DE102008002209A1 - Verfahren zur Aufreinigung von Erythropoietin - Google Patents

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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufreinigung von Erythropoietin, wobei Erythropoietin enthaltender Kulturüberstand von Erythropoietin-produzierenden eukaryontischen Zellen folgenden Schritten unterworfen wird: a) Entfernen von Zellbestandteilen und b) Behandlung des Produktes aus a) durch folgende Chromatographieschritte in der angegebenen Reihenfolge: i) Reversed-Phase-Chromatographie; ii) Anionenaustausch-Chromatograpie; iii) Hydroxyapatit-Chromatographie.

Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Aufreinigung von Erythropoietin, wobei Erythropoietin enthaltender Kulturüberstand von Erythropoietin-produzierenden eukaryontischen Zellen durch bestimmte, in einer festgelegten Art und Weise nacheinander ausgeführten chromatographischen Aufreinigungsschritte aufgearbeitet wird.
  • Erythropoietin, kurz EPO genannt, ist ein Glykoprotein, das die Bildung von Erythrocyten im Knochenmark anregt. EPO wird hauptsächlich in den Nieren gebildet und gelangt von dort aus über den Blutkreislauf zu seinem Zielort. Bei Niereninsuffizienz produzieren die geschädigten Nieren zu wenig oder überhaupt kein EPO, was zur Folge hat, dass aus den Stammzellen des Knochenmarks zu wenig Erythrocyten hervorgehen. Diese sogenannte renale Anämie kann durch Verabreichung von EPO in physiologischen Mengen, die die Bildung von Erythrocyten im Knochenmark stimulieren, behandelt werden. Das zur Verabreichung verwendete EPO kann entweder aus Humanurin gewonnen oder durch gentechnologische Methoden erzeugt werden. Da EPO im menschlichen Körper nur in geringen Spuren enthalten ist, ist die Isolierung von EPO aus der natürlichen Quelle für therapeutische Anwendungen praktisch unmöglich. Daher bieten gentechnische Methoden die einzige wirtschaftliche Möglichkeit, diesen Stoff in größeren Mengen zu produzieren.
  • Die rekombinante Herstellung von Erythropoietin ist seit der Identifizierung des humanen Erythropoietin-Gens im Jahr 1984 möglich. Seit Anfang der 90er Jahre sind verschiedene Arzneimittel entwickelt worden, die humanes Erythropoietin enthalten, das auf gentechnologischem Weg in eukaryontischen Zellen, vor allem in CHO-Zellen (Chinese Hamster Ovary) produziert wurde. Die Herstellung von rekombinantem humanen Erythropoietin ist beispielsweise beschrieben in EP-A-0 148 605 und EP-A-205 564 .
  • Die rekombinante Herstellung von Erythropoietin erfolgt üblicherweise in CHO-Wirtszellen. Während diese früher in Kulturmedien kultiviert wurden, denen fötales Kälberserum und manchmal auch Rinderinsulin zugesetzt war, findet die Kultivierung heutzutage regelmäßig in serum- und proteinfreiem Medium statt. Auf diese Weise kann das Risiko von Kontaminationen mit bovinen Proteinen, bovinen Viren, boviner DNA oder anderen unerwünschten Substanzen bovinen Ursprungs ganz vermieden werden. Für die Kultivierung von eukaryontischen Zellen werden geeignete, serum- und proteinfreie Medien von verschiedenen kommerziellen Herstellern angeboten, z. B. das Medium MAM-PF2, vertrieben von u. a. durch Bioconcept, Allschwil, Schweiz, oder die Medien DMEM und DMENU12, angeboten z. B. von Invitrogen/Gibco, Eggenstein, Deutschland.
  • Auch verschiedene chromatographische Reinigungsverfahren für Erythropoietin sind bereits im Stand der Technik beschrieben worden. EP-A-0 228 452 beschreibt ein Verfahren zur Aufreinigung von biologisch aktivem Erythropoietin aus einer Flüssigkeit, umfassend die chromatographischen Schritte Anionenaustausch-Chromatographie und Reversed-Phase-Chromatographie.
  • In EP-A-0 267 678 wird die Aufreinigung eines in serumfreier Kultur hergestellten Erythropoietins beschrieben, wobei aufeinander folgend eine Dialyse, eine Ionenaustausch-Chromatographie, eine präparative Reversed-Phase-HPLC und eine Gelfiltrationschromatographie durchgeführt werden. Dabei kann der Gelfiltrationschromatographieschritt durch eine Ionenaustauschchromatographie ersetzt werden. Ebenso wird vorgeschlagen, vor der (ersten) Ionenaustauschchromatographie eine Farbstoffaffinitätschromatographie an einer Blue Trisacryl-Säule durchzuführen.
  • In EP-A-0 830 376 ist ein Verfahren zur Reinigung von Erythropoietin beschrieben, bei dem EPO aus dem Kulturüberstand im ersten Schritt der chromatographischen Aufreinigung einer Farbstoffaffinitätschromatographie unterzogen wird. Im zweiten Schritt folgt eine Chromatographie an einem hydrophobierten Träger, gefolgt von einer Hydroxyapatit-Chromatographie. Hieran schließt sich dann eine Reversed-Phase-HPLC an, gefolgt von einer Anionenaustausch-Chromatographie als letztem Chromatographieschritt.
  • EP-A-1 127 063 beschreibt ein Aufreinigungsverfahren für Erythropoietin, das folgende Schritte umfasst: differentielle Präzipitation, hydrophobe Interaktionschromatographie, Diafiltration, Anionenaustausch-Chromatographie, Kationenaustausch-Chromatographie und Size-Exclusion-Chromatographie. Die einzelnen Reinigungsschritte werden in EP-A-1 127 063 in der genannten Reihenfolge durchgeführt. In einer Variante des Verfahrens umfasst die Reinigung die folgenden Schritte: differentielle Präzipitation, hydrophobe Interaktionschromatographie, Diafiltration, Anionenaustausch-Chromatographie, Kationenaustausch-Chromatographie, eine weitere Diafiltration und Size-Exclusion-Chromatographie. In jedem Fall sieht das Verfahren im ersten Schritt eine Präzipitation, gefolgt von einer Zentrifugation vor. Ebenso ist eine Gelfiltration zum Abschluss der chromatographischen Reinigung zwingend vorgesehen.
  • Die internationale Anmeldung WO-A-03/045996 beschreibt ein Reinigungsverfahren für EPO, umfassend eine Anionenaustausch-Chromatographie, gefolgt von einer Reversed-Phase-Chromatographie und einer weiteren Anionenaustausch-Chromatographie. An die zweite Anionenaustausch-Chromatographie schließt sich eine Size-Exclusion-Chromatographie unter Einsatz eines Gelfiltrationsmediums an.
  • Die Reinigung von Erythropoietin ist auch Gegenstand von EP-A-0 428 267 . Hier wird eine Chromatographie an einer Q Sepharose-Säule durchgeführt, teilweise gefolgt von Reversed-Phase-Chromatographie und Gelfiltration.
  • In der WO2005/121173 wird ein Verfahren zur Aufreinigung von mittels fermentativer Verfahren hergestelltem EPO angegeben. Dieses Verfahren geht von einer chromatographischen Reinigung mit mindestens vier verschiedenen chromatographischen Trennmethoden aus. Die erste Anionenaustausch-chromatographie wird gefolgt von einer Affinitätschromatographie, einer hydrophoben Interaktionschromatographie und einer Hydroxyapatit-Chromatographie, wobei die Reihenfolge dieser 3 letztgenannten Chromatographiearten beliebig sein kann. Abschließend kommt wieder eine Anionenaustauschchromatographie zum Einsatz.
  • Es werden mittels dieses Verfahrens also mindestens 5 Chromatographieschritte benötigt, um EPO herzustellen, welches den von der Europäischen Pharmacopoeia geforderten Reinheitskriterien genügt. Kriterien für ein geeignetes EPO sind u. a. ein Gehalt von Fremdproteinen, die aus der Wirtszelle stammen von < 100 ppm, Gehalt an DNA aus der Wirtszelle von < 100 pg/mg EPO und schließlich eine hinsichtlich der Isoformen-Zusammensetzung dem Standard entsprechende Zusammensetzung (Ph. Eur.; 01/2002: 1316).
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein weiteres Aufreinigungsverfahren anzugeben. Dieses sollte ein EPO-Endprodukt liefern, das dem in der Europäischen Pharmacopoeia (Ph. Eur.; 01/2002: 1316) definierten Standard bzw. der Guidance an Biosimilar Medicinal Products Containing Recombinant Erythropoietins (EMEA/CHMP/94256/2005) entspricht und in geeigneter Weise in einer technischen, insbesondere fermentativen EPO-Produktion einsetzbar ist. Insbesondere sollte das vorliegende Verfahren vom ökonomischen Gesichtspunkt den Ver fahren des Standes der Technik überlegen sein. Weiterhin sollte das erfindungsgemäße Verfahren bei nicht erheblicher Verschlechterung der Reinigungsleistung mit weniger chromatographischen Reinigungsschritten auskommen und auf spezielle technisch aufwendige Chromatographieschritte, wie z. B. der Affinitäts-Chromatographie verzichten können.
  • Die technische Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Aufreinigung von Erythropoietin, wobei Erythropoietin enthaltender Kulturüberstand von Erythropoietin-produzierenden eukaryontischen Zellen folgenden Schritten unterworfen wird:
    • a) Entfernen von Zellbestandteilen; und
    • b) Behandlung des Produktes aus a) durch folgende Chromatographieschritte in der angegebenen Reihenfolge
    • i) Reversed-Phase-Chromatographie;
    • ii) Anionenaustausch-Chromatographie;
    • iii) Hydroxyapatit-Chromatographie.
  • In eine bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens werden vor Schritt a) und zwischen den Schritten a) bis b iii) keine anderen Chromatographie-Verfahren angewandt. Zudem ist weiter bevorzugt, dass auch nach Schritt b iii) keine anderen Chromatographie-Verfahren angewandt werden.
  • Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Erythropoietin Produkt hergestellt, das dem in der Europäischen Pharmacopoeia (Ph. Eur.; 01/2002: 1316) definierten Standard bzw. der Guidance an Biosimilar Medicinal Products Containing Recombinant Erythropoietins (EMEA/CHMP/94256/2005) entspricht. Dabei erfüllt das so hergestellte Erythropoietin die folgenden Kriterien: ein Gehalt von Fremdproteinen, die aus der Wirtszelle stammen von < 100 ppm, Gehalt an DNA aus der Wirtszelle von < 100 pg/mg EPO und schließlich eine hinsichtlich der Isoformen-Zusammensetzung dem Standard entsprechende Zusammensetzung (Ph. Eur.; 01/2002: 1316). Das erhaltene EPO-Produkt hat weiterhin eine biologische Aktivität von mindestens 150.000 IE/mg im Bio-Assay. Darüber hinaus entsprechen die Bandenstruktur in der IEF und das Glycosylierungsmuster einem marktüblichen Erypo®-Präparat.
  • Dadurch, dass in einem Verfahren zur Aufreinigung des Fermentationsüberstandes einer biotechnologischen EPO-Herstellung aus Säugerzellkulturen der von Zellbestandteilen gereinigte Fermentationsüberstand durch folgende Chromatographieschritte in der angegebenen Reihenfolge behandelt wird
    • i) Reversed-Phase-Chromatographie (RP-Chromatographie)
    • ii) Anionenaustausch-Chromatographie (DEAE-Chromatographie)
    • iii) Hydroxyapatit-Chromatographie (HA-Chromatographie)
    gelangt man äußerst vorteilhaft und trotzdem in überraschender Art und Weise zur Lösung der gestellten Aufgaben. Der Fachmann, der sich mit der formulierten Aufgabenstellung konfrontiert sieht, hätte angesichts des bestehenden Standes der Technik – insbesondere der WO2005/121173 , wonach eine RP-Chromatographie möglichst vermieden werden sollte – nicht mit Aussicht auf Erfolg in Betracht gezogen, dass eine Verminderung der Anzahl an erforderlichen Chromatographieschritte zur Aufreinigung von standardgemäßem EPO möglich ist. Dadurch resultieren ein geringerer apparativer, personeller und Materialaufwand sowie eine Zeitersparnis, vor allem aber höchste Sicherheit gegen virale Kontaminationen. Auch können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren weniger Hilfsstoffe und nur unbedenkliche organische Lösungsmittel, wie z. B. Ethanol oder 2-Propanol verwendet werden. Dieses Ziel wird in geeigneter Weise dadurch erreicht, dass die oben angeführten Chromatographieschritte in der angegebenen Reihenfolge durchgeführt werden.
  • Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren genutzten chromatographischen Prinzipien sind literaturbekannt und dem Fach mann geläufig (Meyer, Praxis der Hochleistungs-Flüssigchromatographie, Wiley-VCH Weinheim 2004; Unger, Handbuch der HPLC, Teil 1 und 2, GIT Verlag Darmstadt 1994). Darüber hinaus finden sich weiterführende und detaillierte Informationen zu den Chromatographiemedien in den Produktinformationen der jeweiligen Hersteller bzw. Lieferanten.
  • Weiterhin ist bevorzugt, dass die eukaryontischen Erythropoietin-produzierenden Zellen, Säugetierzellen, besonders bevorzugt menschliche Zellen und ganz besonders bevorzugt Chinese-Hamster-Ovary Zellen (CHO) sind, die humanes rekombinantes Erythropoietin exprimieren.
  • In einem weiteren bevorzugten Verfahren ist vorgesehen, dass zusätzlich solche Eluatfraktionen, die in ihrem Banden- bzw. Glycosylierungmuster nicht dem Referenzmaterial entsprechen, einer weiteren Anionenaustausch-Chromatographie nach ii) und/oder Hydroxyapatit-Chromatographie nach iii) unterzogen werden.
  • Weiterhin ist bevorzugt, dass nach den Schritten i), ii) und/oder iii) eine Ultrafiltration durchgeführt wird.
  • In einem weiteren bevorzugten Verfahren enthält Schritt a) eine Mikrofiltration und eine anschließende Ultrafiltration.
  • In bevorzugter Weise erfolgt die Reversed-Phase-Chromatographie an einem Trägermaterial als stationäre Phase, die ausgewählt ist aus der Gruppe C1 bis C8-modifizierte Kieselgele, hydrophobierte Polymerträger auf Basis von Polystyrol-/Divinylbenzol und hydrophobierte monolithische Phasenmaterialien auf Kieselgel- oder Polymerbasis, und als Eluent wird eine wässrige Alkanollösung verwendet. Besonders bevorzugt werden Ethanol oder 2-Propanol oder deren Mischungen, und ganz besonders bevorzugt 2-Propanol, mit entsprechend gepufferten wässrigen Systemen als Eluent verwendet.
  • In einem weiteren bevorzugten Verfahren erfolgt die Anionenaustausch-Chromatographie an einem Trägermaterial als stationäre Phase mit funktionellen Gruppen, die ausgewählt sind aus Diethylaminoethyl-Gruppen (DEAE), quarternäre Aminoethyl-Gruppen (QAE), quaternäre Ammonium-Gruppen oder Dimethylaminoethyl-Gruppen (DMAE).
  • Weiterhin ist bevorzugt, dass die Anionenaustausch-Chromatographie mindestens einen Waschschritt mit einem wässrigen Puffersystem, vorzugsweise mit einem Puffersystem auf Basis einer organischen Säure, insbesondere mit einem Acetatpuffer umfasst.
  • Besonders bevorzugt, umfasst die Anionenaustausch-Chromatographie mindestens einen Waschschritt mit einer wässrigen Pufferlösung mit einem pH von 3,5 bis 5,5, besonders bevorzugt mit einem pH von 4,0 bis 5,0 und am meisten bevorzugt mit einem pH bei etwa 4,5. Als Puffer eignet sich vor allem ein Acetat-Puffer, vorzugsweise ein Natriumacetat-Puffer.
  • In bevorzugter Weise wird als Eluent bei der Anionenaustausch-chromatographie anorganische Säure in einer wässrigen Pufferlösung verwendet. In außerdem und besonders bevorzugter Weise werden als Eluent bei der Anionenaustausch-Chromatographie Chloridionen in einer wässrigen Pufferlösung verwendet.
  • In einem weiteren bevorzugten Verfahren umfasst die Hydroxyapatit-Chromatographie mindestens einen Waschschritt mit einem Puffersystem auf Basis einer organischen Säure, vorzugsweise mit einem Acetatpuffer.
  • Ebenfalls bevorzugt wird als Eluent bei der Hydroxyapatit-Chromatographie ein Puffersystem auf Basis einer anorganischen Säure, besonders bevorzugt ein Phosphatpuffer verwendet.
  • Erläuterung der besonders bevorzugten Ausführungsformen
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit zur Aufreinigung von Erythropoietin, wobei Erythropoietin enthaltender Kulturüberstand von Erythropoietin-produzierenden eukaryontischen Zellen folgenden Schritten unterworfen wird:
    • a) Entfernen von Zellbestandteilen; und
    • b) Behandlung des Produktes aus a) durch folgende Chromatographieschritte in der angegebenen Reihenfolge
    • i) Reversed-Phase-Chromatographie;
    • ii) Anionenaustausch-Chromatographie;
    • iii) Hydroxyapatit-Chromatographie.
  • Die Reversed-Phase-Chromatographie wird als „Capture-Schritt” eingesetzt. In diesem ersten Reinigungsschritt wird EPO aus dem Fermentationsüberstand angereichert. Dabei sind unterschiedliche hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den Probenmolekülen und der stationären Phase von Bedeutung. Die Probenkomponenten werden umso stärker festgehalten, je weniger sie in Wasser löslich sind, d. h. je unpolarer sie sind. Die Reversed-Phase-Chromatographie kann mit herkömmlichen, kommerziell erhältlichen Phasenmaterialien sowohl auf Kieselgel- als auch auf Polymerbasis durchgeführt werden, die speziell zur Proteinanalytik geeignet sind. Typischerweise werden großporige Kieselgelmaterialien, z. B. 300 Å oder 500 Å, mit kurzkettiger Kohlenstoffbelegung, z. B. C1, C2, C3 und C4, unporöse hydrophobierte Polymerträger auf Polystyrol-/Divinylbenzolbasis und speziell hydrophobierte monolithische Phasenmaterialien ebenfalls auf Kieselgel- oder Polymerbasis eingesetzt. Zu den Herstellern bzw. Lieferanten dieser stationären Phasen zählen u. a. die Firmen Merck, Waters, GE Healthcare, Tosoh Biosience, Bio-Rad, Dionex, YMC, Phenomenex, Macherey-Nagel und BIA Separations.
  • Bevorzugte Reversed-Phase-Materialien sind unporöse hydrophobierte Polymerträger auf Polystyrol-/Divinylbenzolbasis. Besonders bevorzugt werden SOURCE 30RPC oder das entsprechende 15 μm-Material (SOURCE 15RPC) von GE Healthcare.
  • Als Eluenten können vorzugsweise Alkohole wie Ethanol oder 2-Propanol oder deren Mischungen mit entsprechend gepufferten wässrigen Systemen Verwendung finden. Besonders bevorzugt wird der Einsatz von 2-Propanol, da der organische Lösungsmittelanteil im Eluenten, im Vergleich zu Ethanol, deutlich geringer ist und so sicherheitstechnische und ökonomische Vorteile bestehen. Darüber hinaus ist 2-Propanol aufgrund seiner Mischbarkeits- und Löslichkeitseigenschaften als Lösungsvermittler vorzüglich geeignet (Unger, Handbuch der HPLC, Teil 1, GIT Verlag Darmstadt 1994; Nowotny et al., Chromatographia 1988, 25, 409–412).
  • Die Anionenaustausch-Chromatographie beruht auf der kompetitiven Wechselwirkung geladener Ionen der Probelösung mit dem eingesetzten Puffermedium. Sie kann mit herkömmlichen, kommerziell erhältlichen Anionenaustausch-Harzen mit Diethylaminoethyl-(DEAE), quaternärer Aminoethyl-(QAE), quaternärer Ammonium- oder Dimethylaminoethylfunktionalisierung (DMAE) durchgeführt werden. Erhältlich sind diese Phasenmaterialien z. B. bei GE Healthcare, Tosoh Biosience, Bio-Rad oder Merck. Bevorzugt werden Diethylaminoethyl (DEAE)-funktionalisierte Anionenaustauscherharze eingesetzt. Besonders bevorzugt wird in der Anionenaustausch-Chromatographie TSKgel DEAE-5PW (30 μm), erhältlich von Tosoh Bioscience, verwendet. Dieser Chromatographieschritt ist im Hinblick auf das notwendige Glycosylierungsmuster im EPO-Endprodukt von Bedeutung.
  • Die Anionenaustausch-Chromatographie beinhaltet in der bevorzugten Ausführungsform einen sauren Waschschritt („Saurer Wash”), mit dem die basischen Isoformen des Erythropoietin durch die pH-Absenkung eluiert und somit abgetrennt werden ( EP-1428878 ). „Saurer Wash” bedeutet dabei, dass der pH-Wert des Waschpuffers zwischen 3,5 und 5,5, besonders bevorzugt zwischen 4,0 und 5,0 und am meisten bevorzugt bei etwa 4,5 liegt. Als Puffer eignet sich vor allem ein Natriumacetat-Puffer.
  • Für die Hydroxyapatit-Chromatographie können übliche Hydroxyapatit-(bzw. Hydroxylapatit-)Materialien eingesetzt werden. Hydroxylapatit ist hexagonal kristallines Calciumphosphat und eignet sich besonders zur Trennung von Proteinen und anderen Biopolymeren. Dieser Aufreinigungsschritt wird zur Entfernung der „phosphatierten” EPO-Moleküle durchgeführt. Bevorzugt wird CHT keramisches Hydroxyapatit (Bio-Rad) eingesetzt, besonders bevorzugt CHT keramisches Hydroxyapatit Typ 1 (Bio-Rad).
  • Sowohl die Reversed-Phase-Chromatographie als auch die Anionenaustausch-Chromatographie als auch die Hydroxyapatit-Chromatographie kann zur Steigerung der Gesamtproduktausbeute im Sinne einer Reprozessierung für solche Eluatfraktionen wiederholt werden, die in ihrer Produktqualität, insbesondere ihrem Banden- bzw. Glycosylierungsmuster nicht dem Referenzmaterial entsprechen. Dabei handelt es sich typischerweise um die frühen bzw. späten Randfraktionen der Hauptfraktionen, die als solche bereits nach dem ersten Aufreinigungsschritt die gewünschten Produkteigenschaften aufweisen. Die Einstufung der Güte der Fraktionen auf den verschiedenen Aufreinigungsstufen erfolgt mit Standardmethoden (Isoelektrische Fokussierung (IEF) und Hochleistungsanionenaustausch-Chromatographie mit gepulster amperometrischer Detektion (HPAEC-PAD): Lasne, Nature 2000, 405 605–635; Holländer et al., LaborPraxis 2004, 56–59; Hokke et al., Eur. J. Biochem. 1995, 228, 981–1008; Dionex Technical Note 42, 1997. Als Referenzmaterial dient jeweils ein kommerziell erhältliches Erypo®-Präparat (JANSSEN-CILAG).
  • Vor der Aufreinigung des Kulturüberstandes mit den genannten Chromatographie-Verfahren wird zur Zellabtrennung eine Mikrofiltration über 1,2 μm- und 0,65 μm-Filter durchgeführt. Anschließend erfolgt eine Ultrafiltration (cut off 10.000 Da) des zellfreien Filtrats auf 1/10 des Ausgangsvolumens. Nach der Ultrafiltration wird der konzentrierte Zellüberstand sterilfiltriert und im ersten Chromatographieschritt (Reversed-Phase-Chromatographie) eingesetzt. Die Filtrationsschritte, insbesondere die Sterilfiltration, sind literaturbekannt und dem Fachmann geläufig (Munir, Handbuch Ultrafiltration, Behr Hamburg 1990; Ullmann B2, 10-2, 10-21 und B3 11-6; Gasger, Handbuch der industriellen Fest-Flüssig-Filtration, Hüthig Heidelberg 1990; Ullmann A16, 187–258).
  • Es wurde gefunden, dass das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene EPO die in der Europäischen Pharmacopoeia definierten Qualitätskriterien erfüllt. Insbesondere entsprechen die Isoformen-Zusammensetzung und das Glycosylierungsmuster dem in der Europäischen Pharmacopoeia (Ph. Eur.; 01/2002: 1316) bzw. der Guidance an Biosimilar Medicinal Products Containing Recombinant Erythropoietins (EMEA/CHMP/94256/2005) definierten Standard. Als Referenzmaterial dient ein kommerziell erhältliches Erypo®-Präparat (JANSSEN-CILAG).
  • Die Aktivität des Proteins sollte mindestens 100.000 IE/mg betragen, vorzugsweise mindestens 125.000 IE/mg und besonders bevorzugt mindestens 150.000 IE/mg (siehe auch Europäische Pharmacopoeia 01/2002: 1316).
  • Das erfindungsgemäß aufgereinigte EPO ist bevorzugt rekombinantes humanes Erythropoietin, hergestellt in eukaryontischen Zellen. Bevorzugt wird das rekombinante EPO in Säugerzellen, besonders bevorzugt in CHO-Zellen hergestellt, wie z. B. beschrieben in EP-A-0 205 564 und EP-A-0 148 605 . Die Fermentation erfolgt nach herkömmlichen Protokollen in kommerziell erhältlichen Kulturmedien.
  • Unter Erythropoietin (EPO) wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung jedes Protein verstanden, das in der Lage ist, die Erythrocyten-Bildung im Knochenmark zu stimulieren und gemäß dem in der Europäischen Pharmacopoeia (Ph. Eur.; 01/2002: 1316) beschriebenen Assay eindeutig als Erythropoietin identifiziert werden kann (Bestimmung der Aktivität in polyzythämischen oder normozythämischen Mäusen). Bei dem Erythropoietin kann es sich um das wildtypische humane Eythropoetin oder um eine Variante davon mit einem oder mehreren Aminosäureaustauschen, -deletionen oder -additionen handeln. Wenn es sich um eine Variante von Erythropoietin handelt, dann ist bevorzugt, dass diese Variante sich lediglich in 1 bis 20, bevorzugt in lediglich 1 bis 15, besonders bevorzugt in lediglich 1 bis 10 Aminosäurepositionen vom humanen Wildtyp-Erythropoietin durch Aminosäureaustausche, -deletionen oder -additionen unterscheidet.
  • Unter Reinigung von Erythropoietin oder Anreicherung von Erythropoietin wird vorliegend verstanden, dass das Protein Erythropoietin aus einem Gemisch in sehr reiner Form erhalten wird, das in dem Gemisch enthaltene Erythropoietin wird also angereichert, bis im Wesentlichen neben standardgemäßem Erythropoietin keine weiteren Proteine mehr enthalten sind.
  • Beschreibung der Figuren
  • 1 zeigt exemplarisch die chromatographische Abtrennung des Erythropoietin-Peaks bei der Reversed-Phase-Chromatographie. Aufgetragen ist die Peakintensität in Form von milli-Absorption Units (mAU) über der Elutionszeit (in min.) bei einer UV-Wellenlänge von 280 nm.
  • 2 zeigt exemplarisch die chromatographische Abtrennung des Erythropoietin-Peaks unter den Bedingungen der Anionenaustausch-Chromatographie. Aufgetragen ist die Peakintensität in Form von milli-Absorption Units (mAU) über der Elutionszeit (in min.) bei einer UV-Wellenlänge von 280 nm.
  • 3 zeigt exemplarisch das IEF-Gel der isolierten EPO-Eluatfraktion nach der Anionenaustausch-Chromatographie im Vergleich zum Erypo®-Präparat.
  • 4 zeigt exemplarisch die chromatographische Abtrennung des Erythropoietin-Peaks bei der Hydroxyapatit-Chromatographie. Aufgetragen ist die Peakintensität in Form von milli-Absorption Units (mAU) über der Elutionszeit (in min.) bei einer UV-Wellenlänge von 280 nm.
  • 5 zeigt exemplarisch das IEF-Gel der isolierten EPO-Eluatfraktion nach der Hydroxyapatit-Chromatographie im Vergleich zum Erypo®-Präparat.
  • 6 zeigt den nativen Glycosylierungsstatus des aufgereinigten EPO-Endproduktes.
  • 7 zeigt den Glycosylierungsstatus eines kommerziell erhältlichen Erypo®-Präparates (JANSSEN-CILAG).
  • Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern, ohne sie einzuschränken.
  • Beispiele
  • Beispiel 1: Produktion von EPO in CHO-Zellen
  • EPO wird fermentativ in CHO-Zellen produziert. Die Fermentation erfolgt nach Standardverfahren, wie sie in der patent- und wissenschaftlichen Literatur für eukaryontische, insbesondere CHO-Zellen beschrieben sind. Die Kultivierung erfolgt im Perfusionsreaktor in Kulturmedium, das frei von tierischen Komponenten ist. Die Ernte findet in einem Zeitraum bis zu 50 Tagen kontinuierlich statt. Zur Zellabtrennung wird eine Mikrofiltration über einen geeigneten Filter (z. B. Opticap XLT30 Capsule mit Milligard-Medium 0,5–1,2 μm, Millipore und Sartobran P Midi-caps 0,45–0,65 μm, Sartorius) bei einer Flussrate von 1–2 L/min durchgeführt. Anschließend erfolgt zunächst eine Ultrafiltration (cut off 10.000 Da) des zellfreien Filtrats (z. B. Ultran Pilot, Polyethersulfon 4 × 0,45 m2, Schleicher & Schüll) und dann eine Sterilfiltration (z. B. über Opticap-Filtereinheiten mit 0,5 μm Milligard-Vorfilter und 0,2 μm Durapore Sterilfilter, Millipore).
  • Beispiel 2: Reversed-Phase-Chromatographie („Capture-Schritt”)
  • Als „Capture-Schritt” wird eine Reversed-Phase-Chromatographie an SOURCE 30RPC durchgeführt. In diesem ersten Reinigungsschritt wird EPO aus dem Fermentationsüberstand angereichert. Dabei werden mehrere Waschschritte durchgeführt. Der erste Waschschritt wird mit PBS Puffer (Phosphat buffered saline) durchgeführt. Der nächste Waschschritt wird mit einer Mischung aus Wasser/Isopropanol/TFA im Volumenverhältnis von 10/2/0.1 bis 10/1/0.1 bei einer Flussrate 40–50 mL/min durchgeführt. Die Produktelution wird mit einer Mischung aus Wasser/Isopropanol/TFA im Volumen-Verhältnis von 10/4/0.1 bei einer Flussrate von 30–40 mL/min durchgeführt. Die Flussraten wurden für diese Trennung entsprechend opti miert und angepasst. Danach wird ein Waschschritt mit Isopropanol/0,1% TFA-Lösung im Volumen-Verhältnis 60/40 durchgeführt.
  • Die trifluoressigsaure Produktfraktion wird direkt nach der Elution im Verhältnis 1:1 mit einem Phosphatpuffer (pH-Wert 10) versetzt und mit 15 mM Natriumphosphatpuffer bis auf pH 7,2 verdünnt. Die dabei neutralisierte EPO-haltige Lösung wird jetzt steril filtriert.
  • Die Inprozesskontrolle (IPC) zur EPO-Anreicherung wird auf einer analytischen RP-HPLC-Trennsäule im TFA/Acetonitril-System durchgeführt. Die Ausbeute an EPO nach diesem Chromatographieschritt beträgt mindestens 50%, bevorzugt mindestens 65% und besonders bevorzugt mindestens 80%.
  • Beispiel 3: Anionenaustausch-Chromatographie
  • Die neutralisierte EPO-Produktfraktion aus der Reversed-Phase-Chromatographie wird mit einer Förderleistung von 20 mL/min aufgetragen. Die EPO-haltige Lösung wird jetzt durch drei Waschschritte bei konstanter Flussrate von 40 mL/min aufgereinigt, wobei der erste und dritte Waschschritt jeweils bei einem pH von 7,2 mit 20 mM Natriumacetatlösung und der zweite bei einem pH von 4,5 mit einer entsprechenden Natriumacetatlösung durchgeführt wird. Die Produktelution wird unter Gradientenbedingungen mit einem Natriumacetat/Natriumchlorid-Puffer (pH 7,2) durchgeführt (Flussrate 30–40 mL/min). Dabei wird der Pufferanteil langsam, linear von 0 auf 80% erhöht.
  • Mit Hilfe der isoelektrischen Fokussierung (IEF) werden die Eluatfraktionen analysiert und entsprechend der Bandenlage im IEF in Produkt-Pool (Hauptfraktion) und Randfraktionen unterteilt. Als Referenzmaterial dient ein kommerziell erhältli ches Erypo®-Präparat. Der EPO-Gehalt der Hauptfraktion wird mittels RP-Chromatographie ermittelt. Die ausgewählten Eluatfraktionen werden mittels Ultrafiltration konzentriert und für die nachfolgende Hydroxyaptatit-Chromatographie umgepuffert. Die Ausbeute an Erythropoietin nach diesem Chromatographieschritt beträgt mindestens 20%, bevorzugt mindestens 30% und besonders bevorzugt mindestens 40%.
  • Die isoelektrische Fokussierung wird auf einem Ultradünnschicht-Polyacrylamidgel durchgeführt. Dazu müssen die Probelösungen vor der Applikation mit Hilfe eines Mikrozentrifugationskit (cutoff 10.000 Da) entsalzt und aufkonzentriert werden. Die Fokussierung erfolgt bei Spannungen von 300–2.000 V. Nach 5.000 Vh ist die Entwicklung beendet. Das Gel wird anschließend mit Silbernitrat oder Coomassie angefärbt und ausgewertet.
  • Beispiel 4: Hydroxyapatit-Chromatographie
  • Dieser Aufreinigungsschritt ist zur Entfernung der „phosphatierten” EPO-Moleküle geeignet. Die Hauptfraktion der Anionenaustausch-Chromatographie wird mittels Ultrafiltration in den Startpuffer der Hydroxyapatit-Säule umgepuffert und anschließend sterilfiltriert.
  • Die Probeninjektion erfolgt mit einer Förderleistung von 30 mL/min auf eine CHT Ceramic Hydroxyapatit Typ 1-Phase. Der Waschschritt wird mit einem Natriumacetatpuffer (pH 6,8), die Probenelution mit einem Phosphatpuffer bei pH 6,8 und einer Flussrate von 50 mL/min unter Gradientenbedingung durchgeführt. Dabei wird der Phosphatpufferanteil langsam, linear von 0 auf 25% erhöht.
  • Die spezifikationsgerechten EPO-Fraktionen liegen in einem Natriumacetat-Natriumphosphat-Puffer vor und werden mit PBS (Endabfüllungspuffer) mittels Ultrafiltration umgepuffert und bei –20°C tiefgefroren. Der EPO-Gehalt der einzelnen Fraktionen wird mittels RP-Chromatographie ermittelt. Die Ausbeute an Erythropoietin nach diesem Chromatographieschritt beträgt mindestens 30%, bevorzugt mindestens 40% und besonders bevorzugt mindestens 50%.
  • Die Analyse des Glycosylierungsmusters mittels HPAEC-PAD erfolgt nach enzymatischer Abspaltung der Kohlenhydratketten mittels PNGase F (Roche Diagnostics GmbH) vom Protein. Nach Isolierung und Entsalzung erfolgt die Analyse der Zuckerreste auf einem Hochleistungsanionenaustauscher mit gepulster amperometrischer Detektion.
  • Das schließlich erhaltene EPO-Produkt hat eine biologische Aktivität von mindestens 150.000 IE/mg im Bio-Assay und erfüllt alle Anforderungen der Europäischen Pharmacopoeia (Ph. Eur.; 01/2002: 1316) bzw. der Guidance an Biosimilar Medicinal Products Containing Recombinant Erythropoietins (EMEA/CHMP/94256/2005). Darüber hinaus entsprechen die Bandenstruktur in der IEF und das Glycosylierungsmuster einem marktüblichen Erypo®-Präparat.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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  • Zitierte Patentliteratur
    • - EP 0148605 A [0003, 0041]
    • - EP 205564 A [0003]
    • - EP 0228452 A [0005]
    • - EP 0267678 A [0006]
    • - EP 0830376 A [0007]
    • - EP 1127063 A [0008, 0008]
    • - WO 03/045996 A [0009]
    • - EP 428267 [0010]
    • - WO 2005/121173 [0011, 0017]
    • - EP 1428878 [0035]
    • - EP 0205564 A [0041]
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • - Ph. Eur.; 01/2002: 1316 [0012]
    • - Ph. Eur.; 01/2002: 1316 [0013]
    • - Ph. Eur.; 01/2002: 1316 [0016]
    • - Ph. Eur.; 01/2002: 1316 [0016]
    • - Meyer, Praxis der Hochleistungs-Flüssigchromatographie, Wiley-VCH Weinheim 2004; [0018]
    • - Unger, Handbuch der HPLC, Teil 1 und 2, GIT Verlag Darmstadt 1994 [0018]
    • - Unger, Handbuch der HPLC, Teil 1, GIT Verlag Darmstadt 1994 [0033]
    • - Nowotny et al., Chromatographia 1988, 25, 409–412 [0033]
    • - Lasne, Nature 2000, 405 605–635 [0037]
    • - Holländer et al., LaborPraxis 2004, 56–59 [0037]
    • - Hokke et al., Eur. J. Biochem. 1995, 228, 981–1008 [0037]
    • - Dionex Technical Note 42, 1997 [0037]
    • - Munir, Handbuch Ultrafiltration, Behr Hamburg 1990 [0038]
    • - Ullmann B2, 10-2, 10-21 und B3 11-6 [0038]
    • - Gasger, Handbuch der industriellen Fest-Flüssig-Filtration, Hüthig Heidelberg 1990 [0038]
    • - Ullmann A16, 187–258 [0038]
    • - Ph. Eur.; 01/2002: 1316 [0039]
    • - Europäische Pharmacopoeia 01/2002: 1316 [0040]
    • - Ph. Eur.; 01/2002: 1316 [0042]
    • - Ph. Eur.; 01/2002: 1316 [0063]

Claims (17)

  1. Ein Verfahren zur Aufreinigung von Erythropoietin, wobei Erythropoietin enthaltender Kulturüberstand von Erythropoietin-produzierenden eukaryontischen Zellen folgenden Schritten unterworfen wird: a) Entfernen von Zellbestandteilen; und b) Behandlung des Produktes aus a) durch folgende Chromatographieschritte in der angegebenen Reihenfolge i) Reversed-Phase-Chromatographie; ii) Anionenaustausch-Chromatographie; iii) Hydroxyapatit-Chromatographie.
  2. Das Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vor Schritt a) und zwischen den Schritten a) bis b iii) keine anderen Chromatographie-Verfahren angewandt werden.
  3. Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die eukaryontischen Erythropoietinproduzierenden Zellen Säugetier-Zellen, bevorzugt menschliche Zellen und besonders bevorzugt Chinese-Hamster-Ovary Zellen sind, die humanes rekombinantes Erythropoietin exprimieren.
  4. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich solche Eluatfraktionen, deren Produktqualität nicht dem Referenzmaterial entsprechen, einer weiteren Reversed-Phase-Chromatographie nach i) und/oder Anionenaustausch-Chromatographie nach ii) und/oder Hydroxyapatit-Chromatographie nach iii) unterzogen werden.
  5. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass nach den Schritten i), ii) und/oder iii) eine Ultrafiltration durchgeführt wird.
  6. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt a) eine Mikrofiltration und eine anschließende Ultrafiltration enthält.
  7. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Reversed-Phase-Chromatographie an einem Trägermaterial als stationäre Phase erfolgt, die ausgewählt ist aus der Gruppe C1 bis C8-modifizierte Kieselgele, hydrophobierte Polymerträger auf Basis von Polystyrol-/Divinylbenzol und hydrophobierte monolithische Phasenmaterialien auf Kieselgel- oder Polymerbasis, und wobei als Eluent eine wässrige Alkanollösung verwendet wird.
  8. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Anionenaustausch-Chromatographie an einem Trägermaterial als stationärer Phase erfolgt mit funktionellen Gruppen, die ausgewählt sind aus Diethylaminoethyl-Gruppen (DEAE), quarternäre Aminoethyl-Gruppen (QAE), quaternäre Ammonium-Gruppen oder Dimethylaminoethyl-Gruppen (DMAE).
  9. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Anionenaustausch-Chromatographie mindestens einen Waschschritt mit einem wässrigen Puffersystem umfasst.
  10. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Anionenaustausch-Chromatographie mindestens einen Waschschritt mit einem Puffersystem auf Basis einer organischen Säure umfasst.
  11. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Anionenaustausch-Chromatographie mindestens einen Waschschritt mit einer wässrigen Pufferlösung mit einem pH von 3,5 bis 5,5 umfasst.
  12. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass als Eluent bei der Anionenaustausch-Chromatographie anorganische Säure in einer wässrigen Pufferlösung verwendet wird.
  13. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass als Eluent bei der Anionenaustausch-Chromatographie Chloridionen in einer wässrigen Pufferlösung verwendet werden.
  14. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydroxyapatit-Chromatographie mindestens einen Waschschritt mit einem Puffersystem auf Basis einer organischen Säure umfasst.
  15. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydroxyapatit-Chromatographie mindestens einen Waschschritt mit einem Acetatpuffer umfasst.
  16. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass als Eluent bei der Hydroxyapatit-Chromatographie ein Puffersystem auf Basis einer anorganischen Säure verwendet wird.
  17. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass als Eluent bei der Hydroxyapatit-Chromatographie ein Phosphatpuffer verwendet wird.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2325194A1 (de) * 2009-11-24 2011-05-25 Glycotope GmbH Verfahren zur Reinigung von Glykoproteinen
US10617975B2 (en) 2014-12-15 2020-04-14 Merck Patent Gmbh Target molecule capture from crude solutions
CN108348604B (zh) * 2015-09-08 2022-04-29 沃特世科技公司 用于分析抗体-药物缀合物的多维色谱方法
KR101847169B1 (ko) * 2015-10-07 2018-04-09 주식회사 녹십자 지속형 에리트로포이에틴 함유 조성물
US10604779B2 (en) 2016-03-09 2020-03-31 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Method for production of mutant-type human erythropoietin
JP7177035B2 (ja) * 2016-07-15 2022-11-22 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー Ｐｅｇ化エリスロポエチンを精製するための方法

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0148605A2 (de) 1983-12-13 1985-07-17 Kirin-Amgen, Inc. Herstellung von Erythropoietin
EP0205564A1 (de) 1984-12-04 1986-12-30 Genetics Inst Herstellungsverfahren für erythropoietin.
EP0228452A1 (de) 1985-06-20 1987-07-15 Kirin Amgen Inc Proteinreinigung.
EP0267678A1 (de) 1986-09-15 1988-05-18 Genzyme Corporation Rekombinantes menschliches Erythropoietin
EP0428267A2 (de) 1989-10-13 1991-05-22 Amgen Inc. Erythropoietin-Isoformen
EP0830376A1 (de) 1995-05-11 1998-03-25 Roche Diagnostics GmbH Verfahren zur herstellung von erythropoietin frei von tierischen proteinen
EP1127063A1 (de) 1998-11-06 2001-08-29 Sterrenbeld Biotechnologie North America, Inc. Methoden zur aufreinigung von rekombinatem humanem erythropoietin aus zellkulturüberständen
WO2003045996A1 (en) 2001-11-28 2003-06-05 Sandoz Gmbh Chromatographic purification of recombinant human erythropoietin
EP1428878A1 (de) 2002-12-13 2004-06-16 Siegfried Ltd. Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Erythropoietin
WO2005121173A1 (de) 2004-06-08 2005-12-22 Bioceuticals Arzneimittel Ag Verfahren zur reinigung von erythropoietin

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6265542B1 (en) * 1997-10-24 2001-07-24 Genentech, Inc. Purification of molecules
PT1501369E (pt) * 2002-04-26 2015-09-21 Genentech Inc Purificação de proteínas com base na não afinidade
EP1548031A1 (de) * 2003-12-22 2005-06-29 Dubai Genetics FZ-LLC Naturidentischer Erythropoietin
WO2006069246A2 (en) * 2004-12-22 2006-06-29 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0148605A2 (de) 1983-12-13 1985-07-17 Kirin-Amgen, Inc. Herstellung von Erythropoietin
EP0205564A1 (de) 1984-12-04 1986-12-30 Genetics Inst Herstellungsverfahren für erythropoietin.
EP0228452A1 (de) 1985-06-20 1987-07-15 Kirin Amgen Inc Proteinreinigung.
EP0267678A1 (de) 1986-09-15 1988-05-18 Genzyme Corporation Rekombinantes menschliches Erythropoietin
EP0428267A2 (de) 1989-10-13 1991-05-22 Amgen Inc. Erythropoietin-Isoformen
EP0830376A1 (de) 1995-05-11 1998-03-25 Roche Diagnostics GmbH Verfahren zur herstellung von erythropoietin frei von tierischen proteinen
EP1127063A1 (de) 1998-11-06 2001-08-29 Sterrenbeld Biotechnologie North America, Inc. Methoden zur aufreinigung von rekombinatem humanem erythropoietin aus zellkulturüberständen
WO2003045996A1 (en) 2001-11-28 2003-06-05 Sandoz Gmbh Chromatographic purification of recombinant human erythropoietin
EP1428878A1 (de) 2002-12-13 2004-06-16 Siegfried Ltd. Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Erythropoietin
WO2005121173A1 (de) 2004-06-08 2005-12-22 Bioceuticals Arzneimittel Ag Verfahren zur reinigung von erythropoietin

Non-Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Dionex Technical Note 42, 1997
Gasger, Handbuch der industriellen Fest-Flüssig-Filtration, Hüthig Heidelberg 1990
Hokke et al., Eur. J. Biochem. 1995, 228, 981-1008
Holländer et al., LaborPraxis 2004, 56-59
Lasne, Nature 2000, 405 605-635
Meyer, Praxis der Hochleistungs-Flüssigchromatographie, Wiley-VCH Weinheim 2004;
Munir, Handbuch Ultrafiltration, Behr Hamburg 1990
Nowotny et al., Chromatographia 1988, 25, 409-412
Ph. Eur.; 01/2002: 1316
Ullmann A16, 187-258
Ullmann B2, 10-2, 10-21 und B3 11-6
Unger, Handbuch der HPLC, Teil 1 und 2, GIT Verlag Darmstadt 1994
Unger, Handbuch der HPLC, Teil 1, GIT Verlag Darmstadt 1994

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Publication number Publication date
CA2727042A1 (en) 2009-12-10
CN102056940A (zh) 2011-05-11
IL209654A0 (en) 2011-02-28
BRPI0914877A2 (pt) 2015-11-24
EP2283036A1 (de) 2011-02-16
JP2011521993A (ja) 2011-07-28
US20110152506A1 (en) 2011-06-23
WO2009147060A1 (de) 2009-12-10

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