JPH08308572A - ヒト非−小細胞肺癌に関するモノクローナル抗体産生細胞系 - Google Patents
ヒト非−小細胞肺癌に関するモノクローナル抗体産生細胞系Info
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- JPH08308572A JPH08308572A JP7318233A JP31823395A JPH08308572A JP H08308572 A JPH08308572 A JP H08308572A JP 7318233 A JP7318233 A JP 7318233A JP 31823395 A JP31823395 A JP 31823395A JP H08308572 A JPH08308572 A JP H08308572A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】肺における悪性状態の存在を測定するのに有用
なモノクローナル抗体を産生する細胞系を提供する。 【解決手段】その抗原結合部位が、ヒト非−小細胞肺癌
細胞の特性を有する細胞表面糖質抗原であるＬｅy 抗原
を限定するＬ１５と呼称されるモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ細胞系。
なモノクローナル抗体を産生する細胞系を提供する。 【解決手段】その抗原結合部位が、ヒト非−小細胞肺癌
細胞の特性を有する細胞表面糖質抗原であるＬｅy 抗原
を限定するＬ１５と呼称されるモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ細胞系。
Description
【０００１】
【従来の技術】ヒト肺癌は男性における癌腫による多く
の死亡の原因となるものであり、また女性における癌腫
死亡の最も頻繁な原因としての乳癌の侵襲の過程である
（キャンサー ファクツ アンド フィガーズ，1983年
［Cancer Facts and Figures，1983］）。この疾患
は、４つの主な組織学的タイプ、すなわち類表皮腫（エ
ピデルモイド）（３０％）、腺癌（３５％）、未分化大
細胞（１５％）および小細胞（２０％）に分けることが
できる。肺癌の多くの症例は、化学療法および照射療法
によって治癒不可能である。小細胞肺癌は、大きさにお
ける低減によって化学療法および照射療法に応答する
が、全体的な治癒ではない。腫瘍の完全な外科手術的除
去が唯一有効な療法であると見なされている。しかしな
がら、予期せぬことには、肺癌患者の３０％未満が、診
断で完全に切除され得る腫瘍を有しており、また肺癌患
者の1/3 未満が、外科手術的完全除去の後５年間生存し
ている。それゆえ、肺癌のより早期の診断、癌延展の程
度のより良好な限定、およびより効果的な療法を可能と
する方法に対する大きな必要性が存在する。
の死亡の原因となるものであり、また女性における癌腫
死亡の最も頻繁な原因としての乳癌の侵襲の過程である
（キャンサー ファクツ アンド フィガーズ，1983年
［Cancer Facts and Figures，1983］）。この疾患
は、４つの主な組織学的タイプ、すなわち類表皮腫（エ
ピデルモイド）（３０％）、腺癌（３５％）、未分化大
細胞（１５％）および小細胞（２０％）に分けることが
できる。肺癌の多くの症例は、化学療法および照射療法
によって治癒不可能である。小細胞肺癌は、大きさにお
ける低減によって化学療法および照射療法に応答する
が、全体的な治癒ではない。腫瘍の完全な外科手術的除
去が唯一有効な療法であると見なされている。しかしな
がら、予期せぬことには、肺癌患者の３０％未満が、診
断で完全に切除され得る腫瘍を有しており、また肺癌患
者の1/3 未満が、外科手術的完全除去の後５年間生存し
ている。それゆえ、肺癌のより早期の診断、癌延展の程
度のより良好な限定、およびより効果的な療法を可能と
する方法に対する大きな必要性が存在する。
【０００２】モノクローナル抗体は、これらのすべての
目的のために用いられ得るものである。しかしながら、
必須条件は、正常成人組織においてよりもより肺癌にお
いて強く発現される抗原に対する抗体を見出すことであ
る。腫瘍細胞集団の公知の不均質性、同じ抗原における
いくつかの決定基の存在、治療学的標的と比較した場合
における診断マーカーとしてのこれらの好適性に関する
抗体間の予期された違い、および同じ抗原に対する異な
る抗体の異なる生物学的特性の見地において、いくつか
の異なる抗体が必要とされる。
目的のために用いられ得るものである。しかしながら、
必須条件は、正常成人組織においてよりもより肺癌にお
いて強く発現される抗原に対する抗体を見出すことであ
る。腫瘍細胞集団の公知の不均質性、同じ抗原における
いくつかの決定基の存在、治療学的標的と比較した場合
における診断マーカーとしてのこれらの好適性に関する
抗体間の予期された違い、および同じ抗原に対する異な
る抗体の異なる生物学的特性の見地において、いくつか
の異なる抗体が必要とされる。
【０００３】肺癌抗原に対するヒトモノクローナル抗体
は、シコラら［Sikora et al. ］（ブリテッシュ ジャ
ーナル オブ キャンサー（1981年）［Br. J. Cancer
(1981)］）によって述べられている。いくつかのタイプ
のヒト肺癌に関して特異性を示すモノクローナル抗体
は、カッチッタら［Cuttitta et al. ］（プロシーディ
ング オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイ
エンシズ オブ ザ ユナイテッド ステート オブ
アメリカ（1981年）78：4591〜4595［Proc. Natl. Aca
d. Sci. U.S.A. (1981)78：4591−4595］）によって開
示されている。モノクローナル抗体によって限定された
ヒト肺腺癌に関連する抗原が、バルキら［Varki et a
l.］（キャンサー リサーチ（1984年）44： 681〜 687
［Cancer Research (1984)44： 681− 687］）によって
述べられている。
は、シコラら［Sikora et al. ］（ブリテッシュ ジャ
ーナル オブ キャンサー（1981年）［Br. J. Cancer
(1981)］）によって述べられている。いくつかのタイプ
のヒト肺癌に関して特異性を示すモノクローナル抗体
は、カッチッタら［Cuttitta et al. ］（プロシーディ
ング オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイ
エンシズ オブ ザ ユナイテッド ステート オブ
アメリカ（1981年）78：4591〜4595［Proc. Natl. Aca
d. Sci. U.S.A. (1981)78：4591−4595］）によって開
示されている。モノクローナル抗体によって限定された
ヒト肺腺癌に関連する抗原が、バルキら［Varki et a
l.］（キャンサー リサーチ（1984年）44： 681〜 687
［Cancer Research (1984)44： 681− 687］）によって
述べられている。
【０００４】糖脂質Ｌｅx 抗原に対するマウスモノクロ
ーナル抗体が、ハコモリら［Hakomori et al. ］（バイ
オケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ コ
ミュニケーションズ（1981年） 100：1578〜1586［Bioc
hemical and Biophysical Research Communicaitons (1
981 ) 100：1578−1586］、ブロックホーズら［Brockh
aus et al.］（アーク．バイオケム．バイオフィズ（19
82年） 217： 647［Arch. Biochem. Biophys. (1982 )
217 ： 647］）、フクシら［Fukushi et al.］（ジャー
ナル オブ バイオロジー アンド ケミストリー（19
84年） 259： 506［J. Biol. Chem. (1984) 259： 50
6］）、フクシら（ジェイ．エクスプ．メド．（1984
年） 159： 506［J. Exp. Med. (1984) 159： 50
6］）、チャイアら［Chia et al. ］（キャンサー リ
サーチ（1985年）45： 435［Cancer Res. (1985)45： 4
35］）によって述べられている。Ｌｅx 抗原に対する抗
体は、アベら［Abe et al.］（ジャーナル オブ バイ
オロジイ アンド ケミストリー（1983年） 258：8934
［J. Biol. Chem. (1983) 258：8934］）、リオイドら
［Lloyd et al.］（イムノジェネテックス，（1983年）
17： 537［Immunogenetics (1983) 17： 537］）、ブラ
ウン ら［Brown et al.］（バイオサイ．レプ．（1983
年） 3： 163［Biosci. Rep. (1983) 3： 163］）によ
って述べられている。あらかじめ定められた特異性の抗
体を分泌する融合細胞の連続培養が、コーラーら［Kohl
er et al. ］（ネイチャー（1975年） 265： 495〜 497
［Nature (1975)265： 495− 497］）によって述べられ
ている。
ーナル抗体が、ハコモリら［Hakomori et al. ］（バイ
オケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ コ
ミュニケーションズ（1981年） 100：1578〜1586［Bioc
hemical and Biophysical Research Communicaitons (1
981 ) 100：1578−1586］、ブロックホーズら［Brockh
aus et al.］（アーク．バイオケム．バイオフィズ（19
82年） 217： 647［Arch. Biochem. Biophys. (1982 )
217 ： 647］）、フクシら［Fukushi et al.］（ジャー
ナル オブ バイオロジー アンド ケミストリー（19
84年） 259： 506［J. Biol. Chem. (1984) 259： 50
6］）、フクシら（ジェイ．エクスプ．メド．（1984
年） 159： 506［J. Exp. Med. (1984) 159： 50
6］）、チャイアら［Chia et al. ］（キャンサー リ
サーチ（1985年）45： 435［Cancer Res. (1985)45： 4
35］）によって述べられている。Ｌｅx 抗原に対する抗
体は、アベら［Abe et al.］（ジャーナル オブ バイ
オロジイ アンド ケミストリー（1983年） 258：8934
［J. Biol. Chem. (1983) 258：8934］）、リオイドら
［Lloyd et al.］（イムノジェネテックス，（1983年）
17： 537［Immunogenetics (1983) 17： 537］）、ブラ
ウン ら［Brown et al.］（バイオサイ．レプ．（1983
年） 3： 163［Biosci. Rep. (1983) 3： 163］）によ
って述べられている。あらかじめ定められた特異性の抗
体を分泌する融合細胞の連続培養が、コーラーら［Kohl
er et al. ］（ネイチャー（1975年） 265： 495〜 497
［Nature (1975)265： 495− 497］）によって述べられ
ている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、非−小細胞肺
癌（ＮＳＣＬＣ，［non-small cell lung carcinom
a］）細胞に関連する糖質［carbohydrate］（糖脂質［g
lycolipid］）抗原における決定部位を限定する新規な
モノクローナル抗体を産生する細胞系に関するものであ
る。”ＮＳＣＬＣ細胞”なる用語は、類表皮含細胞、腺
癌細胞および未分化大細胞癌細胞を含むものである。決
定部位はまた、例えば、乳房のいくつかの癌などのいく
つかの他の癌の抗原において見い出されることができ、
そして、これゆえ本発明の抗体は、これらの他の癌細胞
に対しても結合する。本発明のモノクローナル抗体は腫
瘍細胞に対するよりもより低い度合で正常成人細胞に結
合する。”より低い度合での結合”なる用語は、結合が
免疫組織学的技術によって検知することが不可能であろ
うことおよび腫瘍細胞に対するよりも正常細胞に対して
より弱い結合であるだろうことを意味する。このモノク
ローナル抗体は、マウスハイブリドーマによって分泌さ
れる。
癌（ＮＳＣＬＣ，［non-small cell lung carcinom
a］）細胞に関連する糖質［carbohydrate］（糖脂質［g
lycolipid］）抗原における決定部位を限定する新規な
モノクローナル抗体を産生する細胞系に関するものであ
る。”ＮＳＣＬＣ細胞”なる用語は、類表皮含細胞、腺
癌細胞および未分化大細胞癌細胞を含むものである。決
定部位はまた、例えば、乳房のいくつかの癌などのいく
つかの他の癌の抗原において見い出されることができ、
そして、これゆえ本発明の抗体は、これらの他の癌細胞
に対しても結合する。本発明のモノクローナル抗体は腫
瘍細胞に対するよりもより低い度合で正常成人細胞に結
合する。”より低い度合での結合”なる用語は、結合が
免疫組織学的技術によって検知することが不可能であろ
うことおよび腫瘍細胞に対するよりも正常細胞に対して
より弱い結合であるだろうことを意味する。このモノク
ローナル抗体は、マウスハイブリドーマによって分泌さ
れる。
【０００６】本発明はまた、Ｌｅx またはＬｅy 抗原の
特性を有する抗原の存在に関し肺組織および他のヒト組
織を調べることにより肺における悪性状態の存在を測定
する方法を含むものである。Ｌｅx 抗原は、ハコモリら
（上記）、ブロックホーズら（上記）、フクシら（上
記）およびチャイアら（上記）によって述べられてお
り、Ｌｅy 抗原は、アベら（上記）、リオイドら（上
記）およびブラウンら（上記）によって述べられてい
る。
特性を有する抗原の存在に関し肺組織および他のヒト組
織を調べることにより肺における悪性状態の存在を測定
する方法を含むものである。Ｌｅx 抗原は、ハコモリら
（上記）、ブロックホーズら（上記）、フクシら（上
記）およびチャイアら（上記）によって述べられてお
り、Ｌｅy 抗原は、アベら（上記）、リオイドら（上
記）およびブラウンら（上記）によって述べられてい
る。
【０００７】例えば、被験者からの細胞は、Ｌｅy また
はＬｅx である、あるいはＬｅy またはＬｅx の特性を
有する糖質抗原に関連した細胞における決定部位を限定
する抗体、あるいはこのような抗体の機能的等価体もし
くはフラグメントと接触され得る。これゆえ本発明は、
本発明のモノクローナル抗体を用いるいくつかの診断方
法に関するものである。このような方法のひとつは、Ｎ
ＳＣＬＣ細胞の存在の、このような細胞を含んでいるで
あろうと疑われる検体における、測定を包含するもので
ある。この検体は、モノクローナル抗体と接触させら
れ、そしてこのことは、この検体において存在し得る他
の細胞タイプから、このような細胞を識別できるもので
ある。接触は、抗体のこのような細胞への結合のための
条件下で行なわれる。接触の後、検体における抗体のこ
のような細胞への結合の存在あるいは不在が測定され
る。この結合は、検体におけるＮＳＣＬＣ細胞の存在あ
るいは不在に関連するものである。一般に、検体は、モ
ノクローナル抗体に関する標識された特異的結合パート
ナーと接触させられる。この標識は、検知可能な信号を
発し得るものである。他の診断方法は、特有に標識され
た（例えば放射性同位元素で）、そしてその後患者中へ
注射される抗体あるいは抗体フラグメントの腫瘍への局
在化を包含するものである。この方法は、疾患の程度に
関して癌患者を段階づけるためおよび療法に応じての変
化を観察するためのより良好な方法を提供し得る。
はＬｅx である、あるいはＬｅy またはＬｅx の特性を
有する糖質抗原に関連した細胞における決定部位を限定
する抗体、あるいはこのような抗体の機能的等価体もし
くはフラグメントと接触され得る。これゆえ本発明は、
本発明のモノクローナル抗体を用いるいくつかの診断方
法に関するものである。このような方法のひとつは、Ｎ
ＳＣＬＣ細胞の存在の、このような細胞を含んでいるで
あろうと疑われる検体における、測定を包含するもので
ある。この検体は、モノクローナル抗体と接触させら
れ、そしてこのことは、この検体において存在し得る他
の細胞タイプから、このような細胞を識別できるもので
ある。接触は、抗体のこのような細胞への結合のための
条件下で行なわれる。接触の後、検体における抗体のこ
のような細胞への結合の存在あるいは不在が測定され
る。この結合は、検体におけるＮＳＣＬＣ細胞の存在あ
るいは不在に関連するものである。一般に、検体は、モ
ノクローナル抗体に関する標識された特異的結合パート
ナーと接触させられる。この標識は、検知可能な信号を
発し得るものである。他の診断方法は、特有に標識され
た（例えば放射性同位元素で）、そしてその後患者中へ
注射される抗体あるいは抗体フラグメントの腫瘍への局
在化を包含するものである。この方法は、疾患の程度に
関して癌患者を段階づけるためおよび療法に応じての変
化を観察するためのより良好な方法を提供し得る。
【０００８】本発明はまた治療的適用を有するものであ
る。抗体は、腫瘍細胞表面で高い濃度にて発現される上
記の抗原のいずれかあるいは双方と反応し得る。その抗
体は、例えば化学療法製薬剤および放射性同位元素を含
む（しかしながらこれらに限定されるわけではない。）
抗腫瘍効果を有する種々の作用物質の担体として用いら
れることができる。
る。抗体は、腫瘍細胞表面で高い濃度にて発現される上
記の抗原のいずれかあるいは双方と反応し得る。その抗
体は、例えば化学療法製薬剤および放射性同位元素を含
む（しかしながらこれらに限定されるわけではない。）
抗腫瘍効果を有する種々の作用物質の担体として用いら
れることができる。
【０００９】本発明は、ヒトＮＳＣＬＣ細胞における抗
原に対して結合する新規な抗体を産生する細胞系に関す
るものである。本発明のモノクローナル抗体は、コーラ
ーとミルステイン［Kohler and Milstein ］の標準的技
法（上記）によって製造され得る。例えば、複数の滲出
液からのヒト肺癌細胞、またはヒト非−小細胞肺癌から
の培養細胞、または正常胎児肺からの細胞が、免疫原と
して用いられる。これらの細胞は、マウス中へ注射さ
れ、十分な時間の後にマウスは屠殺されそして脾細胞が
得られる。所望の免疫グロブリンをコードする脾細胞染
色体は、一般的にはポリエチレングリコ―ルの存在下に
おいて、脾細胞を骨髄腫細胞とあるいはリンパ腫細胞と
融合することによって不滅化される。融合されたハイブ
リドーマを含む得られた細胞は、ＨＡＴ培地などのごと
き選択培地において増殖させられ、そして生存細胞がこ
のような培地において限界希釈条件を用いて増殖され
る。細胞は、例えば微小力価ウェル（窪み）［microtit
er well ］などのような適当な容器中にて増殖され、そ
して上澄み液が所望の特異性を有するモノクローナル抗
体に関してスクリーニングされた。
原に対して結合する新規な抗体を産生する細胞系に関す
るものである。本発明のモノクローナル抗体は、コーラ
ーとミルステイン［Kohler and Milstein ］の標準的技
法（上記）によって製造され得る。例えば、複数の滲出
液からのヒト肺癌細胞、またはヒト非−小細胞肺癌から
の培養細胞、または正常胎児肺からの細胞が、免疫原と
して用いられる。これらの細胞は、マウス中へ注射さ
れ、十分な時間の後にマウスは屠殺されそして脾細胞が
得られる。所望の免疫グロブリンをコードする脾細胞染
色体は、一般的にはポリエチレングリコ―ルの存在下に
おいて、脾細胞を骨髄腫細胞とあるいはリンパ腫細胞と
融合することによって不滅化される。融合されたハイブ
リドーマを含む得られた細胞は、ＨＡＴ培地などのごと
き選択培地において増殖させられ、そして生存細胞がこ
のような培地において限界希釈条件を用いて増殖され
る。細胞は、例えば微小力価ウェル（窪み）［microtit
er well ］などのような適当な容器中にて増殖され、そ
して上澄み液が所望の特異性を有するモノクローナル抗
体に関してスクリーニングされた。
【００１０】モノクローナル抗体の収率を高めるために
種々の技術が存在し、例えばハイブリドーマ細胞を受け
入れる哺乳動物宿主の腹腔内へハイブリドーマ細胞を注
入し、そして腹水を収獲するといったようなことがあ
る。腹水中に十分な量のモノクローナル抗体が集められ
ない場合、該抗体は宿主の血液から収獲される。種々の
周知の方法が、モノクローナル抗体を他のタンパク質あ
るいは他の不純物から遊離するための、モノクローナル
抗体の単離および精製に関して存在する（コーラーとミ
ルステイン，上記，を参照のこと。） 本発明によるモノクローナル抗体は、Ｌ１５と呼称され
る。それは、Ｌｅy 抗原であるあるいはＬｅy 抗原の特
異性を有する、細胞表面糖質抗原を限定する。我々は、
この抗原をヒトＮＳＣＬＣ細胞およびいくつかの他のヒ
ト癌からの細胞の特性として認めている。抗体はＩｇＭ
イソタイプのものである。それは、主要臓器の線維芽細
胞、内皮細胞あるいは上皮細胞のような正常細胞に対し
て検知可能に結合することはない。Ｌ１５抗体は、Ｌ１
５マウスハイブリドーマによって産生される。
種々の技術が存在し、例えばハイブリドーマ細胞を受け
入れる哺乳動物宿主の腹腔内へハイブリドーマ細胞を注
入し、そして腹水を収獲するといったようなことがあ
る。腹水中に十分な量のモノクローナル抗体が集められ
ない場合、該抗体は宿主の血液から収獲される。種々の
周知の方法が、モノクローナル抗体を他のタンパク質あ
るいは他の不純物から遊離するための、モノクローナル
抗体の単離および精製に関して存在する（コーラーとミ
ルステイン，上記，を参照のこと。） 本発明によるモノクローナル抗体は、Ｌ１５と呼称され
る。それは、Ｌｅy 抗原であるあるいはＬｅy 抗原の特
異性を有する、細胞表面糖質抗原を限定する。我々は、
この抗原をヒトＮＳＣＬＣ細胞およびいくつかの他のヒ
ト癌からの細胞の特性として認めている。抗体はＩｇＭ
イソタイプのものである。それは、主要臓器の線維芽細
胞、内皮細胞あるいは上皮細胞のような正常細胞に対し
て検知可能に結合することはない。Ｌ１５抗体は、Ｌ１
５マウスハイブリドーマによって産生される。
【００１１】本発明によるモノクローナル抗体は、Ｌ１
７と呼称される。それは、Ｌｅx 抗原であるあるいはＬ
ｅx 抗原の特異性を有する、細胞表面糖質決定基を限定
する。我々は、この抗原もまたヒトＮＳＣＬＣ細胞およ
びいくつかの他のヒト癌からの細胞の特性として認めて
いる。この抗体はＩｇＭイソタイプのものである。それ
は、主要臓器の線維芽細胞、内皮細胞あるいは上皮細胞
のような正常細胞に対しては、腫瘍細胞に対するよりも
低く結合する。Ｌ１７抗体は、Ｌ１７マウスハイブリド
ーマによって産生される。
７と呼称される。それは、Ｌｅx 抗原であるあるいはＬ
ｅx 抗原の特異性を有する、細胞表面糖質決定基を限定
する。我々は、この抗原もまたヒトＮＳＣＬＣ細胞およ
びいくつかの他のヒト癌からの細胞の特性として認めて
いる。この抗体はＩｇＭイソタイプのものである。それ
は、主要臓器の線維芽細胞、内皮細胞あるいは上皮細胞
のような正常細胞に対しては、腫瘍細胞に対するよりも
低く結合する。Ｌ１７抗体は、Ｌ１７マウスハイブリド
ーマによって産生される。
【００１２】抗体Ｌ１５は、以下のごとく同定されたよ
うな構造を有するＬｅy を認識する。 異なる鎖長を有する糖脂質の系列が、この抗体によって
検知され得る。
うな構造を有するＬｅy を認識する。 異なる鎖長を有する糖脂質の系列が、この抗体によって
検知され得る。
【００１３】抗体Ｌ１７は、末端でＬｅx を運ぶすべて
の、糖脂質抗原、すなわち； の系列と反応する。Ｒは種々の長さの血液型２の鎖であ
り得る（ Galα1 → 4GlcNAcβ1 →3Galβ1 → 4GalNAc
β1 → 3）。
の、糖脂質抗原、すなわち； の系列と反応する。Ｒは種々の長さの血液型２の鎖であ
り得る（ Galα1 → 4GlcNAcβ1 →3Galβ1 → 4GalNAc
β1 → 3）。
【００１４】この抗体はまた以下に示すようなトリクコ
シルＹ構造； と反応する。
シルＹ構造； と反応する。
【００１５】本発明の範疇にはまた、例えばFab 、(Fa
b')2 、Ｆｖフラグメントなどのような上記モノクロー
ナル抗体の有用な結合フラグメントが含まれる。これら
の抗体フラグメントは周知の技法によって得られる。例
えば、有用な結合フラグメントは、パパインあるいはペ
プシンを用いる抗原のペプチターゼ分解によって調製さ
れ得る。
b')2 、Ｆｖフラグメントなどのような上記モノクロー
ナル抗体の有用な結合フラグメントが含まれる。これら
の抗体フラグメントは周知の技法によって得られる。例
えば、有用な結合フラグメントは、パパインあるいはペ
プシンを用いる抗原のペプチターゼ分解によって調製さ
れ得る。
【００１６】本発明はまた、Ｌｅy もしくはＬｅx 抗原
の、あるいはＬｅx およびＬｅy 抗原の特性を有する抗
原（すなわち、Ｌｅy あるいはＬｅx に関連するが全く
同一ではないものであり、Ｌｅy あるいはＬｅx を認識
する抗体によって認識される抗原）の、ヒトにおけるＮ
ＳＣＬＣ癌を検知するあるいは治療することにおける診
断学的および治療学的使用をも含むものである。抗原
は、ハコモリら（上記）によっておよびアベら（上記）
によって述べられるような周知の方法によって精製され
得る。
の、あるいはＬｅx およびＬｅy 抗原の特性を有する抗
原（すなわち、Ｌｅy あるいはＬｅx に関連するが全く
同一ではないものであり、Ｌｅy あるいはＬｅx を認識
する抗体によって認識される抗原）の、ヒトにおけるＮ
ＳＣＬＣ癌を検知するあるいは治療することにおける診
断学的および治療学的使用をも含むものである。抗原
は、ハコモリら（上記）によっておよびアベら（上記）
によって述べられるような周知の方法によって精製され
得る。
【００１７】本発明の一方法は、被験者からの肺組織あ
るいは他の組織を、Ｌｅy もしくはＬｅx である、ある
いはＬｅy もしくはＬｅx の特性を有する糖質抗原の存
在に関して調べることによる、被験者の肺悪性状態の存
在の測定を包含するものである。”組織”なる用語は、
切除細胞、剥脱性細胞、ならびに血液、血漿、血清、尿
等の体液等に関するものである。”悪性状態”なる用語
は、癌そのもの、新生物形成の［neoplastic］悪性の
［malignant ］ないしは腫瘍の［tumor ］細胞、あるい
は同様のものを含む意味での形成異常細胞の存在に関す
るものである。例えば検体は、例えばＬ１５もしくはＬ
１７抗体のような本発明のモノクローナル抗体のような
Ｌｅy もしくはＬｅx における決定部位を認識するモノ
クローナル抗体と、または例えばハコモリら（上記）、
フクシら（上記）、チャイアら（上記）、アベら（上
記）、リオイドら（上記）およびブラウンら（上記）に
よって述べられたような抗体のごとき同様の特性を有す
る抗体と接触され得るあるいは組合され得る。接触は抗
体の悪性細胞への結合のための条件下で行なわれる。接
触の後、検体における悪性細胞への抗体の結合の存在が
観察される。すなわち、検体は、抗体と抗原部位との免
疫複合体に関して調べられる。この免疫複合体形成は、
検体における悪性細胞の存在に関するものである。
るいは他の組織を、Ｌｅy もしくはＬｅx である、ある
いはＬｅy もしくはＬｅx の特性を有する糖質抗原の存
在に関して調べることによる、被験者の肺悪性状態の存
在の測定を包含するものである。”組織”なる用語は、
切除細胞、剥脱性細胞、ならびに血液、血漿、血清、尿
等の体液等に関するものである。”悪性状態”なる用語
は、癌そのもの、新生物形成の［neoplastic］悪性の
［malignant ］ないしは腫瘍の［tumor ］細胞、あるい
は同様のものを含む意味での形成異常細胞の存在に関す
るものである。例えば検体は、例えばＬ１５もしくはＬ
１７抗体のような本発明のモノクローナル抗体のような
Ｌｅy もしくはＬｅx における決定部位を認識するモノ
クローナル抗体と、または例えばハコモリら（上記）、
フクシら（上記）、チャイアら（上記）、アベら（上
記）、リオイドら（上記）およびブラウンら（上記）に
よって述べられたような抗体のごとき同様の特性を有す
る抗体と接触され得るあるいは組合され得る。接触は抗
体の悪性細胞への結合のための条件下で行なわれる。接
触の後、検体における悪性細胞への抗体の結合の存在が
観察される。すなわち、検体は、抗体と抗原部位との免
疫複合体に関して調べられる。この免疫複合体形成は、
検体における悪性細胞の存在に関するものである。
【００１８】本発明による方法の特定の実施例（説明の
ために挙げられるもので本発明を限定するものではな
い。）は、切除細胞における腫瘍細胞の検知方法であ
る。上記方法は、腫瘍の除去の後に得られた腫瘍の一切
片である検体に対して適用される。切除される腫瘍は、
切片を得るために処理され、この処理は、切除直後に、
通常の冷凍である、腫瘍もしくは組織を冷凍することを
最初に含むものである。組織の冷凍層は、次に、例えば
低温槽を用いて、切片へと切断される。
ために挙げられるもので本発明を限定するものではな
い。）は、切除細胞における腫瘍細胞の検知方法であ
る。上記方法は、腫瘍の除去の後に得られた腫瘍の一切
片である検体に対して適用される。切除される腫瘍は、
切片を得るために処理され、この処理は、切除直後に、
通常の冷凍である、腫瘍もしくは組織を冷凍することを
最初に含むものである。組織の冷凍層は、次に、例えば
低温槽を用いて、切片へと切断される。
【００１９】上記のようにして得られた腫瘍の切片は、
本発明のモノクローナル抗体と接触させられ、そして次
に検知可能な標識で標識された、上記モノクローナル抗
体に対して指向した第２の抗体と接触させられる。切除
された検体、例えば腫瘍の切片は、第１のモノクローナ
ル抗体と、該抗体の悪性細胞への結合のための条件下で
接触させられる。インキュベーションは、例えばガラス
製ペトリ皿のような適当な容器において、約２０〜３０
℃の温度で約１５〜３０分間の間、例えば少量のアジ酸
ナトリウムを含有するリン酸緩衝食塩水などのような水
性培地中で通常行なわれる。用いられる抗体の量は、通
常検知可能な結合を提供する、すなわち抗体と問題の決
定ないしは抗原部位との間の免疫複合体の検知可能な数
を提供するのに十分なものである。
本発明のモノクローナル抗体と接触させられ、そして次
に検知可能な標識で標識された、上記モノクローナル抗
体に対して指向した第２の抗体と接触させられる。切除
された検体、例えば腫瘍の切片は、第１のモノクローナ
ル抗体と、該抗体の悪性細胞への結合のための条件下で
接触させられる。インキュベーションは、例えばガラス
製ペトリ皿のような適当な容器において、約２０〜３０
℃の温度で約１５〜３０分間の間、例えば少量のアジ酸
ナトリウムを含有するリン酸緩衝食塩水などのような水
性培地中で通常行なわれる。用いられる抗体の量は、通
常検知可能な結合を提供する、すなわち抗体と問題の決
定ないしは抗原部位との間の免疫複合体の検知可能な数
を提供するのに十分なものである。
【００２０】インキュベーションに続き、切片は、非特
異的に結合した抗体を低減ないし消去するために洗浄さ
れ、そして次に、抗原部位を保持する検体の細胞へのモ
ノクローナル抗体の結合によるものである上記の複合体
を観察するために調べられる。結合は、切片における悪
性細胞の存在に関するものである。従って、結合は、例
えば、検体を該モノクローナル抗体に関する標識された
特異的結合パートナーと接触させることによって測定さ
れる。標識は検知可能な信号を発し得るものであり、放
射性標識、例えば蛍光体などのような発色団、酵素など
であり得る。
異的に結合した抗体を低減ないし消去するために洗浄さ
れ、そして次に、抗原部位を保持する検体の細胞へのモ
ノクローナル抗体の結合によるものである上記の複合体
を観察するために調べられる。結合は、切片における悪
性細胞の存在に関するものである。従って、結合は、例
えば、検体を該モノクローナル抗体に関する標識された
特異的結合パートナーと接触させることによって測定さ
れる。標識は検知可能な信号を発し得るものであり、放
射性標識、例えば蛍光体などのような発色団、酵素など
であり得る。
【００２１】上記のアプローチを用いる技術の一例は、
免疫蛍光染色法である。この技術において、腫瘍の冷凍
切片は、アセトンを用いてガラス製スライド上に固定さ
れ、そして例えばペトリ皿にて、モノクローナル抗体と
インキュベートされる。例えばリン酸緩衝食塩水などの
ような適当な緩衝液で洗浄の後、この切片は、ペトリ皿
上に移され、そして例えば、用いられたモノクローナル
抗体に関して特異的な標識化抗体であり得る、モノクロ
ーナル抗体に関する標識された特異的結合パートナーと
接触させられる。ほとんどの場合において、モノクロー
ナル抗体はマウス源由来のものであるので、モノクロー
ナル抗体に関し特異的な標識された抗マウス免疫グロブ
リンが用いられ得る。このような免疫グロブリンは、適
当な宿主をマウス抗体で注射し、十分な時間をおき、そ
して注射された宿主の血液から抗マウス免疫グロブリン
を収獲することによる標準的技術により産生され得る。
免疫蛍光染色法である。この技術において、腫瘍の冷凍
切片は、アセトンを用いてガラス製スライド上に固定さ
れ、そして例えばペトリ皿にて、モノクローナル抗体と
インキュベートされる。例えばリン酸緩衝食塩水などの
ような適当な緩衝液で洗浄の後、この切片は、ペトリ皿
上に移され、そして例えば、用いられたモノクローナル
抗体に関して特異的な標識化抗体であり得る、モノクロ
ーナル抗体に関する標識された特異的結合パートナーと
接触させられる。ほとんどの場合において、モノクロー
ナル抗体はマウス源由来のものであるので、モノクロー
ナル抗体に関し特異的な標識された抗マウス免疫グロブ
リンが用いられ得る。このような免疫グロブリンは、適
当な宿主をマウス抗体で注射し、十分な時間をおき、そ
して注射された宿主の血液から抗マウス免疫グロブリン
を収獲することによる標準的技術により産生され得る。
【００２２】該スライドの、例えば水性緩衝液を用いて
の二度目の洗浄の後に、切片は、蛍光抗体含有流体およ
びカバーグラスで覆われ、そして次に該切片に対するモ
ノクローナル抗体の結合を測定するために蛍光顕微鏡で
調べられた。結合の測定はまた、検体中でこのような結
合の位置の識別をも含むものである。検体へのモノクロ
ーナル抗体の結合はまた、放射性物質、染料および蛍光
体を含む発色団、あるいは酵素などのような検知可能な
信号を発し得る標識に共有結合されたモノクローナル抗
体を用いることによって測定され得る。抗体当りの用い
られた標識の数は、標識された抗体が用いられる診断方
法の必要条件および抗体へ標識を結合するための部位の
有効性によって通常決定される。
の二度目の洗浄の後に、切片は、蛍光抗体含有流体およ
びカバーグラスで覆われ、そして次に該切片に対するモ
ノクローナル抗体の結合を測定するために蛍光顕微鏡で
調べられた。結合の測定はまた、検体中でこのような結
合の位置の識別をも含むものである。検体へのモノクロ
ーナル抗体の結合はまた、放射性物質、染料および蛍光
体を含む発色団、あるいは酵素などのような検知可能な
信号を発し得る標識に共有結合されたモノクローナル抗
体を用いることによって測定され得る。抗体当りの用い
られた標識の数は、標識された抗体が用いられる診断方
法の必要条件および抗体へ標識を結合するための部位の
有効性によって通常決定される。
【００２３】抗体および抗体フラグメントへ標識を結合
させるための方法は当分野において周知のものである。
このような方法は、米国特許第 4,220,450号、第 4,23
5,869号、第 3,935,074号および第 3,996,345号中に見
い出される。本発明のモノクロ―ナル抗体が用いられ得
る技術の他の例は、血漿および血清を含む意味での体液
中におけるＬｅx およびＬｅy 決定基を負う分子の検知
である。この目的のため、本発明の抗体は、単独である
いは別の決定基に対して指向する他の抗体と共に用いら
れ得る。
させるための方法は当分野において周知のものである。
このような方法は、米国特許第 4,220,450号、第 4,23
5,869号、第 3,935,074号および第 3,996,345号中に見
い出される。本発明のモノクロ―ナル抗体が用いられ得
る技術の他の例は、血漿および血清を含む意味での体液
中におけるＬｅx およびＬｅy 決定基を負う分子の検知
である。この目的のため、本発明の抗体は、単独である
いは別の決定基に対して指向する他の抗体と共に用いら
れ得る。
【００２４】本発明のモノクローナル抗体が用いられる
技術のさらに別の例は、イムノペルオキシダーゼ標識
［Immunoperoxidase labeling ］（ガリギュースら，イ
ンターナショナル ジャーナル オブ キャンサー（19
82年）29： 511〜 515により変更されたようなステロン
ベーガー，イムノサイトケミストリー，ジョン ウィリ
ー アンド サンズ，ニューヨーク，1979年，第 104〜
109頁［Sternberger, Immunocytochemistry, John Wil
ey & Sons, New York, 1979, pp104-169 as modified b
y Garrigues et al., Int. J. Cancer (1982) 29： 511
− 515］）である。試験されるべき組織は、ガラス製ス
ライドなどのような支持体上に、アセトンなどのような
適当な溶媒を用いて固定される。次に、組織は、モノク
ローナル抗体とインキュベートされ、そして洗浄されて
結合していない抗体が除かれる。次に組織はウサギ抗マ
ウスＩｇＧとインキュベートされ、結合していない抗体
を除去するために洗浄され、マウスペルオキシダーゼ‐
抗ペルオキシダーゼ複合体と組合され、結合していない
接合体を除去するために洗浄し、そして次に酵素に関す
る基質で処理された。この処理に続き、該スライドは、
検知可能な信号に関して調べられた。
技術のさらに別の例は、イムノペルオキシダーゼ標識
［Immunoperoxidase labeling ］（ガリギュースら，イ
ンターナショナル ジャーナル オブ キャンサー（19
82年）29： 511〜 515により変更されたようなステロン
ベーガー，イムノサイトケミストリー，ジョン ウィリ
ー アンド サンズ，ニューヨーク，1979年，第 104〜
109頁［Sternberger, Immunocytochemistry, John Wil
ey & Sons, New York, 1979, pp104-169 as modified b
y Garrigues et al., Int. J. Cancer (1982) 29： 511
− 515］）である。試験されるべき組織は、ガラス製ス
ライドなどのような支持体上に、アセトンなどのような
適当な溶媒を用いて固定される。次に、組織は、モノク
ローナル抗体とインキュベートされ、そして洗浄されて
結合していない抗体が除かれる。次に組織はウサギ抗マ
ウスＩｇＧとインキュベートされ、結合していない抗体
を除去するために洗浄され、マウスペルオキシダーゼ‐
抗ペルオキシダーゼ複合体と組合され、結合していない
接合体を除去するために洗浄し、そして次に酵素に関す
る基質で処理された。この処理に続き、該スライドは、
検知可能な信号に関して調べられた。
【００２５】本発明の抗体は、例えば、だ液のような肺
からの剥脱性細胞検体におけるあるいは子宮頚部塗抹標
本における、悪性状態の存在を測定する方法に用いられ
得る。”剥脱性”なる用語は、検体が、組織の表面をこ
するあるいは洗浄することによって得られた単離細胞あ
るいは細胞の凝集物（それらの細胞は個々に、あるいは
鱗屑ないしは板状において除去される。）からなるもの
であることを意味するものである。剥脱性細胞検体は、
生検によって得られたもののような、切除された組織か
ら識別されるべきである。検体と抗体との間の接触は、
抗原部位への抗体の結合のための条件下で行なわれる。
接触の後、抗原部位への抗体の結合の存在あるいは不在
が測定され、そしてこれは肺における悪性状態の存在に
関するものである。
からの剥脱性細胞検体におけるあるいは子宮頚部塗抹標
本における、悪性状態の存在を測定する方法に用いられ
得る。”剥脱性”なる用語は、検体が、組織の表面をこ
するあるいは洗浄することによって得られた単離細胞あ
るいは細胞の凝集物（それらの細胞は個々に、あるいは
鱗屑ないしは板状において除去される。）からなるもの
であることを意味するものである。剥脱性細胞検体は、
生検によって得られたもののような、切除された組織か
ら識別されるべきである。検体と抗体との間の接触は、
抗原部位への抗体の結合のための条件下で行なわれる。
接触の後、抗原部位への抗体の結合の存在あるいは不在
が測定され、そしてこれは肺における悪性状態の存在に
関するものである。
【００２６】肺における悪性の存在を測定するために、
痰試料は、この方法において使用される剥脱性細胞検体
を与える。この方法は、気管支、あるいは咽頭口部、口
を含む胃腸路などからの剥脱性細胞検体における悪性状
態の検知において利用性を見出すものである。剥脱性細
胞検体は次に、抗原‐抗体複合体を形成するために、検
体の特異的抗原部位への抗体の結合のための条件下で前
述の抗体と接触させられた。この抗原部位は、検体にお
ける細胞あるいは細胞フラグメント上に存在され得る。
一般に、検体は例えば通常ガラスあるいはその他の適当
な物質からなるスライドのような適当な支持体上へ載置
される。剥脱性細胞検体は、通常、スライドの表面上に
検体の薄層を与えるようにスライド上で塗抹される。抗
体と検体との間の接触は、通常、水性緩衝化培地中にて
行なわれる。用いられる緩衝液は、リン酸塩、トリス、
重炭酸塩などを含む。pHは、検体および抗体の状態に関
係するものであって、通常５〜８の範囲内にある。水性
培地は、約０〜４０％の量の有機極性溶媒をさらに含ん
でいてもよい。有機極性溶媒は水溶性であり、通常約１
〜１０個の炭素原子と約１〜４個の酸素原子を有してい
る。抗体は、水性培地中に約１〜１００μｇ／ｍｌ、好
ましくは約１０〜２０μｇ／ｍｌの濃度で存在する。検
体の抗体との接触の間の温度は、約４〜４０℃、好まし
くは１０〜３０℃である。接触の期間は、通常約１５〜
１２０分、好ましくは約３０〜６０分間である。
痰試料は、この方法において使用される剥脱性細胞検体
を与える。この方法は、気管支、あるいは咽頭口部、口
を含む胃腸路などからの剥脱性細胞検体における悪性状
態の検知において利用性を見出すものである。剥脱性細
胞検体は次に、抗原‐抗体複合体を形成するために、検
体の特異的抗原部位への抗体の結合のための条件下で前
述の抗体と接触させられた。この抗原部位は、検体にお
ける細胞あるいは細胞フラグメント上に存在され得る。
一般に、検体は例えば通常ガラスあるいはその他の適当
な物質からなるスライドのような適当な支持体上へ載置
される。剥脱性細胞検体は、通常、スライドの表面上に
検体の薄層を与えるようにスライド上で塗抹される。抗
体と検体との間の接触は、通常、水性緩衝化培地中にて
行なわれる。用いられる緩衝液は、リン酸塩、トリス、
重炭酸塩などを含む。pHは、検体および抗体の状態に関
係するものであって、通常５〜８の範囲内にある。水性
培地は、約０〜４０％の量の有機極性溶媒をさらに含ん
でいてもよい。有機極性溶媒は水溶性であり、通常約１
〜１０個の炭素原子と約１〜４個の酸素原子を有してい
る。抗体は、水性培地中に約１〜１００μｇ／ｍｌ、好
ましくは約１０〜２０μｇ／ｍｌの濃度で存在する。検
体の抗体との接触の間の温度は、約４〜４０℃、好まし
くは１０〜３０℃である。接触の期間は、通常約１５〜
１２０分、好ましくは約３０〜６０分間である。
【００２７】検体と抗体との間の接触の後、支持体は通
常未反応抗体を除去するために処理される。通常、これ
は支持体を水性の、通常緩衝化された、培地で洗浄する
ことによりなされる。次に、検体における抗原部位へ結
合した抗体（ここでこの結合は、該位置での悪性状態の
存在に関するものである。）の存在が観察される。すな
わち、検体は、形成された抗原‐抗体（免疫）複合体の
数を測定するために調べられる。いくつかの例において
は、問題の抗原部位の極めて少ない数が、剥脱性細胞検
体において見い出され得ることに注意すべきである。し
かしながら、悪性状態においては、多数の抗原部位が存
在し、この後者の状態は、多数の抗原‐抗体複合体が、
悪性状態が存在している場合には計測可能であるゆえ
に、この方法により、非悪性状態以上に容易に識別でき
る。結合の存在の測定を行なうために、検知可能な信号
を発する手段が、検定系に組入れられる。例えば、検定
において用いられた抗体を検知可能な信号を発し得る標
識へ結合させることができる。標識は、放射性物質、染
料および蛍光体を含む発色団、酵素あるいは同様のもの
であり得る。抗体に対して用いられる標識の数は、方法
の必要条件および抗体へ標識を結合させるための部位の
有効性によって通常決定される。
常未反応抗体を除去するために処理される。通常、これ
は支持体を水性の、通常緩衝化された、培地で洗浄する
ことによりなされる。次に、検体における抗原部位へ結
合した抗体（ここでこの結合は、該位置での悪性状態の
存在に関するものである。）の存在が観察される。すな
わち、検体は、形成された抗原‐抗体（免疫）複合体の
数を測定するために調べられる。いくつかの例において
は、問題の抗原部位の極めて少ない数が、剥脱性細胞検
体において見い出され得ることに注意すべきである。し
かしながら、悪性状態においては、多数の抗原部位が存
在し、この後者の状態は、多数の抗原‐抗体複合体が、
悪性状態が存在している場合には計測可能であるゆえ
に、この方法により、非悪性状態以上に容易に識別でき
る。結合の存在の測定を行なうために、検知可能な信号
を発する手段が、検定系に組入れられる。例えば、検定
において用いられた抗体を検知可能な信号を発し得る標
識へ結合させることができる。標識は、放射性物質、染
料および蛍光体を含む発色団、酵素あるいは同様のもの
であり得る。抗体に対して用いられる標識の数は、方法
の必要条件および抗体へ標識を結合させるための部位の
有効性によって通常決定される。
【００２８】あるいはまた、洗浄されたスライドを、例
えば用いられた抗体に対して特異的な標識された抗体で
あり得る、抗体に対する標識された特異的結合パートナ
ーと接触させることも可能である。モノクローナル抗体
がマウス源由来のものである場合には、該方法において
用いられた抗体に対して特異性の標識された抗マウス免
疫グロブリンが用いられ得る。このような免疫グロブリ
ンは、適当な宿主にモノクローナル抗体を注射し、適当
な時間をおき、そして注射された宿主の血液から抗マウ
ス免疫グロブリンを収獲することによる標準的技術によ
って産生され得る。抗体に対する標識された特異的結合
パートナーが用いられる場合、スライドは、該スライド
を蛍光に関して調べる前に再度、水性培地で洗浄されな
ければならない。
えば用いられた抗体に対して特異的な標識された抗体で
あり得る、抗体に対する標識された特異的結合パートナ
ーと接触させることも可能である。モノクローナル抗体
がマウス源由来のものである場合には、該方法において
用いられた抗体に対して特異性の標識された抗マウス免
疫グロブリンが用いられ得る。このような免疫グロブリ
ンは、適当な宿主にモノクローナル抗体を注射し、適当
な時間をおき、そして注射された宿主の血液から抗マウ
ス免疫グロブリンを収獲することによる標準的技術によ
って産生され得る。抗体に対する標識された特異的結合
パートナーが用いられる場合、スライドは、該スライド
を蛍光に関して調べる前に再度、水性培地で洗浄されな
ければならない。
【００２９】蛍光体標識が用いられる場合において抗体
と細胞検体との間の結合の存在を測定するために、スラ
イドは、通常は蛍光顕微鏡を用いて、蛍光に関して調べ
られる。蛍光体以外の標識が用いられる場合には、スラ
イドないし検体は、沈澱物、色彩等の形成に関して調べ
られる。上記の説明は、免疫蛍光検査技術における本発
明の抗体使用に主として注がれたものである。しかしな
がら本発明の抗体は、抗原‐抗体反応を含むほとんどの
検定法において用いられることができるものである。該
検定法群は、均質性［homogeneous ］でも不均質性［he
terogeneous ］でもよい。均質性検定方法においては、
検体は、血清、尿および同様なもののごとき生物学的流
体であり得、または、検体は溶解されそして屑を除去す
るために清澄化され得る。免疫学的反応は、通常特異的
抗体、標識された被分析物および関心の試料を含むもの
である。標識から生じる信号が、抗体の標識された被分
析物への結合において直接的にあるいは間接的に変化さ
れる。免疫学的反応およびその程度検知の双方が、均質
溶液において行なわれる。用いられ得る免疫化学標識
は、フリーラジカル類、蛍光染料類、酵素類、バクテリ
オファージ類、補酵素類などが含まれる。
と細胞検体との間の結合の存在を測定するために、スラ
イドは、通常は蛍光顕微鏡を用いて、蛍光に関して調べ
られる。蛍光体以外の標識が用いられる場合には、スラ
イドないし検体は、沈澱物、色彩等の形成に関して調べ
られる。上記の説明は、免疫蛍光検査技術における本発
明の抗体使用に主として注がれたものである。しかしな
がら本発明の抗体は、抗原‐抗体反応を含むほとんどの
検定法において用いられることができるものである。該
検定法群は、均質性［homogeneous ］でも不均質性［he
terogeneous ］でもよい。均質性検定方法においては、
検体は、血清、尿および同様なもののごとき生物学的流
体であり得、または、検体は溶解されそして屑を除去す
るために清澄化され得る。免疫学的反応は、通常特異的
抗体、標識された被分析物および関心の試料を含むもの
である。標識から生じる信号が、抗体の標識された被分
析物への結合において直接的にあるいは間接的に変化さ
れる。免疫学的反応およびその程度検知の双方が、均質
溶液において行なわれる。用いられ得る免疫化学標識
は、フリーラジカル類、蛍光染料類、酵素類、バクテリ
オファージ類、補酵素類などが含まれる。
【００３０】不均質性検定方法においては、試薬は、通
常、検体、特異性抗体、および検知可能な信号を発する
ための手段である。検体はプレートあるいはスライドな
どのような支持体上に通常載置され、そして液相中で抗
体と接触させられる。支持体は次に液相から分離され、
支持体相あるいは液相のいずれかが、検知可能な信号に
関して、このような信号を発する手段を用いて調べられ
る。この信号は、検体における被分析物の存在に関する
ものである。検知可能な信号を発する手段は、放射性標
識類、蛍光体類、酵素類などの使用を含むものである。
不均質性免疫検定法の例としては、放射性標識免疫検定
法（ラジオイムノアッセイ）、免疫蛍光検査方法、酵素
結合免疫学的検定法などが含まれる。
常、検体、特異性抗体、および検知可能な信号を発する
ための手段である。検体はプレートあるいはスライドな
どのような支持体上に通常載置され、そして液相中で抗
体と接触させられる。支持体は次に液相から分離され、
支持体相あるいは液相のいずれかが、検知可能な信号に
関して、このような信号を発する手段を用いて調べられ
る。この信号は、検体における被分析物の存在に関する
ものである。検知可能な信号を発する手段は、放射性標
識類、蛍光体類、酵素類などの使用を含むものである。
不均質性免疫検定法の例としては、放射性標識免疫検定
法（ラジオイムノアッセイ）、免疫蛍光検査方法、酵素
結合免疫学的検定法などが含まれる。
【００３１】上記の免疫学的検定技術の詳細な論議に関
しては、エドワード ティー マギオ［Edward T. Magg
io］（シーアールシー プレス インコーポレーテッ
ド，ボカ ラトン，フロリダ，1980年［CRC Press In
c., Boca Raton, Florida,1980］）による”エンザイム
‐イムノアッセイ［Enzyme-Immunoassay］”を参照のこ
と。例えば、米国特許第 3,690,834号、第 3,791,932
号、第 3,817,837号、第 3,850,578号、第 3,853,987
号、第 3,867,517号、第 3,901,654号、第 3,935,074
号、第 3,984,533号、第 3,996,345号および第 4,098,8
76号（この列挙は、余す所なく掲げることを意図するも
のではない。）もまた参照のこと。
しては、エドワード ティー マギオ［Edward T. Magg
io］（シーアールシー プレス インコーポレーテッ
ド，ボカ ラトン，フロリダ，1980年［CRC Press In
c., Boca Raton, Florida,1980］）による”エンザイム
‐イムノアッセイ［Enzyme-Immunoassay］”を参照のこ
と。例えば、米国特許第 3,690,834号、第 3,791,932
号、第 3,817,837号、第 3,850,578号、第 3,853,987
号、第 3,867,517号、第 3,901,654号、第 3,935,074
号、第 3,984,533号、第 3,996,345号および第 4,098,8
76号（この列挙は、余す所なく掲げることを意図するも
のではない。）もまた参照のこと。
【００３２】本発明の抗体はまた、ジェイ．ナクル．メ
ド．（1983年）24： 123〜 129［J.Nucl. Med. (1983)2
4： 123− 129］中におよびジャ―ナル オブ クリニ
カルインベスティゲーション（1983年）72：2101〜2114
［J. Clin. Invest. (1983) 72：2101−2114］中に悪性
骨髄腫に関して述べられたものと同様な方法において、
ＮＳＣＬＣを保持するヒト患者での転移性沈積物を画像
とするために用いられ得る。抗体またはそのフラグメン
トは、放射性標識され、そして患者へ静脈内的に投与さ
れ、その後該患者は例えばガンマ線カメラなどを用いて
画像とされる。
ド．（1983年）24： 123〜 129［J.Nucl. Med. (1983)2
4： 123− 129］中におよびジャ―ナル オブ クリニ
カルインベスティゲーション（1983年）72：2101〜2114
［J. Clin. Invest. (1983) 72：2101−2114］中に悪性
骨髄腫に関して述べられたものと同様な方法において、
ＮＳＣＬＣを保持するヒト患者での転移性沈積物を画像
とするために用いられ得る。抗体またはそのフラグメン
トは、放射性標識され、そして患者へ静脈内的に投与さ
れ、その後該患者は例えばガンマ線カメラなどを用いて
画像とされる。
【００３３】本発明による方法の上記の特定の実施例群
は、それぞれの抗原上の特異的決定部位に結合するおよ
びマウス源からのＩｇＭサブクラスのものである抗体を
用いるものであるが、これは何ら限定を意味するもので
はない。上記抗体類、ならびにマウス源、ヒトを含むそ
の他の哺乳動物源もしくは他の源またはこれらの組合せ
のいずれかからの上記抗体類と機能的等価性を有する抗
体類が本発明の方法において、その他のイソタイプと同
様に用いられ得る。”機能的等価性”なる用語は、抗体
がそれぞれ上記に述べた決定部位のいずれかに結合する
ことができ、そしてこのような部位に関して本発明の特
定の抗体と競合し得ることを意味する。すなわち、この
ような抗体は、このような決定部位を有する細胞もしく
は細胞フラグメントまたは分泌された抗原を含有する検
体と組合せられた場合に、このような決定部位に結合
し、そしてこのような部位への結合から本発明の抗体を
阻害するものであろう。さらにまた、Ｌｅy およびＬｅ
x 抗原が１つ以上の決定部位を有するゆえに、本発明の
方法は、前記のモノクローナル抗体類によって限定され
た決定部位以外の決定部位を限定するモノクローナル抗
体類の使用を含むものである。
は、それぞれの抗原上の特異的決定部位に結合するおよ
びマウス源からのＩｇＭサブクラスのものである抗体を
用いるものであるが、これは何ら限定を意味するもので
はない。上記抗体類、ならびにマウス源、ヒトを含むそ
の他の哺乳動物源もしくは他の源またはこれらの組合せ
のいずれかからの上記抗体類と機能的等価性を有する抗
体類が本発明の方法において、その他のイソタイプと同
様に用いられ得る。”機能的等価性”なる用語は、抗体
がそれぞれ上記に述べた決定部位のいずれかに結合する
ことができ、そしてこのような部位に関して本発明の特
定の抗体と競合し得ることを意味する。すなわち、この
ような抗体は、このような決定部位を有する細胞もしく
は細胞フラグメントまたは分泌された抗原を含有する検
体と組合せられた場合に、このような決定部位に結合
し、そしてこのような部位への結合から本発明の抗体を
阻害するものであろう。さらにまた、Ｌｅy およびＬｅ
x 抗原が１つ以上の決定部位を有するゆえに、本発明の
方法は、前記のモノクローナル抗体類によって限定され
た決定部位以外の決定部位を限定するモノクローナル抗
体類の使用を含むものである。
【００３４】本発明はまた、上記に述べた方法を実施す
るための診断キットを含むものである。１つの実施態様
においては、診断キットは、（ａ）上記により詳細に定
義されたモノクローナル抗体および（ｂ）上記モノクロ
ーナル抗体に対する特異結合パートナーと検知可能な信
号を発し得る標識との接合体からなる。この試薬はま
た、緩衝化剤、および例えば、ポリサッカライド類のよ
うなタンパク質安定化剤などのごとき補助的作用物質を
も含み得る。この診断キットはさらにまた、必要に応じ
て、該標識が一構成成分である信号発生系の他の構成成
分、試験におけるバックグラウンド干渉を低減するため
の作用物質、対照試薬、試験を行なうための装置などを
含み得るものである。他の実施態様においては、診断キ
ットは、本発明のモノクローナル抗体と検知可能な信号
を発し得る標識との接合体からなるものである。上記し
たような補助的作用物質はまた存在し得る。
るための診断キットを含むものである。１つの実施態様
においては、診断キットは、（ａ）上記により詳細に定
義されたモノクローナル抗体および（ｂ）上記モノクロ
ーナル抗体に対する特異結合パートナーと検知可能な信
号を発し得る標識との接合体からなる。この試薬はま
た、緩衝化剤、および例えば、ポリサッカライド類のよ
うなタンパク質安定化剤などのごとき補助的作用物質を
も含み得る。この診断キットはさらにまた、必要に応じ
て、該標識が一構成成分である信号発生系の他の構成成
分、試験におけるバックグラウンド干渉を低減するため
の作用物質、対照試薬、試験を行なうための装置などを
含み得るものである。他の実施態様においては、診断キ
ットは、本発明のモノクローナル抗体と検知可能な信号
を発し得る標識との接合体からなるものである。上記し
たような補助的作用物質はまた存在し得る。
【００３５】本発明の抗体は、治療学的に用いられ得
る。固有の生物学的特性を有する抗体は、直接治療剤と
して有用であり得る（シェアーズら、コントル．オンコ
ル．カーガー，バッセル（1984年）19： 180〜 192［Se
ars, et al., Control. Oncol.Karger, Basel, (1984)1
9： 180− 192］）。さらにまた、抗体は、免疫毒素を
形成するために毒素へ、はまた放射線製薬的または製薬
的に形成するために放射性物質または薬剤へ結合され得
る。抗体の免疫毒素あるいは放射線製薬品を製造する方
法は、周知である（例えばキャンサー トリートメント
レポーツ（1984年）68： 317〜 328［Cancer Treatme
nt Reports (1984) 68： 317− 328］を参照のこ
と。）。
る。固有の生物学的特性を有する抗体は、直接治療剤と
して有用であり得る（シェアーズら、コントル．オンコ
ル．カーガー，バッセル（1984年）19： 180〜 192［Se
ars, et al., Control. Oncol.Karger, Basel, (1984)1
9： 180− 192］）。さらにまた、抗体は、免疫毒素を
形成するために毒素へ、はまた放射線製薬的または製薬
的に形成するために放射性物質または薬剤へ結合され得
る。抗体の免疫毒素あるいは放射線製薬品を製造する方
法は、周知である（例えばキャンサー トリートメント
レポーツ（1984年）68： 317〜 328［Cancer Treatme
nt Reports (1984) 68： 317− 328］を参照のこ
と。）。
【００３６】本発明のモノクローナル抗体の他の治療的
用途は、免疫源として本発明のモノクローナル抗体の１
つを使用することにより産生される抗イディオタイプ抗
体での患者免疫処置である。このような免疫処置は、能
動的抗腫瘍活性をもたらし得る（例えば、ネポムら，プ
ロシーディング オブ ザ ナショナル アカデミーオ
ド サイエンシズ オブ ザ ユナイテッド ステート
オブ アメリカ（1984年）81：2864〜2867［Nepom et
al., Proc. Natl. Sci. U.S.A. (1984)81：2864−286
7］を参照のこと。）。同様のアプローチにおいて、患
者は、それぞれの抗体の精製形態あるいは変性形態にお
けるそれぞれの抗体で免疫化され得る。
用途は、免疫源として本発明のモノクローナル抗体の１
つを使用することにより産生される抗イディオタイプ抗
体での患者免疫処置である。このような免疫処置は、能
動的抗腫瘍活性をもたらし得る（例えば、ネポムら，プ
ロシーディング オブ ザ ナショナル アカデミーオ
ド サイエンシズ オブ ザ ユナイテッド ステート
オブ アメリカ（1984年）81：2864〜2867［Nepom et
al., Proc. Natl. Sci. U.S.A. (1984)81：2864−286
7］を参照のこと。）。同様のアプローチにおいて、患
者は、それぞれの抗体の精製形態あるいは変性形態にお
けるそれぞれの抗体で免疫化され得る。
【００３７】本発明の興味ある観点は、本発明の抗体
は、例えば、それぞれ1984年11月 2日および1984年12月
21日に出願された米国特許一連番号第 667,521号および
第 684,759号に述べられたようなＮＳＣＬＣに対するそ
の他の抗体と組み合わせることができることである。こ
の組合せは、上記したような少なくとも４つのタイプの
肺癌、すなわち、未分化大細胞肺癌、小細胞肺癌、腺癌
および類表皮癌を検知することにおいて有効である。
は、例えば、それぞれ1984年11月 2日および1984年12月
21日に出願された米国特許一連番号第 667,521号および
第 684,759号に述べられたようなＮＳＣＬＣに対するそ
の他の抗体と組み合わせることができることである。こ
の組合せは、上記したような少なくとも４つのタイプの
肺癌、すなわち、未分化大細胞肺癌、小細胞肺癌、腺癌
および類表皮癌を検知することにおいて有効である。
【００３８】本発明のモノクローナル抗体はまた、乳癌
などのようなその他の癌に関連する抗原における決定部
位を限定する。従って、本発明の抗体は、このような癌
に対して指向する診断的あるいは治療的製品における使
用を見い出し得るものである。
などのようなその他の癌に関連する抗原における決定部
位を限定する。従って、本発明の抗体は、このような癌
に対して指向する診断的あるいは治療的製品における使
用を見い出し得るものである。
【００３９】
【００４０】
【実施例１】本発明は、以外の例示的実施例によってさ
らに論証される。いくつかの用いられた手段が最初に述
べられる。 免疫組織学的技術 冷凍断片における免疫組織学的研究のために、ガリギュ
ースら［Garrigues etal.］（インターナショナル ジ
ャーナル オブ キャンサー（1982年）29： 511〜 515
［Int. J. Cancer (1982) 29： 511− 515］）によって
修正されるようなイムノケミストリー，ジョン ウイリ
ー アンド サンズ，ニューヨーク，1979年，第 104〜
169頁［Immunochemistry, John Wiley & Sons, New Yo
rk, 1979, pp:104-169］中のステルンベーガー［Sternb
erger ］の非標識化抗体技術［unlabelled antibody te
chnique ］が用いられた。これらの試験に関する標的組
織は、外科手術で得られそして液体窒素中で予め冷却さ
れたいたイソペンタン中での剥離の４時間以内で冷凍さ
れた。組織は、そして使用するまで、液体窒素中である
いは−７０℃で貯蔵された。ウサギ抗マウスＩｇＧ（ス
テルンベーガー‐メイヤー イムノケミカルズ インコ
ーポレーテッド，メリーランド州ジャレッティスビル
［Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc. Jarettsv
ille, MD］）が1/50の希釈で用いられた。特に精製され
たマウスペルオキシダーゼ‐抗ペルオキシダーゼ複合体
２mg／ｍｌを含有するマウスペルオキシダーゼ‐抗ペル
オキシダーゼ複合体（ＰＡＰ，ステルンベーガー‐メイ
ヤー イムノケミカルズ インコーポレーテッド）が1/
80の希釈で用いられた。冷凍切片が調製され、乾燥さ
れ、アセトンで処理されそして乾燥された（ガリギュー
スら［Garrigues et al.］，1982年）。組織学的評価に
関して用いられる切片は、ヘモトキシリンで染色され
た。非特異的バックグラウンドを減少するために、切片
は、1/5 に希釈された正常ヒト血清と予備的にインキュ
ベートされた（ガリギュースら，1982年）。マウス抗
体、ヤギ抗マウスＩｇＧおよびマウスＰＡＰが１０％正
常ヒト血清および３％ウサギ血清の溶液中に希釈され
た。
らに論証される。いくつかの用いられた手段が最初に述
べられる。 免疫組織学的技術 冷凍断片における免疫組織学的研究のために、ガリギュ
ースら［Garrigues etal.］（インターナショナル ジ
ャーナル オブ キャンサー（1982年）29： 511〜 515
［Int. J. Cancer (1982) 29： 511− 515］）によって
修正されるようなイムノケミストリー，ジョン ウイリ
ー アンド サンズ，ニューヨーク，1979年，第 104〜
169頁［Immunochemistry, John Wiley & Sons, New Yo
rk, 1979, pp:104-169］中のステルンベーガー［Sternb
erger ］の非標識化抗体技術［unlabelled antibody te
chnique ］が用いられた。これらの試験に関する標的組
織は、外科手術で得られそして液体窒素中で予め冷却さ
れたいたイソペンタン中での剥離の４時間以内で冷凍さ
れた。組織は、そして使用するまで、液体窒素中である
いは−７０℃で貯蔵された。ウサギ抗マウスＩｇＧ（ス
テルンベーガー‐メイヤー イムノケミカルズ インコ
ーポレーテッド，メリーランド州ジャレッティスビル
［Sternberger-Meyer Immunochemicals, Inc. Jarettsv
ille, MD］）が1/50の希釈で用いられた。特に精製され
たマウスペルオキシダーゼ‐抗ペルオキシダーゼ複合体
２mg／ｍｌを含有するマウスペルオキシダーゼ‐抗ペル
オキシダーゼ複合体（ＰＡＰ，ステルンベーガー‐メイ
ヤー イムノケミカルズ インコーポレーテッド）が1/
80の希釈で用いられた。冷凍切片が調製され、乾燥さ
れ、アセトンで処理されそして乾燥された（ガリギュー
スら［Garrigues et al.］，1982年）。組織学的評価に
関して用いられる切片は、ヘモトキシリンで染色され
た。非特異的バックグラウンドを減少するために、切片
は、1/5 に希釈された正常ヒト血清と予備的にインキュ
ベートされた（ガリギュースら，1982年）。マウス抗
体、ヤギ抗マウスＩｇＧおよびマウスＰＡＰが１０％正
常ヒト血清および３％ウサギ血清の溶液中に希釈され
た。
【００４１】染色手順は、一連の切片を２．５時間特異
的抗体あるいは対照抗体のいずれかで処理し、1/50に希
釈されたウサギ抗マウスＩｇＧと３０分間インキュベー
トされ、そして1/80に希釈されたマウスＰＡＰ複合体に
３０分間されされることから成るものであった。抗体と
のそれぞれの処理の後、スライドはリン酸緩衝食塩水
（ＰＢＳ）中で２度ずつ洗浄された。免疫組織化学的反
応は、０．０５Ｍトリス、pH７．６中の新たに調製され
た０．０５％ 3,3'‐ジアミノベンジド テトラハイド
ロクロライド（シグマ，ミズーリー州セントルイス）お
よび０．０１％過酸化水素を８分間用いて発展させられ
た。蒸溜水中の１％ ＯｓＯ4 溶液へ２０分間さらにさ
らすことは、着色を強烈なものにした。切片は水ですす
がれ、アルコール中で脱水化され、キシレン中で透明と
され、スライド上に載置された。切片はそれぞれコード
下で研究され、コードされた試料はひとりの無関係な研
究者によって調査された。代表的なスライドは微分干渉
差異光学（ゼイス‐ノマルスキー［Zeiss-Nomarski］）
を用いることによって写真とされた。抗体着色の程度
は、０（反応性なし）、＋（わずかの陽性細胞）、＋＋
（少なくとも１／３の細胞陽性）、＋＋＋（多くの細胞
陽性）、＋＋＋（ほぼ全ての細胞強い陽性）として評価
された。＋と０の着色の間の差異は、＋＋と＋との間の
差異よりもより明確さの低いわかれ目であったので、＋
＋ないしはそれ以上として程度づけされた着色を”陽
性”として数えることを決定した。腫瘍細胞および支質
細胞の双方が腫瘍試料中に観察されたが、支質細胞は全
く着色されないかあるいは腫瘍細胞よりもより弱く着色
されるゆえ、着色は、腫瘍細胞のものに関連して記録さ
れた。 抗原位置の決定 抗原の細胞下局在は、非イオン性界面活性剤での透過化
の前あるいは後の細胞に対して結合する抗体を計測する
ことによって測定された。完全な培養細胞の細胞表面へ
結合する抗体は、 125Ｉ標識された抗体を用いての直接
結合検定法（ブラウンら，プロシーディング オブ ザ
ナショナル アカデミー オブ サイエンシズ オブ
ザ ユナイテッド ステート オブ アメリカ（1981
年）78：539〜 543［Brown et al., Proc. Natl. Acad.
Sci.U.S.A. (1981) 78： 539−543］）によってあるい
は、（ＦＡＣＳ）II細胞識別器を用いる間接蛍光によっ
て同定された。細胞内位置に結合する抗体は、 125Ｉ標
識された抗体を細胞に直接結合させ、続いて、パラホル
ムアルデヒドで固定化し、さらに続いて非イオン性界面
活性剤ＮＰ−４０で透過化することによって測定され
た。 結合検定法 ａ）放射性標識された抗体を用いることによって行なわ
れる結合検定法（ブラウンら，上記）のために、培養細
胞（１０6 ）は、培養培地中で熱活性化（５６℃で３０
分間）胎児ウシ血清１００μｌ中の 125Ｉ標識された抗
体１０6 cpm と４℃で３０分間インキュベ―トされた。
ＰＢＳ ５ｍｌの添加の後、細胞は２５０×ｇで１０分
間遠心分離することによってペレット化された。上澄み
液は吸い出され、そしてペレットは 125Ｉに関して計数
された。非特異的結合を計測するために、並行的インキ
ュベーションが競合物として標識されていない抗体１０
μｇを用いて行なわれた（ブラウンら，上記）いくつか
の例においては、係合検定法は、類似の様式においてプ
ラスチック製培養皿へ付着した細胞単一層上で行なわれ
た。 ｂ）ＦＡＣＳII細胞識別器において行なわれる結合検定
法のために、細胞は、５mMエチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）を含むＰＢＳを用いて、それらの基質から除去
された。１×１０5 細胞を含有する試料は最初に２μｇ
／ｍｌの濃度でモノクローナル抗体とインキュベートさ
れ、続いて１：２００の希釈でフルオレセイン結合ヤギ
抗マウス抗体とインキュベートされた。細胞は次に洗浄
されそして培養培地中に再懸濁された。ＦＡＣＳ分析の
直前に、ヨウ化プロピシウムが非生存細胞を染色するた
めに１μｇ／ｍｌの最終濃度へと添加された。ＦＡＣＳ
分析の間、細胞放射赤色蛍光が、生存細胞のみを調べる
ために、電子的に追出された。フルオレセイン蛍光の平
均強度が、次にそれぞれの抗体に関して測定された。陰
性の比較対照はモノクローナル抗体のない試料から構成
されており、一方陽性の比較対照は、ＨＬＡタイプ１組
織適合性抗原に対するモノクローナル抗体からなるもの
であった。平均チャンネルフルオレセインが少なくとも
バックグラウンドの３倍であった場合に、着色は陽性で
あると見なされた。 糖脂質に対する抗体の反応性の測定 抗体は、微量試験ウェルに吸収させた精製糖脂質（コレ
ステロールおよびレシチンを伴う）とのおよび糖脂質が
分画されている薄層クロマトグラフィープレートとのイ
ンキュベーションによって糖脂質抗原への反応性に関し
て試験された。結合抗体は、マウス免疫グロブリンに対
する抗血清および放射性ヨウ素結合タンパク質Ａとのイ
ンキュベーションによって測定された。 イソタイプ測定 ａ）オークターロニー免疫拡散法 特定のハイブリドーマの上澄液の部分標本が２％寒天プ
レートの中央ウェル中へ入れられた。単特異性ウサギ抗
マウスＩｇイソタイプ抗体（メロイ［Meloy ］）が外側
のウェル中へ入れられそしてプレートは室温で２時間、
さらに４℃で一晩インキュベートされた。 ｂ）可撓性ポリ塩化ビニル製の９６ウェルプレート（コ
ースター［Coster］）が３７℃で２時間０．１mg／ｍｌ
ヤギ抗マウスＩｇ抗体で被覆され、そして３７℃で２時
間３％ＢＳＡ溶液で逆被覆された。ハイブリドーマ上澄
液が次に３７℃で２時間インキュベートされた。ＰＢＳ
で洗浄した後、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）プレート
は、３７℃で２時間ペルオキシダーゼに結合した単特異
性ウサギ抗マウスＩｇイソタイプ抗体（ザイムド［Zyme
d ］）とインキュベートされた。洗浄の後、プレートは
０．１Ｍクエン酸緩衝液pH４．５中の１mg／ｍｌオルソ
フェニレンジアミンおよび０．３％ Ｈ2 Ｏ2 とインキ
ュベートされた。６３０nmでの光学密度がダイナテック
酵素結合免疫吸着剤検定プレート読取器［Dynatec ELIS
A plate reader］において測定された。 スタフィロコッカス タンパク質Ａ結合測定法 微小力価プレートがＰＢＳに０．０２％ＮａＮ3 を加え
たものの中の５％ＦＣＳとインキュベートされそして上
澄液は吸い出された。腫瘍細胞の懸濁液（２×１０7 細
胞／ｍｌ）の２５μｌが、それぞれのウェルへ加えら
れ、そして室温で１時間、特定の抗体２５μｌとインキ
ュベートされた。プレートは１２００rpmで７分間遠心
分離され、５０％ ＮＣＳ／ＰＢＳ／ＮａＮ3 で二度洗
浄され、そして 125Ｉ‐スタフィロコッカス タンパク
質Ａ（約５０，０００cpm ／２５ｌ）２５μｌが添加さ
れた。プレートは２５℃で１時間インキュベートされ、
５０％ ＮＣＳ／ＰＢＳ／ＮａＮ3 で２度洗浄され、そ
して乾燥された。ウェルの底部が切断されそしてガンマ
ーカウンター中で計数された。
的抗体あるいは対照抗体のいずれかで処理し、1/50に希
釈されたウサギ抗マウスＩｇＧと３０分間インキュベー
トされ、そして1/80に希釈されたマウスＰＡＰ複合体に
３０分間されされることから成るものであった。抗体と
のそれぞれの処理の後、スライドはリン酸緩衝食塩水
（ＰＢＳ）中で２度ずつ洗浄された。免疫組織化学的反
応は、０．０５Ｍトリス、pH７．６中の新たに調製され
た０．０５％ 3,3'‐ジアミノベンジド テトラハイド
ロクロライド（シグマ，ミズーリー州セントルイス）お
よび０．０１％過酸化水素を８分間用いて発展させられ
た。蒸溜水中の１％ ＯｓＯ4 溶液へ２０分間さらにさ
らすことは、着色を強烈なものにした。切片は水ですす
がれ、アルコール中で脱水化され、キシレン中で透明と
され、スライド上に載置された。切片はそれぞれコード
下で研究され、コードされた試料はひとりの無関係な研
究者によって調査された。代表的なスライドは微分干渉
差異光学（ゼイス‐ノマルスキー［Zeiss-Nomarski］）
を用いることによって写真とされた。抗体着色の程度
は、０（反応性なし）、＋（わずかの陽性細胞）、＋＋
（少なくとも１／３の細胞陽性）、＋＋＋（多くの細胞
陽性）、＋＋＋（ほぼ全ての細胞強い陽性）として評価
された。＋と０の着色の間の差異は、＋＋と＋との間の
差異よりもより明確さの低いわかれ目であったので、＋
＋ないしはそれ以上として程度づけされた着色を”陽
性”として数えることを決定した。腫瘍細胞および支質
細胞の双方が腫瘍試料中に観察されたが、支質細胞は全
く着色されないかあるいは腫瘍細胞よりもより弱く着色
されるゆえ、着色は、腫瘍細胞のものに関連して記録さ
れた。 抗原位置の決定 抗原の細胞下局在は、非イオン性界面活性剤での透過化
の前あるいは後の細胞に対して結合する抗体を計測する
ことによって測定された。完全な培養細胞の細胞表面へ
結合する抗体は、 125Ｉ標識された抗体を用いての直接
結合検定法（ブラウンら，プロシーディング オブ ザ
ナショナル アカデミー オブ サイエンシズ オブ
ザ ユナイテッド ステート オブ アメリカ（1981
年）78：539〜 543［Brown et al., Proc. Natl. Acad.
Sci.U.S.A. (1981) 78： 539−543］）によってあるい
は、（ＦＡＣＳ）II細胞識別器を用いる間接蛍光によっ
て同定された。細胞内位置に結合する抗体は、 125Ｉ標
識された抗体を細胞に直接結合させ、続いて、パラホル
ムアルデヒドで固定化し、さらに続いて非イオン性界面
活性剤ＮＰ−４０で透過化することによって測定され
た。 結合検定法 ａ）放射性標識された抗体を用いることによって行なわ
れる結合検定法（ブラウンら，上記）のために、培養細
胞（１０6 ）は、培養培地中で熱活性化（５６℃で３０
分間）胎児ウシ血清１００μｌ中の 125Ｉ標識された抗
体１０6 cpm と４℃で３０分間インキュベ―トされた。
ＰＢＳ ５ｍｌの添加の後、細胞は２５０×ｇで１０分
間遠心分離することによってペレット化された。上澄み
液は吸い出され、そしてペレットは 125Ｉに関して計数
された。非特異的結合を計測するために、並行的インキ
ュベーションが競合物として標識されていない抗体１０
μｇを用いて行なわれた（ブラウンら，上記）いくつか
の例においては、係合検定法は、類似の様式においてプ
ラスチック製培養皿へ付着した細胞単一層上で行なわれ
た。 ｂ）ＦＡＣＳII細胞識別器において行なわれる結合検定
法のために、細胞は、５mMエチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）を含むＰＢＳを用いて、それらの基質から除去
された。１×１０5 細胞を含有する試料は最初に２μｇ
／ｍｌの濃度でモノクローナル抗体とインキュベートさ
れ、続いて１：２００の希釈でフルオレセイン結合ヤギ
抗マウス抗体とインキュベートされた。細胞は次に洗浄
されそして培養培地中に再懸濁された。ＦＡＣＳ分析の
直前に、ヨウ化プロピシウムが非生存細胞を染色するた
めに１μｇ／ｍｌの最終濃度へと添加された。ＦＡＣＳ
分析の間、細胞放射赤色蛍光が、生存細胞のみを調べる
ために、電子的に追出された。フルオレセイン蛍光の平
均強度が、次にそれぞれの抗体に関して測定された。陰
性の比較対照はモノクローナル抗体のない試料から構成
されており、一方陽性の比較対照は、ＨＬＡタイプ１組
織適合性抗原に対するモノクローナル抗体からなるもの
であった。平均チャンネルフルオレセインが少なくとも
バックグラウンドの３倍であった場合に、着色は陽性で
あると見なされた。 糖脂質に対する抗体の反応性の測定 抗体は、微量試験ウェルに吸収させた精製糖脂質（コレ
ステロールおよびレシチンを伴う）とのおよび糖脂質が
分画されている薄層クロマトグラフィープレートとのイ
ンキュベーションによって糖脂質抗原への反応性に関し
て試験された。結合抗体は、マウス免疫グロブリンに対
する抗血清および放射性ヨウ素結合タンパク質Ａとのイ
ンキュベーションによって測定された。 イソタイプ測定 ａ）オークターロニー免疫拡散法 特定のハイブリドーマの上澄液の部分標本が２％寒天プ
レートの中央ウェル中へ入れられた。単特異性ウサギ抗
マウスＩｇイソタイプ抗体（メロイ［Meloy ］）が外側
のウェル中へ入れられそしてプレートは室温で２時間、
さらに４℃で一晩インキュベートされた。 ｂ）可撓性ポリ塩化ビニル製の９６ウェルプレート（コ
ースター［Coster］）が３７℃で２時間０．１mg／ｍｌ
ヤギ抗マウスＩｇ抗体で被覆され、そして３７℃で２時
間３％ＢＳＡ溶液で逆被覆された。ハイブリドーマ上澄
液が次に３７℃で２時間インキュベートされた。ＰＢＳ
で洗浄した後、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）プレート
は、３７℃で２時間ペルオキシダーゼに結合した単特異
性ウサギ抗マウスＩｇイソタイプ抗体（ザイムド［Zyme
d ］）とインキュベートされた。洗浄の後、プレートは
０．１Ｍクエン酸緩衝液pH４．５中の１mg／ｍｌオルソ
フェニレンジアミンおよび０．３％ Ｈ2 Ｏ2 とインキ
ュベートされた。６３０nmでの光学密度がダイナテック
酵素結合免疫吸着剤検定プレート読取器［Dynatec ELIS
A plate reader］において測定された。 スタフィロコッカス タンパク質Ａ結合測定法 微小力価プレートがＰＢＳに０．０２％ＮａＮ3 を加え
たものの中の５％ＦＣＳとインキュベートされそして上
澄液は吸い出された。腫瘍細胞の懸濁液（２×１０7 細
胞／ｍｌ）の２５μｌが、それぞれのウェルへ加えら
れ、そして室温で１時間、特定の抗体２５μｌとインキ
ュベートされた。プレートは１２００rpmで７分間遠心
分離され、５０％ ＮＣＳ／ＰＢＳ／ＮａＮ3 で二度洗
浄され、そして 125Ｉ‐スタフィロコッカス タンパク
質Ａ（約５０，０００cpm ／２５ｌ）２５μｌが添加さ
れた。プレートは２５℃で１時間インキュベートされ、
５０％ ＮＣＳ／ＰＢＳ／ＮａＮ3 で２度洗浄され、そ
して乾燥された。ウェルの底部が切断されそしてガンマ
ーカウンター中で計数された。
【００４２】
【実施例２】 モノクローナル抗体の調製 モノクローナル抗体は、３カ月齢のＢＡＬＢ／ｃマウス
を転移性非−小細胞肺癌を病んでいる患者からの胸膜滲
出液よりの細胞で免疫処置することによって産生され
た。免疫処置は、約１０7 細胞でマウスを腹腔内的に３
〜４回注射することにより行なわれた。最後の免疫処置
の３日後、脾臓が除去され、培養培地中に懸濁されそし
てＮＳ１マウス骨髄腫細胞と融合された（コーラーとミ
ルステイン，上記）。混合物は、単一融合細胞（クロー
ン）を起源として発する低濃度培養株を形成するために
接種された。ハイブリッド形成のために用いられるこの
技術は、イェイら［Yeh et al.］（インターナショナル
ジャーナル オブ キャンサー（1979年）29： 269〜
275［Ｉnt. J. Cancer (1979)29： 269− 275］によっ
てすでに述べられている。
を転移性非−小細胞肺癌を病んでいる患者からの胸膜滲
出液よりの細胞で免疫処置することによって産生され
た。免疫処置は、約１０7 細胞でマウスを腹腔内的に３
〜４回注射することにより行なわれた。最後の免疫処置
の３日後、脾臓が除去され、培養培地中に懸濁されそし
てＮＳ１マウス骨髄腫細胞と融合された（コーラーとミ
ルステイン，上記）。混合物は、単一融合細胞（クロー
ン）を起源として発する低濃度培養株を形成するために
接種された。ハイブリッド形成のために用いられるこの
技術は、イェイら［Yeh et al.］（インターナショナル
ジャーナル オブ キャンサー（1979年）29： 269〜
275［Ｉnt. J. Cancer (1979)29： 269− 275］によっ
てすでに述べられている。
【００４３】ハイブリッド細胞からの上澄み液は、酵素
結合免疫吸着剤検定法およびオートラジオグラフィー的
間接 125Ｉ‐標識化タンパク質Ａ検定法［autoradiogra
phicindirect 125Ｉ‐labelled protein A assey］
（ブラウンら，ジャーナル オブ イムノロジー メソ
ッズ（1979年）31： 201〜 209［Brown et al., J. Imm
unol. Meth. (1979)31： 201− 209］）の双方を用いる
ことによって、とりわけ細胞膜を含有する免疫処置に用
いられた腫瘍からの抽出物に対してスクリーニングされ
た。これらの抽出物は、コルカーら［Colcher et al.］
（キャンサー リサーチ（1981年）42：1451〜1459［Ca
ncer Res., (1981) 42：1451−1459］）；イェイら（上
記）から修正された方法を用いて調製された。このため
に、組織はＰＢＳで洗浄されそして懸濁され、完全な腫
瘍に関するものは、テンレス鋼製ふるいを通して圧搾す
ることによってなされた。この後に、１mMフェニルメチ
ルスルフォニルフルオライド（カルビオケム‐ベーリン
グ コーポレーション カルフォルニア州サンディエゴ
［Calbiochem-Behring Corp., San Diego, CA ］）を含
む１mM ＮａＨＣＯ3 が添加され、原料は、次にデュー
ンス［Dounce］ホモジナイザーのＢ乳棒の５０ストロー
クで、氷上において均質化された。２７，０００×ｇで
１５分間の遠心分離の後、上澄み液が除去され、そして
ペレットはＰＢＳ中に再懸濁され、１分間音波処理さ
れ、−７０℃で貯蔵された。
結合免疫吸着剤検定法およびオートラジオグラフィー的
間接 125Ｉ‐標識化タンパク質Ａ検定法［autoradiogra
phicindirect 125Ｉ‐labelled protein A assey］
（ブラウンら，ジャーナル オブ イムノロジー メソ
ッズ（1979年）31： 201〜 209［Brown et al., J. Imm
unol. Meth. (1979)31： 201− 209］）の双方を用いる
ことによって、とりわけ細胞膜を含有する免疫処置に用
いられた腫瘍からの抽出物に対してスクリーニングされ
た。これらの抽出物は、コルカーら［Colcher et al.］
（キャンサー リサーチ（1981年）42：1451〜1459［Ca
ncer Res., (1981) 42：1451−1459］）；イェイら（上
記）から修正された方法を用いて調製された。このため
に、組織はＰＢＳで洗浄されそして懸濁され、完全な腫
瘍に関するものは、テンレス鋼製ふるいを通して圧搾す
ることによってなされた。この後に、１mMフェニルメチ
ルスルフォニルフルオライド（カルビオケム‐ベーリン
グ コーポレーション カルフォルニア州サンディエゴ
［Calbiochem-Behring Corp., San Diego, CA ］）を含
む１mM ＮａＨＣＯ3 が添加され、原料は、次にデュー
ンス［Dounce］ホモジナイザーのＢ乳棒の５０ストロー
クで、氷上において均質化された。２７，０００×ｇで
１５分間の遠心分離の後、上澄み液が除去され、そして
ペレットはＰＢＳ中に再懸濁され、１分間音波処理さ
れ、−７０℃で貯蔵された。
【００４４】細胞膜抽出物に結合する抗体を産生したハ
イブリドーマは、クローン化され、試験管内で増殖さ
れ、そして抗体特異性に関してさらに試験された。この
試験上記した免疫組織学的技術を用いることによって行
なわれ、肺癌、他の腫瘍および正常ヒト組織の冷凍切片
に結合するための抗体の能力が試験された。ヒト肺癌腫
に対する顕性特異性の抗体を産生するこれらのハイブリ
ドーマは再クローンされ、増殖され、そしてプリスタン
処理された３カ月齢ＢＡＬＢ／ｃマウス中へ注射され、
そこで、これらは腹水腫瘍として増殖した。
イブリドーマは、クローン化され、試験管内で増殖さ
れ、そして抗体特異性に関してさらに試験された。この
試験上記した免疫組織学的技術を用いることによって行
なわれ、肺癌、他の腫瘍および正常ヒト組織の冷凍切片
に結合するための抗体の能力が試験された。ヒト肺癌腫
に対する顕性特異性の抗体を産生するこれらのハイブリ
ドーマは再クローンされ、増殖され、そしてプリスタン
処理された３カ月齢ＢＡＬＢ／ｃマウス中へ注射され、
そこで、これらは腹水腫瘍として増殖した。
【００４５】腹水中へ分泌される抗体は、タンパク質Ａ
セファロース［Sepharose ］において（エイら，イムノ
ケミストリー，（1978年）15： 429［Ey et al. Ｉmmun
ochemistry (1978) 15： 429］）あるいはセファクリル
Ｓ−３００［Sephacryl S-300 ］中でのゲル濾過によっ
て精製された。精製抗体は、免疫組織学による付加的な
特異性試験、該抗体が細胞表面に結合したことを測定す
るための完全細胞における結合検定、および上記したよ
うな放射性免疫沈降試験を含むなお一層の特性づけのた
めに用いられた。
セファロース［Sepharose ］において（エイら，イムノ
ケミストリー，（1978年）15： 429［Ey et al. Ｉmmun
ochemistry (1978) 15： 429］）あるいはセファクリル
Ｓ−３００［Sephacryl S-300 ］中でのゲル濾過によっ
て精製された。精製抗体は、免疫組織学による付加的な
特異性試験、該抗体が細胞表面に結合したことを測定す
るための完全細胞における結合検定、および上記したよ
うな放射性免疫沈降試験を含むなお一層の特性づけのた
めに用いられた。
【００４６】モノクローナル抗体Ｌ１５および１７は、
上記したような免疫組織学的技術にかけられた。抗体Ｌ
１５はＮＳＣＬＣ細胞に強く結合し、そして以下の細
胞、すなわち、結腸癌、乳癌、正常心臓、正常白血球、
正常脳、正常結腸、正常腎臓、正常脾臓、正常皮膚およ
び正常肝臓の細胞には結合しなかった。
上記したような免疫組織学的技術にかけられた。抗体Ｌ
１５はＮＳＣＬＣ細胞に強く結合し、そして以下の細
胞、すなわち、結腸癌、乳癌、正常心臓、正常白血球、
正常脳、正常結腸、正常腎臓、正常脾臓、正常皮膚およ
び正常肝臓の細胞には結合しなかった。
【００４７】抗体Ｌ１７はＮＳＣＬＣ細胞に強く結合
し、そして以下の細胞、すなわち、正常心臓、正常脳、
正常結腸、正常皮膚および正常肝臓の細胞には結合しな
かった。Ｌ１５および１７と呼称される細胞系は共に19
85年 3月１日にA.T.C.C に寄託され、そしてそれぞれ受
入番号ＨＢ８７３８およびＨＢ８７３９を与えられた。
し、そして以下の細胞、すなわち、正常心臓、正常脳、
正常結腸、正常皮膚および正常肝臓の細胞には結合しな
かった。Ｌ１５および１７と呼称される細胞系は共に19
85年 3月１日にA.T.C.C に寄託され、そしてそれぞれ受
入番号ＨＢ８７３８およびＨＢ８７３９を与えられた。
【００４８】本発明は、上記の実施態様に特に言及して
詳細に述べられた。しかしながら、種々の変更と修正が
本発明の精神と視野の範囲内で期待され得ることが理解
されるべきである。
詳細に述べられた。しかしながら、種々の変更と修正が
本発明の精神と視野の範囲内で期待され得ることが理解
されるべきである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 カール エリック ヘルストーム アメリカ合衆国 ワシントン州 シアト ル、 ノース イースト サーバー ディ ーアール． 3925 (72)発明者 ダイアン ホーン アメリカ合衆国 ワシントン州 シアト ル、 ウエスト オリンピック パレス ナンバー 404 202 (72)発明者 ペーター リンスレイ アメリカ合衆国 ワシントン州 シアト ル、 ナインス ウエスト 2430
Claims (2)
- 【請求項１】モノクローナル抗体Ｌ１５を産生する細胞
系。 - 【請求項２】受入番号ＨＢ８７３８でＡＴＣＣに寄託さ
れた請求項１に記載の細胞系。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/738,612 US4873188A (en) | 1985-05-28 | 1985-05-28 | Method, monoclonal antibody, and monoclonal antibody fragments for detecting human non-small cell lung carcinomas and cell line for producing such antibodies |
| US738612 | 2000-12-15 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61121399A Division JP2555028B2 (ja) | 1985-05-28 | 1986-05-28 | ヒト非−小細胞肺癌に関するモノクロ−ナル抗体 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08308572A true JPH08308572A (ja) | 1996-11-26 |
| JP2655830B2 JP2655830B2 (ja) | 1997-09-24 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61121399A Expired - Lifetime JP2555028B2 (ja) | 1985-05-28 | 1986-05-28 | ヒト非−小細胞肺癌に関するモノクロ−ナル抗体 |
| JP7318233A Expired - Lifetime JP2655830B2 (ja) | 1985-05-28 | 1995-12-06 | ヒト非−小細胞肺癌に関するモノクローナル抗体産生細胞系 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61121399A Expired - Lifetime JP2555028B2 (ja) | 1985-05-28 | 1986-05-28 | ヒト非−小細胞肺癌に関するモノクロ−ナル抗体 |
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| EP (1) | EP0203552B1 (ja) |
| JP (2) | JP2555028B2 (ja) |
| KR (1) | KR860009126A (ja) |
| AT (1) | ATE91132T1 (ja) |
| CA (1) | CA1337755C (ja) |
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| DK (1) | DK166682B1 (ja) |
| ES (1) | ES8707863A1 (ja) |
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| GB (1) | GB2176890B (ja) |
| GR (1) | GR861362B (ja) |
| HU (1) | HU208041B (ja) |
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| IL (1) | IL78769A (ja) |
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| NZ (1) | NZ216214A (ja) |
| OA (1) | OA08331A (ja) |
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| PT (1) | PT82672B (ja) |
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| AU616897B2 (en) * | 1987-07-31 | 1991-11-14 | Japan Immuno Research Laboratories Co., Ltd. | Detection method of abnormally-responding lymphocytes as well as detection reagent and kit therefor |
| JPH083487B2 (ja) * | 1987-07-31 | 1996-01-17 | 株式会社日本抗体研究所 | 異常応答リンパ球の検出方法並びにこれに用いる検出用試薬及びキット |
| US5403717A (en) * | 1987-08-11 | 1995-04-04 | Pacific Northwest Research | Diagnosis of premalignant or malignant conditions of human secretory epithelia |
| US5075218A (en) * | 1987-12-29 | 1991-12-24 | Biomira, Inc. | Screening for antibodies which bind carbohydrate epitopes of tumor-associated antigens, and uses thereof |
| AU632469B2 (en) * | 1988-04-04 | 1993-01-07 | Johns Hopkins University, The | A method for early detection of lung cancer |
| US6020145A (en) * | 1989-06-30 | 2000-02-01 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods for determining the presence of carcinoma using the antigen binding region of monoclonal antibody BR96 |
| EP0544898A1 (en) * | 1991-06-26 | 1993-06-09 | The Biomembrane Institute | Early diagnosis of lung cancer using anti-carbohydrate antibody combinations |
| US6117981A (en) * | 1999-06-03 | 2000-09-12 | Cytoclonal Pharmaceutics, Inc. | Hybridomas for lung cancer marker and monoclonal antibodies thereof |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1190853A (en) * | 1981-10-13 | 1985-07-23 | Roberto L. Ceriani | Method and compositions for carcinoma diagnosis |
| ATE28937T1 (de) * | 1982-08-09 | 1987-08-15 | Centocor Inc | Immunotest fuer kohlehydrat-antigen-determinant. |
| US4569788A (en) * | 1983-05-18 | 1986-02-11 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Monoclonal antibodies against non small cell lung cancer |
| US4607009A (en) * | 1983-09-16 | 1986-08-19 | The Wistar Institute | Lewis blood group phenotype assay |
| US4752569A (en) * | 1984-06-21 | 1988-06-21 | The Regents Of The University Of California | Sialylated Lewisx epitope, antibodies and diagnosis |
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1985
- 1985-05-28 US US06/738,612 patent/US4873188A/en not_active Expired - Fee Related
-
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