JPS61116660A - 腫瘍に関連した特殊な抗原シアロシルラクトテトラオースに特異的な抗体 - Google Patents
腫瘍に関連した特殊な抗原シアロシルラクトテトラオースに特異的な抗体Info
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- JPS61116660A JPS61116660A JP60186757A JP18675785A JPS61116660A JP S61116660 A JPS61116660 A JP S61116660A JP 60186757 A JP60186757 A JP 60186757A JP 18675785 A JP18675785 A JP 18675785A JP S61116660 A JPS61116660 A JP S61116660A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
この発明は特殊な腫瘍関連の炭水化物性の抗原、シアロ
シμラクトテトフォースエψＮｅｕＡｃＬｃＯｓｅ４（
ＩＵＰＡＣ−４ＵＢ リピッド ドキュメント（Ｉ、
ｉｐｉｄＤｏｃｕｍｅｎｔ）、１９７７）をヒトの腫瘍
の診断および治療処置に用いることに関する。
シμラクトテトフォースエψＮｅｕＡｃＬｃＯｓｅ４（
ＩＵＰＡＣ−４ＵＢ リピッド ドキュメント（Ｉ、
ｉｐｉｄＤｏｃｕｍｅｎｔ）、１９７７）をヒトの腫瘍
の診断および治療処置に用いることに関する。
組繊細胞の腫瘍細胞への変換は細胞表面における炭水化
物構造の変化に関連することが確認されている。多くの
炭水化物構造は抗原として働き、腫瘍修飾構造はいわゆ
る腫瘍関連抗原の形体を代表するものである。細胞表面
炭水化物構造はリビツド部分と結合している、この場合
はグリコリピッドと称される、あるいはタンパク（ベプ
タイド）と結合している、この場合はグリコプロティン
（グリコペプチド）と称される。これら２つの形体につ
いての一般名はグリココンジュゲートである。
物構造の変化に関連することが確認されている。多くの
炭水化物構造は抗原として働き、腫瘍修飾構造はいわゆ
る腫瘍関連抗原の形体を代表するものである。細胞表面
炭水化物構造はリビツド部分と結合している、この場合
はグリコリピッドと称される、あるいはタンパク（ベプ
タイド）と結合している、この場合はグリコプロティン
（グリコペプチド）と称される。これら２つの形体につ
いての一般名はグリココンジュゲートである。
腫瘍関連のグリココンジュゲート抗原はかつてはヒトの
腫瘍病との関係において知られていた。黒色腫瘍におい
て、炭化水素構造であるシアロシ／ｖ２／ングリオテト
フォースおよびンアロシμヲクトースはリピツド部分に
結合しているものとして特定されてきた。二つのガン関
連抗ＧＩＣＡ（ｇａｓｔｒｏ４ｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃ
ａｎｃｅｒ ５ｎｔｉｇｅｎ）は特に胃腸ガンに見出さ
れているが、一方、第三の抗原ＣＡ−５０は一般的なガ
ン抗原と考えられている。これらの抗原はすべて腫瘍細
胞表面から分泌泌され血清中に見出される。
腫瘍病との関係において知られていた。黒色腫瘍におい
て、炭化水素構造であるシアロシ／ｖ２／ングリオテト
フォースおよびンアロシμヲクトースはリピツド部分に
結合しているものとして特定されてきた。二つのガン関
連抗ＧＩＣＡ（ｇａｓｔｒｏ４ｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃ
ａｎｃｅｒ ５ｎｔｉｇｅｎ）は特に胃腸ガンに見出さ
れているが、一方、第三の抗原ＣＡ−５０は一般的なガ
ン抗原と考えられている。これらの抗原はすべて腫瘍細
胞表面から分泌泌され血清中に見出される。
本発明は、多くの型のガンの患者は、初期の腫瘍および
その転移において、正常組織において発現されないグリ
ココンジュゲーＦを発現するという驚くべき発見に基づ
くものでおる。
その転移において、正常組織において発現されないグリ
ココンジュゲーＦを発現するという驚くべき発見に基づ
くものでおる。
本発明によれば、グリココンジュゲート抗原はグリコリ
ピッド抗原として分離された。これはガングリオシドで
あって完全な化学構造としてＮｅｕＡｃα−３Ｇａｌβ
−３Ｇ１ｃＮＡｃβ−５Ｇａｌβ−４Ｇｌｃ−Ｃｅｒ
あるいはＮｅｕＡｃ ＬｃＯｓｅ４ Ｃｅｒ（ＩＵＰ
ＡＣ−Ｉ’ＵＢ リビツド ドキュメント（Ｌｉｐｉｄ
Ｄｏｃｕｍｅｎｔ）、１９７７）を有している。本ガ
ングリオクトの基本構造を有するがシアル酸を有しない
グリコリピッドはヒトの胎便には見出されるが、広範な
研究を行っても、本ガングリオシドをヒトの成人の組織
から見出すことは不可能であった。しかしながら、この
ガングリオシドは種々の器管の多くのガンにおけるリビ
ツド抽出物に見出される。本発明の範囲において、体液
および組織中の当該抗原の検出のための鋭敏な方法が苦
心の末でき上ったのである。かかる方法は、非常な低濃
度で存在する抗原を特異なモノクロナール抗体に結合さ
せることによって定量できるという事実に基づいている
。いくつかのモノクロナール抗体カマウスをヒトの結腸
ガンセｆｉ／１１フインテ免疫することによシ調製され
た。これらのモノクロナール抗体は、シアロシ！ラクト
テトフォースがモノシアロガングリオシドとして存在す
るとき、すなわち、シアル酸を特殊な成分として含有す
る、灰化水素含有リピツドとして存在すルトキ、そのシ
アロシμラクＦテトフォースを検出するのであり、かつ
、同一の炭化水素構造がタンパクに結合している場合、
それらすべての抗原を検出するのである。シアル酸は抗
原活性に必要なものでちる。というのは抗体をシアリダ
ーゼ酵素で加水分解すると抗原がモノクロナール抗体と
結合する活性が完全に除かれるからである。このモノク
ロナール抗体はまた、シアロシｐラクトテトフォースに
加え、その分子に結合したフコース部分を含有する抗原
をも検出する。
ピッド抗原として分離された。これはガングリオシドで
あって完全な化学構造としてＮｅｕＡｃα−３Ｇａｌβ
−３Ｇ１ｃＮＡｃβ−５Ｇａｌβ−４Ｇｌｃ−Ｃｅｒ
あるいはＮｅｕＡｃ ＬｃＯｓｅ４ Ｃｅｒ（ＩＵＰ
ＡＣ−Ｉ’ＵＢ リビツド ドキュメント（Ｌｉｐｉｄ
Ｄｏｃｕｍｅｎｔ）、１９７７）を有している。本ガ
ングリオクトの基本構造を有するがシアル酸を有しない
グリコリピッドはヒトの胎便には見出されるが、広範な
研究を行っても、本ガングリオシドをヒトの成人の組織
から見出すことは不可能であった。しかしながら、この
ガングリオシドは種々の器管の多くのガンにおけるリビ
ツド抽出物に見出される。本発明の範囲において、体液
および組織中の当該抗原の検出のための鋭敏な方法が苦
心の末でき上ったのである。かかる方法は、非常な低濃
度で存在する抗原を特異なモノクロナール抗体に結合さ
せることによって定量できるという事実に基づいている
。いくつかのモノクロナール抗体カマウスをヒトの結腸
ガンセｆｉ／１１フインテ免疫することによシ調製され
た。これらのモノクロナール抗体は、シアロシ！ラクト
テトフォースがモノシアロガングリオシドとして存在す
るとき、すなわち、シアル酸を特殊な成分として含有す
る、灰化水素含有リピツドとして存在すルトキ、そのシ
アロシμラクＦテトフォースを検出するのであり、かつ
、同一の炭化水素構造がタンパクに結合している場合、
それらすべての抗原を検出するのである。シアル酸は抗
原活性に必要なものでちる。というのは抗体をシアリダ
ーゼ酵素で加水分解すると抗原がモノクロナール抗体と
結合する活性が完全に除かれるからである。このモノク
ロナール抗体はまた、シアロシｐラクトテトフォースに
加え、その分子に結合したフコース部分を含有する抗原
をも検出する。
本発明の範囲内で、腫瘍関連グリコリピッド、ンアロシ
μラクトテトフオシμセフミドをヒトの腸瘍組織から純
粋な形で分離する方法が完成された。特別の方法でえら
れた精製されたガングリオシドは増加した免疫活性を有
し、モノクロナール抗体の製造に使用される。本発明の
範囲内で、組織、組織部分、体液中の当該抗原の特定、
定量に用いられる方法が開発された。診断目的のための
これらの方法は、本抗原は純粋なガングリオシド抗原、
クアロシμラクトテトフオシ！セラミドに対して生産さ
れた特異なモノクロナール抗体に結合させることによっ
て検出できるという事実に基いている。以下の例はガン
グリオシドが測定できる種々の資料を示すものである。
μラクトテトフオシμセフミドをヒトの腸瘍組織から純
粋な形で分離する方法が完成された。特別の方法でえら
れた精製されたガングリオシドは増加した免疫活性を有
し、モノクロナール抗体の製造に使用される。本発明の
範囲内で、組織、組織部分、体液中の当該抗原の特定、
定量に用いられる方法が開発された。診断目的のための
これらの方法は、本抗原は純粋なガングリオシド抗原、
クアロシμラクトテトフオシ！セラミドに対して生産さ
れた特異なモノクロナール抗体に結合させることによっ
て検出できるという事実に基いている。以下の例はガン
グリオシドが測定できる種々の資料を示すものである。
すなわち、肺、肝臓、腸管、胃または膵臓の腫瘍組織の
手術あるいはオードブシー材料、および種々の器管の腫
瘍組織のバイオデｙ−１胃あるいは呼吸管の吸出し、痰
、または胸膜腔の穿刺によって見られる細胞、ならびに
、血液、血漿、血清、リンパ液、脳を髄液、尿、唾液ｆ
等である。
手術あるいはオードブシー材料、および種々の器管の腫
瘍組織のバイオデｙ−１胃あるいは呼吸管の吸出し、痰
、または胸膜腔の穿刺によって見られる細胞、ならびに
、血液、血漿、血清、リンパ液、脳を髄液、尿、唾液ｆ
等である。
本発明で用いられる抗原はシアロシルラクトテトラオー
スと称され、次の構造を有する。
スと称され、次の構造を有する。
ＮｅｕＡｃα−５Ｇａｌβ−３Ｇ１ｃｍＮＡｃβ−３Ｇ
ａｌβ−４Ｇ１ｃあるいはＩＶ ”ＮｅｕＡｃＬｃｏｓ
ｅ 、＠１１７ＰＡＣ−ＩＵＢ リビツドドキュメン
ト （Ｌｆｐｉｄ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ） 、 １
９７７）、α −４結合のＮ−アセチμグｐコサミン分
子にフコースを結合させて修飾した抗原はすべて本発明
の範囲に属するものである。
ａｌβ−４Ｇ１ｃあるいはＩＶ ”ＮｅｕＡｃＬｃｏｓ
ｅ 、＠１１７ＰＡＣ−ＩＵＢ リビツドドキュメン
ト （Ｌｆｐｉｄ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ） 、 １
９７７）、α −４結合のＮ−アセチμグｐコサミン分
子にフコースを結合させて修飾した抗原はすべて本発明
の範囲に属するものである。
モノクロナール抗体を特定するのに用いられた抗原はリ
ビツド基に結合した抗原からつくられたが、すべての他
の化合物への結合を含むものである。本発明で使用され
る抗原は患者のオードブシーによって見られる腫瘍組織
から分離することができる。
ビツド基に結合した抗原からつくられたが、すべての他
の化合物への結合を含むものである。本発明で使用され
る抗原は患者のオードブシーによって見られる腫瘍組織
から分離することができる。
特に良好な資料はある形状の肺ガンである。
ガン組織中の抗原濃度は一般に低く、抗原の分離は面倒
である。我々は腫瘍抗原の分離のためのもう一つの生物
学的な出発材料を見出した。
である。我々は腫瘍抗原の分離のためのもう一つの生物
学的な出発材料を見出した。
セμ・フィンＣｏ１ｏ ２０５ はいわゆるヌード・マ
ウス（一般名ｎｕ／ｎｕ ）に移植すると腫瘍となる。
ウス（一般名ｎｕ／ｎｕ ）に移植すると腫瘍となる。
この腫瘍は抗原を高濃度で含有し、その抗原にはフコー
スが結合している。分離したガングリオシドをα−ラフ
コクダーゼ酵素処理することくよシ、フコース部分は分
離し、グリコリピッド抗原は純粋な形で見られる。
スが結合している。分離したガングリオシドをα−ラフ
コクダーゼ酵素処理することくよシ、フコース部分は分
離し、グリコリピッド抗原は純粋な形で見られる。
本発明は、Ｃｏ１ｏ ２０５ ＮＡ胞によっていわゆる
ヌード・マウスに誘導した腫瘍またはヒトの腫瘍からク
ロマトグラフ法によって腫瘍抗原を誘導することに関す
る。本発明はまた、ある種のバクテリアの膜に吸着させ
た純粋な抗原に対するモノクロナール抗体の製造に関す
る。本発明は、また、化学物質シアロシμラクトテトフ
ォース、この物質の誘導体、これらに対するすべての型
の抗体を種々の器管の種々のガンの診断に用いること、
および患者のガンの治療に用いることを含むものである
。
ヌード・マウスに誘導した腫瘍またはヒトの腫瘍からク
ロマトグラフ法によって腫瘍抗原を誘導することに関す
る。本発明はまた、ある種のバクテリアの膜に吸着させ
た純粋な抗原に対するモノクロナール抗体の製造に関す
る。本発明は、また、化学物質シアロシμラクトテトフ
ォース、この物質の誘導体、これらに対するすべての型
の抗体を種々の器管の種々のガンの診断に用いること、
および患者のガンの治療に用いることを含むものである
。
実施例１
ンアロＶ＃ラクトテトフォース抗体の、いわゆるヌード
・マウスおよびヒトのガン組織からガングリオシドの形
状での調製 Ｑ、１ｍｊの（Ｌ８５％Ｎａｃｌ、 １／１５燐酸バッ
ファーｐＨ７，２に懸濁した１００万個の生きたＣ０Ｉ
Ｏ２０５細胞を各マウス４個所に皮下移植した。生育し
た腫瘍の大きさにより、４〜５週間後、動物を殺し、腫
瘍を切り取り均一化した。
・マウスおよびヒトのガン組織からガングリオシドの形
状での調製 Ｑ、１ｍｊの（Ｌ８５％Ｎａｃｌ、 １／１５燐酸バッ
ファーｐＨ７，２に懸濁した１００万個の生きたＣ０Ｉ
Ｏ２０５細胞を各マウス４個所に皮下移植した。生育し
た腫瘍の大きさにより、４〜５週間後、動物を殺し、腫
瘍を切り取り均一化した。
組織からのガングリオシドの抽出
組織材料１容量に対し３容量の水を加えたのち、組織を
均り化した。腫瘍組織をナイフ・ホモゲナイザーで１５
１１０回転／分、３分均一化したのち、１ｏ容量のメタ
ノ−μを攪拌しつつ加え、次いで５容量のクロロホルム
を加えた。
均り化した。腫瘍組織をナイフ・ホモゲナイザーで１５
１１０回転／分、３分均一化したのち、１ｏ容量のメタ
ノ−μを攪拌しつつ加え、次いで５容量のクロロホルム
を加えた。
遠心分離で透明な抽出物を分離した。組織容量４容量の
水を加え、組織は再度均一化し九。そして、１０容量の
メタノ−μおよび５容最のクロロホルムを攪拌しながら
加えた。透明な抽出物を遠心分離で分離した。抽出物を
合し、水を加えて最終的なりロロホμムーメタノーμ−
水の比が４：８：５．６（容量）になるようにした。
水を加え、組織は再度均一化し九。そして、１０容量の
メタノ−μおよび５容最のクロロホルムを攪拌しながら
加えた。透明な抽出物を遠心分離で分離した。抽出物を
合し、水を加えて最終的なりロロホμムーメタノーμ−
水の比が４：８：５．６（容量）になるようにした。
分液漏斗中で混合したのち、二つの上層を分離した。下
層に等容量のメタノ−μを加え、混合に際しα７容量の
水を加え念。注意深く混合したのち、分液漏斗を二つの
明確な液層がえられる°まで放置した。上層を回収し、
第１の上層と合し九。合併した上層に泡立ちを防ぐため
にイソブタノ−μを加え、それから、抽出物は５０℃の
水浴中口−タリーエバポレーターで濃ａした。
層に等容量のメタノ−μを加え、混合に際しα７容量の
水を加え念。注意深く混合したのち、分液漏斗を二つの
明確な液層がえられる°まで放置した。上層を回収し、
第１の上層と合し九。合併した上層に泡立ちを防ぐため
にイソブタノ−μを加え、それから、抽出物は５０℃の
水浴中口−タリーエバポレーターで濃ａした。
残査にもとの組織の容量に対し１５容量のメタノールお
よびα５容量のｔ ＯＭ苛性カリを加え室温で一夜放置
した。それから、烈しく攪拌し゛ながらｔＯＭの塩酸を
加えてｐＨ１３とし、水に対し透析を４８時間行った。
よびα５容量のｔ ＯＭ苛性カリを加え室温で一夜放置
した。それから、烈しく攪拌し゛ながらｔＯＭの塩酸を
加えてｐＨ１３とし、水に対し透析を４８時間行った。
ヌード・マウスのｍ瘍について行ったのと同様の抽出を
ヒトの腫瘍組織について行った。
ヒトの腫瘍組織について行った。
イオン交換クロマトグラフィーによるモノシアロガング
リオシド部分の分離 透析した粗製のガングリオシド抽出物を蒸発させ、元の
組織１ｇａす１ｄのクロロホルム−メタノ−〜−水（６
０： ５０ ： ４．５ ）混合物に再溶解した。内径
２０置のカラムに、スフエロｖμ−ＤＥＡＲ−デキスト
ラン（インステイチュート・メリエオー、−リオ、フラ
ンス）を同一の溶剤中酢酸塩の形で一組織各５ｇに対し
少くとも１−のイオレ交換体−充填した。純粋なガング
リオシド抽出物をカラムにゆっく夛と加え、それからカ
ラムは床容量の１０倍容量のクロロホμムーメタノー〃
−水（６０：３０ ：４．５）で溶出した。モノシア
ロガングリオシド分画は１０床容量のＣＬＯ２Ｍ酢酸カ
リメタノ−！溶液で溶出した。モノＶアロガングリオシ
ド分画は蒸発させ、蒸留水に対し透析して脱塩した。
リオシド部分の分離 透析した粗製のガングリオシド抽出物を蒸発させ、元の
組織１ｇａす１ｄのクロロホルム−メタノ−〜−水（６
０： ５０ ： ４．５ ）混合物に再溶解した。内径
２０置のカラムに、スフエロｖμ−ＤＥＡＲ−デキスト
ラン（インステイチュート・メリエオー、−リオ、フラ
ンス）を同一の溶剤中酢酸塩の形で一組織各５ｇに対し
少くとも１−のイオレ交換体−充填した。純粋なガング
リオシド抽出物をカラムにゆっく夛と加え、それからカ
ラムは床容量の１０倍容量のクロロホμムーメタノー〃
−水（６０：３０ ：４．５）で溶出した。モノシア
ロガングリオシド分画は１０床容量のＣＬＯ２Ｍ酢酸カ
リメタノ−！溶液で溶出した。モノＶアロガングリオシ
ド分画は蒸発させ、蒸留水に対し透析して脱塩した。
シリカゲμクロマトグヲフイーによるＶアロ！／／Ｌ／
ヲクトテトフォシμセラミドの精製クロマトグラフィー
には元の組織１ｇに対し１ｇのラクトビーズ（フトロン
ラクトビーズ、東京、日本）を用いた。ただし、少く
とも２５Ｉｉｉｉ用いた。ゲルをクロロホμムーメタノ
−／Ｌ／（容量比４：１）中でスラリーとし、半融ガラ
スフィルターを有し、ゲルの量に応じ直径１５〜２０■
のガフスカラムに注入した。ガングリｙＦＶＹ分画は１
０−のクロロホルム−メタノ−μ−水（６５：２５：４
容量）に溶解し、カラムに入れた。最初、ゲｌｖｇ（重
量／容量）当たシ１５−のクロロホルム−メタノ−μ−
水（６５：２５：４）で溶出し、１分画として回収した
。溶出は、それから、クロロホμムーメタノー／Ｉ／−
２，５Ｍ７：／モニア（６０： ４０ ： ９容量）で
続け、５−の分画を分画コレクターで採取した。溶出は
、各分画の１０μｔを、カラムクロマトグラフィーに用
いたのと同じ溶剤、−ｔなりち、クロロホｐムーメ／／
−／ｌ／−λ５Ｍアンモニア（６０：４０：９）を用い
た高処理薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）”ｔ’
七二ターした。そして、ガングリオシドはＶゾμシノー
μ試薬で観察した（スヴエンナーホμムＬ１ビオキミカ
、ビオフィジカｅアクタ２４．６０４−６１４．１９５
７）。シアロシμラクトテトラオシルセラミドを含む分
画は合併し、蒸発させて乾燥した。
ヲクトテトフォシμセラミドの精製クロマトグラフィー
には元の組織１ｇに対し１ｇのラクトビーズ（フトロン
ラクトビーズ、東京、日本）を用いた。ただし、少く
とも２５Ｉｉｉｉ用いた。ゲルをクロロホμムーメタノ
−／Ｌ／（容量比４：１）中でスラリーとし、半融ガラ
スフィルターを有し、ゲルの量に応じ直径１５〜２０■
のガフスカラムに注入した。ガングリｙＦＶＹ分画は１
０−のクロロホルム−メタノ−μ−水（６５：２５：４
容量）に溶解し、カラムに入れた。最初、ゲｌｖｇ（重
量／容量）当たシ１５−のクロロホルム−メタノ−μ−
水（６５：２５：４）で溶出し、１分画として回収した
。溶出は、それから、クロロホμムーメタノー／Ｉ／−
２，５Ｍ７：／モニア（６０： ４０ ： ９容量）で
続け、５−の分画を分画コレクターで採取した。溶出は
、各分画の１０μｔを、カラムクロマトグラフィーに用
いたのと同じ溶剤、−ｔなりち、クロロホｐムーメ／／
−／ｌ／−λ５Ｍアンモニア（６０：４０：９）を用い
た高処理薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）”ｔ’
七二ターした。そして、ガングリオシドはＶゾμシノー
μ試薬で観察した（スヴエンナーホμムＬ１ビオキミカ
、ビオフィジカｅアクタ２４．６０４−６１４．１９５
７）。シアロシμラクトテトラオシルセラミドを含む分
画は合併し、蒸発させて乾燥した。
シアロシ〃ラクトテトッオシルセラミドの最終精製は調
製用薄層クロマトグラフィーによって達成された。ガン
グリオシド（５μ七ｐ〕は薄層板（２０Ｘ２０α、厚さ
Ｑ、２５惰、メルクＡＧ、ダμムシュタット、西ドイツ
）に塗布し、クロロホルム−メタノ−／Ｉ／−２，５Ｍ
アンキニアで２１℃で１時間展開した。クロマトグラフ
ィーが完了したのち、０．０１％プロムチモーμブルー
水溶液を板にスプレーし、シアロシμフクトテトラオシ
μセフミドのバンドを切取った。
製用薄層クロマトグラフィーによって達成された。ガン
グリオシド（５μ七ｐ〕は薄層板（２０Ｘ２０α、厚さ
Ｑ、２５惰、メルクＡＧ、ダμムシュタット、西ドイツ
）に塗布し、クロロホルム−メタノ−／Ｉ／−２，５Ｍ
アンキニアで２１℃で１時間展開した。クロマトグラフ
ィーが完了したのち、０．０１％プロムチモーμブルー
水溶液を板にスプレーし、シアロシμフクトテトラオシ
μセフミドのバンドを切取った。
ガングリオシドをゲｐからクロロホルム−メタノール−
水（３０：６０ ：２０、容量）で溶出し、ＬＬ１Ｍ水
酸化カリメタノ−ｐ溶液１滴を加え、混合物を乾燥する
まで蒸発させた。ガングリオシドを少量のクロロホμム
ーメタノーμ（２：１、容量）Ｋ溶解し、密栓したチュ
ーブ（テフロンのヌクリューΦキャップのついたクリマ
ックスチューブ）中、暗所、４℃で保存した。
水（３０：６０ ：２０、容量）で溶出し、ＬＬ１Ｍ水
酸化カリメタノ−ｐ溶液１滴を加え、混合物を乾燥する
まで蒸発させた。ガングリオシドを少量のクロロホμム
ーメタノーμ（２：１、容量）Ｋ溶解し、密栓したチュ
ーブ（テフロンのヌクリューΦキャップのついたクリマ
ックスチューブ）中、暗所、４℃で保存した。
実施例２
シアロシμヲクトテトラオース抗原に対するモノクロナ
ール抗体の生産のための精製したシアロシμラクトテト
ラオシμセラミドガングリオシドの利用 ヤング、Ｗ％Ｗ１および共同研究者によって記載された
方法（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１５０．１００８−１０１
９．１９７９）による免疫を行う前に、実施例１の精製
されたシアロシμラクトテトフォシルセラミドガングリ
オシドを酸で洗浄したすｐモネヲミネソタバクテリアに
吸着させた。
ール抗体の生産のための精製したシアロシμラクトテト
ラオシμセラミドガングリオシドの利用 ヤング、Ｗ％Ｗ１および共同研究者によって記載された
方法（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１５０．１００８−１０１
９．１９７９）による免疫を行う前に、実施例１の精製
されたシアロシμラクトテトフォシルセラミドガングリ
オシドを酸で洗浄したすｐモネヲミネソタバクテリアに
吸着させた。
６〜８週令のＢＡＬＢ／Ｃマウスを１００μｔの燐酸バ
ッファー生理食塩水ｐＨ７，４に懸濁した５０置ｇの酸
で洗浄したすμモネラミネソタバクテリアに吸着した５
μｙのガングリオシドで静注で免疫した。２週間後、同
一条件で同一投与量の免疫源で新たな免疫を行った（ブ
ースター投与）。
ッファー生理食塩水ｐＨ７，４に懸濁した５０置ｇの酸
で洗浄したすμモネラミネソタバクテリアに吸着した５
μｙのガングリオシドで静注で免疫した。２週間後、同
一条件で同一投与量の免疫源で新たな免疫を行った（ブ
ースター投与）。
ブースター投与後３日して、牌臓細胞を免疫したマウス
から摘出し、マウス５ｐ２１０ミエローマ細胞と融合さ
せた。生じたハイプリドーマを増殖し、試験し、デュ、
セント、グロス、Ｓ、Ｆ、およびシャイブツガ−によっ
て考案された方法（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍ’￥’ｔｈ
ｏｄｓ、 １〜２１．１９８０）によってクローン化を
行った。各マイクロタイター穴から生育したハイプリド
ーマともども培地を回収し、シアロシルラクトテトラオ
ースに対する抗体を培地が含有しているかどうか検定し
た。検定は次の方法によるＥＬＩＳＡ法で行った。シア
ロシμヲクトテトフオシｐセラミドガングリオシドをメ
タノ−〃に溶解し、５０ｐｍｏｌをポリビニルミクロタ
イタープレートの。
から摘出し、マウス５ｐ２１０ミエローマ細胞と融合さ
せた。生じたハイプリドーマを増殖し、試験し、デュ、
セント、グロス、Ｓ、Ｆ、およびシャイブツガ−によっ
て考案された方法（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍ’￥’ｔｈ
ｏｄｓ、 １〜２１．１９８０）によってクローン化を
行った。各マイクロタイター穴から生育したハイプリド
ーマともども培地を回収し、シアロシルラクトテトラオ
ースに対する抗体を培地が含有しているかどうか検定し
た。検定は次の方法によるＥＬＩＳＡ法で行った。シア
ロシμヲクトテトフオシｐセラミドガングリオシドをメ
タノ−〃に溶解し、５０ｐｍｏｌをポリビニルミクロタ
イタープレートの。
穴に入れた。メタノ−μを蒸発させ、１００μｔのハイ
プリドーマ培地を同容量の０．０１Ｍ燐酸でバッファー
にした食塩水（（Ｌ１４Ｍ）、ｐＨ１５で稀釈したもの
を穴に入れた。培養は１７時間行った。それから、１０
０μｔの、パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合したウサ
ギの抗マウス免疫グロブリンで上記燐酸バッファーで１
７２００ に稀釈し、１％の牛血清アルブミンを加えた
もの、を穴に加えた。４時間培養し、１０Ｇ１ｓｔの酸
素基質（０，１％のオ〃トフエニｐジアミンのクエン酸
バッファーＱ、ｐＨ４，５α３−のＨ２Ｏ２と混合）を
加えたのち４５０ｎｍの吸収をタイターテツクミクロタ
イタースキャンナーで測定した。もし吸収が平均の培養
のプヲンクの吸収を２倍あるいはそれ以上であれば、ハ
イブリッドは陽性とした。陽性のハイブリッドの培地を
集めさらにスクリーニングを行った（下記）。一方、陽
性のハイブリッドは液体窒素で凍結した。シアロシμヲ
クトテトラオＶ／Ｉ／セフミドに対し陽性のハイブリッ
ドの培地はヒトのリンパ球に対し交差反応性について試
験した。ヒトリンパ球（ＨｕＬｙ−Ｃ）はすべて異った
ＡＢＨ−血液グμｍデの５人の提供者からの血液を段階
的に遠心分離して分離し、細胞は合併した。固定化され
た細胞についてＥＬＩＳＡテヌトを行った。ＨｕＬｙ−
Ｃと交差反応する抗体を生産したハイブリッドは以後増
殖させなかった。
プリドーマ培地を同容量の０．０１Ｍ燐酸でバッファー
にした食塩水（（Ｌ１４Ｍ）、ｐＨ１５で稀釈したもの
を穴に入れた。培養は１７時間行った。それから、１０
０μｔの、パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合したウサ
ギの抗マウス免疫グロブリンで上記燐酸バッファーで１
７２００ に稀釈し、１％の牛血清アルブミンを加えた
もの、を穴に加えた。４時間培養し、１０Ｇ１ｓｔの酸
素基質（０，１％のオ〃トフエニｐジアミンのクエン酸
バッファーＱ、ｐＨ４，５α３−のＨ２Ｏ２と混合）を
加えたのち４５０ｎｍの吸収をタイターテツクミクロタ
イタースキャンナーで測定した。もし吸収が平均の培養
のプヲンクの吸収を２倍あるいはそれ以上であれば、ハ
イブリッドは陽性とした。陽性のハイブリッドの培地を
集めさらにスクリーニングを行った（下記）。一方、陽
性のハイブリッドは液体窒素で凍結した。シアロシμヲ
クトテトラオＶ／Ｉ／セフミドに対し陽性のハイブリッ
ドの培地はヒトのリンパ球に対し交差反応性について試
験した。ヒトリンパ球（ＨｕＬｙ−Ｃ）はすべて異った
ＡＢＨ−血液グμｍデの５人の提供者からの血液を段階
的に遠心分離して分離し、細胞は合併した。固定化され
た細胞についてＥＬＩＳＡテヌトを行った。ＨｕＬｙ−
Ｃと交差反応する抗体を生産したハイブリッドは以後増
殖させなかった。
ガングリオシドに陽性でＨｕＬｙ−Ｃに陰性のハイブリ
ッドを限定稀釈でクローン化し増殖させた。
ッドを限定稀釈でクローン化し増殖させた。
各クローンのアイソタイプはアイソタイプ特異性抗マウ
ス免疫グロブリンを用いるマンシニテクニクによって検
定した。
ス免疫グロブリンを用いるマンシニテクニクによって検
定した。
ガングリオシド陽性でＨｕＬｙ−Ｃ陰性のクローンの反
応性は二重抗体固相ラジオイムノアッセイで測定した。
応性は二重抗体固相ラジオイムノアッセイで測定した。
シアロシｐフクトテトラオシｐセラミドガングリオシド
および多数の中性のグリコリヒツトおよび他のガングリ
オシドをメタノ−μに溶解してピペットでマイクロタイ
タープレートの穴に注ぎ、メタノ−ｐを蒸発させた。
および多数の中性のグリコリヒツトおよび他のガングリ
オシドをメタノ−μに溶解してピペットでマイクロタイ
タープレートの穴に注ぎ、メタノ−ｐを蒸発させた。
ンアロシルラクトテトラオシｐセラミドに対するモノク
ロナール抗体と培養し、結合の量を１１２５で標識した
抗マウス免疫グロブリンで検出した。
ロナール抗体と培養し、結合の量を１１２５で標識した
抗マウス免疫グロブリンで検出した。
モノクロナール抗体の特異性はまたガングリオシド抗原
の薄層クロマトグラフィーの免疫染色で測定した。多く
の異った腫瘍組織から分離された全ガングリオシド分画
を、裏にアルミニアの付いた高処理薄層板（ＨＰＴＬＣ
）で分離し、１ｑＩＩの牛血清アルブミンを含むトリス
バッファー食塩水（ｐＨ７，８）で稀釈した陽性ハイプ
リドーマの培地とともに培養した。結合したモノクロナ
ール抗体はＨＩＭで標識した抗マウス免疫グロブリンで
検出した。これはＸ線フィルムに１２〜２４時間露光さ
せた。
の薄層クロマトグラフィーの免疫染色で測定した。多く
の異った腫瘍組織から分離された全ガングリオシド分画
を、裏にアルミニアの付いた高処理薄層板（ＨＰＴＬＣ
）で分離し、１ｑＩＩの牛血清アルブミンを含むトリス
バッファー食塩水（ｐＨ７，８）で稀釈した陽性ハイプ
リドーマの培地とともに培養した。結合したモノクロナ
ール抗体はＨＩＭで標識した抗マウス免疫グロブリンで
検出した。これはＸ線フィルムに１２〜２４時間露光さ
せた。
試験したモノクロナール抗体はすべて中性グリコリピッ
ドに反応しなかった。Ｖアロシ／Ｌ’ヲクトテトフォＶ
ルセヲミツドガングリオシドに対し陽性であった抗体の
大半は同様の法化水素構造を有するガングリオシドと烈
しく反応することを示し、かつＮ−アセチｐグμコサミ
ンに結合したフコースを含有するものにも烈しく反応す
ることを示した。
ドに反応しなかった。Ｖアロシ／Ｌ’ヲクトテトフォＶ
ルセヲミツドガングリオシドに対し陽性であった抗体の
大半は同様の法化水素構造を有するガングリオシドと烈
しく反応することを示し、かつＮ−アセチｐグμコサミ
ンに結合したフコースを含有するものにも烈しく反応す
ることを示した。
実施例５
ｍ５ｉｎ中のシアロシμラクトテトラオース抗原の定量
腫瘍抗原はグリコリピッドおよびグリコプロティンとし
て分離した。抗原をガングリオシドとして分離する場合
は実施例２に記載されたのと同様の基本方法が用いられ
た。しかし、この方法は分析に少量の組織サンプμが用
いられる場合に採用される。
て分離した。抗原をガングリオシドとして分離する場合
は実施例２に記載されたのと同様の基本方法が用いられ
た。しかし、この方法は分析に少量の組織サンプμが用
いられる場合に採用される。
ガングリオシド抗原の検出
約［ｌＬｌｇの組織に（Ｌ５−の水を加え、組織を水浴
中、テフロンの乳棒を有する円錐形ホモゲナイザーで均
一化した。均一化が完了したのち、１、６ ｄのメタノ
−μとα８−のクロロホルムを加えた。充分混０合した
のち、試験管を１００×１で１０分間遠心分離した。透
明な上澄液をテフロンのキャップの付いた少さなキマツ
クスチューブに移した。試験管内の沈殿物は［１５−の
水に懸澗し、次いで、第一の抽出に用いたのと同量のメ
タノ−μとクロロホルムを加えた。混合および遠心分離
は前と同様に行った。二つの上澄液を合併し、水を加え
て最終的なりロロホルムーメタノーμ−水比が４：８：
ｃＬ６（容量）になるようＫした。遠心分離を１０．Ｑ
Ｘｇで５分間行った。上層をすりガラスの首のついた少
さい円形フラスコに移し、Ｑ、５Ｗ１ｔのクロロホルム
と１．ローの水を下層に加えた。混合しながらガラスの
首のついた円形フラスコに移し、１１容量のイソブタノ
−ｐを加えた。残査をｃＬ１ＭＮａＯＨメタノール溶液
と乾燥するまで蒸発させた。試験管は１時間室温に放置
した。
中、テフロンの乳棒を有する円錐形ホモゲナイザーで均
一化した。均一化が完了したのち、１、６ ｄのメタノ
−μとα８−のクロロホルムを加えた。充分混０合した
のち、試験管を１００×１で１０分間遠心分離した。透
明な上澄液をテフロンのキャップの付いた少さなキマツ
クスチューブに移した。試験管内の沈殿物は［１５−の
水に懸澗し、次いで、第一の抽出に用いたのと同量のメ
タノ−μとクロロホルムを加えた。混合および遠心分離
は前と同様に行った。二つの上澄液を合併し、水を加え
て最終的なりロロホルムーメタノーμ−水比が４：８：
ｃＬ６（容量）になるようＫした。遠心分離を１０．Ｑ
Ｘｇで５分間行った。上層をすりガラスの首のついた少
さい円形フラスコに移し、Ｑ、５Ｗ１ｔのクロロホルム
と１．ローの水を下層に加えた。混合しながらガラスの
首のついた円形フラスコに移し、１１容量のイソブタノ
−ｐを加えた。残査をｃＬ１ＭＮａＯＨメタノール溶液
と乾燥するまで蒸発させた。試験管は１時間室温に放置
した。
トランスエステル化が完了したのち、４−のクロロホル
ムと１−のメタノールを加え、内容物ヲ、クロロホルム
−メタノール−水（６０：５０：４．５容量）中１ｇの
セファデックスＧ２５を充填した小さいカラムに注入し
た。カラムを１５ｄＯクロロホｐムーメタノールー水（
６０：３０：４．５）で溶出した。溶出液はゆつくυと
、１．０ｇのＤＥＡＥ−セファロース（登録商標、ファ
μマシア ファイン ケミカルズ、ウプサラ、スウェー
デン）のアセテート型ヲ充填したカラムに加えた。カラ
ムを１（ｌｄのメタノ−μで洗浄したのち、モノシアロ
ガングリオシドを１（Ｉｔ／の（ＬＯ２Ｍ酢酸カリメタ
ノ−ｐ溶液で溶出した。蒸発およびクロロホμムーメタ
ノーｐ−水（６５：２５：４、容量）に再溶解したのち
、単純なモノシアロガングリオシドはンアロシμラクト
テトラオシμセヲミドかう１５カラム容量の６５ ：２
５ ：４（重量／容量）で溶出することによって分離さ
れ、一方、複合ガングリオシド分画は１０容量のクロロ
ホμムーメタノーμ−水（５０：４０二１０、容量）で
溶出された。
ムと１−のメタノールを加え、内容物ヲ、クロロホルム
−メタノール−水（６０：５０：４．５容量）中１ｇの
セファデックスＧ２５を充填した小さいカラムに注入し
た。カラムを１５ｄＯクロロホｐムーメタノールー水（
６０：３０：４．５）で溶出した。溶出液はゆつくυと
、１．０ｇのＤＥＡＥ−セファロース（登録商標、ファ
μマシア ファイン ケミカルズ、ウプサラ、スウェー
デン）のアセテート型ヲ充填したカラムに加えた。カラ
ムを１（ｌｄのメタノ−μで洗浄したのち、モノシアロ
ガングリオシドを１（Ｉｔ／の（ＬＯ２Ｍ酢酸カリメタ
ノ−ｐ溶液で溶出した。蒸発およびクロロホμムーメタ
ノーｐ−水（６５：２５：４、容量）に再溶解したのち
、単純なモノシアロガングリオシドはンアロシμラクト
テトラオシμセヲミドかう１５カラム容量の６５ ：２
５ ：４（重量／容量）で溶出することによって分離さ
れ、一方、複合ガングリオシド分画は１０容量のクロロ
ホμムーメタノーμ−水（５０：４０二１０、容量）で
溶出された。
組織の精製した複合ガングリオシド分画の一部をメタノ
ールに溶解し、抽出物５０μｔをポリビニルマイクロタ
イタープレートの穴に加えた。１〜２５ ｐｍｏｌ
の純粋なシアロシルラクトテトラオシμセラミドのメタ
ノール溶液標準溶液をプレートの他の穴に加えた。溶媒
を窒素気流下蒸発させた。未知のサンプμと標準に１０
〜１００μｇの、シアロシルラクトテトラオース、もし
、それにフコースが結合しているならばそれに特異的な
、実施例２に記載の方法で調製されたモノクロナール抗
体を、燐酸バッファーの生理食塩水ｐＨ７，４（ＰＢＳ
）で１Ｌ％の牛血清アルブミンを含有するものに溶解し
て加えた。サンプルは室温で１時間培養し、ＰＢＳ溶液
で３回洗浄した。それから１１２５で標識した抗マウス
免疫グロブリンを加え３時間反応させた。
ールに溶解し、抽出物５０μｔをポリビニルマイクロタ
イタープレートの穴に加えた。１〜２５ ｐｍｏｌ
の純粋なシアロシルラクトテトラオシμセラミドのメタ
ノール溶液標準溶液をプレートの他の穴に加えた。溶媒
を窒素気流下蒸発させた。未知のサンプμと標準に１０
〜１００μｇの、シアロシルラクトテトラオース、もし
、それにフコースが結合しているならばそれに特異的な
、実施例２に記載の方法で調製されたモノクロナール抗
体を、燐酸バッファーの生理食塩水ｐＨ７，４（ＰＢＳ
）で１Ｌ％の牛血清アルブミンを含有するものに溶解し
て加えた。サンプルは室温で１時間培養し、ＰＢＳ溶液
で３回洗浄した。それから１１２５で標識した抗マウス
免疫グロブリンを加え３時間反応させた。
ＰＢＳで繰返し洗浄したのち、未知および標準の穴をマ
イクロタイタープレートから切取りガンマ−カウンター
で測定した。未知のシアａシｐヲクトテトラオース抗原
の濃度を純粋なシアロシルラクトテトラオンμセラミド
の標準曲線から計算で求めた。
イクロタイタープレートから切取りガンマ−カウンター
で測定した。未知のシアａシｐヲクトテトラオース抗原
の濃度を純粋なシアロシルラクトテトラオンμセラミド
の標準曲線から計算で求めた。
シアロシｐラクトテトラオーヌ抗原のタンパク結合型は
免疫学的アイソトープおよび酵素法によって検出できる
。腫瘍組織の水性ホモグネ−）１００μｔを培養チュー
ブに入れ、ついで１００ Ｄｔのモノクロナール抗体を
加え、混合した。チューブに栓をし、室温で、ゆるやか
に振盪しながら９０分間培養した。シアロシルックトテ
トラオｙμセラミドガングリオシド抗原の薄層を塗布し
たポリスチレンのビーズを各チューブに入れる。抗原ビ
ーズを加えたのち、プラスチックビーズ上に存在する気
泡を除くためチューブをわずかにタッピングした。サン
プルは４時間培養した。培養液は水アスピレータ−で吸
引分離し、ビーズを２−の燐酸バッファー生理食塩水で
２回洗浄した。洗浄液はできるだけ注意して除いた。そ
れから、１１２５で標識した抗マウ・ス抗体２００μｔ
を加え、−夜、４℃で培養を行った。抗体溶液を吸引除
去し、ビーズを燐酸バッファー生理食塩水２−で４回洗
浄した。洗浄液は各洗浄ごとに注意深く除いた。ビーズ
の入った培養チューブをガンマ−カウンター中に置き１
″５のＣｍｐ数を測定した。各分析において、ブランク
（抗原なし）をも分析した。
免疫学的アイソトープおよび酵素法によって検出できる
。腫瘍組織の水性ホモグネ−）１００μｔを培養チュー
ブに入れ、ついで１００ Ｄｔのモノクロナール抗体を
加え、混合した。チューブに栓をし、室温で、ゆるやか
に振盪しながら９０分間培養した。シアロシルックトテ
トラオｙμセラミドガングリオシド抗原の薄層を塗布し
たポリスチレンのビーズを各チューブに入れる。抗原ビ
ーズを加えたのち、プラスチックビーズ上に存在する気
泡を除くためチューブをわずかにタッピングした。サン
プルは４時間培養した。培養液は水アスピレータ−で吸
引分離し、ビーズを２−の燐酸バッファー生理食塩水で
２回洗浄した。洗浄液はできるだけ注意して除いた。そ
れから、１１２５で標識した抗マウ・ス抗体２００μｔ
を加え、−夜、４℃で培養を行った。抗体溶液を吸引除
去し、ビーズを燐酸バッファー生理食塩水２−で４回洗
浄した。洗浄液は各洗浄ごとに注意深く除いた。ビーズ
の入った培養チューブをガンマ−カウンター中に置き１
″５のＣｍｐ数を測定した。各分析において、ブランク
（抗原なし）をも分析した。
さらに、少くとも１つの陽性サンプμ（抗原の存在がす
でに知られている組織からの水性抽出物）も常に分析し
た。抑制（１ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を測定し、抑制があ
まり大きい場合には、その価から腫瘍抽出物の稀釈を行
うことが可能であった。
でに知られている組織からの水性抽出物）も常に分析し
た。抑制（１ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を測定し、抑制があ
まり大きい場合には、その価から腫瘍抽出物の稀釈を行
うことが可能であった。
Ｖアロγμフクトテトフォース抑制テストによれば、種
々の形状の腫瘍において５５〜８０％の高頻度の陽性を
示すことが判った。水溶性抗原のある種の活性が小腸、
大腸、膵臓のような器管に見出された。リピツド抽出物
におけるシアロシμヲクトテトラオース抗原テスト（ガ
ングリオ７ドとして）は一般に高い特異性（正常組織に
は陽性はない）を示し、また腫瘍組織には多数の陽性の
ものがあった。本発明においては、検出法は免疫抑制テ
ストにおけるアイソトープ標識した第二抗体に基づくも
のである。
々の形状の腫瘍において５５〜８０％の高頻度の陽性を
示すことが判った。水溶性抗原のある種の活性が小腸、
大腸、膵臓のような器管に見出された。リピツド抽出物
におけるシアロシμヲクトテトラオース抗原テスト（ガ
ングリオ７ドとして）は一般に高い特異性（正常組織に
は陽性はない）を示し、また腫瘍組織には多数の陽性の
ものがあった。本発明においては、検出法は免疫抑制テ
ストにおけるアイソトープ標識した第二抗体に基づくも
のである。
実施例４
ガン患者の血清中のシアロシμラクトテトフォース抗原
の測定 １００μＬの患者の血清を培養チューブに入れそれから
１００μｔのモノクロナール抗体を加え混合した。チュ
ーブに栓をし９０分間、室温でゆるやかに振盪しながら
培養した。それから、シアロシμフクトテトラオシμセ
ラミドでコーティングしたポリスチレンピーズヲ各チュ
ーブに入れた。存在する気泡はチューブを注意深くタッ
ピングすることにより消滅した。培養をさらに４時間行
った。そののち、培養液を水アスピレータ−で吸引除去
し、ビーズを２−の燐酸バッファー生理食塩水で２回洗
浄した。洗浄面はできるだけ注意深く除去した。それか
ら、１１２５で標識した抗体２００μＬを加え４℃で一
夜培養した。そののち抗原溶液を吸引除去し、ビーズを
２艷の燐酸バッファー生理食塩水で４回洗浄した。洗浄
液を各洗浄について注意深く除去した。ポリスチレンビ
ーズの入った培養チューブをガンマ−カウンターに置き
、計数を行った。
の測定 １００μＬの患者の血清を培養チューブに入れそれから
１００μｔのモノクロナール抗体を加え混合した。チュ
ーブに栓をし９０分間、室温でゆるやかに振盪しながら
培養した。それから、シアロシμフクトテトラオシμセ
ラミドでコーティングしたポリスチレンピーズヲ各チュ
ーブに入れた。存在する気泡はチューブを注意深くタッ
ピングすることにより消滅した。培養をさらに４時間行
った。そののち、培養液を水アスピレータ−で吸引除去
し、ビーズを２−の燐酸バッファー生理食塩水で２回洗
浄した。洗浄面はできるだけ注意深く除去した。それか
ら、１１２５で標識した抗体２００μＬを加え４℃で一
夜培養した。そののち抗原溶液を吸引除去し、ビーズを
２艷の燐酸バッファー生理食塩水で４回洗浄した。洗浄
液を各洗浄について注意深く除去した。ポリスチレンビ
ーズの入った培養チューブをガンマ−カウンターに置き
、計数を行った。
実施例５
ガン患者の血清中のシアロシ〜ラクトテトツオンμセフ
ミドの測定 ０．５ｔＩｔの生理食塩水で稀釈した１−の血清を攪拌
しながら小さいキマックスチューブ中４ｗｔのメタノ−
μに滴下した。それから、２−のクロロホルムを加えサ
ンプｐは充分攪拌し８ｏ。
ミドの測定 ０．５ｔＩｔの生理食塩水で稀釈した１−の血清を攪拌
しながら小さいキマックスチューブ中４ｗｔのメタノ−
μに滴下した。それから、２−のクロロホルムを加えサ
ンプｐは充分攪拌し８ｏ。
ＸＧで１０分間遠心分離を行った。透明な上澄液を小さ
い円形フラスコに移し、蒸発乾燥した。
い円形フラスコに移し、蒸発乾燥した。
５ＷＩｔのクロロホルムに溶解し、１ｇのクリヵゲ／Ｉ
／ノカラム（キーゼルゲｌＶ６０．２５０〜４００メツ
シュ、メルクＡＧ、ダルムシュタット、西ドイツ）に注
入した。カラムを１０−のクロロホルムおよび１５＋ｄ
のクロロホルム−メタノール−水（６５：２５：４容量
）で溶出した。最後の溶出物をゆっくりと１ｇのＤｇＡ
Ｅ−セファロースカラムに加え、１０−のメタノールで
溶出した。複合モノシアロガングリオシドを０．０２Ｍ
酢酸カリメタノ−１ｖ溶液１０ｍで溶出した。蒸留水に
対する透析で脱塩し、ガングリオＶド分画をメタノ−μ
に溶解した。
／ノカラム（キーゼルゲｌＶ６０．２５０〜４００メツ
シュ、メルクＡＧ、ダルムシュタット、西ドイツ）に注
入した。カラムを１０−のクロロホルムおよび１５＋ｄ
のクロロホルム−メタノール−水（６５：２５：４容量
）で溶出した。最後の溶出物をゆっくりと１ｇのＤｇＡ
Ｅ−セファロースカラムに加え、１０−のメタノールで
溶出した。複合モノシアロガングリオシドを０．０２Ｍ
酢酸カリメタノ−１ｖ溶液１０ｍで溶出した。蒸留水に
対する透析で脱塩し、ガングリオＶド分画をメタノ−μ
に溶解した。
シアロンμラクトテトラオシｐセラミドの濃度を二重固
相抗体法で測定した。この方法では、ガングリオシドを
固相に吸着させ、モノクロナール抗体と抗マウス免疫グ
ロブリンで測定した。
相抗体法で測定した。この方法では、ガングリオシドを
固相に吸着させ、モノクロナール抗体と抗マウス免疫グ
ロブリンで測定した。
２０ ｐｍｏｌの純シアロシルラクトテトフォシμセヲ
ミドおよび血清からの純モノシアロガングリオシドのサ
ンプμをメタノ−μに溶解し、県側的に稀釈したもの（
１／２〜１７２０４Ｂ ）をボリヒニｐマイクロタイタ
ープレート（フロラ・ッポフトリーズ ａｒｔ、 ｎｒ
、 ７７−１７５ −０５）の穴にピペットで注入し
蒸発させた。穴は１チの牛血清アルブミン（ＢＳＡ）の
燐酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）でブロックし、１
％ノＢ Ｓ Ａ１７）Ｐ Ｂ Ｓ溶液で稀釈した５ ０
ａｔの当該抗原に対するモノクロナール抗体を加えた
。４時間培養したのち、穴はＰＢＳ ２００μｔで３回
洗浄した。
ミドおよび血清からの純モノシアロガングリオシドのサ
ンプμをメタノ−μに溶解し、県側的に稀釈したもの（
１／２〜１７２０４Ｂ ）をボリヒニｐマイクロタイタ
ープレート（フロラ・ッポフトリーズ ａｒｔ、 ｎｒ
、 ７７−１７５ −０５）の穴にピペットで注入し
蒸発させた。穴は１チの牛血清アルブミン（ＢＳＡ）の
燐酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）でブロックし、１
％ノＢ Ｓ Ａ１７）Ｐ Ｂ Ｓ溶液で稀釈した５ ０
ａｔの当該抗原に対するモノクロナール抗体を加えた
。４時間培養したのち、穴はＰＢＳ ２００μｔで３回
洗浄した。
洗浄後、固定されたモノクロナール抗体を、１１ＬＩ、
（−オキシダーゼまたはβ−ガヲクトンダーゼで標識し
た抗マウス免疫グロブリンで測定した。他の抗体の濃度
の測定はガンマ−カウンターで、または酵素基質（オル
トフエニｐノアミンまたはメチμウンペリフエリμｍβ
−ガラクトンド、クエン酸バッファー中、ｐＨ４，２，
３０分後スペクトロフルオリメーターで蛍光を読む）の
添加後行われる。ンアロシμラクトテトラオシμセラミ
ドの濃度は純粋なガングリオシドの標準サンプルから計
算される。上記の条件では、抗体血清は腺ガン患者にの
み検出された。
（−オキシダーゼまたはβ−ガヲクトンダーゼで標識し
た抗マウス免疫グロブリンで測定した。他の抗体の濃度
の測定はガンマ−カウンターで、または酵素基質（オル
トフエニｐノアミンまたはメチμウンペリフエリμｍβ
−ガラクトンド、クエン酸バッファー中、ｐＨ４，２，
３０分後スペクトロフルオリメーターで蛍光を読む）の
添加後行われる。ンアロシμラクトテトラオシμセラミ
ドの濃度は純粋なガングリオシドの標準サンプルから計
算される。上記の条件では、抗体血清は腺ガン患者にの
み検出された。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、炭水化物性の特殊な腫瘍関連抗原またはハプテン、
シアロシルラクトテトラオース （ＩＶ＾３ＮｅｕＡｃＬｃＯｓｅ＿４）の、ヒトの腫瘍
の診断および治療処理のための利用法。 ２、抗原に対する抗体あるいは他の試薬を検出、測定、
部位検出および処置に用いる特許請求の範囲第１項記載
の利用法。 ３、抗原がシアロシルラクトテトラオシルセラミドの形
でガンまたはその転移から分離される特許請求の範囲第
１項記載の利用法。 ４、抗原またはその免疫原性形の誘導体をその抗原に対
するモノクロナールまたはポリクロナール抗体の生産に
用いる特許請求の範囲第１項記載の利用法。 ５、結合した特異モノクロナール抗体を酸素、例えばβ
−カラクトシダーゼ、またはパーオキシダーゼ、ラジオ
アクティブアイソトープ、例えばＩ＾１＾２＾５、また
は蛍光、例えばダンシルクロリドで測定する特許請求の
範囲第１項記載の利用法。 ６、抗原の測定を組織化学的調製物または組織部分の細
胞レベルで免疫組織化学的方法で行う特許請求の範囲第
１項記載の利用法。 ７、患者の腫瘍および腫瘍転移の部位をラジオアクティ
ブアイソトープまたは他の方法で標識した抗体で検出す
る特許請求の範囲第１項記載の利用法。 ８、シアロシルラクトテトラオースに対する抗体をガン
の治療に用いる特許請求の範囲第１項記載の利用法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE8404283A SE455445B (sv) | 1984-08-28 | 1984-08-28 | Antikroppar mot sialosyllaktotetraos (iv?723neuaclcose?714) och antikroppens resp antigenets anvendning vid tumordiagnostik |
| SE8404283-7 | 1984-08-28 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61116660A true JPS61116660A (ja) | 1986-06-04 |
| JPH0690204B2 JPH0690204B2 (ja) | 1994-11-14 |
Family
ID=20356831
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60186757A Expired - Lifetime JPH0690204B2 (ja) | 1984-08-28 | 1985-08-27 | 腫瘍に関連した特殊な抗原シアロシルラクトテトラオースに特異的な抗体 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0173663B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0690204B2 (ja) |
| AT (1) | ATE71225T1 (ja) |
| DE (1) | DE3585061D1 (ja) |
| SE (1) | SE455445B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990010708A1 (fr) * | 1989-03-09 | 1990-09-20 | The Sendai Institute Of Microbiology | Anticorps monoclonal, et procede d'analyse, kit de reactif, procede de recherche et medicament utilisant ledit anticorps |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0287916A1 (en) * | 1987-04-13 | 1988-10-26 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Immunoassay |
| US5079353A (en) * | 1987-12-02 | 1992-01-07 | Chembiomed, Ltd. | Sialic acid glycosides, antigens, immunoadsorbents, and methods for their preparation |
| EP0380084A3 (en) * | 1989-01-27 | 1991-03-13 | The Biomembrane Institute | Method for the inhibition of cell-cell and cell substratum interactions by the blocking of carbohydrate-carbohydrate interactions |
| EP1363643A2 (en) | 2000-12-22 | 2003-11-26 | Medlyte, Inc. | Compositions and methods for the treatment and prevention of cardiovascular diseases and disorders, and for identifying agents therapeutic therefor |
| US7862812B2 (en) | 2006-05-31 | 2011-01-04 | Lpath, Inc. | Methods for decreasing immune response and treating immune conditions |
| US8796429B2 (en) | 2006-05-31 | 2014-08-05 | Lpath, Inc. | Bioactive lipid derivatives, and methods of making and using same |
| US9274130B2 (en) | 2006-05-31 | 2016-03-01 | Lpath, Inc. | Prevention and treatment of pain using antibodies to lysophosphatidic acid |
| US9217749B2 (en) | 2006-05-31 | 2015-12-22 | Lpath, Inc. | Immune-derived moieties reactive against lysophosphatidic acid |
| US9274129B2 (en) | 2006-05-31 | 2016-03-01 | Lpath, Inc. | Methods and reagents for detecting bioactive lipids |
| US8444970B2 (en) | 2006-10-27 | 2013-05-21 | Lpath, Inc. | Compositions and methods for treating ocular diseases and conditions |
| SI2087002T1 (sl) | 2006-10-27 | 2014-11-28 | Lpath, Inc. | Sestavki in postopki za vezavo sfingozin-1-fosfata |
| US8361465B2 (en) | 2007-10-26 | 2013-01-29 | Lpath, Inc. | Use of anti-sphingosine-1-phosphate antibodies in combination with chemotherapeutic agents |
| US8871202B2 (en) | 2008-10-24 | 2014-10-28 | Lpath, Inc. | Prevention and treatment of pain using antibodies to sphingosine-1-phosphate |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4471057A (en) * | 1981-06-30 | 1984-09-11 | The Wistar Institute | Detection of colorectal carcinoma |
| EP0118365B1 (en) * | 1983-03-04 | 1990-08-29 | Health Research, Inc. | Monoclonal antibodies to human breast carcinoma cells and their use in diagnosis and therapy |
| US4569788A (en) * | 1983-05-18 | 1986-02-11 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Monoclonal antibodies against non small cell lung cancer |
-
1984
- 1984-08-28 SE SE8404283A patent/SE455445B/sv not_active IP Right Cessation
-
1985
- 1985-08-06 AT AT85850256T patent/ATE71225T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-08-06 DE DE8585850256T patent/DE3585061D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-08-06 EP EP85850256A patent/EP0173663B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-08-27 JP JP60186757A patent/JPH0690204B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990010708A1 (fr) * | 1989-03-09 | 1990-09-20 | The Sendai Institute Of Microbiology | Anticorps monoclonal, et procede d'analyse, kit de reactif, procede de recherche et medicament utilisant ledit anticorps |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SE8404283D0 (sv) | 1984-08-28 |
| SE455445B (sv) | 1988-07-11 |
| DE3585061D1 (de) | 1992-02-13 |
| EP0173663A2 (en) | 1986-03-05 |
| SE8404283L (sv) | 1986-03-01 |
| EP0173663A3 (en) | 1987-10-07 |
| EP0173663B1 (en) | 1992-01-02 |
| JPH0690204B2 (ja) | 1994-11-14 |
| ATE71225T1 (de) | 1992-01-15 |
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