DE2726886A1 - Neues glykoprotein und verfahren zu dessen herstellung - Google Patents

Neues glykoprotein und verfahren zu dessen herstellung

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DE2726886A1
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Description

BEHRINGWERKE /AKTIENGESELLSCHAFT, Marburg / Lahn
Aktenzeichen: Ma 299
Datum: ^k. Juni 1977 HOE 77/B 012
Neues Glykoprotcin und Verfahren zu dessen Herstellung
Die Erfindung betrifft ein neues Glykoprotein, das im Blutserum, im Urin und im Extrakt menschlicher Plazenten nachgewiesen und daraus isoliert werden kann sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung.
Die durch die wässrige Extraktion menschlicher Plazenten erhältliche Proteinlsöung enthält bekanntlich eine Vielzahl von Komponenten, die teilweise den Serumproteinen zuzuordnen und zum anderen Teil Gewebeproteine sind.
Die Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, ein bisher noch nicht bekanntes Serur.-Glykoprotein aus dem Extrakt menschlicher Plazenten zu isolieren, damit spezifisch gegen das neue Glykoprotein gerichtete Antiseren herzustellen, womit das Glykoprotein im Serum und im Urin qualitativ nachgewiesen oder quantitativ bestimmt werden kann.
Gegenstand der Erfindung ist ein neues Glykoprotein, welches aus Blutserum, aus Urin und dem Extrakt menschlicher Plazenten erhältlich ist. Es ist gekennzeichnet durch einen Proteinanteil, im wesentlichen bestehend aus Ol -Aminosäuren, von 75 - 6 %,
einen Kohlenhydratanteil von 24,6 - 5,2 %, davon Hexosen 8,9 - 2 %, N-acetyliertes Hexosamin 7,1 - 1,5 %, Fucose 0,2 - 0,2 % N-acetylierte Neuraminsäure 8,4 - 1,5 %, einen Sedimentationskoeffizienten s„„ von 2,5 - 0,3 S,
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ein Molekulargewicht von 35 000 - 5 000 aufgrund der Bestimmung in der Ultrazentrifuge bzw. ein Molekulargewicht von 65 000 - 10 000 aufgrund der Bestimmung im Natriumdodezylsulfat-haltigen Polyacrylamidgel,
einen isoelektrischen Punkt von pH 3,4 - 0,4,
einen Extinktionskceffizienten E 1 ^n (28C nm) von 1,9 - 0,3, eine elektrcphoretische Beweglichkeit im Bereich zwischen den dL~ und den C^2-Globulinen und
eine spezifische immunologische Reaktion mit einem spezifisch gegen das Glykoprotein gerichteten Antikörper.
Zur Erläuterung der kennzeichneden Merkmale des Glykoproteins sei folgendes ausgeführt:
Die Bestimmung der Sedimentationskoeffizienten wurde in einer analytischen Ultrazentrifuge der Firma Beckman (Spinco-Apparatur, Modell E) bei 6.000 UpM in Doppelsektorzellen mit Hilfe der UV-Scanner Technik bei 280 nm durchgeführt. Als Lösungsmittel diente ein 0,05 M Phcsphatpuffer (pH 6,8) der 0,2 Mol/l NaCl enthielt. Die Proteinkonzentration betrug 2 %. Die Sedimentationskoeffizienten sind auf die Basis von Wasser bei 200C umgerechnet worden.
Zur Ermittlung der Molekulargewichte wurds die Sedimentationsgleichgewichtsmethode und die Polyacrylamidgel-Elektrophorese herangezogen. Die Bestimmung in der Ultrazentrifuge wurde bei 9.000 UpM vorgenommen. Die Auswertung erfolgte unter Zugrundelegung eines partiellen spezifischen Volumens (partial specific volume) von 0,74 ml/g. In der Ultrazentrifuge ergab sich ein Molekulargewicht von 35.000 - 5.000.
Für die Polyacrylamidgel-Elektrophorese wurden zwei Verfahren angewandt. Die Auftrennung im normalen Polyacrylamid (PAA)-GeI erfolgte nach der Methode von Zwisler und Biel, Z.klin. Chem. 4^, Seite 58, (1966). Zur Untersuchung im Natriumdodecylsulfat-haltigen Gel wurde ein Gel mit 7,5 % PAA das 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS) enthielt, verwendet. Zur Reduktion sind die Proteine in 1 %
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SDS mit 1 % Merkaptoäthanol inkubiert worden. Das Anfärben der Proteine geschah mit Amidoschwarz. Aus derWanderung im SDS-haltigen PAA-GeI wurde für das Glykoprotein ein Molekulargewicht von 65.000 - 10.000 abgeleitet.
Die Bestimmung des isoelektrischen Punktes wurde mit einer Säule (440 ml) der Firma LKB Stockholm, durchgeführt. Das sogenannte Ampholin-Gemisch hatte bei der Untersuchung des Glykoproteins einen pH-Bereich von 2,5 bis 4,0.
Die Untersuchung der elektrophoretischen Beweglichkeit erfolgte in der Mikromodifikation von Beckmann Instruments auf Zelluloseazetatfolien mit Natriumdiäthylbarbiturat-Puffer pH 8,6.
Die Bestimmung der Kohlehydrate erfolgte nach der von H.E. Schultze R. Schmidtberger, H. Haupt, Biochem. Z. 329, Seite 490, (1958), beschriebenen Methode.
Die Aminosäurenanalyse wurde nach S. Moore, D.H. Spackmann, W.H. Stein, Anal. Chem. V±, Seite 1185, (1958), unter Verwendung des Flüssigkeitschromatographen Multichrom B der Firma Beckmann durchgeführt. 1/2 Cystin wurde nach Oxydation der Proteine mit Perameisensäure (S. Moore et al., Anal. Chem. _3£, Seite 1185, (1958) und nachfolgender Chromatographie (S. Moore, J.Biol.Chem. 238, Seite 235, (1963)) als Cysteinsäure bestimmt. DerTryptophengehalt ist mit der direkten photometrischen Bestimmung nach H. Edelhoch, Biochemistry j5, Seite 1948, (1967), ermittelt worden.
Die immunologische Charakterisierung der Substanz erfolgt am einfachsten mit einem bekannten Diffusionsverfahren, bei welchen Antigen, d.h. das Glykoprotein und ein gegen das Glykoprotein gerichteter Antikörper bzw. das hinsichtlich der Antikörper nicht angereicherte Antiserum gegeneinander in einem Trägermedium, wie z.B. Agar, diffundieren. Treffen die beiden Reaktionskomponenten in einem günstigen Verhältnis aufeinander, bildet sich ein sieht-
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bares Präzicirat aus. Nach dieser Kenntnis ist es für den Fachmann einleuchtend, dai alle immunologischen Techniken zum Nachweis und zur Bestir_~.ur.r sowohl des neuen Glykoproteins, als auch der gegen das Glykoprctein gerichteten Antikörper möglich sind.
Eine einfache und in der Regel ausreichend genaue Methode zur quantitativen Bestimmung des Glykoproteins in Körperflüssigkeiten oder in Gevrebextrakten stellt die sogenannte Laurell-Technik dar. Sie ist beschrieben in Analyt. Biochem. (New York), 15, Seite 45 (1965) .
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung des oben charakterisierten Glykoproteins, dadurch gekennzeichnet, daß Körperflüssigkeiten oder Extrakte von Organen, welche das Glykoprotein en-'nalten, unter Zugrundelegung folgender erfindungsgemäß gefundener Kriterien fraktioniert werden.
Das Glykcrpc-ein ist mit Neutralsalzen fällbar. Mit dem üblicherweise für derartige Fällungen verwendeten Ammoniumsulfat wird es bei einer Säztigungskonzentration des Salzes von 30 bis 60 % in einem pH-rereich in der Nähe des Neutralpunktes gefällt.
Entsprechend seinem Molekulargewicht kann das Glykoprotein durch Maßnahnen, die zur Abtrennung von Substanzen mit Molekulargewichten zwischen 25.000 und 75.000 geeignet sind, gewonnen werden. Vorteilhaft verde' hierfür die Methoden der Gel-Filtration oder Ultrafiltration eingesetzt.
Das Glykoprctein wird bei neutralem oder schwach alkalischem pH-Wert an schwach basische Ionenaustaischer adsorbiert. Vorteilhaft wird dabei eine vergleichsweise wenig konzentrierte Pufferlösung verwendet, denn durch Erhöhung der Salzkonzentration oder auch durch Erniedrigung des pH-Wertes kann die Adsorption verhindert werden. Andererseits bietet sich bei Kenntnis dieses Verhaltens die Möglichkeit an, das Glykoprotein zu adsorbieren und unter Ver-
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wendung von höherkonzentrierten Salzlösungen bzw. von Pufferlösungen r.it erniedrigtem pH-Wert zu eluieren.
Es hat sich gezeigt, daß das neue Glykoprotein mit den wasserlöslichen organischen Basen der Acridin- und Chinolinreihe, die für Protein-Fa'llungsverfahren üblicherweise Verwendung finden, nicht präzipitier- vird. Es bleibt in den bei diesem Verfahren üblichen Konzentrazicr.en im wässirgen Überstand. Danach kann eine Acridinbase, vrie 2-Xthoxy-6 , 9-Diaminoacridinlactct oder eine Chinolinbase , wie Eis- (2::.£-chyl-4-aminochinolyl-6) -carbamid-hydrochlorid, zur Fällung vcr: bo-l eitenden Proteinen verwendet werden, wobei das erf indur.gscer.äSe Glykoprotein im Überstand verbleibt.
Ähnliche Überlegungen können gelten bei Verwendung von Hydroxylapatit als Adsorbens für Proteine. Das neue Glykoprotein zeigt keine Affinität zum Hydroxylapatit, wohingegen eine Reihe von Begleitprcteir.en von Hydroxylapatit festgehalten wird. Das Glykoprotein gehört somit zu den Hydroxylapatit-passierenden Globulinen. Der Erfinder schlägt vor, es als Hydroxylapatit passierendes Globulin (KPG-2) zu bezeichnen.
Aufgrund der Kenntnis der elektrophoretischen Beweglichkeit kann für die Anreicherung bzw. Isolierung des Glykoproteins die präparative Zcnedektrophorese eingesetzt v/erden.
Die Affinitat des Glykoproteins aufgrund sein® immunologischen Verhaltens kann dafür eingesetzt werden, das Glykoprotein mit Hilfe von sz~: IrjT.un-Adsorptionsverfahren anzureichern. Hierfür kann in ansich bekannter Weise ein Immunadsoibens d.h. ein trägergebundener Antikörper, gegen das neue Glykoprotein hergestellt werden, welches das Glykcprotein spezifisch zu binden vermag. Das Glykoprotein kann danach durch Änderung der Milieubedingungen wieder eluiert werden, wie dies in der Fachliteratur mehrfach beschrieben ist.
Durch eine ausgewählte Kombination der genannten Methoden, nerseits zur Anreicherung des Glykoproteins anderersföit^s zu einer
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Abtrennung von übrigen Begleitproteinen führen, kann die Isolierung der erfindungsgemäßen Substanzen erfolgen. Demzufolge ist der Gegenstand der vorliegenden Erfindung in den einzelnen Anreicherungsschritten für das neue Glykoprotein und in den durch Kombination der Maßnahmen zur Anreicherung sich ergebenden Verfahren zu dessen Reinigung zu sehen.
Die Leitlinie für das Verfahren zur Herstellung des Glykoproteins besteht darin, daß jeweils derjenige Anteil gewonnen wird, welcher eine positive immunologische Reaktion mit einem gegen das neue Glykoprotein gerichteten Atiserum ergibt.
Nach Durchführung der genannten Verfahrensschritte zeigt es sich zuweilen, daß das Glykorpotein noch von anderen immunologisch nachweisbaren Beqleitproteinen verunreinigt ist. In diesem Falle werden die Verunreiniqunqen durch deren spezifische Adsorption entfernt. Man bedient sich dabei gängiger Techniken der Immunadsorption, bei welchen nach beschriebenen Verfahren an einen Träger gebundene Antikörper gegen das zu entfernende Protein als Adsorbenzien eingesetzt werden. Häufig ist das weitgehend reine neue Glykoprotein noch mit Spuren des schwangerschafts-spezifischen ß..-Glykoproteins und/oder des CL B-Glykoproteins, auch als leicht fällbares Oi1-Glykoprotein bezeichnet, vergesellschaftet. Zu deren Abtrennung können gegen die Proteine gerichteten Immunoglobuline, welche kovalent an vernetzte Agarpräparationen, wie z.B. SEPHAROSE, gebunden sind, verwendet werden.
Die auf eine Säule, welche mit dem spezifischen Immunadsorbens gefüllt wurde, aufgetragene Proteinlösung läuft insoweit unbehelligt durch die Säule, als nur diejenigen Komponenten gebunden werden, gegen die der Träger einen immunologisch aktiven Partner enthält. Das neue Glykoprotein kann auf diese Weise von den Verunreinigungen befreit werden.
Zur Herstellung des neuen Glykoproteins werden mehrere der angeführten Maßnahmen miteinander kombiniert und dabei jeweils diejenige Fraktion weiterverarbeitet, in der immunologisch das neue GIy-
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koprotein nachgewiesen werden kann, während die übrigen Fraktionen verworfen werden.
Als Ausgang sr.aterial für die Herstellung des neuen Glykoproteins kann jede Körperflüssigkeit oder jeder Organextrakt verwendet werden, in welchen es gelingt, das Glykoprotein immunologisch nachzuweisen. Bevorzugt werden Extrakte menschlicher Plazenten verwendet, die durch Zerkleinerung und Extraktion mit Wasser oder einer verdünnten, zveckr.äßig einer wen ige r als 10 %igen Salzlösung, vorteilhaft mit eir.er 0,5 %igen Neutralsalzlösung, wie beispielsweise Natriumchlorid, gewonnen werden können. Zweckmäßig verwendet man auf 1 kg Plazenten etwa 1-5 Liter der Extraktionslösung. Die nicht gelcsrer. Anteile werden durch Zentrifugation oder Filtration von dem Extrakt abgetrennt.
Das Verfahre" zur Anreicherung ist gekennzeichnet durch die Anwendung mindestens einer der folgenden Maßnahmen auf Körperflüssigkeiten, welche das neue Glykoprotein enthalten und die ansschließende Gewinnung der bezüglich des Glykoproteins angereicherten Fraktion:
a) Zugabe vcn wasserlöslichen Derivaten einer Acridin- oder Chinolinbase, vorzugsweise des 2-Äthoxy-6,9-Diaminoacridin-lactat, im pH-3ereich von 5 - 10, vorzugsweise bei etwa pH 8, bis zu einer Er.dkonzentration von etwa 0,8 % (Gewicht zu Volumen), wobei das Glykoprotein im wesentlichen im überstand verbleibt.
b) Zugabe von Neutralsalzen bis zur Ausfällung des Glykoproteins, vorzugsveise vom Ammoniumsulfat bei etwa neutralem pH-Wert von 5-8 bis zu 30 - 60 % der Sättigungskonzentration des Ammoniurr.sulf ats.
c) Adsorption des Glykoproteins an einem schwach-basischen Ionenaustauscher, wie Diäthylaminoäthyl-cellulose, bei einer Leitfähigkeit der Lösung von 0 - 2 mS und neutralem oder schwachalkalischen pH-Wert (6 - 9). Beispielsweise unter Verwendung
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eines etwa 0,01 M Puffers vom pH-Wert von etv/a 8. Ein bevorzugt zu verwendender Puffer ist beispielsweise Tris-Hydroxymethylä.-incr.ethan" HCl. Die Elution des Glykoproteins kann durch Senkung des pH-Wertes unter pH 7,0 oder durch Erhöhung der Leitfähigkeit über 5 mS erreicht werden.
d) Trennung aufgrund der Molekülgröße (Molekularsiebfraktionierung). Besonders geeignet ist die Gelfiltration in einer Säule gefüllt: r.ir. einem Polymeren entsprechender Porengröße, beispielsweise nit Epichlorhydrin-vernetztem Dextran, als
ι P)
SEPHAZZÄ hergestellt von der Firma Pharmacia, Uppsala, mit de~ Ziel der Anreicherung von Proteinen mit einem Moleku-
(R) largevich- von etwa 50.000. Aber auch Produkte wie ULTROGEL
(R)
von Li'.B, Brcrrjna oder BIO-GEL von Bio-Rad Laboratories, Richr.cnd, Calif, können eingesetzt v/erden.
e) Durchführung einer Adsorption mit Hydroxylapatit. Da das GIykoprctein in verdünnter Phosphatpufferlösung von Hydroxylapatinicht gebunden wird, ist Hydroxylapatit ein geeignetes Agens, ur. Begleitproteine des Glykoproteins aus der Lösung zu entfernen. Die Protein-lösunc» wird hierfür zweckmäßig auf einen pH-Werc u~ den Neutralpunkt eingestellt und die Leitfähigkeit der Lesung auf etwa 1 mS gehalten.
f) Präparazive Zonenelektrophorese.
Geeigne- für die Durchführung einer Elektrophorese ist eine das G_y>" rcteine enthaltende Lösung, verzugsweise eine alkalische Pufferlösung, beispielsweise in einem Natriumdiäthylbarbitur=-cuffer von pH 8,6, und einer Ionenstärke - 0,1. Die Lösung virirLn eine Apparatur zur präparativen Elektrophorese eingetragen, wie sie beispielsweise von N. Heimburger und R. Schmidrberger in Behringwerke-Mitteilungen, Heft 43, Seite 83 ff., insbesondere auf Seite 119-120, beschrieben wird. Bei dem Gera- handelt es sich um die horizontale Anordnung einer Trägerelektrophorese in einem offenen Trog, in Vielchem das Trägermaterial zur Abführung der bei der Elektrophorese auftreten-
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"owg^nalInspected
den Jcule1sehen Wärme auf unter 100C gekühlt wird. Als Trägermaterial dienen gegenüber Proteinen indifferente Substanzen, vorteilhaft Polyvinylchlorid, oder dessen Copolymerisate in Fcrr. eir.es feinen Granulats.
Es ist erpfehlenswert, die Elektrophorese im alkalischen pH-Bereich, vorteilhaft bei etwa pH 8,6, bei einer Ionenstärke von 0,Cc - 0,12 und bei einer Feldstärke von 4-6 Volt/cm vorzur.ehrer.. Bei Verwendung von 0,1 M Natriumdiäthylbarbituratpuffer ve- pH-Wert 8,6 wandert das Glykoprotein im elektrischen FeIi in den zwischen oL - und c(2~Globulinen liegenden Bereich der Plasmaproteine.
Für die Gewinnung des neuen Glykoproteins wird die betreffende Zone herausgeschnitten und vom inerten Trägermaterial mit Hilfe von Wasser oder wässrigen Salzlösungen, beispielsweise einer 0,5 bis 1 »igen Kochsalzlösung, eluiert.
Das erfindur.csre.Tiäß hergestellt Glykoprotein hat antigene Eigenschaften. Zir.e canit durchgeführte Immunisierung von Tieren nach bekannten Methoden führte zur Bildung von spezifischen Antikörpern im Blut der ir-.unisierten Tiere. Deren Seren könne nach üblichen Verfahren gevcr.r.en und die darin enthaltenenen Antikörper angereichert werde:.. ZLe Antiseren können in bekannten immunologischen Verfahren zurr. !Nachweis und zur Bestimmung des neuen Proteins in Körperf l\is = ig-:eiten, insbesondere in dem Blutserum, Verwendung finden.
Die Erfindung vird in dem nachstehenden Beispiel näher erläutert.
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ORIGINAL INSPECTED
1 !3~Γ»νι JA
-xf-
Beispiel:
150 kg tiefgefrorene Plazenten werden zerkleinert und mit 150 1 einer 0,5 %igen wässrigen Natriumchloridlösung extrahiert. Der Extrakt wird r.it 2n-Natriumhydroxyd auf pH 8 eingestellt und mit 50 1 einer 3 %igen wässrige Lösung von Diamonoäthoxyacridin-lactat versetzt. Nach einer Wartezeit von 1 Stunde wird der Überstand der das erfindungsgemäße Glykoprotein (HPG-2) enthält, abgehebert, mit 5 % festem Natriumchlorid (11 kg) zur Abscheidung des noch in Lösung verbliebenen Diaminoäthoxyacridin-lactats versetzt, filtirert und r.it 3C % - bezogen auf das Gewicht der Flüssigkeit - festem Amr.oniur.s-.ilfat versetzt und gut durchgerührt. Nach 1 Stunde wird der Niederschlag abfiltriert.
500 g des auf dem Filter gesammelten Niederschlages werden in 500 p.l destilliertem Wasser gelöst und gegen eine 0,01 molare Tris-(oxynethyl)-aminomethan-Saizsäure-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0, die 0,05 % Xatriumazid enthält, dialysiert. Die dialysierte Lösung wird zentrifugiert und der überstand wird mit der gleichen Puffer-Lösung auf 2.000 ml aufgefüllt, mit 0,1 η Natriumhydroxydlösung auf pH 8,C eingestellt und mit 500 g feuchter Diathylaminoathylcellulose (Firma Serva, Heidelberg) 1 Stunde verrührt.
Dann wird die Diathylaminoathylcellulose durch Filtrieren von der Lösung abgetrennt, zweimal mit je 1 Liter 0,01 molarem Tris-(oxymethyl)-arinonethan-Salzsäure-Puffer vom pH-Wert 8,0 gewaschen und danach dreimal mit je 500 m^0,02 molarem Tris-(oxymethyl)-aminomethar.-Salzsäure-Puffer, pH 6,5, der 0,85 % Natriumchlorid und 0,05 % Natriumazid enthält, eluiert.
Den vereinigten Eluaten werden 30 % Ammonsulfat, bezogen auf das Flüssigkeitsgewicht, zugesetzt und das ganze wird verrührt. Der Niederschlag, der das Protein (HPG-2) enthält, wird in 300 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Proteinlösung wird gegen Tris-
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ORIGINAL INSPECTED
Hydroxymethyl-Aminomethan-Salzsäure-Puffer von pH 8,0, der 1,0 Mol Natriur.chlorid/1 enthält, dialysiert und auf eine mit Sephadex G-150 gefüllte Säule (100 χ 20 cm) aufgetragen und mit dem genannten Puffer eluiert. Während der Elution findet eine Fraktionierung der Proteine nach deren Molekülgröße statt.
Anschließend v;erden die Eluate mit spezifischem Antiserum getestet, die das Glykoprotein (HPG-2) enthaltenden Franktionen werden gesammelt und daraus die Proteine nochmals, wie oben beschrieben, mit 30 % festen Arjr.onsulf at ausgefällt.
Zur Weiterreinigung wird die Fällung in 50 ml Wasser gelöst, gegen einen 0,005 π Phosphatpuffer, pH 6,8, dialysiert und auf eine mit Hydroxylapatit gefüllte Säule, 3 χ 23 cm, gegeben. Die Entwicklung der Säule erfolgt mit dem 0,005 m Phosphatpuffer, pH 6,8.
Das Glykoprotein (HPG-2) erscheint im Durchlauf; dieser wird auf einem Ultrafilter eingeengt. Das Konzentrat wird anschließend gegen einen 0,01 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,0, dialysiert und an DEAE-SEPHADEX (Säule 3 χ 23 cm) adsorbiert. Zur Elution und Auftrennung der adsorbierten Proteine dient ein NaCl-Gradient von 0 - 2 %, Die das Glykoprotein (HPG-2) enthaltenden Eluatfraktionen werden gesammelt eingeengt.
Zur Weiterreinigung wird das eingeengte Eluat in einer 0,075 m Anunoniurükarbonatlösung aufgenommen und einer präparativen Zoneelektrophcrese unterworfen. Die das HPG-2 enthaltende Zone wird nach der Auitrennung herausgeschnitten und mit physiologischer Kochsalzlsöung eluiert; die Eluate engt man anschließend auf dem Ultrafilter ein.
Das als Verunreinigung noch vorhandene Ck .B-Glykoprotein wird mit Hilfe eines entsprechenden Immunadsorbens entfernt. Zur Herstellung des Irr-.unadsorbens werden Antikörper gegen das (A^-B-Glykoprotein kovalent an Sepharose gebunden und das so erhaltene Adsorbens mit den Eulat im Batch-Verfahren oder in einer Säule in Berührung
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gebracht. Dabei wird ίλ.Β-Glykoprotein an die trägergebundenen Antikörper adsorbiert, während das Glykoprotein HPG-2 in Lösung bleibt. Die Lösung, die dann nur noch HPG-2 enthält wird gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert. Man erhält etwa 10 bis 30 mg des neuen Glykoproteins HPG-2.
Es zeigt folgende Aminosäure-Zusammensetzung (Häufigkeit mit Variationskieffizienten (VK) in %):
Häufigkeit
in Mol % VK %
Lysin 4,41 6,92
Histidin 1,22 22,79
Arginin 1,34 9,18
Asparaginsäure 8,23 2,56
Threonin 6,74 2,42
Serin 5,26 6,85
Glutaminsäure 12.59 0,49
Prolin 11,27 9,20
Glycin 5,63 9,84
Alanin 15,05 6,35
Cystin/2 3,65 22,76
Valin 9,89 7,94
Methionin 0,0 0,0
Isoleucin 0,88 7,39
Leucin 9,09 3,74
Tyrosin 1,02 30,77
Phenylalanin 3,60 . 5,14
Tryptophan 0,14 96,98
/13
809883/0017

Claims (5)

  1. HOE 77/d 012
    Patentansprüche
    Ί. Neues Glykoprotein gekennzeichnet durch
    a) einen Proteinanteil von 75 - 6 %;
    b) einen Kohlenhydratanteil von 24,6 - 5,2 % davon Hexosen 8,9 - 2 %, N-acetyliertes Hexosamin 7,1 - 1,5 %, Fucose 0,2 - 0,2 %, N-acetylierte Neuraminsäure 8,4 - 1,5 %.
    c) einen Sedimentationskieffzienten S^n von 2,5 - 0,3 S;
    J. υ w
    d) ein in der Ultrazentrifuge bestimmtes Molekulargewicht von 35 000 - 5 000;
    e) einen isoelektrischen Punkt von pH 3,4 - 0,4;
    f) einen Extinktionskoeffizienten K Λ (280 mm) von 1,9 - 0,3;
    1 cm
    g) eine elektrophoretisch^ Beweglichkeit im Bereich zwischen ei λ~ und den Λ -Globulinen;
    h) eine spezifische immunologische Reaktion iait einem spezifisch gegen das Glykoprotein gerichteten Antikörper.
  2. 2. Verfahren zur Anreicherung des Glykoproteins nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Proteinlösung, in welcher das Glykoprotein immunologisch nachgewiesen werden kann, mindestens einer der folgenden Maßnahmen unterworfen wird und die bezüglich des Glykoproteins angereicherte Fraktion gewonnen wird:
    a) Zugabe von Neutralsalzen bis zur Ausfällung des Glykoproteins;
    b) Molekularsiebfraktionierunq und Gewinnung der Fraktion mit einem ftolekulargewicht von 25 000 bis 75 000;
    c) Adsorption des Glykoproteins an einen schwach basischen Ionenaustauscher und Elution davon;
    d) Zugabe von wasserlöslichen Derivaten einer Acridin- oder Chinolinbase im Bereich vom pH 5 - 10 bis zu einer Endkonzentration von etwa 0,8 %;
    e) Behandlung der Glykoproteinlösung mit Hydroxylapatit;
    f) Präparative Zonelektrophorese und Gewinnung der Zone zwischen ^1 - und '^,,-Globulinen;
    g) Behandlung der Proteinlsöung mit einem Immunadsorbens.
    /^h 809883/0017
    HOE 77/B 012
  3. 3. Verfahrer, nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Proteinlesung ein Extrakt aus menschlichen Plazenten verwenden -.»ird.
  4. 4. Ver'-'.'c-r.iur.q des Proteins nach Anspruch 1 zur Gewinnung von Antikere-.
  5. 5. Antis z~\.\:. erhältlich durch Irarriuni si erung von Wirbeltieren nit ■:.; :\er Glykoproteins nach Anspruch 1 .
    ,VfED 809883/0017
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