JPS61294366A - 糖鎖に特異的な抗体の検出用試薬及びその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、複合糖質糖鎖に特異的な抗体を検出及び力価
検定をするための試薬、それを使用して試料、例えば血
清等の中に存在する該抗体を検出及び力価検定する方法
、更に該試薬を用いて得られる糖鎖に特異的な単クロー
ン抗体を産生ずるハイプリドーマに関する。

〔従来の技術〕

自然界に広く存在する糖タンパク質、糖脂質、ムコ多糖
などの複合糖質の糖鎖を認識する特異的な抗体について
研究が継続されているが、一般には製造し難いとされ、
これら複合糖質を単独又は適当な担体に結合させたもの
をアジュバントと混じて、家兎、マウスなどに免疫した
場合でも例えばム、Ｂ％”、−・ａ％Ｌｅｂ、工等のご
とき各種の血液型活性物質である特別の糖鎖の場合を除
けば糖鎖特異的な抗体は得られないのが通常であ・つた
。これらの血液型活性物質を含めて従来、細胞表面に存
在する複合糖質に対する抗体を産生させようとする手段
として、細胞又はそれをホルムアルデヒドなどで処理し
たものを単独又はアジュバントと共に血流、腹腔、皮下
、皮肉等に反復投与し、適当な時間の後に血液を採取す
る。

この血液から血清を調製したのち血清中の抗体と免疫に
用いた細胞又はその修飾物との結合力を指標として血中
抗体価を判定するのが通常であった。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかし、この場合細胞表面には複合糖質よシもむしろ主
要成分としての各種タンパク質が存在するため、得られ
た抗体のほとんどはこれらタンパク質成分に特異的なも
ので８シ、この中から糖鎖に対する抗体を選択すること
は事実上不可能であった。

本発明の目的は、該抗体の検出及び力価検定用試薬、及
びそれを利用した試料中の抗体の検出及び力価検定方法
と単りローン性該抗体を産生ずるハイブリドーマを提供
することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は糖鎖に特異
的な抗体の検出及び力価検定用試薬に関する発明であっ
て、複合糖質、それと含む細胞又はそれに由来する標品
における糖鎖に特異的な抗体の検出が可能なムチン型又
は血清型の糖ペプチドを含有してなることを特徴とする
。

また本発明の第２の発明は、試料中の糖鎖に特異的な抗
体の検出及び力価検定方法に関する発明であって、糖鎖
に特異的な抗体の検出が可能なムチン型又は血清型の糖
ペプチドを吸着させたアッセイプレートを用いることを
特徴とする。

更に本発明の第３の発明は、糖鎖に特異的な単クローン
抗体を産生ずるハイブリドーマに関する発明であって、
糖鎖に特異的な抗体産生細胞を含有する細胞とミエロー
マ細胞とを融合させてハイブリドーマを形成させ、次い
で糖鎖に特異的な抗体の検出が可能なムチン型又は血清
型の糖ペプチドを吸着させたアッセイプレートを用いて
抗体産生細胞を選択してなることを特徴とする。

本発明者は前記従来技術の状況にかんがみ、高級脂肪酸
を糖ペプチドに化合させることによって糖鎖に対する抗
体価が顕著に上昇することを発見し、このことを基礎に
特願昭５９−９５６６号を抗体産生誘起物質として出願
した。その後、該発明の改良について研究を継続した結
果、抗体価を上昇させると共に産生した糖鎖に対する抗
体の検出能を増強することについて研究を拡大し本発明
に到達したものである。

本発明によれば、該試薬によシ容易に糖鎖特異的抗体を
検出及び力価検定し、その細胞からのハイブリドーマの
製造、それによる単クローン抗体の大量調製を可能にし
たものである。

糖鎖特異的抗体を検出及び力価検定するには、まず糖鎖
を糖ペプチドの形で調製し、これを吸着させたプレート
に検定すべき例えば血清又は細胞培養液を加え更に一次
抗体に対する二次抗体又はプロティンＡ（牛丼化学社製
）を加え、これに予め結合させである放射標識又は容易
に活性測定可能な酵素を指標として測定するもので条り
、必要に応じ定量も可能である。

本発明では糖ペプチドの調製１．被検細胞としてヒト腸
ガン株化細胞（Ｌ８１８０．５Ｗ１１１６゜ＨＯＴ　−
８など）を用いたが、前述の発明で使用した腹水肝ガン
ＡＨ６６などの他のガン細胞によっても同様な結果が得
られておシ、この方法は当然他のいかなる動植物細胞、
微生物細胞にも適用し得るものである。糖ペプチドはガ
ン細胞以外の例えば卵白アルブミンなどからも調製可能
であシ、これらを吸着したプレートによっても種々の糖
鎖に対する抗体を検出及びカ１検定することが可能であ
る。

本発明で用いたヒト腸ガン株化細胞ＬＳ１８０（ＡＴＯ
ＯＣＬ−１８７）　、８Ｗ　１１１６　（ＡＴＣＩＣ０
ｃＬ２３３）、ＨＯＴ−８（）ＴＯＯＯＯＬ　２４４　
）などはアメリカン　タイブ　カルチャー　コレクショ
ン（ＡＴＣ！Ｏ）よシ導入した。これらの細胞の培養条
件はすべてＡＴＯＯの推奨するものであるが、之れらの
株化細胞はクローン化されていないため将来クローン分
布く変化を生ずる可能性が残されており注意を要する。

また、これらの細胞のうち１８１８０は最大の増殖速度
（倍化時間約２０時間）を有し、従来最もよく用いられ
ていた８Ｗ１１１６倍化時間１６３時間）よシ使用が容
易であった。

糖ペプチドの調製はストレプトマイセス・グリセウス（
Ｅｌｔｒａｐｔｏｍｙｃｅｇ　ｇｒｉｓｓｕｓ）よシ分
離した非特異的プロテイナーゼ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓ・
）である科研製薬鯛品のプロナーゼＰ　（Ｐｒｏｎａａ
ｅ　Ｐ）又はこれと同等のタンパク質分解酵素を用いる
が、その分解は可能であるならペプチド鎖が存在しない
程度徹底的な分解を図ることも必要であシ好ましい。

ゲル濾過のためのセファデックスＧ−２５（ファルマシ
ア社製）は通常粒子サイズのもの、＠ファイン”と呼ば
れるもののいずれをも用いることかでき、もちろんこれ
と同等の効果を有する例えば米国バイオランド社のバイ
オ−ゲル？−４又はＰ−６の使用も可能であシ、セファ
デックスＧ−５０についてはパイオーゲルＰ−６又はＰ
−１０も同等に使用できる。カラムのサイズは試料量に
応じて適宜定め、例えば試料量が１０−程であれば１．
５　Ｘ　６０　ｃｍのカラムが適当である。

オルシノール−硫酸反応は糖ペプチドの一般的な糖成分
である中性糖（ガラクトース、マンノースなど）の定量
に用いる簡便な方法であるが、比較的少量の細胞を出発
材料とする場合には培養の際、放射標識をもつ単糖（通
常３Ｈ−又は１４０−グルコサミン）を加えた培地を用
いて糖ペプチドの糖鎖部分を代謝的に標識しておき、カ
ラムからの溶出画分をモニターする方法もある。

セファデックスＧ−５０による分画によって得られる２
つの画分は抗体力価の検定に用いるだけの抗原としては
、それ以上の分画精製は必要ないが、更にハイブリドー
マ製造のための指標とするなら更にセファデックスＧ−
２００又は他の同等のゲルー過効果を有する手段により
精製することが望ましい。ムチン型糖ペプチドに混入し
たムコ多糖体は検出用プレートを製造するためには何ら
の支障もなかった。また、検出用プレートにはポリ塩化
ビニル製ミクロタイタープレート〔例えばコースタ−２
５９５（米国コースタ−社製）〕の使用が便利である。

ムチン型糖ペプチドのプレートへの吸着のためにはグル
タルアルデヒドとポリリジン（シグマ社製Ｐ１２７Ｋ　
　平均分子量９Ｑ、０００）のごとき吸着性が高くアミ
ン基を有する化合物である塩基性ポリペプチドあるいは
類似の合成ポリマーの存在が必須である。これらの糖ペ
プチドのアミノ基とポリリジンのアミノ基の間にグルタ
ルアルデヒドがシッフ塩基形成による架橋を形成するも
のと推定され、この結合は１ｉａＢＩＩＩ４等による還
元によってより安定な結合に変更できるが中性付近の操
作においては特に還元安定の必要はなかった。

血清型糖ペプチドのプレートへの吸着は糖ペプチドに脂
溶性を持たせることが必要であ〕、そのためＫはパルミ
チン酸、ステアリン酸、オレイン酸のごとき高級脂肪酸
を結合させる方法が最も簡便である。

本発明になる糖鎖特異的抗体検出用プレートによシ、血
清抗体価がタンパク質を抗原とした場合のような顕著な
レベルに到達していないマウスの抗体産生細胞からのハ
イブリドーマの製造も一般的な方法に準拠して製造する
ことができた。すなわち前記したように、該抗体産生細
胞を含有する細胞とミエローマ細胞とを融合させ、その
後に、前記アッセイプレートラ用いて、ハイブリドーマ
から抗体産生細胞を選別して、単クローン抗体を産生ず
るハイブリドーマ製造得する。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、
本発明はこれに限定されない。

実施例１ （糖ペプチドの調製） ヒト腸ガン株化細胞ＬＥ１１８０　（ＡＴＯＯ保管番号
ｃｂ−１ａ７）を１０％子牛脂児血清を含むダルベツコ
の培地で培養し、約７日後に収獲した。

収獲した細胞はリン酸緩衝食塩水（以下ＰＢ８と略記す
る）（食塩１５７ｍＭ１塩化カリウム２．７ｍＭ、リン
酸−水素ナトリウムａ１ｍＭ、リン酸二水素カリウム１
．５ｍＭ、塩化カルシウムｔｏｍＭ１塩化マグネシウム
（１５ｍＭ）で繰返し洗浄したのち、１％トライトン！
−１００（ローム　アンド　ハース社製）を含むＰＢＳ
を加え水冷下Ｋかくはんし、遠心分離によシ上清を得、
この上清を透析ののち凍結乾燥した。これをクロロホル
ム／メタノール（２：１）で脱脂し、α０１Ｍの酢酸カ
ルシウムを含む酢酸緩衝液に懸濁して、プロナーゼＰ（
斜伏製薬社製）を乾燥体に対し１１５０を加え少量のト
ルエンを加えてから３７℃で３日間放置し充分なタンパ
ク質分解を行った。はぼ透明となった可溶化細胞消化液
に等容の１０％トリクロロ酢酸水溶液を加えかくはんの
のち、放置して生成する不溶物を遠心分離し、得られた
上清に等容のエーテルを加えよく混和ののち遠心分離し
上清を除いた。この下層（水層）Ｋ更にエーテルを加え
ての遠心分離操作を３回繰返し、水層が約ｐＨ５になっ
たことを確かめたのち予め（１５Ｍピリジン−酢酸緩衝
ｉ［（ｐＢ＆ｏ）で平衡化したセファデック撫Ｇ−２５
を充てんしたカラム（１，５Ｘ　６０　ｃｍ　）　Ｋ注
入し、同じ緩衝液によシ展開して流出液をフラクション
コレクターに、よシ採取し、オルシノール−硫酸による
陽性の画分を集め凍結乾燥した。

得られた乾燥粉末はＣＬ５Ｍピリジン−酢酸緩衝１（ｐ
ｌ！！ｈｏ）に溶解ののちセファデックスＧ−５０を用
いて同様にゲル濾過し、フラクションコレクターで５ｍ
ずつの画分に分けた（第１図）。

この分画によりてＧ−５０を素通シした画分（Ｇ−５０
−１）と遅れて溶出された画分（Ｇ−５０−１）が得ら
れ、前者には通常ムチン型（０−グリコシド型）糖タン
パク質由来の糖ペプチド、後者は血清型（Ｎ−グリコシ
ド型）糖タンパク質由来の糖ペプチドが含まれる。すな
わち第１図は、上記のことを、フラクション番号（横軸
）と（１４０）グルコサミン放射活性（ｄｐｍｘ　１０
−”／２０μｔ１縦軸）との関係で示したグラフである
。

フラクション番号２０〜２９までの画分を集め凍結乾燥
によシ溶媒を除きセファデックスＧ−２００を用い前の
操作と同様に処理して事実上血清型糖ペプチドを含まな
いムチン型糖ペプチドを得た。

（ムチン型糖ペプチドのプレートへの吸着）α９％食塩
及びα０２％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ、０．２
５％グルタルアルデヒドＰＢ８溶液、ＦＢ８１ｄ当シα
２５■のポリリジン（シグマ社製Ｐ１２７４　平均分子
量９Ｇ、０００）を含む溶液を用意したのち、ムチン型
糖ペプチド１〜を水に溶解し１−溶液とした。ムチン型
糖ペプチド溶液１００ｐｔ、　ＰＢＳ１．９−、グルタ
ルアルデヒド溶液３３μｔを混じ、ポリ塩化ビニル製９
６ウエルのミクロタイタープレートの１ワエル当シ、こ
の混合液を２０７１１分注し、室温で約１時間放置した
。次いで先に調製したポリリジン溶液を上記プレートの
１ウェル当、９１゜μｌずつ注入し、プレートを適宜振
とうしてウェル内容液を素早く混合したのち４℃で２日
間放置した（ｅ−ｓｏ−１プレート）。この方法によシ
糖ペプチドの約５０％がプレートに吸着した。

（血清型糖ペプチドのプレートへの吸着）血清型糖ペプ
チド２．５■を５ｏｐｔの水に溶解し、これに２００ｐ
／のピリジンを加え、次いでパルミチン酸無水物９．９
１５ｍｇのピリジン１−溶液を加えてかくはんし３７℃
で６時間反応させた。反応液をロータリーエバポレータ
ーで乾固し、エーテルで洗浄ののち再び乾固してバルミ
トイル化糖ペプチド（以下、ｐａｌ−ＧＰと略記する）
の乾燥物を得た。糖ペプチドとして２．５９相当のｐａ
ｌ−ＧＰを２．０４−の９８％ピリジンに溶解し、水１
．８５７−を加えたのち前記ミクロタイタ−プレートに
１ウエル当＃）２０μｌを分注シた。プレートはデシケ
ータ−中五酸化リンの存在下で乾固したのち、１％牛血
清アルブミン（１％ＢＡＡ　）を含むＰＢＥｉ１５０μ
ｌで３回洗浄し付着しなかった糖ペプチドを除去した。

そののちプレートを乾固した（Ｇ−５０−１７’レート
）。この方法によシ糖ペプチドの約１０％がプレートに
吸着した。

（糖鎖特異的抗体の検出及び力価検定）Ｌ８−１８０細
胞１Ｇ’個をＢＡＩＪＢｌｏ　　マウスの腹腔内に移植
し、２か刃径に採血して血清を調製ののち、α１％Ｂ８
ム、（ＬＯ２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＥＩ溶液で
希釈して、Ｇ−５０−■プレートにその２０μｌを加え
４℃で一夜放置した。１％Ｂ８ムを含むＰＢＥＩ溶液で
洗浄したプレートに５０μｌのＸ’ＢＢに溶解した膓工
（牛丼化学社製）を用いて調製した１０万ａｐｍの１鵡
ニープロテインＡを加え２時間室温に放置し、ＰＢＥ１
１５０μｌで洗浄して洗浄液の放射活性が消失したのち
プレートのカウントを測定した（第２図）。

Ｇ−５０−１１プレートについても同一の操作ヲ行いプ
レートのカウントを測定した（第３図）。

すなわち、第２図及び第３図は、各プレートを用いて検
定した結果を、血清希釈倍率（横軸）と（−１）プロテ
インム放射活性（ｏｐｍｘ　１ｏ−／ウェル、縦軸）の
関係で示したグラフであシ、黒丸印が免疫マウス血清、
白丸印が非免疫（正常）マウス血清の場合である。

Ｇ−５０−１，Ｇ−５０−１で行った結果よシ、いずれ
のプレートを用いても非免疫血清に比べて免疫血清では
共に著しい抗体価の上昇が見られ、２５６〜５１２倍希
釈においても力価はなお有意であった。この血清抗体が
糖ペプチドに特異的であることは１％Ｂ８ムを用いてＢ
Ｓムを吸着させたプレートでは事実止金ぐｌｘ−プロテ
ィンＡの結合が見られなかったこと、付着量とほぼ同量
の糖ペプチドを加えることによってＩニブロチインＡの
結合が約５０％阻害されたことくよって明らかであった
。また、Ｇ−５０−Ｉプレートで検出された抗体のプレ
ートへの結合はプレートを予めノイラミニダーゼで処理
することによって有意に抑制され、本発明によシ作製さ
れたクローンＭＬ８１０２の産生ずる抗体のＧ−５０−
１への結合もノイラミニダーゼ処理により完全に抑制さ
れることが確認された。

（糖鎖特異的抗体産生クローンの製造）ヒト腸ガン株化
細胞１８１８０１０’個を約１０日間隔でＢＡＬＢ１０
マウス腹腔に７〜８回注射し、それから２０〜３０日（
ブースター期間）の後、同細胞１ｃＰ個を静注した３日
後に肺臓を摘出し、得られた肺臓由来リンパ細胞１．５
Ｘ１０・個をミエローマ細胞ＢＰ　２１０１．８　Ｘ　
１０’個とポリエチレングリコール（牛丼化学社製）の
存在下に融合させてハイブリドーマを得、このノ１イブ
リドーマを含むＨＹ培地をウェル当り３０〜１００個の
細胞数になるように９６ウ工ルプレート７枚に分注した
。各プレートは３７℃、５％二酸化炭素、条件下で培養
され、翌日ＨＡＴ　　。

培地を加え培養１２日目に上清３０μｌをとジアジ化ナ
トリウムを含むＰＢ８で希釈してＧ−５０−１及びａ−
５０−１２１／−トｃ分注ｔ、、ＩＷｚ−プロティンＡ
の結合値を測定するととくよυＧ−５０−１．Ｇ−５０
−１１のプレートのいずれか又は両者に結合する抗体を
産生ずるハイブリドーマ１２種を選択し、更に２回のク
ローニングによって安定な抗体産生クローンの５種（Ｍ
Ｌｇ　１０２、ＭＬＥＩ　１０５、ＭＬｇ　１０４、Ｍ
ＬＢ１０５、ＭＬＥｉ１’０６）を得ることができた。

〔発明の効果〕

以上詳細に説明したように、本発明の検出及び力価検定
°用試薬により、例えば腸ガンの判定に有効な特異的抗
体を検出及び力価検定することが可能となった。そして
、そのような抗体産生細胞を常法によシハイプリドーマ
化して、単クローン抗体を取得することができた。

したがって本発明はガン診断上、顕著な効果を奏するも
のである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明で使用する糖タンパク質糖鎖の分離結果
をフラクション番号と（１４Ｑ）グルコサミン放射活性
との関係で示したグラフ、第２図及び第３図はいずれも
本発明によるアツセイプレートを用いて糖鎖特異的抗体
を検定した結果を血清希釈倍率と（１１１ｚ　）プロテ
ィンＡ放射活性との関係で示したグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、複合糖質、それを含む細胞又はそれに由来する標品
   における糖鎖に特異的な抗体の検出が可能なムチン型又
   は血清型の糖ペプチドを含有してなることを特徴とする
   糖鎖に特異的な抗体の検出及び力価検定用試薬。 ２、糖鎖に特異的な抗体の検出が可能なムチン型又は血
   清型の糖ペプチドを吸着させたアツセイプレートを用い
   ることを特徴とする試料中の糖鎖に特異的な抗体の検出
   及び力価検定方法。 ３、糖鎖に特異的な抗体産生細胞を含有する細胞とミエ
   ローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを形成させ、
   次いで糖鎖に特異的な抗体の検出が可能なムチン型又は
   血清型の糖ペプチドを吸着させたアツセイプレートを用
   いて抗体産生細胞を選択してなることを特徴とする糖鎖
   に特異的な単クローン抗体を産生するハイブリドーマ。