KR102470282B1

KR102470282B1 - Ｐｅｇ화 에리트로포이에틴을 정제하기 위한 방법

Info

Publication number: KR102470282B1
Application number: KR1020197001213A
Authority: KR
Inventors: 로베르토 팔켄슈타인; 베른하르트 슈펜스베르거
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2016-07-15
Filing date: 2017-07-13
Publication date: 2022-11-24
Also published as: CA3027143A1; IL264153B; AU2017295037A1; PL3484911T3; WO2018011381A1; HRP20202077T1; EP3484911B1; US20210155655A1; IL264153A; CN109415427A; US11993630B2; BR112018076390A2; AU2017295037B2; ES2841648T3; MX2018016033A; KR20190026759A; US20190300567A1; EP3484911A1; JP2023015257A; KR20220158870A

Abstract

본원에는 양이온 교환 크로마토그래피 방법에 의해, 에리트로포이에틴과 단일 폴리(에틸렌글리콜) 잔기를 포함하는 단백질을 반응 부산물들 또는 미반응 출발 재료로부터 정제하기 위한 방법이 보고되어 있다. 양이온 교환 Toyopearl® SP-650 크로마토그래피 재료를 사용하고, 제1 세척 단계의 pH값에 비하여 pH값이 상승한 제2 세척 용액을 사용함으로써, 에리트로포이에틴과 단일 폴리(에틸렌글리콜) 잔기를 포함하는 융합 단백질은 단일 단계에서 고 순도와 고 수율로, 그리고 대규모 적용에 대한 적합성을 보이며 수득될 수 있음이 확인되었다.

Description

ＰＥＧ화 에리트로포이에틴을 정제하기 위한 방법

본원에는 양이온 교환 크로마토그래피 재료를 사용하는 단일 컬럼 공정으로 PEG화 에리트로포이에틴을 정제하기 위한 방법이 보고되어 있다.

단백질은 오늘날의 의학적 포트폴리오에 있어서 중요한 역할을 담당한다. 인간에의 적용을 위해 모든 치료용 단백질은 변별적 기준을 충족하여야 한다. 생물약제학 제제의 인간에 대한 안전성을 보장하기 위해, 제조 공정 중 축적되는 부산물은 특히 제거되어야 한다. 규제 사양(regulatory specification)을 충족하기 위해 하나 이상의 정제 단계가 제조 공정에 따라야 한다. 여타의 것들 중 순도, 처리량 및 수율은 적당한 정제 공정을 결정하는데 중요한 역할을 담당한다.

치료용 단백질의 접합체, 예컨대 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 인터루킨-6의 접합체(EP 0 442 724), PEG 및 에리트로포이에틴의 접합체(WO 01/02017), 엔도스타틴과 면역글로불린을 포함하는 키메라 분자(US 2005/008649), 분비된 항체 기반 융합 단백질(US 2002/147311), 알부민을 포함하는 융합 폴리펩티드(US 2005/0100991; 인간 혈청 알부민인 경우는 US 5,876,969), PEG화 폴리펩티드(US 2005/0114037), 그리고 에리트로포이에틴 융합체가 보고된 바 있다.

Necina, R.외 다수(Biotechnol. Bioeng. 60 (1998) 689-698)는, 고 전하 밀도를 보이는 이온 교환 매질에 의해 세포 배양 상청액으로부터 직접 인간 모노클로날 항체를 포착하는 것에 관하여 보고하였다. WO 89/05157에는 세포 배양 배지를 직접 양이온 교환 처리시킴으로써 면역글로불린 생성물을 정제하기 위한 방법이 보고되어 있다. 모노클로날 IgG 항체의 마우스 복수로부터의 1단계 정제는 Danielsson, A.외 다수에 의하여 기술되었다[J. Immun. Meth. 115 (1988) 79-88]. 이온 교환 크로마토그래피에 의해 폴리펩티드를 정제하기 위한 방법은, 하나 이상의 오염물로부터 관심 폴리펩티드를 분리하는데 구배 세척법(gradient wash)을 사용하는 WO 2004/024866에 보고되어 있다. EP 0 530 447에는, 3개의 크로마토그래피 단계들을 조합하여 수행함으로써 IgG 모노클로날 항체를 정제하기 위한 방법이 보고되어 있다. 모노-PEG화 인터루킨-1 수용체 길항체의 손쉬운 정제는 Yu, G.외 다수에 의해 보고되었다[Process Biotechnol. 42 (2007) 971-977]. Wang, H.외 다수는, 이.콜라이에서 발현된 hTFF3의 2단계 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제를 보고하고 있다[Peptides 26 (2005) 1213-1218]. Yun, Q.외 다수는, 2개의 연속 이온 교환 크로마토그래피 단계에 의한, PEG화된 rhG-CSF의 정제를 보고하고 있다[Yun, Q., et al., J. Biotechnol. 118 (2005) 67-74].

PEG화된 에리트로포이에틴을 SP Sephacryl S 500 HR 컬럼상에서 정제하기 위한 방법은 WO 2012/035037에 보고되어 있다.

WO 1999/057134는, 이온 교환 크로마토그래피에 의한 단백질 정제에 대해 보고하고 있다.

두 양이온 교환 크로마토그래피 단계에 동일 유형의 양이온 교환 재료가 사용되는, 2개의 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함하는, 모노-PEG화 에리트로포이에틴의 정제를 위한 방법이 WO 2009/010270에 보고되어 있다.

본원에는 양이온 교환 크로마토그래피 방법에 의해 에리트로포이에틴과 단일 폴리(에틸렌글리콜) 잔기를 포함하는 단백질 접합체를 반응 부산물들 또는 미반응 출발 재료로부터 정제하기 위한 방법이 보고되어 있다.

pH값이 상승한 세척 용액을 사용하는 세척 단계가 수행됨으로써 에리트로포이에틴과 단일 폴리(에틸렌글리콜) 잔기를 포함하는 접합 단백질은, 개선되고 간편한 방법에서 단일 단계로 양이온 교환 크로마토그래피 재료, 예컨대 Toyopearl® SP-650로부터 고 순도와 고 수율로 수득될 수 있음이 확인되었다.

2개의 순차적 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 수행하는, 에리트로포이에틴과 단일 폴리(에틸렌글리콜) 잔기를 포함하는 단백질 접합체에 대한 정제 공정과 비교되었을 때, 수율과 품질은 적어도 동등하거나 더 우수하다는 것도 확인되었다. 1 컬럼 공정은 공정의 확고함의 증진을 도모하면서 동일 품질의 달성을 허용한다. 이는 또한 제조 비용과 제조 시간을 줄여준다. 최종 수율은 모노-PEG화 에리트로포이에틴의 품질을 떨어뜨리지 않고 증가할 수 있다.

그러므로 본원에는 일 양태로서, 에리트로포이에틴과 단일 폴리(에틸렌글리콜) 잔기를 포함하는 단백질을 수득/정제/제조하기 위한 방법으로서, 하기 단계들, 즉

a) 에리트로포이에틴과, 에리트로포이에틴 분자당 하나 이상의 폴리(에틸렌글리콜) 잔기가 결합된 에리트로포이에틴 및 폴리(에틸렌글리콜)의 접합체의 혼합물을 포함하는 용액을, 크로마토그래피 재료로서 Toyopearl® SP-650을 포함하는 컬럼에 적용하는 단계[다만, 이때 pH 약 2.4 내지 약 2.7인 제1 용액이 적용됨];

b) 제1 용액(pH 약 2.4 내지 약 2.7)에 비하여 pH값이 증가한 제2 용액을 적용하는 단계;

c) 전도도가 증가하였거나 증가하는 용액을 컬럼에 적용함으로써, 에리트로포이에틴 및 단일 폴리(에틸렌글리콜) 잔기를 포함하는 단백질을 회수하는 단계

를 포함하는 방법이 보고되어 있다.

본원에는 일 양태로서, 에리트로포이에틴과 단일 폴리(에틸렌글리콜) 잔기를 포함하는 단백질을 수득/정제/제조하기 위한 방법으로서, 하기 단계들, 즉

a) 에리트로포이에틴과, 에리트로포이에틴 분자당 하나 이상의 폴리(에틸렌글리콜) 잔기가 결합된 에리트로포이에틴 및 폴리(에틸렌글리콜)의 접합체의 혼합물을 포함하는 용액을, 작용기로서 설포프로필을 보유하는 메타크릴레이트 매트릭스를 가지는 크로마토그래피 재료를 포함하는 컬럼에 적용하는 단계[다만, 이때 pH 약 2.4 내지 약 2.7인 제1 용액이 적용됨];

를 포함하는 방법이 보고되어 있다.

일 구현예에서, 본 방법은 단계 b) 이후 및 단계 c) 이전에 pH 약 2.4 내지 약 2.7인 제1 용액을 다시 적용하는 단계를 추가로 포함한다. 그러므로 일 구현예에는, 에리트로포이에틴과 단일 폴리(에틸렌글리콜) 잔기를 포함하는 단백질을 수득/정제/제조하기 위한 방법으로서, 하기 단계들, 즉

a) 에리트로포이에틴과, 에리트로포이에틴 분자당 하나 이상의 폴리(에틸렌글리콜) 잔기가 결합된 에리트로포이에틴 및 폴리(에틸렌글리콜)의 접합체의 혼합물을 포함하는 용액을, Toyopearl® SP-650 크로마토그래피 재료를 포함하는 컬럼에 적용하는 단계[다만, 이때 pH 약 2.4 내지 약 2.7인 제1 용액이 적용됨];

b) pH 약 2.4 내지 약 2.7인 제1 용액에 비하여 pH값이 증가한 제2 용액을 적용하는 단계;

b1) pH 약 2.4 내지 약 2.7인 제1 용액을 다시 적용하는 단계;

를 포함하는 방법이 보고되어 있다.

일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액은 pH 약 2.7 내지 약 3.2, 바람직하게 pH 약 2.7 내지 약 3.0인 용액이다.

일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액은 일정한 전도도 값을 가지는 용액이다.

일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액과, pH가 약 2.4 내지 약 2.7인 제1 용액은 거의 동일하고 일정한 전도도 값을 가진다.

일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액 및/또는 pH가 약 2.4 내지 약 2.7인 제1 용액은 전도도 값이 약 19 mS/cm, 바람직하게 전도도 값이 약 17 mS/cm 내지 약 19 mS/cm으로 일정하다.

일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액의 pH는 약 2.7 내지 약 3.2이고, 전도도 값은 약 19 mS/cm이다.

일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액은 인산염 완충 용액이다.

일 구현예에서, 에리트로포이에틴과, 에리트로포이에틴 분자당 하나 이상의 폴리(에틸렌글리콜) 잔기가 결합된 에리트로포이에틴 및 폴리(에틸렌글리콜)의 접합체의 혼합물을 포함하는 용액은 전도도 값 약 19 mS/cm로 조정되지 않는다.

일 구현예에서, 전도도가 증가하였거나 증가하는 용액은 염화나트륨 농도가 증가하였거나 증가하는 용액이다. 일 구현예에서, 전도도가 증가하였거나 증가하는 용액의 pH값은 pH 2.3 내지 pH 3.5이다.

일 구현예에서, 전도도가 증가하였거나 증가하는 용액은 단계적으로나 선형으로 증가하는 전도도를 보인다.

일 구현예에서, 본 방법은 단계 a)의 크로마토그래피 컬럼 직경이 적어도 30 cm인 대규모 단백질 제조에 사용된다.

일 구현예에서, 에리트로포이에틴은 인간 에리트로포이에틴이다. 일 구현예에서, 인간 에리트로포이에틴은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 가진다.

일 구현예에서, 단일 폴리(에틸렌글리콜) 잔기의 분자량은 20 kDa 내지 40 kDa이다.

본원에는 일 양태에 에리트로포이에틴 및 단일 폴리(에틸렌글리콜) 잔기를 포함하는 단백질을 수득하기 위한 방법으로서, 하기 단계들, 즉

a) 에리트로포이에틴과, 에리트로포이에틴 분자당 하나 이상의 폴리(에틸렌글리콜) 잔기가 결합된 에리트로포이에틴 및 폴리(에틸렌글리콜)의 접합체의 혼합물을 포함하는 용액을, 크로마토그래피 재료로서 Toyopearl® SP-650M을 포함하는 컬럼에 적용하는 단계[다만, 이때 pH 약 2.4 내지 약 2.7인 제1 용액이 적용됨];

a1) pH 약 2.4 내지 약 2.7인 제1 용액을 다시 적용하는 단계;

를 포함하는 방법이 보고되어 있다.

본원에는 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼, 예컨대 Toyopearl® SP-650을 포함하는 컬럼 상에서 구배 용리 방법이 진행되는 방법으로서, 양이온 교환 크로마토그래피/Toyopearl® SP-650 컬럼이 2가지 세척 용액으로 세척된 후, 하나의 에리트로포이에틴 분자와 하나의 폴리(에틸렌글리콜) 잔기를 포함하는 단백질의 회수/용리가 개시되는, 하나의 에리트로포이에틴 분자와 하나의 폴리(에틸렌글리콜) 잔기를 포함하는 단백질을 정제하기 위한 방법이 보고되어 있다. 본원에 있어서, 제2 세척 용액은 제1 세척 용액에 비하여 pH값이 증가한 것이다.

일반적인 크로마토그래피 방법과 이 방법의 용도는 당 업자에게 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[Heftmann, E., (ed.), Chromatography, 5^th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Elsevier Science Publishing Company, New York (1992); Deyl, Z., (ed.), Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands (1998); Poole, C.F., and Poole, S.K., Chromatography Today, Elsevier Science Publishing Company, New York (1991); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer Verlag (1982); Sambrook, J., et al., (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989); 또는 Ausubel, F.M., et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &　Sons, Inc., New York (1987-1994)]을 참조한다.

"~에 적용하는 것"이란 용어는, 정제 방법의 한 종속 단계, 즉 어떤 용액이 크로마토그래피 재료와 접촉하게 되는 단계를 지칭한다. 이는, a) 크로마토그래피 재료가 담겨있는 크로마토그래피 디바이스에 용액이 첨가되는 것, 또는 b) 크로마토그래피 재료가 용액에 첨가되는 것 중 어느 하나를 지칭한다. a)의 경우, 용액은 디바이스를 통과하고, 이때 크로마토그래피 재료와, 이 용액에 함유된 성분들 사이의 상호작용이 허용된다. 조건, 예컨대 pH, 전도도, 염 농도, 온도 및/또는 유속에 따라서, 용액 중 어떤 성분은 크로마토그래피 재료에 결합하게 되고, 이로 말미암아 추가 단계에서 크로마토그래피 재료로부터 회수될 수 있게 된다. 용액 중에 남아있던 성분들은 통과액(flow-through) 중에서 발견될 수 있다. "통과액"이란, 디바이스를 통과한 후 수득된 용액으로서, 컬럼을 세척하는데 사용되거나 또는 크로마토그래피 재료에 결합되어 있던 성분들의 용리를 유도하는데 사용되는, 적용된 용액이거나 완충 용액 중 어느 하나일 수 있는 용액을 지칭한다. 일 구현예에서, 디바이스는 컬럼 또는 카세트이다. b)의 경우, 크로마토그래피 재료는, 예컨대 고체로서 용액, 예컨대 정제될 관심 성분을 함유하는 용액에 첨가될 수 있으며, 이때 크로마토그래피 재료와 용액 중 성분들 사이의 상호작용이 허용된다. 상호작용 후 크로마토그래피 재료는, 예컨대 여과에 의해 제거되고, 크로마토그래피 재료에 결합되어 있던 성분도 또한 여과에 의해 용액으로부터 제거되는 반면, 크로마토그래피 재료에 결합되지 않은 성분들은 용액 중에 남게 된다.

"결합 및 용리 모드"란 용어는, 정제될 관심 성분을 함유하는 용액이 크로마토그래피 재료에 적용됨으로써, 관심 성분이 크로마토그래피 재료에 결합하게 되는 크로마토그래피 단계의 작동 모드를 지칭한다. 그러므로 관심 성분은 크로마토그래피 재료 상에 잔류하게 되는 반면, 비관심 성분은 통과액 또는 상청액과 함께 제거된다. 이후 관심 성분은 제2 단계에서 크로마토그래피 재료로부터 용리 용액과 함께 회수된다. 일 구현예에서, 본원에 보고된 바와 같은 방법은 결합 및 용리 모드로 작동된다.

본원에 보고된 바와 같은 방법에 사용되는 용액은 미정제 또는 완충 용액이다. "완충 용액"이란 용어는, 용해된 완충 성분에 의해 산성 또는 알칼리성 성분의 부가나 방출로 말미암은 pH 변화가 사라져 pH가 균일하게 된 용액을 지칭한다. 이러한 특성을 가지는 임의의 완충 성분이 사용될 수 있다. 일반적으로 약학적으로 허용 가능한 완충 성분이 사용된다. 일 구현예에서, 완충 용액은 인산 및/또는 이의 염으로 이루어진 인산염 완충 용액, 또는 아세트산 및 이의 염으로 이루어진 아세트산염 완충 용액, 또는 시트르산 및/또는 이의 염으로 이루어진 시트르산염 완충 용액, 또는 모폴린 완충 용액, 또는 2-(N-모폴리노)에탄설폰 완충 용액, 또는 히스티딘 완충 용액, 또는 글리신 완충 용액, 또는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(TRIS) 완충 용액으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 완충 용액은 인산염 완충 용액, 또는 아세트산염 완충 용액, 또는 시트르산염 완충 용액, 또는 히스티딘 완충 용액으로부터 선택된다. 선택적으로 완충 용액은 추가의 염, 예컨대 염화나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 시트르산나트륨 또는 시트르산칼륨을 포함할 수 있다. 당 분야에서는 완충 용액은 추후 이 완충 용액이 사용되는 조건과 거의 동일한 조건하에서 제조됨이 이해된다. 예를 들어 완충 용액의 pH는, 추후 의도된 공정에서 이 용액이 사용될 때의 온도와 거의 동일한 온도에서 조정된다. 예를 들어 만일 완충 용액이 4℃에서 수행되는 크로마토그래피 방법에서 사용되면, 완충 용액의 온도가 (예컨대 30℃가 아닌) 거의 동일한 온도에 도달하였을 때, pH는 조정될 것이다. 일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액은 인산염 완충 용액이다.

본 출원에 있어서 호환되어 사용되는 "연속 용리" 및 "연속 용리 방법"이란 용어는, 용리(즉 크로마토그래피 재료에 결합되어 있던 화합물이 이 재료로부터 회수되는 것)를 유도하는 용액의 전도도가 연속적으로 변하는(즉 상승하거나 강하되는) 방법, 즉 농도가 소폭만큼씩 연속으로 변하는(다만 각각의 폭들은 용리 유도 성분의 농도 변화율 2% 또는 변화율 1%보다 크지 않음) 방법을 지칭한다. 이러한 "연속 용리"에 있어서, 하나 이상의 조건, 예컨대 pH, 이온 세기, 염 농도 및/또는 크로마토그래피 속도는 선형으로, 또는 지수적으로, 또는 점근적으로 변할 수 있다. 일 구현예에서, 변화는 선형 변화이다.

본 출원에 있어서 호환되어 사용되는 "단계별 용리", "단계적 용리", "단계적 용리 방법" 및 "단계별 용리 방법"이란 용어는, 예컨대 용리(즉 재료에 결합되어 있던 화합물이 이 재료로부터 용해되는 것)를 유도하는 성분의 농도가 즉시, 즉 하나의 값/수준으로부터 그 다음의 값/수준으로 바로 상승하거나 강하되는 방법을 지칭한다. 이 "단계별 용리"에서, 하나 이상의 조건, 예컨대 pH, 이온 세기, 염 농도 및/또는 크로마토그래피 속도는 제1(예컨대 출발) 값으로부터 제2(예컨대 최종) 값으로 한 번에 변하는데, 즉 조건은 선형 변화와는 대조적으로 증분적, 즉 단계적으로 변한다. "단계별 용리 방법"에서는, 각각의 이온 세기 증가가 이루어진 후에 새로운 분획이 수집된다. 이러한 분획은 이온 교환 재료로부터 회수된 화합물들을 함유하되, 이 경우 이온 세기는 상응하여 증가한다. 이처럼 각 단계별 증가가 일어난 후, 조건은 용리 방법의 다음 단계가 진행될 때까지 유지된다. "단계별 용리"에 있어서, 하나 이상의 조건은 제1(예컨대 출발) 값으로부터 제2(예컨대 최종) 값으로 한 번에 변한다. 변화율은, 용리 유도 성분 농도의 10% 이상일 수 있다. 즉, 용리 유도 성분 농도의 경우 제1 단계에서 100%라면, 제2 단계에서는 110% 이상, 그리고 제3 단계에서는 120% 이상이다. 뿐만 아니라, 변화율은 용리 유도 성분 농도의 50% 이상일 수 있다. 또한 변화율은 용리 유도 성분 농도의 120% 이상일 수 있다. "단계별 용리"는, 조건이 선형 변화와는 대조적으로 증분적, 즉 단계적으로 변하는 경우를 지칭한다.

"이온 교환 크로마토그래피 재료"란 용어는, 이온 교환 크로마토그래피에서 정지 상으로 사용되는 것으로서, 하전 치환기들을 공유 결합시켜 운반하는 부동의 고분자량 매트릭스를 지칭한다. 전체적으로 중성인 하전 상태를 이루기 위해, 비 공유 결합 짝이온이 이에 결합되어 있다. "이온 교환 크로마토그래피 재료"는 자체의 비 공유 결합 짝이온을, 이 재료 주위 용액 중 유사하게 하전된 이온과 교환하는 능력을 가진다. 이 재료의 교환 가능한 짝이온 전하에 따라서, "이온 교환 수지"는 양이온 교환 수지 또는 음이온 교환 수지로서 지칭된다. 하전된 기(치환기)의 성질에 따라서, "이온 교환 수지"는, 예컨대 양이온 교환 수지의 경우에는 설폰산 수지(S), 또는 설포프로필 수지(SP) 또는 카복시메틸 수지(CM)라 지칭된다. 하전된 기/치환기의 화학적 성질에 따라서 "이온 교환 수지"는, 공유 결합된 하전 치환기의 세기에 따라 강 이온 교환 수지 또는 약 이온 교환 수지로 추가 분류될 수 있다. 예를 들어 강 양이온 교환 수지는 하전된 치환기로서 설폰산기, 바람직하게는 설포프로필기를 가지고, 약 양이온 교환 수지는 하전된 치환기로서 카복실기, 바람직하게 카복시메틸기를 가지며, 약 음이온 교환 수지는 하전된 치환기로서 디에틸아미노에틸기를 가진다. 일 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 재료는 강 양이온 교환 크로마토그래피 재료이다. 일 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 재료는 Toyopearl® SP-650 크로마토그래피 재료이다. 일 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 재료는 Toyopearl® SP-650 M 크로마토그래피 재료이다.

예컨대 폴리펩티드의 아미노산 서열을, 이 아미노산 서열을 암호화하는 상응 핵산 서열로 전환하는 절차 및 방법은 당 업자에게 널리 공지되어 있다. 그러므로 핵산은, 각각의 뉴클레오티드로 이루어진 자체의 핵산 서열, 그리고 이와 유사하게는 이 핵산 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 의해 특징지어진다.

"폴리(에틸렌글리콜)" 또는 "폴리(에틸렌글리콜) 잔기"란 용어는, 필수 부분으로서 폴리(에틸렌글리콜)을 함유하는 비단백 잔기를 지칭한다. 이러한 폴리(에틸렌글리콜) 잔기는 결합 반응에 필수인 것으로서, 분자의 화학 합성으로부터 유래하거나, 분자의 부분들 간에 최적 거리를 두기 위한 스페이서인 추가의 화학기를 함유할 수 있다. 이러한 추가의 화학 기는 폴리(에틸렌글리콜) 잔기의 분자량 산정시 사용되지 않는다. 뿐만 아니라 이러한 폴리(에틸렌글리콜) 잔기는 서로 공유 결합된 폴리(에틸렌글리콜) 사슬 하나 이상으로 이루어질 수 있다. 하나를 초과하는 PEG사슬을 가지는 폴리(에틸렌글리콜) 잔기는 다중 팔(multiarm) 또는 분지형 폴리(에틸렌글리콜) 잔기라 칭하여진다. 분지형 폴리(에틸렌글리콜) 잔기는, 예를 들어 다양한 폴리올, 예컨대 글리세롤, 펜타에리트롤 및 솔비톨에 폴리에틸렌 산화물을 부가함으로써 제조될 수 있다. 분지형 폴리(에틸렌글리콜) 잔기는, 예컨대 EP　0　473　084, US 5,932,462에 보고되어 있다. 일 구현예에서, 폴리(에틸렌글리콜) 잔기는 분자량이 20 kDa 내지 35 kDa이고, 선형인 폴리(에틸렌글리콜) 잔기이다. 다른 구현예에서, 폴리(에틸렌글리콜) 잔기는 분자량이 35 kDa 내지 40 kDa인 분지형 폴리(에틸렌글리콜) 잔기이다.

"폴리(에틸렌글리콜) 잔기와 에리트로포이에틴의 융합"이란 용어는, 에리트로포이에틴의 내부 리신 잔기 또는 N-말단에 폴리(에틸렌글리콜) 잔기가 화학적으로 도입된 공유 결합을 지칭한다. 융합은, 하나의 에리트로포이에틴 분자와 하나 이상의 폴리(에틸렌글리콜) 잔기/잔기들을 포함하는 단백질 접합체를 형성한다. 융합 과정은 또한 PEG화라고도 지칭되며, 이 PEG화의 생성물은 PEG화된 에리트로포이에틴이라 지칭된다. 폴리펩티드와 폴리(에틸렌글리콜) 잔기의 융합/접합은 기술 수준에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 Veronese, F.M.에 의해 검토되었다[Biomaterials 22 (2001) 405-417]. 폴리(에틸렌글리콜) 잔기는 상이한 작용기를 사용하여 결합될 수 있다. 상이한 분자량, 상이한 형태 및 상이한 결합기를 가지는 폴리(에틸렌글리콜)들이 사용될 수 있다[문헌(Francis, G.E., et al., Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18; Delgado, C., et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems 9 (1992) 249-304)도 또한 참조한다]. 에리트로포이에틴과 폴리(에틸렌글리콜) 잔기의 융합은, 예를 들어 WO 00/44785에 기술된 바와 같이 폴리(에틸렌글리콜) 잔기 시약과 함께 수용액 중에서 수행될 수 있다. Lu, Y.외 다수에 따르면, 융합은 또한 고체상에서 수행될 수 있다고 한다[Reactive Polymers 22 (1994) 221-229]. 무작위적이지 않은 N-말단 융합도 또한 WO 94/01451에 따라 달성될 수 있다.

"에리트로포이에틴과 폴리(에틸렌글리콜)을 융합하는 것" 및 "PEG화"라는 용어는, 하나의 에리트로포이에틴 분자와 하나의 폴리(에틸렌글리콜) 잔기를 포함하는 단백질 접합체를 수득하기 위해, 에리트로포이에틴의 N-말단에 있는 폴리(에틸렌글리콜) 잔기 및/또는 내부 리신 잔기 간에 공유 결합을 형성하는 것을 지칭한다. 일 구현예에서, 에리트로포이에틴의 PEG화는, 분자량이 5 kDa 내지 40 kDa인 NHS-활성화 선형 또는 분지형 PEG 분자를 사용하여 수용액 중에서 수행된다.

본 출원에서 사용되는 바와 같은 "결합에 적합한 조건하에"라는 용어와, 이의 문법상 동등한 표현은, 관심 성분, 예컨대 PEG화된 에리트로포이에틴이, 예컨대 이온 교환 재료와 접촉할 때, 이 관심 성분이 정지 상과 결합하는 경우를 지칭한다. 이는, 반드시 관심 성분 100%가 정지 상과 결합하는 경우를 지칭하는 것은 아니고, 본질적으로 관심 성분 100%가 정지 상과 결합하는 경우, 즉 관심 성분 적어도 50%가 정지 상과 결합하는 경우, 관심 성분 적어도 75%가 정지 상과 결합하는 경우, 관심 성분 적어도 85%가 정지 상과 결합하는 경우, 또는 95%를 초과하는 관심 성분이 정지 상과 결합하는 경우를 지칭한다.

에리트로포이에틴과 폴리(에틸렌글리콜)의 화학적 융합 또는 접합은, 일반적으로 상이한 화합물, 예컨대 폴리PEG화 에리트로포이에틴(올리고PEG화 에리트로포이에틴), (단일 폴리(에틸렌글리콜) 잔기를 가지는) 모노PEG화 에리트로포이에틴, 비PEG화 에리트로포이에틴, 활성화된 PEG 에스테르의 가수분해 생성물뿐만 아니라, 에리트로포이에틴 자체의 가수분해 생성물의 혼합물을 만들어낸다. 실질적으로 동종인 형태의 모노PEG화 에리트로포이에틴을 수득하기 위해, 이러한 성분들은 서로로부터 떨어지거나/서로간에 분리되어야 한다.

그러므로 에리트로포이에틴과 단일 폴리(에틸렌글리콜) 잔기를 포함하는 단백질을 수득하기 위한 방법으로서, 하기 단계들, 즉

a) 에리트로포이에틴과, 에리트로포이에틴 분자당 하나 이상의 폴리(에틸렌글리콜) 잔기가 결합된 에리트로포이에틴 및 폴리(에틸렌글리콜)의 접합체의 혼합물을 포함하는 용액을, 양이온 교환 크로마토그래피 재료를 포함하는 컬럼에 적용하는 단계[다만, 이때 pH 약 2.4 내지 약 2.7인 제1 용액이 적용됨];

c) 전도도가 증가하는 용액을 컬럼에 적용함으로써, 에리트로포이에틴 및 단일 폴리(에틸렌글리콜) 잔기를 포함하는 단백질과, 에리트로포이에틴을 별도로 회수하고, 이로써 에리트로포이에틴 및 단일 폴리(에틸렌글리콜) 잔기를 포함하는 단백질을 처음에 회수하는 단계

를 포함하는 방법을 제공하는 것은 본원에 보고된 바와 같은 일 양태이다.

일 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 재료는 강 양이온 교환 크로마토그래피 재료이다. 일 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 재료는 Toyopearl® SP-650 크로마토그래피 재료이다. 일 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 재료는 Toyopearl® SP-650 M 크로마토그래피 재료이다.

일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액은 일정한 전도도 값을 가지는 용액이다. 일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액 및/또는 pH가 약 2.4 내지 약 2.7인 제1 용액은 전도도 값이 약 17 mS/cm 내지 약 19 mS/cm으로 일정하다. 일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액의 pH는 약 2.7 내지 약 3.0이고, 전도도 값은 약 17 mS/cm 내지 약 19 mS/cm이다.

일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액의 pH는 약 2.7 내지 약 3.2이고, 전도도 값은 약 17 mS/cm 내지 약 19 mS/cm이다. 일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액의 pH는 약 2.7 내지 약 3.0이고, 전도도 값은 약 17 mS/cm 내지 약 19 mS/cm이다. 바람직한 일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액의 pH는 약 2.7 내지 약 2.9이고, 전도도 값은 약 17 mS/cm 내지 약 19 mS/cm이거나, 또는 pH는 약 2.7 내지 약 3.0이고, 전도도 값은 약 17 mS/cm 내지 약 18 mS/cm이다.

일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액과 pH가 약 2.4 내지 약 2.7인 제1 용액은 전도도 값이 거의 동일하게 일정하다.

일 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 재료는 작용기로서 설포프로필을 보유하는 메타크릴레이트 매트릭스를 가진다. 일 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 재료의 입도는 약 65 ㎛이다.

이 방법은, 당화된 PEG화 재조합 에리트로포이에틴, 즉 포유동물 세포, 일 구현예에서는 CHO 세포, HEK293 세포 또는 BHK 세포 또는 Per.C6^® 세포 또는 HeLa 세포에 의해 생산된 후 화학적으로 PEG화된, PEG화 재조합 에리트로포이에틴 정제에 특히 유용하다.

본 방법의 제1 단계에서, 에리트로포이에틴은 PEG화된다. PEG화 반응에 사용된 폴리(에틸렌글리콜)(PEG) 중합체 분자의 분자량은 약 20 kDa 내지 약 40 kDa이다. (본원에 사용된 바와 같은 "분자량"이란 용어는, 중합체 화합물로서의 PEG는 한정된 분자량을 가진 채 수득되지 않고, 사실은 분자량 분포를 가지기 때문에, PEG의 평균 분자량인 것으로 이해될 것이고; "약"이란 용어는, PEG 제제 중 일부 분자들은 중량이 더 많이 나가고, 또 다른 일부 분자들은 지정 분자량에 못미칠 경우를 나타내는데, 즉 이 "약"이란 용어는 분자량 분포가, PEG 분자의 95%가 지정 분자량의 +/- 10% 이내에 해당하는 분자량을 가지는 것을 보이는 경우를 지칭한다. 예를 들어 분자량 30 kDa은 27 kDa 내지 33 kDa의 범위의 분자량을 나타낸다.)

"에리트로포이에틴" 및 이의 축약어 "EPO"라는 용어는, 서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 가지는 단백질, 또는 이러한 단백질과 실질적으로 상동성인 것으로서, 자체의 생물학적 특성이, 적혈구 세포 생산 자극 및 골수에 있어 헌신적 적혈구 전구체(committed erythroid progenitor)의 분열 및 분화의 자극과 관련되어 있는 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 재조합 에리트로포이에틴은, 재조합 DNA 기술 또는 내인성 유전자 활성화에 의해 진핵생물 세포, 예컨대 CHO 세포, BHK 세포 또는 HeLa 세포 내에서 발현을 통하여 제조될 수 있는데, 즉 에리트로포이에틴 당단백질은 내인성 유전자 활성화에 의해 발현된다(예를 들어 US　5,733,761, US　5,641,670, US　5,733,746, WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO　90/11354, WO 91/06667 및 WO 91/09955 참조). 일 구현예에서, 에리트로포이에틴은 인간 EPO이다. 일 구현예에서, 인간 에리트로포이에틴은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열을 가진다. 일 구현예에서, 인간 에리트로포이에틴은 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 가진다. "에리트로포이에틴"이란 용어는 또한, 예컨대 EP 1 064 951 또는 US 6,583,272에 보고된 바와 같이, 하나 이상의 아미노산 잔기가 변경, 결실 또는 삽입되었고, 변형되지 않은 단백질의 생물 활성과 거의 동일한 생물 활성을 가지는, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 단백질 변이체를 지칭한다. 변이체는 당화를 위한 추가 부위를 1개 내지 6개 가지는 인간 에리트로포이에틴의 아미노산 서열을 가질 수 있다. PEG화 에리트로포이에틴의 특이적 활성(specific activity)은 당 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 확정될 수 있다. 정제된 PEG화 에리트로포이에틴의 생물 활성으로 말미암아, 주사에 의한 인간 환자에의 단백질 투여는, 주사되지 않은 대상체 군 또는 대상체 대조군의 골수 세포 내에서와 비교되었을 때, 골수 세포 내 증가한 망상적혈구 및 적혈구세포 생산을 초래한다. 본원에 보고된 바와 같은 방법에 따라서 수득 및 정제된 PEG화 에리트로포이에틴의 생물 활성은, Bristow, A.에 따른 방법에 의해 시험될 수 있다[Pharmeuropa Spec. Issue Biologicals BRP Erythropoietin Bio 97-2 (1997) 31-48].

에리트로포이에틴의 아미노산 서열 변이체는, 에리트로포이에틴을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 적당한 변형을 도입하거나, 또는 펩티드를 합성함으로써 제조될 수 있다. 이러한 변형으로서는, 예를 들어 에리트로포이에틴의 아미노산 서열 내 잔기들의 결실 및/또는 이 에리트로포이에틴 아미노산 서열에의 잔기들의 삽입 및/또는 이 잔기들의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합은 최종 구조체를 달성하도록 이루어질 수 있는데, 다만 이 최종 구조체는 인간 에리트로포이에틴 생물 활성과 거의 동일한 생물 활성을 보유한다.

보존적 아미노산 치환은 "바람직한 치환"이라는 표제 하에 표 1에 제시되어 있다. 더욱 실질적인 변화가 "예시적 치환"이라는 표제 하에 이하에 기술된 바와 같이 아미노산 측쇄 군과 관련하여 표 1에 제공되어 있다. 아미노산 치환은 인간 에리트로포이에틴에 도입될 수 있으며, 생성물은 인간 에리트로포이에틴 생물 활성의 보유 여부에 대해 스크리닝된다.

아미노산은 공통의 측쇄 특성에 따라 하기와 같이 분류될 수 있다:

(1) 소수성: 노르루신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 중성 및 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: His, Lys, Arg;

(5) 사슬의 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;

(6) 방향성: Trp, Tyr, Phe

비보존적 치환은 이들 군 중 하나에 속하는 일원의 다른 군에 속하는 일원과의 교환을 수반할 것이다.

에리트로포이에틴의 화학적 PEG화는, 일반적으로 리신 잔기의 ε-아미노기 하나 이상 및/또는 N-말단 아미노기가 PEG화된 에리트로포이에틴을 포함하는 단백질 제제를 만들어낸다. N-말단 아미노산에서의 선택적 PEG화는 문헌[Felix, A.M., et al., ACS Symp. Ser. 680 (Poly(ethylene glycol)) (1997) 218-238]에 따라서 수행될 수 있다. 선택적 N-말단 PEG화는 고체상 합성이 진행되는 동안 N^α-PEG화 아미노산 유도체의, 펩티드 사슬 N-1 말단 아미노산에의 커플링(coupling)에 의해 달성될 수 있다. 측쇄 PEG화는 고체상 합성이 진행되는 동안 N^ε-PEG화 리신 유도체의, 연장중인 사슬에의 커플링에 의해 수행될 수 있다. 병합된 N-말단 PEG화 및 측쇄 PEG화는 전술된 바와 같이 고체상 합성 중에 실현 가능하거나, 또는 활성화된 PEG 시약의, 아미노 탈보호 펩티드에의 적용에 의한 용액상 합성에 의해 실현 가능하다.

적합한 PEG 유도체는, 일 구현예에서는 평균 분자량이 약 5 kDa 내지 약 40 kDa이고, 다른 구현예에서는 약 20 kDa 내지 약 40 kDa이며, 또 다른 구현예에서는 약 30 kDa 내지 약 35 kDa인 활성화 PEG 유도체이다. PEG 유도체는 선형 또는 분지형 PEG일 수 있다. PEG-단백질 및 PEG-펩티드 접합체를 제조하는데 사용하기 적합한 PEG 유도체로서 다양한 것들이 이용될 수 있다.

활성화된 PEG 유도체는 당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 PEG-비닐설폰에 관한 문헌[Morpurgo, M., et al., J. Bioconjug. Chem. 7 (1996) 363-368]에 기술되어 있다. 선형 및 분지형 사슬 PEG 종은 PEG화 단편을 제조하는데 적합하다. 반응성 PEG 시약의 예들로서는 요오도-아세틸-메톡시-PEG, 또는 메톡시-PEG-비닐설폰(일 구현예에서, m은 약 450 내지 약 900의 정수이고, R은 탄소 원자를 1개 내지 6개 가지는 선형 또는 분지형 저급 알킬, 예컨대 메틸, 에틸, 이소프로필 등이되, 메틸이 바람직함)이 있다:

요오도 활성화 성분을 사용하는 것은 당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 Hermanson, G.T.에 의해 기술되었다[Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) pp. 147-148].

일 구현예에서, PEG 종은 활성화된 PEG 에스테르, 예컨대 N-하이드록시숙신이미딜 프로피온산염 또는 N-하이드록시숙신이미딜 부타논산염 또는 N-하이드록시숙신이미드, 예컨대 PEG-NHS이다[Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69]. 일 구현예에서, PEG는 알콕시-PEG-N-하이드록시숙신이미드, 예컨대 메톡시-PEG-N-하이드록시숙신이미드(MW 30000)(다만 R 및 m은 상기 정의된 바와 같음)이 사용될 때, N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 즉

에 의해 활성화된다. 일 구현예에서, PEG 종은 메톡시 폴리(에틸렌글리콜)-부티르산의 N-하이드록시숙신이미딜 에스테르이다. "알콕시"란 용어는, '알킬'이란 용어가 탄소 원자를 최대 4개 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 알킬기를 의미할 때의 알킬에테르기, 예컨대 메톡시, 에톡시 및 n-프로폭시 등을 지칭하고, 바람직하게는 메톡시를 지칭한다.

"실질적으로 동종인 형태"란 용어는, 수득, 함유 또는 사용된 에리트로포이에틴 단백질 융합체 또는 접합체가, 한정된 수만큼의 PEG 잔기가 부착되어 이를 가지게 된 것을 지칭한다. 일 구현예에서, PEG화된 에리트로포이에틴은 모노PEG화 에리트로포이에틴이다. 제제는 미반응(즉 PEG기가 존재하지 않는) 에리트로포이에틴, 폴리PEG화 에리트로포이에틴뿐만 아니라, PEG화 반응 중 생성된 이 폴리펩티드의 단편을 함유할 수 있다. "실질적으로 동종인 형태"란, 모노PEG화 에리트로포이에틴 제제가 적어도 50%(w/w)의 모노PEG화 에리트로포이에틴 또는 적어도 75%(w/w)의 모노PEG화 에리트로포이에틴 또는 적어도 90%(w/w)의 모노PEG화 에리트로포이에틴 또는 95%(w/w) 초과의 모노PEG화 에리트로포이에틴을 함유하는 경우를 지칭한다. %값은 모노PEG화 에리트로포이에틴을 수득해내는 크로마토그래피 방법에 대응하는 크로마토그램의 면적%를 기반으로 한다.

본원에는 모노PEG화 에리트로포이에틴의 실질적으로 동종인 형태를 수득하기 위해 PEG화 에리트로포이에틴을 정제하기 위한 방법이 보고되어 있다. 오로지 단일 크로마토그래피 단계만을 사용/이용하여, 해당 공정을 간단하고 기술상 더욱 실용적으로 만듦으로써 정제 공정은 개선될 수 있음이 확인되었다.

따라서 본 발명은 보통의 세척 단계에 더하여, pH값이, 제1 세척 단계의 pH값에 비하여 증가한 용액을 사용하는 세척 단계를 도입/적용함으로써, Toyopearl® SP-650 크로마토그래피 재료를 사용하여 모노PEG화 에리트로포이에틴을 단일 크로마토그래피 단계에서 수득/제조/정제하기 위한 방법을 제공한다. 모노PEG화 에리트로포이에틴 중 올리고PEG화 에리트로포이에틴 불순물을 제거/저감시키는 것은 이와 같은 추가의 세척 단계를 사용함으로써 개선될 수 있음이 확인되었다.

그러므로 본원에 보고된 바와 같은, 에리트로포이에틴과 단일 폴리(에틸렌글리콜) 잔기를 포함하는 단백질을 수득/제조/정제하기 위한 방법은 하기 단계들, 즉

c) 전도도가 증가하는 용액을 컬럼에 적용함으로써, 에리트로포이에틴 및 단일 폴리(에틸렌글리콜) 잔기를 포함하는 단백질을 회수하는 단계

를 포함한다.

부산물로부터 모노PEG화 에리트로포이에틴을 분리하는 것/부산물을 제거하는 것은, 만일 pH가 증가한 세척 용액이 적용된 후 이 세척 용액보다 pH가 낮은 제1 세척 용액이 다시 적용되면, 개선되는 것이 확인되었다. 그러므로 일 구현예에서, 본 방법은 단계 b) 이후 및 단계 c) 이전, pH가 약 2.4 내지 약 2.7인 제1 용액을 다시 적용하는 단계를 추가로 포함한다.

추가의/제2 세척 단계에서 제2 용액은 pH값이, 어느 정도 증가폭만큼 증가하여야 함이 확인되었다.

일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액의 pH는 pH 약 2.7 내지 약 3.1인 용액이다. 바람직한 일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액의 pH는 pH 약 2.7 내지 약 3.0인 용액이다. 바람직한 일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액의 pH는 pH 약 2.7 내지 약 2.9인 용액이다. 일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액의 pH는 pH 약 2.8 내지 약 3.0인 용액이다.

일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액의 pH는 제1 용액의 pH에 비하여 25% 이하까지 증가한다. 일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액의 pH는 제1 용액의 pH에 비하여 20% 이하까지 증가한다. 일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액의 pH는 제1 용액의 pH에 비하여 15% 이하까지 증가한다.

일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액의 pH는 제1 용액의 pH에 비하여 0.5 pH 단위까지 증가한다. 일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액의 pH는 제1 용액의 pH에 비하여 0.4 pH 단위까지 증가한다. 일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액의 pH는 제1 용액의 pH에 비하여 0.3 pH 단위까지 증가한다. 일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액의 pH는 제1 용액의 pH에 비하여 0.2 pH 단위까지 증가한다. 일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액의 pH는 제1 용액의 pH에 비하여 0.1 pH 단위까지 증가한다.

일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액의 pH는 제1 용액의 pH에 비하여 0.1 pH 단위 내지 0.5 pH 단위까지 증가한다. 일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액의 pH는 제1 용액의 pH에 비하여 0.3 pH 단위 내지 0.5 pH 단위까지 증가한다.

pH값이 증가한 용액은 전도도가 일정한 용액, 즉 전도도 값이 커야 +/- 10%, 바람직하게는 커야 +/- 5% 안에서 가변하는 용액으로서 적용되어야 한다.

일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액은 전도도 값이 일정한 용액이다. 일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액 및/또는 pH 약 2.4 내지 약 2.7인 제1 용액은 약 17 mS/cm로 일정한 전도도 값을 가진다. 일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액 및/또는 pH 약 2.4 내지 약 2.7인 제1 용액은 약 18 mS/cm로 일정한 전도도 값을 가진다. 일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액 및/또는 pH 약 2.4 내지 약 2.7인 제1 용액은 약 19 mS/cm로 일정한 전도도 값을 가진다. 일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액의 pH는 약 2.7 내지 약 3.0이고, 전도도 값은 약 17 mS/cm이다. 일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액의 pH는 약 2.7 내지 약 3.0이고, 전도도 값은 약 18 mS/cm이다. 일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액의 pH는 약 2.7 내지 약 2.9이고, 전도도 값은 약 19 mS/cm이다.

일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액의 pH는 약 2.7 내지 약 3.0이고, 전도도 값은 약 17 mS/cm 내지 약 19 mS/cm이다. 바람직한 일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액의 pH는 약 2.7 내지 약 2.9이고, 전도도 값은 약 17 mS/cm 내지 약 19 mS/cm이다.

당 분야에서는 pH와 전도도가 서로 관련되어 있는 것으로 이해되고 있다. 따라서 세척 용액의 pH값은, 만일 또한 전도도가 바뀐다면, 전술된 pH값과 상이해질 수 있다. 예를 들어 전도도가 더 낮으면, 거의 동일한 정제 결과가 달성되면서 pH는 더 높은 수준으로 증가할 수 있다.

pH값이 증가한 용액이 적용될 때, 전도도는 제1 세척 용액과 관련하여 일정하게 유지되어야 함이 확인되었다. 일 구현예에서, pH값이 증가한 제2 용액과 pH가 약 2.4 내지 약 2.7인 제1 용액은 거의 동일하게 일정한 전도도 값을 가진다.

폴리PEG화 에리트로포이에틴이 크로마토그래피 재료로부터 회수된 후, 전도도 증가에 의한 모노PEG화 에리트로포이에틴의 용리가 시작된다. 크로마토그래피 재료를 통과하는 이동 상 전도도는 선형으로, 또는 단계적으로 증가한다.

일 구현예에서, 전도도가 증가하는 용액은 선형으로, 또는 단계적으로 증가하는 전도도를 가진다.

전도도 구배가 형성된 중에, 처음에 컬럼으로부터 모노PEG화 에리트로포이에틴이 회수되고, 그 다음에는 실질적으로 동종인 비PEG화 에리트로포이에틴이 회수된다.

일 구현예에서, 전도도의 증가는 염화나트륨 농도가 증가하는 용액을 적용함으로써 달성된다. 일 구현예에서, 전도도를 증가시키기 위해 적용된 용액의 pH값은 pH 2.5 내지 pH 3.5이다.

일 구현예에서, 유리 에리트로포이에틴과 유리 폴리(에틸렌글리콜)의 혼합물뿐만 아니라, 에리트로포이에틴 분자당 하나 이상의 폴리(에틸렌글리콜) 잔기가 결합된 에리트로포이에틴 및 폴리(에틸렌글리콜)의 융합 단백질(즉 단백질 접합체)를 포함하는 용액이 크로마토그래피 재료에 적용되는데, 이 경우 1 mg/ml 내지 4 mg/ml까지의 단백질이 크로마토그래피 재료 1 ml에 적용된다.

본원에 보고된 바와 같은 방법은 (특히 크로마토그래피 재료로서 Toyopearl® SP-650이 사용될 때) 단백질을 대규모로 정제하기 위하여 사용될 수 있음이 확인되었다.

일 구현예에서, 본 방법은 단계 a)의 크로마토그래피 컬럼 직경이 적어도 30 cm인, 대규모 단백질 제조에 사용된다.

"Toyopearl® SP-650 크로마토그래피 재료"란 용어는, (Tosoh Corporation에서 시판되는) 양이온 교환 크로마토그래피 재료를 지칭한다. Toyopearl® SP-650 크로마토그래피 재료는 작용기로서 설포프로필을 보유하는 메타크릴레이트 매트릭스를 가지므로, 강 양이온 교환 크로마토그래피 재료이다. Toyopearl® SP-650 M 크로마토그래피 재료의 입도는 65 ㎛이다.

일 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 재료는 메타크릴레이트 매트릭스를 가진다. 일 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 재료는 작용기로서 설포프로필을 가진다. 일 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 재료는 작용기로서 설포프로필을 보유하는 메타크릴레이트 매트릭스를 가진다. 일 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 재료의 입도는 약 65 ㎛이다.

이하 실시예들, 서열 목록 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공된 것이고, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 특허청구범위에 제시되어 있다. 본 발명의 사상에서 벗어나지 않고, 제시된 절차들에 수정이 가하여질 수 있음이 이해된다.

서열 목록에 관한 설명

서열 번호 1: 인간 에리트로포이에틴의 아미노산 서열.

서열 번호 2: 인간 에리트로포이에틴의 아미노산 서열.

도면에 관한 설명

도 1: 실시예 1에 보고된 바와 같은 방법(pH 2.5에서 세척; 추가 세척 단계 불포함)에 의한, PEG화 에리트로포이에틴 제제 정제시의 용리 크로마토그램.

도 2: 실시예 3에 보고된 바와 같은 방법(pH 2.5에서 세척; pH 2.8에서의 추가 세척 단계 포함)에 의한, PEG화 에리트로포이에틴 제제 정제시의 용리 크로마토그램.

도 3: 실시예 3에 보고된 바와 같은 방법(pH 2.5에서 세척; pH 2.8에서의 추가 세척 단계 포함)에 의한, PEG화 에리트로포이에틴 제제 정제시의 용리 크로마토그램(도 2)의 확대도.

도 4: 실시예 2에 보고된 바와 같은 방법(pH 3.0에서 세척; 추가 세척 단계 불포함)에 의한, PEG화 에리트로포이에틴 제제 정제시의 용리 크로마토그램.

도 5: 실시예 4에 보고된 바와 같은 방법(pH 2.5에서 세척; pH 3.0에서의 추가 세척 단계 포함)에 의한, PEG화 에리트로포이에틴 제제 정제시의 용리 크로마토그램.

실시예 1

Toyopearl ® SP - 650 M 크로마토그래피 재료가 사용되는, PEG화 에리트로포이에틴 제제의 크로마토그래피(추가 세척 단계(pH 2.5) 불포함)

PEG화 에리트로포이에틴 크로마토그래피를 하기 기술한 바와 같이 수행하였다.

PEG화 에리트로포이에틴 크로마토그래피:

수지: SP Toyopearl 650 M

층 용적: 19.6 ml

시료 로딩량: 수지 1 ml당 1.3 mg

유속: 1.3 ml/분

용액:

A: 100 mM 인산칼륨, 100 mM 염화나트륨 (5 M 염화나트륨으로 LF = 19 mS/cm로 조정, pH는 2.5로 조정)

B: 100 mM 인산칼륨, 375 mM 염화나트륨 (pH는 2.5로 조정)

적용 용액: 100% A

세척 용액: 100% A

세척 용적: 100 ml (5 컬럼 용적(CV))

세척 용액(2차 세척): 해당사항 없음

세척 용적(2차 세척): 해당사항 없음

선형 구배 용리 용액: 100% B

선형 구배: 196 ml 이내(10 컬럼 용적), 100% B까지

파장: 280 nm

이 방법에 관한 용리 크로마토그램을 도 1에 제시하였다.

실시예 2

Toyopearl ® SP - 650 M 크로마토그래피 재료가 사용되는, PEG화 에리트로포이에틴 제제의 크로마토그래피(추가 세척 단계(pH 3.0) 불포함)

PEG화 에리트로포이에틴 크로마토그래피:

수지: SP Toyopearl 650 M

층 용적: 19.6 ml

시료 로딩량: 수지 1 ml당 1.3 mg

유속: 1.3 ml/분

용액:

A: 100 mM 인산칼륨, 100 mM 염화나트륨 (pH는 3.0으로 조정, 전도성 값 = 20.5 mS/cm)

B: 100 mM 인산칼륨, 375 mM 염화나트륨 (pH는 2.5로 조정)

적용 용액: 100% A

세척 용액: 100% A

세척 용적: 100 ml (5 컬럼 용적(CV))

세척 용액(2차 세척): 해당사항 없음

세척 용적(2차 세척): 해당사항 없음

선형 구배 용리 용액: 100% B

선형 구배: 196 ml 이내(10 컬럼 용적), 100% B까지

파장: 280 nm

이 방법에 관한 용리 크로마토그램을 도 4에 제시하였다.

실시예 3

Toyopearl ® SP - 650 M 크로마토그래피 재료가 사용되는, PEG화 에리트로포이에틴 제제의 크로마토그래피(pH 2.8이고, 전도도가 약 19 mS /cm인 용액이 사용되는 추가 세척 단계 포함)

수지: SP Toyopearl 650 M

층 용적: 19.6 ml

시료 로딩량: 수지 1 ml당 1.3 mg

유속: 1.3 ml/분

용액:

B: 100 mM 인산칼륨, 375 mM 염화나트륨 (pH는 2.5로 조정)

추가 세척(2차 세척): 100 mM 인산칼륨, 100 mM 염화나트륨 (물로 LF = 19 mS/cm로 조정, pH는 2.8로 조정)

적용 용액: 100% A

세척 용액: 100% A

세척 용적: 100 ml (5 컬럼 용적(CV))

세척 용액(2차 세척): 100% 추가 세척(2차 세척)

세척 용적(2차 세척): 100 ml (5 컬럼 용적(CV))

세척 용액(3차 세척): 100% A

세척 용적(3차 세척): 60 ml (3 컬럼 용적(CV))

선형 구배 용리 용액: 100% B

선형 구배: 196 ml 이내(10 컬럼 용적), 100% B까지

파장: 280 nm

이 방법에 관한 용리 크로마토그램을 도 2에 제시하였으며, 그 확대도를 도 3에 제시하였다.

실시예 4

Toyopearl ® SP - 650 M 크로마토그래피 재료가 사용되는, PEG화 에리트로포이에틴 제제의 크로마토그래피(pH 3.0이고, 전도도가 약 19 mS /cm인 용액이 사용되는 추가 세척 단계 포함)

수지: SP Toyopearl 650 M

층 용적: 19.6 ml

시료 로딩량: 수지 1 ml당 1.3 mg

유속: 1.3 ml/분

용액:

B: 100 mM 인산칼륨, 375 mM 염화나트륨 (pH는 2.5로 조정)

추가 세척(2차 세척): 100 mM 인산칼륨, 100 mM 염화나트륨 (물로 LF = 19 mS/cm로 조정, pH는 3.0으로 조정)

적용 용액: 100% A

세척 용액: 100% A

세척 용적: 100 ml (5 컬럼 용적(CV))

세척 용액(2차 세척): 100% 추가 세척(2차 세척)

세척 용적(2차 세척): 100 ml (5 컬럼 용적(CV))

세척 용액(3차 세척): 100% A

세척 용적(3차 세척): 60 ml (3 컬럼 용적(CV))

선형 구배 용리 용액: 100% B

선형 구배: 196 ml 이내(10 컬럼 용적), 100% B까지

파장: 280 nm

이 방법에 관한 용리 크로마토그램을 도 5에 제시하였다.

실시예 5

Toyopearl ® SP - 650 M 크로마토그래피 재료가 사용되는, PEG화 에리트로포이에틴 제제의 크로마토그래피(pH 값이 상이하고(pH 2.8, 2.9 또는 3.0)이고, 전도도가 약 17 mS /cm인 용액이 사용되는 추가 세척 단계 포함)

수지: SP Toyopearl 650 M

층 용적: 19.2 ml

시료 로딩량: 수지 1 ml당 0.7 mg

유속: 150 cm/시

용액:

A: 100 mM 인산칼륨, 100 mM 염화나트륨 (5 M 염화나트륨으로 LF = 17 mS/cm로 조정, pH는 2.5로 조정)

B: 100 mM 인산칼륨, 375 mM 염화나트륨 (pH는 2.5로 조정)

추가 세척(2차 세척): 100 mM 인산칼륨, 100 mM 염화나트륨 (물로 LF = 17 mS/cm로 조정, pH는 2.8, 2.9 또는 3.0으로 조정)

적용 용액: 100% A

세척 용액: 100% A

세척 용적: 96.2 ml (5 컬럼 용적(CV))

세척 용액(2차 세척): 100% 추가 세척(2차 세척)

세척 용적(2차 세척): 96.2 ml (5 컬럼 용적(CV))

세척 용액(3차 세척): 100% A

세척 용적(3차 세척): 57.7 ml (3 컬럼 용적(CV))

선형 구배 용리 용액: 100% B

선형 구배: 192 ml 이내(10 컬럼 용적), 100% B까지

파장: 280 nm

결과를 하기 표에 제시하였다:

수율은 출발 재료 중 모노PEG화 EPO 함량을 기반으로 산정하였다.

실시예 6

Toyopearl ® SP - 650 M 크로마토그래피 재료가 사용되는, PEG화 에리트로포이에틴 제제의 크로마토그래피(pH 값이 상이하고(pH 2.8, 2.9 또는 3.0)이고, 전도도가 약 18 mS /cm인 용액이 사용되는 추가 세척 단계 포함)

수지: SP Toyopearl 650 M

층 용적: 19.2 ml

시료 로딩량: 수지 1 ml당 0.7 mg

유속: 150 cm/시

용액:

A: 100 mM 인산칼륨, 100 mM 염화나트륨 (5 M 염화나트륨으로 LF = 18 mS/cm로 조정, pH는 2.5로 조정)

B: 100 mM 인산칼륨, 375 mM 염화나트륨 (pH는 2.5로 조정)

추가 세척(2차 세척): 100 mM 인산칼륨, 100 mM 염화나트륨 (물로 LF = 18 mS/cm로 조정, pH는 2.8, 2.9 또는 3.0으로 조정)

적용 용액: 100% A

세척 용액: 100% A

세척 용적: 96.2 ml (5 컬럼 용적(CV))

세척 용액(2차 세척): 100% 추가 세척(2차 세척)

세척 용적(2차 세척): 96.2 ml (5 컬럼 용적(CV))

세척 용액(3차 세척): 100% A

세척 용적(3차 세척): 57.7 ml (3 컬럼 용적(CV))

선형 구배 용리 용액: 100% B

선형 구배: 192 ml 이내(10 컬럼 용적), 100% B까지

파장: 280 nm

결과를 하기 표에 제시하였다:

실시예 7

Toyopearl ® SP - 650 M 크로마토그래피 재료가 사용되는, PEG화 에리트로포이에틴 제제의 크로마토그래피(pH 값이 상이하고(pH 2.8, 2.9 또는 3.0)이고, 전도도가 약 19 mS /cm인 용액이 사용되는 추가 세척 단계 포함)

수지: SP Toyopearl 650 M

층 용적: 19.2 ml

시료 로딩량: 수지 1 ml당 0.7 mg

유속: 150 cm/시

용액:

B: 100 mM 인산칼륨, 375 mM 염화나트륨 (pH는 2.5로 조정)

추가 세척(2차 세척): 100 mM 인산칼륨, 100 mM 염화나트륨 (물로 LF = 19 mS/cm로 조정, pH는 2.8, 2.9 또는 3.0으로 조정)

적용 용액: 100% A

세척 용액: 100% A

세척 용적: 96.2 ml (5 컬럼 용적(CV))

세척 용액(2차 세척): 100% 추가 세척(2차 세척)

세척 용적(2차 세척): 96.2 ml (5 컬럼 용적(CV))

세척 용액(3차 세척): 100% A

세척 용적(3차 세척): 57.7 ml (3 컬럼 용적(CV))

선형 구배 용리 용액: 100% B

선형 구배: 196 ml 이내(10 컬럼 용적), 100% B까지

파장: 280 nm

결과를 하기 표에 제시하였다:

<110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Method for purifying PEGylated erythropoietin <130> P33750-WO <150> EP16179755.0 <151> 2016-07-15 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp 165 <210> 2 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165

Claims

에리트로포이에틴과 단일 폴리에틸렌글리콜 잔기를 포함하는 단백질을 정제하기 위한 방법으로서, 하기 단계들, 즉
a) 에리트로포이에틴과, 에리트로포이에틴 분자당 하나 이상의 폴리에틸렌글리콜 잔기가 결합된 에리트로포이에틴 및 폴리에틸렌글리콜의 접합체의 혼합물을 포함하는 용액을, 작용기로서 설포프로필을 보유하는 메타크릴레이트 매트릭스를 가지는 크로마토그래피 재료 포함 컬럼에 적용하는 단계로서, 이때 pH 2.4 내지 2.7인 제1 용액이 적용됨;
b) 제1 용액에 비하여 pH값이 증가한 제2 용액을 적용하는 단계;
c) 전도도가 증가하였거나 증가하는 용액을 컬럼에 적용함으로써, 에리트로포이에틴 및 단일 폴리에틸렌글리콜 잔기를 포함하는 단백질을 회수하는 단계
를 포함하고,
상기 작용기로서 설포프로필을 보유하는 메타크릴레이트 매트릭스를 가지는 크로마토그래피 재료는 Toyopearl® SP-650 크로마토그래피 재료이며,
상기 pH값이 증가한 제2 용액의 pH는 2.7 내지 3.2이고, 전도도 값은 17 mS/cm 내지 19 mS/cm인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
에리트로포이에틴과 단일 폴리에틸렌글리콜 잔기를 포함하는 단백질을 제조하기 위한 방법으로서, 하기 단계들, 즉
a) 에리트로포이에틴과, 에리트로포이에틴 분자당 하나 이상의 폴리에틸렌글리콜 잔기가 결합된 에리트로포이에틴 및 폴리에틸렌글리콜의 접합체의 혼합물을 포함하는 용액을, 작용기로서 설포프로필을 보유하는 메타크릴레이트 매트릭스를 가지는 크로마토그래피 재료 포함 컬럼에 적용하는 단계로서, 이때 pH 2.4 내지 2.7인 제1 용액이 적용됨;
b) 제1 용액에 비하여 pH값 이 증가한 제2 용액을 적용하는 단계;
c) 전도도가 증가하였거나 증가하는 용액을 컬럼에 적용함으로써, 에리트로포이에틴 및 단일 폴리에틸렌글리콜 잔기를 포함하는 단백질을 회수하는 단계
를 포함하고,
상기 작용기로서 설포프로필을 보유하는 메타크릴레이트 매트릭스를 가지는 크로마토그래피 재료는 Toyopearl® SP-650 크로마토그래피 재료이며,
상기 pH값이 증가한 제2 용액의 pH는 2.7 내지 3.2이고, 전도도 값은 17 mS/cm 내지 19 mS/cm인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 방법은 단계 b) 이후 및 단계 c) 이전에 pH 2.4 내지 2.7인 제1 용액을 다시 적용하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, pH값이 증가한 제2 용액은 pH 2.7 내지 3.0인 용액인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, pH값이 증가한 제2 용액은 일정한 전도도 값을 가지는 용액인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, pH값이 증가한 제2 용액과, pH가 2.4 내지 2.7인 제1 용액은 동일하고 일정한 전도도 값을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, pH값이 증가한 제2 용액, pH가 2.4 내지 2.7인 제1 용액, 또는 양쪽 모두는 전도도 값이 17 mS/cm 내지 19 mS/cm로 일정한 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 에리트로포이에틴과, 에리트로포이에틴 분자당 하나 이상의 폴리에틸렌글리콜 잔기가 결합된 에리트로포이에틴 및 폴리에틸렌글리콜의 접합체의 혼합물을 포함하는 용액은 전도도 값 19 mS/cm로 조정되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 전도도가 증가하는 용액은 염화나트륨 농도가 증가하는 용액인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 전도도가 증가하는 용액은 단계적으로나 선형으로 증가하는 전도도를 보이는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 방법은 대규모 단백질 제조에 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 에리트로포이에틴은 인간 에리트로포이에틴인 것을 특징으로 하는 방법.
제12항에 있어서, 인간 에리트로포이에틴은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단일 폴리에틸렌글리콜 잔기의 분자량은 20 kDa 내지 40 kDa인 것을 특징으로 하는 방법.