JPH03277295A - 人体液中に存在する分子量7万〜30万のコリンエステラーゼに反応するモノクローナル抗体 - Google Patents
人体液中に存在する分子量7万〜30万のコリンエステラーゼに反応するモノクローナル抗体Info
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
[産業上の利用分野]
本発明は、人体液中に存在する分子量7万〜30万のコ
リンエステラーゼ (Small Cholinesterase、以下r
scEJと略称する)に特異的反応性を有するモノクロ
ーナル抗体に関する。
リンエステラーゼ (Small Cholinesterase、以下r
scEJと略称する)に特異的反応性を有するモノクロ
ーナル抗体に関する。
[従来の技術]
コリンエステラーゼChol 1nesterase(
3,1,1,8)は、コリンエステルをコリンと有機酸
に加水分解する酵素をいうが、血清コリンエステラーゼ
はアセチルコリンの外、種々のコリンエステル並びに非
コリン性エステルをも水解する非特異性酵素(Pseu
do−cho l i nesterase)であり、
シアル酸を含む分子量44万(4量体)、22万(2量
体)。
3,1,1,8)は、コリンエステルをコリンと有機酸
に加水分解する酵素をいうが、血清コリンエステラーゼ
はアセチルコリンの外、種々のコリンエステル並びに非
コリン性エステルをも水解する非特異性酵素(Pseu
do−cho l i nesterase)であり、
シアル酸を含む分子量44万(4量体)、22万(2量
体)。
11万(単量体〉の糖蛋白質でおる。測定方法は、アセ
チルコリン、アセチルチオコリン、ブチルコリン、ブチ
ルチオコリンなどを基質とし、血清を作用させ氷解によ
り生じた酢酸またはコリンを測定する。
チルコリン、アセチルチオコリン、ブチルコリン、ブチ
ルチオコリンなどを基質とし、血清を作用させ氷解によ
り生じた酢酸またはコリンを測定する。
[発明が解決しようとする課題]
血清コリンエステラーゼは、肝で生産され血清に供給さ
れることから肝実質障害に際して鋭敏に活性低下を来た
すことにより、その測定は重要な肝機能検査の一つとし
て行なわれている。また、コリンエステラーゼは、コレ
ステロールエステルが蓄積している動脈硬化病巣に存在
していることから、蓄積脂質に対して作用している可能
性も考えられ、脂質代謝、更には動脈硬化症への関与が
示唆されており、その研究が着目されている。
れることから肝実質障害に際して鋭敏に活性低下を来た
すことにより、その測定は重要な肝機能検査の一つとし
て行なわれている。また、コリンエステラーゼは、コレ
ステロールエステルが蓄積している動脈硬化病巣に存在
していることから、蓄積脂質に対して作用している可能
性も考えられ、脂質代謝、更には動脈硬化症への関与が
示唆されており、その研究が着目されている。
しかしながら、血中にはコリンエステラーゼC基質であ
る短鎖脂肪酸エステルが存在しないことにより、コリン
エステラーゼの生理的役割はいまだ充分明らかにされて
いない[Kutty、 K、M、。
る短鎖脂肪酸エステルが存在しないことにより、コリン
エステラーゼの生理的役割はいまだ充分明らかにされて
いない[Kutty、 K、M、。
Reviev、 Biological funit+
on ofcholinesterase、 clin
、 Biochem、 13,239−243(158
0)1゜ましてや全体の活性の10%以下である牛量体
、2量体のコリンエステラーゼについては、その生理的
役割は全く不明でおる。
on ofcholinesterase、 clin
、 Biochem、 13,239−243(158
0)1゜ましてや全体の活性の10%以下である牛量体
、2量体のコリンエステラーゼについては、その生理的
役割は全く不明でおる。
従って、コリンエステラーゼの更に詳細な性状の検討及
び作用機序の解析のための分離精製技術測定技術の確立
が要求されている。
び作用機序の解析のための分離精製技術測定技術の確立
が要求されている。
本発明は、前記のような観点より成されたもので、人体
液中に存在するSCEに特異的反応性を有するモノクロ
ーナル抗体を提供することを目的とするものでおる。
液中に存在するSCEに特異的反応性を有するモノクロ
ーナル抗体を提供することを目的とするものでおる。
1課題を解決するための手段および作用]上記目的を達
成するため、本発明は、コリンエステラーゼを免疫した
哺乳動物の免疫細胞と哺乳人体液中に存在するSCEに
特異的反応性を有することを特徴とするモノクローナル
抗体8要旨としている。
成するため、本発明は、コリンエステラーゼを免疫した
哺乳動物の免疫細胞と哺乳人体液中に存在するSCEに
特異的反応性を有することを特徴とするモノクローナル
抗体8要旨としている。
そして、本発明によって得られたモノクローナル抗体を
使用することにより、SCEを免疫学的に精製及び測定
することをも可能にした。
使用することにより、SCEを免疫学的に精製及び測定
することをも可能にした。
本発明モノクローナル抗体は、コリンエステラーゼで免
疫した哺乳動物の免疫細胞と哺乳動物の骨髄種縮胞との
細胞融合により産生され、SCEに特異的反応性を有す
ることが最大の特徴である。
疫した哺乳動物の免疫細胞と哺乳動物の骨髄種縮胞との
細胞融合により産生され、SCEに特異的反応性を有す
ることが最大の特徴である。
以下、更に本発明モノクローナル抗体について詳述する
。
。
免疫原として用いられるコリンエステラーゼは、文献等
に記載されている方法によって調整されるもの[Bio
chemica et 13iophysica Ac
ta、570(1979)88−95等]及びSCEの
精製品等、SCEを含むものであれば、いずれも使用で
きる。また、免疫抗原で免疫される哺乳動物としては、
特に限定する必要はないが、細胞融合に使用する形質細
胞種細胞との適合性を考慮して選択することが好ましく
、一般には、マウス、ラット等が有利に使用される。
に記載されている方法によって調整されるもの[Bio
chemica et 13iophysica Ac
ta、570(1979)88−95等]及びSCEの
精製品等、SCEを含むものであれば、いずれも使用で
きる。また、免疫抗原で免疫される哺乳動物としては、
特に限定する必要はないが、細胞融合に使用する形質細
胞種細胞との適合性を考慮して選択することが好ましく
、一般には、マウス、ラット等が有利に使用される。
免疫は、−船釣方法により、例えば上記免疫抗原を哺乳
動物に静脈内、皮内、皮下若しくは腹腔内性@等により
投与することにより行なわれる。
動物に静脈内、皮内、皮下若しくは腹腔内性@等により
投与することにより行なわれる。
より具体的には、免疫原を所望により通常のアジュバン
トとの併用により、動物に2〜14日毎に数回投与し総
投与量が約100〜1000/、(に]/マウス程度に
なるようにするのが好ましい。免疫細胞としては、上記
最終投与の約3日後に摘出した牌臓細胞を使用すること
が好ましい。
トとの併用により、動物に2〜14日毎に数回投与し総
投与量が約100〜1000/、(に]/マウス程度に
なるようにするのが好ましい。免疫細胞としては、上記
最終投与の約3日後に摘出した牌臓細胞を使用すること
が好ましい。
また、上記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての
哺乳動物の形質細胞種細胞としては、既に公知の種々の
細胞株、例えばE)3 (p3/X63−A Q 8
> [Nature、 256,495−497(19
75)] 、p3−LJ 1 ICurrent To
pics in Microbiology andI
mmunology、 81.1−7(1978)]
、N5−1 [Eur、 J。
哺乳動物の形質細胞種細胞としては、既に公知の種々の
細胞株、例えばE)3 (p3/X63−A Q 8
> [Nature、 256,495−497(19
75)] 、p3−LJ 1 ICurrent To
pics in Microbiology andI
mmunology、 81.1−7(1978)]
、N5−1 [Eur、 J。
Immunol、、 6,511−519(1976)
L MPC−11[Ce1L 8,405−415(1
97B)] 、5P−210[Nature、 276
.269−2γ0(1978)] 、FO[J。
L MPC−11[Ce1L 8,405−415(1
97B)] 、5P−210[Nature、 276
.269−2γ0(1978)] 、FO[J。
Immunol、 MeTH,、35,1−21(1
980)]、 X63. 6゜5、3. [J、 I
mmunOl、、 123,1548−1550(19
79)]、S 194 [J、 Exp、 Med、、
148,313−323(197B)]等や、ラット
におけるR 210 [Nat−0re、 277、1
31−133(1979月等の骨髄種縮胞等が使用され
る。
980)]、 X63. 6゜5、3. [J、 I
mmunOl、、 123,1548−1550(19
79)]、S 194 [J、 Exp、 Med、、
148,313−323(197B)]等や、ラット
におけるR 210 [Nat−0re、 277、1
31−133(1979月等の骨髄種縮胞等が使用され
る。
上記免疫細胞と形質細胞種細胞との融合反応は、基本的
には、公知の方法、例えばマイルスタイン(t4i l
5tein)らの方法[Method in Enzy
mology、 V。
には、公知の方法、例えばマイルスタイン(t4i l
5tein)らの方法[Method in Enzy
mology、 V。
、 73.pp3(1981)]等に準じて行ない)q
る。より具体的には上記融合反応は、例えば融合促進剤
の存在下に通常の栄養培地中で行なわれる。融合促進剤
としては、通常用いられるもの、例えばポリエチレング
リコール(PEG> 、センダイウィルス(HVJ>等
が使用され、更に所望により融合効率を高めるために、
ジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することも
できる。免疫細胞と形質細胞種細胞との使用比は、通常
の方法と変りがなく、例えば形質細胞種細胞に対し、免
疫細胞を約1〜10倍程度用いればよい。上記融合時の
培地としては、例えば上記形質細胞種細胞株の増殖に使
用されるような、RPMI−1640培地、MEM培地
、その他この種の細胞培養に使用される通常の各種培地
を利用でき、通常は牛胎児血清(Fe2>等の血清補液
を抜いておくのがよい。
る。より具体的には上記融合反応は、例えば融合促進剤
の存在下に通常の栄養培地中で行なわれる。融合促進剤
としては、通常用いられるもの、例えばポリエチレング
リコール(PEG> 、センダイウィルス(HVJ>等
が使用され、更に所望により融合効率を高めるために、
ジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することも
できる。免疫細胞と形質細胞種細胞との使用比は、通常
の方法と変りがなく、例えば形質細胞種細胞に対し、免
疫細胞を約1〜10倍程度用いればよい。上記融合時の
培地としては、例えば上記形質細胞種細胞株の増殖に使
用されるような、RPMI−1640培地、MEM培地
、その他この種の細胞培養に使用される通常の各種培地
を利用でき、通常は牛胎児血清(Fe2>等の血清補液
を抜いておくのがよい。
融合は、上記免疫細胞と形質細胞種細胞との所定量を上
記培地内でよく混合し、予め37℃程度に加熱温度した
PEG溶液、例えば平均分子量1゜OOO〜6.○OO
程度のものを、通常培地に約30〜60W/V%の濃度
で加えて混ぜ合せることにより行なわれる。以後、過当
な培地を逐次添加して遠心し、上清を除去する操作を繰
返すことにJ:り所望のハイブリドーマが形成される。
記培地内でよく混合し、予め37℃程度に加熱温度した
PEG溶液、例えば平均分子量1゜OOO〜6.○OO
程度のものを、通常培地に約30〜60W/V%の濃度
で加えて混ぜ合せることにより行なわれる。以後、過当
な培地を逐次添加して遠心し、上清を除去する操作を繰
返すことにJ:り所望のハイブリドーマが形成される。
得られる所望のハイブリドーマの分離は、通常の選択用
培地、例えばHAT培地(ヒポキサンチン、アミツブ1
ノテン及びチミジンを含む培地)で培養することにより
行なわれる。このHAT培地での培養は、目的とするハ
イブリドーマ以外の細胞(未融合細胞等)が死滅するの
に充分な時間、通常数日〜数週間行なえばよい。かくし
て得られるハイブリドーマは、通常の限界希釈法に従い
、目的とする抗体の産生株の検索及び単一クローン化が
行なわれる。
培地、例えばHAT培地(ヒポキサンチン、アミツブ1
ノテン及びチミジンを含む培地)で培養することにより
行なわれる。このHAT培地での培養は、目的とするハ
イブリドーマ以外の細胞(未融合細胞等)が死滅するの
に充分な時間、通常数日〜数週間行なえばよい。かくし
て得られるハイブリドーマは、通常の限界希釈法に従い
、目的とする抗体の産生株の検索及び単一クローン化が
行なわれる。
前記産生株の検索は、例えばELISA法[Engva
ll、 E、、METH,Enzymol、、 70,
419−439(1980月、プラーク法、スポット法
、凝集反応法、オクテロニイー(Ouchter l
ony)法、ラジオイムノアッセイ(RIA)法等の一
般に抗体の検出に用いられている種々の方法rLFハイ
ブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社R&D
プランニング発行、pp30−53.昭和57年3月5
日]に従って行なわれる。また、この検索は、前記免疫
抗原を使用して行なわれる。
ll、 E、、METH,Enzymol、、 70,
419−439(1980月、プラーク法、スポット法
、凝集反応法、オクテロニイー(Ouchter l
ony)法、ラジオイムノアッセイ(RIA)法等の一
般に抗体の検出に用いられている種々の方法rLFハイ
ブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社R&D
プランニング発行、pp30−53.昭和57年3月5
日]に従って行なわれる。また、この検索は、前記免疫
抗原を使用して行なわれる。
かくして得られるSCEを認識する抗体を産生ずるハイ
ブリドーマは、通常の培地て継代培養することができ、
また液体窒素中で長期間保存することができる。
ブリドーマは、通常の培地て継代培養することができ、
また液体窒素中で長期間保存することができる。
前記ハイブリドーマからの本発明モノクローナル抗体の
採取は、このハイブリドーマを常法に従って培養し、そ
の培養上清として得る方法、或いはハイ1リドーマをこ
れと適合性のある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹
水として得る方法等が採用される。前者の方法は、高純
度の抗体を得るのに適しており、後者の方法は、抗体の
大量生産に適している。また、上記により)qられる抗
体は、更に、塩析、ゲルai過法、アフィニティクロマ
トグラフィー等の通常の精製手段により精製することも
てきる。
採取は、このハイブリドーマを常法に従って培養し、そ
の培養上清として得る方法、或いはハイ1リドーマをこ
れと適合性のある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹
水として得る方法等が採用される。前者の方法は、高純
度の抗体を得るのに適しており、後者の方法は、抗体の
大量生産に適している。また、上記により)qられる抗
体は、更に、塩析、ゲルai過法、アフィニティクロマ
トグラフィー等の通常の精製手段により精製することも
てきる。
本発明モノクローナル抗体は、SC圧に極めて高い特異
的反応性を有するので、これを利用してSCEの精製及
び測定を行なうことができる。従って、本発明は、上記
特定の抗体を使用するSCEの免疫学的精製法及びSC
Eの免疫学的測定法をも提供するものである。
的反応性を有するので、これを利用してSCEの精製及
び測定を行なうことができる。従って、本発明は、上記
特定の抗体を使用するSCEの免疫学的精製法及びSC
Eの免疫学的測定法をも提供するものである。
SCEの精製及び測定は、本発明のモノクローナル抗体
を使用する以外の基本操作は、常法に従って行なわれる
。以下、SCEの測定法を詳述する。
を使用する以外の基本操作は、常法に従って行なわれる
。以下、SCEの測定法を詳述する。
SCEの測定は、公知の通常の免疫検定法、例えばRI
A法、酵素免疫測定法(EIA)等に従つて行なうこと
かでき、これらの各免疫検定法における操作、手順等は
一般に採用されているそれらと特に異ならず、例えば公
知の直接法、間接法、競合法、サンドイツチ法等に準じ
ることができる。
A法、酵素免疫測定法(EIA)等に従つて行なうこと
かでき、これらの各免疫検定法における操作、手順等は
一般に採用されているそれらと特に異ならず、例えば公
知の直接法、間接法、競合法、サンドイツチ法等に準じ
ることができる。
診断を目的とする場合には、上記測定法において、検体
として細胞、組織片及び/又は各種体液が使用される。
として細胞、組織片及び/又は各種体液が使用される。
検体として細胞及び7/又は組織片を使用する場合は、
通常の直接ないし間接免疫法に従い行なわれる。この方
法によれば、生理食塩水又は通常のリン酸塩緩衝液(P
BS)等の緩衝液中に浮遊した細胞に、又はガラススラ
イド等の上に固定した細胞ないし組織切片に、本発明モ
ノクローナル抗体を免疫反応させ、細胞又は組織片を上
記緩衝液で充分に洗浄後、通常通りに細胞又は組織片に
結合した本発明モノクローナル抗体の存在を直接ないし
間接に検定すればよい。上記検定の為の標識剤は、一部
俊述するが、通常の蛍光又は酵素等が利用できる。
通常の直接ないし間接免疫法に従い行なわれる。この方
法によれば、生理食塩水又は通常のリン酸塩緩衝液(P
BS)等の緩衝液中に浮遊した細胞に、又はガラススラ
イド等の上に固定した細胞ないし組織切片に、本発明モ
ノクローナル抗体を免疫反応させ、細胞又は組織片を上
記緩衝液で充分に洗浄後、通常通りに細胞又は組織片に
結合した本発明モノクローナル抗体の存在を直接ないし
間接に検定すればよい。上記検定の為の標識剤は、一部
俊述するが、通常の蛍光又は酵素等が利用できる。
測定材料として体液を使用する場合もまた常法に従うこ
とができる。ここで体液としては、例えば血液、細胞組
織液、リンパ液、1水、腹水、羊水、胃液、尿、すい液
、髄液、唾液等又は前記の細胞又は組織片の可溶化後の
遠Iム上清等を使用することかできる。
とができる。ここで体液としては、例えば血液、細胞組
織液、リンパ液、1水、腹水、羊水、胃液、尿、すい液
、髄液、唾液等又は前記の細胞又は組織片の可溶化後の
遠Iム上清等を使用することかできる。
不溶化法(不溶化抗原または不溶化抗体を用いる方法)
を採用する場合は、常法に従い上記SCF又は本発明モ
ノクローナル抗体は、不溶性担体に化学的又は物理的に
反応させることにより製造される。ここで不溶性担体と
しては、例えばセルロース粉末、セファデックス、セフ
ァ0−ス、ポリスチレン、濾紙、カルボキシメチルセル
ロース、イオン交換樹脂、デキストラン、プラスチック
フィルム、プラスチックチューブ、ナイロン、ガラスピ
ーズ、絹、ポリアミン−メチルビニルエーテル−マレイ
ン酸共重合体、アミノ酸共重合体、エチレン−マレイン
酸共重合体等を使用できる。不溶化は、共有結合法とし
てのジアゾ法、ペプチド法(酸アミド誘導体法、カルボ
キシクロリド樹脂法、カルボジイミド樹脂法、無水マレ
イン酸誘導体法、イソシアナート誘導体法、臭化シアン
活性化多糖化法、セルロースカルボナート誘導体法、縮
合試薬を使用する方法等)、アルキル化法、架橋試薬に
よる担体結合法(架橋試薬としてゲルタールアルデヒド
、ヘキサメチレンイソシアナート等を用いる)、Ugi
反応による担体結合法等の化学的反応、あるいはイオン
交換樹脂のような担体を用いるイオン結合法、ガラスピ
ーズ等の多孔性ガラスを担体として用いる物理的吸着法
によって行なわれる。
を採用する場合は、常法に従い上記SCF又は本発明モ
ノクローナル抗体は、不溶性担体に化学的又は物理的に
反応させることにより製造される。ここで不溶性担体と
しては、例えばセルロース粉末、セファデックス、セフ
ァ0−ス、ポリスチレン、濾紙、カルボキシメチルセル
ロース、イオン交換樹脂、デキストラン、プラスチック
フィルム、プラスチックチューブ、ナイロン、ガラスピ
ーズ、絹、ポリアミン−メチルビニルエーテル−マレイ
ン酸共重合体、アミノ酸共重合体、エチレン−マレイン
酸共重合体等を使用できる。不溶化は、共有結合法とし
てのジアゾ法、ペプチド法(酸アミド誘導体法、カルボ
キシクロリド樹脂法、カルボジイミド樹脂法、無水マレ
イン酸誘導体法、イソシアナート誘導体法、臭化シアン
活性化多糖化法、セルロースカルボナート誘導体法、縮
合試薬を使用する方法等)、アルキル化法、架橋試薬に
よる担体結合法(架橋試薬としてゲルタールアルデヒド
、ヘキサメチレンイソシアナート等を用いる)、Ugi
反応による担体結合法等の化学的反応、あるいはイオン
交換樹脂のような担体を用いるイオン結合法、ガラスピ
ーズ等の多孔性ガラスを担体として用いる物理的吸着法
によって行なわれる。
標識抗原又は標識抗体としては、前記SCE又は本発明
モノクローナル抗体を、通常の放射性物質、酵素標識物
質、蛍光物質等の各擾標識剤で標識化したものが用いら
れる。この標識剤としての放射性物質としては、125
−1等の放射性ヨード等を、蛍光物質としては、フルオ
レッセイン・イソチオシアナート(F1丁C)、テトラ
メチルローダミン・イソチオシアナート(TRI丁C)
、置換ローダミン・イソチオシアナート(XRITC)
、ローダミンB・イソチオシアナート、ジクロロトリア
ジンフルオレッセイン(DTAF)等を、酵素標識物質
としては、パーオキシダーゼ(POX)、アルカリフォ
スファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、マイクロパーオ
キシダーゼ、キモトリプシノーゲン、プロカルボキシペ
プチダーゼ、グリセロアルデヒド−3−リン酸脱水素酵
素、アミラーゼ、ホスホリラーゼ、D−ナーゼ、Rナー
ゼ等をそれぞれ挙げることができる。これらによる標識
方法もまた常法に従うことができるrLJ、 Biol
、 chem7.254.9349−9351(197
9)Nature、 194,495(1962);蛍
光抗体法、医化学実験講座No4,263−270;
Acta、Endocrinol、 5uppl、16
8.206(1972); Proc、 Nat、 A
Cad、 Sci、、USA。
モノクローナル抗体を、通常の放射性物質、酵素標識物
質、蛍光物質等の各擾標識剤で標識化したものが用いら
れる。この標識剤としての放射性物質としては、125
−1等の放射性ヨード等を、蛍光物質としては、フルオ
レッセイン・イソチオシアナート(F1丁C)、テトラ
メチルローダミン・イソチオシアナート(TRI丁C)
、置換ローダミン・イソチオシアナート(XRITC)
、ローダミンB・イソチオシアナート、ジクロロトリア
ジンフルオレッセイン(DTAF)等を、酵素標識物質
としては、パーオキシダーゼ(POX)、アルカリフォ
スファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、マイクロパーオ
キシダーゼ、キモトリプシノーゲン、プロカルボキシペ
プチダーゼ、グリセロアルデヒド−3−リン酸脱水素酵
素、アミラーゼ、ホスホリラーゼ、D−ナーゼ、Rナー
ゼ等をそれぞれ挙げることができる。これらによる標識
方法もまた常法に従うことができるrLJ、 Biol
、 chem7.254.9349−9351(197
9)Nature、 194,495(1962);蛍
光抗体法、医化学実験講座No4,263−270;
Acta、Endocrinol、 5uppl、16
8.206(1972); Proc、 Nat、 A
Cad、 Sci、、USA。
57、713(1967)等参照J。
本発明における検体中の被検物質SCEの測定・定量方
法は、上記不溶化抗原、不溶化抗体、標識抗原及び標識
抗体のいずれかを用いて免疫反応させることにより実施
される。その際測定系に利用される溶媒としては、反応
に悪影響を与えない通常のもの、例えばクエン酸緩衡液
、リン酸緩耐液、トリス−塩酸緩衝液、ホウM緩衝液、
酢酸緩衝液等のDH4〜8程度の緩衝液を好ましいもの
として例示できる。また、測定の際の免疫反応条件は特
に制限はなく、通常のこの種測定法と同様のものとする
ことかできる。即ち、前記免疫反応は一般に45℃以下
、好ましくは約4〜40℃の温度条件下、1〜40時間
を要して行なわれる。
法は、上記不溶化抗原、不溶化抗体、標識抗原及び標識
抗体のいずれかを用いて免疫反応させることにより実施
される。その際測定系に利用される溶媒としては、反応
に悪影響を与えない通常のもの、例えばクエン酸緩衡液
、リン酸緩耐液、トリス−塩酸緩衝液、ホウM緩衝液、
酢酸緩衝液等のDH4〜8程度の緩衝液を好ましいもの
として例示できる。また、測定の際の免疫反応条件は特
に制限はなく、通常のこの種測定法と同様のものとする
ことかできる。即ち、前記免疫反応は一般に45℃以下
、好ましくは約4〜40℃の温度条件下、1〜40時間
を要して行なわれる。
免疫反応終了後の結合体及び遊離体(B−F>の分離も
公知の方法に従い、例えば不溶化法を採用したときは、
遠心分離、濾別、洗浄、デカンテーション等の分離手段
により固相一液相を分離することができる。その他の場
合には、例えばデキストラン−活性炭法、第2抗体法等
の常法に従えばよい。
公知の方法に従い、例えば不溶化法を採用したときは、
遠心分離、濾別、洗浄、デカンテーション等の分離手段
により固相一液相を分離することができる。その他の場
合には、例えばデキストラン−活性炭法、第2抗体法等
の常法に従えばよい。
上記測定法を実施するのに特に便利な方法は、キットを
使用する方法である。このようなキットには、抗体試薬
として本発明モノクローナル抗体を含有せしめることが
重要である。この抗体試薬には、グリセロールや生血清
蛋白のような安定化剤及び/又は保存剤を添加すること
ができる。好ましくは、この抗体試薬は凍結乾燥したも
のであリ、キットには水溶性もしくは水と混和しうる溶
媒を含有させることができる。更にこの抗体試薬には、
再構成された試薬系を一定のI)Hに保つための緩衝液
及び/又は使用前に試料が悪化するのを防ぐための保存
剤及び/又は安定剤を添加することができる。緩衝液は
キット試薬の必須成分とは考えられないが、上記測定法
を実施する際に、p)−1を4〜8程度とするものを用
いるのが好ましい。また、再構成剤は好ましくは水を含
んだものでおるが、水の一部又は全部を水と混和し得る
溶媒で置き換えることもできる。水と混和し得る溶媒と
しては当業者に周知であり、例えばグリセリン、アルコ
ール類、グリコール類、グリコールエーテル類等を使用
できる。
使用する方法である。このようなキットには、抗体試薬
として本発明モノクローナル抗体を含有せしめることが
重要である。この抗体試薬には、グリセロールや生血清
蛋白のような安定化剤及び/又は保存剤を添加すること
ができる。好ましくは、この抗体試薬は凍結乾燥したも
のであリ、キットには水溶性もしくは水と混和しうる溶
媒を含有させることができる。更にこの抗体試薬には、
再構成された試薬系を一定のI)Hに保つための緩衝液
及び/又は使用前に試料が悪化するのを防ぐための保存
剤及び/又は安定剤を添加することができる。緩衝液は
キット試薬の必須成分とは考えられないが、上記測定法
を実施する際に、p)−1を4〜8程度とするものを用
いるのが好ましい。また、再構成剤は好ましくは水を含
んだものでおるが、水の一部又は全部を水と混和し得る
溶媒で置き換えることもできる。水と混和し得る溶媒と
しては当業者に周知であり、例えばグリセリン、アルコ
ール類、グリコール類、グリコールエーテル類等を使用
できる。
[実施例]
1: 免疫原の精製
新鮮人血清200m&を10mMリン酸カリウム緩衝液
(pH8,0)に対して4℃以下で24時間透析した。
(pH8,0)に対して4℃以下で24時間透析した。
次に、これを同緩衝液で平衡化したTrimethyl
ammonium anilinium 230mg
結合5epharO3eカラム(2,5X10al
>に付し、同M衝液200dで洗浄後、20077ZM
NaCLを含む同緩衝液で目的酵素の溶出を行なった
。これを50mM NaCLを含む10mMリンIII
tIi衝液で透析後、再度 Trimethyl am
monium aniliniumSepharose
カラムに付し、同緩衝液200dで洗浄後、OmMから
200mM NaCLまで濃度勾配をかけ、目的酵素を
含む分画を分離した。更に、これを10mMリン酸カリ
ウム!!衝液で透析後、同緩衝液で平衡化されてDEA
E−3ephadeXカラム(1,2X16CIt>に
付し、10mMリン酸カリウム緩衝液から200mMリ
ン酸緩衝液まで濃度勾配をかけ、SCEを含むコリンエ
ステラーゼ0、51FJを得た。これは、透析、濃縮後
、20℃以下に保存した。
ammonium anilinium 230mg
結合5epharO3eカラム(2,5X10al
>に付し、同M衝液200dで洗浄後、20077ZM
NaCLを含む同緩衝液で目的酵素の溶出を行なった
。これを50mM NaCLを含む10mMリンIII
tIi衝液で透析後、再度 Trimethyl am
monium aniliniumSepharose
カラムに付し、同緩衝液200dで洗浄後、OmMから
200mM NaCLまで濃度勾配をかけ、目的酵素を
含む分画を分離した。更に、これを10mMリン酸カリ
ウム!!衝液で透析後、同緩衝液で平衡化されてDEA
E−3ephadeXカラム(1,2X16CIt>に
付し、10mMリン酸カリウム緩衝液から200mMリ
ン酸緩衝液まで濃度勾配をかけ、SCEを含むコリンエ
ステラーゼ0、51FJを得た。これは、透析、濃縮後
、20℃以下に保存した。
2; ハイブリドーマの作製
免疫原とフロイントコンブリードアシュバンドを1:1
に混合し、その250μ!(免疫原20μq)をBa
I b/cマウス(♀、8連合)の背中に皮肉注射した
。更に、2週間間隔で計6回、同量免疫した。最終免疫
の3日後に稗臓を摘出し、牌細胞をRPMI−1640
培地で3回洗浄する。マウス骨髄種縮胞株N5−1を同
様に洗浄後、このN5−1.2.2x10E7個と、上
記牌細胞1゜6X10E8個を50rnf!遠心管に入
れ混合する。
に混合し、その250μ!(免疫原20μq)をBa
I b/cマウス(♀、8連合)の背中に皮肉注射した
。更に、2週間間隔で計6回、同量免疫した。最終免疫
の3日後に稗臓を摘出し、牌細胞をRPMI−1640
培地で3回洗浄する。マウス骨髄種縮胞株N5−1を同
様に洗浄後、このN5−1.2.2x10E7個と、上
記牌細胞1゜6X10E8個を50rnf!遠心管に入
れ混合する。
200×Ω、5分遠心後、上清をパスツールピペットで
除去する。37℃に保温したポリエチレングリコール4
000(シグマ社製>50w/v%のRPMI−164
0溶液0.5dを1分かけて滴下し、7分間ゆっくり混
合する。37℃に保温した15%FC3、lff1Mピ
ルベートのRPM11640(以下「完全RPMI−1
640Jと略称する>1dを加え1分間、更に同量の完
全RPMI−1640を加え1分間、次いで8Id!の
完全RPMIを滴下し、2分間ゆっくりと撹1半する。
除去する。37℃に保温したポリエチレングリコール4
000(シグマ社製>50w/v%のRPMI−164
0溶液0.5dを1分かけて滴下し、7分間ゆっくり混
合する。37℃に保温した15%FC3、lff1Mピ
ルベートのRPM11640(以下「完全RPMI−1
640Jと略称する>1dを加え1分間、更に同量の完
全RPMI−1640を加え1分間、次いで8Id!の
完全RPMIを滴下し、2分間ゆっくりと撹1半する。
200xc+、5分遠心後、上清を除去し、37℃保温
完全RPMI−1640に細胞lX10E7個/!d!
となる様に懸濁し、マイクロテスト−I・プレート(フ
ァルコン社製)に100μ2ずつ接種し、37℃、5%
炭酸ガスインキュベーター内で培養する。24時間後1
.OX10E−4Mヒポキサンチン、4.OXloE−
7Mアミノプテリン、1.6X10E−5Mチミジンを
含む上記完全RPMI−1640(以下rHAT培地」
と略称する>100μ2を各ウェルに添加する。以後上
清の半分を第2.3,5.8及び11日目に、夫々、新
しいHAT培地に換え、14日目に同様に上清の半分を
、1.Ox10E−4Mヒポキサンチン、1.6X10
E−5Mチミジンを含む完全RPMI−1640(以下
rHA培地Jと略称する)に換える。同様に第18.2
0.23及び26日目に上清の半分をHT培地に換え、
第288目に上清の半分を完全RPMI−1640に換
える。以後、この完全RPMI−1640で増殖維持す
る。かくして得られるハイブリドーマは、これを限界希
釈法によりクローニング化した。即ち、ハイブリドーマ
3個/d、Ba I b/cマウス胸腺細胞1X10−
E7/rdとなる様に完全RPMIに調整し、この0.
2m/ウェルとなる様に96ウエルのプレートにまき培
養した。増殖してくるハイブリドーマを更に同様にクロ
ーニング化した。目的の抗体を産生するクローンの検索
は、免疫原を5ephacryl S−300(2,5
x90cm)に付し、SCE及び分子ff130万〜5
0万のコリンエステラーゼを分離し、それぞれの分画の
7μg/ウェルをコートした96ウエルプレート(ダイ
ナチックラボラトリ−社製)を用い、パーオキシダーゼ
標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体を使用したELI
SA法により行なった。かくしてクローンNQSCE−
29で表わされる所望のハイブリドーマを得た。
完全RPMI−1640に細胞lX10E7個/!d!
となる様に懸濁し、マイクロテスト−I・プレート(フ
ァルコン社製)に100μ2ずつ接種し、37℃、5%
炭酸ガスインキュベーター内で培養する。24時間後1
.OX10E−4Mヒポキサンチン、4.OXloE−
7Mアミノプテリン、1.6X10E−5Mチミジンを
含む上記完全RPMI−1640(以下rHAT培地」
と略称する>100μ2を各ウェルに添加する。以後上
清の半分を第2.3,5.8及び11日目に、夫々、新
しいHAT培地に換え、14日目に同様に上清の半分を
、1.Ox10E−4Mヒポキサンチン、1.6X10
E−5Mチミジンを含む完全RPMI−1640(以下
rHA培地Jと略称する)に換える。同様に第18.2
0.23及び26日目に上清の半分をHT培地に換え、
第288目に上清の半分を完全RPMI−1640に換
える。以後、この完全RPMI−1640で増殖維持す
る。かくして得られるハイブリドーマは、これを限界希
釈法によりクローニング化した。即ち、ハイブリドーマ
3個/d、Ba I b/cマウス胸腺細胞1X10−
E7/rdとなる様に完全RPMIに調整し、この0.
2m/ウェルとなる様に96ウエルのプレートにまき培
養した。増殖してくるハイブリドーマを更に同様にクロ
ーニング化した。目的の抗体を産生するクローンの検索
は、免疫原を5ephacryl S−300(2,5
x90cm)に付し、SCE及び分子ff130万〜5
0万のコリンエステラーゼを分離し、それぞれの分画の
7μg/ウェルをコートした96ウエルプレート(ダイ
ナチックラボラトリ−社製)を用い、パーオキシダーゼ
標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体を使用したELI
SA法により行なった。かくしてクローンNQSCE−
29で表わされる所望のハイブリドーマを得た。
3; 抗体の作製
(1) 前記2で得たクローンNQSCE−29のハイ
ブリドーマを完全RPMI〜1640培地にて5%炭酸
ガスインキュベーター中で、37℃にて48時間培養し
た。培養液を遠心分離(3,OOOrpm、10分〉し
て、本発明のモノクローナル抗体を含む培養上清を取得
した。
ブリドーマを完全RPMI〜1640培地にて5%炭酸
ガスインキュベーター中で、37℃にて48時間培養し
た。培養液を遠心分離(3,OOOrpm、10分〉し
て、本発明のモノクローナル抗体を含む培養上清を取得
した。
(2) 前記2で得たクローンNα5CE−29の各ハ
イブリドーマ1x10E6個をRPMI−1640培地
0.5ml1に懸濁し、あらかじめプリスタン(0,!
M/マウス)を投与した13alb/Cマウスに腹腔内
投与した。10日後、蓄積した腹水を採取し、夫々抗体
SCE〜29を含む腹水4〜8d/マウスを得た。これ
らの抗体濃度は何れも1〜10IRg/Idでおった。
イブリドーマ1x10E6個をRPMI−1640培地
0.5ml1に懸濁し、あらかじめプリスタン(0,!
M/マウス)を投与した13alb/Cマウスに腹腔内
投与した。10日後、蓄積した腹水を採取し、夫々抗体
SCE〜29を含む腹水4〜8d/マウスを得た。これ
らの抗体濃度は何れも1〜10IRg/Idでおった。
4; 抗体の性状
免疫グロブリンクラス:
各種マウス免疫グロブリンクラスに対するウサギ抗体(
Li↑ton、 B10r>etico、 Inc、
KenSlngtOn。
Li↑ton、 B10r>etico、 Inc、
KenSlngtOn。
HD20795)及び125−I標識プロティンAを使
用してYeh等の方法に準じて行なった。[Hin(7
−Yang Yeh et al、 Proc、 Na
tl、 Acad、 Sc+、 USA。
用してYeh等の方法に準じて行なった。[Hin(7
−Yang Yeh et al、 Proc、 Na
tl、 Acad、 Sc+、 USA。
Vol、76、 No、6.pp、2927−2931
(1979) ]。
(1979) ]。
結果を下記第1表に示す。
5: 抗体の特異性
(1)
本発明抗体の反応待費性を以下の2サンプルを用い、E
LISA法で行なった。
LISA法で行なった。
サンプル1:前記1で得た免疫原を5ephacryl
S−300(2,5x90cm)に付し、分子量30万
〜50万の分画を集め、7μ9/rdに調整した。
S−300(2,5x90cm)に付し、分子量30万
〜50万の分画を集め、7μ9/rdに調整した。
サンプル2: サンプル1と同様に免疫原を5epha
cryl S−300(2,5x90cm)に付し、S
CE分画を集め7μg/dに調整した。
cryl S−300(2,5x90cm)に付し、S
CE分画を集め7μg/dに調整した。
上記サンプルと本発明モノクローナル抗体との反応性を
前記1のクローンの検索と同様にして、ELISA法に
従い試験した。その結果、本発明モノクローナル抗体は
SCEと反応することが確認された。
前記1のクローンの検索と同様にして、ELISA法に
従い試験した。その結果、本発明モノクローナル抗体は
SCEと反応することが確認された。
(2〉
人血清11Id!を5ephacryl S−300に
付し得られた各画と本モノクローナル抗体との反応性を
EIA法により検定した。即ち、本モノクローナル抗体
固相化ELISAプレート(96穴平底プレート)に試
料を50μm/well加え室温で2時間反応させる。
付し得られた各画と本モノクローナル抗体との反応性を
EIA法により検定した。即ち、本モノクローナル抗体
固相化ELISAプレート(96穴平底プレート)に試
料を50μm/well加え室温で2時間反応させる。
次に、未反応物質を除去後、酸素標識コリンエステラー
ゼモノクローナル抗体を室温で2時間反応させる。最後
に未反応物質を除去)麦、基質を加え反応を行ない、そ
の発色度合より本モノクローナル抗体との反応性を測定
した。
ゼモノクローナル抗体を室温で2時間反応させる。最後
に未反応物質を除去)麦、基質を加え反応を行ない、そ
の発色度合より本モノクローナル抗体との反応性を測定
した。
第1図に示す如く、血清中に存在するコリンエステラー
ゼはその90%以上か分子量30〜50万であり、残り
の10%以下がSCEである。本モノクローナル抗体は
、第2図に示す如く、分子量7万〜30万のコリンエス
テラーゼと反応することが確認された。
ゼはその90%以上か分子量30〜50万であり、残り
の10%以下がSCEである。本モノクローナル抗体は
、第2図に示す如く、分子量7万〜30万のコリンエス
テラーゼと反応することが確認された。
なお、コリンエステラーゼの測定は、コリンE試薬(国
際試薬〉を用いて行なった。
際試薬〉を用いて行なった。
(3)
健常者、肝硬変患者及び脂肪肝患者血清中のSCEの測
定結果を第3図に示す。健常者と比較し肝硬変患者では
低値を示し、脂肪肝患者では高値を示す。
定結果を第3図に示す。健常者と比較し肝硬変患者では
低値を示し、脂肪肝患者では高値を示す。
[発明の効果]
本モノクローナル抗体は、SCEに特異的に反応するの
で、この抗体を利用すれば免疫学的測定技術及び免疫学
的精製技術が提供される。そして被検者のSCEの測定
を行なえば、例えば肝硬変。
で、この抗体を利用すれば免疫学的測定技術及び免疫学
的精製技術が提供される。そして被検者のSCEの測定
を行なえば、例えば肝硬変。
脂肪肝等の肝障害の診断が可能である。
第1図は、ゲル濾過法を用いて人血清中に存在するコリ
ンエステラーゼの分子量の分布図、第2図は、本モノク
ローナル抗体と反応するコリンエステラーゼの分子量の
分布図、第3図は、健常者。 肝硬変患者及び脂肪肝患者の血清中のSCEの測定結果
である。 平成 2年 3月27日 n=17 n=5 第 図 分Of!52m//1ube セフ77911/S−300(15xlooCm)
り07 トク−7Vl %”r!4’ ヒトhH%1
ml腹イ會丁I(ニス=11貨鴬j啼テ々−す!し季1
1小二(0,1M pH72)←−→490nmnO
RtrL(コ1ル1ス↑フーj−7=j、ajC”−−
−−’)280nmf)d171第2 図
ンエステラーゼの分子量の分布図、第2図は、本モノク
ローナル抗体と反応するコリンエステラーゼの分子量の
分布図、第3図は、健常者。 肝硬変患者及び脂肪肝患者の血清中のSCEの測定結果
である。 平成 2年 3月27日 n=17 n=5 第 図 分Of!52m//1ube セフ77911/S−300(15xlooCm)
り07 トク−7Vl %”r!4’ ヒトhH%1
ml腹イ會丁I(ニス=11貨鴬j啼テ々−す!し季1
1小二(0,1M pH72)←−→490nmnO
RtrL(コ1ル1ス↑フーj−7=j、ajC”−−
−−’)280nmf)d171第2 図
Claims (1)
- 1 コリンエステラーゼを免疫した哺乳動物の免疫細胞
と哺乳動物の骨髄種縮胞との融合細胞により産生され、
人体液中に存在する分子量7万〜30万のコリンエステ
ラーゼに特異的反応性を有することを特徴とするモノク
ローナル抗体。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2075748A JPH0630620B2 (ja) | 1990-03-27 | 1990-03-27 | 人体液中に存在する分子量7万〜30万のコリンエステラーゼに反応するモノクローナル抗体 |
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0738890A1 (en) * | 1995-04-18 | 1996-10-23 | Tosoh Corporation | Method for measuring cholinesterase and method for distinguishing between liver cirrhosis and hepatitis |
CN102827826A (zh) * | 2012-09-11 | 2012-12-19 | 赵永祥 | 一种诱导树突状细胞与肿瘤细胞融合的方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH02245195A (ja) * | 1989-03-20 | 1990-09-28 | Nippon Shibayama Hitsuji Center:Kk | 人血漿中に存在する分子量7万〜14万のコリンエステラーゼに特異的反応性を有するモノクローナル抗体 |
-
1990
- 1990-03-27 JP JP2075748A patent/JPH0630620B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
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---|---|---|---|---|
JPH02245195A (ja) * | 1989-03-20 | 1990-09-28 | Nippon Shibayama Hitsuji Center:Kk | 人血漿中に存在する分子量7万〜14万のコリンエステラーゼに特異的反応性を有するモノクローナル抗体 |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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EP0738890A1 (en) * | 1995-04-18 | 1996-10-23 | Tosoh Corporation | Method for measuring cholinesterase and method for distinguishing between liver cirrhosis and hepatitis |
US6333162B1 (en) | 1995-04-18 | 2001-12-25 | Tosoh Corporation | Method for measuring cholinesterase and method for distinguishing between liver cirrhosis and hepatitis |
CN102827826A (zh) * | 2012-09-11 | 2012-12-19 | 赵永祥 | 一种诱导树突状细胞与肿瘤细胞融合的方法 |
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Publication number | Publication date |
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JPH0630620B2 (ja) | 1994-04-27 |
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