DE4020012A1 - Verfahren zur herstellung von erythrozytenhaemolysaten - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von langzeitstabilen Hämolysaten aus Säugetier-Erythrozyten. Die gereinigten Hämolysate aus Humanerythrozyten sind besonders geeignet zur Präzisionskontrolle des Hämoglobingehaltes im Blut.

Die Hämolyse kann auf mechanischem Weg, durch Zusatz von Chemikalien oder auch durch Änderung des physik.-chemischen Umfeldes z. B. der osmotischen Bedingungen erfolgen. Wenn das Lysat die Qualitäten eines Kontrollmaterials aufweisen soll, verringert sich die Zahl der in Frage kommenden Verfahren. Das Kontrollmaterial muß außer den gewünschten Inhaltsstoffen auch eine gute Langzeitstabilität aufweisen, um seinen Einsatz in der Labordiagnostik zu ermöglichen. In der Regel sind deshalb bestimmte Reinigungsschritte erforderlich. Bekannt sind als Reinigungsschritte Verfahren, die auch in der Plasmafraktionierung angewendet werden: Die Affinitätschromatografie, die Fällung mit polyvalenten Kationen oder Anionen sowie die Fällung mit Zinkverbindungen. Verfahren, die gezielt die Herstellung eines diagnostischen Präparates beschreiben, werden durch die Patentschriften DD 1 50 543 und DD 2 15 700 geschützt. In der Schrift DD 1 50 543 werden die Erythrozyten durch mehrmaliges Waschen mit hypertonischer Natriumchloridlösung gereinigt und anschließend durch wiederholtes Einfrieren bei Temperaturen unter -120°C und Auftauen in einem Temperaturbereich von +20°C bis +50°C hämolysiert.

Nach mehrwöchiger Zwischenlagerung bei +2°C bis +6°C werden die größeren Zelltrümmer durch Zentrifugieren abgetrennt, die Lösung durch Stufenfiltration von feindispersen Anteilen gereinigt und schließlich sterilfiltriert.

Nach DD 2 15 700 wird eine blutgruppengleiche Verarbeitung vorgenommen. Die Erythrozytensuspension wird unter Verwendung eines Zellseparators gewaschen und die gereinigten Erythrozytenkonzentrate bei Temperaturen unter -10°C zwischengelagert.

Die Herstellung des Rohhämolysates und die weitere Reinigung erfolgt entsprechend DD 1 50 543 durch Zentrifugation, Stufen- und Sterilfiltration.

Die Nachteile dieser bekannten Verfahren werden in folgenden Punkten gesehen:

- die Erythrozyten müssen vor ihrem Einsatz gereinigt werden.

- die lange Verarbeitungsdauer und die vielen Arbeitsschritte bergen die Gefahr bakterieller Kontaminationen in sich.

Eigene Untersuchungen zeigen ferner, daß die Stabilität dieser Lysate unzureichend ist, sie weisen nach relativ kurzer Standzeit substanzbedingte Ausfällungen und Flocken auf.

Das Ziel der Erfindung besteht darin, durch ein reproduzierbares Verfahren mit geringem technischen und ökonomischen Aufwand die Herstellung einer langzeitstabilen Hämoglobinlösung zu ermöglichen.

Aufgabe der Erfindung ist es, die Stabilität einer Hämoglobinlösung dadurch zu gewährleisten, daß die herstellungsbedingten und zu Instabilitäten führenden Begleitsubstanzen, Zelltrümmer und Plasmaglobuline aus der Lösung entfernt werden.

Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß diese Reinigung in einem Schritt vollzogen werden kann. Die störenden Begleitsubstanzen lassen sich unter definierten Bedingungen durch die Zugabe von Methanol oder Ethanol bis zu 50 Vol.-% sicher ausfällen und durch Zentrifugation entfernen. In der klaren Lösung kann der gewünschte Hämoglobingehalt durch Verdünnen eingestellt werden. Anschließend wird sterilfiltriert und in die Endbehältnisse abgefüllt.

Die Vorteile des Verfahrens sind darin zu sehen, daß die Erythrozytenkonzentrate ohne vorherige Reinigung eingesetzt werden können, daß die kurze Verarbeitungsdauer, die Verarbeitungstemperatur und der Alkohol einen zuverlässigen Schutz gegen bakterielle Kontaminationen bilden und daß diese Lösungen eine sehr gute Langzeitstabilität aufweisen.

4.1 l Human-Erythrozytenkonzentrat werden mit dem gleichen Volumen einer Natriumazetat-Pufferlösung (10 ml konz. Essigsäure und 16 g Natriumhydroxid rein in 10 l destilliertem Wasser gelöst, pH-Wert 4,6-4,8) versetzt und mit einem hochtourigen Rührgerät 5 bis 10 Minuten hämolysiert. Zur Suspension mit einem pH-Wert von 5,5 bis 6,5 werden langsam unter Rühren bei +5°C bis +10°C 12,6 l 66 Vol.-%iges Methanol zugesetzt. Der ausgefallene Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt und verworfen.

Das Zentrifugat wird in Hohlfaserdialysatoren konzentriert und anschließend gegen destilliertes Wasser dialysiert, bis die Gefrierpunkterniedrigung der Lösung unter 0,15°C liegt. Nach Bestimmung des Hämoglobingehaltes wird die Lösung mit destilliertem Wasser auf die gewünschte Konzentration verdünnt ggf. mit einer Lösung des Natriumsalzes der o-(Aethylmercurithio)-Benzoesäure (Thiomersal®) als Konservierungsmittel versetzt (Zugabe von 1 ml 2%iger Lösung pro 100 ml Hämolysat).

Claims (3)

1. Verfahren zur Herstellung einer langzeitstabilen Hämoglobinlösung, gekennzeichnet dadurch, daß das Hämolysat von Säugetier-Erythrozyten durch Alkoholfällung von störenden Zellbruchstücken und instabilen Begleitproteinen befreit wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß zur Fällung Methanol oder Ethanol in Konzentration von 35 bis 50 Vol.-% eingesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Fällung bei pH-Werten zwischen 5,5-6,5 und im Temperaturbereich vonn +20°C bis +15°C vorgenommen wird.