JPH03277295A - 人体液中に存在する分子量７万〜３０万のコリンエステラーゼに反応するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、人体液中に存在する分子量７万〜３０万のコ
リンエステラーゼ （Ｓｍａｌｌ　Ｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ、以下ｒ
ｓｃＥＪと略称する）に特異的反応性を有するモノクロ
ーナル抗体に関する。

［従来の技術］ コリンエステラーゼＣｈｏｌ　１ｎｅｓｔｅｒａｓｅ（
３，１，１，８）は、コリンエステルをコリンと有機酸
に加水分解する酵素をいうが、血清コリンエステラーゼ
はアセチルコリンの外、種々のコリンエステル並びに非
コリン性エステルをも水解する非特異性酵素（Ｐｓｅｕ
ｄｏ−ｃｈｏ　ｌ　ｉ　ｎｅｓｔｅｒａｓｅ）であり、
シアル酸を含む分子量４４万（４量体）、２２万（２量
体）。

１１万（単量体〉の糖蛋白質でおる。測定方法は、アセ
チルコリン、アセチルチオコリン、ブチルコリン、ブチ
ルチオコリンなどを基質とし、血清を作用させ氷解によ
り生じた酢酸またはコリンを測定する。

［発明が解決しようとする課題］ 血清コリンエステラーゼは、肝で生産され血清に供給さ
れることから肝実質障害に際して鋭敏に活性低下を来た
すことにより、その測定は重要な肝機能検査の一つとし
て行なわれている。また、コリンエステラーゼは、コレ
ステロールエステルが蓄積している動脈硬化病巣に存在
していることから、蓄積脂質に対して作用している可能
性も考えられ、脂質代謝、更には動脈硬化症への関与が
示唆されており、その研究が着目されている。

しかしながら、血中にはコリンエステラーゼＣ基質であ
る短鎖脂肪酸エステルが存在しないことにより、コリン
エステラーゼの生理的役割はいまだ充分明らかにされて
いない［Ｋｕｔｔｙ、　Ｋ、Ｍ、。

Ｒｅｖｉｅｖ、　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｆｕｎｉｔ＋
ｏｎ　ｏｆｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ、　ｃｌｉｎ
、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３，２３９−２４３（１５８
０）１゜ましてや全体の活性の１０％以下である牛量体
、２量体のコリンエステラーゼについては、その生理的
役割は全く不明でおる。

従って、コリンエステラーゼの更に詳細な性状の検討及
び作用機序の解析のための分離精製技術測定技術の確立
が要求されている。

本発明は、前記のような観点より成されたもので、人体
液中に存在するＳＣＥに特異的反応性を有するモノクロ
ーナル抗体を提供することを目的とするものでおる。

１課題を解決するための手段および作用］上記目的を達
成するため、本発明は、コリンエステラーゼを免疫した
哺乳動物の免疫細胞と哺乳人体液中に存在するＳＣＥに
特異的反応性を有することを特徴とするモノクローナル
抗体８要旨としている。

そして、本発明によって得られたモノクローナル抗体を
使用することにより、ＳＣＥを免疫学的に精製及び測定
することをも可能にした。

本発明モノクローナル抗体は、コリンエステラーゼで免
疫した哺乳動物の免疫細胞と哺乳動物の骨髄種縮胞との
細胞融合により産生され、ＳＣＥに特異的反応性を有す
ることが最大の特徴である。

以下、更に本発明モノクローナル抗体について詳述する
。

免疫原として用いられるコリンエステラーゼは、文献等
に記載されている方法によって調整されるもの［Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａ　ｅｔ　１３ｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃ
ｔａ、５７０（１９７９）８８−９５等］及びＳＣＥの
精製品等、ＳＣＥを含むものであれば、いずれも使用で
きる。また、免疫抗原で免疫される哺乳動物としては、
特に限定する必要はないが、細胞融合に使用する形質細
胞種細胞との適合性を考慮して選択することが好ましく
、一般には、マウス、ラット等が有利に使用される。

免疫は、−船釣方法により、例えば上記免疫抗原を哺乳
動物に静脈内、皮内、皮下若しくは腹腔内性＠等により
投与することにより行なわれる。

より具体的には、免疫原を所望により通常のアジュバン
トとの併用により、動物に２〜１４日毎に数回投与し総
投与量が約１００〜１０００／、（に］／マウス程度に
なるようにするのが好ましい。免疫細胞としては、上記
最終投与の約３日後に摘出した牌臓細胞を使用すること
が好ましい。

また、上記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての
哺乳動物の形質細胞種細胞としては、既に公知の種々の
細胞株、例えばＥ）３　（ｐ３／Ｘ６３−Ａ　Ｑ　８　
＞　［Ｎａｔｕｒｅ、　２５６，４９５−４９７（１９
７５）］　、ｐ３−ＬＪ　１　ＩＣｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏ
ｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄＩ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　８１．１−７（１９７８）］　
、Ｎ５−１　［Ｅｕｒ、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　６，５１１−５１９（１９７６）
Ｌ　ＭＰＣ−１１［Ｃｅ１Ｌ　８，４０５−４１５（１
９７Ｂ）］　、５Ｐ−２１０［Ｎａｔｕｒｅ、　２７６
．２６９−２γ０（１９７８）］　、ＦＯ［Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　ＭｅＴＨ，、３５，１−２１（１
９８０）］、　Ｘ６３．　　６゜５、３．　［Ｊ、　Ｉ
ｍｍｕｎＯｌ、、　１２３，１５４８−１５５０（１９
７９）］、Ｓ　１９４　［Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、
　１４８，３１３−３２３（１９７Ｂ）］等や、ラット
におけるＲ　２１０　［Ｎａｔ−０ｒｅ、　２７７、１
３１−１３３（１９７９月等の骨髄種縮胞等が使用され
る。

上記免疫細胞と形質細胞種細胞との融合反応は、基本的
には、公知の方法、例えばマイルスタイン（ｔ４ｉ　ｌ
５ｔｅｉｎ）らの方法［Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ、　Ｖ。

、　７３．ｐｐ３（１９８１）］等に準じて行ない）ｑ
る。より具体的には上記融合反応は、例えば融合促進剤
の存在下に通常の栄養培地中で行なわれる。融合促進剤
としては、通常用いられるもの、例えばポリエチレング
リコール（ＰＥＧ＞　、センダイウィルス（ＨＶＪ＞等
が使用され、更に所望により融合効率を高めるために、
ジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することも
できる。免疫細胞と形質細胞種細胞との使用比は、通常
の方法と変りがなく、例えば形質細胞種細胞に対し、免
疫細胞を約１〜１０倍程度用いればよい。上記融合時の
培地としては、例えば上記形質細胞種細胞株の増殖に使
用されるような、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地
、その他この種の細胞培養に使用される通常の各種培地
を利用でき、通常は牛胎児血清（Ｆｅ２＞等の血清補液
を抜いておくのがよい。

融合は、上記免疫細胞と形質細胞種細胞との所定量を上
記培地内でよく混合し、予め３７℃程度に加熱温度した
ＰＥＧ溶液、例えば平均分子量１゜ＯＯＯ〜６．○ＯＯ
程度のものを、通常培地に約３０〜６０Ｗ／Ｖ％の濃度
で加えて混ぜ合せることにより行なわれる。以後、過当
な培地を逐次添加して遠心し、上清を除去する操作を繰
返すことにＪ：り所望のハイブリドーマが形成される。

得られる所望のハイブリドーマの分離は、通常の選択用
培地、例えばＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミツブ１
ノテン及びチミジンを含む培地）で培養することにより
行なわれる。このＨＡＴ培地での培養は、目的とするハ
イブリドーマ以外の細胞（未融合細胞等）が死滅するの
に充分な時間、通常数日〜数週間行なえばよい。かくし
て得られるハイブリドーマは、通常の限界希釈法に従い
、目的とする抗体の産生株の検索及び単一クローン化が
行なわれる。

前記産生株の検索は、例えばＥＬＩＳＡ法［Ｅｎｇｖａ
ｌｌ、　Ｅ、、ＭＥＴＨ，Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　７０，
４１９−４３９（１９８０月、プラーク法、スポット法
、凝集反応法、オクテロニイー（Ｏｕｃｈｔｅｒ　ｌ　
ｏｎｙ）法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法等の一
般に抗体の検出に用いられている種々の方法ｒＬＦハイ
ブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄ
プランニング発行、ｐｐ３０−５３．昭和５７年３月５
日］に従って行なわれる。また、この検索は、前記免疫
抗原を使用して行なわれる。

かくして得られるＳＣＥを認識する抗体を産生ずるハイ
ブリドーマは、通常の培地て継代培養することができ、
また液体窒素中で長期間保存することができる。

前記ハイブリドーマからの本発明モノクローナル抗体の
採取は、このハイブリドーマを常法に従って培養し、そ
の培養上清として得る方法、或いはハイ１リドーマをこ
れと適合性のある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹
水として得る方法等が採用される。前者の方法は、高純
度の抗体を得るのに適しており、後者の方法は、抗体の
大量生産に適している。また、上記により）ｑられる抗
体は、更に、塩析、ゲルａｉ過法、アフィニティクロマ
トグラフィー等の通常の精製手段により精製することも
てきる。

本発明モノクローナル抗体は、ＳＣ圧に極めて高い特異
的反応性を有するので、これを利用してＳＣＥの精製及
び測定を行なうことができる。従って、本発明は、上記
特定の抗体を使用するＳＣＥの免疫学的精製法及びＳＣ
Ｅの免疫学的測定法をも提供するものである。

ＳＣＥの精製及び測定は、本発明のモノクローナル抗体
を使用する以外の基本操作は、常法に従って行なわれる
。以下、ＳＣＥの測定法を詳述する。

ＳＣＥの測定は、公知の通常の免疫検定法、例えばＲＩ
Ａ法、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）等に従つて行なうこと
かでき、これらの各免疫検定法における操作、手順等は
一般に採用されているそれらと特に異ならず、例えば公
知の直接法、間接法、競合法、サンドイツチ法等に準じ
ることができる。

診断を目的とする場合には、上記測定法において、検体
として細胞、組織片及び／又は各種体液が使用される。

検体として細胞及び７／又は組織片を使用する場合は、
通常の直接ないし間接免疫法に従い行なわれる。この方
法によれば、生理食塩水又は通常のリン酸塩緩衝液（Ｐ
ＢＳ）等の緩衝液中に浮遊した細胞に、又はガラススラ
イド等の上に固定した細胞ないし組織切片に、本発明モ
ノクローナル抗体を免疫反応させ、細胞又は組織片を上
記緩衝液で充分に洗浄後、通常通りに細胞又は組織片に
結合した本発明モノクローナル抗体の存在を直接ないし
間接に検定すればよい。上記検定の為の標識剤は、一部
俊述するが、通常の蛍光又は酵素等が利用できる。

測定材料として体液を使用する場合もまた常法に従うこ
とができる。ここで体液としては、例えば血液、細胞組
織液、リンパ液、１水、腹水、羊水、胃液、尿、すい液
、髄液、唾液等又は前記の細胞又は組織片の可溶化後の
遠Ｉム上清等を使用することかできる。

不溶化法（不溶化抗原または不溶化抗体を用いる方法）
を採用する場合は、常法に従い上記ＳＣＦ又は本発明モ
ノクローナル抗体は、不溶性担体に化学的又は物理的に
反応させることにより製造される。ここで不溶性担体と
しては、例えばセルロース粉末、セファデックス、セフ
ァ０−ス、ポリスチレン、濾紙、カルボキシメチルセル
ロース、イオン交換樹脂、デキストラン、プラスチック
フィルム、プラスチックチューブ、ナイロン、ガラスピ
ーズ、絹、ポリアミン−メチルビニルエーテル−マレイ
ン酸共重合体、アミノ酸共重合体、エチレン−マレイン
酸共重合体等を使用できる。不溶化は、共有結合法とし
てのジアゾ法、ペプチド法（酸アミド誘導体法、カルボ
キシクロリド樹脂法、カルボジイミド樹脂法、無水マレ
イン酸誘導体法、イソシアナート誘導体法、臭化シアン
活性化多糖化法、セルロースカルボナート誘導体法、縮
合試薬を使用する方法等）、アルキル化法、架橋試薬に
よる担体結合法（架橋試薬としてゲルタールアルデヒド
、ヘキサメチレンイソシアナート等を用いる）、Ｕｇｉ
反応による担体結合法等の化学的反応、あるいはイオン
交換樹脂のような担体を用いるイオン結合法、ガラスピ
ーズ等の多孔性ガラスを担体として用いる物理的吸着法
によって行なわれる。

標識抗原又は標識抗体としては、前記ＳＣＥ又は本発明
モノクローナル抗体を、通常の放射性物質、酵素標識物
質、蛍光物質等の各擾標識剤で標識化したものが用いら
れる。この標識剤としての放射性物質としては、１２５
−１等の放射性ヨード等を、蛍光物質としては、フルオ
レッセイン・イソチオシアナート（Ｆ１丁Ｃ）、テトラ
メチルローダミン・イソチオシアナート（ＴＲＩ丁Ｃ）
、置換ローダミン・イソチオシアナート（ＸＲＩＴＣ）
、ローダミンＢ・イソチオシアナート、ジクロロトリア
ジンフルオレッセイン（ＤＴＡＦ）等を、酵素標識物質
としては、パーオキシダーゼ（ＰＯＸ）、アルカリフォ
スファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、マイクロパーオ
キシダーゼ、キモトリプシノーゲン、プロカルボキシペ
プチダーゼ、グリセロアルデヒド−３−リン酸脱水素酵
素、アミラーゼ、ホスホリラーゼ、Ｄ−ナーゼ、Ｒナー
ゼ等をそれぞれ挙げることができる。これらによる標識
方法もまた常法に従うことができるｒＬＪ、　Ｂｉｏｌ
、　ｃｈｅｍ７．２５４．９３４９−９３５１（１９７
９）Ｎａｔｕｒｅ、　１９４，４９５（１９６２）；蛍
光抗体法、医化学実験講座Ｎｏ４，２６３−２７０；　
Ａｃｔａ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　５ｕｐｐｌ、１６
８．２０６（１９７２）；　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａ
Ｃａｄ、　Ｓｃｉ、、ＵＳＡ。

５７、７１３（１９６７）等参照Ｊ。

本発明における検体中の被検物質ＳＣＥの測定・定量方
法は、上記不溶化抗原、不溶化抗体、標識抗原及び標識
抗体のいずれかを用いて免疫反応させることにより実施
される。その際測定系に利用される溶媒としては、反応
に悪影響を与えない通常のもの、例えばクエン酸緩衡液
、リン酸緩耐液、トリス−塩酸緩衝液、ホウＭ緩衝液、
酢酸緩衝液等のＤＨ４〜８程度の緩衝液を好ましいもの
として例示できる。また、測定の際の免疫反応条件は特
に制限はなく、通常のこの種測定法と同様のものとする
ことかできる。即ち、前記免疫反応は一般に４５℃以下
、好ましくは約４〜４０℃の温度条件下、１〜４０時間
を要して行なわれる。

免疫反応終了後の結合体及び遊離体（Ｂ−Ｆ＞の分離も
公知の方法に従い、例えば不溶化法を採用したときは、
遠心分離、濾別、洗浄、デカンテーション等の分離手段
により固相一液相を分離することができる。その他の場
合には、例えばデキストラン−活性炭法、第２抗体法等
の常法に従えばよい。

上記測定法を実施するのに特に便利な方法は、キットを
使用する方法である。このようなキットには、抗体試薬
として本発明モノクローナル抗体を含有せしめることが
重要である。この抗体試薬には、グリセロールや生血清
蛋白のような安定化剤及び／又は保存剤を添加すること
ができる。好ましくは、この抗体試薬は凍結乾燥したも
のであリ、キットには水溶性もしくは水と混和しうる溶
媒を含有させることができる。更にこの抗体試薬には、
再構成された試薬系を一定のＩ）Ｈに保つための緩衝液
及び／又は使用前に試料が悪化するのを防ぐための保存
剤及び／又は安定剤を添加することができる。緩衝液は
キット試薬の必須成分とは考えられないが、上記測定法
を実施する際に、ｐ）−１を４〜８程度とするものを用
いるのが好ましい。また、再構成剤は好ましくは水を含
んだものでおるが、水の一部又は全部を水と混和し得る
溶媒で置き換えることもできる。水と混和し得る溶媒と
しては当業者に周知であり、例えばグリセリン、アルコ
ール類、グリコール類、グリコールエーテル類等を使用
できる。

［実施例］ １：　免疫原の精製 新鮮人血清２００ｍ＆を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ８，０）に対して４℃以下で２４時間透析した。

次に、これを同緩衝液で平衡化したＴｒｉｍｅｔｈｙｌ
　ａｍｍｏｎｉｕｍ　ａｎｉｌｉｎｉｕｍ　２３０ｍｇ
　　結合５ｅｐｈａｒＯ３ｅカラム（２，５Ｘ１０ａｌ
＞に付し、同Ｍ衝液２００ｄで洗浄後、２００７７ＺＭ
　ＮａＣＬを含む同緩衝液で目的酵素の溶出を行なった
。これを５０ｍＭ　ＮａＣＬを含む１０ｍＭリンＩＩＩ
ｔＩｉ衝液で透析後、再度　Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ　ａｍ
ｍｏｎｉｕｍ　ａｎｉｌｉｎｉｕｍＳｅｐｈａｒｏｓｅ
カラムに付し、同緩衝液２００ｄで洗浄後、ＯｍＭから
２００ｍＭ　ＮａＣＬまで濃度勾配をかけ、目的酵素を
含む分画を分離した。更に、これを１０ｍＭリン酸カリ
ウム！！衝液で透析後、同緩衝液で平衡化されてＤＥＡ
Ｅ−３ｅｐｈａｄｅＸカラム（１，２Ｘ１６ＣＩｔ＞に
付し、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液から２００ｍＭリ
ン酸緩衝液まで濃度勾配をかけ、ＳＣＥを含むコリンエ
ステラーゼ０、５１ＦＪを得た。これは、透析、濃縮後
、２０℃以下に保存した。

２；　ハイブリドーマの作製 免疫原とフロイントコンブリードアシュバンドを１：１
に混合し、その２５０μ！（免疫原２０μｑ）をＢａ　
Ｉ　ｂ／ｃマウス（♀、８連合）の背中に皮肉注射した
。更に、２週間間隔で計６回、同量免疫した。最終免疫
の３日後に稗臓を摘出し、牌細胞をＲＰＭＩ−１６４０
培地で３回洗浄する。マウス骨髄種縮胞株Ｎ５−１を同
様に洗浄後、このＮ５−１．２．２ｘ１０Ｅ７個と、上
記牌細胞１゜６Ｘ１０Ｅ８個を５０ｒｎｆ！遠心管に入
れ混合する。

２００×Ω、５分遠心後、上清をパスツールピペットで
除去する。３７℃に保温したポリエチレングリコール４
０００（シグマ社製＞５０ｗ／ｖ％のＲＰＭＩ−１６４
０溶液０．５ｄを１分かけて滴下し、７分間ゆっくり混
合する。３７℃に保温した１５％ＦＣ３、ｌｆｆ１Ｍピ
ルベートのＲＰＭ１１６４０（以下「完全ＲＰＭＩ−１
６４０Ｊと略称する＞１ｄを加え１分間、更に同量の完
全ＲＰＭＩ−１６４０を加え１分間、次いで８Ｉｄ！の
完全ＲＰＭＩを滴下し、２分間ゆっくりと撹１半する。

２００ｘｃ＋、５分遠心後、上清を除去し、３７℃保温
完全ＲＰＭＩ−１６４０に細胞ｌＸ１０Ｅ７個／！ｄ！
となる様に懸濁し、マイクロテスト−Ｉ・プレート（フ
ァルコン社製）に１００μ２ずつ接種し、３７℃、５％
炭酸ガスインキュベーター内で培養する。２４時間後１
．ＯＸ１０Ｅ−４Ｍヒポキサンチン、４．ＯＸｌｏＥ−
７Ｍアミノプテリン、１．６Ｘ１０Ｅ−５Ｍチミジンを
含む上記完全ＲＰＭＩ−１６４０（以下ｒＨＡＴ培地」
と略称する＞１００μ２を各ウェルに添加する。以後上
清の半分を第２．３，５．８及び１１日目に、夫々、新
しいＨＡＴ培地に換え、１４日目に同様に上清の半分を
、１．Ｏｘ１０Ｅ−４Ｍヒポキサンチン、１．６Ｘ１０
Ｅ−５Ｍチミジンを含む完全ＲＰＭＩ−１６４０（以下
ｒＨＡ培地Ｊと略称する）に換える。同様に第１８．２
０．２３及び２６日目に上清の半分をＨＴ培地に換え、
第２８８目に上清の半分を完全ＲＰＭＩ−１６４０に換
える。以後、この完全ＲＰＭＩ−１６４０で増殖維持す
る。かくして得られるハイブリドーマは、これを限界希
釈法によりクローニング化した。即ち、ハイブリドーマ
３個／ｄ、Ｂａ　Ｉ　ｂ／ｃマウス胸腺細胞１Ｘ１０−
Ｅ７／ｒｄとなる様に完全ＲＰＭＩに調整し、この０．
２ｍ／ウェルとなる様に９６ウエルのプレートにまき培
養した。増殖してくるハイブリドーマを更に同様にクロ
ーニング化した。目的の抗体を産生するクローンの検索
は、免疫原を５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−３００（２，５
ｘ９０ｃｍ）に付し、ＳＣＥ及び分子ｆｆ１３０万〜５
０万のコリンエステラーゼを分離し、それぞれの分画の
７μｇ／ウェルをコートした９６ウエルプレート（ダイ
ナチックラボラトリ−社製）を用い、パーオキシダーゼ
標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体を使用したＥＬＩ
ＳＡ法により行なった。かくしてクローンＮＱＳＣＥ−
２９で表わされる所望のハイブリドーマを得た。

３；　抗体の作製 （１）　前記２で得たクローンＮＱＳＣＥ−２９のハイ
ブリドーマを完全ＲＰＭＩ〜１６４０培地にて５％炭酸
ガスインキュベーター中で、３７℃にて４８時間培養し
た。培養液を遠心分離（３，ＯＯＯｒｐｍ、１０分〉し
て、本発明のモノクローナル抗体を含む培養上清を取得
した。

（２）　前記２で得たクローンＮα５ＣＥ−２９の各ハ
イブリドーマ１ｘ１０Ｅ６個をＲＰＭＩ−１６４０培地
０．５ｍｌ１に懸濁し、あらかじめプリスタン（０，！
Ｍ／マウス）を投与した１３ａｌｂ／Ｃマウスに腹腔内
投与した。１０日後、蓄積した腹水を採取し、夫々抗体
ＳＣＥ〜２９を含む腹水４〜８ｄ／マウスを得た。これ
らの抗体濃度は何れも１〜１０ＩＲｇ／Ｉｄでおった。

４；　抗体の性状 免疫グロブリンクラス： 各種マウス免疫グロブリンクラスに対するウサギ抗体（
Ｌｉ↑ｔｏｎ、　Ｂ１０ｒ＞ｅｔｉｃｏ、　Ｉｎｃ、　
ＫｅｎＳｌｎｇｔＯｎ。

ＨＤ２０７９５）及び１２５−Ｉ標識プロティンＡを使
用してＹｅｈ等の方法に準じて行なった。［Ｈｉｎ（７
−Ｙａｎｇ　Ｙｅｈ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ＋、　ＵＳＡ。

Ｖｏｌ、７６、　Ｎｏ、６．ｐｐ、２９２７−２９３１
（１９７９）　］。

結果を下記第１表に示す。

５：　抗体の特異性 （１） 本発明抗体の反応待費性を以下の２サンプルを用い、Ｅ
ＬＩＳＡ法で行なった。

サンプル１：前記１で得た免疫原を５ｅｐｈａｃｒｙｌ
Ｓ−３００（２，５ｘ９０ｃｍ）に付し、分子量３０万
〜５０万の分画を集め、７μ９／ｒｄに調整した。

サンプル２：　サンプル１と同様に免疫原を５ｅｐｈａ
ｃｒｙｌ　Ｓ−３００（２，５ｘ９０ｃｍ）に付し、Ｓ
ＣＥ分画を集め７μｇ／ｄに調整した。

上記サンプルと本発明モノクローナル抗体との反応性を
前記１のクローンの検索と同様にして、ＥＬＩＳＡ法に
従い試験した。その結果、本発明モノクローナル抗体は
ＳＣＥと反応することが確認された。

（２〉 人血清１１Ｉｄ！を５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−３００に
付し得られた各画と本モノクローナル抗体との反応性を
ＥＩＡ法により検定した。即ち、本モノクローナル抗体
固相化ＥＬＩＳＡプレート（９６穴平底プレート）に試
料を５０μｍ／ｗｅｌｌ加え室温で２時間反応させる。

次に、未反応物質を除去後、酸素標識コリンエステラー
ゼモノクローナル抗体を室温で２時間反応させる。最後
に未反応物質を除去）麦、基質を加え反応を行ない、そ
の発色度合より本モノクローナル抗体との反応性を測定
した。

第１図に示す如く、血清中に存在するコリンエステラー
ゼはその９０％以上か分子量３０〜５０万であり、残り
の１０％以下がＳＣＥである。本モノクローナル抗体は
、第２図に示す如く、分子量７万〜３０万のコリンエス
テラーゼと反応することが確認された。

なお、コリンエステラーゼの測定は、コリンＥ試薬（国
際試薬〉を用いて行なった。

（３） 健常者、肝硬変患者及び脂肪肝患者血清中のＳＣＥの測
定結果を第３図に示す。健常者と比較し肝硬変患者では
低値を示し、脂肪肝患者では高値を示す。

［発明の効果］ 本モノクローナル抗体は、ＳＣＥに特異的に反応するの
で、この抗体を利用すれば免疫学的測定技術及び免疫学
的精製技術が提供される。そして被検者のＳＣＥの測定
を行なえば、例えば肝硬変。

脂肪肝等の肝障害の診断が可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ゲル濾過法を用いて人血清中に存在するコリ
ンエステラーゼの分子量の分布図、第２図は、本モノク
ローナル抗体と反応するコリンエステラーゼの分子量の
分布図、第３図は、健常者。 肝硬変患者及び脂肪肝患者の血清中のＳＣＥの測定結果
である。 平成　２年　３月２７日 ｎ＝１７ ｎ＝５ 第 図 分Ｏｆ！５２ｍ／／１ｕｂｅ セフ７７９１１／Ｓ−３００（１５ｘｌｏｏＣｍ）　　
り０７　トク−７Ｖｌ　　％”ｒ！４’　ヒトｈＨ％１
ｍｌ腹イ會丁Ｉ（ニス＝１１貨鴬ｊ啼テ々−す！し季１
１小二（０，１Ｍ　　ｐＨ７２）←−→４９０ｎｍｎＯ
ＲｔｒＬ（コ１ル１ス↑フーｊ−７＝ｊ、ａｊＣ”−−
−−’）２８０ｎｍｆ）ｄ１７１第２ 図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １　コリンエステラーゼを免疫した哺乳動物の免疫細胞
   と哺乳動物の骨髄種縮胞との融合細胞により産生され、
   人体液中に存在する分子量７万〜３０万のコリンエステ
   ラーゼに特異的反応性を有することを特徴とするモノク
   ローナル抗体。