DE19707508C2 - Verfahren zur Isolierung von Hämoglobin und die Verwendung des so isolierten Hämoglobins - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Hämoglobin und die Verwendung des so isolierten Hämoglobins gemäß den Patentansprüchen.

Mit Hämoglobin wird der rote Blutfarbstoff der Wirbeltiere bezeichnet, der in den Erythrozythen des Blutes enthalten ist. Hämoglobin ist ein tetrameres Eisenprotein, dessen Monomere aus je einer Globin-Kette mit einem Molekül Häm als prostetischer Gruppe bestehen. Hämoglobin hat seine Funktion darin, den einge­ atmeten Sauerstoff in der Lunge aufzunehmen und ihn zu den Muskeln sowie zu anderen atmenden Geweben zu transportieren. Ferner wird ein großer Teil des Kohlendioxids, das als Stoffwechsel-Endprodukt im peripheren Gewebe entsteht, durch Bindung an das Hämoglobin zur Lunge geführt und dort aus­ geschieden.

Zur Herstellung von Hämoglobin sind Verfahren bekannt (vgl. z. B. J. Exp. Med., 126, (1967), 1127; J. Lab. Clin. Med. 89, (1977), 509). Vielfach wird Hämoglobin aus Erythrozyten durch Lyse dieser mit destilliertem Wasser oder Lösungen niedriger Ionenstärke gewonnen. Dabei werden auch Glykoproteine und Glykolipide von den Erythrozyten freigesetzt, die dann das Hämoglobin kontaminieren. Zur Beseitigung der Kontamination werden organische Lösungsmittel, wie Toluol oder Chloroform, eingesetzt. Diese beeinflussen allerdings die Struktur von Hämoglobin, wodurch dieses häufig nicht in nativer Form erhalten wird. Auch erweist sich ein solches Hämoglobin oft als nicht stabil.

CA88: 101259p beschreibt die Isolierung von Hämoglobulin aus Erythrozyten, bei der diese mit Tetrachlorethylen gemischt und die erhaltene Lösung erhitzt und dann die organische Phase abgetrennt werden.

EP 0 356 257 A2 beschreibt die Lyophilisierung von Erythrozyten mit einer Kohlenhydrat- bzw. Kohlenhydrat-Polymer-Lösung. Nach Rehydrierung werden Erythrozyten erhalten, von denen etwa 50% intakte Zellmembranen aufweisen. Ferner wird Hämoglobulin in der Lösung erhalten.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem ein stabiles Hämoglobin in nativer Form bereitgestellt werden kann.

Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.

In Schritt (a) werden Erythrozyten-haltige Stoffe gesammelt. Dies können jegliche Stoffe sein, die Erythrozyten enthalten können. Insbesondere sind dies Blut, Blutkonserven und Zellkonzentrate. Die Stoffe können frisch isoliert sein oder älter als das jeweilige Verfalldatum sein. Der Ausdurck "Sam­ meln" betrifft jegliche Verfahren, Erythrozyten-haltige Stoffe zu vereinigen bzw. die Erythrozyten daraus anzureichern, wobei für letzteres insbesondere die Zentrifugation zu nennen ist.

In Schritt (b) werden die Erythrozyten mit einer physiologischen Pufferlösung gewaschen. Dies dient insbesondere dazu, Konservierungsmittel, wie CPDA und Restplasma, zu entfernen. Der Ausdruck "physiologische Pufferlösung" umfaßt jegliche Puffer­ lösung, die den gleichen osmotischen Druck wie Blutserum auf­ weist. Günstig ist eine Pufferlösung, die 5 mM Tris, pH 8,2 in 150 mM NaCl aufweist, besonders günstig ist eine 5 mM Pufferlösung, die 20% Natriumdihydrogenphosphat und 80% Kaliumhydrogenphosphat in 150 mM NaCl umfaßt. Ferner ist es vor­ teilhaft, den Waschvorgang unter sterilen, apyrogenen Bedin­ gungen bei 2-8°C durchzuführen. Besonders günstig ist es, wenn das Volumen der physiologischen Pufferlösung etwa 5-20fach von jenem der Erythrozyten ist.

In Schritt (c) werden die Erythrozyten unter osmotischen Schockbedingungen behandelt. Mit dem Ausdruck "osmotische Schockbedingungen" sind jegliche Bedingungen gemeint, unter denen Erythrozyten kontrolliert quellen, nicht aber lysieren, so daß nur Hämoglobin, nicht aber Glykoproteine bzw. Glykolipide freigesetzt werden. Hierzu werden die Erythrozyten mit absteigendem Gradienten einer physiologischen Pufferlösung, insbesondere jener von Schritt (b), behandelt. Ein solcher Gradient kann z. B. durch Zugabe folgender Puffer erhalten wer­ den: 5 mM Tris, pH 8,2, 150 mM NaCl mit 100% Ausgangs- und 0% Endanteil, und 5 mM Tris, pH 8,2 mit 0% Ausgangs- und 100% Endanteil. Günstig ist es, folgende Puffer zu verwenden: 5 mM Pufferlösung, umfassend 20% Natriumdihydrogenphosphat und 80% Kaliumhydrogenphosphat in 150 mM NaCl, mit 100% Ausgangs- und 0% Endanteil, und 5 mM Pufferlösung, umfassend 20% Natriumdihydrogenphosphat und 80% Kaliumhydrogenphosphat, mit 0% Ausgangs- und 100% Endanteil.

In Schritt (d) wird die Hämoglobin-Lösung filtriert. Hierzu wird eine Membran verwendet, die eine Porengröße im Bereich von 1-0,1 µm, vorzugsweise 0,8 µm, aufweist. Günstig kann es sein, Schritt (d) mehrfach und/oder rezirkulär durchzuführen. Gleiches gilt für die Schritte (b) und (c).

In Schritt (e) wird eine weitere Filtration der Hämoglobin- Lösung durchgeführt. Hierzu werden Membranen verwendet, welche die Abtrennung von Kontaminationen, insbesondere solcher < 300 kD bzw. < 30 kD ermöglichen. Günstig kann es sein, eine weitere Membran zu verwenden, welche die Abtrennung von Kontaminationen < 10 kD ermöglicht. Besonders günstig ist es, wenn für die Verwendung letzterer Membran die Hämoglobin-Lösung in einem 5 mM Tris-Puffer, pH 6,35 vorliegt.

Durch die Schritte (a)-(e) wird stabiles Hämoglobin in nativer Form erhalten. Dieses weist auch eine hohe Reinheit auf, die allerdings noch gesteigert werden kann, wenn nach Schritt (e) eine Ionenaustausch-Chromatographie durchgeführt wird. Günstig ist es, eine Kationenaustausch-Chromatographie durchzuführen. Eine solche umfaßt vorzugsweise die folgenden Verfahrensschritte:

• a) Beladen einer Kationenaustauscher-Säule mit der Hämoglobin- Lösung von Schritt (e),
• b) Spülen der Kationenaustauscher-Säule mit einem Kaliumphosphat-Puffer,
• c) Eluieren des Hämoglobins durch Gradientenwechsel eines Kaliumphosphat-Puffers,
• d) Einstellen des Hämoglobin-Eluats auf pH 7.33 mit Kaliumphosphat und auf eine Ionenstärke von 100 mM mit NaCl, und
• e) Filtrieren des Hämoglobin-Eluats durch eine Membran, welche die Abtrennung von Kontaminationen < 10 kD ermöglicht.

In Schritt (f) wird eine übliche Kationenaustauscher-Säule verwendet. Diese wird mit der Hämoglobin-Lösung von Schritt (e) beladen, wobei eine Fließrate von 75-150 cm/h günstig ist.

In Schritt (g) wird die Kationenaustauscher-Säule mit einem Kaliumphosphatpuffer gespült, um Kontaminationen zu entfernen. Als Kaliumphosphat-Puffer eignet sich besonders ein solcher, der 20-50 mM Kaliumphosphat enthält und einen pH von 6,5 aufweist. Günstig ist es auch, den Spülvorgang durch Messung der optischen Dichte bei 280 und 405 oder 540 nm zu verfolgen.

In Schritt (h) wird das Hämoglobin von der Kationenaustauscher- Säule eluiert. Hierzu ist es günstig, den Gradienten eines Kaliumphosphat-Puffers zu wechseln. Dies kann vorzugsweise durch Zugabe folgender Puffer erreicht werden: 20-50 mM Kaliumphosphat-Puffer, pH 6,35-6,5, mit 100% Ausgangs- und 0% Endanteil und 50 mM Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,5-7,6 mit 0% Ausgangs- und 100% Endanteil. Günstig ist es auch, die Elution von Hämoglobin durch Messung der optischen Dichte bei 280 und 405 oder 540 nm zu verfolgen.

In Schritt (i) wird das Hämoglobin-Eluat auf einen pH von 7,33 und eine Ionenstärke von 100 mM eingestellt. Hierzu ist es günstig, Kaliumphosphat für die Einstellung des pH und NaCl für die Ionenstärke zu verwenden. Es wird ein Hämoglobin-Eluat erhalten, das physiologisch ist.

In (j) wird das Hämoglobin-Eluat filtriert. Hierzu wird eine Membran verwendet, welche die Abtrennung von Kontaminationen < 10 kD ermöglicht.

Durch die Schritte (f)-(j) wird erreicht, daß das Hämoglobin eine Reinheit von etwa 99% aufweist.

Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, Hämoglobin herzustellen, das stabil ist. Dies zeigt sich z. B. darin, daß das Hämoglobin ohne Veränderung seiner Struktur eingefroren und aufgetaut werden kann, selbst wenn keine Stabilisatoren oder Additive zugesetzt werden. Auch liegt das Hämoglobin in nativer Form vor. Ferner weist es eine hohe Reinheit auf. Somit kann das Hämoglobin für jegliche Zwecke in der Diagnostik und Therapie verwendet werden. Insbesondere eignet es sich, zur Herstellung von Blutersatzstoffen verwendet zu werden. Darüberhinaus kann das Hämoglobin bzw. das erfindungsgemäße Verfahren bestens eingesetzt werden, Hämoglobin-Standards zu erstellen.

Die Erfindung wird durch das nachfolgende Beispiel erläutert.

Beispiel: Isolierung von Hämoglobin

Ein Membranmodul, das eine Membran-Porengröße von 0,8 µm enthält, wird mit 50 ml abgelaufenem Zellkonzentrat beladen. Dieses wird mit 250 ml einer 5 mM Pufferlösung gewaschen, die 20% Natriumdihydrogenphosphat und 80% Kaliumhydrogenphosphat in 150 mM NaCl umfaßt. Durch das Waschen werden Konservierungsstoffe entfernt.

Durch das Membranmodul werden zwei Puffer gepumpt. Puffer A ist eine 5 mM Pufferlösung, umfassend 20% Natriumdihydrogenphosphat und 80% Kaliumhydrogenphosphat in 150 mM NaCl. Puffer B ist eine 5 mM Pufferlösung, umfassend 20% Natriumdihydrogenphosphat und 80% Kaliumhydrogenphosphat. Der Anfangsanteil von Puffer A ist 100% und der Endanteil 0%. Der Anfangsanteil von Puffer B ist 0% und der Endanteil 100%. Der Übergang von Puffer A zu Puffer B verläuft kontinuierlich innerhalb von 2 Stunden. Es wird ein absteigender Gradient erhalten, wodurch die Erythrozyten zum Schwellen gebracht werden und Hämoglobin in gelöster Form freigegeben wird. Die Hämoglobin-Lösung wird rezirkulär durch das Modul geschickt, wodurch das Hämoglobin angereichert wird.

Die Hämoglobin-Lösung wird filtriert, wobei Membranen mit einem Porendurchmesser von 0,5 µm-0,1 µm verwendet werden. Die erhaltene Hämoglobin-Lösung wird weiter einer Ultrafiltration unterzogen, wodurch die Abtrennung von Kontaminationen mit einem Molekulargewicht < 300 kD und < 30 kD ermöglicht wird. Ferner wird die Hämoglobin-Lösung einer Filtration unterzogen, welche die Abtrennung von Kontaminationen < 10 kD ermöglicht. Hierzu wird ein 5 mM Tris-Puffer, pH 6,35 zur Hämoglobin-Spülung verwendet. Die erhaltene Hämoglobin-Lösung wird einer Kationenaustausch-Chromatographie unterworfen, wodurch ein Hämoglobin mit einer Reinheit von etwa 99% erhalten wird.

Claims (14)

1.1. Verfahren zur Isolierung von Hämoglobin, umfassend die folgenden Verfahrensschritte:

• a) Sammeln eines Erythrozyten-haltigen Stoffes,
• b) Waschen der Erythrozyten mit einer physiologischen Pufferlösung,
• c) Behandeln der Erythrozyten unter osmotischen Schockbedingungen mit absteigendem Gradienten der physiologischen Pufferlösung von (b),
• d) Filtrieren der aus (c) erhaltenen Hämoglobin-Lösung durch eine Membran mit Porengröße im Bereich von 1-­ 0,1 µm, und
• e) Filtrieren der aus (d) erhaltenen Hämoglobin-Lösung durch Membranen, welche die Abtrennung von Kontaminationen < 300 kD bzw. < 30 kD erlauben.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Erythrozyten-haltige Stoff von (a) Blut, eine Blutkonserve oder ein Zellkonzentrat ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die physiologische Pufferlösung von (b) eine 5 mM Pufferlösung ist, umfassend 20% Natriumdihydrogenphosphat und 80% Kaliumhydrogenphosphat in 150 mM NaCl.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß der absteigende Gradient der physiologischen Pufferlösung von (b) durch die Zugabe folgender Puffer erhalten wird:

• 1. 5 mM Pufferlösung, umfassend 20% Natriumdihydrogenphosphat und 80% Kaliumhydrogenphosphat in 150 mM NaCl mit 100% Ausgangs- und 0% Endanteil, und
• 2. 5 mM Pufferlösung, umfassend 20% Natriumdihydrogenphosphat und 80% Kaliumhydrogenphosphat mit 0% Ausgangs- und 100% Endanteil.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die Porengröße der Membran von (d) 0,8 µm ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die Schritte (b), (c) und/oder (d) mehrfach und/oder rezirkulär durchgeführt werden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt (e) auch eine Membran umfaßt, welche die Abtrennung von Kontaminationen < 10 kD ermöglicht.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Hämoglobin-Lösung in einem 5 mM Tris-Puffer, pH 6,35 vorliegt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß nach Schritt (e) eine Ionenaustausch- Chromatographie durchgeführt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Ionenaustausch-Chromatographie folgende Verfahrensschritte umfaßt:

• a) Beladen einer Kationenaustauscher-Säule mit der Hämoglobin-Lösung von Schritt (e),
• b) Spülen der Kationenaustauscher-Säule mit einem Kaliumphosphat-Puffer,
• c) Eluieren des Hämoglobins durch Gradientenwechsel eines Kaliumphosphat-Puffers,
• d) Einstellen des Hämoglobin-Eluats auf pH 7.33 mit Kaliumphosphat und auf eine Ionenstärke von 100 mM mit NaCl, und
• e) Filtrieren des Hämoglobin-Eluats durch einen Membran, welche die Abtrennung von Kontaminationen < 10 kD ermöglicht.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Gradientenwechsel des Kaliumphosphat-Puffers von (h) durch Zugabe folgender Puffer erreicht wird:

• 1. 20 bis 50 mM Kaliumphosphat-Puffer, pH 6.35-6.5 mit 100% Ausgangs- und 0% Endanteil, und
• 2. 50 mM Kaliumphosphat-Puffer, pH 7.5-7.8 mit 0% Ausgangs- und 100% Endanteil.

12. Verwendung des nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 isolierten Hämoglobins für diagnosti­ sche und/oder therapeutische Zwecke.

13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei das Hämoglobin für Blutersatzstoffe eingesetzt wird.

14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei das Hämoglobin als Hämoglobin-Standard eingesetzt wird.