉平。可以使用具有这种性质的任何缓冲物质。通常，使用药学上可接受的缓冲物质。在一个实施方案中，缓冲溶液选自：由磷酸和/或其盐组成的磷酸盐缓冲溶液，或由乙酸及其盐组成的乙酸盐缓冲溶液，或由柠檬酸和/或其盐组成的柠檬酸盐缓冲溶液，或吗啉缓冲溶液，或2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液，或组氨酸缓冲溶液，或甘氨酸缓冲溶液，或三(羟基甲基)氨基甲烷(TRIS)缓冲溶液。在一个实施方案中，缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液，或乙酸盐缓冲溶液，或柠檬酸盐缓冲溶液，或组氨酸缓冲溶液。任选地，缓冲溶液可以包含额外的盐，例如氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾、柠檬酸钠或柠檬酸钾。本领域中应当理解，缓冲溶液在与随后使用的那些相当的条件下制备。例如，在与随后用于预期的方法中使用的温度相当的温度调节缓冲溶液的pH。例如，如果缓冲溶液用于在4℃进行的色谱方法中，当缓冲溶液具有相当的温度和例如不在30℃，可以调节pH。在一个实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液是磷酸盐缓冲溶液。
术语“连续洗脱”和“连续洗脱方法”在本申请中可互换使用，表示这样的方法：其中造成洗脱(即从色谱材料回收结合的化合物)的溶液的电导率连续地变化(即升高或降低)，即通过一系列小步骤来改变浓度，每个小步骤不大于造成洗脱的物质的浓度的2％或1％的变化。在该“连续洗脱”中，一个或多个条件(例如pH、离子强度、盐浓度和/或色谱流速)可以线性地或指数地或渐近地变化。在一个实施方案中，所述变化是线性的。
术语“分步洗脱”，“逐步洗脱”，“逐步洗脱方法”和“分步洗脱方法”在本申请中可互换使用，表示方法，其中例如引起洗脱的物质的浓度，即结合的化合物从材料中溶解，立即升高或降低，即直接从一个值/水平升高到下一个值/水平。在该“分步洗脱”中，一个或多个条件，例如pH、离子强度、盐的浓度和/或色谱的流速从第一个例如开始值到第二个例如最终值即刻全部变化，即与线性变化相反，条件递增地、即逐步地变化。在“分步洗脱方法”中，在每次增加离子强度后，收集新的级分。该级分含有从离子交换材料中回收的化合物，相应地增加了离子强度。在每次增加后，维持条件直至洗脱方法中的下一步骤。在“分步洗脱”中，一个或多个条件从第一个例如开始值到第二个例如最终值即刻完全变化。该变化可以是引起洗脱的物质浓度的10％或更多。即，在第一步骤中引起洗脱的物质的浓度为100％的情况中，在第二步骤中为110％或更多，并且在第三步骤中为120％或更多。该变化也可以是引起洗脱的物质浓度的50％或更多。此外，该变化可以是引起洗脱的物质浓度的120％或更多。“分步洗脱”表示与线性变化相反，条件递增地、即逐步地变化。
术语“离子交换色谱材料”表示固定的高分子量基质，其带有共价结合的带电荷的取代基，在离子交换色谱法中用作固定相。为了达到整体电荷中性，非共价结合的抗衡离子与之结合。“离子交换色谱材料”具有将其非共价结合的抗衡离子交换成周围溶液中的类似的带电荷的离子的能力。取决于其可交换的抗衡离子的电荷，“离子交换树脂”指阳离子交换树脂或阴离子交换树脂。取决于带电荷的基团(取代基)的性质，“离子交换树脂”是指：例如在阳离子交换树脂的情况下，磺酸树脂(S)或磺丙基树脂(SP)或羧甲基树脂(CM)。取决于带电荷基团/取代基的化学性质，“离子交换树脂”还可以分类为强或弱离子交换树脂，这取决于共价键合的带电荷取代基的强度。例如，强阳离子交换树脂具有磺酸基，优选磺丙基，作为带电荷的取代基，弱阳离子交换树脂具有羧基，优选羧甲基，作为带电荷的取代基，并且弱阴离子交换树脂具有二乙基氨基乙基作为带电荷的取代基。在一个实施方案中，阳离子交换色谱材料是强阳离子交换色谱材料。在一个实施方案中，阳离子交换色谱材料是SP-650色谱材料。在一个实施方案中，阳离子交换色谱材料是SP-650M色谱材料。
本领域技术人员熟知用于将氨基酸序列(例如多肽的氨基酸序列)转化成编码该氨基酸序列的对应核酸序列的步骤和方法。因此，通过它的由各个核苷酸组成的核酸序列来表征核酸，同样通过由其编码的多肽的氨基酸序列来表征核酸。
术语“聚(乙二醇)”或“聚(乙二醇)残基”表示，含有聚(乙二醇)作为基本部分的非蛋白质性的残基。这样的聚(乙二醇)残基可以含有结合反应所必需的其它化学基团，其源自分子的化学合成，或者是分子的多个部分的最佳距离的间隔物。这些其它化学基团不用于计算聚(乙二醇)残基的分子量。另外，这样的聚(乙二醇)残基可以由一个或多个聚(乙二醇)链组成，所述链共价地连接在一起。具有超过一个PEG链的聚(乙二醇)残基称作多臂或支链聚(乙二醇)残基。例如，通过向不同的多元醇(包括甘油、季戊四醇和山梨醇)添加聚氧化乙烯，可以制备支链聚(乙二醇)残基。支链聚(乙二醇)残基在例如EP 0 473 084、US 5,932,462中报道。在一个实施方案中，聚(乙二醇)残基具有20kDa至35kDa的分子量，并且是直链聚(乙二醇)残基。在另一个实施方案中，聚(乙二醇)残基是具有35kDa至40kDa的分子量的支链聚(乙二醇)残基。
术语“促红细胞生成素与聚(乙二醇)残基的融合”表示，在促红细胞生成素的N-端或内部赖氨酸残基处共价化学引入的聚(乙二醇)残基的连接。融合会产生蛋白质缀合物，其包含一个促红细胞生成素分子和一个或多个聚(乙二醇)残基。融合方法也指聚乙二醇化，并且其产物指聚乙二醇化的促红细胞生成素。多肽与聚(乙二醇)残基的融合/缀合是在现有技术中广泛已知的，并且在例如Veronese，F.M.，Biomaterials 22(2001)405-417中综述。使用不同的官能团，可以连接聚(乙二醇)残基。可以使用具有不同分子量、不同形式以及不同连接基团的聚(乙二醇)(还参见Francis,G.E.等人，Int.J.Hematol.68(1998)1-18；Delgado,C.等人，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Systems 9(1992)249-304)。促红细胞生成素和聚(乙二醇)残基的融合可以在含有聚(乙二醇)残基试剂的水溶液中进行，如例如在WO00/44785中描述。融合还可以在固相上进行，根据Lu,Y.等人，Reactive Polymers 22(1994)221-229。根据WO 94/01451，还可以产生非随机的N-端融合。
术语“使促红细胞生成素与聚(乙二醇)融合”和“聚乙二醇化”表示，在聚(乙二醇)残基与促红细胞生成素的N-端和/或内部赖氨酸残基之间形成共价键，以便获得蛋白质缀合物，所述蛋白质缀合物包含一个促红细胞生成素分子和一个聚(乙二醇)残基。在一个实施方案中，使用分子量在5kDa至40kDa之间的NHS-活化的直链或支链PEG分子，在水溶液中进行促红细胞生成素的聚乙二醇化。
本申请中所用的术语“在适于结合的条件下”及其语法上的相当的表述表示，目标物质(例如聚乙二醇化的促红细胞生成素)在与固定相(例如离子交换材料)接触时与之结合。这不一定表示100％的目标物质与固定相结合，而表示基本上100％的目标物质与固定相结合，即至少50％的目标物质与固定相结合，至少75％的目标物质与固定相结合，至少85％的目标物质与固定相结合或者95％以上目标物质与固定相结合。
促红细胞生成素和聚(乙二醇)的化学融合或缀合通常产生不同化合物的混合物，所述化合物例如多聚乙二醇化的促红细胞生成素(寡聚乙二醇化的促红细胞生成素)、单聚乙二醇化的促红细胞生成素(具有单个聚(乙二醇残基)、未聚乙二醇化的促红细胞生成素、活化的PEG酯的水解产物以及促红细胞生成素本身的水解产物。为了获得基本上均质形式的单聚乙二醇化的促红细胞生成素，必须对这些物质进行除去/相互分离。
因此，本文报道的一个方面是，提供了用于获得包含促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基的蛋白质的方法，所述方法包括下述步骤：
a)将溶液应用于包含阳离子交换色谱材料的柱，所述溶液包含促红细胞生成素以及促红细胞生成素与聚(乙二醇)的缀合物的混合物，在所述缀合物中每个促红细胞生成素分子具有一个或多个聚(乙二醇)残基，所述柱已经应用了具有约2.4-约2.7的pH的第一溶液，
b)应用相对于具有pH值为约2.4至约2.7的第一溶液具有增加的pH值的第二溶液，
c)将具有逐渐增加的电导率的溶液应用于柱，从而分别地回收蛋白质和促红细胞生成素，所述蛋白质包含促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基，从而首先回收包含促红细胞生成素和单个(乙二醇)残基的蛋白质。
在一个实施方案中，阳离子交换色谱材料是强阳离子交换色谱材料。在一个实施方案中，阳离子交换色谱材料是SP-650色谱材料。在一个实施方案中，阳离子交换色谱材料是SP-650M色谱材料。
在一个实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液是具有恒定电导率值的溶液。在一个实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液和/或具有约2.4至约2.7pH的第一溶液具有约17mS/cm至约19mS/cm的恒定电导率值。在一个实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液具有约2.7至约3.0的pH并且具有约17mS/cm至约19mS/cm的电导率值。
在一个实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液具有约2.7至约3.2的pH并且具有约17mS/cm至约19mS/cm的电导率值。在一个实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液具有约2.7至约3.0的pH并且具有约17mS/cm至约19mS/cm的电导率值。在一个优选的实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液具有约2.7至约2.9的pH并且具有约17mS/cm至约19mS/cm的电导率值，或约2.7至约3.0的pH和约17mS/cm至约18mS/cm的电导率值。
在一个实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液和具有约2.4至约2.7pH的第一溶液具有大约相同的恒定电导率值。
在一个实施方案中，阳离子交换色谱材料具有带有磺丙基作为官能团的甲基丙烯酸酯的基质。在一个实施方案中，阳离子交换色谱材料具有约65μm的粒径。
该方法特别适用于纯化聚乙二醇化的重组促红细胞生成素，后者是糖基化的，即其已由哺乳动物细胞制备，在一个实施方案中，由CHO细胞或HEK293细胞或BHK细胞或Per.细胞或HeLa细胞制备，并且随后被化学地聚乙二醇化。
在所述方法的第一步中，促红细胞生成素被聚乙二醇化。在聚乙二醇化反应中所用的聚(乙二醇)(PEG)聚合物分子具有约20kDa至40kDa的分子量(本文使用的术语“分子量”应当被理解为PEG的平均分子量，因为PEG作为聚合化合物不是以确定的分子量被获得的，而事实上是具有分子量分布；术语“约”表示，在PEG制备物中，一些分子的重量大于标示分子量，一些分子的重量小于标示分子量，即术语“约”是指这样的分子量分布：其中95％的PEG分子具有在标示分子量+/-10％以内的分子量。例如，30kDa的分子量表示27kDa至33kDa的范围)。
术语“促红细胞生成素”和它的缩写“EPO”是指，具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质，或者基本上与之同源的蛋白质或多肽，其生物学性质与刺激红血细胞产生和刺激骨髓中定型红系祖细胞的分裂和分化有关。可以如下制备重组促红细胞生成素：通过重组DNA技术或通过内源性基因活化(即，通过内源性基因活化表达促红细胞生成素糖蛋白质)，在真核细胞中(例如在CHO细胞或BHK细胞或HeLa细胞中)表达，参见例如US5,733,761、US 5,641,670、US 5,733,746、WO 93/09222、WO 94/12650、WO 95/31560、WO90/11354、WO 91/06667和WO 91/09955。在一个实施方案中，促红细胞生成素是人EPO。在一个实施方案中，人促红细胞生成素具有在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中描述的氨基酸序列。在一个实施方案中，人促红细胞生成素具有在SEQ ID NO：1中描述的氨基酸序列。术语“促红细胞生成素”也表示SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的蛋白质的变体，其中一个或多个氨基酸残基已经被改变、缺失或插入，并且其具有与未修饰的蛋白质可比较的生物学活性，例如在EP 1 064 951或US 6,583,272中所报道的那些。变体可以具有含有1-6个额外糖基化位点的人促红细胞生成素的氨基酸序列。通过本领域已知的多种测定法，可以确定聚乙二醇化的促红细胞生成素的比活性。纯化的聚乙二醇化的促红细胞生成素的生物活性会使得，通过给人患者注射施用蛋白质，导致与未注射的或对照组的个体相比，骨髓细胞会增加网织红细胞和红血细胞的产生。通过Bristow,A.,Pharmeuropa Spec.Issue BiologicalsBRP Erythropoietin Bio 97-2(1997)31-48的方法，可以试验根据在本文中报道的方法获得和纯化的聚乙二醇化的促红细胞生成素的生物活性。
通过将适当的修饰引入编码促红细胞生成素的核苷酸序列中，或通过肽合成，可以制备促红细胞生成素的氨基酸序列变体。这样的修饰包括例如在促红细胞生成素的氨基酸序列内删除残基和/或插入残基和/或替换残基。可以进行删除、插入和替换的任意组合，以获得最终的构建体，前提条件是，最终的构建体具有与人促红细胞生成素可比较的生物活性。
保守氨基酸替换显示在表1中“优选替换”的标题下。更多的实质变化提供在表1中，在“示例性替换”的标题下，并且在下面参照氨基酸侧链类别进行了描述。可以将氨基酸替换引入人促红细胞生成素中，并且针对人促红细胞生成素的生物活性的保留来筛选产物。
表1
根据共有的侧链性质，可以将氨基酸分组：
(1)疏水的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性的：Asp、Glu；
(4)碱性的：His、Lys、Arg；
(5)影响链定向的残基：Gly、Pro；
(6)芳族的：Trp、Tyr、Phe。
非保守替换是指，将这些类别之一的一个成员替换为另一类。
促红细胞生成素的化学聚乙二醇化通常产生包含促红细胞生成素的蛋白质制备物，所述促红细胞生成素在赖氨酸残基的一个或多个ε-氨基处和/或在N-端氨基处被聚乙二醇化。根据Felix,A.M.等人，ACS Symp.Ser.680(Poly(ethylene glycol))(1997)218-238，可以进行在N-端氨基酸处的选择性的聚乙二醇化。通过使Nα-聚乙二醇化的氨基酸衍生物与肽链的N-1端氨基酸偶联，可以在固相合成过程中实现选择性的N-端聚乙二醇化。通过使Nε-聚乙二醇化的赖氨酸衍生物与生长链偶联，可以在固相合成过程中实现侧链聚乙二醇化。如上所述在固相合成内，或者通过将活化的PEG试剂应用至氨基脱保护的肽上进行溶液相合成，组合的N-端和侧链聚乙二醇化是可行的。
适合的PEG衍生物是这样的活化的PEG分子：在一个实施方案中，其具有约5kDa至约40kDa的平均分子量，在另一个实施方案中，其具有约20kDa至约40kDa的平均分子量，并且在进一步的实施方案中，其具有约30kDa至约35kDa的平均分子量。PEG衍生物可以是直链或支链PEG。多种适合用于制备PEG-蛋白质和PEG-肽缀合物的PEG衍生物是可利用的。
活化的PEG衍生物是本领域已知的，并且描述在例如M Morpurgo,M.等人，J.Bioconjug.Chem.7(1996)363-368中(就PEG-乙烯基砜而言)。直链和支链PEG种类适用于制备聚乙二醇化的片段。反应性的PEG试剂的实例是碘-乙酰基-甲氧基-PEG或甲氧基-PEG-乙烯基砜(在一个实施方案中，m是约450至约900的整数，并且R是具有1-6个碳原子的直链或支链低级烷基，例如甲基、乙基、异丙基等，其中甲基是优选的)：
这些碘-活化的物质的应用是本领域已知的，并且描述在例如Hermanson,G.T.，Bioconjugate Techniques,Academic Press,San Diego(1996)pp.147-148中。
在一个实施方案中，PEG种类是活化的PEG酯，例如N-羟基琥珀酰亚胺基丙酸酯或N-羟基琥珀酰亚胺基丁酸酯或N-羟基琥珀酰亚胺，例如PEG-NHS(Monfardini,C.等人，Bioconjugate Chem.6(1995)62-69)。在一个实施方案中，PEG被N-羟基琥珀酰亚胺酯活化
其中使用烷氧基-PEG-N-羟基琥珀酰亚胺，例如甲氧基-PEG-N-羟基琥珀酰亚胺(MW 30000)，其中R和m如上定义。在一个实施方案中，PEG种类是甲氧基聚(乙二醇)-丁酸的N-羟基琥珀酰亚胺基酯。术语“烷氧基”是指烷基醚基团，其中术语‘烷基’是指包含最大值4个碳原子的直链或支链烷基，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基等，优选甲氧基。
术语“基本上均质形式”表示，所获得的、所含有的或所使用的促红细胞生成素蛋白质融合物或缀合物是具有确定数量的连接的PEG残基的那些。在一个实施方案中，聚乙二醇化的促红细胞生成素是单聚乙二醇化的促红细胞生成素。该制备物可以含有未反应的(即缺少PEG基团的)促红细胞生成素、多聚乙二醇化的促红细胞生成素以及在聚乙二醇化反应过程中产生的多肽片段。术语“基本上均质形式”表示，单聚乙二醇化的促红细胞生成素制备物含有至少50％(w/w)的单聚乙二醇化的促红细胞生成素或至少75％的单聚乙二醇化的促红细胞生成素或至少90％的单聚乙二醇化的促红细胞生成素或超过95％的单聚乙二醇化的促红细胞生成素。百分比数值是基于色谱图的面积％，所述色谱图与用于获得单聚乙二醇化的促红细胞生成素的色谱方法相对应。
本文报道了用于纯化聚乙二醇化的促红细胞生成素，以便获得基本上均质形式的单聚乙二醇化的促红细胞生成素的方法。已经发现，可以仅使用/利用单一色谱步骤改善纯化方法，从而产生简化和技术上更切实可行的方法。
因此，本发明提供了方法，所述方法在单个色谱步骤中，使用SP-650色谱材料，通过引入/应用洗涤步骤(除了正常的洗涤步骤)来获得/产生/纯化单聚乙二醇化的促红细胞生成素，该方法使用具有相应于第一个洗涤步骤中的pH值增加的pH值的溶液。已经发现在单聚乙二醇化的促红细胞生成素中的寡聚乙二醇化的促红细胞生成素的杂质的除去/减少可以通过使用这种额外的洗涤步骤来改善。
因此，如本文所报道的，获得/产生/纯化包含促红细胞生成素和单一聚(乙二醇)残基的蛋白质的方法包括以下步骤：
a)将溶液应用于包含SP-650作为色谱材料的柱，所述溶液包含促红细胞生成素以及促红细胞生成素与聚(乙二醇)的缀合物的混合物，在所述缀合物中每个促红细胞生成素分子具有一个或多个聚(乙二醇)残基，所述柱已经应用了具有约2.4至约2.7的pH的第一溶液，
b)应用相对于具有pH值为约2.4至约2.7的第一溶液具有增加的pH值的第二溶液，
c)将具有逐渐增加的电导率的溶液应用于柱，从而回收包含促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基是蛋白质。
已经发现，如果在应用具有增加的pH的洗涤溶液后，再应用具有更低pH的第一洗涤溶液，则从副产物中分离单聚乙二醇化的促红细胞生成素/除去副产物得到改善。因此，在一个实施方案中，该方法还包括在步骤b)之后和步骤c)之前再应用具有约2.4至约2.7的pH的第一溶液的步骤。
已经发现，在额外/第二洗涤步骤中，第二溶液应当具有增加的pH值，其中这种增加达到一定量级。
在一个实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液的pH是具有约2.7至约3.1的pH的溶液。在一个优选的实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液的pH是具有约2.7至约3.0的pH的溶液。在一个优选的实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液的pH是具有约2.7至约2.9的pH的溶液。在一个实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液的pH是具有约2.8至约3.0的pH的溶液。
在一个实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液的pH比第一溶液增加至多25％。在一个实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液的pH比第一溶液增加至多20％。在一个实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液的pH比第一溶液增加至多15％。
在一个实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液的pH比第一溶液增加0.5个pH单位。在一个实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液的pH比第一溶液增加0.4个pH单位。在一个实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液的pH比第一溶液增加0.3个pH单位。在一个实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液的pH比第一溶液增加0.2个pH单位。在一个实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液的pH比第一溶液增加0.1个pH单位。
在一个实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液的pH比第一溶液增加0.1-0.5个pH单位。在一个实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液的pH比第一溶液增加0.3-0.5个pH单位。
应当将具有增加的pH值的溶液作为具有恒定电导率的溶液应用，即电导率值至多改变+/-10％，优选至多改变+/-5％。
在一个实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液是具有恒定电导率值的溶液。在一个实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液和/或具有约2.4至约2.7的pH的第一溶液具有约17mS/cm的恒定电导率值。在一个实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液和/或具有约2.4至约2.7的pH的第一溶液具有约18mS/cm的恒定电导率值。在一个实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液和/或具有约2.4至约2.7的pH的第一溶液具有约19mS/cm的恒定电导率值。在一个实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液具有约2.7至约3.0的pH并且具有约17mS/cm的电导率值。在一个实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液具有约2.7至约3.0的pH并且具有约18mS/cm的电导率值。在一个实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液具有约2.7至约2.9的pH并且具有约19mS/cm的电导率值。
在一个实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液具有约2.7至约3.0的pH，并且具有约17mS/cm至约19mS/cm的电导率值。在一个优选的实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液具有约2.7至约2.9的pH，并且具有约17mS/cm至约19mS/cm的电导率值。
在本领域中应理解，pH和电导率彼此相关。因此，如果导电率也改变，则洗涤溶液的pH值可以与上述不同。例如，当电导率更低时，pH可以增加到更高的程度，同时实现相当的纯化结果。
已经发现，当应用具有增加的pH值的溶液时，电导率应当相对于第一洗涤溶液保持恒定。在一个实施方案中，具有增加的pH值的第二溶液和具有约2.4至约2.7的pH值的第一溶液具有大约相同的恒定电导率值。
在从色谱材料中回收多聚乙二醇化的促红细胞生成素后，通过增加电导率开始洗脱单聚乙二醇化的促红细胞生成素。通过色谱材料的流动相的电导率是线性或逐步增加的。
在一个实施方案中，具有逐渐增加的电导率的溶液具有线性或逐步增加的电导率。
在电导率梯度中，首先从柱上回收单聚乙二醇化的促红细胞生成素，然后，回收基本上均质的非聚乙二醇化的促红细胞生成素。
在一个实施方案中，通过应用具有逐渐增加的氯化钠浓度的溶液增加电导率。在一个实施方案中，用于增加电导率的溶液具有pH 2.5至pH 3.5的pH值。
在一个实施方案中，将包含游离促红细胞生成素和游离聚(乙二醇)以及促红细胞生成素与聚(乙二醇)的融合蛋白质(即蛋白质缀合物)的混合物的溶液应用于色谱材料，所述融合蛋白质中每个促红细胞生成素分子包含一个或多个聚(乙二醇)残基，其中以1mg/mL至4mg/mL蛋白质应用于1mL色谱材料。
已经发现，如本文报道的方法(特别是当使用SP-650作为色谱材料时)可以用于大规模纯化蛋白质。
在一个实施方案中，该方法用于大规模蛋白质制备，其中步骤a)的色谱柱具有至少30cm的直径。
术语“SP-650色谱材料”是指阳离子交换色谱材料(可从TosohCorporation得到)。SP-650色谱材料具有带有磺丙基作为官能团的甲基丙烯酸酯基质，并且因此是强阳离子交换色谱材料。SP-650M色谱材料具有65μm的粒径。
在一个实施方案中，阳离子交换色谱材料具有甲基丙烯酸酯基质。在一个实施方案中，阳离子交换色谱材料具有磺丙基作为官能团。在一个实施方案中，阳离子交换色谱材料具有带有磺丙基作为官能团的甲基丙烯酸酯基质。在一个实施方案中，阳离子交换色谱材料具有约65μm的粒径。
提供下述实施例、序列表和附图以帮助理解本发明，本发明的实际范围在所附的权利要求中给出。应当理解，在不背离本发明的主旨的情况下可以对所述方法进行修改。
序列表的描述
SEQ ID NO：01 人促红细胞生成素的氨基酸序列。
SEQ ID NO：02 人促红细胞生成素的氨基酸序列。
附图描述
图1使用实施例1报道的方法纯化聚乙二醇化的促红细胞生成素制备物的洗脱色谱图(洗涤，在pH 2.5；无额外洗涤步骤)。
图2使用实施例3报道的方法纯化聚乙二醇化的促红细胞生成素制备物的洗脱色谱图(洗涤，在pH 2.5；额外洗涤步骤，在pH 2.8)。
图3使用实施例3报道的方法纯化聚乙二醇化的促红细胞生成素制备物的洗脱色谱图(图2)的放大图(洗涤，在pH 2.5；额外洗涤步骤，在pH 2.8)。
图4使用实施例2报道的方法纯化聚乙二醇化的促红细胞生成素制备物的洗脱色谱图(洗涤，在pH 3.0；无额外洗涤步骤)。
图5使用实施例4报道的方法纯化聚乙二醇化的促红细胞生成素制备物的洗脱色谱图(洗涤，在pH 2.5；额外洗涤步骤，在pH 3.0)。
实施例1
使用SP-650M色谱材料，无额外洗涤步骤(pH 2.5)的聚乙二醇化的促红细胞生成素的色谱
聚乙二醇化的促红细胞生成素色谱如下所示进行。
聚乙二醇化的促红细胞生成素色谱：
树脂：SP Toyopearl 650M
床体积：19.6mL
上样：1.3mg/mL树脂
流速：1.3mL/分钟
溶液：A：100mM磷酸钾，100mM氯化钠，调节至pH 2.5，调节至LF＝19mS/cm(用5m氯化钠)
B：100mM磷酸钾，375mM氯化钠，调节至pH 2.5
应用溶液：100％A
洗涤溶液：100％A
洗涤体积：100mL(5个柱体积(CV))
洗涤溶液(洗涤2)：无
洗涤体积(洗涤2)：无
线性梯度洗脱溶液：100％B
线性梯度：在196mL(10个柱体积)内至100％B
波长：280nm
该方法的洗脱色谱图如图1中所示。
实施例2
使用SP-650M色谱材料，无额外洗涤步骤(pH 3.0)的聚乙二醇化的促红细胞生成素的色谱
聚乙二醇化的促红细胞生成素色谱如下所示进行。
聚乙二醇化的促红细胞生成素色谱：
树脂：SP Toyopearl 650M
床体积：19.6mL
上样：1.3mg/mL树脂
流速：1.3mL/分钟
溶液：A：100mM磷酸钾，100mM氯化钠，调节至pH 3.0，电导率值＝20.5mS/cm
B：100mM磷酸钾，375mM氯化钠，调节至pH 2.5
应用溶液：100％A
洗涤溶液：100％A
洗涤体积：100mL(5个柱体积(CV))
洗涤溶液(洗涤2)：无
洗涤体积(洗涤2)：无
线性梯度洗脱溶液：100％B
线性梯度：196mL(10个柱体积)内至100％B
波长：280nm
该方法的洗脱色谱图如图4中所示。
实施例3
使用SP-650M色谱材料，具有使用pH 2.8和约19mS/cm电导率的溶液的额外洗涤步骤的聚乙二醇化的促红细胞生成素的色谱
聚乙二醇化的促红细胞生成素色谱如下所示进行：
树脂：SP Toyopearl 650M
床体积：19.6mL
上样：1.3mg/mL树脂
流速：1.3mL/分钟
溶液：A：100mM磷酸钾，100mM氯化钠，调节至pH 2.5，调节至LF＝19mS/cm(用5m氯化钠)
B：100mM磷酸钾，375mM氯化钠，调节至pH 2.5
额外洗涤(洗涤2)：100mM磷酸钾，100mM氯化钠，调节至pH 2.8，调节至LF＝19mS/cm(用水)
应用溶液：100％A
洗涤溶液：100％A
洗涤体积：100mL(5个柱体积(CV))
洗涤溶液(洗涤2)：100％额外洗涤(洗涤2)
洗涤体积(洗涤2)：100mL(5个柱体积(CV))
洗涤溶液(洗涤3)：100％A
洗涤体积(洗涤3)：60mL(3个柱体积(CV))
线性梯度洗脱溶液：100％B
线性梯度：196mL(10个柱体积)内至100％B
波长：280nm
该方法的洗脱色谱图如图2中所示并且放大图如图3中所示。
实施例4
使用SP-650M色谱材料，具有使用pH 3.0和约19mS/cm电导率的溶液的额外洗涤步骤的聚乙二醇化的促红细胞生成素的色谱
聚乙二醇化的促红细胞生成素色谱如下所示进行：
树脂：SP Toyopearl 650M
床体积：19.6mL
上样：1.3mg/mL树脂
流速：1.3ml/分钟
溶液：A：100mM磷酸钾，100mM氯化钠，调节至pH 2.5，调节至LF＝19mS/cm(用5m氯化钠)
B：100mM磷酸钾，375mM氯化钠，调节至pH 2.5
额外洗涤(洗涤2)：100mM磷酸钾，100mM氯化钠，调节至pH 3.0，调节至LF＝19mS/cm(用水)
应用溶液：100％A
洗涤溶液：100％A
洗涤体积：100mL(5个柱体积(CV))
洗涤溶液(洗涤2)：100％额外洗涤(洗涤2)
洗涤体积(洗涤2)：100mL(5个柱体积(CV))
洗涤溶液(洗涤3)：100％A
洗涤体积(洗涤3)：60mL(3个柱体积(CV))
线性梯度洗脱溶液：100％B
线性梯度：196mL(10个柱体积)内至100％B
波长：280nm
该方法的洗脱色谱图如图5中所示。
实施例5
使用SP-650M色谱材料，具有使用不同pH值(pH 2.8、2.9或3.0)和约17mS/cm电导率的溶液的额外洗涤步骤的聚乙二醇化的促红细胞生成素的色谱
聚乙二醇化的促红细胞生成素色谱如下所示进行：
树脂：SP Toyopearl 650M
床体积：19.2mL
上样：0.7mg/mL树脂
流速：150cm/小时
溶液：A：100mM磷酸钾，100mM氯化钠，调节至pH 2.5，调节至LF＝17mS/cm(用5m氯化钠)
B：100mM磷酸钾，375mM氯化钠，调节至pH 2.5
额外洗涤(洗涤2)：100mM磷酸钾，100mM氯化钠，调节至pH 2.8、2.9或3.0，调节至LF＝17mS/cm(用水)
应用溶液：100％A
洗涤溶液：100％A
洗涤体积：96.2mL(5个柱体积(CV))
洗涤溶液(洗涤2)：100％额外洗涤(洗涤2)
洗涤体积(洗涤2)：96.2mL(5个柱体积(CV))
洗涤溶液(洗涤3)：100％A
洗涤体积(洗涤3)：57.7mL(3个柱体积(CV))
线性梯度洗脱溶液：100％B
线性梯度：192mL(10个柱体积)内至100％B
波长：280nm
结果如下所示：
收率基于原料中的单聚乙二醇化的EPO含量计算。
实施例6
使用SP-650M色谱材料，具有使用不同pH值(pH 2.8、2.9或3.0)和约18mS/cm电导率的溶液的额外洗涤步骤的聚乙二醇化的促红细胞生成素的色谱
聚乙二醇化的促红细胞生成素色谱如下所示进行：
树脂：SP Toyopearl 650M
床体积：19.2mL
上样：0.7mg/mL树脂
流速：150cm/h
溶液：A：100mM磷酸钾，100mM氯化钠，调节至pH 2.5，调节至LF＝18mS/cm(用5m氯化钠)
B：100mM磷酸钾，375mM氯化钠，调节至pH 2.5
额外洗涤(洗涤2)：100mM磷酸钾，100mM氯化钠，调节至pH 2.8、2.9或3.0，调节至LF＝18mS/cm(用水)
应用溶液：100％A
洗涤溶液：100％A
洗涤体积：96.2mL(5个柱体积(CV))
洗涤溶液(洗涤2)：100％额外洗涤(洗涤2)
洗涤体积(洗涤2)：96.2mL(5个柱体积(CV))
洗涤溶液(洗涤3)：100％A
洗涤体积(洗涤3)：57.7mL(3个柱体积(CV))
线性梯度洗脱溶液：100％B
线性梯度：192mL(10个柱体积)内至100％B
波长：280nm
结果如下所示：
收率基于原料中的单聚乙二醇化的EPO含量计算。
实施例7
使用SP-650M色谱材料，具有使用不同pH值(pH 2.8、2.9或3.0)和约19mS/cm电导率的溶液的额外洗涤步骤的聚乙二醇化的促红细胞生成素的色谱
聚乙二醇化的促红细胞生成素色谱如下所示进行：
树脂：SP Toyopearl 650M
床体积：19.2mL
上样：0.7mg/mL树脂
流速：150cm/小时
溶液：A：100mM磷酸钾，100mM氯化钠，调节至pH 2.5，调节至LF＝19mS/cm(用5m氯化钠)
B：100mM磷酸钾，375mM氯化钠，调节至pH 2.5
额外洗涤(洗涤2)：100mM磷酸钾，100mM氯化钠，调节至pH 2.8、2.9或3.0，调节至LF＝19mS/cm(用水)
应用溶液：100％A
洗涤溶液：100％A
洗涤体积：96.2mL(5个柱体积(CV))
洗涤溶液(洗涤2)：100％额外洗涤(洗涤2)
洗涤体积(洗涤2)：96.2mL(5个柱体积(CV))
洗涤溶液(洗涤3)：100％A
洗涤体积(洗涤3)：57.7mL(3个柱体积(CV))
线性梯度洗脱溶液：100％B
线性梯度：196mL(10个柱体积)内至100％B
波长：280nm
结果如下所示：
收率基于原料中单聚乙二醇化的EPO含量计算。

Claims (14)

1.用于纯化包含促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基的蛋白质的方法，该方法包括下述步骤：
a)将溶液应用于包含色谱材料的柱，所述色谱材料具有带有磺丙基作为官能团的甲基丙烯酸酯基质，所述溶液包含促红细胞生成素以及促红细胞生成素与聚(乙二醇)的缀合物的混合物，在所述缀合物中每个促红细胞生成素分子具有一个或多个聚(乙二醇)残基，所述柱已经应用了具有约2.4至约2.7的pH的第一溶液，
b)应用相对于第一溶液具有增加的pH值的第二溶液，
c)将具有增加了或逐渐增加的电导率的溶液应用于柱，从而回收包含促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基的蛋白质。
2.权利要求1的方法，其特征在于该方法还包括在步骤b)之后和步骤c)之前再应用具有约2.4至约2.7的pH的第一溶液的步骤。
3.权利要求1或2任一项的方法，其特征在于具有增加的pH值的第二溶液是具有约2.7至约3.0的pH的溶液。
4.权利要求1-3任一项的方法，其特征在于具有增加的pH值的第二溶液是具有恒定电导率值的溶液。
5.权利要求1-4任一项的方法，其特征在于具有增加的pH值的第二溶液和具有约2.4至约2.7的pH的第一溶液具有大约相同的恒定电导率值。
6.权利要求1-5任一项的方法，其特征在于具有增加的pH值的第二溶液和/或具有约2.4至约2.7的pH的第一溶液具有约17mS/cm至约19mS/cm的恒定电导率值。
7.权利要求1-6任一项的方法，其特征在于具有增加的pH值的第二溶液具有约2.7至约3.0的pH并且具有约17mS/cm至约19mS/cm的电导率值。
8.权利要求1-7任一项的方法，其特征在于不将包含促红细胞生成素以及促红细胞生成素和聚(乙二醇)的缀合物的混合物的溶液调节至约19mS/cm的电导率值，在所述缀合物中每个促红细胞生成素分子具有一个或多个聚(乙二醇)残基。
9.权利要求1-8任一项的方法，其特征在于具有逐渐增加的电导率的溶液是具有逐渐增加的氯化钠浓度的溶液。
10.权利要求1-9任一项的方法，其特征在于具有逐渐增加的电导率的溶液具有线性或逐步增加的电导率。
11.权利要求1-10任一项的方法，其特征在于该方法用于大规模蛋白质制备，其中步骤a)的色谱柱具有至少30cm的直径。
12.权利要求1-11任一项的方法，其特征在于促红细胞生成素是人促红细胞生成素。
13.权利要求12的方法，其特征在于人促红细胞生成素具有SEQ ID NO：01或SEQ IDNO：02的氨基酸序列。
14.权利要求1-13任一项的方法，其特征在于单个聚(乙二醇)残基具有20kDa至40kDa的分子量。
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