JPS6317900A

JPS6317900A - 糖鎖抗体の製造法

Info

Publication number: JPS6317900A
Application number: JP61163139A
Authority: JP
Inventors: Naoyuki Taniguchi; 直之谷口
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1986-07-10
Filing date: 1986-07-10
Publication date: 1988-01-25

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、糖鎖抗体の製造法、詳しくは糖蛋白質等の糖
鎖を特異的に認識できる抗体の新規な製造法に関する。

従来の技術癌患者の血清等の体液中に含有されている癌組織由来の
糖蛋白質は、癌性変化を受けている場合が多く、従来か
らこれを腫瘍マーカーとして免疫学的手法により癌の診
断等を行なう試みがなされている。即ち、従来、癌組織
から糖蛋白質を精製し、これを用いて抗体を製造し、得
られた抗体を用いて血清等の試料により癌の診断等を行
なうことが試みられている（例えば、綜合臨床ｖｏ１．
３４゜ＮＱ１２．２６２５〜２６３２　（１９８５年）
参照）。

しかし、この場合、診断に用い得る特異性の高い抗体を
効率良く得ることができないという問題があった。即ち
、糖蛋白質の癌性変化のうち腫瘍細胞由来の特異的な変
化は蛋白部分ではなく糖鎖部分に出現することが多いが
、従来の抗体の製造法では蛋白部分を認識する抗体が多
量に生成するため腫瘍マーカーに対する特異性が低いと
いう問題があった。

従って、糖蛋白質腫瘍マーカーの糖鎖に特異的な抗体の
効率的な製造技術の開発が要望されているのが現状であ
る。

発明が解決しようとする問題点本発明の目的は、上記要望に応え、糖鎖に特異的な抗体
を効率良く得ることができるＶｆｒ規な抗体の製造法を
提供することにある。

問題点を解決するための手段本発明者は、前記現状に鑑み、鋭意研究した結果、ハプ
テンとすべき糖鎖のキャリアー蛋白として免疫する哺乳
動物の自己蛋白を用いることにより目的が達成できるこ
とを見出し、これに基づき本発明を完成するに至った。

即ち本発明は、糖鎖に特異的な抗体を製造する方法であ
って、該糖鎖のキャリアー蛋白として免疫する哺乳動物
の自己蛋白を用いることを特徴とする糖鎖抗体の製造法
に係る。

本発明方法によれば、特にキャリアー蛋白として免疫す
る哺乳動物の自己蛋白を用いることにより蛋白部分を認
識する抗体が生成しないので糖鎖に特異的な抗体を極め
て効率的に得ることができる。また、得られる抗体は、
従来方法により得られた抗体に比して糖蛋白質１！瘍マ
ーカー等に対する特異性が高く、従って、該抗体は該マ
ーカーの各種免疫測定法における特異抗体として好適に
利用でき、これによって癌の臨床上の診断や研究が行な
い得ると共に、該マーカーの精製等にも利用できる。

本発明法において用いられる糖鎖としては、ハプテンと
して作用する限り、特に限定されず、各種のもの例えば
、Ｎ−グリコシド型、Ｏ−グリコシド型、コラーゲン型
糖蛋白質及びガングリオ系、グロボ系、ラクト系糖脂質
等の糖鎖を使用できる。

特に好ましく使用できるものとしては、腫瘍マーカーと
なり得る糖蛋白質、糖脂質等の糖鎖を例示することがで
きる。該糖蛋白質としてはγ−グルタミルトランスペプ
チダーゼ（γ−ＧＴＰ）　、α−フェトプロティン（Ａ
ＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）等を、また当該糖脂質
としては、ガングリオシドＧＭｚ　、ＧＭ２　、ＧＭ３
　、ＧＤｌａ。

ＧＤ２　、ＧＤ３等の酸性糖脂質並びにフォルスマン抗
原、グロボシド等の中性糖脂質等を例示できる。糖蛋白
質、糖脂質から糖鎖を分離する方法としては、常法でよ
く、例えばヒドラジン分解法、プロナーゼによる徹底消
化、Ｎ−グリカナーゼ処理、Ｏ−グリカナーゼ処理、ト
リフルオロ酢酸による分解等を挙げることができ、それ
らによる処理操作等は、通常のこの種方法のそれらと同
様に行ない得る（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　Ｅｎｚｙｍｏｌ、
。

Ｖｏｌ、８３．２６３　（１９Ｂ２＞他〕。

本発明法においては、ハプテンとすべき糖鎖のキャリア
ー蛋白として免疫する哺乳動物の自己蛋白を用いること
を必須とする。かかる技術手段は、本発明者が始めて見
出したものであり、これにより糖鎖に特異的な抗体を極
めて効率的に得ることができる。ここで、自己とは、キ
ャリアー蛋白の抗原性が同一である動物を意味し、その
限りにおいて、同一個体ないしは純系にとどまらず、広
く同一種が例示される。

上記において、好ましく使用できるキャリアー蛋白とし
ては、例えば血清アルブミン、血清グロブリン、チログ
ロブリン、ヘモグロブリン、ヘモシアニン類等の自己蛋
白を広く挙げることができる。

上記において、キャリアー蛋白を供給する哺乳動物、即
ち免疫され、抗体の製造に供される哺乳動物としては、
特に制限はなく例えばウサギ、モルモット、マウス、ヒ
ツジ、ヤギ、ウシ、ウマ等を例示できる。

上記糖鎖とキャリアー蛋白との反応は公知の各種方法例
えば（Ａ＞イソチオシアネートカップリング法、（Ｂ）
ジアゾカップリング法、（Ｃ）アミド結合法、（Ｄ＞還
元的アミン化法、（Ｅ）グアニジンカップリング法等に
従い実施できる（Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｃａｒｂｏ
ｈｙｄｒａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄＢｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｖｏｌ、３７．　ｐ２２５−２８
１　（１９８０）、ＭｅｔｈＯｄＳ　ｉｎ　ｔｎｚｙｍ
ｏ＋ｏｇｙ、ｖｏ＋ｉ、　ＣｏｍｐｉｅｘＣａｒｂｏｈ
ｙｄｒａｔｅｓ、Ｐａｒｔ　Ｃ，ｐ１５５−１７５（１
９７８）　、蛋白質核酸酵素　Ｖｏｌ、２５．　Ｎｏ、
８．ｐ７０７−７２４（１９８０）及びＡｒｃｈｉｖｅ
ｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏ
ｐｈｙｓｉｃｓ　ｖｏｌ。

２０５、Ｎα２．ｐ３３Ｂ−３９５（１９８０）　　）
。

上記イソチオシアネートカップリング法（Ａ法）は、還
元的アミン化反応（例えばハプテンにβ−（ｐ−アミノ
フェニル）エチルアミン等のジアミン誘導体及びＮａＢ
Ｈａ　、ＮａＢＨ３ＣＮ等の還元剤を反応させる）によ
り製造される化合物にチオフォスゲンを反応させたのち
、得られるイソチオシアネート体にキャリアー蛋白をカ
ップリング反応させることにより実施される。上記還元
的アミノ化反応は、適当な不活性溶媒例えば０．２モル
リン酸カルシウム（ｐＨ＝８＞等の緩衝液、水、生理食
塩水又はメタノール、エタノール等のアルコール中、０
〜４０℃にて３時間〜３日間で好適に進行する。また還
元的アミノ化反応により得られる化合物とチオフォスゲ
ンとの反応は、適当な不活性溶媒例えば水、０．１モル
炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ＝８＞又は生理食塩水
中−１０°Ｃ〜室温にて３０分〜２時間で好適に進行す
る。

更にイソチオシアネート体とキャリアー蛋白との反応は
、適当な不活性溶媒例えば水、生理食塩水又は０．１モ
ル炭酸水素ナトリウム水溶液（ＤＨ＝９．５）中で一り
０℃〜室温にて１５〜２０時間で好適に進行する。

ジアゾカップリング法（Ｂ法）は、例えば上記Ａ法の還
元的アミン化反応により製造された化合物に亜硝酸ナト
リウムと塩酸又は硫酸等のジアゾ化剤を反応させて製造
されるジアゾ化合物に、キャリアー蛋白をカップリング
反応ざぜることにより実施される。上記ジアゾ化反応は
、適当な不活性溶媒例えば水、生理食塩水又は塩酸水溶
液等の鉱酸水溶液中、−１０〜−２０℃にて１０〜６０
分で好適に進行する。またジアゾ化合物とキャリアー蛋
白とのカップリング反応は一１０〜２０℃にて２〜６時
間で好適に進行する。

アミド結合法（Ｃ法）は例えばハプテンのアルデヒド基
＠：酸化銀等の酸化剤で酸化して糖カルボン酸としたの
ち、該糖カルボン酸とキャリアー蛋白のアミン基とをア
ミド結合反応させることにより実施される。アミド結合
反応は、通常のベプタイドのアミド結合生成反応により
、例えば１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）
−カルボジイミド等の脱水剤を用いた脱水縮合反応によ
り実施できる。この脱水縮合反応は、適当な不活性溶媒
例えば１モル酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝５．５）等
の緩衝液中、Ｏ℃〜室温にて３〜１２時間で好適に進行
する。

還元的アミノ化法（Ｄ法）は例えばハプテンにキャリア
ー蛋白及びＮａＢＨａ　、ＮａＢＨ３ＣＮ等の還元剤を
反応させることにより実施される。

還元的アミノ化反応の条件としては、前記Ａ法の還元的
アミノ化反応の条件を採用できる。

上記Ａ−Ｄ法において各試薬の使用量は、原料に対して
少なくとも等モル量程度、通常好ましくは過剰量とされ
る。

かくして糖鎖とキャリアー蛋白とが結合した所望の糖鎖
抗原を製造できる。反応終了後得られる糖鎖抗原は常法
に従い、例えば透析法、ゲル濾過法、分別沈澱等により
容易に単離精製できる。

上記で１ｑられる糖鎖抗原による抗体の作成は、常法に
従い行なうことができる。即ち、該抗原を哺乳動物に投
与して免疫し、生成される抗体を採取するか、或いは上
記抗原で免疫された哺乳動物の形質細胞（免疫細胞）と
哺乳動物の形質細胞腫細胞とを細胞融合させ、所望抗原
に対する抗体を産生する融合細胞をクローン化し、該ク
ローンより抗体を採取する公知の方法により実施できる
。

ここで、用いる哺乳動物は、いずれの方法においても、
キャリアー蛋白を供給した哺乳動物とキャリヤー蛋白の
抗原性が同一である動物を用いる。

上記第１の方法においては、抗体の産生は例えば上記抗
原の所定量を生理食塩水で適当濃度に希釈し、これに必
要に応じてフロイントの不完全アジュバント又はフロイ
ントの完全アジュバント等のアジュバントを混合し、得
られる懸濁液を投与することにより行なわれる。上記投
与は皮下、筋注、腹腔内、静脈内、経口等、好ましくは
皮下、腹腔内、静脈内経路で行なわれる。投与回数、投
与量等は常法に従い適宜に決定できる。例えばウサギに
上記懸濁液を皮肉注射（抗原の量として０．０５〜５！
ｒｔｇ／回）し、以後２週間毎に１〜１０ケ月、好まし
くは１〜３ケ月間投与し免疫化させればよい。抗体の採
取は、上記懸濁液の最終投与後抗体が多量産生される時
期、通常上記最終投与の１〜２週間週間経過色疫化され
た動物から採血し、これを遠心弁ｍ後血清を分離採取す
ることにより行われる。また上記血清は更に塩析、吸着
法、アフイニイテイクロマトグラフィー等の通常の精製
手段により精製してもよい。

また、上記第２の方法において、免疫化の方法は、前記
した第１の方法に準じることができる。

免疫細胞としては、最終免疫の約３日後に摘出した牌臓
細胞を好ましく使用できる。

上記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動
物の形質細胞肝細胞としては、既に公知の種々の細胞株
、例えばｐ３　（Ｄ３／Ｘ６３−ＡＣ１８）（Ｎａｔｕ
ｒｅ　、２５６，４９５−４９７（１９７５）　）　、
ｐ３−Ｕ　１　（ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓ　　ｉｎ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　　ａｎｄ　　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｃ＋ｙ。

Ｊユ、　１−７　（１９７８＞）、Ｎ５−１　（Ｅｕｒ
。

Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、　６．５１１−５１９（１９
７６））、ＭＰＣ−１１（Ｃｅｌｌ　、旦。

４０５−４１５　（１９７６））、　５Ｐ２１０（Ｎａ
ｔｕｒｅ　、２７６．２６９−２７０（１９７８）　）
　、ＦＯ（Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、。

３５．１−２１　（１９８０））、Ｘ６３．６．５゜３
、　　（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１４８，３１３−３２
３　（１９７８））等や、ラットにおけるＲ２１０　（
Ｎａｔｕｒｅ、２７７．１３１−１３３（１９７９））
等の骨髄腫細胞を例示できる。

上記免疫細胞と形質細胞腫ｗｉ朧との融合反応は、基本
的には公知の方法、例えばマイルスタインら（Ｍｉｌｓ
ｔｅｉｎ　、　ｅｔ　　ａｔ、、　Ｍｅｔｈｏｄ　　ｉ
ｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　、　Ｖｏｌ、　７３．　Ｄｐ
３（１９８１）　）の方法等に準じて行ない得る。より
詳細には、上記融合反応は、適当な融合促進剤の存在下
、通常の栄養培地中で行なわれる。融合促進剤としては
、通常用いられているポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）　、センダイウィルス（ＨＶ’Ｊ）等を例示できる。

更に所望により培地中には融合効率を高めるために、ジ
メチルスルホキシド等の補助剤等を添加することもでき
る。免疫細胞と形質細胞腫細胞との使用割合は、通常の
方法と異ならず、例えば形質細胞腫細胞に対して、免疫
細胞を約１〜１０倍程度使用するのがよい。融合反応時
の培地としては、形質細胞腫細胞株の増殖に一般に用い
られる各種のもの、例えばＲＰＭＩ−１６４０培地、Ｍ
ＥＭ培地等を使用でき、通常は牛胎児血清（ＦＯ３）等
の血清補液を抜いておくのが望ましい。

融合反応は、上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との所定量
を上記培地内でよく混合し、予め３７℃程度に加温した
ＰＥＧ溶液、例えば平均分子量１０００〜６０００程度
のものを、通常培地に約３０〜６０ｗ／ｖ％の濃度で加
えて混ぜ合せることにより実施される。以後適当な培地
を逐次添加して、遠心分離し、上清を除去する操作を繰
返すことにより、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）が
形成される。

得られる所望ハイブリドーマの分離は、通常の選別用培
地、例えばＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン及びチミジンを含む培地）で培養することにより実施
できる。該ＨＡＴ培地での培養は、目的とするハイブリ
ドーマ以外の細胞（未融合細胞等）が死滅するのに充分
な時間、通常数日〜数週間行なえばよい。かくして得ら
れるハイブリドーマは、通常の限界希釈法に従い、目的
とする抗体の産生株の検索及び単一クローン化に供せら
れる。

該産生株の検索は、例えばエリザ（ＥＬＩＳＡ）法（１
：ｎｇｖａｌｌ、　Ｅ、、　Ｍｅｔｈ　、Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ、、　７０゜４１９−４３９　（１９８０））　、プ
ラーク法、スポット法、凝集反応法、オクタロニイー（
Ｑｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法、ラジオイムノアッセイ（
ＲＩＡ）法等の一般に抗体の検出に用いられている各種
の方法に従って実施できる〔「ハイブリドーマ法とモノ
クローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプランニング発行、
第３０−５３頁、昭和５７年３月５日〕。

上記第２の方法により１ｑられる目的のモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培地で継代培
養でき、また液体窒素中で容易に長期間保存することが
できる。

上記特定のハイブリドーマからの目的とする抗体の採取
は、該ハイブリドーマを常法に従い培養し、その培養上
清から所望抗体を分離する方法や上記ハイブリドーマを
、これと適合性のある哺乳動物に投与して増殖させ、そ
の腹水より所望抗体を分離する方法等に従い行なわれる
。前者の方法は高純度の抗体を得るのに適しており、後
者の方法は大量生産性に優れている。また、上記のごと
くして得られた抗体は、必要に応じて、更に塩析、吸着
、ゲルか過、アフイニイテイークロマトグラフイー等の
通常の精製手段により精製することができる。

かくして、目的の糖鎖抗体即ち糖鎖を特異的に認識でき
る抗体を収得できる。

本発明方法においては、特にキャリアー蛋白として免疫
する哺乳動物の自己蛋白を用いることにより蛋白部分を
認識する抗体が生成しないので、前記の第１及び第２の
いずれの方法による場合も目的の糖鎖抗体を極めて効率
的に得ることができる。又、ハプテンとして、腫瘍マー
カーである糖鎖を採用する場合には、より特異性の高い
抗体を得ることができる。

従って、本発明法により得られる糖蛋白質等の腫瘍マー
カーに特異的な糖鎖抗体の利用によれば、癌細胞もしく
は癌組織上の又は体液中の癌関連糖鎖を免疫反応（抗原
抗体反応）により測定することができ、これにより癌の
診断や研究をすることができると共に、該マーカーの精
製等にも利用できる。この場合、本発明法により得られ
る′ｅ鎮抗体は、従来方法により得られる抗体に比して
、腫瘍マーカーに対する特異性が高いので、より好適に
利用できる。

上記の癌関連糖鎖の測定は、通常の方法に従い、例えば
具体的には以下の如くして行なわれる。即ち測定材料と
して細胞及び／又は組織片を使用する場合は、通常の間
接免疫法に従い行われる。この方法によれば、生理食塩
水又は通常のリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）等の緩衝液中に
浮遊した細胞に、又はガラススライド上に固定化した組
織切片に、本発明法で得た抗体を免疫反応させ、細胞又
は組織片を上記緩衝液で充分に洗浄後、常法通りに標識
抗体法により、又は標識プロティンＡの使用により、細
胞又は組織片に結合した当該抗体の有無を調べればよい
。

測定材料として体液を使用する場合もまた常法に従うこ
とができる。ここで体液としては例えば血液、細胞組織
液、リンパ液、胸水、腹水、羊水、胃液、尿、膵液、髄
液、唾液等又は前記の細胞又は組織片の可溶化後の遠心
上清等を使用することができる。上記細胞又は組織片の
可溶化後の遠心上清は、通常の方法例えばホモジネート
法や可溶止剤を用いる可溶化の後、これを遠心分離して
上清を採取することによ゛り得ることができる。また血
液を使用する場合は、通常血清又は血漿として使用する
のが好ましい。測定に用いられる体液の量は、０．１〜
１０ｍ１２程度採取すればよい。

上記各種体液をｍ！定材料とする場合の測定方法として
は、通常の競合法によるラジオイムノアッセイ法（ＲＩ
Ａ）又は酵素免疫測定法（ＥＩＡ）により行うのが好ま
しい。これら方法の操作、手順等は通常の方法に従うこ
とができる。即ち通常の溶媒中、一定量の標準抗原、標
識抗原及び抗体を競合反応させ、次いで抗原抗体結合物
（免疫複合体）及び非結合抗原を分離し、そのいずれか
−方の標識活性を測定し、既知濃度の標準抗原に対する
標準曲線を作成する。同様に標準抗原の代りに濃度未知
の被検試料（体液）を使用してその標識活性を測定し、
前記標準曲線より被検試料中の使用した抗体に対する免
疫感受性物質（癌関連糖ｍ）＝を定量することができる
。

実施例以下、本発明を更に詳しく説明する為、実施例としてヒ
ト肝癌のγ−ＧＴＰ糖鎖に対する抗体の製造例を、又参
考例として該抗体を用いて行った血清診断例をそれぞれ
挙げるが、本発明は之等に限定されるものではない。

実施例 ■　糖鎖抗原の作製呑口等の文献（ＪＮＣＩ　　１９８５ニア５：８４１−
８４７）に記載のγ−ＧＴＰの４５０μ９を、−晩水に
対して透析し、凍結乾燥後、アブデンハルデン装置にて
、乾燥させた。魚雷した１１＋１ｉ２のヒドラジンを加
えて、１００℃、１２時間、スクリュー付ガラス試験内
でヒドラジン分解を行った。トルエンを加えて４５〜５
０℃で蒸発乾固させ、ついで２．５ｍ１２の水を加えた
。

水で平衡化したバイオゲルＰ４カラム（３ｉ。

−Ｒａｄ、φ１．５Ｘ３Ｃ）ｃｍ＞にかけ、３戒ずつ分
画してフルオレツサミン陽性の第９〜１９両分（合計３
３戒）を集め、凍結乾燥した。これに１戒の飽和ＮａＨ
ＣＯ３水溶液、５０１．ｔＱの無水酢酸を加え撹拌下に
２時間室温で反応させ、更に５０μ２の無水酢酸を加え
、同じく室温で９時間反応させてアセチル化した。反応
液を水で平衡化したダウエックス５０　（Ｄｏｖｅｘ５
０Ｗ、　　（Ｈ”　ｆｏｒｍ）　、［）ｏｖｅｘ）のカ
ラム（φ１Ｘ３ＣＷ１＞にかけ、２５戒の水で洗浄し、
素通り部分を全て集めて、凍結乾燥した。これに０．５
ＩＮ１１２のｐ−アミノフェニルエチルアミンを加えて
、室温で１５時間反応後、０．５ｍ１２のエタノール、
１戒のＮａＢＨ４のエタノール溶液を加えて、更に２時
間反応させた。

更に１２／ｆｆ！ＦのＮａＢＨａのエタノール溶液の１
ｍ１２を加えて３時間反応後、水で希釈し氷で冷却し、
酢酸でＤＨを５，６に調整した。窒素気流下でエタノー
ルを蒸発後、水で平衡化したバイオゲルＰ−２カラム（
Ｂｉｏ−Ｒａｄ、φ１ｘ２０ｍ）で１戒ずつ分画した。

第１０〜１４両分を集め、再び凍結乾燥後、水で平衡化
したセファデックスＧ−１０カラム（ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ。

φ１×４５α〕で分画し第５〜４０両分を集め、凍結乾
燥した。得られたフエネチラミン誘導体を２回の０．１
Ｍ　　ＮａＨＣＯ３（１）８８．０＞に溶解し、これを
６５μｍｏｌのチオフォスゲンを含むクロロホルム溶液
２．５１ＴＩＱの上に重層した。１時間激しく撹拌し、
１２回容量のガラス遠心管に移して、３０００回転で１
５分遠心分離した。水層をとり、２戒のクロロホルムで
２回洗浄してチオホスゲンを除去した。

約２＋ｎＩ２の水層に、４ｏｏｔｉｙのＢＡＬＢ／Ｃマ
ウスの血清アルブミンを含む０．３ＭＮａＣＱ　　−０
，１Ｍ　　　　ＮａＨＣＯ３液　（ｐＨ９，０）の２ｍ
Ｑを加え、１８時間室温で反応ざせた。尚、上記アルブ
ミンは、後記の免疫するＢＡＬＢ／Ｃマウスと同系のマ
ウス血清５戒を抗マウスアルブミン−ウサギＩＣＩ（１
Ｃ１１ｆｆ＞をセファロース４Ｂに固定化したカラムに
かけ、４０ｍＭアンモニアで溶出させる、免疫吸着体を
用いて精製したものを使用した。

上記によって得た、目的のｒ−ＧＴＰ糖鎖−ＢＡＬＢ／
Ｃマウスアルブミンの複合体を水に対して一晩透析し、
−３０℃に保存した。

かくして、γ−ＧＴＰ糖鎖とＢＡＬＢ／Ｃマウス血清ア
ルブミンとが結合した目的の糖鎖抗原３９μ３を得た。

■　抗体の製造上記■で得た糖鎖抗原の１５μｓを、等量の７ジユバン
ド（Ｆ　ｒｅｕｎｄ’ｓ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕ
ｖａｎｔ　）と混合して、ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、皮下
投与し、１０日後に同量追加免疫した。更に７日目に、
アジュバントを用いずに糖鎖抗原（７，５μ３）を腹腔
内投与して最終免疫とした。尚−部血清（ポリクローナ
ル抗体）を採取して、オフタロニーテスト（Ｐｒｏｇ、
　Ａ　ｌｌｅｒｇｙ１９５８：６：３Ｏ−１５４）を行
った結果、上記■で得たγ−ＧＴＰ＠鎖との間で単一の
沈降線を与えた。

上記最終免疫の３日後に牌臓を摘出して牌細胞を調製し
、常法に従って、Ｎ５−１　（ｍｏｕｓｅｐｌａｓｍａ
ｃｙｔｏｍａ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ＞と、３０％ポリエ
チレングリコール１５００（片山化学曲）及び１０％Ｄ
ＭＳＯを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて細胞融合
した。

融合細胞は組織培養プレート（＃３０４０゜Ｆａｌｃｏ
ｎ　　Ｐ　１ａｓｔｉｃ）を使用して、リトルフィール
ド（Ｌ　１ｔｔｌｅ−ｆｉｅｌｄ　）の方法（３ｃｉｅ
ｎｃｅ１９６４　；１４５　ニア０９−７１５）に従つ
−て、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン含有
培地を用いて選択した。

所望の融合細胞は、抗ヒト腎γ−ＧＴＰヤギＩＣＩＧを
コートしたポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｉ
ｍｍｕｎｏｌａｔｅ　　１　：Ａ／５Ｎｕｎｃ）を用い
る呑口等の方法（ＪＮＣＩ、１９８５　：　７５　：８
４１−８４７）によってスクリーニングし、限界希釈法
に従ってクローン化した。

かくして所望の特異反応性を有するモノクローナル抗体
を産生する融合細胞を得、該細胞の培養により、目的の
糖鎖抗体（モノクローナル抗体）を得た。該抗体は、上
記ＥＬＩＳＡによれば、ヒト肝癌及びヒト腎癌由来のγ
−ＧＴＰと反応しヒト正常肝γ−ＧＴＰとは低い反応性
しか示さなかった。又、イムノグロブリン・アイソタイ
プは、オフタロニー法によりＩＯＭと確認された。

■　糖鎖抗体の反応特異性前記■において、ＮａＢＨｚのかわりにＮａＢ３Ｈｚを
使用することにより、３日−ラベルされたγ−ＧＴＰ糖
鎮を得糖鎖種々の濃度の該糖鎖と上記■で得た抗体（モ
ノクローナル抗体）とを反応させ、抗原抗体複合物をミ
リポアフィルタ−上に捕捉させることにより、抗原抗体
反応の測定を行った。

その結果、上記モノクローナル抗体は、３日−ラベルし
たγ−ＧＴＰ糖鎖と抗原抗体複合物を形成し、その量は
、γ−ＧＴＰ糖鎖に濃度依存性を示した。又、この反応
系に、前もって、精製γ−ＧＴＰを加えた結果、抗原抗
体複合物の形成の阻害が認められた。このことより上記
■で得られた糖鎖抗体は、γ−ＧＴＰ糖鎖の特異抗体で
あることが確認された。

尚、ウェスタン・プロッティング（ｐｒＯｃ。

Ｎａｔｌ　、Ａｃａｄ　、　Ｓｃｉ、　、　　（１９７
９）　、　７６゜４３５０−４３５４）により、該抗体
は、Ｔ−ＧＴＰの大サブユニットの糖鎖と反応すること
が確認された。

参考例実施例で得た糖鎖抗体を用いて各種患者の血清診断を試
みた。即ち、２μ９／’１００μＱ濃度の糖鎖抗体（モ
ノクローナル抗体）の５０ｍＭ炭酸塩−重炭酸塩緩衝液
（ｐＨ９，６＞溶液を、ポリスチレンマイクロタイター
プレートのウェルに加え、室温で２時間放置し不溶化し
た。１％（Ｗ／■）オブアルブミンのＰＢＳ溶液にてブ
ロック後、０．０５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ＞２０を含
むＰＢＳにて洗浄して不溶化抗体を得た。

被検ヒト血清は、０．１％オブアルプミンを含むＰＢＳ
にて、１００〜４００倍軸釈してサンプルとし、その１
００μＱを上記、抗体がコートされた各ウェルに加えた
。４℃で一部インキュベーション後、ＰＢＳで２回洗浄
し、同様にアルカリフォスファターゼで標識した抗ヒト
腎γＧＴＰ−ＩｇＧを反応させるサンドイツチ法によっ
て測定を行った（呑口他、ＣＡＮＣＥＲＲｅｓ、　７５
゜５８３５−５８．１９８５）。

その結果、肝癌、転移性肝癌、卵巣癌、子宮癌、肝炎の
一部などで高値を示す例が多く、又白血病、食道癌、胆
石、すい臓癌などでは陰性であった。

本発明により得られる糖鎖抗体は、臨床診断に充分に利
用できることが確認された。

（以　上）

Claims

【特許請求の範囲】

１　糖鎖に特異的な抗体を製造する方法であつて、該糖
鎖のキャリアー蛋白として免疫する哺乳動物の自己蛋白
を用いることを特徴とする糖鎖抗体の製造法。