JP2555028B2 - ヒト非−小細胞肺癌に関するモノクロ−ナル抗体 - Google Patents
ヒト非−小細胞肺癌に関するモノクロ−ナル抗体Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 （１）発明の分野 ヒト肺癌は男性における癌腫による多くの死亡の原因
となるものであり、また女性における癌腫死亡の最も頻
繁な原因としての乳癌の侵襲の過程である（キャンサー
ファクツ アンド フィガーズ,1983年［Cancer Fact
s and Figures,1983］）。この疾患は、４つの主な組織
学的タイプ、すなわち類表皮腫（エピデルモイド）（30
％）、腺癌（35％）、未分化大細胞（15％）および小細
胞（20％）に分けることができる。肺癌の多くの症例
は、化学療法および照射療法によって治癒不可能であ
る。小細胞肺癌は、大きさにおける低減によって化学療
法および照射療法に応答するが、全体的な治癒ではな
い。腫瘍の完全な外科手術的除去が唯一有効な療法であ
ると見なされている。しかしながら、予期せぬことに
は、肺癌患者の30％未満が、診断で完全に切除され得る
腫瘍を有しており、また肺癌患者の1/3未満が、外科手
術的完全除去の後５年間生存している。それゆえ、肺癌
のより早期の診断、癌延展の程度のより良好な限定、お
よびより効果的な療法を可能とする方法に対する大きな
必要性が存在する。
となるものであり、また女性における癌腫死亡の最も頻
繁な原因としての乳癌の侵襲の過程である（キャンサー
ファクツ アンド フィガーズ,1983年［Cancer Fact
s and Figures,1983］）。この疾患は、４つの主な組織
学的タイプ、すなわち類表皮腫（エピデルモイド）（30
％）、腺癌（35％）、未分化大細胞（15％）および小細
胞（20％）に分けることができる。肺癌の多くの症例
は、化学療法および照射療法によって治癒不可能であ
る。小細胞肺癌は、大きさにおける低減によって化学療
法および照射療法に応答するが、全体的な治癒ではな
い。腫瘍の完全な外科手術的除去が唯一有効な療法であ
ると見なされている。しかしながら、予期せぬことに
は、肺癌患者の30％未満が、診断で完全に切除され得る
腫瘍を有しており、また肺癌患者の1/3未満が、外科手
術的完全除去の後５年間生存している。それゆえ、肺癌
のより早期の診断、癌延展の程度のより良好な限定、お
よびより効果的な療法を可能とする方法に対する大きな
必要性が存在する。
モノクローナル抗体は、これらのすべての目的のため
に用いられ得るものである。しかしながら、必須条件
は、正常成人組織においてよりもより肺癌において強く
発現される抗原に対する抗体を見出すことである。腫瘍
細胞集団の公知の布均質性、同じ抗原におけるいくつか
の決定基の存在、治療学的標的と比較した場合における
診断マーカーとしてのこれらの好適性に関する抗体間の
予期された違い、および同じ抗原に対する異なる抗体の
異なる生物学的特性の見地において、いくつかの異なる
抗体が必要とされる。
に用いられ得るものである。しかしながら、必須条件
は、正常成人組織においてよりもより肺癌において強く
発現される抗原に対する抗体を見出すことである。腫瘍
細胞集団の公知の布均質性、同じ抗原におけるいくつか
の決定基の存在、治療学的標的と比較した場合における
診断マーカーとしてのこれらの好適性に関する抗体間の
予期された違い、および同じ抗原に対する異なる抗体の
異なる生物学的特性の見地において、いくつかの異なる
抗体が必要とされる。
（２）先行技術の記載 肺癌抗原に対するヒトモノクローナル抗体は、シコラ
ら［Sikora et al.］（ブリテッシュ ジャーナル オ
ブ キャンサー（1981年）［Br.J.Cancer（1981）］）
によって述べられている。いくつかのタイプのヒト肺癌
に関して特異性を示すモノクローナル抗体は、カッチッ
タら［Cuttitta et al.］（プロシーディング オブ
ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシズ オ
ブ ザ ユナイテッド ステート オブ アメリカ（19
81年）78:4591〜4595［Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.（19
81）78:4591−4595］）によって開示されている。モノ
クローナル抗体によって限定されたヒト肺腺癌に関連す
る抗原が、バルキら［Varki et al.］（キャンサー リ
サーチ（1984年）44:681〜687［Cancer Research（198
4）44:681−687］）によって述べられている。
ら［Sikora et al.］（ブリテッシュ ジャーナル オ
ブ キャンサー（1981年）［Br.J.Cancer（1981）］）
によって述べられている。いくつかのタイプのヒト肺癌
に関して特異性を示すモノクローナル抗体は、カッチッ
タら［Cuttitta et al.］（プロシーディング オブ
ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシズ オ
ブ ザ ユナイテッド ステート オブ アメリカ（19
81年）78:4591〜4595［Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.（19
81）78:4591−4595］）によって開示されている。モノ
クローナル抗体によって限定されたヒト肺腺癌に関連す
る抗原が、バルキら［Varki et al.］（キャンサー リ
サーチ（1984年）44:681〜687［Cancer Research（198
4）44:681−687］）によって述べられている。
糖脂質Lex抗原に対するマウスモノクローナル抗体
が、ハコモリら［Hakomori et al.］（バイオケミカル
アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケー
ションズ（1981年）100:1578〜1586［Biochemical and
Biophysical Research Communicaitons（1981）100:157
8−1586］、ブロックホーズら［Brockhaus et al.］
（アーク．バイオケム．バイオフィズ（1982年）217:64
7［Arch.Biochem.Biophys.（1982）217:647］）、フク
シら［Fukushi et al.］（ジャーナル オブ バイオロ
ジー アンド ケミストリー（1984年）259:506［J.Bio
l.Chem.（1984）259:506］）、フクシら（ジェイ．エク
スプ．メド．（1984年）159:506［J.Exp.Med.（1984）1
59:506］）、チャイアら［Chia et al.］（キャンサー
リサーチ（1985年）45:435［Cancer Res.（1985）45:
435］）によって述べられている。Lex抗原に対する抗体
は、アベら［Abe et al.］（ジャーナル オブ バイオ
ロジイ アンド ケミストリー（1983年）258:8934［J.
Biol.Chem.（1983）258:8934］）、リオイドら［Lloyd
et al.］（イムノジェネテックス，（1983年）17:537
［Immunogenetics（1983）17:537］）、ブラウンら［Br
own et al.）（バイオサイ．レプ．（1983年）3:163［B
iosci.Rep.（1983）3:163］）によって述べられてい
る。あらかじめ定められた特異性の抗体を分泌する融合
細胞の連続培養が、コーラーら［Ｋhler et al.］
（ネイチャー（1975年）265:495〜497［Nature（1975）
265:495−497］によって述べられている。
が、ハコモリら［Hakomori et al.］（バイオケミカル
アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケー
ションズ（1981年）100:1578〜1586［Biochemical and
Biophysical Research Communicaitons（1981）100:157
8−1586］、ブロックホーズら［Brockhaus et al.］
（アーク．バイオケム．バイオフィズ（1982年）217:64
7［Arch.Biochem.Biophys.（1982）217:647］）、フク
シら［Fukushi et al.］（ジャーナル オブ バイオロ
ジー アンド ケミストリー（1984年）259:506［J.Bio
l.Chem.（1984）259:506］）、フクシら（ジェイ．エク
スプ．メド．（1984年）159:506［J.Exp.Med.（1984）1
59:506］）、チャイアら［Chia et al.］（キャンサー
リサーチ（1985年）45:435［Cancer Res.（1985）45:
435］）によって述べられている。Lex抗原に対する抗体
は、アベら［Abe et al.］（ジャーナル オブ バイオ
ロジイ アンド ケミストリー（1983年）258:8934［J.
Biol.Chem.（1983）258:8934］）、リオイドら［Lloyd
et al.］（イムノジェネテックス，（1983年）17:537
［Immunogenetics（1983）17:537］）、ブラウンら［Br
own et al.）（バイオサイ．レプ．（1983年）3:163［B
iosci.Rep.（1983）3:163］）によって述べられてい
る。あらかじめ定められた特異性の抗体を分泌する融合
細胞の連続培養が、コーラーら［Ｋhler et al.］
（ネイチャー（1975年）265:495〜497［Nature（1975）
265:495−497］によって述べられている。
発明の概要 本発明は、非−小細胞肺癌（NSCLC,［non−small cel
l lung carcinoma］）細胞に関連する糖質［carbohydra
te］（糖脂質［glycolipid］）抗原における決定部位に
結合する新規なモノクローナル抗体に関するものであ
る。"NSCLC細胞”なる用語は、類表皮含細胞、腺癌細胞
および未分化大細胞癌細胞を含むものである。決定部位
はまた、例えば、乳房のいくつかの癌などのいくつかの
他の癌の抗原において見い出されることができ、そし
て、これゆえ本発明の抗体は、これらの他の癌細胞に対
しても結合する。本発明のモノクローナル抗体は腫瘍細
胞に対するよりもより低い度合で正常成人細胞に結合す
る。”より低い度合での結合”なる用語は、結合が免疫
組織学的技術によって検知することが不可能であろうこ
とおよび腫瘍細胞に対するよりも正常細胞に対してより
弱い結合であるだろうことを意味する。このモノクロー
ナル抗体は、マウスハイブリドーマによって分泌され
る。
l lung carcinoma］）細胞に関連する糖質［carbohydra
te］（糖脂質［glycolipid］）抗原における決定部位に
結合する新規なモノクローナル抗体に関するものであ
る。"NSCLC細胞”なる用語は、類表皮含細胞、腺癌細胞
および未分化大細胞癌細胞を含むものである。決定部位
はまた、例えば、乳房のいくつかの癌などのいくつかの
他の癌の抗原において見い出されることができ、そし
て、これゆえ本発明の抗体は、これらの他の癌細胞に対
しても結合する。本発明のモノクローナル抗体は腫瘍細
胞に対するよりもより低い度合で正常成人細胞に結合す
る。”より低い度合での結合”なる用語は、結合が免疫
組織学的技術によって検知することが不可能であろうこ
とおよび腫瘍細胞に対するよりも正常細胞に対してより
弱い結合であるだろうことを意味する。このモノクロー
ナル抗体は、マウスハイブリドーマによって分泌され
る。
本発明はまた、Ley抗原の特性を有する抗原の存在に
関し肺組織および他のヒト組織を調べることにより肺に
おける悪性状態の存在を測定する方法を含むものであ
る。Lex抗原は、ハコモリら（上記）、ブロックホーズ
ら（上記）、フクシら（上記）およびチャイアら（上
記）によって述べられており、Ley抗原は、アベら（上
記）、リオイドら（上記）およびブラウンら（上記）に
よって述べられている。
関し肺組織および他のヒト組織を調べることにより肺に
おける悪性状態の存在を測定する方法を含むものであ
る。Lex抗原は、ハコモリら（上記）、ブロックホーズ
ら（上記）、フクシら（上記）およびチャイアら（上
記）によって述べられており、Ley抗原は、アベら（上
記）、リオイドら（上記）およびブラウンら（上記）に
よって述べられている。
例えば、被験者からの細胞は、Leyである、あるいはL
eyの特性を有する糖質抗原に関連した細胞における決定
部位に結合する抗体、あるいはこのような抗体のFab,F
（ab′）2又はFvフラグメントと接触され得る。
eyの特性を有する糖質抗原に関連した細胞における決定
部位に結合する抗体、あるいはこのような抗体のFab,F
（ab′）2又はFvフラグメントと接触され得る。
これゆえ本発明は、本発明のモノクローナル抗体を用
いるいくつかの診断方法に関するものである。このよう
な方法のひとつは、NSCLC細胞の存在の、このような細
胞を含んでいるであろうと疑われる検体における、測定
を包含するものである。この検体は、モノクローナル抗
体と接触させられ、そしてこのことは、この検体におい
て存在し得る他の細胞タイプから、このような細胞を識
別できるものである。接触は、抗体のこのような細胞へ
の結合のための条件下で行なわれる。接触の後、検体に
おける抗体のこのような細胞への結合の存在あるいは不
在が測定される。この結合は、検体におけるNSCLC細胞
の存在あるいは不在に関連するものである。一般に、検
体は、モノクローナル抗体に関する標識された特異的結
合パートナーと接触させられる。この標識は、検知可能
な信号を発し得るものである。他の診断方法は、特有に
標識された（例えば放射性同位元素で）、そしてその後
患者中へ注射される抗体あるいは抗体フラグメントの腫
瘍への局在化を包含するものである。この方法は、疾患
の程度に関して癌患者を段階づけるためおよび療法に応
じての変化を観察するためのより良好な方法を提供し得
る。
いるいくつかの診断方法に関するものである。このよう
な方法のひとつは、NSCLC細胞の存在の、このような細
胞を含んでいるであろうと疑われる検体における、測定
を包含するものである。この検体は、モノクローナル抗
体と接触させられ、そしてこのことは、この検体におい
て存在し得る他の細胞タイプから、このような細胞を識
別できるものである。接触は、抗体のこのような細胞へ
の結合のための条件下で行なわれる。接触の後、検体に
おける抗体のこのような細胞への結合の存在あるいは不
在が測定される。この結合は、検体におけるNSCLC細胞
の存在あるいは不在に関連するものである。一般に、検
体は、モノクローナル抗体に関する標識された特異的結
合パートナーと接触させられる。この標識は、検知可能
な信号を発し得るものである。他の診断方法は、特有に
標識された（例えば放射性同位元素で）、そしてその後
患者中へ注射される抗体あるいは抗体フラグメントの腫
瘍への局在化を包含するものである。この方法は、疾患
の程度に関して癌患者を段階づけるためおよび療法に応
じての変化を観察するためのより良好な方法を提供し得
る。
本発明はまた治療的適用を有するものである。抗体
は、腫瘍細胞表面で高い濃度にて発現される上記の抗原
のいずれかあるいは双方と反応し得る。その抗体は、例
えば化学療法製薬剤および放射性同位元素を含む（しか
しながらこれらに限定されるわけではない。）抗腫瘍効
果を有する種々の作用物質の担体として用いられること
ができる。
は、腫瘍細胞表面で高い濃度にて発現される上記の抗原
のいずれかあるいは双方と反応し得る。その抗体は、例
えば化学療法製薬剤および放射性同位元素を含む（しか
しながらこれらに限定されるわけではない。）抗腫瘍効
果を有する種々の作用物質の担体として用いられること
ができる。
特定の実施態様の詳述 本発明は、ヒトNSCLC細胞における抗原に対して結合
する新規な抗体に関するものであり、またこのような抗
体を用いる診断学的および治療学的方法に関するもので
ある。本発明のモノクローナル抗体は、コーラーとミル
ステイン［Ｋhler and Milstein］の標準的技法（上
記）によって製造され得る。例えば、複数の滲出液から
のヒト肺癌細胞、またはヒト非−小細胞肺癌からの培養
細胞、または正常胎児肺からの細胞が、免疫原として用
いられる。これらの細胞は、マウス中へ注射され、十分
な時間の後にマウスは屠殺されそして脾細胞が得られ
る。所望の免疫グロブリンをコードする脾細胞染色体
は、一般的にはポリエチレングリコールの存在下におい
て、脾細胞を骨髄腫細胞とあるいはリンパ腫細胞と融合
することによって不滅化される。融合されたハイブリド
ーマを含む得られた細胞は、HAT培地などのごとき選択
培地において増殖させられ、そして生存細胞がこのよう
な培地において限界希釈条件を用いて増殖される。細胞
は、例えば微小力価ウェル（窪み）［microtiter wel
l］などのような適当な容器中にて増殖され、そして上
澄み液が所望の特異性を有するモノクローナル抗体に関
してスクリーニングされた。
する新規な抗体に関するものであり、またこのような抗
体を用いる診断学的および治療学的方法に関するもので
ある。本発明のモノクローナル抗体は、コーラーとミル
ステイン［Ｋhler and Milstein］の標準的技法（上
記）によって製造され得る。例えば、複数の滲出液から
のヒト肺癌細胞、またはヒト非−小細胞肺癌からの培養
細胞、または正常胎児肺からの細胞が、免疫原として用
いられる。これらの細胞は、マウス中へ注射され、十分
な時間の後にマウスは屠殺されそして脾細胞が得られ
る。所望の免疫グロブリンをコードする脾細胞染色体
は、一般的にはポリエチレングリコールの存在下におい
て、脾細胞を骨髄腫細胞とあるいはリンパ腫細胞と融合
することによって不滅化される。融合されたハイブリド
ーマを含む得られた細胞は、HAT培地などのごとき選択
培地において増殖させられ、そして生存細胞がこのよう
な培地において限界希釈条件を用いて増殖される。細胞
は、例えば微小力価ウェル（窪み）［microtiter wel
l］などのような適当な容器中にて増殖され、そして上
澄み液が所望の特異性を有するモノクローナル抗体に関
してスクリーニングされた。
モノクローナル抗体の収率を高めるために種々の技術
が存在し、例えばハイブリドーマ細胞を受け入れる哺乳
動物宿主の腹腔内へハイブリドーマ細胞を注入し、そし
て腹水を収獲するといったようなことがある。腹水中に
十分な量のモノクローナル抗体が集められない場合、該
抗体は宿主の血液から収獲される。種々の周知の方法
が、モノクローナル抗体を他のタンパク質あるいは他の
不純物から遊離するための、モノクローナル抗体の単離
および精製に関して存在する（コーラーとミルステイ
ン，上記，を参照のこと。） 本発明によるモノクローナル抗体は、L15と呼称され
る。それは、Ley抗原であるあるいはLey抗原の特異性を
有する、細胞表面糖質抗原に結合する。我々は、この抗
原をヒトNSCLC細胞およびいくつかの他のヒト癌からの
細胞の特性として認めている。抗体はIgMイソタイプの
ものである。それは、主要臓器の線維芽細胞、内皮細胞
あるいは上皮細胞のような正常細胞に対して検知可能に
結合することはない。L15抗体は、L15マウスハイブリド
ーマによって産生される。
が存在し、例えばハイブリドーマ細胞を受け入れる哺乳
動物宿主の腹腔内へハイブリドーマ細胞を注入し、そし
て腹水を収獲するといったようなことがある。腹水中に
十分な量のモノクローナル抗体が集められない場合、該
抗体は宿主の血液から収獲される。種々の周知の方法
が、モノクローナル抗体を他のタンパク質あるいは他の
不純物から遊離するための、モノクローナル抗体の単離
および精製に関して存在する（コーラーとミルステイ
ン，上記，を参照のこと。） 本発明によるモノクローナル抗体は、L15と呼称され
る。それは、Ley抗原であるあるいはLey抗原の特異性を
有する、細胞表面糖質抗原に結合する。我々は、この抗
原をヒトNSCLC細胞およびいくつかの他のヒト癌からの
細胞の特性として認めている。抗体はIgMイソタイプの
ものである。それは、主要臓器の線維芽細胞、内皮細胞
あるいは上皮細胞のような正常細胞に対して検知可能に
結合することはない。L15抗体は、L15マウスハイブリド
ーマによって産生される。
抗体L15は、以下のごとく同定されたような構造を有
するLeyを認識する。
するLeyを認識する。
異なる鎖長を有する糖脂質の系列が、この抗体によっ
て検知され得る。
て検知され得る。
本発明の範疇にはまた、例えばFab、（Fab′）2、Fv
フラグメントなどのような上記モノクローナル抗体の有
用な結合フラグメントが含まれる。これらの抗体フラグ
メントは周知の技法によって得られる。例えば、有用な
結合フラグメントは、パパインあるいはペプシンを用い
る抗原のペプチターゼ分解によって調製され得る。
フラグメントなどのような上記モノクローナル抗体の有
用な結合フラグメントが含まれる。これらの抗体フラグ
メントは周知の技法によって得られる。例えば、有用な
結合フラグメントは、パパインあるいはペプシンを用い
る抗原のペプチターゼ分解によって調製され得る。
本発明はまた、Ley抗原の、あるいはLey抗原の特性を
有する抗原（すなわち、LeyあるいはLexに関連するが全
く同一ではないものであり、Leyを認識する抗体によっ
て認識される抗原）の、ヒトにおけるNSCLC癌を検知す
るあるいは治療することにおける診断学的および治療学
的使用をも含むものである。抗原は、ハコモリら（上
記）によっておよびアベら（上記）によって述べられる
ような周知の方法によって精製され得る。
有する抗原（すなわち、LeyあるいはLexに関連するが全
く同一ではないものであり、Leyを認識する抗体によっ
て認識される抗原）の、ヒトにおけるNSCLC癌を検知す
るあるいは治療することにおける診断学的および治療学
的使用をも含むものである。抗原は、ハコモリら（上
記）によっておよびアベら（上記）によって述べられる
ような周知の方法によって精製され得る。
本発明の一方法は、被験者からの肺組織あるいは他の
組織を、Leyである、あるいはLeyの特性を有する糖質抗
原の存在に関して調べることによる、被験者の肺悪性状
態の存在の測定を包含するものである。”組織”なる用
語は、切除細胞、剥脱性細胞、ならびに血液、血漿、血
清、尿等の体液等に関するものである。”悪性状態”な
る用語は、癌そのもの、新生物形成の［neoplastic］悪
性の［malignant］ないしは腫瘍の［tumor］細胞、ある
いは同様のものを含む意味での形成異常細胞の存在に関
するものである。例えば検体は、例えばL15抗体のよう
な本発明のモノクローナル抗体のようなLeyにおける決
定部位を認識するモノクローナル抗体と、または例え
ば、アベら（上記）、リオイドら（上記）およびブラウ
ンら（上記）によって述べられたような抗体のごとき同
様の特性を有する抗体と接触され得るあるいは組合され
得る。接触は抗体の悪性細胞への結合のための条件下で
行なわれる。接触の後、検体における悪性細胞への抗体
の結合の存在が観察される。すなわち、検体は、抗体と
抗原部位との免疫複合体に関して調べられる。この免疫
複合体形成は、検体における悪性細胞の存在に関するも
のである。
組織を、Leyである、あるいはLeyの特性を有する糖質抗
原の存在に関して調べることによる、被験者の肺悪性状
態の存在の測定を包含するものである。”組織”なる用
語は、切除細胞、剥脱性細胞、ならびに血液、血漿、血
清、尿等の体液等に関するものである。”悪性状態”な
る用語は、癌そのもの、新生物形成の［neoplastic］悪
性の［malignant］ないしは腫瘍の［tumor］細胞、ある
いは同様のものを含む意味での形成異常細胞の存在に関
するものである。例えば検体は、例えばL15抗体のよう
な本発明のモノクローナル抗体のようなLeyにおける決
定部位を認識するモノクローナル抗体と、または例え
ば、アベら（上記）、リオイドら（上記）およびブラウ
ンら（上記）によって述べられたような抗体のごとき同
様の特性を有する抗体と接触され得るあるいは組合され
得る。接触は抗体の悪性細胞への結合のための条件下で
行なわれる。接触の後、検体における悪性細胞への抗体
の結合の存在が観察される。すなわち、検体は、抗体と
抗原部位との免疫複合体に関して調べられる。この免疫
複合体形成は、検体における悪性細胞の存在に関するも
のである。
本発明による方法の特定の実施例（説明のために挙げ
られるもので本発明を限定するものではない。）は、切
除細胞における腫瘍細胞の検知方法である。上記方法
は、腫瘍の除去の後に得られた腫瘍の一切片である検体
に対して適用される。切除される腫瘍は、切片を得るた
めに処理され、この処理は、切除直後に、通常の冷凍で
ある、腫瘍もしくは組織を冷凍することを最初に含むも
のである。組織の冷凍層は、次に、例えば低温槽を用い
て、切片へと切断される。
られるもので本発明を限定するものではない。）は、切
除細胞における腫瘍細胞の検知方法である。上記方法
は、腫瘍の除去の後に得られた腫瘍の一切片である検体
に対して適用される。切除される腫瘍は、切片を得るた
めに処理され、この処理は、切除直後に、通常の冷凍で
ある、腫瘍もしくは組織を冷凍することを最初に含むも
のである。組織の冷凍層は、次に、例えば低温槽を用い
て、切片へと切断される。
上記のようにして得られた腫瘍の切片は、本発明のモ
ノクローナル抗体と接触させられ、そして次に検知可能
な標識で標識された、上記モノクローナル抗体に対して
指向した第２の抗体と接触させられる。
ノクローナル抗体と接触させられ、そして次に検知可能
な標識で標識された、上記モノクローナル抗体に対して
指向した第２の抗体と接触させられる。
切除された検体、例えば腫瘍の切片は、第１のモノク
ローナル抗体と、該抗体の悪性細胞への結合のための条
件下で接触させられる。インキュベーションは、例えば
ガラス製ペトリ皿のような適当な容器において、約20〜
30℃の温度で約15〜30分間の間、例えば少量のアジ酸ナ
トリウムを含有するリン酸緩衝食塩水などのような水性
培地中で通常行なわれる。用いられる抗体の量は、通常
検知可能な結合を提供する、すなわち抗体と問題の決定
ないしは抗原部位との間の免疫複合体の検知可能な数を
提供するのに十分なものである。
ローナル抗体と、該抗体の悪性細胞への結合のための条
件下で接触させられる。インキュベーションは、例えば
ガラス製ペトリ皿のような適当な容器において、約20〜
30℃の温度で約15〜30分間の間、例えば少量のアジ酸ナ
トリウムを含有するリン酸緩衝食塩水などのような水性
培地中で通常行なわれる。用いられる抗体の量は、通常
検知可能な結合を提供する、すなわち抗体と問題の決定
ないしは抗原部位との間の免疫複合体の検知可能な数を
提供するのに十分なものである。
インキュベーションに続き、切片は、非特異的に結合
した抗体を低減ないし消去するために洗浄され、そして
次に、抗原部位を保持する検体の細胞へのモノクローナ
ル抗体の結合によるものである上記の複合体を観察する
ために調べられる。結合は、切片における悪性細胞の存
在に関するものである。従って、結合は、例えば、検体
を該モノクローナル抗体に関する標識された特異的結合
パートナーと接触させることによって測定される。標識
は検知可能な信号を発し得るものであり、放射性標識、
例えば蛍光体などのような発色団、酵素などであり得
る。
した抗体を低減ないし消去するために洗浄され、そして
次に、抗原部位を保持する検体の細胞へのモノクローナ
ル抗体の結合によるものである上記の複合体を観察する
ために調べられる。結合は、切片における悪性細胞の存
在に関するものである。従って、結合は、例えば、検体
を該モノクローナル抗体に関する標識された特異的結合
パートナーと接触させることによって測定される。標識
は検知可能な信号を発し得るものであり、放射性標識、
例えば蛍光体などのような発色団、酵素などであり得
る。
上記のアプローチを用いる技術の一例は、免疫蛍光染
色法である。この技術において、腫瘍の冷凍切片は、ア
セトンを用いてガラス製スライド上に固定され、そして
例えばペトリ皿にて、モノクローナル抗体とインキュベ
ートされる。例えばリン酸緩衝食塩水などのような適当
な緩衝液で洗浄の後、この切片は、ペトリ皿上に移さ
れ、そして例えば、用いられたモノクローナル抗体に関
して特異的な標識化抗体であり得る、モノクローナル抗
体に関する標識された特異的結合パートナーと接触させ
られる。ほとんどの場合において、モノクローナル抗体
はマウス源由来のものであるので、モノクローナル抗体
に関し特異的な標識された抗マウス免疫グロブリンが用
いられ得る。このような免疫グロブリンは、適当な宿主
をマウス抗体で注射し、十分な時間をおき、そして注射
された宿主の血液から抗マウス免疫グロブリンを収獲す
ることによる標準的技術により産生され得る。
色法である。この技術において、腫瘍の冷凍切片は、ア
セトンを用いてガラス製スライド上に固定され、そして
例えばペトリ皿にて、モノクローナル抗体とインキュベ
ートされる。例えばリン酸緩衝食塩水などのような適当
な緩衝液で洗浄の後、この切片は、ペトリ皿上に移さ
れ、そして例えば、用いられたモノクローナル抗体に関
して特異的な標識化抗体であり得る、モノクローナル抗
体に関する標識された特異的結合パートナーと接触させ
られる。ほとんどの場合において、モノクローナル抗体
はマウス源由来のものであるので、モノクローナル抗体
に関し特異的な標識された抗マウス免疫グロブリンが用
いられ得る。このような免疫グロブリンは、適当な宿主
をマウス抗体で注射し、十分な時間をおき、そして注射
された宿主の血液から抗マウス免疫グロブリンを収獲す
ることによる標準的技術により産生され得る。
該スライドの、例えば水性緩衝液を用いての二度目の
洗浄の後に、切片は、蛍光抗体含有流体およびカバーグ
ラスで覆われ、そして次に該切片に対するモノクローナ
ル抗体の結合を測定するために蛍光顕微鏡で調べられ
た。結合の測定はまた、検体中でこのような結合の位置
の識別をも含むものである。
洗浄の後に、切片は、蛍光抗体含有流体およびカバーグ
ラスで覆われ、そして次に該切片に対するモノクローナ
ル抗体の結合を測定するために蛍光顕微鏡で調べられ
た。結合の測定はまた、検体中でこのような結合の位置
の識別をも含むものである。
検体へのモノクローナル抗体の結合はまた、放射性物
質、染料および蛍光体を含む発色団、あるいは酵素など
のような検知可能な信号を発し得る標識に共有結合され
たモノクローナル抗体を用いることによって測定され得
る。抗体当りの用いられた標識の数は、標識された抗体
が用いられる診断方法の必要条件および抗体へ標識を結
合するための部位の有効性によって通常決定される。
質、染料および蛍光体を含む発色団、あるいは酵素など
のような検知可能な信号を発し得る標識に共有結合され
たモノクローナル抗体を用いることによって測定され得
る。抗体当りの用いられた標識の数は、標識された抗体
が用いられる診断方法の必要条件および抗体へ標識を結
合するための部位の有効性によって通常決定される。
抗体および抗体フラグメントへ標識を結合させるため
の方法は当分野において周知のものである。このような
方法は、米国特許第4,220,450号、第4,235,869号、第3,
935,074号および第3,996,345号中に見い出される。
の方法は当分野において周知のものである。このような
方法は、米国特許第4,220,450号、第4,235,869号、第3,
935,074号および第3,996,345号中に見い出される。
本発明のモノクローナル抗体が用いられ得る技術の他
の例は、血漿および血清を含む意味での体液中における
Ley決定基を負う分子の検知である。この目的のため、
本発明の抗体は、単独であるいは別の決定基に対して指
向する他の抗体と共に用いられ得る。
の例は、血漿および血清を含む意味での体液中における
Ley決定基を負う分子の検知である。この目的のため、
本発明の抗体は、単独であるいは別の決定基に対して指
向する他の抗体と共に用いられ得る。
本発明のモノクローナル抗体が用いられる技術のさら
に別の例は、イムノペルオキシダーゼ標識［Immunopero
xidase labeling］（ガリギュースら，インターナショ
ナル ジャーナル オブ キャンサー（1982年）29:511
〜515により変更されたようなステロンベーガー，イム
ノサイトケミストリー，ジョン ウィリー アンド サ
ンズ，ニューヨーク,1979年，第104〜109頁［Sternberg
er,Immunocytochemistry,John Wiley＆Sons,New York,1
979,pp104−169 as modified by Garrigues et al.,In
t.J.Cancer（1982）29:511−515］）である。試験され
るべき組織は、ガラス製スライドなどのような支持体上
に、アセトンなどのような適当な溶媒を用いて固定され
る。次に、組織は、モノクローナル抗体とインキュベー
トされ、そして洗浄されて結合していない抗体が除かれ
る。次に組織はウサギ抗マウスIgGとインキュベートさ
れ、結合していない抗体を除去するために洗浄され、マ
ウスペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダーゼ複合体と組
合され、結合していない接合体を除去するために洗浄
し、そして次に酵素に関する基質で処理された。この処
理に続き、該スライドは、検知可能な信号に関して調べ
られた。
に別の例は、イムノペルオキシダーゼ標識［Immunopero
xidase labeling］（ガリギュースら，インターナショ
ナル ジャーナル オブ キャンサー（1982年）29:511
〜515により変更されたようなステロンベーガー，イム
ノサイトケミストリー，ジョン ウィリー アンド サ
ンズ，ニューヨーク,1979年，第104〜109頁［Sternberg
er,Immunocytochemistry,John Wiley＆Sons,New York,1
979,pp104−169 as modified by Garrigues et al.,In
t.J.Cancer（1982）29:511−515］）である。試験され
るべき組織は、ガラス製スライドなどのような支持体上
に、アセトンなどのような適当な溶媒を用いて固定され
る。次に、組織は、モノクローナル抗体とインキュベー
トされ、そして洗浄されて結合していない抗体が除かれ
る。次に組織はウサギ抗マウスIgGとインキュベートさ
れ、結合していない抗体を除去するために洗浄され、マ
ウスペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダーゼ複合体と組
合され、結合していない接合体を除去するために洗浄
し、そして次に酵素に関する基質で処理された。この処
理に続き、該スライドは、検知可能な信号に関して調べ
られた。
本発明の抗体は、例えば、だ液のような肺からの剥脱
性細胞検体におけるあるいは子宮頸部塗抹標本におけ
る、悪性状態の存在を測定する方法に用いられ得る。”
剥脱性”なる用語は、検体が、組織の表面をこするある
いは洗浄することによって得られた単離細胞あるいは細
胞の凝集物（それらの細胞は個々に、あるいは鱗屑ない
しは板状において除去される。）からなるものであるこ
とを意味するものである。剥脱性細胞検体は、生検によ
って得られたもののような、切除された組織から識別さ
れるべきである。検体と抗体との間の接触は、抗原部位
への抗体の結合のための条件下で行なわれる。接触の
後、抗原部位への抗体の結合の存在あるいは不在が測定
され、そしてこれは肺における悪性状態の存在に関する
ものである。
性細胞検体におけるあるいは子宮頸部塗抹標本におけ
る、悪性状態の存在を測定する方法に用いられ得る。”
剥脱性”なる用語は、検体が、組織の表面をこするある
いは洗浄することによって得られた単離細胞あるいは細
胞の凝集物（それらの細胞は個々に、あるいは鱗屑ない
しは板状において除去される。）からなるものであるこ
とを意味するものである。剥脱性細胞検体は、生検によ
って得られたもののような、切除された組織から識別さ
れるべきである。検体と抗体との間の接触は、抗原部位
への抗体の結合のための条件下で行なわれる。接触の
後、抗原部位への抗体の結合の存在あるいは不在が測定
され、そしてこれは肺における悪性状態の存在に関する
ものである。
肺における悪性の存在を測定するために、痰試料は、
この方法において使用される剥脱性細胞検体を与える。
この方法は、気管支、あるいは咽頭口部、口を含む胃腸
路などからの剥脱性細胞検体における悪性状態の検知に
おいて利用性を見出すものである。
この方法において使用される剥脱性細胞検体を与える。
この方法は、気管支、あるいは咽頭口部、口を含む胃腸
路などからの剥脱性細胞検体における悪性状態の検知に
おいて利用性を見出すものである。
剥脱性細胞検体は次に、抗原−抗体複合体を形成する
ために、検体の特異的抗原部位への抗体の結合のための
条件下で前述の抗体と接触させられた。この抗原部位
は、検体における細胞あるいは細胞フラグメント上に存
在され得る。一般に、検体は例えば通常ガラスあるいは
その他の適当な物質からなるスライドのような適当な支
持体上へ載置される。剥脱性細胞検体は、通常、スライ
ドの表面上に検体の薄層を与えるようにスライド上で塗
抹される。抗体と検体との間の接触は、通常、水性緩衝
化培地中にて行なわれる。用いられる緩衝液は、リン酸
塩、トリス、重炭酸塩などを含む。pHは、検体および抗
体の状態に関係するものであって、通常５〜８の範囲内
にある。水性培地は、約０〜40％の量の有機極性溶媒を
さらに含んでいてもよい。有機極性溶媒は水溶性であ
り、通常約１〜10個の炭素原子と約１〜４個の酸素原子
を有している。抗体は、水性培地中に約１〜100μg/m
l、好ましくは約10〜20μg/mlの濃度で存在する。検体
の抗体との接触の間の温度は、約４〜40℃、好ましくは
10〜30℃である。接触の期間は、通常約15〜120分、好
ましくは約30〜60分間である。
ために、検体の特異的抗原部位への抗体の結合のための
条件下で前述の抗体と接触させられた。この抗原部位
は、検体における細胞あるいは細胞フラグメント上に存
在され得る。一般に、検体は例えば通常ガラスあるいは
その他の適当な物質からなるスライドのような適当な支
持体上へ載置される。剥脱性細胞検体は、通常、スライ
ドの表面上に検体の薄層を与えるようにスライド上で塗
抹される。抗体と検体との間の接触は、通常、水性緩衝
化培地中にて行なわれる。用いられる緩衝液は、リン酸
塩、トリス、重炭酸塩などを含む。pHは、検体および抗
体の状態に関係するものであって、通常５〜８の範囲内
にある。水性培地は、約０〜40％の量の有機極性溶媒を
さらに含んでいてもよい。有機極性溶媒は水溶性であ
り、通常約１〜10個の炭素原子と約１〜４個の酸素原子
を有している。抗体は、水性培地中に約１〜100μg/m
l、好ましくは約10〜20μg/mlの濃度で存在する。検体
の抗体との接触の間の温度は、約４〜40℃、好ましくは
10〜30℃である。接触の期間は、通常約15〜120分、好
ましくは約30〜60分間である。
検体と抗体との間の接触の後、支持体は通常未反応抗
体を除去するために処理される。通常、これは支持体を
水性の、通常緩衝化された、培地で洗浄することにより
なされる。
体を除去するために処理される。通常、これは支持体を
水性の、通常緩衝化された、培地で洗浄することにより
なされる。
次に、検体における抗原部位へ結合した抗体（ここで
この結合は、該位置での悪性状態の存在に関するもので
ある。）の存在が観察される。すなわち、検体は、形成
された抗原−抗体（免疫）複合体の数を測定するために
調べられる。いくつかの例においては、問題の抗原部位
の極めて少ない数が、剥脱性細胞検体において見い出さ
れ得ることに注意すべきである。しかしながら、悪性状
態においては、多数の抗原部位が存在し、この後者の状
態は、多数の抗原−抗体複合体が、悪性状態が存在して
いる場合には計測可能であるゆえに、この方法により、
非悪性状態以上に容易に識別できる。結合の存在の測定
を行なうために、検知可能な信号を発する手段が、検定
系に組入れられる。例えば、検定において用いられた抗
体を検知可能な信号を発し得る標識へ結合させることが
できる。標識は、放射性物質、染料および蛍光体を含む
発色団、酵素あるいは同様のものであり得る。抗体に対
して用いられる標識の数は、方法の必要条件および抗体
へ標識を結合させるための部位の有効性によって通常決
定される。
この結合は、該位置での悪性状態の存在に関するもので
ある。）の存在が観察される。すなわち、検体は、形成
された抗原−抗体（免疫）複合体の数を測定するために
調べられる。いくつかの例においては、問題の抗原部位
の極めて少ない数が、剥脱性細胞検体において見い出さ
れ得ることに注意すべきである。しかしながら、悪性状
態においては、多数の抗原部位が存在し、この後者の状
態は、多数の抗原−抗体複合体が、悪性状態が存在して
いる場合には計測可能であるゆえに、この方法により、
非悪性状態以上に容易に識別できる。結合の存在の測定
を行なうために、検知可能な信号を発する手段が、検定
系に組入れられる。例えば、検定において用いられた抗
体を検知可能な信号を発し得る標識へ結合させることが
できる。標識は、放射性物質、染料および蛍光体を含む
発色団、酵素あるいは同様のものであり得る。抗体に対
して用いられる標識の数は、方法の必要条件および抗体
へ標識を結合させるための部位の有効性によって通常決
定される。
あるいはまた、洗浄されたスライドを、例えば用いら
れた抗体に対して特異的な標識された抗体であり得る、
抗体に対する標識された特異的結合パートナーと接触さ
せることも可能である。モノクローナル抗体がマウス源
由来のものである場合には、該方法において用いられた
抗体に対して特異性の標識された抗マウス免疫グロブリ
ンが用いられ得る。このような免疫グロブリンは、適当
な宿主にモノクローナル抗体を注射し、適当な時間をお
き、そして注射された宿主の血液から抗マウス免疫グロ
ブリンを収獲することによる標準的技術によって産生さ
れ得る。抗体に対する標識された特異的結合パートナー
が用いられる場合、スライドは、該スライドを蛍光に関
して調べる前に再度、水性培地で洗浄されなければなら
ない。
れた抗体に対して特異的な標識された抗体であり得る、
抗体に対する標識された特異的結合パートナーと接触さ
せることも可能である。モノクローナル抗体がマウス源
由来のものである場合には、該方法において用いられた
抗体に対して特異性の標識された抗マウス免疫グロブリ
ンが用いられ得る。このような免疫グロブリンは、適当
な宿主にモノクローナル抗体を注射し、適当な時間をお
き、そして注射された宿主の血液から抗マウス免疫グロ
ブリンを収獲することによる標準的技術によって産生さ
れ得る。抗体に対する標識された特異的結合パートナー
が用いられる場合、スライドは、該スライドを蛍光に関
して調べる前に再度、水性培地で洗浄されなければなら
ない。
蛍光体標識が用いられる場合において抗体と細胞検体
との間の結合の存在を測定するために、スライドは、通
常は蛍光顕微鏡を用いて、蛍光に関して調べられる。蛍
光体以外の標識が用いられる場合には、スライドないし
検体は、沈澱物、色彩等の形成に関して調べられる。
との間の結合の存在を測定するために、スライドは、通
常は蛍光顕微鏡を用いて、蛍光に関して調べられる。蛍
光体以外の標識が用いられる場合には、スライドないし
検体は、沈澱物、色彩等の形成に関して調べられる。
上記の説明は、免疫蛍光検査技術における本発明の抗
体使用に主として注がれたものである。しかしながら本
発明の抗体は、抗原−抗体反応を含むほとんどの検定法
において用いられることができるものである。該検定法
群は、均質性［homogeneous］でも不均質性［heterogen
eous］でもよい。均質性検定方法においては、検体は、
血清、尿および同様なもののごとき生物学的流体であり
得、または、検体は溶解されそして屑を除去するために
清澄化され得る。免疫学的反応は、通常特異的抗体、標
識された被分析物および関心の試料を含むものである。
標識から生じる信号が、抗体の標識された被分析物への
結合において直接的にあるいは間接的に変化される。免
疫学的反応およびその程度検知の双方が、均質溶液にお
いて行なわれる。用いられ得る免疫化学標識は、フリー
ラジカル類、蛍光染料類、酵素類、バクテリオファージ
類、補酵素類などが含まれる。
体使用に主として注がれたものである。しかしながら本
発明の抗体は、抗原−抗体反応を含むほとんどの検定法
において用いられることができるものである。該検定法
群は、均質性［homogeneous］でも不均質性［heterogen
eous］でもよい。均質性検定方法においては、検体は、
血清、尿および同様なもののごとき生物学的流体であり
得、または、検体は溶解されそして屑を除去するために
清澄化され得る。免疫学的反応は、通常特異的抗体、標
識された被分析物および関心の試料を含むものである。
標識から生じる信号が、抗体の標識された被分析物への
結合において直接的にあるいは間接的に変化される。免
疫学的反応およびその程度検知の双方が、均質溶液にお
いて行なわれる。用いられ得る免疫化学標識は、フリー
ラジカル類、蛍光染料類、酵素類、バクテリオファージ
類、補酵素類などが含まれる。
不均質性検定方法においては、試薬は、通常、検体、
特異性抗体、および検知可能な信号を発するための手段
である。検体はプレートあるいはスライドなどのような
支持体上に通常載置され、そして液相中で抗体と接触さ
せられる。支持体は次に液相から分離され、支持体相あ
るいは液相のいずれかが、検知可能な信号に関して、こ
のような信号を発する手段を用いて調べられる。この信
号は、検体における被分析物の存在に関するものであ
る。検知可能な信号を発する手段は、放射性標識類、蛍
光体類、酵素類などの使用を含むものである。不均質性
免疫検定法の例としては、放射性標識免疫検定法（ラジ
オイムノアッセイ）、免疫蛍光検査方法、酵素結合免疫
学的検定法などが含まれる。
特異性抗体、および検知可能な信号を発するための手段
である。検体はプレートあるいはスライドなどのような
支持体上に通常載置され、そして液相中で抗体と接触さ
せられる。支持体は次に液相から分離され、支持体相あ
るいは液相のいずれかが、検知可能な信号に関して、こ
のような信号を発する手段を用いて調べられる。この信
号は、検体における被分析物の存在に関するものであ
る。検知可能な信号を発する手段は、放射性標識類、蛍
光体類、酵素類などの使用を含むものである。不均質性
免疫検定法の例としては、放射性標識免疫検定法（ラジ
オイムノアッセイ）、免疫蛍光検査方法、酵素結合免疫
学的検定法などが含まれる。
上記の免疫学的検定技術の詳細な論議に関しては、エ
ドワード ティー マギオ［Edward T.Maggio］（シー
アールシー プレス インコーポレーテッド，ボカ ラ
トン，フロリダ,1980年［CRC Press Inc.,Boca Raton,F
lorida,1980］）による”エンザイム−イムノアッセイ
［Enzyme−Immunoassay］”を参照のこと。例えば、米
国特許第3,690,834号、第3,791,932号、第3,817,837
号、第3,850,578号、第3,853,987号、第3,867,517号、
第3,901,654号、第3,935,074号、第3,984,533号、第3,9
96,345号および第4,098,876号（この列挙は、余す所な
く掲げることを意図するものではない。）もまた参照の
こと。
ドワード ティー マギオ［Edward T.Maggio］（シー
アールシー プレス インコーポレーテッド，ボカ ラ
トン，フロリダ,1980年［CRC Press Inc.,Boca Raton,F
lorida,1980］）による”エンザイム−イムノアッセイ
［Enzyme−Immunoassay］”を参照のこと。例えば、米
国特許第3,690,834号、第3,791,932号、第3,817,837
号、第3,850,578号、第3,853,987号、第3,867,517号、
第3,901,654号、第3,935,074号、第3,984,533号、第3,9
96,345号および第4,098,876号（この列挙は、余す所な
く掲げることを意図するものではない。）もまた参照の
こと。
本発明の抗体はまた、ジェイ．ナクル．メド．（1983
年）24:123〜129［J.Nucl.Med.（1983）24:123−129］
中におよびジャーナル オブ クリニカル インベステ
ィゲーション（1983年）72:2101〜2114［J.Clin.Inves
t.（1983）72:2101−2114］中に悪性骨髄腫に関して述
べられたものと同様な方法において、NSCLCを保持する
ヒト患者での転移性沈積物を画像とするために用いられ
得る。抗体またはそのフラグメントは、放射性標識さ
れ、そして患者へ静脈内的に投与され、その後該患者は
例えばガンマ線カメラなどを用いて画像とされる。
年）24:123〜129［J.Nucl.Med.（1983）24:123−129］
中におよびジャーナル オブ クリニカル インベステ
ィゲーション（1983年）72:2101〜2114［J.Clin.Inves
t.（1983）72:2101−2114］中に悪性骨髄腫に関して述
べられたものと同様な方法において、NSCLCを保持する
ヒト患者での転移性沈積物を画像とするために用いられ
得る。抗体またはそのフラグメントは、放射性標識さ
れ、そして患者へ静脈内的に投与され、その後該患者は
例えばガンマ線カメラなどを用いて画像とされる。
本発明による方法の上記の特定の実施例群は、それぞ
れの抗原上の特異的決定部位に結合するおよびマウス源
からのIgMサブクラスのものである抗体を用いるもので
あるが、これは何ら限定を意味するものではない。上記
抗体類、ならびにマウス源、ヒトを含むその他の哺乳動
物源もしくは他の源またはこれらの組合せのいずれかか
らの上記抗体類と機能的等価性を有する抗体類が本発明
の方法において、その他のイソタイプと同様に用いられ
得る。”機能的等価性”なる用語は、抗体がそれぞれ上
記に述べた決定部位のいずれかに結合することができ、
そしてこのような部位に関して本発明の特定の抗体と競
合し得ることを意味する。すなわち、このような抗体
は、このような決定部位を有する細胞もしくは細胞フラ
グメントまたは分泌された抗原を含有する検体と組合せ
られた場合に、このような決定部位に結合し、そしてこ
のような部位への結合から本発明の抗体を阻害するもの
であろう。さらにまた、Ley抗原が１つ以上の決定部位
を有するゆえに、本発明の方法は、前記のモノクローナ
ル抗体類によって結合された決定部位以外の決定部位に
結合するモノクローナル抗体類の使用を含むものであ
る。
れの抗原上の特異的決定部位に結合するおよびマウス源
からのIgMサブクラスのものである抗体を用いるもので
あるが、これは何ら限定を意味するものではない。上記
抗体類、ならびにマウス源、ヒトを含むその他の哺乳動
物源もしくは他の源またはこれらの組合せのいずれかか
らの上記抗体類と機能的等価性を有する抗体類が本発明
の方法において、その他のイソタイプと同様に用いられ
得る。”機能的等価性”なる用語は、抗体がそれぞれ上
記に述べた決定部位のいずれかに結合することができ、
そしてこのような部位に関して本発明の特定の抗体と競
合し得ることを意味する。すなわち、このような抗体
は、このような決定部位を有する細胞もしくは細胞フラ
グメントまたは分泌された抗原を含有する検体と組合せ
られた場合に、このような決定部位に結合し、そしてこ
のような部位への結合から本発明の抗体を阻害するもの
であろう。さらにまた、Ley抗原が１つ以上の決定部位
を有するゆえに、本発明の方法は、前記のモノクローナ
ル抗体類によって結合された決定部位以外の決定部位に
結合するモノクローナル抗体類の使用を含むものであ
る。
本発明はまた、上記に述べた方法を実施するための診
断キットを含むものである。１つの実施態様において
は、診断キットは、（ａ）上記により詳細に定義された
モノクローナル抗体および（ｂ）上記モノクローナル抗
体に対する特異結合パートナーと検知可能な信号を発し
得る標識との接合体からなる。この試薬はまた、緩衝化
剤、および例えば、ポリサッカライド類のようなタンパ
ク質安定化剤などのごとき補助的作用物質をも含み得
る。この診断キットはさらにまた、必要に応じて、該標
識が一構成成分である信号発生系の他の構成成分、試験
におけるバックグラウンド干渉を低減するための作用物
質、対照試薬、試験を行なうための装置などを含み得る
ものである。他の実施態様においては、診断キットは、
本発明のモノクローナル抗体と検知可能な信号を発し得
る標識との接合体からなるものである。上記したような
補助的作用物質はまた存在し得る。
断キットを含むものである。１つの実施態様において
は、診断キットは、（ａ）上記により詳細に定義された
モノクローナル抗体および（ｂ）上記モノクローナル抗
体に対する特異結合パートナーと検知可能な信号を発し
得る標識との接合体からなる。この試薬はまた、緩衝化
剤、および例えば、ポリサッカライド類のようなタンパ
ク質安定化剤などのごとき補助的作用物質をも含み得
る。この診断キットはさらにまた、必要に応じて、該標
識が一構成成分である信号発生系の他の構成成分、試験
におけるバックグラウンド干渉を低減するための作用物
質、対照試薬、試験を行なうための装置などを含み得る
ものである。他の実施態様においては、診断キットは、
本発明のモノクローナル抗体と検知可能な信号を発し得
る標識との接合体からなるものである。上記したような
補助的作用物質はまた存在し得る。
本発明の抗体は、治療学的に用いられ得る。固有の生
物学的特性を有する抗体は、直接治療剤として有用であ
り得る（シェアーズら、コントル．オンコル．カーガ
ー，バッセル（1984年）19:180〜192［Sears,et at.,Co
ntrol.Oncol.Karger,Basel,（1984）19:180−192］）。
さらにまた、抗体は、免疫毒素を形成するために毒素
へ、はまた放射線製薬的または製薬的に形成するために
放射性物質または薬剤へ結合され得る。抗体の免疫毒素
あるいは放射線製薬品を製造する方法は、周知である
（例えばキャンサー トリートメント レポーツ（1984
年）68:317〜328［Cancer Treatment Reports（1984）6
8:317−328］を参照のこと。）。
物学的特性を有する抗体は、直接治療剤として有用であ
り得る（シェアーズら、コントル．オンコル．カーガ
ー，バッセル（1984年）19:180〜192［Sears,et at.,Co
ntrol.Oncol.Karger,Basel,（1984）19:180−192］）。
さらにまた、抗体は、免疫毒素を形成するために毒素
へ、はまた放射線製薬的または製薬的に形成するために
放射性物質または薬剤へ結合され得る。抗体の免疫毒素
あるいは放射線製薬品を製造する方法は、周知である
（例えばキャンサー トリートメント レポーツ（1984
年）68:317〜328［Cancer Treatment Reports（1984）6
8:317−328］を参照のこと。）。
本発明のモノクローナル抗体の他の治療的用途は、免
疫源として本発明のモノクローナル抗体の１つを使用す
ることにより産生される抗イディオタイプ抗体での患者
免疫処置である。このような免疫処置は、能動的抗腫瘍
活性をもたらし得る（例えば、ネポムら，プロシーディ
ング オブ ザ ナショナル アカデミー オド サイ
エンシズ オブ ザ ユナイテッド ステート オブ
アメリカ（1984年）81:2864〜2867［Nepom et al.,Pro
c.Natl.Sci.U.S.A.（1984）81:2864−2867］を参照のこ
と。）。同様のアプローチにおいて、患者は、それぞれ
の抗体の精製形態あるいは変形形態におけるそれぞれの
抗体で免疫化され得る。
疫源として本発明のモノクローナル抗体の１つを使用す
ることにより産生される抗イディオタイプ抗体での患者
免疫処置である。このような免疫処置は、能動的抗腫瘍
活性をもたらし得る（例えば、ネポムら，プロシーディ
ング オブ ザ ナショナル アカデミー オド サイ
エンシズ オブ ザ ユナイテッド ステート オブ
アメリカ（1984年）81:2864〜2867［Nepom et al.,Pro
c.Natl.Sci.U.S.A.（1984）81:2864−2867］を参照のこ
と。）。同様のアプローチにおいて、患者は、それぞれ
の抗体の精製形態あるいは変形形態におけるそれぞれの
抗体で免疫化され得る。
本発明の興味ある観点は、本発明の抗体は、例えば、
それぞれ1984年11月２日および1984年12月21日に出願さ
れた米国特許一連番号第667,521号および第684,759号に
述べられたようなNSCLCに対するその他の抗体と組み合
わせることができることである。この組合せは、上記し
たような少なくとも４つのタイプの肺癌、すなわち、未
分化大細胞肺癌、小細胞肺癌、腺癌および類表皮癌を検
知することにおいて有効である。
それぞれ1984年11月２日および1984年12月21日に出願さ
れた米国特許一連番号第667,521号および第684,759号に
述べられたようなNSCLCに対するその他の抗体と組み合
わせることができることである。この組合せは、上記し
たような少なくとも４つのタイプの肺癌、すなわち、未
分化大細胞肺癌、小細胞肺癌、腺癌および類表皮癌を検
知することにおいて有効である。
本発明のモノクローナル抗体はまた、乳癌などのよう
なその他の癌に関連する抗原における決定部位に結合す
る。従って、本発明の抗体は、このような癌に対して指
向する診断的あるいは治療的製品における使用を見い出
し得るものである。
なその他の癌に関連する抗原における決定部位に結合す
る。従って、本発明の抗体は、このような癌に対して指
向する診断的あるいは治療的製品における使用を見い出
し得るものである。
実施例 本発明は、以外の例示的実施例によってさらに論証さ
れる。いくつかの用いられた手段が最初に述べられる。
れる。いくつかの用いられた手段が最初に述べられる。
免疫組織学的技術 冷凍断片における免疫組織学的研究のために、ガリギ
ュースら［Garrigues et al.］（インターナショナル
ジャーナル オブ キャンサー（1982年）29:511〜515
［Int.J.Cancer（1982）29:511−515］）によって修正
されるようなイムノケミストリー，ジョン ウイリー
アンド サンズ，ニューヨーク,1979年，第104〜169頁
［Immunochemistry,John Wiley＆Sons,New York,1979,p
p:104−169］中のステルンベーガー［Sternberger］の
非標識化抗体技術［unlabelled antibody technique］
が用いられた。これらの試験に関する標的組織は、外科
手術で得られそして液体窒素中で予め冷却されたいたイ
ソペンタン中での剥離の４時間以内で冷凍された。組織
は、そして使用するまで、液体窒素中であるいは−70℃
で貯蔵された。ウサギ抗マウスIgG（ステルンベーガー
‐メイヤー イムノケミカルズ インコーポレーテッ
ド，メリーランド州ジャレッティスビル［Sternberger
−Meyer Immunochemicals,Inc.Jarettsville,MD］）が1
/50の希釈で用いられた。特に精製されたマウスペルオ
キシダーゼ‐抗ペルオキシダーゼ複合体2mg/mlを含有す
るマウスペルオキシダーゼ‐抗ペルオキシダーゼ複合体
（PAP,ステルンベーガー‐メイヤー イムノケミカルズ
インコーポレーテッド）が1/80の希釈で用いられた。
冷凍切片が調製され、乾燥され、アセトンで処理されそ
して乾燥された（ガリギュースら［Garrigues et a
l.］,1982年）。組織学的評価に関して用いられる切片
は、ヘモトキシリンで染色された。非特異的バックグラ
ウンドを減少するために、切片は、1/5に希釈された正
常ヒト血清と予備的にインキュベートされた（ガリギュ
ースら,1982年）。マウス抗体、ヤギ抗マウスIgGおよび
マウスPAPが10％正常ヒト血清および３％ウサギ血清の
溶液中に希釈された。
ュースら［Garrigues et al.］（インターナショナル
ジャーナル オブ キャンサー（1982年）29:511〜515
［Int.J.Cancer（1982）29:511−515］）によって修正
されるようなイムノケミストリー，ジョン ウイリー
アンド サンズ，ニューヨーク,1979年，第104〜169頁
［Immunochemistry,John Wiley＆Sons,New York,1979,p
p:104−169］中のステルンベーガー［Sternberger］の
非標識化抗体技術［unlabelled antibody technique］
が用いられた。これらの試験に関する標的組織は、外科
手術で得られそして液体窒素中で予め冷却されたいたイ
ソペンタン中での剥離の４時間以内で冷凍された。組織
は、そして使用するまで、液体窒素中であるいは−70℃
で貯蔵された。ウサギ抗マウスIgG（ステルンベーガー
‐メイヤー イムノケミカルズ インコーポレーテッ
ド，メリーランド州ジャレッティスビル［Sternberger
−Meyer Immunochemicals,Inc.Jarettsville,MD］）が1
/50の希釈で用いられた。特に精製されたマウスペルオ
キシダーゼ‐抗ペルオキシダーゼ複合体2mg/mlを含有す
るマウスペルオキシダーゼ‐抗ペルオキシダーゼ複合体
（PAP,ステルンベーガー‐メイヤー イムノケミカルズ
インコーポレーテッド）が1/80の希釈で用いられた。
冷凍切片が調製され、乾燥され、アセトンで処理されそ
して乾燥された（ガリギュースら［Garrigues et a
l.］,1982年）。組織学的評価に関して用いられる切片
は、ヘモトキシリンで染色された。非特異的バックグラ
ウンドを減少するために、切片は、1/5に希釈された正
常ヒト血清と予備的にインキュベートされた（ガリギュ
ースら,1982年）。マウス抗体、ヤギ抗マウスIgGおよび
マウスPAPが10％正常ヒト血清および３％ウサギ血清の
溶液中に希釈された。
染色手順は、一連の切片を2.5時間特異的抗体あるい
は対照抗体のいずれかで処理し、1/50に希釈されたウサ
ギ抗マウスIgGと30分間インキュベートされ、そして1/8
0に希釈されたマウスPAP複合体に30分間されされること
から成るものであった。抗体とのそれぞれの処理の後、
スライドはリン酸緩衝食塩水（PBS）中で２度ずつ洗浄
された。免疫組織化学的反応は、0.05Mトリス、pH7.6中
の新たに調製された0.05％ 3,3′−ジアミノベンジド
テトラハイドロクロライド（シグマ，ミズーリー州セ
ントルイス）および0.01％過酸化水素を８分間用いて発
展させられた。蒸溜水中の１％ OsO4溶液へ20分間さら
にさらすことは、着色を強烈なものにした。切片は水で
すすがれ、アルコール中で脱水化され、キシレン中で透
明とされ、スライド上に載置された。切片はそれぞれコ
ード下で研究され、コードされた試料はひとりの無関係
な研究者によって調査された。代表的なスライドは微分
干渉差異光学（ゼイス−ノマルスキー［Zeiss−Nomarsk
i］）を用いることによって写真とされた。抗体着色の
程度は、０（反応性なし）、＋（わずかの陽性細胞）、
＋＋（少なくとも1/3の細胞陽性）、＋＋＋（多くの細
胞陽性）、＋＋＋（ほぼ全ての細胞強い陽性）として評
価された。＋と０の着色の間の差異は、＋＋と＋との間
の差異よりもより明確さの低いわかれ目であったので、
＋＋ないしはそれ以上として程度づけされた着色を”陽
性”として数えることを決定した。腫瘍細胞および支質
細胞の双方が腫瘍試料中に観察されたが、支質細胞は全
く着色されないかあるいは腫瘍細胞よりもより弱く着色
されるゆえ、着色は、腫瘍細胞のものに関連して記録さ
れた。
は対照抗体のいずれかで処理し、1/50に希釈されたウサ
ギ抗マウスIgGと30分間インキュベートされ、そして1/8
0に希釈されたマウスPAP複合体に30分間されされること
から成るものであった。抗体とのそれぞれの処理の後、
スライドはリン酸緩衝食塩水（PBS）中で２度ずつ洗浄
された。免疫組織化学的反応は、0.05Mトリス、pH7.6中
の新たに調製された0.05％ 3,3′−ジアミノベンジド
テトラハイドロクロライド（シグマ，ミズーリー州セ
ントルイス）および0.01％過酸化水素を８分間用いて発
展させられた。蒸溜水中の１％ OsO4溶液へ20分間さら
にさらすことは、着色を強烈なものにした。切片は水で
すすがれ、アルコール中で脱水化され、キシレン中で透
明とされ、スライド上に載置された。切片はそれぞれコ
ード下で研究され、コードされた試料はひとりの無関係
な研究者によって調査された。代表的なスライドは微分
干渉差異光学（ゼイス−ノマルスキー［Zeiss−Nomarsk
i］）を用いることによって写真とされた。抗体着色の
程度は、０（反応性なし）、＋（わずかの陽性細胞）、
＋＋（少なくとも1/3の細胞陽性）、＋＋＋（多くの細
胞陽性）、＋＋＋（ほぼ全ての細胞強い陽性）として評
価された。＋と０の着色の間の差異は、＋＋と＋との間
の差異よりもより明確さの低いわかれ目であったので、
＋＋ないしはそれ以上として程度づけされた着色を”陽
性”として数えることを決定した。腫瘍細胞および支質
細胞の双方が腫瘍試料中に観察されたが、支質細胞は全
く着色されないかあるいは腫瘍細胞よりもより弱く着色
されるゆえ、着色は、腫瘍細胞のものに関連して記録さ
れた。
抗原位置の決定 抗原の細胞下局在は、非イオン性界面活性剤での透過
化の前あるいは後の細胞に対して結合する抗体を計測す
ることによって測定された。完全な培養細胞の細胞表面
へ結合する抗体は、125I標識された抗体を用いての直接
結合検定法（ブラウンら，プロシーディング オブ ザ
ナショナル アカデミー オブ サイエンシズ オブ
ザ ユナイテッド ステート オブ アメリカ（1981
年）78:539〜543［Brown et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.（1981）78:539−543］）によってあるいは、（F
ACS）II細胞識別器を用いる間接蛍光によって同定され
た。細胞内位置に結合する抗体は、125I標識された抗体
を細胞に直接結合させ、続いて、パラホルムアルデヒド
で固定化し、さらに続いて非イオン性界面活性剤NP−40
で透過化することによって測定された。
化の前あるいは後の細胞に対して結合する抗体を計測す
ることによって測定された。完全な培養細胞の細胞表面
へ結合する抗体は、125I標識された抗体を用いての直接
結合検定法（ブラウンら，プロシーディング オブ ザ
ナショナル アカデミー オブ サイエンシズ オブ
ザ ユナイテッド ステート オブ アメリカ（1981
年）78:539〜543［Brown et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.（1981）78:539−543］）によってあるいは、（F
ACS）II細胞識別器を用いる間接蛍光によって同定され
た。細胞内位置に結合する抗体は、125I標識された抗体
を細胞に直接結合させ、続いて、パラホルムアルデヒド
で固定化し、さらに続いて非イオン性界面活性剤NP−40
で透過化することによって測定された。
結合検定法 ａ）放射性標識された抗体を用いることによって行なわ
れる結合検定法（ブラウンら，上記）のために、培養細
胞（106）は、培養培地中で熱活性化（56℃で30分間）
胎児ウシ血清100μｌ中の125I標識された抗体106cpmと
４℃で30分間インキュベートされた。PBS 5mlの添加の
後、細胞は250×ｇで10分間遠心分離することによって
ペレット化された。上澄み液は吸い出され、そしてペレ
ットは125Iに関して計数された。非特異的結合を計測す
るために、並行的インキュベーションが競合物として標
識されていない抗体10μｇを用いて行なわれた（ブラウ
ンら，上記）いくつかの例においては、結合検定法は、
類似の様式においてプラスチック製培養皿へ付着した細
胞単一層上で行なわれた。
れる結合検定法（ブラウンら，上記）のために、培養細
胞（106）は、培養培地中で熱活性化（56℃で30分間）
胎児ウシ血清100μｌ中の125I標識された抗体106cpmと
４℃で30分間インキュベートされた。PBS 5mlの添加の
後、細胞は250×ｇで10分間遠心分離することによって
ペレット化された。上澄み液は吸い出され、そしてペレ
ットは125Iに関して計数された。非特異的結合を計測す
るために、並行的インキュベーションが競合物として標
識されていない抗体10μｇを用いて行なわれた（ブラウ
ンら，上記）いくつかの例においては、結合検定法は、
類似の様式においてプラスチック製培養皿へ付着した細
胞単一層上で行なわれた。
ｂ）FACSII細胞識別器において行なわれる結合検定法の
ために、細胞は、5mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）
を含むPBSを用いて、それらの基質から除去された。１
×105細胞を含有する試料は最初に２μg/mlの濃度でモ
ノクローナル抗体とインキュベートされ、続いて1:200
の希釈でフルオレセイン結合ヤギ抗マウス抗体とインキ
ュベートされた。細胞は次に洗浄されそして培養培地中
に再懸濁された。FACS分析の直前に、ヨウ化プロピシウ
ムが非生存細胞を染色するために１μg/mlの最終濃度へ
と添加された。FACS分析の間、細胞放射赤色蛍光が、生
存細胞のみを調べるために、電子的に追出された。フル
オレセイン蛍光の平均強度が、次にそれぞれの抗体に関
して測定された。陰性の比較対照はモノクローナル抗体
のない試料から構成されており、一方陽性の比較対照
は、HLAタイプ１組織適合性抗原に対するモノクローナ
ル抗体からなるものであった。平均チャンネルフルオレ
セインが少なくともバックグラウンドの３倍であった場
合に、着色は陽性であると見なされた。
ために、細胞は、5mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）
を含むPBSを用いて、それらの基質から除去された。１
×105細胞を含有する試料は最初に２μg/mlの濃度でモ
ノクローナル抗体とインキュベートされ、続いて1:200
の希釈でフルオレセイン結合ヤギ抗マウス抗体とインキ
ュベートされた。細胞は次に洗浄されそして培養培地中
に再懸濁された。FACS分析の直前に、ヨウ化プロピシウ
ムが非生存細胞を染色するために１μg/mlの最終濃度へ
と添加された。FACS分析の間、細胞放射赤色蛍光が、生
存細胞のみを調べるために、電子的に追出された。フル
オレセイン蛍光の平均強度が、次にそれぞれの抗体に関
して測定された。陰性の比較対照はモノクローナル抗体
のない試料から構成されており、一方陽性の比較対照
は、HLAタイプ１組織適合性抗原に対するモノクローナ
ル抗体からなるものであった。平均チャンネルフルオレ
セインが少なくともバックグラウンドの３倍であった場
合に、着色は陽性であると見なされた。
糖脂質に対する抗体の反応性の測定 抗体は、微量試験ウェルに吸収させた精製糖脂質（コ
レステロールおよびレシチンを伴う）とのおよび糖脂質
が分画されている薄層クロマトグラフィープレートとの
インキュベーションによって糖脂質抗原への反応性に関
して試験された。結合抗体は、マウス免疫グロブリンに
対する抗血清および放射性ヨウ素結合タンパク質Ａとの
インキュベーションによって測定された。
レステロールおよびレシチンを伴う）とのおよび糖脂質
が分画されている薄層クロマトグラフィープレートとの
インキュベーションによって糖脂質抗原への反応性に関
して試験された。結合抗体は、マウス免疫グロブリンに
対する抗血清および放射性ヨウ素結合タンパク質Ａとの
インキュベーションによって測定された。
イソタイプ測定 ａ）オークターロニー免疫拡散法 特定のハイブリドーマの上澄液の部分標本が２％寒天
プレートの中央ウェル中へ入れられた。単特異性ウサギ
抗マウスIgイソタイプ抗体（メロイ［Meloy］）が外側
のウェル中へ入れられそしてプレートは室温で２時間、
さらに４℃で一晩インキュベートされた。
プレートの中央ウェル中へ入れられた。単特異性ウサギ
抗マウスIgイソタイプ抗体（メロイ［Meloy］）が外側
のウェル中へ入れられそしてプレートは室温で２時間、
さらに４℃で一晩インキュベートされた。
ｂ）可撓性ポリ塩化ビニル製の96ウェルプレート（コー
スター［Coster］）が37℃で２時間0.1mg/mlヤギ抗マウ
スIg抗体で被覆され、そして37℃で２時間３％BSA溶液
で逆被覆された。バイブリドーマ上澄液が次に37℃で２
時間インキュベートされた。PBSで洗浄した後、ウシ血
清アルブミン（BSA）プレートは、37℃で２時間ペルオ
キシダーゼに結合した単特異性ウサギ抗マウスIgイソタ
イプ抗体（ザイムド［Zymed］）とインキュベートされ
た。洗浄の後、プレートは0.1Mクエン酸緩衝液pH4.5中
の1mg/mlオルソフェニレンジアミンおよび0.3％ H2O2
とインキュベートされた。630nmでの光学密度がダイナ
テック酵素結合免疫吸着剤検定プレート読取器［Dynate
c ELISA plate reader］において測定された。
スター［Coster］）が37℃で２時間0.1mg/mlヤギ抗マウ
スIg抗体で被覆され、そして37℃で２時間３％BSA溶液
で逆被覆された。バイブリドーマ上澄液が次に37℃で２
時間インキュベートされた。PBSで洗浄した後、ウシ血
清アルブミン（BSA）プレートは、37℃で２時間ペルオ
キシダーゼに結合した単特異性ウサギ抗マウスIgイソタ
イプ抗体（ザイムド［Zymed］）とインキュベートされ
た。洗浄の後、プレートは0.1Mクエン酸緩衝液pH4.5中
の1mg/mlオルソフェニレンジアミンおよび0.3％ H2O2
とインキュベートされた。630nmでの光学密度がダイナ
テック酵素結合免疫吸着剤検定プレート読取器［Dynate
c ELISA plate reader］において測定された。
スタフィロコッカス タンパク質Ａ結合測定法 微小力価プレートがPBSに0.02％NaN3を加えたものの
中の５％FCSとインキュベートされそして上澄液は吸い
出された。腫瘍細胞の懸濁液（２×107細胞/ml）の25μ
ｌが、それぞれのウェルへ加えられ、そして室温で１時
間、特定の抗体25μｌとインキュベートされた。プレー
トは1200rpmで７分間遠心分離され、50％ NCS/PBS/NaN
3で二度洗浄され、そして125I−スタフィロコッカス
タンパク質Ａ（約50,000cpm/25l）25μｌが添加され
た。プレートは25℃で１時間インキュベートされ、50％
NCS/PBS/NaN3で２度洗浄され、そして乾燥された。ウ
ェルの底部が切断されそしてガンマーカウンター中で計
数された。
中の５％FCSとインキュベートされそして上澄液は吸い
出された。腫瘍細胞の懸濁液（２×107細胞/ml）の25μ
ｌが、それぞれのウェルへ加えられ、そして室温で１時
間、特定の抗体25μｌとインキュベートされた。プレー
トは1200rpmで７分間遠心分離され、50％ NCS/PBS/NaN
3で二度洗浄され、そして125I−スタフィロコッカス
タンパク質Ａ（約50,000cpm/25l）25μｌが添加され
た。プレートは25℃で１時間インキュベートされ、50％
NCS/PBS/NaN3で２度洗浄され、そして乾燥された。ウ
ェルの底部が切断されそしてガンマーカウンター中で計
数された。
実施例 モノクローナル抗体の調製 モノクローナル抗体は、３カ月齢のBALB/cマウスを転
移性非−小細胞肺癌を病んでいる患者からの胸膜滲出液
よりの細胞で免疫処置することによって産生された。免
疫処置は、約107細胞でマウスを腹腔内的に３〜４回注
射することにより行なわれた。最後の免疫処置の３日
後、脾臓が除去され、培養培地中に懸濁されそしてNS1
マウス骨髄腫細胞と融合された（コーラーとミルステイ
ン，上記）。混合物は、単一融合細胞（クローン）を起
源として発する低濃度培養株を形成するために接種され
た。ハイブリッド形成のために用いられるこの技術は、
イェイら［Yeh et al.］（インターナショナル ジャー
ナル オブ キャンサー（1979年）29:269〜275［Int.
J.Cancer（1979）29:269−275］によってすでに述べら
れている。
移性非−小細胞肺癌を病んでいる患者からの胸膜滲出液
よりの細胞で免疫処置することによって産生された。免
疫処置は、約107細胞でマウスを腹腔内的に３〜４回注
射することにより行なわれた。最後の免疫処置の３日
後、脾臓が除去され、培養培地中に懸濁されそしてNS1
マウス骨髄腫細胞と融合された（コーラーとミルステイ
ン，上記）。混合物は、単一融合細胞（クローン）を起
源として発する低濃度培養株を形成するために接種され
た。ハイブリッド形成のために用いられるこの技術は、
イェイら［Yeh et al.］（インターナショナル ジャー
ナル オブ キャンサー（1979年）29:269〜275［Int.
J.Cancer（1979）29:269−275］によってすでに述べら
れている。
ハイブリッド細胞からの上澄み液は、酵素結合免疫吸
着剤検定法およびオートラジオグラフィー的間接125I−
標識化タンパク質Ａ検定法［autoradiographic indirec
t125I−labelled protein A assey］（ブラウンら，ジ
ャーナル オブ イムノロジー メソッズ（1979年）3
1:201〜209［Brown et al.,J.Immunol.Meth.（1979）3
1:201−209］）の双方を用いることによって、とりわけ
細胞膜を含有する免疫処置に用いられた腫瘍からの抽出
物に対してスクリーニングされた。これらの抽出物は、
コルカーら［Colcher et al.］（キャンサー リサーチ
（1981年）42:1451〜1459［Cancer Res.,（1981）42:14
51−1459］）；イェイら（上記）から修正された方法を
用いて調製された。このために、組織はPBSで洗浄され
そして懸濁され、完全な腫瘍に関するものは、テンレス
鋼製ふるいを通して圧搾することによってなされた。こ
の後に、1mMフェニルメチルスルフォニルフルオライド
（カルビオケム−ベーリング コーポレーション カル
フォルニア州サンディエゴ［Calbiochem−Behring Cor
p.,San Diego,CA］）を含む1mM NaHCO3が添加され、原
料は、次にデューンス［Dounce］ホモジナイザーのＢ乳
棒の50ストロークで、氷上において均質化された。27,0
00×ｇで15分間の遠心分離の後、上澄み液が除去され、
そしてペレットはPBS中に再懸濁され、１分間音波処理
され、−70℃で貯蔵された。
着剤検定法およびオートラジオグラフィー的間接125I−
標識化タンパク質Ａ検定法［autoradiographic indirec
t125I−labelled protein A assey］（ブラウンら，ジ
ャーナル オブ イムノロジー メソッズ（1979年）3
1:201〜209［Brown et al.,J.Immunol.Meth.（1979）3
1:201−209］）の双方を用いることによって、とりわけ
細胞膜を含有する免疫処置に用いられた腫瘍からの抽出
物に対してスクリーニングされた。これらの抽出物は、
コルカーら［Colcher et al.］（キャンサー リサーチ
（1981年）42:1451〜1459［Cancer Res.,（1981）42:14
51−1459］）；イェイら（上記）から修正された方法を
用いて調製された。このために、組織はPBSで洗浄され
そして懸濁され、完全な腫瘍に関するものは、テンレス
鋼製ふるいを通して圧搾することによってなされた。こ
の後に、1mMフェニルメチルスルフォニルフルオライド
（カルビオケム−ベーリング コーポレーション カル
フォルニア州サンディエゴ［Calbiochem−Behring Cor
p.,San Diego,CA］）を含む1mM NaHCO3が添加され、原
料は、次にデューンス［Dounce］ホモジナイザーのＢ乳
棒の50ストロークで、氷上において均質化された。27,0
00×ｇで15分間の遠心分離の後、上澄み液が除去され、
そしてペレットはPBS中に再懸濁され、１分間音波処理
され、−70℃で貯蔵された。
細胞膜抽出物に結合する抗体を産生したハイブリドー
マは、クローン化され、試験管内で増殖され、そして抗
体特異性に関してさらに試験された。この試験上記した
免疫組織学的技術を用いることによって行なわれ、肺
癌、他の腫瘍および正常ヒト組織の冷凍切片に結合する
ための抗体の能力が試験された。ヒト肺癌腫に対する顕
性特異性の抗体を産生するこれらのハイブリドーマは再
クローンされ、増殖され、そしてプリスタン処理された
３カ月齢BALB/cマウス中へ注射され、そこで、これらは
腹水腫瘍として増殖した。
マは、クローン化され、試験管内で増殖され、そして抗
体特異性に関してさらに試験された。この試験上記した
免疫組織学的技術を用いることによって行なわれ、肺
癌、他の腫瘍および正常ヒト組織の冷凍切片に結合する
ための抗体の能力が試験された。ヒト肺癌腫に対する顕
性特異性の抗体を産生するこれらのハイブリドーマは再
クローンされ、増殖され、そしてプリスタン処理された
３カ月齢BALB/cマウス中へ注射され、そこで、これらは
腹水腫瘍として増殖した。
腹水中へ分泌される抗体は、タンパク質Ａセファロー
ス［Sepharose］において（エイら，イムノケミストリ
ー，（1978年）15:429［Ey et al.Immunochemistry（19
78）15:429］）あるいはセファクリルＳ−300［Sephacr
yl S−300］中でのゲル濾過によって精製された。精製
抗体は、免疫組織学による付加的な特異性試験、該抗体
が細胞表面に結合したことを測定するための完全細胞に
おける結合検定、および上記したような放射性免疫沈降
試験を含むなお一層の特性づけのために用いられた。
ス［Sepharose］において（エイら，イムノケミストリ
ー，（1978年）15:429［Ey et al.Immunochemistry（19
78）15:429］）あるいはセファクリルＳ−300［Sephacr
yl S−300］中でのゲル濾過によって精製された。精製
抗体は、免疫組織学による付加的な特異性試験、該抗体
が細胞表面に結合したことを測定するための完全細胞に
おける結合検定、および上記したような放射性免疫沈降
試験を含むなお一層の特性づけのために用いられた。
モノクローナル抗体L15は、上記したような免疫組織
学的技術にかけられた。
学的技術にかけられた。
抗体L15はNSCLC細胞に強く結合し、そして以下の細
胞、すなわち、結腸癌、乳癌、正常心臓、正常白血球、
正常脳、正常結腸、正常腎臓、正常脾臓、正常皮膚およ
び正常肝臓の細胞には結合しなかった。
胞、すなわち、結腸癌、乳癌、正常心臓、正常白血球、
正常脳、正常結腸、正常腎臓、正常脾臓、正常皮膚およ
び正常肝臓の細胞には結合しなかった。
L15と呼称される細胞系は共に1985年３月１日にA.T.
C.Cに寄託され、そしてそれぞれ受入番号HB8738を与え
られた。
C.Cに寄託され、そしてそれぞれ受入番号HB8738を与え
られた。
本発明は、上記の実施態様に特に言及して詳細に述べ
られた。しかしながら、種々の変更と修正が本発明の精
神と視野の範囲内で期待され得ることが理解されるべき
である。
られた。しかしながら、種々の変更と修正が本発明の精
神と視野の範囲内で期待され得ることが理解されるべき
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 カール エリック ヘルストーム アメリカ合衆国 ワシントン州 シアト ル、ノース イースト サーバー ディ ーアール．3925 (72)発明者 ダイアン ホーン アメリカ合衆国 ワシントン州 シアト ル、ウエスト オリンピック パレス ナンバー 404 202 (72)発明者 リンスレイ アメリカ合衆国 ワシントン州 シアト ル、ナインス ウエスト 2430 (56)参考文献 Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈ ｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．220［１ ］（1983）Ｐ．318−320 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，259［７ ］（1984）Ｐ．4681−4685 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，259［７ ］（1984）Ｐ．4672−4680
Claims (20)
- 【請求項１】その抗原結合部位は、ヒト非−小細胞肺癌
細胞の特性を有する細胞表面糖質抗原であるLey抗原に
結合する、ATCCに寄託された受入番号HB8738の特性を有
するハイブリドーマ細胞系によって産生されるL15と呼
称されるモノクローナル抗体。 - 【請求項２】その抗原結合部位は、ヒト非−小細胞肺癌
細胞の特性を有する細胞表面糖質抗原であるLey抗原に
結合する、ATCCに寄託された受入番号HB8738の特性を有
するハイブリドーマ細胞系によって産生されるL15と呼
称されるモノクローナル抗体のFab,F（ab′）2又はFvフ
ラグメント。 - 【請求項３】IgMクラスのものである特許請求の範囲第
１項に記載の抗体。 - 【請求項４】検知可能な信号を発生し得る標識に結合さ
れた特許請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗
体。 - 【請求項５】標識が蛍光体である特許請求の範囲第４項
に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項６】被検者からの組織をLey抗原である糖質抗
原の存在に関してその抗原結合部位が、ヒト非−小細胞
肺癌細胞の特性を有する細胞表面糖質抗原であるLey抗
原に結合する、ATCCに寄託された受入番号HB8738の特性
を有するハイブリドーマ細胞系によって産生されるL15
と呼称されるモノクローナル抗体を用いて調べることよ
りなる被検者の肺における悪性状態の存在を測定する方
法。 - 【請求項７】組織が、切除組織、剥脱性組織および体液
からなる群から選ばれたものである特許請求の範囲第６
項に記載の方法。 - 【請求項８】（ａ）Ley抗原である抗原上の決定部位に
結合するモノクローナル抗体の検体への結合のために被
検者から得られた組織の該検体を該モノクローナル抗体
と接触させ、 （ｂ）肺における悪性状態の存在に関連する結合であ
る、該抗体の該検体への結合の存在を観察することより
なる被検者の肺における悪性状態の存在を測定する特許
請求の範囲第６項に記載の方法。 - 【請求項９】結合の程度は、該検体を、検知可能な信号
を発生し得る標識と該モノクローナル抗体に関する特異
的結合パートナーとの接合体と接触させることにより測
定されるものである特許請求の範囲第８項に記載の方
法。 - 【請求項１０】モノクローナル抗体が、検知可能な信号
を発生し得る標識に接合されているものである特許請求
の範囲第８項に記載の方法。 - 【請求項１１】該モノクローナル抗体に関する標識され
た特異的結合パートナーが該モノクローナル抗体に対し
て特異的な抗体である特許請求の範囲第９項に記載の方
法。 - 【請求項１２】標識が発色団である特許請求の範囲第11
項に記載の方法。 - 【請求項１３】組織が、切除組織、剥脱性組織および体
液からなる群から選ばれたものである特許請求の範囲第
８項に記載の方法。 - 【請求項１４】（ａ）肺における悪性状態の存在を測定
するのに有用な、その抗原結合部位が、ヒト非−小細胞
肺癌細胞の特性を有する細胞表面糖質抗原であるLey抗
原に結合する、ATCCに寄託された受入番号HB8738の特性
を有するハイブリドーマ細胞系によって産生されるL15
と呼称されるモノクローナル抗体、あるいはそのFab,F
（ab′）2又はFvフラグメントと、 （ｂ）（１）信号発生系の１構成成分である標識と
（２）上記（ａ）のモノクローナル抗体の特異的結合パ
ートナーとの接合体からなる診断キット。 - 【請求項１５】標識が、酵素である特許請求の範囲第14
項に記載の診断キット。 - 【請求項１６】標識が、蛍光体である特許請求の範囲第
14項に記載の診断キット。 - 【請求項１７】（１）信号発生系の１構成成分である標
識と（２）肺における悪性状態の存在を測定するのに有
用な、その抗原結合部位が、ヒト非−小細胞肺癌細胞の
特性を有する細胞表面糖質抗原であるLey抗原に結合す
る、ATCCに寄託された受入番号HB8738の特性を有するハ
イブリドーマ細胞系によって産生されるL15と呼称され
るモノクローナル抗体、あるいはそのFab,F（ab′）2又
はFvフラグメントとの接合体からなる診断キット。 - 【請求項１８】標識が、蛍光体である特許請求の範囲第
17項に記載の診断キット。 - 【請求項１９】標識が、酵素である特許請求の範囲第17
項に記載の診断キット。 - 【請求項２０】（ａ）ヒト組織の検体を該モノクローナ
ル抗体と、該検体の該抗体への結合のための条件下で接
触させ、 （ｂ）該抗体の該検体への、該組織における悪性状態の
存在に関連する結合の存在を観察することよりなる、ヒ
ト組織における悪性状態の存在を測定するための特許請
求の範囲第６項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/738,612 US4873188A (en) | 1985-05-28 | 1985-05-28 | Method, monoclonal antibody, and monoclonal antibody fragments for detecting human non-small cell lung carcinomas and cell line for producing such antibodies |
| US738612 | 1985-05-28 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7318233A Division JP2655830B2 (ja) | 1985-05-28 | 1995-12-06 | ヒト非−小細胞肺癌に関するモノクローナル抗体産生細胞系 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6236198A JPS6236198A (ja) | 1987-02-17 |
| JP2555028B2 true JP2555028B2 (ja) | 1996-11-20 |
Family
ID=24968735
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61121399A Expired - Lifetime JP2555028B2 (ja) | 1985-05-28 | 1986-05-28 | ヒト非−小細胞肺癌に関するモノクロ−ナル抗体 |
| JP7318233A Expired - Lifetime JP2655830B2 (ja) | 1985-05-28 | 1995-12-06 | ヒト非−小細胞肺癌に関するモノクローナル抗体産生細胞系 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7318233A Expired - Lifetime JP2655830B2 (ja) | 1985-05-28 | 1995-12-06 | ヒト非−小細胞肺癌に関するモノクローナル抗体産生細胞系 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0203552B1 (ja) |
| JP (2) | JP2555028B2 (ja) |
| KR (1) | KR860009126A (ja) |
| AT (1) | ATE91132T1 (ja) |
| CA (1) | CA1337755C (ja) |
| DE (1) | DE3688638T2 (ja) |
| DK (1) | DK166682B1 (ja) |
| ES (1) | ES8707863A1 (ja) |
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| GB (1) | GB2176890B (ja) |
| GR (1) | GR861362B (ja) |
| HU (1) | HU208041B (ja) |
| IE (1) | IE59254B1 (ja) |
| IL (1) | IL78769A (ja) |
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| YU (1) | YU46168B (ja) |
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| AU616897B2 (en) * | 1987-07-31 | 1991-11-14 | Japan Immuno Research Laboratories Co., Ltd. | Detection method of abnormally-responding lymphocytes as well as detection reagent and kit therefor |
| JPH083487B2 (ja) * | 1987-07-31 | 1996-01-17 | 株式会社日本抗体研究所 | 異常応答リンパ球の検出方法並びにこれに用いる検出用試薬及びキット |
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| US5075218A (en) * | 1987-12-29 | 1991-12-24 | Biomira, Inc. | Screening for antibodies which bind carbohydrate epitopes of tumor-associated antigens, and uses thereof |
| AU632469B2 (en) * | 1988-04-04 | 1993-01-07 | Johns Hopkins University, The | A method for early detection of lung cancer |
| US6020145A (en) * | 1989-06-30 | 2000-02-01 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods for determining the presence of carcinoma using the antigen binding region of monoclonal antibody BR96 |
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|---|---|---|---|---|
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| US4752569A (en) * | 1984-06-21 | 1988-06-21 | The Regents Of The University Of California | Sialylated Lewisx epitope, antibodies and diagnosis |
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-
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1995
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Non-Patent Citations (3)
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| Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２２０［１］（１９８３）Ｐ．３１８−３２０ |
| Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９［７］（１９８４）Ｐ．４６７２−４６８０ |
| Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９［７］（１９８４）Ｐ．４６８１−４６８５ |
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